CN1894276A - Hcv ns3－ns4a蛋白酶抗药性突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及HCVNS3/4A蛋白酶的突变体。更具体说，本发明鉴定出对药物治疗有抗药性的HCV NS3/4A蛋白酶突变体。

Description

HCV NS3-NS4A蛋白酶抗药性突变体
                    背景
发明领域
本发明涉及丙肝病毒NS3/4A蛋白酶的抗药性突变体。
技术背景
丙肝病毒(HCV)感染是备受关注的人类医学问题。已知HCV是大多数非甲非乙型肝炎病例的致病因子，估计全球3％的人为血清阳性[A.Alberti等，“丙型肝炎的天然历史”，J.Hepatology，31，(Suppl，1)：17-24(1999)]。单单美国就有将近4百万人感染[M.J.Alter等，“美国病毒性肝炎的流行病学”，Gastroenterol.Clin.North Am.，23，pp：437-455(1994)；M.J.Alter，“美国的丙肝病毒感染”，J.Hepatology，31，(Suppl.1)，pp：88-91(1999)]。
第一次接触HCV时只有约20％的感染者发展为急性临床肝炎，而其他人似乎不发生明显的感染症状。然而在大约70％的病例中病毒产生了持续几十年的慢性感染[S.Iwarson，“慢性肝炎的自然进程”，FEMSMicrobiology Reviews，14，pp：201-204(1994)；D.Lavanchy，“丙肝的全球调查和控制”，J.Viral Hepatitis，6，pp：35-47(1999)]。这常常导致复发和肝脏炎症进行性恶化，常导致更为严重的疾病状态，如肝硬化和肝细胞肝癌[M.C.Kew，“丙肝和肝细胞肝癌”，FEMS Microbiology Reviews，14，pp：211-220(1994)；I.Saito等，“丙肝病毒感染与肝细胞肝癌的发生相关”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，pp：6547-6549(1990)]。不幸的是，对慢性HCV使人衰弱的进程尚无普遍有效的治疗方法。
HCV的基因组编码一个3010-3033个氨基酸的多聚蛋白[Q.L.Choo等，“丙肝病毒的基因组成和多样性”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，pp：2451-2455(1991)；N.Kato等，“非甲非乙型肝炎日本病人的人丙肝病毒基因组的分子克隆”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，pp：9524-9528(1990)；A.Takamizawa等，“分离自人类携带者的丙肝病毒基因组的结构和组成”，J.Virol，65，pp：1105-1113(1991)]。推测HCV的非结构性(NS)蛋白为病毒复制提供了必需的催化机制。此类NS蛋白源自所述多聚蛋白的水解切割[R.Bartenschlager等，“丙肝病毒的非结构蛋白3编码在NS3/3和NS4/5连接区处切割所需的丝氨酸型蛋白酶”，J.Virol，67，pp：3835-3844(1993)；A.Grakoui等，“丙肝病毒编码的丝氨酸蛋白酶的特征：蛋白酶依赖性多聚蛋白切割位点的确定”，J.Virol，67：2832-43，1993；A.Grakoui等，“丙肝病毒多聚蛋白切割产物的表达和鉴定”，J.Virol，67：1385-95，1993；L.Tomei等，“NS3是丙肝病毒多聚蛋白加工所需的丝氨酸蛋白酶”，J.Virol，67：4017-26，1993]。
HCV NS蛋白3(NS3)具有丝氨酸蛋白酶活性，能加工病毒多聚蛋白而产生病毒的大多数酶，是病毒复制和感染性所必需的。已证明NS3的前181个氨基酸(病毒多聚蛋白的1027-1207残基)含有NS3的丝氨酸蛋白酶结构域，能加工HCV多聚蛋白下游所有4个位点[C.Lin等，“丙肝病毒NS3丝氨酸蛋白酶：反式切割的要求和加工动力学”，J.Virol，68，pp.8147-8157(1994)]。HCV NS3丝氨酸蛋白酶的催化三联体的取代可导致病毒不能在黑猩猩中复制和感染[A.A.Kolykhalov等，“丙肝病毒编码的酶活性和3′非翻译区中的保守性RNA元件是病毒体内复制所必需的”，J.Virol，74：2046-2051]。已知黄热病毒NS3蛋白酶中的突变可降低病毒感染性[Chambers，T.J.等，“证明黄热病毒非结构蛋白NS3的N-末端结构域是负责病毒多聚蛋白位点特异性切割的丝氨酸蛋白酶的证据”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，pp：8898-8902(1990)]。
HCV NS3丝氨酸蛋白酶及其相关辅因子NS4A能加工病毒非结构蛋白区成为各非结构蛋白质，包括所有的病毒酶[C.Failla等，“丙肝病毒NS3蛋白酶的氨基末端结构域是与NS4A相互反应所必需的”，J.Virol，69，pp：1769-1777；Y.Tanji等，“丙肝病毒编码的非结构蛋白NS4A在病毒蛋白加工中具有通用功能”，J.Virol.69，pp：1575-1581；C.Lin等，“丙肝病毒NS4A蛋白的中心区在体内外可形成活性NS3-NS4A丝氨酸蛋白酶复合体”，J.Virol.69，pp：4373-4380]，是病毒复制所必需的。此种加工看来与人免疫缺陷病毒(也参与病毒蛋白加工)天冬氨酰蛋白酶的加工相类似。能抑制病毒蛋白质加工的HIV蛋白酶抑制剂是对人类有效的抗病毒药物，表明打断病毒生命周期的这个阶段将产生有治疗活性的药物。因此它是药物开发的有吸引力的靶标。
现有技术已描述了几种有潜力的HCV蛋白酶抑制剂[PCT公开号Nos.WO 02/18369、WO 02/08244、WO 00/09558、WO 00/09543、WO99/64442、WO 99/07733、WO 99/07734、WO 99/50230、WO 98/46630、WO 98/17679和WO 97/43310，美国专利5,990,276，M.Linas-Brunet等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8，pp：1713-1718(1998)；W.Han等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，pp：711-712(2000)；R.Dunsdon等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，pp：2267-2270(2000)；和S.LaPlante等.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，pp：2271-2274(2000)]。然而这些化合物是否具有可接受药物的适当作用模式尚未明了。此外，HCV蛋白酶可能变得对目前可接受的药物有抗药性。
因此，近年来对HCV的了解尚未能产生任何满意的抗HCV药物或治疗方法。对于HCV疾病，已确立的唯一治疗方法是干扰素α治疗。然而干扰素α有明显的副作用[M.A.Walker等，“丙肝病毒：当前治疗方法和进展综述”，DDT，4，pp：518-29(1999)；D.Moradpour等，“丙肝的现有和研发中的疗法”，Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.，11，pp：1199-1202(1999)；H.L.A.Janssen等，“与慢性病毒性肝炎α干扰素治疗相关的自杀”，J.Hepatol.，21，pp：241-243(1994)；P.F.Renault等，“α干扰素的副作用”，Seminars in Liver Disease，9，pp：273-277(1989)]并且只在一部分病例中(～25％)诱导了长期缓解[O.Weiland，“慢性丙肝病毒感染的干扰素治疗”，FEMS Microbiol.Rev.，14，pp：279-288(1994)]。目前的标准治疗方法是PEG化干扰素α联用利巴伟林，发达国家慢性丙肝病人中70％感染的是1型基因的病毒，其中40-50％有持续性病毒反应(SVR)，2或3型基因的HCV感染病人有80％SVR[J.G.McHutchison等，N.Engl.J.Med.，339：1485-1492(1998)；G.L.Davis等，N.Engl.J.Med.，339：1493-1499(1998)]。 而且，能有效抗HCV的疫苗前景仍然不明朗。
因此，需要更有效的抗HCV治疗方法，特别是能抑制HCV NS3丝氨酸蛋白酶的化合物。这类化合物可用作抗病毒药物，特别是抗HCV药物。对HCV抗药突变体的了解将进一步促进有效的HCV治疗药物的发展。
发明概述
本发明涉及丙肝病毒NS3/4A蛋白酶的抗药性突变体。
因此，本发明某些方面涉及编码HCVNS3/4A蛋白酶突变体或其生物学活性类似物或片段的分离的HCV多聚核苷酸，其中，与野生型多聚核苷酸156位密码子相对应的密码子，和/或与野生型多聚核苷酸168位密码子相对应的密码子发生突变，因而不能编码156位的丙氨酸和/或168位的天冬氨酸。本文描述的含这类示范性突变的多聚核苷酸，包括其中与野生型多聚核苷酸156位相对应的密码子编码丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸的多聚核苷酸。其它示范性实施方式包括与野生型多聚核苷酸168位相对应的密码子编码天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸的多聚核苷酸。特别关注156位和168位密码子突变的任何组合。野生型HCV NS3/4A蛋白酶是本领域技术人员熟知的，它由多聚核苷酸序列SEQ ID No：1所编码。该多聚核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID No：2。
本文也考虑上述多聚核苷酸编码的多肽或其生物学活性片段。本发明也包括含有这类多聚核苷酸的载体、被这类多聚核苷酸转化或转染的宿主细胞、和含有这类多聚核苷酸的细胞系。制备这类载体、转化宿主细胞和制备细胞系的方法和组合物是本领域技术人员已知的常规技术。含有本文所述突变型多聚核苷酸或蛋白质的分离出的HCV变体病毒也是本发明的一部分。
本文也考虑只含上述多聚核苷酸或只含上述蛋白质的组合物，或与其它组合物和组分混合的组合物。
本发明说明了检测生物样品中抗药性HCV存在的方法，该方法包括检测本文所述多聚核苷酸的存在。通常这些方法包括：从样品获得或分离出多聚核苷酸；测定该多聚核苷酸的序列；和评估在该多聚核苷酸中是否存在抗药性相关突变如本文所述的一种或多种突变(如在与野生型HCVNS3/4A蛋白酶156残基相对应的残基上编码丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸的密码子，和/或与168残基相对应的残基编码谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸或酪氨酸的密码子)。
也考虑检测或诊断病人感染的HCV是否是抗药性病毒的方法，该方法包括：收集HCV感染病人的生物学样本；评价血浆样本是否含有编码突变型HCV NS3/4A蛋白酶的核酸，若存在突变的HCV NS3/4A蛋白酶表明该病人有抗药性HCV感染。
其它方面考虑评价HCV感染的病人是否对VX-950的敏感性或易感性降低的方法，该方法包括评价病人的HCV NS3/4A蛋白酶DNA在编码野生型HCV NS3/4A蛋白酶156残基的密码子位点是否有突变。
还有一方面涉及评价HCV的感染病人是否对蛋白酶抑制敏感性或易感性降低的方法，该方法包括评价病人的HCV NS3/4A蛋白酶DNA在编码野生型HCV NS3/4A蛋白酶156残基的密码子位点是否有突变。
本发明还考虑评价候选或潜在HCV抑制剂的方法，该方法包括：将含有本发明多聚核苷酸和编码指示剂的指示基因的载体导入宿主细胞中；培养该宿主细胞；并测定抑制剂有无时指示剂的情况。
测试具有抗HCV活性的化合物的其它方法，是提供本文所述突变型蛋白酶和蛋白酶底物；在底物存在时使该蛋白酶与候选的或潜在的抑制剂接触；并评价或测定对该蛋白酶水解活性的抑制作用。
其它方面提供鉴定可作为本文所述抗药性蛋白酶抑制剂的化合物的方法，该方法包括：测定在没有此化合物时所述蛋白酶的活性；测定存在该化合物时所述蛋白酶的活性；比较存在和不存在该化合物时试验的结果，当蛋白酶活性由于存在该化合物而降低时，表明该化合物是此蛋白酶的抑制剂。
当NS3/4A蛋白酶变得对VX-950有抗药性时，也考虑鉴定能维持VX-950活性的化合物的方法，该方法中，使抗药性蛋白酶与该化合物接触；评估存在该化合物时VX-950抑制该蛋白酶活性的能力。
本发明利用了已能分辨NS3/4A蛋白酶的三维结构这一优势(见例WO 98/11134)。利用本发明的技术和说明，获得了本发明抗药性蛋白酶的三维模型；设计或选择与突变型蛋白酶三维结构相互作用的化合物，并评价该化合物与该蛋白酶结合或相互作用的能力(如通过分子模型)。典型的三维模型是依据NS3/4A蛋白酶的X光晶体结构(图1和2)构建的。此模型可通过计算机辅助方法或X光晶体图获得。可将这些评价与测定野生型蛋白酶时的评价作比较。
可从组合性化学文库中鉴定这种化合物或通过合理的药物设计制备。在示范性实施方式中，该化合物是通过合理的药物设计、从VX-950的结构衍生制备的。在示范性实施方式中，可将经鉴定的化合物配制成为含有该化合物和药学上可接受的载体、佐剂或运载体的组合物。该组合物宜含有抑制NS3/4A丝氨酸蛋白酶的有效量的该化合物。更优选该组合物配制为可给予病人的形式。该组合物也可含有选自：免疫调节制剂、抗病毒制剂、HCV蛋白酶的第二抑制剂、HCV生命周期其它靶分子的抑制剂、细胞色素P-450抑制剂等其它药物，或它们的组合。
本发明的其它方法考虑抑制丙型肝炎NS3/4A蛋白酶活性，包括将丝氨酸蛋白酶与本发明化合物或组合物接触的步骤。其它方面考虑治疗病人HCV感染的其它方法，所述方法包括给予病人本发明化合物或组合物。
考虑的治疗或减轻病人HCV感染的其它方法包括采用本文所述方法(依赖于对所述突变的检测)确定病人感染的HCV是否对治疗有抗药性，和用针对抗药性HCV的组合物或治疗方法来治疗病人。
其它方面阐述排除或减少生物样品、或医学装置、或实验装置受HCV污染的方法，该方法包括使所述生物样品或医学装置或实验装置与按本文所述鉴定的化合物接触的步骤。在其它实施方式中，可用本文所述方法测定所述生物样品或医学装置或实验装置是否污染了抗药性HCV毒株。
本发明的其它特征和优点可在以下详细描述中阐明。然而应理解，这种详细描述和具体实施例虽然说明了本发明的优选实施方式，但它只是阐述性的，因为本领域技术人员知道可根据这些详细描述作出各种变化和修改，但这些都属于本发明的思路和范围。
附图简述
以下附图构成了本说明书的一部分，进一步阐明了本发明的各方面内容。通过参考这些附图结合本文提供的具体实施方式的详细描述可更好地理解本发明。
图1是BILN2061和VX-950两种HCV NS3蛋白酶-蛋白酶抑制剂(PI)复合体的X光结构图。溶解和重叠两个复合体结构(VX-950蓝色，BILN2061红色)。BILN2061中以球杆状表示的三个残基(R123、R155和D168)形成了盐桥，但在VX-950中不形成盐桥。去除D168的负电导致对R155的限制丧失，继而丧失与BILN2061的大P2的堆叠能力并提高了去溶剂化的代价。R155在VX-950结构中不受D168的限制，D168V突变不影响其结合。
图2是A156S突变导致结合丧失，这是由于与VX-950的空间冲突，但与BILN 2061无冲突。VX-950(左上图，蓝色)或BILN 2061(左下图，红色)与以黄色加强表示野生型A156的X光结构图。A156S突变(灰色)与VX-950(右上图，蓝色)或BILN 2061(右下图，红色)的模型。所有可能的扭转角被认为是由于突变残基的丝氨酸侧链所致。
图3是A156V突变导致其与PI结合的丧失，这是由于与VX-950或BILN 2061的空间冲突。A156V突变(绿色)与VX-950(左，蓝色)或BILN 2061(右，红色)的模型。
图4是VX-950(A)和BILN 2061(B)的化学结构。
图5是获得对VX-950有抗药性的HCV复制子细胞。如材料和方法中所述，G418存在和VX-950浓度增加(A)时连续传代HCV Con1亚基因组复制子细胞。每周两次将复制子细胞一分为二，向培养基中加入新鲜的PI。阴影区表示该时段复制子细胞很少或没有完全生长同时伴有大量细胞死亡。在抗药性选择期间抽提不同时间点(实心箭头所指)复制子细胞的总细胞RNA，直接或在亚克隆入TA载体后测定覆盖HCV NS3丝氨酸蛋白酶的RT-PCR产物的序列。用标准的48小时试验测定56天时VX-950对系列A或野生型复制子细胞的IC50值(B)。
图6是获得对BILN 2061有抗药性的HCV复制子细胞。如材料和方法中所述，G418存在和BILN 2061浓度增加(A)时连续传代HCV Con1亚基因组复制子细胞。每周两次将复制子细胞一分为二，向培养基中加入新鲜的PI。阴影区表示该时段复制子细胞很少或没有完全生长同时伴有大量细胞死亡。在抗药性选择期间抽提不同时间点(实心箭头所指)复制子细胞的总细胞RNA，直接或在亚克隆入TA载体后测定覆盖HCV NS3丝氨酸蛋白酶的RT-PCR产物的序列。用标准的48小时试验测定59天时BILN 2061对系列A或野生型复制子细胞的IC50值(B)。
图7是蛋白酶：抑制剂复合体的模型。该蛋白质根据其二级结构以淡灰色草图表示。抑制剂以球杆状表示(VX-950紫色，BILN 2061黄色)、氮原子蓝色、氧原子红色、硫原子橙色。关键残基的侧链用不同颜色的棒表示：Ala156(绿)、Asp168(橙)和Arg123(橙)。BILN 2061：蛋白酶模型的Arg155侧链以青色显示，而在VX-950：蛋白酶模型中以橙色显示。用点面突出了这些侧链。灰色表示催化性三联体：Ser139、His57和Asp81(该图由PyMOL Molecular Graphics Systems绘出，DeLano ScientificLLC，San Carlos，California，USA，Copyright1998-2003)。
图8是从VX-950抗药复制子细胞获得双重抗药性复制子。(A)：0.25mg/ml G418、14μM VX-950存在和BILN 2061浓度增加时连续传代VX-950抗药性复制子细胞。每周两次将复制子细胞一分为二，并向培养基中加入新鲜的VX-950和BILN 2061(分别用实心方块和三角表示)。在抗药性选择期间的第32天抽提复制子细胞的总细胞RNA，直接或在亚克隆入TA载体后测定覆盖HCV NS3丝氨酸蛋白酶的RT-PCR产物的序列。(B)显示VX-950培养52天时抗系列A(VX-950抗性，实心方块)或系列C(双重抗性，空心方块)复制子细胞的VX-950滴度，HCV RNA水平在用VX-950培养48小时后测定。(C)显示用BILN 2061培养52天时抗系列A(VX-950抗性，实心三角)或系列C(双重抗性，空心三角)复制子细胞的BILN 2061滴度，HCV RNA水平在用BILN 2061培养48小时后测定。
图9是从BILN 2061抗药复制子细胞获得双重抗药性复制子。(A)：0.25mg/mlG418、7或14μM VX-950存在和BILN 2061浓度增加时连续传代BILN 2061抗药性复制子细胞。每周两次将复制子细胞一分为二，并向培养基中加入新鲜的VX-950和BILN 2061(分别用实心方块和三角表示)。在抗药性选择期间的第32天抽提复制子细胞的总细胞RNA，直接或在亚克隆入TA载体后测定覆盖HCV NS3丝氨酸蛋白酶的RT-PCR产物的序列。(B)显示VX-950培养52天时抗系列B(BILN 2061抗性，实心方块)或系列D(双重抗性，空心方块)复制子细胞的VX-950滴度，HCV RNA水平在用VX-950培养48小时后测定。(C)显示用BILN 2061培养52天时抗系列B(BILN 2061抗性，实心三角)或系列D(双重抗性，空心三角)复制细胞的BILN 2061滴度，HCV RNA水平在用BILN 206培养48小时后测定。
图10是从原初复制子细胞获得双重抗药性复制子。0.25mg/mlG418存在，和VX-950及BILN 2061浓度增加时连续传代HCV亚基因组复制子细胞。每周两次将复制子细胞一分为二，并向培养基中加入新鲜的VX-950和BILN 2061(分别用实心方块和棱形表示)。框出的区域表示该时段复制子细胞很少或没有完全生长同时伴有大量细胞死亡。在抗药性选择期间的不同时间点(用空心箭头指出)抽提复制子细胞的总细胞RNA，直接或在亚克隆入TA载体后测定覆盖HCV NS3丝氨酸蛋白酶的RT-PCR产物的序列。
图11是Thr156侧链构象与抑制剂结合的关系图。粗线代表突变体酶Thr156的侧链和抑制剂或底物的P2侧链。Val156侧链被认为也有同样的三种构象。最后的一个构象(-60/180°)对此二突变而言能量最低，但仍排斥两种抑制剂。
优选实施方式的描述
本发明人确定某些治疗性化合物存在时HCV病毒株会发生特定突变，使HCV病毒株对这些化合物的治疗能力产生抵抗。在具体实施方式中，确定了这些HCV抗药性突变株中丙肝病毒NS3/4A蛋白酶发生突变，这些突变赋予了病毒对蛋白酶抑制剂化合物的抗药性。这些发现可用于设计治疗HCV感染的方法。
在具体实施方式中，已确定野生型HCV NS3/4A(其序列见SEQ IDNo：2)的156位氨基酸残基易发生突变。此残基突变导致HCV对蛋白酶抑制剂的干预治疗产生抗药性。在一实施方式中，证明野生型HCV NS3/4A中编码丙氨酸的野生型156位密码子突变成在HCV NS3/4A多肽相应位置编码丝氨酸的密码子。另一实施方式中，该密码子突变成在HCV NS3/4A多肽相应位置编码缬氨酸的密码子。在又一实施方式中，HCV NS3/4A中相应位置编码的是苏氨酸。
鉴于以上发现，本发明提供的编码HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)的HCV DNA中156位密码子编码丝氨酸。本发明另一实施方式提供的编码HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)的HCV DNA中156位密码子编码缬氨酸。还有一实施方式提供的编码HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)的HCV DNA中156位密码子编码苏氨酸。
其它实施方式中，已确定在某些实施方式中，156位密码子是编码缬氨酸、丝氨酸或苏氨酸的密码子，此位156残基在正常的天然/野生型HCVNS3/4A中是丙氨酸，另外还有一突变发生在天然/野生型HCV NS3/4A的残基168位密码子(正常情况下是天冬氨酸)，突变成缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。虽然在某些实施方式中，可考虑HCV NS3/4A蛋白酶突变体同时在156和165位含有突变，但只含有一个突变也被认为是本发明的一部分。
本发明的具体方面包括编码HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)的HCV DNA，其中156位密码子编码缬氨酸或丝氨酸，168位密码子编码天冬氨酸或谷氨酸。本发明的另一实施方式提供编码HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)的HCV DNA，其中168位密码子编码缬氨酸。本发明另一实施方式提供编码HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)的HCV DNA，其中168位密码子编码丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
本发明DNA的编号系统与SEQ ID NO：1的序列一致。本发明的DNA可衍生自SEQ ID NO：1。可用固相合成法或重组法产生该DNA。在具体实施方式中，特别考虑定点突变序列SEQ ID NO：2以产生一种或其它本文所述突变。
应知道蛋白质突变可以是完全突变(如蛋白质的所有或几乎所有部分转变成突变型蛋白质)、部分突变或无突变(如没有或几乎没有突变)。因此，本发明的组合物或方法可含有野生型和突变型蛋白的混合物。
本发明的另一实施方式提供含有156位氨基酸是丝氨酸的HCVNS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)。
本发明的另一实施方式提供含有156位氨基酸是缬氨酸的HCVNS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)。
本发明的另一实施方式提供含有156位氨基酸是苏氨酸的HCVNS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)。
本发明的另一实施方式提供含有156位氨基酸是缬氨酸或苏氨酸，168位氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸的HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)。
本发明的另一实施方式提供分离的HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)，其含有该蛋白酶的156位氨基酸，其168位氨基酸是缬氨酸。
本发明的另一实施方式提供的HCV NS3/4A蛋白酶(或其片段或类似物)含有该蛋白的156位氨基酸，其168位氨基酸是丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
可用常规技术修饰本发明的DNA和蛋白质。例如，该DNA可包含能使其附着于固体支持物的修饰。该蛋白可包含共价连接的标记化合物。
本发明的DNA或蛋白质可以是计算机可读形式，包括但不限于，贮存在计算机可读媒介上和/或计算机可读数据库中(见例WO 98/11134)。
对于特定用途，可将本发明的DNA插入到一载体中。任何合适的载体均包括在本发明的范围内。合适的载体是本领域已知的。一种实施方式提供表达载体。另一实施方式提供病毒载体。载体可以是一种克隆工具或可以另含有调控序列，如启动子、增强子和终止子或聚腺苷酸信号。
因此，本发明也提供含有HCV NS3/4A蛋白酶DNA(或其片段或类似物)的载体，其中：
该DNA的156位密码子编码丝氨酸；
该DNA的156位密码子编码缬氨酸；
该DNA的156位密码子编码苏氨酸；
该DNA的156位密码子编码缬氨酸或苏氨酸，和168位密码子编码天冬氨酸或谷氨酸；
该DNA的168位密码子编码缬氨酸；
该DNA的168位密码子编码丙氨酸；
该DNA的168位密码子编码甘氨酸；和/或
该DNA的168位密码子编码酪氨酸。
另一种实施方式提供表达载体。另一实施方式提供病毒载体。载体可以是一种克隆工具或可以另含有调控序列，如启动子、增强子和终止子或聚腺苷酸信号。这些载体可用于任何适合的宿主细胞。宿主细胞是本领域已知的。
因此，本发明也提供含有HCVNS3/4A蛋白酶DNA的宿主细胞，其中该DNA的156位密码子编码丝氨酸；该DNA的156位密码子编码缬氨酸；该DNA的156位密码子编码苏氨酸；该DNA的156位密码子编码缬氨酸或苏氨酸，和168位密码子编码天冬氨酸或谷氨酸；该DNA的168位密码子编码缬氨酸；该DNA的168位密码子编码丙氨酸；该DNA的168位密码子编码甘氨酸；和/或该DNA的168位密码子编码酪氨酸。该DNA的表达将提供包含具有以下突变型蛋白酶的宿主细胞：A156位丝氨酸突变；A156缬氨酸突变；A156苏氨酸突变；A156缬氨酸或苏氨酸突变和D168谷氨酸突变；D168缬氨酸突变；D168丙氨酸突变；D168甘氨酸突变；和/或D168酪氨酸突变。也提供含有本发明DNA或蛋白质的细胞系。
本发明也提供含有本发明DNA或本发明蛋白质的HCV变异株和含有该DNA和蛋白质的组合物。
本发明的HCV变异株以及DNA和/或蛋白质可用于发现药物及监测合适的HCV治疗方法。
相应的，本发明的另一实施方式是提供检测生物样品中HCV存在的方法，该方法包括检测本发明DNA的存在。这些方法可包括以下步骤：a)获得(或提取)DNA；b)测定该DNA的序列；c)测定或推断该DNA中多聚核苷酸156位密码子是否编码丝氨酸；该多聚核苷酸156位密码子是否编码缬氨酸；该多聚核苷酸156位密码子是否编码苏氨酸；156位密码子是否编码缬氨酸或苏氨酸和168位密码子是否编码天冬氨酸或谷氨酸；168位密码子是否编码缬氨酸；168位密码子是否编码丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。在某些实施方式中，所述含HCV的生物样本得自感染HCV的动物。检测这类DNA的存在可用于指导医师诊断可能有抗药性或难以用蛋白酶抑制剂治疗的HCV感染的病人。根据这种指导，本领域技术人员可修改患此感染病人的治疗方案，例如提高所给予的治疗剂量，用感染病人的HCV病毒株对其不具有抗药性的药物来提供另外的治疗。
本发明的方法需要获得一定量的DNA。如专业人员所知的那样去获得此DNA并扩增。可用标准方法(如PCR，杂交)实施本发明。这些技术是本领域技术人员熟知的。
本发明还提供通过监测本文所述的突变来治疗或预防HCV感染的方法。如果HCV中存在抗药性突变，就按此方法治疗病人。该方法包括：a)收集HCV感染病人的样本(如血浆样本、PBMC、肝细胞或其它样本)；和b)评价该血浆样本所含的核酸是否编码156位密码子有突变的HCVNS3/4A蛋白酶；其中，该突变导致丙氨酸被丝氨酸取代。也可用本文所述的其它突变取代156位丙氨酸--＞丝氨酸突变，来应用类似的方法。此外，类似方法可能涉及鉴定A156的丝氨酸突变(或本文鉴定的其它突变)和蛋白酶的其它突变。这些方法均包括：获得DNA，扩增该DNA，和测定该DNA的序列。
本发明也提供评估用NS3/4A蛋白酶抑制剂治疗HCV感染病人效果的方法，该方法包括：a)收集HCV感染病人的样本(如血浆样本)；和b)评价该血浆样本所含的核酸是否编码156位密码子有突变的HCV NS3/4A蛋白酶；其中，该突变导致丙氨酸被丝氨酸取代。可利用本发明的其它突变进行类似的方法。
本发明方法目的是鉴定已给予HCV蛋白酶抑制剂的病人中有无抗药性突变病毒。这些方法可用于正在治疗或已作了治疗的病人。这些和其它诊断技术是本领域已知的(见美国专利5,631,128和6,489,098)。
因此，一种实施方式是提供一种方法，该方法用于评价HCV感染的病人是否含有156位密码子发生突变的HCV NS3/4A蛋白酶DNA。这种病人可能对VX-950等药物治疗有抗药性。因此可用VX-950的替代疗法治疗该病人。其它实施方式提供一种方法，该方法用于评价HCV感染的病人是否含有168位密码子发生突变的HCV NS3/4A蛋白酶DNA。
这些突变中的某些可导致对VX-950敏感性或易感性降低。类似地，某些突变与对BILN 2061的敏感性或易感性降低有关或导致这种降低(WO 00/59929；US6,608,027)。其它突变可导致对VX-950和BILN 2061二者的敏感性或易感性降低。可按照本发明方法评价对其中一种或全部两种化合物敏感性或易感性的降低。通过了解这种抗药性突变的模式，可研发出更有效的治疗方案。
例如，本发明的方法可用于设计和/或发现对于抗本文所述抗药性突变体具有活性的化合物。
因此，本发明提供评价候选的或潜在的HCV抑制剂的方法，该方法包括：
a)将含有本发明DNA和编码指示剂的指示基因的载体引入宿主细胞中；
b)培养该宿主细胞；和
c)存在或不存在抑制剂时检测所述指示剂。
此方法中，可在步骤a)--c)的一步或多步中加入测试化合物。
本发明另一实施方式是提供检测化合物抗HCV活性的方法，该方法包括：
a)提供本发明的蛋白酶和蛋白酶底物；
b)在底物存在下使该蛋白酶与候选的或潜在的抑制剂接触；和
c)评价或检测对该蛋白酶水解活性的抑制。
本发明另一实施方式是提供鉴定本发明蛋白酶的抑制剂的方法，该方法包括：
a)检测不存在某化合物时所述蛋白酶的活性；
b)检测存在该化合物时所述蛋白酶的活性；
c)比较a)与b)的结果。此方法还可包括：
d)检测不存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；
e)检测存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；和
f)比较d)与e)的结果。然后分析这些方法所获得的数据，例如比较a)和/或b)的结果，及d)和/或e)的结果。
还提供的方法包括：
d)检测不存在该化合物时第二种NS3/4A蛋白酶的活性，所述第二种NS3/4A蛋白酶包括该蛋白酶的氨基酸168位，其中所述氨基酸168位是缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸；
e)检测存在该化合物时第二种蛋白酶的活性；和
f)比较d)和e)的结果。此方法还包括：
g)检测不存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；
h)检测存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；
i)比较g)与h)的结果。在更具体的实施方式中，该方法包括比较a)和/或b)的结果和d)和/或e)的结果；和/或g)和/或h)的结果。
病毒对某药物产生抗药性后，该病毒可能进一步突变再次对该药物变得敏感。发生此情况的一种方法是使该病毒接触第二种药物。因此本发明还提供鉴定当NS3/4A蛋白酶变得对VX-950产生抗药性时能够挽回VX-950活性的方法，该方法包括：
a)使本文所述突变的蛋白酶与感兴趣的化合物接触；
b)检测VX-950抑制a)所述蛋白酶活性的能力。也提供类似的挽回BILN 2061对抗药性突变株和/或VX-950和BILN 2061双重抗药性突变株活性的方法。
抗药性病毒的另一方面内容是可用另一药物治疗此病毒。因此鉴定对抗药性病毒具有活性的化合物的方法是非常有用的发现药物的工具。可将本文所述的方法用于高通量筛选技术中。或者，本发明也提供进行合理的药物设计技术的方法。利用本文阐述的HCV NS3/4A蛋白酶的结构信息(如野生型蛋白质156和/或168位残基的突变)作为设计蛋白酶有效抑制剂的基础。更具体说，本发明首次鉴定到对蛋白酶抑制剂如VX-950和BILN2061治疗具有抗药性的HCV病毒株。
当利用组合文库中的化合物来检测潜在的蛋白酶抑制靶药物时，可联合应用合理的药物设计与大规模筛选实验的系统方法。
合理的药物设计是受到关注的方法，其利用有关药物受体或其天然配体之一的结构信息来鉴定或创造候选药物。可利用X光晶体图或核磁共振光谱等方法来测定蛋白的三维结构。本发明中，HCV NS3/4A蛋白酶突变体的三维结构包含156或168位残基之一或二者的突变，现在可方便地用常规X光晶体图和/或NMR谱技术来测定。
当利用组合文库中的化合物来检测潜在的蛋白酶抑制靶药物时，可联合应用合理的药物设计与大规模筛选实验的系统方法。利用本文提供的信息，本领域技术人员可采用计算机程序来检索含有许多不同化学化合物结构的数据库。计算机能选出最可能与抗药性突变病毒株HCVNS3/4A蛋白酶相互作用的那些化合物，用针对蛋白酶抑制剂的常规实验室测试方法，如本文所述的方法，来测试以这种方法鉴定到的化合物。
某些实施方式中，考虑可利用VX-950或BILN 2061的结构(见图4)作为起始结构来设计其它分子。本文已证明突变的蛋白酶与VX-950相互作用降低。从VX-950衍生的结构与当156位残基是缬氨酸、丝氨酸或苏氨酸和/或168位残基是缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或谷氨酸时而产生的三维结构更易配合和相互作用，它们将是新的蛋白酶抑制剂，可用于对抗HCVNS3/4A蛋白酶中有突变的抗药性HCV病毒株。这类化合物可能对所含HCV NS3/4A蛋白酶无突变的野生型HCV病毒株也有效。本发明的教导可使本领域技术人员尽可能缩小检索范围以减少大规模筛选的代价。
在具体实施方式中，起始化合物的结构具有VX-950的结构(见以下结构B)。虽然示范的是VX-950，但可采用950的任何立体异构体，包括其正丙基侧链为D-和L-异构体的混合物。以下结构，结构式A说明了这种非对映异构体。它是结构B(VX-950)和结构C化合物的混合物。
                         结构A
                         结构B
Figure A20048003702800273
                         结构C
可采用合理的药物设计来连续修饰此分子的不同部位产生其可用作蛋白酶抑制剂的衍生物。VX-950与野生型HCV NS3/4A蛋白酶结合的晶体结构见图1。图中的数据显示，去除HCV NS3/4A蛋白酶D168的负电荷导致不能限制R155从而不能与BILN 2061的大P2重叠，提高了去溶剂化所消耗的能。在VX-950溶解结构中D168不能限制R155，因此D168突变不影响其结合。利用通过合理药物设计所阐明的衍生物不难进行这种结合研究，来鉴定对这些突变具有结合能力和/或治疗效力的药物。
曾利用合理的药物设计来鉴定治疗流感所用的扎那米韦(Relenza)。导致发现扎那米韦的设计思想的产生是通过选择最可能与神经氨酸酶(一种病毒产生的，从感染细胞释放新形成病毒所需的酶)相互作用的分子。近年来许多治疗HIV感染的药物(如RitonivirTM，IndinavirTM(吲哚那韦))也是通过合理的药物设计方案鉴定的，这些药物被设计成能切割病毒蛋白质然后使它们适当装配的病毒蛋白酶相互作用。
通过基于配体的合理设计产生的其它熟知药物有ViagraTM(伟哥)。设计此药物来模仿cGMP。一种能结合磷酸二酯酶的配体。
鉴于一旦知道了药物靶标的结构，合理的药物设计技术即可奏效，故可考虑利用本发明的发现，即揭示了对已知的HCV蛋白酶抑制剂有抗药性的HCV病毒株的HCV NS3/4A蛋白酶的结构，本领域技术人员可利用此发现来合理设计药物，鉴定可用于治疗HCV的药物。
因此，本发明也提供鉴定对本发明蛋白酶有效的化合物的方法，该方法包括：
a)获得该蛋白酶的三维结构模型；
b)设计或选择化合物；
c)评价该化合物与所述蛋白酶结合或相互作用的能力。
这些方法中，三维结构模型基于NS3/4A蛋白酶的X光晶体结构(图1和2)。已知可通过例如计算机辅助的分子模拟方法从晶体结构产生模型(见例美国专利6,162,613；WO 98/11134和/或WO 02/068933)。也可从本发明蛋白质的X光晶体图获得三维模型。如本领域所知，蛋白质在有或无其配体(如待评价的化合物)时都可结晶。
评价化合物与蛋白酶结合或相互作用能力的方法是本领域已知的(见例美国6,162,613；WO98/11134和/或WO 02/068933)。如可通过分子模拟进行这种评价。选出化合物后，可用标准试验或本文提供的试验测试它们以确定该化合物对各种HCV蛋白酶的效力。
因此利用本发明的技术，可进行筛选试验来鉴定对抗药性HCV感染有效的蛋白酶抑制剂。本发明证明，HCV NS3/4A蛋白酶的156或168位残基发生突变的那些HCV病毒株中诱导了抗药性。更具体说，本文证明由于A156突变为丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸和/或D168突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或谷氨酸而导致该HCV对药物治疗产生抗药性。
考虑作为突变型HCV NS3/4A蛋白酶(包括上述一种或多种突变)抑制剂的组合物可用于治疗HCV的治疗性实施方式中。可以设计这些化合物来模拟VX-950或BILN 2061的作用，或从VX-950或BILN 2061衍生这些化合物。在鉴定此类化合物的筛选试验中，可先在体外筛选候选药物的基本生化活性，然后在HCV感染的体内模型中测试其降低、减轻或治疗干预HCV感染的能力。本发明的突变蛋白酶具有蛋白酶活性。可利用测定野生型HCV NS3/4A蛋白酶活性的常规试验来设置筛选试验检测突变型HCV NS3/4A蛋白酶的活性。在优选实施方式中，将抗突变型HCVNS3/4A蛋白酶的抑制剂活性与抗野生型HCV NS3/4A蛋白酶的抑制剂活性相比较。
可通过获得含HCV NS3/4A蛋白酶的样品，使该样品与候选药物接触来测定候选药物抑制该蛋白酶的能力。测定在存在和不存在该候选药物时的HCV蛋白酶活性。所述蛋白酶可以是分离的蛋白、含该分离蛋白的膜组分，或可以在表达该蛋白酶的细胞中。因此通常是在没有候选药物时检测含蛋白酶样品中的所述蛋白酶活性，然后将该候选药物加到含蛋白酶样品的同一或类似组合物中，检测所述蛋白酶的活性。任何候选药物如能降低样品中所述蛋白酶的活性，则表明该候选药物具有所需的抑制活性。
在体内筛选试验中，以不同剂量给予模型动物受试化合物一段时间，然后监测HCV相关症状的减轻。一种或多种所述症状的任何改善表明该候选药物是有用的药物。
术语“候选药物”本文用于指可能用作HCV蛋白酶抑制剂的任何分子，不论该蛋白酶是野生型或突变型。这类药物可以是蛋白或其片段、小分子抑制物，甚或核酸分子。最有用的药学化合物可能是结构上与其它已知的HCV蛋白酶抑制剂，如VX-950或BILN 2061或本文所述其它抑制剂相关的化合物。合理的药物设计不仅包括与已知的抑制剂作比较，还包括预测与这些抑制剂的靶分子结构有无相关性。
一方面，人们可简单地从各种商品化来源获得小分子文库，据认为，小分子文库在对有用化合物的“强力”鉴定中符合有用药物的基本标准。筛选这些文库(包括组合产生的文库(如肽文库))，是一种快速有效的筛选大量相关(和不相关)化合物活性的方法。组合方法也可通过产生第二、第三和第四代活性化合物，使潜在的药物自身快速进化，而不是产生不需要的化合物。
候选药物可包括天然化合物的片段或其一部分，或可发现已知无活性的化合物的活性组合。有人提出可从天然来源，如动物、细菌、真菌、植物来源如树叶树皮和水生样品中分离获得，检测其中是否可能存在有用的药学物质。可理解待筛选的药物也可得自或合成自化学组合物或人造化合物。
某些情况时，候选药物的“有效量”是与没有此药物时相比，能有效地重复性产生抑制HCV NS3/4A蛋白酶表达或活性，抑制HCV产生或毒力，抑制HCV感染，或减轻或缓解HCV感染的一种或多种症状等这些参数水平的量。能实现这些参数发生明显有利变化的化合物将被采用。可能达到(所述蛋白酶)活性和/或表达显著改变，如活性改变至少约30-40％，最优选改变至少约50％，尽可能更高。
显性VX-950抗药性突变A156S的病毒株仍对BILN 2061敏感。为证实所观察到的Ala156或Asp168突变是否足够分别产生对VX-950或BILN2061的抗药性，利用定点突变将156或168位处的各突变引入野生型NS3蛋白酶结构域中。
定点特异性突变是可用于制备本发明方法所用突变蛋白酶的另一种技术。此技术采用对DNA(编码要修饰的氨基酸序列)的特异性突变。此技术还能够制备和测定序列变异，通过在该DNA中引入一个或多个核苷酸序列的变化掺入一种或多种上述突变。可通过利用编码所需突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列，以及足够数量的毗连核苷酸来提供足够大小和序列复杂性的引物序列，形成跨越缺失接头区两侧的稳定双链体来产生定点特异性突变。通常优选长度约17-25个核苷酸的引物，包括要改变的序列接头区两侧约5-10个残基。
该技术通常采用单链和双链形式的噬菌体载体。用于定点突变的典型载体包括M13噬菌体等载体。这些噬菌体载体可从市场上购买到，它们的用法是本领域技术人员熟知的。通常，定点突变也可采用双链质粒，这可省去将目的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。
通常进行定点突变先要获得单链载体，或将其中含有编码所需蛋白质的DNA序列的双链载体的两条链解链。合成制备携带有所需突变序列的寡核苷酸引物。使此引物与单链DNA制备物退火，当进行选择性杂交(退火)时要考虑到错配程度，采用DNA聚合酶(如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段)以完成携带突变的链合成。从而编码原先无突变序列的一条链与携带所需突变的第二条链之间形成杂合双链体。用此杂合双链体载体转化合适的细胞(如大肠杆菌细胞)，选择含有突变序列的重组载体的细胞克隆。
当然，上述定点突变方法不是唯一的产生可能有用的突变蛋白酶的方法，也不意味限于此方法。本发明也考虑其它可实现突变的方法，如用诱变剂(如羟基乙胺)处理携带有目的基因的重组载体来获得变异序列。
在我们的试验条件下，基因型1a和1b的野生型NS3蛋白酶结构域对FRET底物的动力学参数相同[表1A和1B]。虽然NS4A肽辅因子得自HCV基因型1a，但观察到的动力学参数没有明显不同。这与分子模型相一致，提示在基因型1a和1b之间NS4A的中心区保守性变异不影响NS4A核心肽与NS3蛋白酶结构域之间的相互作用。利用基因型1a和1b的野生型蛋白酶测定了VX-950和BILN 2061的Ki值，这二种野生型蛋白酶之间没有统计学显著差异(表2)。
A156S突变蛋白酶对FRET底物的动力学参数事实上与野生型蛋白酶的相同(表1A和1B)。然而，VX-950对A156S突变蛋白酶的Ki值为2.9μM，比其对野生型蛋白酶(0.1μM)的高29倍(表2)。BILN 2061对A156S突变体的Ki值为112nM，比其对野生型蛋白酶(19nM)高6倍(表2)。
含A156S取代的复制子细胞中的HCV RNA水平类似于野生型复制子细胞(数据未显示)，这与A156S突变蛋白酶和野生型NS3丝氨酸蛋白酶之间类似的酶催化效力相一致。VX-950对A156S复制子细胞的IC50值为4.65μM，比对野生型复制子细胞(0.40μM)高12倍(表3)。BILN 2061对A156S(7nM)和野生型复制子细胞(4nM)的IC50值之间差异无显著性(表3)。
主要BILN 2061抗药性突变体，D168V和D168A，仍对VX-950完全敏感。
通过比较野生型和两种突变型NS3丝氨酸蛋白酶的kcat和kcat/Km值，表明D168V突变不影响对底物的动力学参数，D168A突变也显示只有微小改变(不到10倍)(表1A和1B)。类似地，观察到Asp168的两种取代对VX-950的Ki值无显著影响(表2)。然而，168位天冬氨酸为缬氨酸或丙氨酸所取代可导致突变的NS3蛋白酶不受高达1.2μM的BILN2061抑制(表2)。这些数据表明，与野生型蛋白酶相比，两种突变蛋白酶对BILN 2061的敏感性至少降低了63倍。抗药性的确切等级不能测定，因为如650nm吸光值测定所示，BILN 2061在1.2μM以上浓度时不溶于试验缓冲液。也通过定点突变将D168V和D168A突变引入野生型HCV复制子中，产生了携带此二取代之一的稳定复制子细胞系。BILN 2061对D168V复制子细胞的IC50为5.09μM，比对野生型复制子细胞(4nM)高1,300倍以上(表3)。BILN 2061对D168A突变复制子细胞的IC50为1.86μM。VX-950对D168V和野生型复制子细胞的IC50值几乎无变化(表3)。
因此也提供了用本发明方法鉴定到的化合物，其中一化合物是HCVNS3/4A蛋白酶的抑制剂。这类化合物可通过如上述合理的药物设计产生。
本发明还提供含有上述化合物的组合物及它们的使用方法。可用这类组合物来预处理要插入病人体内的侵入性装置，在给予病人之前处理生物学样品如血液，也可直接给予病人。在各种情况下，这类组合物可用于抑制HCV复制，减少HCV感染的危险或严重程度。
本发明另一实施方式提供含有本发明所鉴定的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的组合物。按照优选实施方式，本发明所鉴定的化合物存在的量应能有效减少样品或病人中的病毒负荷，其中所述病毒编码病毒生命周期所必须的丝氨酸蛋白酶。
如果这些组合物采用本发明化合物的药学上可接受的盐，这些盐宜得自无机或有机酸和碱的盐。酸加成盐中包括：乙酸、己二酸、海藻酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、亚硫酸、丁酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊酰丙酸、二葡糖酸、十二烷基磺酸、乙基磺酸、富马酸、葡糖庚酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、辛酸、氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、2-羟基乙基磺酸、乳酸、马来酸、甲基磺酸、2-奈磺酸、烟酸、草酸、棕榈酸、果酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、丙酸异戊酯、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、甲苯磺酸和十一酸的盐。碱加成盐包括：铵盐、碱金属盐如钠盐和钾盐、碱土金属盐如钙盐和镁盐、有机碱盐如二环己胺盐、N-甲基-D-葡糖胺盐、氨基酸如精氨酸、赖氨酸盐等。
另外，含氮的碱性基团可用低级卤代烷等试剂季胺化，如氯代、溴代和碘代甲基、乙基、丙基和丁基；硫酸二烷基盐如硫酸二甲基、二乙基、二丁基和二戊基盐；长链卤如氯代、溴代和碘代癸基、月桂基、肉豆蔻基和十八烷基；卤代芳烷基如苄基和苯乙基溴等。从而获得水溶性或油溶性或分散性产品。
也可附加合适的功能基团来修饰用于本发明组合物和方法中的化合物以提高选择性生物学性能。这类修饰是本领域已知的，包括提高渗入给定生物系统(如血液、淋巴系统、中枢神经系统)的能力，提高口服利用度，提高溶解性使得能注射给药，改变代谢和改变排泄速度。
可用于这些组合物的药学上可接受的载体包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲剂如磷酸、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸、蜡质、聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
根据一优选实施方式，将本发明组合物配制成药物给予哺乳动物，优选给予人。
本发明的药物组合物可经口服、喷雾吸入、局部、直肠、鼻内、口含、阴道内或经植入的存贮器给予。术语“胃肠道外”本文用于指包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑囊内、胸骨内、腱鞘内、肝内、病灶内、颅内注射或灌注技术。优选该组合物经口服或静脉内给予。
本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。可按照本领域已知的技术用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制这些悬浮液。该无菌可注射制剂也可以是用无毒性胃肠道外可接受的稀释液或溶剂如1，3二丁醇配制的无菌可注射溶液或悬浮液。可采用的可接受的运载体和溶剂是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，常规采用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的不挥发油包括合成的单、双甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物，和天然的药学上可接受的油，如橄榄油或海狸油，特别是它们的聚氧乙烯衍生物可用于制备该可注射溶液。这些油性溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或类似的分散剂，通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳液和悬浮液。其它常用的表面活性剂如吐温、Span，和其它常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的乳化剂或生物利用增强剂，也可用于配制制剂。
用于单一治疗来预防和治疗病毒介导的，特别是HCV介导的疾病的本文所述蛋白酶抑制剂化合物，每天剂量水平约为0.01-100mg/kg体重，，优选约0.5-75mg/kg体重。通常本发明的药物组合物每天给药1-5次，或者连续输注。这种给药方式可用作慢性或急性治疗。与运载物质混合产生单剂型的活性成分量取决于所治疗的宿主和给药的具体方式。典型的制剂含有约5-95％的活性化合物(w/w)。这类制剂优选含有约20-80％的活性化合物。
当本发明的组合物含有本发明所鉴定的化合物与一种或多种其它治疗性或预防性制剂的混合物时，所述化合物和其它制剂的剂量水平应为单次治疗方案通常给予剂量的约10-100％之间，更优选在10-80％之间。
本发明的药物组合物可以口服可接受的剂型口服给药，包括但不限于：胶囊、药片、水悬液或溶液。就口服药片而言，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。也常加入润滑剂如硬脂酸镁。以胶囊剂型口服给药时所用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当需要口服水悬液时，可用乳化剂和悬浮剂混合活性成分。如需要也可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
或者，本发明的药物组合物可以直肠给药的锭剂给予。可通过将该药物与室温时为固体但在直肠温度下为液体而可在直肠内融化释放药物的无刺激性赋形剂混合制备此锭剂。这些赋形剂包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
也可局部给予本发明的药物组合物，特别是当治疗目标包括局部应用易接近的区域或器官时，如眼、皮肤或下消化道疾病。对于这些区域或器官不难制备各自合适的局部使用剂型。
下消化道局部应用可采用直肠锭剂(见上)或合适的霜剂。也可采用局部透皮贴片。
对于局部应用，可将该药物组合物配制成所含活性成分悬浮在或溶解在一种或多种载体中的合适油膏。可局部给予本发明化合物的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚乙烯、聚丙烯化合物、乳化蜡和水。或者可将该药物组合物配制成所含活性成分悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的合适洗剂或霜剂。合适的载体包括但不限于：矿物油、单硬脂酸山梨聚糖、聚山梨醇酯60、鲸脂蜡、芳基鲸脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
对于眼科应用，可将该药物组合物用pH适当的等渗无菌盐水配制成微粒化悬液，优选用pH适当的等渗无菌盐水配成溶液，加或不加防腐剂如氯代苄基烷。或者，对于眼科应用，可将该药物组合物配成油膏，如凡士林。
本发明的药物组合物也可通过鼻气溶胶或吸入给药。可用制药领域熟知的技术制备此组合物，用盐水、苯甲醇或其它合适的防腐剂、可提高生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物、和/或其它常规促溶或促分散剂配成溶液。
最优选配制成用于口服给药的药物组合物。
另一实施方式中，本发明的组合物还包含其它抗病毒药物，优选抗HCV药物。这类抗病毒药物包括但不限于：免疫调节剂，如α-、β-、和γ-干扰素、peg化产生的干扰素α化合物和胸腺素；其它抗病毒药物如利巴伟林、金刚胺和汰比夫定；其它丙肝蛋白酶抑制剂(NS2-NS3抑制剂和NS3-NS4A抑制剂)；HCV生命周期其它靶分子的抑制剂，包括螺旋酶和聚合酶抑制剂；内部核糖体进入抑制剂；广谱病毒抑制剂如IMPDH抑制剂(如美国专利5,807,876；6,498,178；6,344,465；6,054,472；WO97/40028；WO 98/40381；WO 00/56331和霉酚酸及其衍生物包括但不限于VX-497、VX-148和/或VX-944)；或上述药物的任何组合。也见W.Markland等，Antimicrobial & Antivial Chemotherapy，44，p：859(2000)和美国专利6,541,496。
本文中采用了以下定义(商标是指本申请申请日时可获得的产品)。
“Peg-Intron”指PEG-Intron，获自Schering Corporation，Kenilworth，NJ的peg干扰素α-2b；“Intron”指Intron-A，获自Schering Corporation，Kenilworth，NJ的干扰素α-2b；“利巴伟林”指利巴伟林(1-β-D-呋喃糖苷基-1H-1，2，4-三唑基-3-氨甲酰)，获自ICN药物公司，Costa Mesa，CA；在Merck Index，entry8365，第12版中有描述；也可获自Schering Corporation，Kenilworth，NJ的Rebetol，或获自Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ的Copegus；“Pagasys”指Pagasys，获自Hoffmann-La Roche，Nutley的peg化干扰素α-2a；“Roferon”指Roferon，获自Hoffmann-La Roche，Nutley的重组干扰素α-2a；“Berefor”指Berefor，获自Boehringer IngelheimPharmaceutical，Inc.Ridgefield，CT的干扰素α-2；Sumiferon，天然α-干扰素的混合物，如获自Sumitomo，Japan的Sumiferon；Wellferon，获自Glaxo-Wellcome LTD.，Great Britain的干扰素α-n1；Alferon，天然α-干扰素的混合物，由Interferon Sciences生产，可获自Purdue Frederick Co.，CT。
术语“干扰素”本文用于指高度同源的种特异性蛋白质家族成员，它们能抑制病毒复制和细胞增殖，调节免疫应答，如干扰素α、干扰素β和干扰素γ。Merck Index，entry5015，第12版。根据本发明一实施方式，，所述干扰素是α-干扰素。根据本发明一实施方式，本发明的治疗性组合采用天然干扰素α2a。或者，本发明的治疗性组合采用天然干扰素α2b。在其它实施方式中，本发明的治疗性组合物采用重组的干扰素α2a或2b。在另一实施方式中，干扰素是peg化干扰素α-2b或2b。适合本发明的干扰素包括：
(a)Intron(干扰素α-2b，Schering Plough)，
(b)Peg-Intron，
(c)Pegasys，
(d)Roferon，
(e)Berefor，
(f)Sumiferon，
(g)Wellferon，
(h)获自Amgen，Inc.，Newbury Park，CA的共有序列干扰素α，
(i)Alferon；
(j)Viraferon
(k)Infergen。
如有经验的医师所知，蛋白酶抑制剂宜经口服给予。干扰素通常不口服。然而，本文不将本发明的方法和组合限制于任何特定的剂型或给药方案。本发明组合中的各化合物可分开给予，一起或以组合方式给予。
一实施方式中，所述蛋白酶抑制剂和干扰素以分开的剂型给予。一实施方式中，以同一剂型给予其它药物与蛋白酶抑制剂，或以分开的剂型给予。因为本发明包括化合物的组合，各化合物的具体用量可能取决于组合中各化合物彼此的具体用量。如有经验的医师所知，干扰素的剂量通常以IU表示(如约400-1200万IU)。
因此可与本发明化合物联用的药物(免疫调节药物或其它)包括但不限于：干扰素α-2b(IntronA，Schering Plough)；Rebatron(Schering Plough，干扰素α-2b加利巴伟林)；peg化干扰素α(Reddy，K.R.等，“与慢性丙肝无肝硬化病人所用干扰素α-2a相比，peg化干扰素α-2a(40-kd)的药效和安全性”，Hepatology，33，pp.433-438(2001))；共有序列干扰素(Kao，J.H.等，“共有序列干扰素治疗慢性肝炎的效果”，J.Gastroenterol.Hepatol.15，pp.1418-1423(2000))；干扰素α-2a(RoferonA，Roche)，淋巴母细胞或“天然”干扰素；干扰素τ(Clayette，P等，“IFN-τ，一种具有抗逆转录病毒活性的新型I类干扰素”，Pathol Biol，(Paris)，47，pp.553-559(1999))；白介素2(Davis，G.L等“治疗丙肝的未来选择”Seminars in LiverDiseases，19，pp.103-112(1999))；白介素6(Davis，G.L等“治疗丙肝的未来选择”Seminars in Liver Diseases，19，pp.103-112(1999))；白介素12(Davis，G.L等“治疗丙肝的未来选择”Seminars in LiverDiseases，19，pp.103-112(1999))；利巴伟林和能促进I型T辅助细胞应答产生的化合物(Davis等“治疗丙肝的未来选择”Seminars in LiverDiseases，19，pp.103-112(1999))。干扰素通过直接抗病毒作用和/或调节对感染的免疫应答可减轻病毒感染。干扰素常通过对病毒渗入或去包膜、病毒RNA的合成、病毒蛋白的翻译和/或病毒装配和释放的抑制来介导抗病毒作用。
刺激细胞合成干扰素的化合物(Tazulakhova，E B等，“俄罗斯在新型干扰素诱生剂的筛选、分析和临床应用中的经验”J.Interferon CytokineRes.，21pp.65-73)包括但不限于双链RNA，单用或与妥布霉素和咪喹莫特联用(3M Pharmaceuticals；Sauder，D.N，“咪喹莫特的免疫调节和药理性能”，J.Am.Acad.Dermatol.，43pp.S6-11(2000))。
可与本发明化合物联用的其它非免疫调节性或调节性化合物包括但不限于纳入本文参考文献的WO 02/18369中所述的那些(见例如273页9-22行和274页4行至276页11行，其全部内容纳入本文作参考)。
刺激细胞合成干扰素的化合物(Tazulakhova等，J.Interfero CytokineRes.，21，65-73)包括但不限于双链RNA，单用或与妥布霉素和咪喹莫特联用(3M Pharmaceuticals；Sauder，J Am Acad Dermatol.，43，S6-11(2000))。
其它通过非免疫调节机制具有或可能具有抗HCV病毒活性的化合物包括但不限于：利巴伟林(ICN Pharmaceuticals)；肌苷5′-单磷酸脱氢酶抑制剂(本文提供的VX-497结构式)；金刚胺和金刚乙胺(Younossi等，Seminars in Liver Diseases，19，95-102(1999))；LY217896(美国专利4,835,168)(Colacino等，Antimicrobial Agents & Chemotherapy34，2156-2163(1990))；和9-羟基亚胺基-6-甲氧基-1，4a二甲基1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氢-菲-1-羧酸甲酯；6-甲氧基-1，4a二甲基-9-(4-甲基-哌嗪-1-基亚胺基)-1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氢-菲-1羧酸甲酯盐酸盐；1-(2-氯-苯基)-3-(2，2-二苯基-乙基)-脲(美国专利6,127,422)。
以下参考文献说明了上述分子的给药剂型、剂量和途径，或者这些是本领域熟知的，例如：F G，Hayden，Goodman & Gilman′s ThePharmacological basis of Therapeutics，第9版；Hardman等编，McGraw-Hill，New York(1996)，第50章，1191-1223页和其中引用的参考文献。或者，一旦鉴定到显示有抗病毒活性，特别是针对抗药性HCV病毒株的抗病毒活性的化合物，可用本领域熟知的技术测定该化合物的药学有效量。例如见Benet等，Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basisof Therapeutics，第9版；Hardman等编.，McGraw-Hill，New York(1996)，第1章，3-27页和其中引用的参考文献。因此不难用常规方法确定这类化合物的适合剂型、剂量范围和剂量方案。
可将本发明的药物组合给予细胞、多个细胞、或病人，以分开的药学上可接受的剂型同时或依次给予，或以含有一种以上的治疗药物的制剂形式给予，或以单一药物和多种药物配方的形式给予。不论何种给予途径，这些药物组合形成含抗HCV有效量的药学上可接受的制剂组分。
近年来能获得的可用于本发明方法中的许多免疫调节和免疫刺激剂包括：AA-2G；金刚酰胺二肽；腺苷脱氨酶；Enzon佐剂，Alliance；佐剂Ribi；Vaxcei佐剂；Adjuvax；agelasphin-11；AIDS治疗药物，Chiron；algal葡聚糖，SRI；alganunulin，Anutech；红宝方(Anginlyc)；抗细胞因子，Yeda；抗皮质素；抗胃泌素-17免疫原，Ap；抗原输送系统，Vac；抗原制剂，IDBC；抗GnRH免疫原，Aphton；Antiherpin；阿比朵尔(Arbidol)；azarole；Bay-q-8939；Bay-r-1005；BCH-1393；Betafectin；必思添(Biostim)；BL-001；BL-009；Broncostat；Cantastim；CDRI-84-246；头孢地嗪(cefodizime)；驱化因子抑制剂，ICOS；CMV肽，City of Hope；CN-5888；细胞因子释放剂，St；DHEAS，Paradigm；DISC TA-HSV；J07B；I01A；I01Z；二硫卡钠(ditiocarb Sodium)；ECA-10-142；ELS-1；内毒素，Novartis；FCE-20696；FCE-24089；FCE-24578；FLT-3配体，Immunex；FR-900483；FR-900494；FR-901235；FTS-Zn；G-蛋白，Cadus；gludapcin；磺乙谷酰胺(glutaurine)；糖磷肽；GM-2；GM-53；GMDP；生长因子疫苗，EntreM；H-BIG，NABI；H-CIG，NABI；HAB-439；幽门螺杆菌疫苗；疱疹特异性免疫因子；HIV治疗，Uniter Biomed；HyperGAM+CF，ImmuMax；Immun BCG；免疫治疗，Connective；免疫调节剂，Evans；免疫调节剂，Novacell；imreg-1；imreg-2；Indomune；肌苷(pranobex)；干扰素，Dong-A(α-2)；干扰素，Genentech(γ)；干扰素，Novartis(α)；白介素-12，Genetics Inc；白介素-15，Immunex；白介素-16，Research Cor；ISCAR-1；J005X；L-644257；licomarasminic acid；LipoTher；LK-409，LK-410；LP-2307；LT(R1926)；LW-50020；MAF，Shionogi；MDP衍生物，Merck；甲硫氨酰-脑啡肽(met-enkephalin)，TNI；甲基呋喃基丁内酯；MIMP；米立司亭(mirimostim)；混合细菌疫苗，Tem，MM-1；moniliastat；MPLA，Ribi；MS-705；莫拉丁酯(murabutide)；marabutide；Vacsyn；胞壁酰二肽衍生物；胞壁酰二肽衍生物myelopid；-563；NACOS-6；NH-765；NISV，Proteus；NPT-16416；NT-002；PA-485；PEFA-814；肽，Scios；肽聚糖，Pliva；Perthon，AdvancedPlant；PGM衍生物，Pliva；药物提案No.1099；No.1426；No.1549；No.1585；No.1607；No.1710；No.1779；No.2002；No.2060；No.2795；No.3088；No.3111；No.3345；No.3467；No.3668；No.3998；No.3999；No.4089；No.4188；No.4451；No.4500；No.4689；No.4833；No.494；No.5217；No.530；pidotimod；pimelautide；pinafide；PMD-589；podophyllotoxin，Conpharm；POL-509；poly-ICLC；poly-ICLC，Yamasa Shoyu；PolyA-PolyU；多糖A，蛋白质A，Berlux Bioscience；PS34W0；Pseudomonas Mabs，Teijin；Psomaglobin；PTL-78419；Pyrexol；pyriferone；Retrogen；Retropep；RG-003；Rhinostat；rifamaxil；RM-06；Rollin；罗莫肽(romurtide)；RU-40555；RU-41821；风疹抗体，ResCo；S-27649；SB-73；SDZ-280-636；SDZ-MRL953；SK & F-107647；SL04；SL05；SM-4333；可溶性免疫球蛋白(Solutein)；SRI-62-834；SRL-172；ST-570；ST-789；staphage裂解液；刺激子(Stimulon)；抑制素(suppressin)；T-150R1；T-LCEF；他比劳肽(tabilautide)；temuritide；Theradigm-HBV；Theradigm-HBV；Theradigm-HSV；THF，Pharm & Upjohn；THF，Yeda；thymalfasin；thymic hormone fractions；thymocartin；thymolymphotropin；胸腺五肽(thymopentin)；胸腺五肽同类物；胸腺五肽，Peptech；胸腺素组分5α；胸腺刺激素，胸腺曲南(thymotrinan)；TMD-232；TO-115；转移因子，Viragen；促吞噬素(tuftsin)，Selavo；乌苯美司(ubenimex)；Ulsastat；ANGG-；CD-4+；Collag+；COLSF+；COM+；DA-A+；GAST-；GF-TH+；GP-120-；IF+；IF-A+；IF-A-2+；IF-B+；IF-G+；IF-G-1B+；IL-2+；IL-12+；IL-15+；IM+；LHRH-；LIPCOR+L LYM-B+；LYM-NK+；LYM-T+；OPI+；PEP+；PHG-MA+；RNA-SYN-；SY-CW-；TH-A-I+；TH-5+；TNF+；UN。
可用于本发明的代表性核苷和核苷酸化合物包括但不限于：(+)-顺式-5-氟-1-[2-(羟甲基)-[1，3-氧硫烷-5-基]胞嘧啶；(-)-2′-脱氧-3′-硫代胞苷-5′-三磷酸盐(3TC)；(-)-顺式-5-氟-1-[2(羟甲基)-[1，3-氧硫烷-5-基]胞嘧啶(FTC)；(-)2′，3′二脱氧-硫代胞苷[(-)-SddC]；1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)-5-碘代胞嘧啶(FIAC)；1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)-5-碘代胞嘧啶三磷酸(FIACTP)；1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)-5-甲基尿嘧啶(FMAU)；1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷-1，2，4-三唑-3-酰胺；2′，3′-二脱氧-3′-氟-5-甲基-脱氧胞苷(FddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氯-5-甲基-脱氧胞苷(ClddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氨基-5-甲基-脱氧胞苷(AddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氟-5-甲基-胞苷(FddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氯-5-甲基-胞苷(ClddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氨基-5-甲基-胞苷(AddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氟胸苷(FddThd)；2′，3′-二脱氧-β-L-5-氟胞苷(β-L-FddC)；2′，3′-二脱氧-β-L-5-硫代胞苷；2′，3′-二脱氧-β-L-5-胞嘧啶(β-L-ddC)；9-(1，3-二羟基-2-丙氧甲基)鸟嘌呤；2′-脱氧-3′-硫代-5-氟胞苷；3′-氨基-5-甲基-脱氧胞苷(AddMeCyt)；2-氨基-1，9-[2-羟甲基-1-(羟甲基)乙氧基]-6H-嘌呤-6-酮(更昔洛韦gancyclovir)；2-[2-(2-氨基-9H-嘌呤-9y)乙基]-1，3-二乙酸丙二酯(法昔洛韦famciclovir)；2--氨基-1，9二氢-9-[(2-羟基-乙氧基)甲基]-6H-嘌呤-6-酮(无环乌苷)；9-(4-羟基-3-羟甲基-丁-1-基)鸟嘌呤(戊昔洛韦)；9-(4-羟基-3-羟甲基-丁-1-基)-6-脱氧-二乙酸鸟嘌呤(法昔洛韦)；3′-叠氮-，3′-脱氧胸苷(AZT)；3′-氯-5-甲基-脱氧胞苷(ClddMeCyt)；9-(2-磷酰-甲氧乙基)-2′，6′-二胺嘌呤-2′，3′-二脱氧核糖甙；9-(2-磷酰-甲氧乙基)腺嘌呤(PMEA)；无环乌苷三磷酸(ACVTP)；D-碳环-2′-脱氧鸟苷(CdG)；二脱氧-胞苷；二脱氧-胞嘧啶(ddC)；二脱氧鸟嘌呤(ddG)；二脱氧肌苷(ddl)；E-5-(2′-溴乙烯)-2′-三磷酸脱氧尿苷；氟-阿拉伯呋喃糖苷-碘代尿嘧啶；1-(2′-脱氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)-5-碘代-尿嘧啶(FIAU)；司他夫定；9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷-9H-嘌呤-6-一水合氨基(Ara-A)；9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷-9H-嘌呤-6-氨基-5-一水合单磷酰(Ara-AMP)；2′-脱氧-3′-硫-5-氟胞苷；2′，3′二脱氧-鸟嘌呤；和2′，3′二脱氧-鸟苷。
制备用于本发明核苷和核苷酸的合成方法是本领域熟知的，见ActaBiochim Pol，43，25-36(1996)；Swed，Neuleosides Nuleotides 15：361-378(1996)；Synthesis 12，1465-1479(1995)；Carbohyd.Chem.27，242-276(1995)；Chena Nucleosides Nucleotides 3，421-535(1994)；Ann.Reports in Med.Chena，Academic Press；和Exp.Opin.Invest.Drugs 4：95-115(1995)。
上述参考文献中描述的化学反应通常公开了它们在制备本发明化合物中的广泛用途。偶尔，在本文所述化合物范围中某一种化合物不能如所述应用这些反应。该领域技术人员不难识别这些化合物。此时本领域技术人员知道可按常规修改来成功进行这些反应，如对干扰基团采用合适的保护，换成另外的常规试剂，常规修改反应条件等，或用本文公开的或常规的其它反应来制备本发明的相应化合物。所有的制备方法，所有的起始材料是已知的或不难从已知的起始材料制备。
虽然一般采用核苷同类物作为抗病毒药物，但核苷酸(磷酸核苷)有时不得不转变成核苷以有利于它们转运通过细胞膜。经化学修饰能够进入细胞的一个核苷酸例子是S-1-3-羟基-2-磷酰甲氧丙基胞嘧啶(HPMPC，Gilead Sciences)。本发明所用的酸形式的核苷和核苷酸化合物可形成盐。示例包括但不限于碱金属盐或碱土金属盐，如钠、钾、钙或镁盐，或其有机碱或碱性季胺盐形成的盐。
本领域技术人员也能选择给予细胞色素P450单氧合酶抑制剂。这类抑制剂可用于提高受细胞色素P450抑制的化合物的肝浓度和/或血浓度。
如果本发明的实施方式包括CYP抑制剂，可在本发明方法中采用任何能改进相关NS3/4A蛋白酶药物动力学的CYP抑制剂。这些CYP抑制剂包括但不限于：利托那韦(WO 94/14436)、复方酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、环孢素、氟甲噻唑、西米替汀、伊曲康唑、氟康唑、咪康唑、氟戊肟胺、氟西汀、奈法唑酮、舍曲林、吲哚那韦、奈非那韦、安朴瑞那韦、氟彬朴瑞那韦、甲磺酸沙喹那韦、罗比那韦、地那韦定、红霉素、VX-944和VX-497。优选的CYP抑制剂包括利托那韦、复方酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、环孢素和氟甲噻唑。利托那韦的优选剂型见美国专利6,037,157和本文引用的文献：美国专利5,484,801；美国专利申请08/402690和国际申请WO 95/07696和WO 95/09614)。
检测化合物抑制细胞色素P50单氧合酶活性的方法是已知的(见美国6,037,157和Yun等，Drug Metabolism & Disposition，第21卷，403-407页，(1993)。
与本发明方法联合治疗时，可以低于本领域常规剂量的剂量给予免疫调节剂、免疫刺激剂和其它药物。例如，干扰素α在治疗HCV感染的病人时通常给予的剂量是每人约1×106-10×106单位，每周三次(Simon等，Hepatology，25：445-448，1997)。本发明方法和组合物中，此剂量范围可以是每人约0.1×106-7.5×106单位，每周三次，更优选每人约0.5×106-5×106单位，每周三次，最优选每人约1×106-3×106单位，每周三次。由于存在本发明HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂时能增强免疫调节剂、免疫刺激剂或其它抗HCV药物抗丙肝病毒的效果，故可考虑减少本文所述方法和组合物中所用的免疫调节剂/免疫刺激剂的用量。同样的，由于存在免疫调节剂和免疫刺激剂时能增强本发明HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂抗丙肝病毒的效果，故可考虑减少本文所述方法和组合物中所用的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂。所需减少的量可通过常规监测接受治疗的感染病人中丙肝病毒的滴度来确定。这可通过，例如用槽印迹(slot-blot)、点印迹(dot-blot)或RT-PCR技术监测病人血清的HCV RNA来进行，或测定HCV表面抗原或其它抗原。在用本文所述的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和其它具有抗HCV活性的化合物，例如核苷和/或核苷酸抗病毒药物联合治疗时，可同样监测病人，以确定联用时各药物的最低有效量。
在本文所述联合治疗方法中，给予病人核苷或核苷酸抗病毒化合物、或其混合物的剂量范围是每人每天约0.1mg-500mg，优选每人每天约10mg-300mg，更优选每人每天约25mg-200mg，再优选每人每天约50mg-150mg，最优选每人每天约1mg-50mg。
给予病人的化合物剂量可以是单剂量或适当比例的剂量。后者的单位剂量组合物可含有组成每日剂量的多个分剂量。每天的多个剂量也可增加，达到该病人处方药所需的每日总剂量。
用本发明化合物和/或组合物治疗HCV感染病人的方案可视多种因素选择，包括病人的年龄、体重、性别、饮食和医疗情况、感染的严重程度、给药途径、对所用具体化合物的药理学考虑，如活性、效力、药物动力学和毒理学模式，和是否采用了药物输送系统。通常应连续给予本文所述的药物组合几周至数月或数年直到病毒滴度达到可接受的水平，表明感染已得到控制或根除。可用槽印迹(slot-blot)、点印迹(dot-blot)或RT-PCR技术测定病人血清中的肝炎病毒RNA来常规监测用本文所述药物组合治疗的病人，或测定血清丙肝病毒抗原，如表面抗原以确定治疗的效果。用这些方法连续分析获得的数据可在治疗中修正治疗方案，从而给予组合中各组分的优化剂量，并确定治疗时间。因此可合理地修改整个治疗期间的治疗方案/剂量方案，从而给予组合中各抗病毒化合物的最低剂量，它们加在一起能呈现满意的抗丙肝病毒效果，并且使这类抗病毒化合物的联合给药只持续到成功治疗该感染所需要的时间。
本发明包括本文所述HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂与上述以及与上述类似的具有抗HCV活性的化合物的各种组合，来治疗或预防病人的HCV感染，特别是其HCV感染已发展成对VX-950和其它标准蛋白酶抑制剂治疗具有抗药性的那些病人。例如，一种或多种HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂可与下列化合物联用：一种或多种具有抗HCV活性的干扰素或其衍生物；一种或多种具有抗HCV活性的非干扰素化合物；或一种或多种具有抗HCV活性的干扰素化合物和一种或多种具有抗HCV活性的非干扰素化合物。当联用以治疗或预防人类患者的HCV感染时，可以药学有效量或抗HCV有效量提供上述HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和上述具有抗HCV活性的化合物。当如上所述联用时，依靠它们的叠加作用或协同作用，各自可以亚临床药学有效量或抗HCV有效量提供，即，如与采用药学有效量的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和具有抗HCV活性的化合物相比，单用此剂量时，其完全抑制或减少HCV病毒累积、和/或减少或减轻HCV感染相关病症或症状、或病人病理发展的药学效果降低。此外，本发明包括联用HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和上述具有抗HCV活性的化合物来治疗或预防HCV感染，当这些抑制剂或化合物的一种或多种以药学有效量提供时，由于它们和其它药物具有叠加作用或协同作用，其它药物可以亚临床药学有效量或抗HCV有效量提供。术语“叠加作用”描述两种(或多种)药学活性药物的联合作用，其等于单用各药物作用之和。协同作用是两种(或多种)药学活性药物的联合作用，其大于单用各药物作用之和。
病人症状改善时如有必要可给予维持剂量的本发明化合物、组合物或联用。然后可视症状情况降低给药剂量或次数或同时降低两者，降到能维持病情改善的水平，当症状减轻至所需水平时，应结束治疗。然而如果病情复发，病人可能需要长时间间断治疗。
也应理解对某病人的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性、病人的年龄、体重、总体健康情况、性别、饮食、给药频率(time)、排泄速率、联用药物、主治医师的判断和所治具体疾病的严重程度。活性成分的用量也取决于所述具体化合物和该组合物中是否存在其它抗病毒药物及其性质。
根据另一实施方式，本发明提供治疗病毒(其特征是含有病毒生命周期必须的丝氨酸蛋白酶)感染的病人的方法，所述方法通过给予病人本发明的药学上可接受的组合物。优选该方法用于治疗HCV感染的病人。这种治疗可完全根除病毒感染或减轻其严重程度。更优选所述患者是人类。
在另一实施方式中，本发明的方法还包括给予所述病人抗病毒药物的步骤，优选抗HCV药物。这种抗病毒药物包括但不限于：免疫调节剂如α-、β-和γ-干扰素，peg化干扰素-α化合物和胸腺素；其它抗病毒药物如利巴伟林和金刚乙胺；其它丙肝蛋白酶抑制剂(NS2-NS3抑制剂和NS3-NS4A抑制剂)、HCV生命周期其它靶分子抑制剂包括螺旋酶和聚合酶的抑制剂；内部核糖体进入抑制剂；广谱病毒抑制剂，如IMPDH抑制剂(如VX-497和其它IMPDH抑制剂，见美国专利5,807,876，霉酚酸及其衍生物)；或以上任意的组合。
这些添加的药物可作为单剂型的一部分给予所述病人，该单剂型含有本发明化合物和其它抗病毒药物。或者其它药物作为多剂型的一部分与本发明化合物分开给予，所述其它药物可在包含本发明化合物的组合物之前、一起或之后给予。
在另一实施方式中，本发明提供对意欲给予病人的生物材料预处理的方法，该方法包括使所述生物材料与包含本发明化合物的药学上可接受的组合物接触的步骤。这类生物材料包括但不限于；血液，其组分如血浆、血小板、血细胞亚群等；器官如肾、肝、心、肺等；精子和卵子；骨髓及其组分，和其它要输给病人的液体如盐水、葡萄糖等。
根据另一实施方式，本发明提供处理材料的方法，所述材料可能会与以病毒生命周期必须的丝氨酸蛋白酶为特征的病毒接触。此方法包括使所述材料与本发明化合物接触的步骤。此类材料包括但不限于：手术器材和包裹材料、实验室器材和包裹材料、血液收集装置和材料，以及侵入性装置如分流管、支撑管等。
另一实施方式中，可利用本发明化合物作为实验工具来帮助分离病毒编码的丝氨酸蛋白酶。该方法包括以下步骤：提供与固相支持物结合的本发明化合物；在引起所述蛋白酶与所述固相支持物结合的条件下，使所述固相支持物与含有病毒丝氨酸蛋白酶的样品接触；和从所述固相支持物上洗脱所述丝氨酸蛋白酶。此法分离的病毒丝氨酸蛋白酶优选HCVNS3-NS4A蛋白酶。更优选是上述对VX-950和/或BILN 2061治疗有抗药性的突变型HCV NS3-NS4A蛋白酶。这类蛋白酶的例子包括上述SEQ IDNo：2蛋白的156和/或168位具有突变残基(即非野生型)的蛋白酶。
除非另有需要，术语“包含”及其变化形式本文用于指包括所述的元件，但不排除任何其它元件。
可采用技术人员已知的常规技术来实施本发明。这些技术可在已发表的文献中找到，如本领域熟知的标准的重组DNA和分子克隆技术。见例，F M Ausubel，分子生物学现有技术(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc.，Media，PA；Sambrook，J.，Fritsch，E F和Maniatis，T.，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)；ColdSpring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989，和美国专利6,617,156和6,617,130中引用的文献，它们均纳入本文作参考。
实施例
为了更全面了解本发明，提供了以下制备和检测实施例。包括以下实施例是为了展示本发明的某些优选实施方式。本领域技术人员应知实施例所披露的技术遵循了本发明人公开的代表性技术，能很好地实施本发明，故可认为构成了实施本发明的优选模式。然而本领域技术人员也应知借助本文所公开的内容，可对具体实施方式作出许多改变而仍能获得类似结果，但这不脱离本发明的思路和范围。
实施例1：质粒的构建
利用PCR从HCV Con1复制子质粒I377neo/NS3-3′/wt(此研究中重命名为pBR322-HCV-Neo)[V.Lohmann等，Science，285：110-113，1999]获得编码HCV NS3蛋白酶Ala1-Ser181残基的DNA片段(GenBankCAB46913)，将其插入到pBEV11中(S.Chamber等，个人通信)在大肠杆菌中表达含有C末端6个组氨酸标签的HCV蛋白。用PCR为基础的定点突变将对HCV NS3-4A PI的抗药性突变导入此构建物中。为产生含有PI-抗药性突变的HCV复制子，将从HCV Con1复制子产生的1.2-kb HindIII/BstXI片段亚克隆入TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen)中。用PCR将NS3丝氨酸蛋白酶结构域中的PI抗药性突变导入含Hind III/BstX I HCV片段的pCR2.1载体中，将含有突变残基的579-bp BsrGI/BstXI片段亚克隆返回入含有3个适应性突变的第二代Con1复制子质粒pBR322-HCV-Neo-mADE中(见下文)。测序证实了所有的构建物。
实施例2：产生HCV复制子细胞
用Sca I(New England Biolabs)消化Con1亚基因组复制子质粒pBR322-HCV-Neo[Lohmann等，Science，285：110-113，1999]。用T7Mega-script试剂盒(Ambion)从线性化DNA模板产生全长HCV亚基因组复制子RNA，用DNA酶去除模板DNA。将运作后的(run-off)RNA转录物电穿孔引入Huh-7细胞，用含0.25mg/ml或1mg/ml G418(Geneticin)和10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良基础培养基(DMEM)选出稳定的HCV复制子细胞系。将该HCV复制子稳定的细胞维持培养在含10％FBS和0.25mg/ml G418的DMEM中。
产生HCV亚基因组复制子稳定的细胞系过程中，鉴定到适应性突变的几种不同模式。一种模式在HCV非结构蛋白质中有3个取代，通过定点突变导入到原初pBR322-HCV-Neo质粒中产生了第二代亚基因组复制子质粒pBR322-HCV-Neo-mADE。用T7从ScaI-线性化的pBR322-HCV-Neo-mADE质粒转录出的RNA转录物经电穿孔引入Huh7细胞中，形成稳定的复制子细胞克隆的效率比原初Con1复制子RNA高得多。将此研究鉴定到的抗药性突变用定点突变引入到pBR322-HCV-Neo-mADE复制子质粒中。用野生型pBR322-HCV-Neo-mADE或含有抗药性突变的质粒衍生的T7转录物产生了稳定的复制子细胞系。
实施例3：HCV复制子细胞试验方案
将含丙肝病毒(HCV)复制子的细胞维持培养在含10％胎牛血清(FBS)、0.25mg/ml G418和适当添加物的DMEM(培养基A)中。
第一天，用胰酶：EDTA混合物处理复制子细胞单层，除去该混合物，将培养基A稀释至最终浓度100,000个细胞/ml，取100微升10000个细胞接种96孔组织培养板的各孔，在37℃组织培养箱中培养过夜。
第二天，用含适当添加物的2％FBS，0.5％DMSO的DMEM(培养基B)系列稀释化合物(先溶在100％DMSO中)。所有系列稀释液的DMSO最终浓度维持于0.5％。
吸去复制子细胞单层上的培养基，然后加入含各种浓度化合物的培养基B。其它孔中加入无化合物的培养基B作为无化合物对照。
在37℃组织培养箱中以含化合物或0.5％DMSO的培养基B培养细胞48小时。48小时培养结束时去除培养基，用PBS洗涤复制子细胞单层一次，-80℃保存以备RNA抽提。
解冻含处理的复制子细胞单层的培养板，各孔细胞中加入固定量的其它的RNA病毒，如牛腹泻病毒(BVDV)。立即在细胞中加入RNA抽提试剂(如RNeasy试剂盒中的试剂)避免RNA降解。按加以改进来提高抽提效率和一致性的厂商说明提取总RNA。最后洗脱含有HCV复制子RNA的细胞总RNA，-80℃保存以备下一步加工。
用两组特异性引物和探针进行Taqman实时RT-PCR定量试验。一组检测HCV，另一组检测BVDV。将得自处理的HCV复制子细胞的总RNA提取物加入到PCR反应中，用同一个PCR孔定量测定HCV和BVDV RNA两者。根据各孔的BVDV RNA水平标记和排除失败的实验。各孔中的HCVRNA水平按同一块PCR板产生的标准曲线计算。用DMSO或无化合物对照作为0％抑制，计算出因化合物处理而使HCV RNA水平受抑制或降低的百分比。化合物的细胞毒性用线粒体酶为基础的细胞活力试验，CellTiter96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)检测。IC50(观察到HCV RNA水平50％受抑制时的浓度)和CC50(观察到细胞活力50％降低时的浓度)值根据某给定化合物用4参数曲线拟合(SoftMax Pro)产生的滴度曲线计算。
实施例4：HCV PI抗药性复制子细胞的选择
存在0.25mg/ml G418和缓慢递增浓度的VX-950(A系列)、BILN2061(B系列)或VX-950和BILN 2061联用(C、D和E系列)时，系列传代HCV Con1亚基因组稳定复制子细胞。48小时试验(见上)中，VX-950的浓度为3.5μM(或10×IC50)-28μM(或80×IC50)。对于BILN 2061，起始浓度为80nM(80×IC50)，最终浓度为12.5μM(12,500×IC50)。选择期间，当达到70-90％铺满时将复制子细胞一分为二每周两次。不论细胞是否分培，每3-4天加入新鲜的HCV PI。
实施例5：鉴定HCV PI抗药性突变
选择HCV PI-抗药性复制子细胞期间，每次分培细胞培养物时收集细胞沉淀。用RNeasy mini-prep试剂盒(Qiagen)抽提细胞总RNA。用如下HCV-特异性寡核苷酸对(5′-CCTTCTACGCCTTCTTG-3′，SEQ ID No：3)和(5′-CTTGATGGTCTCGATGG-3′，SEQ ID No：4)以Titan One-StepRT-PCR试剂盒(Roche Applied Science)扩增含有HCV NS3丝氨酸蛋白酶区域的1.7kb长的cDNA片段。用QIA-quick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化扩增的产物。为监测选择期间HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域中是否出现HCV PI相关突变，对几个不同培养时间点PI-处理复制子的纯化的1.7kb RT-PCR产物测序。为测定PI-抗药性突变的频率，将VX-950或BILN2061-抗药性复制子细胞的HCV RNA的1.7kb RT-PCR产物连接于TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。每一时间点分离多个细菌单菌落，测定纯化的质粒DNA的HCVNS3蛋白酶编码区序列。
实施例6：表达和纯化HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域
将含有野生型序列或抗药性突变(A156S、D168V或D168A)的HCVNS3丝氨酸蛋白结构域的各表达构建物转化入BL21/DE3pLysS大肠杆菌细胞(Stratagene)。在添加有100μg/ml羧苄青霉素和35μg/ml氯霉素的BHI培养基(Difco Laboratories)中37℃培养新转化的细胞至600nm光密度为0.75。24℃用1mM IPTG诱导4小时。离心收集细胞，-80℃速冻然后纯化蛋白质。所有纯化步骤在4℃进行。为纯化各HCV NS3蛋白酶，取100克沉淀的细胞用1.5L缓冲液A{50mM HEPES，pH8.0，300mM NaCI，0.1％正-辛基-β-D-葡糖吡喃糖苷，5mMβ-巯基乙醇，10％(v/v)甘油}裂解，搅拌30分钟。裂解物用微流体仪(Microfluidics，Newton，MA)匀浆，然后54,000xg超离心45分钟。上清液中加入咪唑至最终浓度5mM，和2ml预先用含5mM咪唑的缓冲液A平衡的Ni-NTA树脂。振荡混合物3小时，用20柱体积的缓冲液A和5mM咪唑洗涤。振荡混合物3小时，用20柱体积的缓冲液A和5mM咪唑洗涤。用含300mM咪唑的缓冲液A洗脱HCV NS3蛋白。浓缩洗脱液，加到用缓冲液A预平衡的Hi-Load 16/60Superdex 200柱上。合并适当的纯化HCV蛋白组分，-80℃保存。
实施例7：HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域的酶活性试验
A HPLC酶活性试验方案
微量HPLC法分离5AB底物和产物
底物：
NH2-Glu-Asp-Vai-Val-(α)Abu-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr-COOH
用DMSO w/0.2M DTT制备20mM 5AB贮存液(或浓度自选)。等份分装-20℃保存。
缓冲液：50mM HEPES，pH7.8；20％甘油；100mM NaCI
试验总体积为100微升。
  X1μl   试验中的浓度
  缓冲液   86.5   见上
  5mM KK4A   0.5   25μM
  1M DTT   0.5   5mM
  DMSO或抑制剂   2.5   2.5％v/v
  50μM tNS3   0.05   25nM
  250μM 5AB(起始)   20   25μM
混合缓冲液、KK4A、DTT和tNS3；96孔板各孔中分别加入78μL。30℃培育～5-10分钟。
将2.5μl合适浓度的测试化合物溶于DMSO(对照只有DMSO)，加到各孔中。室温培育15分钟。
加入20μL 250μM的5AB底物(25μM浓度等于或略低于5AB的Km)起始反应。30℃培育反应物20分钟，然后加入25μL 10％TFA中止反应。将最终反应产物120μL等份转移到HPLC小瓶中。用下述方法使SMSY产物与底物和KK4A分离。
微分离法：
仪器：Aglient 1100
脱气仪G1322A
双元泵G1312A
自动采样器G1313A
柱恒温室G1316A
Diode阵列检测仪G1315A
柱：Phenomenex Jupiter；5微米C18；300；150×2mm；P/O00F-4053-B0。
柱温：40℃
注射体积：100微升
溶剂A＝HPLC级水+0.1％TFA
溶剂B＝HPLC级乙腈+0.1％TFA
  时间(分)   ％B   流速(毫升/分钟)   最大压力
  0   5   0.2   400
  12   60   0.2   400
  13   100   0.2   400
  16   100   0.2   400
  17   5   0.2   400
  停止时间：17分钟。后运行时间：10分钟
B FRET酶试验方案
用Taliani等[Taliani等.，Anal Biochem.，240：60-67，1996]所述的试验经改进测定酶活性。从AnaSpec Incorporated(San Jose，CA)购得内部(internally))淬灭荧光肽(FRET的底物)Ac-DED(EDANS)EEαAbuψ[COO]ASK(DABCYL)-NH2。在96孔微滴定板中以连续模式运作试验。缓冲液含50mM HEPES(pH7.8)，100mM NaCI，20％甘油，5mM DTT和25μM KK4A肽(KKGSVVIVGRIVLSGK；SEQ ID No：5)。KK4A肽代表了基因型1a的NS4A辅因子中心区，加入了赖氨酸残基以改善溶解性能[Landro等.，Biochemistry，36：9340-9348，1997]。缓冲液各组分与2nM的NS3蛋白酶室温预培育10分钟后，加入FRET底物启动反应。用MolecularDevices fmax荧光板式读取仪于30℃监测该反应20分钟。激发光与发射光波长分别为355nm和495nm。为测定底物的动力学参数，FRET肽的浓度为0.5-7.0μM，此范围未见到分子间淬灭。将数据与Michaelis-Menten公式拟合测定底物动力学参数Km和Vmax。用上述试验测得酶活性滴度来计算抑制常数(Ki)，除如上所述在先前10分钟预培育后将溶于DMSO(不高于2％v/vDMSO；对照只用溶剂)的化合物加到该缓冲液各组分和酶中。室温再培育该混合物15分钟，然后30℃再与FRET底物培育20分钟。检测了7-8种浓度的化合物，所得数据与Morrison的紧密结合抑制公式的整合形式相符[J F.Morrison，.Biochim Biophys，Acta，185：269-286，1969]。用Marquardt-Levenberg非线性回归与GraphPad Prism软件拟合所有的底物和抑制剂数据。
实施例8：在HCV复制子细胞中产生对VX-950的抗药性
VX-950(图4A，化学结构)是丙肝治疗的临床候选药物。VX-950是HCV NS3·4A丝氨酸蛋白酶的可逆性共价抑制剂。虽然与肽底物竞争活性位点，但由于它的紧密结合性能和时间依赖性抑制机制而呈现明显的非竞争抑制机制(C，Gates和Y-P.Luong)。经实时RT-PCR(Taqman)法测定，HCV Con1亚基因组复制子细胞与VX-950共培育导致HCV RNA的水平呈浓度依赖性下降(图5B)。在48小时试验中，VX-950的IC值为354nM。
为了鉴定VX-950抗药性突变，在有0.25mg/ml G418和逐渐递增浓度的VX-950(系列A)存在下系列传代Con1亚基因组复制子细胞(如亚培养生长)(图5A，选择曲线)。VX-950的起始浓度为3.5μM或IC50浓度的10倍，最高浓度为28μM或IC50的80倍。每3-4天将复制子细胞一分为二或补充培养基，并加入新鲜VX-950。由于VX-950抑制HCV NS3丝氨酸蛋白酶的活性，因而阻断了HCV RNA的复制，高浓度VX-950存在时HCV蛋白和新霉素转移酶蛋白的稳态水平逐渐降低至最终不能测到。G418存在时，含低或无新霉素转移酶蛋白的细胞增殖速率逐渐降低至最终死亡。只有含对VX-950有抗药性突变的HCV RNA可在高浓度VX-950存在时复制并支持含有它们的复制子细胞生长。系列A的复制子细胞在有3.5uM VX-950的情况下前10天生长正常。10天后，系列A细胞生长显著减慢，10-17天之间观察到大量细胞死亡(图5A，选择曲线)。至21天才恢复正常生长。测定了VX-950对系列A复制子细胞的IC50为8.1-12.0μM，比对野生型复制子细胞的IC50(354nM)高23-34倍(图5B，IC50曲线)。
第7、21和56天抽提系列A细胞的胞内总RNA进行RT-PCR，扩增NS3丝氨酸蛋白酶结构域的编码区。测定RT-PCR产物的序列，鉴定可能引起观察到的VX-950敏感性降低的潜在突变位点。最初复制子细胞的野生型HCV蛋白酶的核苷酸和氨基酸序列见SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。第7天，与培养在无VX-950中的野生型Con1复制子细胞相比，系列A复制子细胞的NS3丝氨酸蛋白酶结构域中没有观察到VX-950相关突变。
第21和56天，在系列A中观察到该蛋白酶结构域中Ala156发生取代，提示156残基的突变可能对VX-950敏感性降低是关键性的。在HCV非结构蛋白区中被NS3·4A丝氨酸蛋白酶切割的4个蛋白水解位点任何之一没发现突变。为了弄清楚取代的特性和频率，将第7或98天的系列A复制子细胞的1.7-kb的RT-PCR产物亚克隆到TA载体中，对两个样品的多个克隆测序。第7天样品所产生的所有克隆都含有野生型Ala156。系列A复制子细胞第98天的样品(已在28μM VX-950中培养63天)，79％(或60/76)的克隆含有丙氨酸--＞丝氨酸(A156S)的取代。
此外，在恒定浓度的VX-950和G418中选出了VX-950抗药性细胞。在此种情况下，长时间用VX-950和G418培养后观察到多个抗药性细胞克隆。测定这些抗药性克隆的HCVNS3丝氨酸蛋白酶序列，发现HCV丝氨酸蛋白酶的156位氨基酸发生类似突变。
实施例9：在HCV复制子细胞中产生对BILN 2061的抗药性
已证明另一种HCVNS3·4A蛋白酶抑制剂，BILN 2061(图4B，化学结构)(WO 00/59929；美国6,608,027)治疗丙肝病人有效果(Lamarre等，Nature Medicine，2003)。以类似于VX-950的方法选出对BILN 2061有抗药性的HCV复制细胞(系列B)。同样，在0.25mg/ml G418和缓慢递增浓度的BILN 2061存在时系列传代野生型Con1亚基因组HCV复制子细胞(图6A，选择性曲线)。在存在80nM BILN 2061或超过IC50 80倍时，前7天系列B细胞生长正常。然而7天后系列B细胞增殖显著减慢，7-17天之间观察到大量细胞死亡。和前面一样，直到21天细胞才开始正常生长。BILN 2061对B细胞的IC50值第59天为1.0-1.8μM，比对野生型复制子细胞的IC50值高1,000-1,800倍(图6B，IC50曲线)。
第7天，NS3丝氨酸蛋白酶结构域中没观察到有BILN 2061相关突变。第24天，在NS3蛋白的168位氨基酸观察到各种取代，提示168位残基的取代可能是BILN 2061抗药性的原因。在HCV非结构蛋白区域中被NS3·4A丝氨酸蛋白酶切割的4个位点没观察到突变。为测定NS3 168位残基各种取代的频率，对培养在3.2μM BILN 2061中的第98天的系列B复制子的NS3丝氨酸蛋白酶测序。94个克隆中有60个(或64％)有Asp168--＞Val(D168V)取代，23个克隆(或24％)有Asp168--＞Ala(D168A)突变。
此外，在恒定浓度的BILN 2061和G418中选出了BILN 2061抗药性细胞。在此种情况下，BILN 2061和G418长期培养后观察到多个抗药性细胞克隆。测定这些抗药性克隆的HCV NS3丝氨酸蛋白酶序列，发现类似的HCV丝氨酸蛋白酶的168位氨基酸突变。
实施例10：选择对VX-950和BILN 2061二者有抗药性的复制子细胞
A.从VX-950抗药性细胞产生交叉抗药性HCV复制子
为鉴定对VX-950和BILN 2061二者有交叉抗药性的抗药突变，采用了几种选择方案。首先在有0.25mg/ml G418，14μM VX-950和缓慢递增浓度的BILN 2061时(系列C，图8A)系列传代VX-950抗药性复制子细胞系[系列A，C.Lin等，J Biol Chem，279：17508-14，2004]。BILN 2061的起始浓度为40nM，最终浓度为6.4μM。每3或4天将复制子细胞一分为二或补充培养基，加入新鲜的VX-950和BILN 2061。因为HCV PI抑制NS3·4A丝氨酸蛋白酶的活性继而阻断HCV RNA的复制，存在高浓度HCVPI时，HCV蛋白和新霉素转移酶蛋白的稳态水平逐渐降低最后检测不到(数据未显示)。存在G418时含少量或不含新霉素转移酶蛋白的细胞增殖速度逐渐降低至最终死亡。预计含重要VX-950抗药性突变A156S的复制子细胞在BILN 2061浓度递增情况下将死亡，因为已证明其对BILN 2061的抑制作用敏感[C.Lin等，J Biol Chem，279：17509-14，2004]。只有含VX-950和BILN 2061交叉抗药性突变的HCV RNA在高浓度的两种HCVPI存在时能复制并支持含该突变的复制子细胞的生长。然而，系列C的复制子细胞在整个选择过程中生长正常，持续56天。测得的BILN 2061对第52天的系列C复制子细胞的IC50值为大约3μM，比对系列A(VX-950抗药性)复制子细胞(约10μM)的高300倍(图8B)。因为52天时30μM的VX-950不能使系列C复制子细胞的HCV RNA减少50％以上，故未能测定VX-950的真正IC50值，表明52天时系列C复制子细胞对VX-950仍有抗药性(图8C)。
提取存在14μM VX-950和0.32μM BILN 2061时培养的第32天的系列C细胞的总细胞RNA作RT-PCR，扩增NS3丝氨酸蛋白酶结构域的编码区。测序RT-PCR产物以鉴定可能引起所见到的对两种HCV PI敏感性降低的潜在突变位置。观察到该蛋白结构域中Ala156发生取代，提示156位残基的突变可能对两种PI敏感性的降低是关键性的。此观察有点出乎意料，因为A156S是VX-950的主要(major)抗药性突变[C.Lin等，J BiolChem，279：17508-175114，2004]。在NS3/4A丝氨酸蛋白酶切割的HCV非结构蛋白区域中的4个蛋白水解位点没发现突变。为了说明这些取代的特性和频率，将第32天系列C复制子细胞的1.7kbTR-PCR产物亚克隆到TA载体中，对10个单菌落测序。6个克隆有Ala156--＞Thr(A156T)取代，3个克隆的Ala156被Val取代(A156V)。第10个克隆仍然是A156S突变。
B.从BILN 2061抗药性细胞产生交叉抗药性HCV复制子
第二种选择方案是在有VX-950和BILN 2061时培养BILN 2061抗药性细胞。此时，在有0.25mg/ml G418和缓慢递增浓度的VX-950和BILN2061条件下系列传代BILN 2061抗药性复制子细胞系[系列B，C.Lin等，J.Biol.Chem，279：17508-17514，2004](系列D，图9A)。BILN 2061的起始浓度为160nM，最终浓度为6.4μM。VX-950只用两种浓度：7μM和14μM。具有主要(major)BILN 2061抗药性突变D168V或D168A的复制子细胞预计在高浓度VX-950时将死亡，因为已证明它们对VX-950的抑制作用敏感[C.Lin等，J.Biol.Chem.279：17508-17514，2004]。同样，只有含VX-950和BILN 2061交叉抗药性突变的HCV RNA在高浓度的两种HCV PI存在时能复制并支持含该突变的复制子细胞生长。然而，系列D的复制子细胞在选择过程的大部分时间中生长正常，也持续56天。因为30μM的VX-950不能使52天的系列D复制子细胞的HCV RNA减少50％以上，故未能测定VX-950的真正IC50值，但其比对系列B(BILN 2061抗药性)复制子细胞的IC50(约0.3μM)至少高100倍(图9B)。测得的BILN 2061对52天的系列D复制子细胞的IC50值约为4μM，表明52天时系列D复制子细胞对BILN 2061仍有抗药性(图9C)。
提取在有14μM VX-950和0.32μM BILN 2061时培养的第32天系列D细胞的总细胞RNA作RT-PCR，扩增NS3丝氨酸蛋白酶结构域的编码区。测序RT-PCR产物以鉴定可能引起所见到的对两种HCV PI敏感性降低的潜在突变位置。也观察到该蛋白结构域中Ala156发生取代，证实156位残基的突变可能对两种PI敏感性的降低是关键性的。在NS3·4A丝氨酸蛋白酶切割的HCV非结构蛋白区域中的4个蛋白水解位点均没发现突变。为了说明这些取代的特性和频率，将第32天系列A复制子细胞的1.7kbTR-PCR产物亚克隆到TA载体中，对14个单菌落测序。12个克隆有A156V取代，而1个克隆有A156T突变。第14个克隆有两种突变，A156S和D168V。
C.从原初复制细胞产生交叉抗药性HCV复制子
在我们先前对单个HCV PI，VX-950或BILN 2061的抗药性突变研究中，细胞生长延迟了几天，期间观察到大量细胞死亡[C.Lin等，J.Biol.Chem.279：17508-17514，2004]，这表明出现了抗药性突变复制子细胞，而同时无抗药性复制子死亡。然而，在选择上述交叉抗药性复制子系列C或D时没有观察到这种细胞死亡或细胞生长延迟。可能抗药性复制子细胞VX-950(系列A)或BILN 2061(系列B)细胞中已存在有小群交叉抗药性突变A156T和A156V。如果是这样，相对于其它潜在的交叉抗药性突变，这两种选择方案更倾向于A156T或A156V突变。因此采用了只对两种抑制剂之一敏感的天然HCV复制子细胞来进行第三种选择方案。
在有0.25mg/ml G418和缓慢递增浓度的VX-950和BILN 2061中系列传代衍生自pBR322-HCV-Neo-mADE的Con1亚基因组复制子细胞(系列E)[C.Lin等，J.Biol.Chem.279：17508-17514，2004](图10)。VX-950起始浓度为3.5μM，最高浓度为14μM。BILN 2061的起始浓度为80nM，最终浓度为3.2μM。每3或4天将复制细胞一分为二或补充培养基，加入新鲜的VX-950和BILN 2061。在有3.5μM VX-950和160nM BILN 2061时，前10天系列E的复制子细胞生长正常。10天后系列E细胞生长显著减慢，10-21天之间观察到大量细胞死亡(图10)。直到21天才生长正常。提取第10、21和48天时系列C细胞的总细胞RNA作RT-PCR，扩增NS3丝氨酸蛋白酶结构域的编码区。与在缺少两种HCV PI条件下培养的野生型Con1复制子细胞相比，第10天系列E复制子细胞的NS3丝氨酸蛋白酶结构域中未观察到HCV PI相关突变。为了说明这些取代的特性和频率，将第21天或48天系列E复制子细胞的1.7kb RT-PCR产物亚克隆到TA载体中，对两种样品的多个克隆测序。在已经3.5μM VX-950和0.32μMBILN 2061培养14天的系列E复制子细胞21天的样品中，65％(或46个克隆有30个)有Ala156--＞Thr(A156T)取代，而35％(或46个克隆有16个)中发现另一种取代：Ala156被Val取代(A156T)。在已经14μM VX-950和1.6μM BILN 2061培养14天的系列E复制细胞的48天样品中，80％(或44个克隆有35个)克隆有A156T取代，而20％(或44个克隆有9个)发现A156V取代。这两种情况下，在10％以上的TA质粒克隆中没发现NS3丝氨酸蛋白酶结构域中有其它突变，表明A156T和A156V是赋予对VX-950和BILN 2061的交叉抗药性的唯一两种突变。
实施例11：用酶试验和复制子细胞试验证明和验证氨基酸156或168的抗药性突变
为验证Ala156或Asp168中所观察到的突变是否足够赋予分别对VX-950或BILN 2061的抗药性，分别利用定点突变将各突变引入野生型NS3蛋白酶结构域的156或168位置。
定点特异性突变是用于制备本发明方法所用的突变蛋白酶的另一种技术。此技术采用了对目标(underlying)DNA(其编码需修饰的氨基酸序列)的特异性突变。此技术也能制备和测试序列变异，通过在DNA中引入一种或多种核苷酸序列变化而掺入一种或多种上述突变。定点特异性突变是通过利用编码所需突变的DNA序列以及足够数量的毗连核苷酸、足够大小和序列复杂性的引物序列而能在横越缺失区的两侧形成稳定的双链体的特异性寡核苷酸序列来产生突变。通常引物宜长约17-25个核苷酸，含待改变序列两侧连接区的约5-10个残基。
该技术一般采用单链或双链形式的噬菌体载体。通常用于定点突变的载体包括M13噬菌体载体。这些噬菌体载体可从市场上购买到，其用法也是本领域技术人员知道的。一般，定点突变中也采用双链质粒，这可省去将目的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。
通常进行定点突变先要获得单链载体，或将含有编码所需蛋白质的DNA序列的双链载体的两条链解链。用合成方法制备携带有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后使该引物与该单链DNA制备物退火结合，选择杂交条件的时候应考虑错配程度，用DNA聚合酶(如大肠杆菌聚合酶IKlenow片段)来完成含突变链的合成。因此形成的杂合双链体中的一条链编码原先的无突变序列，而第二条链带有所需突变。然后用此杂合双链体载体转化合适的细胞，如大肠杆菌细胞，选择含有携带该突变序列的重组载体的克隆。
当然，上述定点突变法不是产生潜在有用的突变蛋白酶的唯一方法，也不意味着限于此方法。本发明还考虑其它获得突变的方法，如用诱变剂如羟胺处理携带有目的基因的重组载体来获得序列变异。
A.显性VX-950抗药性突变A156S仍然对BILN 2061敏感
为验证所观察到的Ala156被Ser取代是否足够赋予对VX-950而非BILN 2061的抗药性，利用定点突变在野生型NS3蛋白酶结构域中用Ser取代了Ala156。
在我们的试验条件下，基因型1a和1b的野生型NS3蛋白酶结构域对FRET底物的动力学参数相同(表1)。虽然NS4A肽协同因子得自HCV基因型1a，但发现动力学参数之间无可见区别。这与分子模型一致，提示基因型1a和1b之间NS4A中心区内的保守性变异不影响NS4A核心肽与NS3蛋白酶结构域之间的相互作用。利用基因型1a和1b野生型蛋白酶测定了VX-950和BILN 2061的Ki值，这两种野生型蛋白酶之间无统计学显著差异(表2)。
A156S突变蛋白酶的FRET底物动力学参数实际上与野生型蛋白酶的相同(表1)。然而，VX-950对A156S突变蛋白酶的Ki值为2.9μM，比对野生型蛋白酶的(0.1μM)高29倍(表2)。BILN 2061对A156S的Ki值为112nM，比对野生型蛋白酶(19nM)高6倍(表2)。
含A156S取代的复制子细胞的HCV RNA水平与野生型复制子细胞相似(数据未显示)，这与A156S突变和野生型NS3丝氨酸蛋白酶具有相似的酶催化活性相一致。VX-950对A156S复制子细胞的IC50值为4.65μM，比对野生型复制子细胞的(0.40μM)高12倍(表3)。BILN 2061对A156S(7nM)和野生型复制子细胞(4nM)的IC50值之间无显著差异(表3)。
B.主要BILN 2061抗药性突变D168V和D168A仍然对VX-950完全敏感
为验证所观察到的Asp168被Val或Ala取代是否足够赋予对BILN2061而非VX-950的抗药性，利用定点突变在野生型NS3蛋白酶结构域中用Val或Ala取代了Asp168。
如野生型和两种突变型NS3丝氨酸蛋白酶的kcat和kcat/Km值比较(表1)所示，D168V突变不影响底物动力学参数，而D168A突变只表现出微小改变(不到10倍)。类似地，Asp168的突变对VX-950的Ki值没观察到显著影响(表2)。然而，168位缬氨酸或丙氨酸取代天冬氨酸导致突变型NS3蛋白酶不受高达1.2μM BILN 2061的抑制(表2)。这些数据表明，与野生型蛋白酶相比，突变型蛋白酶对BILN 2061的敏感性至少低63倍。因为BILN 2061在试验用缓冲液中浓度高于1.2μM时不溶，用650nm吸光度测定不能测到其真正的抗药性等级。还通过定点突变将D168V或D168A突变引入野生型复制子细胞，产生了携带这两种取代之一的稳定复制子细胞系。BILN 2061对D168V复制子细胞的IC50为5.09μM，比对野生型复制子细胞的(4nM)高1300倍(表3)。BILN 2061对D168A突变复制子细胞的IC50为1.86μM。VX-950对D168V和野生型复制子细胞的IC50值几乎不变(表3)。
表1显示野生型或突变型HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域的酶学性能特征。按材料和方法中所述，表达和纯化了5个HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域蛋白质，包括基因型1a和1b野生型(wt)蛋白酶和基因型1b的3个突变(A156S、D168V和D168A)。用KK-NS4A核心肽和FRET底物测定了这些NS3蛋白酶的kcat和Km值。
表1.野生型或突变型HCV NS3丝氨酸蛋白酶的酶学特征
  HCV蛋白酶   Km(μM)   Kcat(s-1)   Kcat/Km(M-1S-1)
  Wt(1a)   1.3   1.2   8.97×105
  Wt(1b)   1.1   1.0   9.47×105
  A156S(1b)   0.9   0.6   6.64×105
  D168V(1b)   1.2   0.6   4.98×105
  D168A(1b)   2.0   0.3   1.50×105
表2表示酶试验中对抗药性的证实。用KK-NS4A肽和FRET底物，测定了VX-950和BILN 2061对5种纯化的HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域的Ki值，包括基因型1a或1b的野生型(wt)蛋白酶以及基因型1b的3种突变A156S、D168V和D168A的Ki值。BILN 2061在反应缓冲液中的溶解度不超过1.2μM。在有1.2μM BILN 2061时对D168V或D168A突变型NS3蛋白酶均未观察到抑制。
表2.VX-950和BILN 2061对野生型和突变型NS3蛋白酶的Ki值
  Ki(μM)
  突变   BILN 2061   VX-950
  Wt(1a)   0.006   0.047
  Wt(1b)   0.019   0.100
  A156S   0.112   2.9
  D168V   ＞1.2   0.043
  D168A   ＞1.2   0.150
表3表示HCV复制子中抗药性的证实。利用T7 RNA转录从相应的高效Con1复制子质粒产生4个HCV亚基因组复制子稳定细胞系，包括野生型(wt)和3个突变体，A156S、D168V和D168A。以标准48小时试验测定了VX-950和BILN 2061对4个HCV复制子细胞系的的IC50值。
表3.VX-950和BILN 2061对含有野生型和突变型NS3蛋白酶的HCV复制子细胞的IC50值。
  复制子IC50(μM)
  突变   BILN 2061   VX-950
  Wt   0.004   0.402
  A156S   0.007   5.09
  D168V   4.65   0.163
  D168A   1.86   0.193
C.A156T和A156V突变对VX-950和BILN 2061的交叉抗药性
为验证所观察到的Ala突变是否足够赋予对VX-950和BILN 2061两者的交叉抗药性，利用定点突变在野生型NS3蛋白酶结构域中用Val或Thr取代了Ala156。
A156T或A156V突变型蛋白酶对FRET底物的催化效率(kcat/Km)比野生型蛋白酶低约5-7倍(表4)。VX-950对A156T或A156V突变型蛋白酶的Ki值分别为9.9μM或33μM，比对野生型蛋白酶(0.1μM)分别高99倍或330倍(表5)。两种突变型蛋白酶均不受高达1.2μM BILN 2061的抑制(表5)。这些数据表明，与野生型蛋白酶相比，这两种突变型蛋白酶对BILN 2061的敏感性至少低63倍。因为BILN 2061在试验用缓冲液中浓度高于1.2μM时不溶，用650nm吸光度测定不能测到其真正的抗药性等级(数据未显示)。
表4.野生型或突变型HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域的酶特性
 HCV蛋白酶  Km(μM)   Kcat(s-1)   Kcat/Km(M-1，s-1)
 野生型  1.1   1.0   9.47×105
 A156T  1.3   0.2   1.36×105
 A156V  2.6   0.6   2.34×105
表4小结：表达和纯化了Con1病毒株的3个HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域蛋白，包括野生型蛋白酶和2个突变体A156T和A156V。用KK-NS4A核心肽和FRET底物测定了这些NS3蛋白酶的kcat和Km值，显示了两次独立试验的平均值。
           表5.用酶试验证实抗药性
  突变   Ki(μM)
  BILN 2061   VX-950
  野生型   0.019   0.100
  A156T(n＝2)   ＞1.2   9.9
  A156V(n＝1)   ＞1.2   33
表5小结：用KK-NS4A核心肽和FRET底物测定了VX-950和BILN2061对5个纯化的HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域，包括野生型蛋白酶及2个突变体A156T和A156V的Ki值。BILN 2061在反应缓冲液中溶解浓度不超过1.2μM。在有1.2μM BILN 2061时对A156T或A156V突变型NS3蛋白酶均未观察到抑制。
含A156T或A156V取代的复制子细胞中HCV RNA水平比野生型复制子细胞低(数据未显示)，这与这两个突变体的酶催化效率比野生型NS3丝氨酸蛋白酶低相一致。在这两种突变型复制子细胞中未观察到高达30μM的VX-950能显著降低HCV复制子RNA，表明这两种突变之一使敏感性至少降低75倍(表6)。BILN 2061对A156T复制子细胞的IC50值为1.09μM，比对野生型复制子细胞(4nM)高约272倍。对A156V突变型复制子，BILN 2061的IC50值为5.76μM，表明A156V突变使敏感性降低1400多倍。
       表6.证实HCV复制子的抗药性
  突变   复制子IC50(μM)
  BILN 2061   VX-950
  野生型   0.004   0.402
  A156T   1.09   ＞30
  A156V   5.76   ＞30
表6小结：利用T7 RNA转录从相应的高效Con1复制子质粒产生了3个HCV亚基因组稳定复制子细胞系，包括野生型和二个突变体A156T和A156V。以标准的48小时试验测定了VX-950和BILN 2061对这3种HCV复制子细胞系的IC50值，显示了两次独立试验的平均值。
实施例12：模型-I
利用Yao等人发表的全长HCV NS3蛋白结构[Yao等，.Structure FoldDes.7：1353-1363，1999](PDB编号：1CU1)，通过模型将VX-950和BILN2061结合入NS3丝氨酸蛋白酶结构域的活性位点。此结构中A区段的蛋白酶结构域的坐标显示NS3蛋白的C-末端链结合于该蛋白酶的底物结合位点中。此链的羧基末端位于活性位点残基His57、Asp81和Ser139附近，与His57和Ser139的侧链以及(形成氧阴离子穴的)137和139残基的主链酰胺基形成氢键。此外，NS3蛋白的最后6个残基(626-631)沿蛋白酶β桶的E2链边缘形成一伸长的反平行β链，产生了12个主链间氢键。预计产物抑制剂如BILN 2061以类似方式结合NS3蛋白酶。因此，我们利用此晶体结构的坐标构建了我们的抑制剂-蛋白酶共同复合体的模型。以QUANTA分子模型软件(Accelrys Inc.，San Diego，California，USA)构建了BILN 2061分子并手动放置在该活性位点内，使其羧基与全长NS3蛋白的NS3 C-末端羧基重叠。然后旋转此抑制剂分子使其形成下列所有的主链间氢键：P1 NH与Arg155羰基、P3羰基与Ala157NH、和P3NH与Ala157羰基。此结合模型使BILN 2061的大P2基团与Arg155侧链直接冲突。为避免此冲突，按NS3蛋白酶与一抑制剂(BILN 2061的同类物)[Y.S.Tsantrizos，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.42，pp.1356-1360，2003]的复合体的晶体结构描述所提议，将Arg155侧链做成伸长的构象。使此抑制剂在两个阶段中能量最低。第一阶段，只有该抑制剂和此蛋白酶的Arg155、Asp168和Arg123的侧链原子能在1000级能量最低时运动。第二阶段，该活性位点的所有侧链原子得以与该抑制剂运动另外1000级。此模型结构与发表的BILN 2061类似物的结构相近[Y.S.Tsantrizos，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.42，pp.1356-1360，2003]。
采用类似方法构建了VX-950在该酶活性位点中的模型。模型中此抑制剂的酮羰基与Ser139侧链的侧面结合形成共价加成物。此种结合模式见于类似的酮酰胺抑制剂[Pemi等，Bioorg.Med.Chem.Lett.14，出版中，2004]和酮酸抑制剂[Di Marco等，J.Biol.Chem.，275：7152-7157，2000]。该抑制剂的主链与NS3C-末端链的残基626-631重叠，形成下列所有的主链氢键：P1NH与Arg155羰基、P3羰基与Ala157NH、和P3NH与Ala157羰基，和P4加盖羰基与Cys159的NH。此结合模型中，VX-950的P2基团位于S2袋中不需要移动Arg155的侧链。叔丁基和环己基分别位于S3和S4袋中。为了相一致，我们采用了BILN 2061模型所用的二阶段能量最小方案。用这两种共复合体模型预测了Ala156和Asp168突变对蛋白酶抑制剂结合的影响。
Asp168的侧链暴露于溶剂。D168V的缬氨酸侧链可采取三种规范(canonical)构象，其x1＝60°、-60°或180°。所有3种Val168侧链的取向都进行建模。通过使抑制剂和Val168可移动而该蛋白分子所有其它原子位置固定使D168V突变型酶和抑制剂相互作用的能量降至最低。在所有情况下，Val168侧链均不会与抑制剂原子产生任何空间冲突。用以下方法将Ala156丝氨酸突变做成模型。Ala156侧链与两种抑制剂的P2基团通过范德华力接触(图9)。将Ala156突变体的丝氨酸侧链做成三种x1＝60°、-60°或180°的规范构象，其能量因保持了该固定蛋白质其余部分的构象而降至最低。这些模型可用来检测此突变对抑制剂结合的作用。发现-60°构象具有的能量最低，因为它能与临近的Arg155羰基形成氢键，但它引起了与两种抑制剂最大数量的不利接触。60°和180°构象在能量上相等，但60°构象不利接触较少，用于我们的分析。
Ala156位于HCV 3·4A蛋白酶结构的E2链上[R.A.Love等，Cell87：331-342，1996]。此链的几个主链原子(主要是Arg155的羰基，和Ala157的主链氮与羰基二者)与底物或基于底物的抑制剂的骨架原子形成氢键。在我们的VX-950：NS3蛋白酶共复合体的结构模型中(图9)，P1NH与Arg155羰基、P3羰基与Ala157NH、和P3NH与Ala157羰基之间形成了三个氢键。在BINL 2061的共复合体模型中也形成同样的氢键。Ala156侧链通过范德华力与这些抑制剂的P2基团接触。我们的A156S突变体模型中，Ser156的末端氧原子与VX-950的P4环己基靠得太近，也靠近BILN2061的末端环戊基帽。因为BILN 2061的末端环戊基帽位于该抑制剂的可屈曲端，它可移动避开此不利接触而对结合不造成大的损失。VX-950的P4环己基的类似移动可使该抑制剂与此蛋白酶的S4和S5亚位点之间的相互作用失去稳定性。因此，预计VX-950与A156S突变型蛋白酶的结合力比BILN 2061与该蛋白酶的结合力损失更大。
Asp168位于NS3蛋白酶结构的F2链上，参与和Arg123和Arg155侧链的盐桥相互作用(图9)[R.A.Love等，Cell 87：331-342，1996]。它也是S4结合袋的一部分。此侧链的脂性部分通过范德华力与BILN 2061的末端环戊基接触，预计不会受到D168V突变的影响，因为此位点的缬氨酸侧链不会引起与该抑制剂的空间冲突。然而，D168V取代导致其失去了与相邻E2链上Arg155侧链的盐桥相互作用(图1)，进而在所述模型中与BILN2061的大P2基团产生了多处接触。BILN 2061：野生型NS3蛋白酶复合体模型中Arg155的构象(图9，青色标记)从能量上讲在D168V突变中不再有利有二个原因。首先在Arg155和Asp168之间失去盐桥相互作用时不可能一直靠近E2链骨架。第二，未得到补偿的并暴露于溶剂的Arg155侧链正电荷将寻找更大的溶剂(保护)壳，如在Protein Data Bank中载脂蛋白酶晶体结构和两种蛋白酶：抑制剂复合体所见到的那样(编号：1DY8和1DY9)中获得[S.Di.Marco等，J.Biol.Chem.275：7152-7157，2000]。这些Arg155的构象与BILN 2061的P2喹啉基团直接冲突，使其结合不稳定。因此，用除谷氨酸外的任何氨基酸取代Asp168将破坏与Arg155相互作用的盐桥导致BILN 2061结合力降低。另一方面，在这两种发表的NS3蛋白酶：抑制剂复合体的晶体结构中，Arg155的构象与我们的VX-950：蛋白酶复合体模型(图9中橙色标记)相似。此外，Arg155的此构象赋予了VX-950结合的稳定性，因为这使得Arg155侧链和该抑制剂之间的范德华力接触数达到最大。因此，预计与BILN 2061相比，VX-950不会受到Asp168取代的影响。
实施例13：模型-II
已描述了利用全长HCV NS3蛋白的晶体结构[N.Yao等，Structure FoldDes.7：1353-1363，1999](蛋白质数据库(Protein Data Base)编号：1CU1)构建了VX-950和BILN 2061与NS3丝氨酸蛋白酶结构域活性位点结合的模型[C.Lin等.，J.Biol.Chem..279：17508-17514，2004]。HCV NS3·4A蛋白酶E2β链上的Ala156侧链使该酶活性位点的S2和S4袋分开，通过范德华力与此二抑制剂的P2基团接触(图7)。Ala156被Val或Thr取代使其侧链延长了两个额外基团(甲基或羟基)而进入了野生型与抑制剂之间的致密间隙中。按照所有的三种x1＝60°、-60°或180°规范构象遵循上述模拟A156S突变的方法[C.Lin等.，J.Biol.Chem.279：17508-17514，2004]，将Val156或Thr156侧链做成模型。通过保持该蛋白其余部分的构象固定使该侧链构象的能量降至最低。抑制剂VX-950和BILN 2061停靠在这些突变的酶活性位点中从而阐明诸突变对抑制剂结合的影响。
156位的丝氨酸侧链的三种可能构象(图11)中，x1＝60°的构象具有最低数量的与VX-950和BILN 2061的不利接触。其它两种构象(x1＝180°和-60°)与两种抑制剂在P2侧链或P3羰基处有多处不利接触。在A156T或A156V突变中，侧链的Cβ原子处的额外基团被迫占据了x1＝180°或-60°这两处位置之一，造成与该抑制剂的不利相互作用。Thr的三种可能构象见图11。所有情况下，该额外基团与抑制剂和/或酶主链原子具有排斥性相互作用。通过最大程度降低能量，我们发现-60/180°构象有最低的排斥性相互作用，排斥的主要原因是突变侧链的末端甲基或羟基与抑制剂的P3羰基之间靠近引起的冲突。因此，A156T和A156V突变对此二种抑制剂都有抗药性。
本文公开和要求的所有组合物和方法凭借本文所公开的内容，无须过多实验就可实施。虽然已通过优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员知道可对所述组合物和/或方法，及所述方法的实施步骤或各步骤的顺序作出各种改进，但这不脱离本发明的概念、思路和范围。更具体说，应懂得可用某些化学和生理学相关的制剂来替代本文所述的制剂，仍能获得相同或相似的结果。所有这些相似的替代和修饰是本领域技术人员知道的，均属于本发明附属权利要求书所确定的思路、范围和概念内。
本文引用的参考文献，它们所提供的实施方案或其它对本文所述的详细补充均专门纳入本文的参考文献中。以下列出了本文专门纳入作参考的参考文献名单。
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序列表
<110>林(Lin)，等
<120>HCV NS3-NS4A蛋白酶抗药性突变体
<130>30852/40505
<140>未知
<141>2004-10-27
<150>美国60/514,740
<151>2003-10-27
<150>美国60/525,222
<151>2003-11-26
<150>美国60/561,662
<151>2004-04-13
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2055
<212>DNA
<213>丙肝病毒
<400>1
gcgcctatta cggcctactc ccaacagacg cgaggcctac ttggctgcat catcactagc    60
ctcacaggcc gggacaggaa ccaggtcgag ggggaggtcc aagtggtctc caccgcaaca    120
caatctttcc tggcgacctg cgtcaatggc gtgtgttgga ctgtctatca tggtgccggc    180
tcaaagaccc ttgccggccc aaagggccca atcacccaaa tgtacaccaa tgtggaccag    240
gacctcgtcg gctggcaagc gccccccggg gcgcgttcct tgacaccatg cacctgcggc    300
agctcggacc tttacttggt cacgaggcat gccgatgtca ttccggtgcg ccggcggggc    360
gacagcaggg ggagcctact ctcccccagg cccgtctcct acttgaaggg ctcttcgggc    420
ggtccactgc tctgcccctc ggggcacgct gtgggcatct ttcgggctgc cgtgtgcacc    480
cgaggggttg cgaaggcggt ggactttgta cccgtcgagt ctatggaaac cactatgcgg    540
tccccggtct tcacggacaa ctcgtcccct ccggccgtac cgcagacatt ccaggtggcc    600
catctacacg cccctactgg tagcggcaag agcactaagg tgccggctgc gtatgcagcc    660
caagggtata aggtgcttgt cctgaacccg tccgtcgccg ccaccctagg tttcggggcg    720
tatatgtcta aggcacatgg tatcgaccct aacatcagaa ccggggtaag gaccatcacc    780
acgggtgccc ccatcacgta ctccacctat ggcaagtttc ttgccgacgg tggttgctct    840
gggggcgcct atgacatcat aatatgtgat gagtgccact caactgactc gaccactatc    900
ctgggcatcg gcacagtcct ggaccaagcg gagacggctg gagcgcgact cgtcgtgctc    960
gccaccgcta cgcctccggg atcggtcacc gtgccacatc caaacatcga ggaggtggct    1020
ctgtccagca ctggagaaat ccccttttat ggcaaagcca tccccatcga gaccatcaag    1080
ggggggaggc acctcatttt ctgccattcc aagaagaaat gtgatgagct cgccgcgaag    1140
ctgtccggcc tcggactcaa tgctgtagca tattaccggg gccttgatgt atccgtcata    1200
ccaactagcg gagacgtcat tgtcgtagca acggacgctc taatgacggg ctttaccggc    1260
gatttcgact cagtgatcga ctgcaataca tgtgtcaccc agacagtcga cttcagcctg    1320
gacccgacct tcaccattga gacgacgacc gtgccacaag acgcggtgtc acgctcgcag    1380
cggcgaggca ggactggtag gggcaggatg ggcatttaca ggtttgtgac tccaggagaa    1440
cggccctcgg gcatgttcga ttcctcggtt ctgtgcgagt gctatgacgc gggctgtgct    1500
tggtacgagc tcacgcccgc cgagacctca gttaggttgc gggcttacct aaacacacca    1560
gggttgcccg tctgccagga ccatctggag ttctgggaga gcgtctttac aggcctcacc    1620
cacatagacg cccatttctt gtcccagact aagcaggcag gagacaactt cccctacctg    1680
gtagcatacc aggctacggt gtgcgccagg gctcaggctc cacctccatc gtgggaccaa    1740
atgtggaagt gtctcatacg gctaaagcct acgctgcacg ggccaacgcc cctgctgtat   1800
aggctgggag ccgttcaaaa cgaggttact accacacacc ccataaccaa atacatcatg   1860
gcatgcatgt cggctgacct ggaggtcgtc acgagcacct gggtgctggt aggcggagtc   1920
ctagcagctc tggccgcgta ttgcctgaca acaggcagcg tggtcattgt gggcaggatc   1980
atcttgtccg gaaagccggc catcattccc gacagggaag tcctttaccg ggagttcgat   2040
gagatggaag agtgc                                                    2055
<210>2
<211>685
<212>PRT
<213>丙肝病毒
<400>2
Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys
1               5                   10                  15
Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Arg Asn Gln Val Glu Gly Glu
            20                  25                  30
Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val
        35                  40                  45
Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu
    50                  55                  60
Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro
                85                  90                  95
Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp
            100                 105                 110
Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser
        115                 120                 125
Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu
    130                 135                 140
Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr
145                 150                 155                 160
Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu
                165                 170                 175
Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala
            180                 185                 190
Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser
        195                 200                 205
Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys
    210                 215                 220
Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala
225                 230                 235                 240
Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val
                245                 250                 255
Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys
            260                 265                 270
Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile
        275                 280                 285
Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly
    290                 295                 300
Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu
305                 310                 315                 320
Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile
                325                 330                 335
Glu Glu Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys
            340                 345                 350
Ala Ile Pro Ile Glu Thr Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys
        355                 360                 365
His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu
    370                 375                 380
Gly Leu Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile
385                 390                 395                 400
Pro Thr Ser Gly Asp Val Ile Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr
                405                 410                 415
Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val
            420                 425                 430
Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr
        435                 440                 445
Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg
    450                 455                 460
Thr Gly Arg Gly Arg Met Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu
465                 470                 475                 480
Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp
                485                 490                 495
Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg
            500                 505                 510
Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His
        515                 520                 525
Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala
    530                 535                 540
His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu
545                 550                 555                 560
Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro
                565                 570                 575
Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu
            580                 585                 590
His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu
        595                 600                 605
Val Thr Thr Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Ala Cys Met Ser
    610                 615                 620
Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val
625                 630                 635                 640
Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile
                645                 650                 655
Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg
            660                 665                 670
Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
        675                 680                 685
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>3
ccttctatcg ccttcttg                          18
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>4
cttgatggtc tcgatgg                           17
<210>5
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>5
Lys Lys Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys
1               5                   10                  15

Claims (79)

1.一种编码HCV NS3/4A蛋白酶或其生物学活性类似物的分离的HCV多聚核苷酸，该多聚核苷酸中对应于野生型多聚核苷酸156位密码子的密码子和/或对应于野生型多聚核苷酸168位密码子的密码子被突变，使其不能编码156位的丙氨酸和/或168位的天冬氨酸。
2.如权利要求1所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸对应于野生型多聚核苷酸156位密码子的密码子编码丝氨酸。
3.如权利要求1所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸对应于野生型多聚核苷酸156位密码子的密码子编码缬氨酸。
4.如权利要求1所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸对应于野生型多聚核苷酸156位密码子的密码子编码苏氨酸。
5.如权利要求1所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸对应于野生型多聚核苷酸156位密码子的密码子编码缬氨酸或苏氨酸，且所述多聚核苷酸对应于野生型168位密码子的密码子编码天冬氨酸或谷氨酸。
6.如权利要求1所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸对应于野生型多聚核苷酸168位密码子的密码子编码缬氨酸。
7.如权利要求1所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸对应于野生型多聚核苷酸168位密码子的密码子编码丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
8.如权利要求1所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述野生型多聚核苷酸具有SEQ ID No：1所示序列。
9.一种编码HCV NS3/4A蛋白酶生物学活性片段的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸的所述片段特征在于其编码的HCV NS3/4A蛋白酶结构域中含有对应于野生型多聚核苷酸156位密码子的密码子和/或对应于野生型多聚核苷酸168位密码子的密码子，其中所述对应于156位密码子的密码子和/或对应于168位密码子的密码子被突变，使其不能编码156位的丙氨酸和/或168位的天冬氨酸。
10.如权利要求9所述的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸的特征在于其含有HCV NS3/4A蛋白酶结构域156位密码子的密码子，该156位密码子编码缬氨酸、苏氨酸或丝氨酸残基而替代了丙氨酸残基。
11.如权利要求9所述的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸的特征在于其含有对应于HCV NS3/4A蛋白酶结构域156位和168位密码子的密码子，该156位密码子编码缬氨酸、苏氨酸而替代了丙氨酸，168位密码子编码天冬氨酸或谷氨酸。
12.如权利要求9所述的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸的特征在于其含有对应于HCV NS3/4A蛋白酶结构域的168位密码子的密码子，该168位密码子编码缬氨酸。
13.如权利要求9所述的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸的特征在于其含有对应于HCV NS3/4A蛋白酶结构域168位密码子的密码子，该168位密码子编码丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
14.如权利要求9所述的分离的HCV多聚核苷酸，其特征在于，所述野生型HCV多聚核苷酸具有SEQ ID No：1所示的序列。
15.一种分离的HCV NS3/4A蛋白酶蛋白，或其生物学活性片段或其生物学活性类似物，其特征在于，它们所含序列中对应于野生型HCVNS3/4A蛋白酶的氨基酸156位的氨基酸残基不是丙氨酸残基，和/或对应于HCV NS3/4A蛋白酶氨基酸168位的氨基酸残基不是天冬氨酸残基。
16.如权利要求15所述的分离的HCV NS3/4A蛋白酶蛋白或其片段或类似物，其特征在于，所述对应于野生型蛋白酶氨基酸156位的氨基酸是缬氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
17.如权利要求15所述的分离的HCV NS3/4A蛋白酶蛋白或其片段或类似物，其特征在于，所述对应于该蛋白酶氨基酸156位的氨基酸是丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸，和对应于氨基酸168位的是天冬氨酸或谷氨酸。
18.如权利要求15所述的分离的HCV NS3/4A蛋白酶蛋白或其片段或类似物，其特征在于，所述对应于野生型蛋白酶氨基酸168位的氨基酸是缬氨酸。
19.如权利要求15所述的分离的HCV NS3/4A蛋白酶蛋白或其片段或类似物，其特征在于，所述对应于野生型蛋白酶氨基酸168位的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
20.如权利要求15所述的分离的HCV NS3/4A蛋白酶蛋白，其特征在于，所述野生型HCVNS3/4A蛋白酶具有SEQ ID No：2所示的序列。
21.一种含有如权利要求1-14任何一项所述多聚核苷酸的载体。
22.一种含有如权利要求1-14任何一项所述多聚核苷酸的宿主细胞或细胞系。
23.一种用权利要求21所述载体转化或转染的宿主细胞。
24.一种含有如权利要求15-21任何一项所述蛋白质的宿主细胞或细胞系。
25.一种含有如权利要求1-14任何一项所述多聚核苷酸的分离的HCV变体。
26.一种含有如权利要求15-23任何一项所述蛋白质的分离的HCV变体。
27.一种含有如权利要求1-14任何一项所述多聚核苷酸的组合物。
28.一种含有如权利要求1-4或7-10任何一项所述多聚核苷酸和权利要求5、6、11或12任何一项所述多聚核苷酸的组合物。
29.一种含有如权利要求15-21任何一项所述蛋白质的组合物。
30.一种含有如权利要求15-18任何一项所述蛋白质和权利要求19或23所述蛋白质的组合物。
31.一种检测生物样品中抗药性HCV存在的方法，该方法包括检测所述生物样品中权利要求1-14任何一项所述多聚核苷酸的存在。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，该方法包括：
a)从所述样品获得所述多聚核苷酸；
b)测定所述多聚核苷酸的序列；
c)测定在所述多聚核苷酸中156位密码子和/或168位密码子是否是非野生型密码子，即所述密码子不编码天冬氨酸。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述非野生型密码子在对应于野生型HCV NS3/4A蛋白酶156位残基的残基编码丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸，和/或在对应于野生型HCVNS3/4A蛋白酶168位残基的残基编码谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，该方法包括检测或推断在所述多聚核苷酸中是否，
a)156位密码子编码丝氨酸，156位密码子编码缬氨酸，156位密码子编码苏氨酸，156位密码子编码缬氨酸或苏氨酸，和156位密码子编码天冬氨酸或谷氨酸；和
b)168位密码子编码缬氨酸，或168位密码子编码丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
35.一种检测病人中的HCV感染是否具有抗药性的方法，该方法包括：
a)收集HCV感染病人的生物学样品；和
b)评价其血浆样品是否含有编码突变型HCV NS3/4A蛋白酶的核酸，样品中存在所述突变型HCV NS3/4A蛋白酶表明所述病人患有抗药性HCV感染。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述编码突变型HCVNS3/4A蛋白酶的核酸在对应于所述HCV NS3/4A 156残基和/或168残基的氨基酸处具有突变，其中，如果对应于野生型HCV NS3/4A 156位残基的氨基酸残基不是丙氨酸，和/或对应于野生型HCV NS3/4A 168位残基的氨基酸残基不是天冬氨酸，则表明所述病人患有抗药性HCV感染。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述突变包括在对应于野生型HCV NS3/4A蛋白酶156位残基的氨基酸残基是丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸
38.如权利要求35、36或37任何一项所述的方法，其特征在于，所述HCV NS3/4A蛋白酶在对应于野生型HCV NS3/4A蛋白酶168位残基的氨基酸残基是天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸。
39.如权利要求35、36或37任何一项所述的方法，其特征在于，所述生物学样品中存在的编码HCV NS3/4A蛋白酶的核酸含有156位密码子突变，该突变导致丙氨酸被丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸取代，或所述突变包含残基168位天冬氨酸被谷氨酸取代。
40.如权利要求35-39任何一项所述的方法，其特征在于，所述生物学样品中存在的编码HCVNS3/4A蛋白酶的核酸含有168位密码子突变，该突变导致天冬氨酸被丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或酪氨酸取代。
41.一种评价HCV感染的病人是否对VX-950的敏感性或易感性降低的方法，该方法包括评价所述病人是否存在丙肝病毒NS3/4A蛋白酶DNA，所述丙肝病毒NS3/4A蛋白酶DNA在编码野生型丙肝病毒NS3/4A蛋白酶残基156位的密码子含有突变。
42.一种评价HCV感染的病人是否对蛋白酶抑制剂的敏感性或易感性降低的方法，该方法包括评价所述病人是否存在丙肝病毒NS3/4A蛋白酶DNA，所述丙肝病毒NS3/4A蛋白酶DNA在编码野生型丙肝病毒NS3/4A蛋白酶残基156位的密码子含有突变。
43.如权利要求41-42任何一项所述的方法，其特征在于，所述突变与对BILN 2061的敏感性或易感性降低有关或导致这种降低。
44.如权利要求41-42任何一项所述的方法，其特征在于，所述突变与对VX-950和BILN 2061的敏感性或易感性降低有关或导致这种降低。
45.一种评价候选或潜在的HCV抑制剂的方法，该方法包括：
a)将含有权利要求1-14任何一项所述的多聚核苷酸和编码一指示剂的指示剂基因的载体引入宿主细胞中；
b)培养该宿主细胞；和
c)存在或不存在抑制剂时检测该指示剂。
46.一种检测抗HCV化合物的活性的方法，该方法包括：
a)提供权利要求15-23任何一项所述的蛋白酶和蛋白酶底物；
b)存在所述底物时使该蛋白酶与候选或潜在的抑制剂接触；和
c)评价或检测该蛋白酶水解活性受到的抑制。
47.一种鉴定可作为权利要求15-23任何一项所述蛋白酶抑制剂的化合物的方法，该方法包括；
a)检测不存在该化合物时此蛋白酶的活性；
b)检测存在该化合物时此蛋白酶的活性；
c)比较a)的结果与b)的结果。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，该方法包括：
d)检测不存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；
e)检测存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；
f)比较d)的结果与e)的结果。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，该方法包括比较a)和/或b)的结果及比较d)和/或e)的结果。
50.如权利要求47所述的方法，其特征在于，该方法包括；
d)检测不存在该化合物时第二种NS3/4A蛋白酶的活性，所述第二种蛋白酶含有对应于野生型蛋白酶残基168位的氨基酸，所述氨基酸被突变成缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸；
e)检测存在该化合物时所述第二种蛋白酶的活性；
f)比较d)的结果与e)的结果。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，该方法包括：
g)检测不存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；
h)检测存在该化合物时野生型蛋白酶的活性；
i)比较g)的结果与h)的结果。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，该方法包括比较a)和/或b)的结果以及d)和/或e)的结果；和/或比较g)和/或h)的结果。
53.一种当NS3/4A蛋白酶变成对VX-950有抗药性时鉴定能够挽回VX-950活性的化合物的方法，该方法包括：
a)使权利要求15-23任何一项所述的蛋白酶与该化合物接触；
b)检测VX-950抑制a)中所述蛋白酶活性的能力。
54.一种鉴定能有效抵抗权利要求15-23任何一项所述蛋白酶的化合物的方法，该方法包括：
a)获得该蛋白酶的三维模型；
b)设计或选择化合物；
c)评价该化合物结合此蛋白酶或与之相互作用的能力。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述三维模型是依据NS3/4A蛋白酶的x光晶体结构(图1和2)构建的。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述模型用计算机辅助方法获得。
57.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述三维模型利用权利要求15-21任何一项所述蛋白质的x-光晶体图获得。
58.如权利要求54-57任何一项所述的方法，其特征在于，该方法通过分子模型来评价。
59.如权利要求54-58任何一项所述的方法，其特征在于，该方法中使所述化合物与野生型蛋白酶接触。
60.如权利要求54-59任何一项所述的方法，其特征在于，该方法中使所述化合物与权利要求15-19任何一项所述的蛋白质接触。
61.如权利要求54-60任何一项所述的方法，其特征在于，该方法中使所述化合物与权利要求20-21任何一项所述的蛋白质接触。
62.如权利要求54-61任何一项所述的方法，其特征在于，该方法中所述化合物是从组合性化学文库中鉴定的化合物。
63.如权利要求54-62任何一项所述的方法，其特征在于，该方法中所述化合物是通过合理的药物设计制备的化合物。
64.如权利要求54-62任何一项所述的方法，其特征在于，该方法中所述化合物是通过合理的药物设计和衍生自VX-950结构而制备的化合物。
65.一种根据权利要求56-61任何一项所述的方法鉴定的化合物。
66.一种含有权利要求65所述化合物和药学上可接受的载体、佐剂或运载体的组合物。
67.如权利要求66所述的组合物，其特征在于，其中所述化合物的量是抑制NS3/4A丝氨酸蛋白酶的有效量。
68.如权利要求67所述的组合物，其特征在于，配制所述组合物给予病人。
69.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有选自免疫调节剂、抗病毒制剂、HCV蛋白酶的第二抑制剂、HCV生命周期其它靶分子的抑制剂、细胞色素P-450抑制剂的其它制剂，或它们的组合。
70.如权利要求69所述的组合物，其特征在于，所述免疫调节剂是α-、β-或γ-干扰素或胸腺素；抗病毒制剂是利巴伟林、金刚胺或胸腺素；HCV生命周期其它靶分子抑制剂是HCV螺旋酶、聚合酶或金属蛋白酶的抑制剂。
71.如权利要求70所述的组合物，其特征在于，所述细胞色素P-450抑制剂是利托那韦。
72一种抑制丙肝病毒NS3/4A蛋白酶活性的方法，该方法包括使所述丝氨酸蛋白酶与权利要求65所述的化合物接触的步骤。
73.一种治疗病人HCV感染的方法，该方法包括给予所述病人权利要求65所述化合物的步骤。
74.一种治疗或减轻病人HCV感染的方法，该方法包括；
a)用权利要求35-44任何一项所述的方法测定所述病人是否感染了对治疗有抗药性的HCV；
b)用针对抗药性HCV治疗的组合物或疗法治疗所述病人。
75.如权利要求73或74所述的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述病人其它制剂，所述其它制剂选自免疫调节剂、抗病毒制剂、HCV蛋白酶的第二抑制剂、HCV生命周期其它靶分子的抑制剂，或它们的组合；所述其它制剂作为单独剂型的一部分或分开的剂型给予所述病人。
76.如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述免疫调节剂是α-、β-或γ-干扰素或胸腺素；所述抗病毒制剂是利巴伟林、金刚胺或胸腺素；所述HCV生命周期其它靶分子的抑制剂是HCV螺旋酶、聚合酶或金属蛋白酶的抑制剂。
77.一种清除或减少生物学样品、医疗或实验室设备中HCV污染的方法，该方法包括使所述生物学样品或医疗或实验室设备与权利要求65所述化合物接触的步骤。
78.如权利要求77所述的方法，其特征在于，按照权利要求31-34所述方法来检测所述生物学样品或医疗或实验室设备污染了抗药性HCV病毒株。
79.如权利要求77所述的方法，其特征在于，所述样品或设备选自：血液、其它体液、生物组织、手术器械、手术包、实验室仪器、实验室服装、血液或其它体液收集装置、血液或其它体液贮藏材料。
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