KR20140098867A - Ｃ형 간염 바이러스 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HCV 변이체, 특히, VX-950과 같은 프로테아제 저해제에 대해 내성을 띠는 변이체에 관한 것이다. 상기 HCV 변이체와 관련된 방법 및 조성물 또한 제공한다. 추가로 다중 바이러스 변이체를 환자로부터 단리, 동정, 및 특징화하는 방법도 제공한다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 변이체{HEPATITIS C VIRUS VARIANTS}

본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV: hepatitis C virus) 변이체에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(HCV)가 전세계적으로 1억 7천만명을 초과하는 사람들을 감염시켰고, 이는 만성 간염의 주 원인이며, 결국에는 말기 간경변과 간세포 암종을 일으킬 수 있다. HCV 감염에 대한 표준 치료법은 현재 리바비린(RBV: ribavirin)과 병용되는 페길화된 인터페론 알파(Peg-IFN: pegylated interferon alpha)이다. HCV 요법의 목표는 6개월간의 항바이러스 치료법 이후 혈액내 검출불가능한 HCV-RNA에 의해 정의되는 지속적 바이러스 반응(SVR: sustained virus response)을 수득함으로써 바이러스 감염을 제거하는 것이다. 불행하게도, 현 치료법은 유전자형 1의 대상자중 약 50%에서는 효과가 없고, 부작용은 상당하다. 따라서, 새로운 항바이러스 표적 및 개선된 치료 전략법이 요구되고 있다([Pawlotsky, J. M., and J. G. McHutchison, 2004, Hepatitis C. Development of new drugs and clinical trials: promises and pitfalls. Summary of an AASLD hepatitis single topic conference, Chicago, IL, February 27-March 1, 2003, Hepatology 39:554-67]; [Strader, et al., 2004, Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C. Hepatology 39:1147-71]).

비-구조(NS: non-structural) 3-4A 프로테아제는 HCV 복제에 필수적인 것이며, 이는 새로운 항-HCV 요법에 대하여 유망한 표적이 된다. 효능이 있고, 특이적인 NS3-4A 프로테아제 저해제인 VX-950은 HCV 유전자형 1로 감염된 대상자의 1b 기 임상 시험에서 상당한 항바이러스 활성이 있는 것으로 입증되었다(연구 VX04-950-101). 대상자가 치료법에 대하여 반응하는 정도 및 관찰되는 바이러스 반동 속도는 부분적으로 유전자형이 프로테아제 저해제에 대해 갖는 감수성 차이 때문일 수 있다. HCV 중합효소의 낮은 충실도와 함께, HCV의 신속한 복제 속도가 그의 전 게놈에 걸쳐 돌연변이를 축적시킨다([Simmonds, P., 2004, Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus - 15 years on. J. Gen. Virol. 85:3173-88]). 프로테아제 영역내 서열 변이성이 어느 정도로 효소의 촉매 효능 또는 저해제의 결합에 영향을 미치는지는 알려져 있지 않다. 추가로, 두드러진 서열 변이를 갖는 다수의 바이러스 게놈을 생성하는 것은 항바이러스 요법으로 치료받는 대상자에서 약물 내성 바이러스 출혈과 관련된 잠재적인 문제를 제시한다. 실제로, 항바이러스 약물, 예로서, HIV 프로테아제 저해제에 대한 약물 내성에 대하여는 잘 기록되어 있다([Johnson, et al, 2004, Top. HIV Med. 12: 119-24]). 약물 내성 돌연변이는 이미 HCV 프로테아제 저해제의 존재하에 시험관내에서 발생하는 것으로 나타나있다([Lin, et al., 2005, In vitro studies of cross-resistance mutations against two hepatitis C virus serine protease inhibitors, VX-950 and BILN 2061. J. Biol. Chem. 280:36784-36791]; [Lin, et al., 2004, In vitro resistance studies of hepatitis C virus serine protease inhibitors, VX-950 and BILN 2061:Structural analysis indicates different resistance mechanisms. J. Biol. Chem. 279:17508-17514]; [Lu, et al., 2004, Antimicrob. Agents Chemother. 48:2260-6]; [Trozzi, et al., 2003, In vitro selection and characterization of hepatitis C virus serine protease variants resistant to an active-site peptide inhibitor. J. Virol. 77:3669-79]). 프로테아제 저해제 BILN 2061에 대하여 내성을 띠는 돌연변이는 NS3 유전자중 위치 R155Q, A156T, 및 D168V/A/Y에서 발견되었지만, NS4 영역 또는 프로테아제 절단 부위에서는 어떤 돌연변이도 관찰되지 않았다. VX-950 내성 돌연변이는 또한 시험관내 위치 A156S에서 발견되었다. VX-950 및 BILN 2061, 둘 모두에 대한 교차-내성 돌연변이는 또한 시험관내 위치 156(A156V/T)에서 발생한 것으로 나타났다[Lin, et al., 2005, 상기 동일].

따라서, 약물 또는 다른 요법에 대하여 내성을 나타내는 돌연변이된 HCV 또는 다른 바이러스를 동정하고, 이들 돌연변이된 바이러스에 대하여 효과적인 새로운 바이러스 치료제를 개발할 필요가 있다.

따라서, 본 발명은 HCV 변이체, 및 관련 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 하나 이상의 프로테아제 저해제, 예로서, VX-950에 대한 감수성이 감소된 HCV 변이체 및 변이체 HCV 프로테아제를 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 HCV NS3 프로테아제를 코딩하는 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드, 그의 생물학적으로 활성인 유사체, 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편을 제공한다. 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는, 야생형 폴리뉴클레오티드의 코돈 36, 41, 43, 54, 148, 155, 또는 156에 상응하는 적어도 하나의 코돈으로서, 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 상응하는 코돈에 의해 코딩되는 아미노산과 상이한 아미노산을 코딩하도록 돌연변이된 것을 갖는다. 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 일부분, 예로서, 서열번호 1의 처음 543개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 별법으로, 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열 또는 그의 일부분과 적어도 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상 일치하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 36에 상응하는 코돈을 포함하는데, 상기 코돈은 V를 코딩하지 않는다. 특정 실시태양에서, 코돈은 M, L, A, 또는 G를 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 41에 상응하는 코돈을 포함하는데, 상기 코돈은 Q를 코딩하지 않는다. 특정 실시태양에서, 코돈은 H를 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 43에 상응하는 코돈을 포함하는데, 상기 코돈은 F를 코딩하지 않는다. 특정 실시태양에서, 코돈은 S를 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 54에 상응하는 코돈을 포함하는데, 상기 코돈은 T를 코딩하지 않는다. 특정 실시태양에서, 코돈은 S 또는 A를 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 148에 상응하는 코돈을 포함하는데, 상기 코돈은 G를 코딩하지 않는다. 특정 실시태양에서, 코돈은 E를 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 155에 상응하는 코돈을 포함하는데, 상기 코돈은 R을 코딩하지 않는다. 특정 실시태양에서, 코돈은 K, M, S, T, G, I, 또는 L을 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 156에 상응하는 코돈을 포함하는데, 상기 코돈은 A를 코딩하지 않는다. 특정 실시태양에서, 코돈은 S, T, V, 또는 I를 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 임의 2개의 코돈에 상응하는 2개의 코돈을 포함하는데, 상기 2개의 코돈은 어느 코돈이든 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 상응하는 코돈에 의해 코딩되는 아미노산과 상이한 아미노산을 코딩하도록 돌연변이된다. 예를 들면, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 코돈은 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 36에 상응하는 코돈을 포함하고, 상기 코돈은 A 또는 M을 코딩하고; 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 추가로 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 155에 상응하는 코돈을 포함하고, 상기 코돈은 K 또는 T를 코딩하고; 별법으로, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 추가로 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 156에 상응하는 코돈을 포함하고, 상기 코돈은 T를 코딩한다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 임의 3개의 코돈에 상응하는 3개의 코돈을 포함하는데, 상기 3개의 코돈 각각은 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 상응하는 코돈에 의해 코딩되는 아미노산과 상이한 아미노산을 코딩하도록 돌연변이된다.

특정 실시태양에서, 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드는 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 임의 4개의 코돈에 상응하는 4개의 코돈을 포함하는데, 상기 4개의 코돈 각각은 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 상응하는 코돈에 의해 코딩되는 아미노산과 상이한 아미노산을 코딩하도록 돌연변이된다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 HCV 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, HCV 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템을 제공하는데, 그러한 발현 시스템은 프로모터에 작동가능하게 연결된 HCV 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있고; 또한 상기 벡터로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 숙주 세포도 제공한다. 별법으로, 본 발명의 발현 시스템은 mRNA 디스플레이 기술, 예컨대, 미국 특허 번호 제6,258,558호에 기재된 RNA-단백질 융합 기술 또는 미국 특허 번호 제6,361,943호에 기재된 시험관내 "바이러스" 기술에 기초한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 단리된 HCV 변이체를 제공한다. 단리된 HCV 변이체는 야생형 폴리뉴클레오티드의 코돈 36, 41, 43, 54, 148, 155, 또는 156에 상응하는 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 코돈이 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 상응하는 코돈에 의해 코딩되는 아미노산과 상이한 아미노산을 코딩하도록 돌연변이된, HCV NS3 프로테아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시태양은 HCV 변이체를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 HCV 변이체의 복제를 저해할 수 있는 화합물을 동정하는 방법; 본 발명의 HCV 변이체에 의해 감염된 세포를 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 단리된 HCV 프로테아제, 특히, HCV NS3 프로테아제를 제공한다. 단리된 HCV NS3 프로테아제는 야생형 HCV NS3 프로테아제의 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 있는 아미노산 서열이 야생형 HCV NS3 프로테아제의 각각의 상응하는 위치에 있는 아미노산과 상이한, 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 야생형 HCV NS3 프로테아제는 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 그의 일부분, 예로서, 서열번호 2의 처음 181개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 단리된 HCV NS3 프로테아제는 HCV NS3 프로테아제의 생물학적으로 활성인 유사체 또는 단편을 포함할 수 있고, 예를 들면, 단리된 HCV NS3 프로테아제는 서열번호 2의 N-말단 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 또는 48개의 아미노산을 갖지 않을 수 있다.

단리된 HCV NS3 프로테아제는 또한 NS4A 보조인자, 예로서, 서열번호 2의 마지막 54개의 아미노산으로 표시되는 NS4A 단백질을 포함할 수 있다. 단리된 HCV NS3 프로테아제는 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,653,127호 및 제6,211,338호 기재되어 있는 것과 같이, NS4A 보조인자를 NS3 프로테아제 도메인에 결합시켜(tethering) 형성된 단백질 복합체일 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 HCV 프로테아제에 특이적인 항체를 제공한다. 본 항체는 야생형 HCV NS3 프로테아제의 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 있는 아미노산이 야생형 HCV NS3 프로테아제의 각각의 상응하는 위치에 있는 아미노산과 상이한, 아미노산 서열을 포함하는 HCV NS3 프로테아제를 인식할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명의 항-HCV 프로테아제 항체를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 포함하는 진단용 키트, 및 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 엄격한 조건하에서 본 발명의 HCV 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 제공한다. 본 발명의 추가의 실시태양은 프로브 또는 프라이머를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 프로브 또는 프라이머를 포함하는 진단용 또는 검출용 키트를 제공하고, 본 키트는 예컨대, 본 발명의 HCV 변이체 또는 HCV NS3 프로테아제가 샘플내 존재하는지 여부를 측정하는데 유용하다.

추가의 측면에서, 본 발명은 환자에서 HCV 감염의 프로테아제 저해제에 대한 약물 내성 또는 감수성을 평가하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 HCV 감염 환자로부터 생물학적 샘플을 수집하고, 샘플은, 야생형 HCV NS3 프로테아제의 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 있는 아미노산이 야생형 HCV NS3 프로테아제의 각각의 상응하는 위치에 있는 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCV NS3 프로테아제를 코딩하는 핵산을 포함하는지 여부를 평가하거나 측정하는 것을 포함할 수 있다. 프로테아제 저해제는 VX-950 또는 다른 프로테아제 저해제일 수 있다.

환자에서 HCV 감염에 대한 치료법을 가이드하거나 치료 요법을 디자인하는 방법 또한 제공한다. 본 방법은 환자의 프로테아제 저해제에 대한 약물 내성 또는 감수성을 평가하고, 약물 내성 또는 감수성에 기초하여 환자에 대한 요법을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 약물 내성이 예측되거나 검출될 경우(예컨대, 프로테아제 저해제, 예로서, VX-950에 대한 감수성 저하), 하나 이상의 다른 화합물 또는 제제가 환자의 치료 계획 또는 치료 요법에 포함될 수 있다. 본 방법은 환자에서 HCV NS3 프로테아제의 서열을 측정하는 방법(예컨대, 유전자형 분석), 환자에서 프로테아제 저해제에 대한 HCV NS3 프로테아제의 감수성을 측정하는 방법(예컨대, 표현형 분석), 또는 환자의 HCV 바이러스 적응도 수준을 측정하는 방법의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표현형 분석은 세포계 시스템(예컨대, 레플리콘 검정법 또는 바이러스 감염 또는 복제 검정법) 뿐만 아니라, 무세포 시스템(예컨대, 시험관내 프로테아제 검정법)에서 수행될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 환자의 HCV 감염 치료용의 후보 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 본 발명의 HCV 변이체로 감염된 샘플을 제공하는 단계, 및 샘플내 HCV 변이체의 활성을 저해하는 후보 화합물의 능력을 검정하는 단계를 포함할 수 있다. HCV 변이체로 감염된 샘플은 환자, 예로서, 세포 또는 혈장 샘플로부터 수득할 수 있다. HCV 변이체로 감염된 샘플은 또한 배양된 세포일 수 있다. HCV 변이체의 활성은 감염, 복제, 및/또는 방출할 수 있는 능력에 의해 측정될 수 있다.

별법으로, 그러한 방법은 본 발명의 HCV 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레플리콘 RNA를 제공하는 단계, 및 적합한 검정법에서 후보 화합물이 레플리콘 RNA의 복제를 저해하는지 여부를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

또다른 대체 방법은 본 발명의 단리된 HCV NS3 프로테아제 및 프로테아제 기질을 제공하는 단계, 및 HCV NS3 프로테아제 활성이 후보 화합물의 존재하에서 감소하였는지 여부를 측정하는 단계를 포함할 수 있고; HCV NS3 프로테아제 및/또는 프로테아제 기질은 세포계 시스템에 존재할 수 있거나, 예를 들면, 배양된 세포에서 발현될 수 있거나, HCV NS3 프로테아제 및/또는 프로테아제 기질은 무세포 시스템, 예를 들면, HCV NS3 프로테아제 및 펩티드 기질을 포함하는 반응 혼합물에 존재할 수 있다. HCV NS3 프로테아제는 미국 특허 번호 제6,258,558호에 기재되어 있는 RNA-단백질 융합 분자일 수 있고, 그러한 융합 분자는 프로테아제 활성을 평가하는 무세포-검정법에 포함될 수 있다.

환자의 HCV 감염 치료용의 후보 화합물을 평가하는 추가의 대체 방법은 본 발명의 HCV 폴리뉴클레오티드 및 지시자를 코딩하는 지시자 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 단계, 및 후보 화합물의 존재 및 후보 화합물의 부재하에서 지시자를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 HCV NS3 프로테아제, 예를 들면, VX-950에 대하여 내성을 띤 HCV NS3 프로테아제에 대한 VX-950의 활성을 구제할 수 있는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 그러한 화합물은 또한 "제2 화합물"로 명명된다. 본 방법은 본 발명의 HCV NS3 프로테아제를 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 및 HCV NS3 프로테아제의 활성을 저해할 수 있는 VX-950의 능력을 검정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 또한 VX-950에 대한 감수성이 저하된 변이체 HCV NS3 프로테아제를 컴퓨터 가상 실험(in silico)으로 모델링하는 단계(예컨대, IC₅₀ 및/또는 K_i 측정으로 측정됨), 및 VX-950의 활성을 구제할 수 있는 화합물을 디자인하고/거나 선택하는 단계를 포함할 수 있다.

환자에서 HCV 감염을 치료하는 방법 또한 제공하며, 본 방법은 환자에게 약제학적 유효량의, VX-950의 활성을 구제할 수 있는 제2 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 제2 화합물은 환자에게 단독으로, 또는 VX-950과 함께 투여될 수 있다. 제2 화합물은 환자의 치료학적 요법을 일시적으로 또는 영구적으로 VX-950을 대신할 수 있다. 예를 들면, 일시적인 대체 치료 요법에서, 화합물을 환자에게 투여하고, 그가 VX-950의 활성을 구제한 이후에 VX-950은 환자에게 다시 투여된다.

HCV NS3 프로테아제 활성을 감소시키는데 효과적인 화합물을 동정하는 방법을 추가로 제공한다. 본 방법은 본 발명의 HCV NS3 프로테아제의 3차원적 모델을 수득하는 단계, 및 화합물을 디자인하거나 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 추가로 컴퓨터 가상 실험, 시험관내, 및/또는 생체내에서 프로테아제에 결합하거나, 프로테아제와 상호작용할 수 있는 화합물의 능력을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 무세포 또는 세포계 검정법에서 디자인되거나 선택된 화합물이 HCV NS3 프로테아제, 특히, 프로테아제 저해제, 예로서, VX-950에 대한 감수성이 저하된 변이체 HCV NS3 프로테아제의 활성을 저해할 수 있는지 여부를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 추가로 또는 별법으로 디자인되거나 선택된 화합물이 세포 또는 샘플내에서 HCV 복제를 저해할 수 있는 능력을 검정하는 단계를 포함할 수 있다. HCV 복제는 본 발명의 HCV 변이체 또는 본 발명의 HCV 레플리콘의 복제를 측정함으로써 측정될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 생물학적 샘플, 또는 의료 또는 실험 장비의 HCV 오염을 제거하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 생물학적 샘플, 또는 의료 또는 실험 장비를 본 발명의 화합물, 예로서, 본원에 기술된 방법에 의해 동정된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 환자에서 HCV 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에게 약제학적 또는 치료학적 유효량의, 본원에 기술된 방법에 의해 동정된 화합물을 단독으로 또는 또다른 항바이러스제와 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 기계-판독식 데이타로 코딩되는 데이타 저장 물질을 포함하는 기계-판독식 데이타 저장 매체를 제공하는 컴퓨터 툴에 관한 것인데, 여기에서, 기계-판독식 데이타는 HCV 변이체 또는 생물학적 샘플과 관련된 2가지 이상의 특징에 대한 지표값을 포함한다. 특징은 a) 프로테아제 저해제에 대한 저하된 감수성에 대하여 내성을 나타낼 수 있는 능력; b) 야생형 HCV NS3 프로테아제의 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 있는 아미노산이 야생형 HCV NS3 프로테아제의 각각의 상응하는 위치에 있는 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCV NS3 프로테아제; c) 환자의 이환률 또는 회복능; 및 d) HCV 변이체의 변경된 복제능(증가 또는 감소)으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 측면은 HCV-감염 환자에서 HCV 변이체의 프로파일을 수득하는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자로부터 샘플(예컨대, 혈장 샘플)을 수득하는 단계, 및 상기 샘플로부터 얻은 적어도 2, 20, 50, 100, 200, 500개 이상의 HCV 비리온으로부터의 HCV 프로테아제의 유전자형 분석 및/또는 표현형 분석을 하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자형 분석은 혈장 샘플로부터 얻은 적어도 2, 20, 50, 100, 200, 500개 이상의 HCV 비리온으로부터의 HCV 프로테아제의 뉴클레오티드 서열을 측정하는 것을 포함할 수 있다.

특정 실시태양에서, 상기와 같이 프로파일링된 환자는 프로테아제 저해제, 예로서, VX-950로 치료받거나, 치료받도록 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 혈장 샘플은 2 이상의 상이한 시점에서 상기와 같이 프로파일링된 환자로부터 수득한다.

도 1은 미처리된 유전자형 1 HCV-감염된 대상자로부터의 NS3 단백질의 N 말단의 543개의 뉴클레오티드에 대한 기준선 서열의 계통학적 분석을 나타낸다.
도 2는 유전자형 1a 및 1b 프로테아제 변이체에 대한 텔라프레비어(VX-950)의 기준선 IC₅₀을 나타낸다.
도 3은 VX-950에 대한 바이러스 반응에 기초하여 대상자를 분류하는 것을 도시한다.
도 4(색상으로 표시)는 돌연변이 패턴에 상응하는 바이러스 반응을 요약한다.
도 5는 VX-950에 대한 프로테아제 단일 내성 돌연변이체의 효소 IC₅₀과 참조 유전자형 1a 균주 HCV-H로부터의 변화 배수를 나타낸다.
도 6은 VX-950에 대한 프로테아제 이중 내성 돌연변이체의 효소 IC₅₀과 참조 유전자형 1a 균주 HCV-H로부터의 변화 배수를 나타낸다.
도 7은 VX-950에 대한 내성과 적응도 사이의 역 상관관계를 나타낸다.
도 8은 2개의 HCV 프로테아제 저해제: VX-950 및 BILN 2061의 구조를 도시한다.
도 9는 구조 연구에 따른 HCV 프로테아제에서의 VX-950의 위치를 도시한다.
도 10은 HCV 바이러스 변이체의 표현형 분석 방법을 약술한다.
도 11은 V36 치환이 VX-950에 대하여 낮은 수준의 내성을 부여한다는 것을 나타낸다.
도 12는 V36M 변이체 프로테아제의 X-선 구조를 나타낸다.
도 13은 V36이 VX-950과 직접적으로 접촉하지 못한다는 것을 나타낸다.
도 14는 내성 수준은 낮고, 적응도는 보다 우수한 G1a에서의 V36M 변이체를 나타낸다.
도 15는 내성 수준은 낮고, 적응도는 보다 낮은 G1a/b에서의 V36A 변이체를 나타낸다.
도 16은 내성 수준은 낮고, 적응도는 보다 낮은 G1b에서의 V36G 변이체를 나타낸다.
도 17은 내성은 없고, 또한 G1에서 희귀한 V36L 변이체를 나타낸다.
도 18은 또한 HCV 바이러스 변이체의 표현형 분석 방법을 약술한다.
도 19는 R155 치환이 VX-950에 대하여 낮은 수준의 내성을 부여한다는 것을 나타낸다.
도 20은 R155K 변이체 프로테아제의 X-선 구조를 나타낸다.
도 21은 R155K 변이체 프로테아제에 결합하는 VX-950의 컴퓨터 모델이다.
도 22는 V36 또는 T54 치환이 VX-950에 대하여 낮은 수준의 내성을 부여한다는 것을 나타낸다.
도 23은 V36M 변이체 프로테아제에 결합하는 VX-950의 컴퓨터 모델이다.
도 24는 V36M 및 R155K 치환은 VX-950에 대한 내성을 부여하는데 있어서 부가적이라는 것을 나타낸다.
도 25는 구조 연구 결과를 나타낸다: (A) Lys¹⁵⁵ 변이체의 X-선 구조와, NS4A 보조인자와의 복합체 형태인 Arg¹⁵⁵ 야생형 NS3 프로테아제 도메인의 중첩. 야생형(청색) 및 R155K 변이체(적색) 프로테아제, 둘 모두의 Cα 원자의 자취는 선으로 나타낸다. 155번 잔기는 질소는 청색으로 산소는 적색으로 하여 공막대 모형(Arg¹⁵⁵) 또는 감초(Liquorice) 모형(Lys¹⁵⁵)을 사용하여 밝게 표시한다. (B) 야생형 NS3-4A에서 Arg¹⁵⁵, Asp¹⁶⁸ 및 Arg¹²³의 측쇄와, R155K 변이체에서 상응하는 Lys¹⁵⁵, Asp¹⁶⁸ 및 Arg¹²³의 측쇄 중첩. R155K 변이체 프로테아제의 3개의 잔기(Arg¹²³, Asp¹⁶⁸, 및 Lys¹⁵⁵)를 감초 모델로 나타내고, 야생형 프로테아제의 Arg¹⁵⁵도 감초 모델로 나타낸다. 야생형 프로테아제의 Arg¹²³ 및 Asp¹⁶⁸ 잔기는 가는 선으로 나타낸다. 모든 질소는 청색, 산소는 적색으로 표시된다.
도 26은 NS4A 보조인자와의 복합체 형태인 HCV NS 3 프로테아제 도메인과, 텔라프레비어의 공-복합체의 컴퓨터 모델을 나타낸다. 야생형(A), R155K(B) 또는 R155T(C) 변이체 프로테아제를 포함한 3개의 모델 모두에서, 텔라프레비어는, 질소는 담청색이고 산소는 적색으로 표시되는 막대 도형으로 나타낸다. 활성 부위 잔기(His⁵⁷, Asp⁸¹, 및 Ser¹³⁹)는 회색 막대로 나타낸다. Arg¹²³ 및 Asp¹⁶⁸ 잔기는 보라색으로 표시되고, 155번 잔기의 측쇄는 황색으로 표시된다. Lys¹⁵⁵ 또는 Thr¹⁵⁵ 측쇄는 신장된 입체형태로 유지되고, 이를 통해 텔라프레비어 P2 기와 최소한의 접촉이 이루어진다.
도 27은 VX-950 내성 레플리콘 변이체는 IFN-알파에 대하여 완전히 감수성인 상태로 유지된다.
도 28은 VX-950 내성 레플리콘 변이체는 리바비린-알파에 대하여 완전히 감수성인 상태로 유지된다.
도 29는 VX-950 병용 요법이 투여되는 동안 바이러스 내성 출현을 억제시켰고, 바이러스 돌파 현상을 방지하였다는 것을 나타낸다.
도 30은 HCV 서열 다양성과 내성 돌연변이에 관한 요약점을 제공한다.
도 31은 종래의 연구를 비롯한, HCV 프로테아제 저해제에 대한 바이러스 변이체 내성의 기전을 요약한다.
도 32는 종래의 연구와 본 연구를 비롯한 HCV 프로테아제 저해제에 대한 바이러스 변이체 내성의 기전과 관련되는 결론을 약술한다.
도 33은 본 연구에 기초한 특정 결론을 요약한다.

본 발명은 HCV 변이체에 관한 것이다. 특히, 프로테아제 저해제에 대한 내성을 나타내는 HCV 변이체를 제공한다. 또한, HCV 변이체와 관련된 방법 및 조성물도 제공한다. 본 방법 및 조성물은 HCV 및 다른 바이러스의 변이체를 비롯한 바이러스 변이체를 동정하는데 유용하고, 항바이러스 화합물을 평가하고 동정하는데 유용하며, 바이러스 감염에 대한 치료제를 개발하고 최적화시키는데 유용하다.

본 발명은 VX-950 투여 이전의, 임상 시험에 등록한 34명의 대상자로부터 단리된 HCV의 NS3 프로테아제 도메인내 서열 다양성 정도를 최초로 특징화한 연구인, 연구 VX04-950-101에 기초한다. 이어서, VX-950에 대한 내성 출현은 VX-950을 14일간 투여한 후 대상자에서 프로테아제 NS3-4A 영역의 서열을 분석함으로써 모니터하였다. 투여하는 동안 발생한 임의의 약물-내성 돌연변이가 VX-950 제거 이후에도 혈장에서 유지되는지 여부를 알아보기 위하여 투여 종료 후 7 내지 10일이 경과한 후에 추적 관찰(follow-up) 샘플을 더 수집하였다. 집단에서 기준선보다 높게 증가한 것으로 밝혀진 임의의 돌연변이는 잠재적으로 약물 내성인 돌연변이로 간주되었다. 약물-내성 돌연변이가 측정가능한 수준까지 축적되는데는 약간의 시간이 소요될 수 있기 때문에 본 연구는 소집단의 변이체(야생형 바이러스 및 바이러스 변이체의 집단에서 우성 종 대신)를 검출하는 새로운 방법을 포함하였는데, 이는 매 시점마다 대상자 1명당 다수(예컨대, 80-85개)의 개개의 바이러스 클론으로부터 서열을 수득하는 것을 포함하였고, 이로써 VX-950을 14일간 투여하였을 때 집단의 약 5%까지 감수성이 감소하여 출현할 수 있는 바이러스 변이체를 검출하고 동정할 수 있다. 그러한 80/85개의 개개의 바이러스 클론은 80/85개 이하의 상이한 비리온을 나타낼 수 있다.

HCV 변이체 및 관련 폴리뉴클레오티드 및 프로테아제

본 발명은 HCV 변이체를 제공한다. 특정 실시태양에서, HCV 변이체는 예로서, VX-950과 같은 프로테아제 저해제에 대한 감수성이 감소된 HCV 프로테아제 ("변이체 HCV 프로테아제"로도 명명됨)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 야생형 HCV는 프로테아제 저해제에 대하여 정상의 또는 바람직한 감수성을 갖는 HCV 프로테아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드("야생형 폴리뉴클레오티드"로도 명명됨)를 포함하는 HCV를 지칭하고, 특정 실시태양에서, 프로테아제 저해제는 VX-950이다. 유사하게, 야생형 HCV 프로테아제는 프로테아제 저해제에 대하여 정상의 또는 바람직한 감수성을 갖는 HCV 프로테아제를 지칭하고, 특정 실시태양에서, 프로테아제 저해제는 VX-950이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, HCV는 임의의 유전자형 또는 아형, 예를 들면, 유전자형 1-6의 HCV일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "NS3 프로테아제" 또는 "HCV NS3 프로테아제"는 세린 프로테아제 활성을 갖는 HCV NS 단백질 3 또는 그의 일부분을 지칭한다. 예를 들면, NS3 프로테아제는 서열번호 2(685개의 아미노산)의 처음 631개의 아미노산 서열로 표시되는 NS3 단백질일 수 있고; 별법으로, NS3 프로테아제는 서열번호 2의 처음 181개의 아미노산으로 표시되는 단백질일 수 있으며; 181-아미노산 단편 또한 당업계에서는 NS3 프로테아제 도메인으로서 지칭된다. NS3 프로테아제는 NS3-NS4A 단백질 복합체, 예로서, 미국 특허 번호 제6,653,127호; 제6,211,338호에 기재되어 있는 복합체일 수 있다. "NS3 프로테아제 활성"은 NS4A 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 일부분의 존재 또는 부재하의 HCV NS 단백질 3 또는 그의 일부분의 프로테아제 활성을 의미한다. 예로서, 서열번호 2의 마지막 54개의 아미노산 서열로 표시되는 것과 같은 NS4A 단백질은 NS3 프로테아제에 대한 보조인자로서 작용을 하며, NS3-NS4A 세린 프로테아제 복합체를 형성할 수 있고; NS4A 단백질의 생물학적으로 활성인 일부분은 NS3 프로테아제에 대한 보조인자로서의 NS4A 단백질 작용을 보유하는 NS4A 단백질 단편을 지칭한다.

본 발명은 또한 단리된 HCV 변이체, 단리된 변이체 HCV NS3 프로테아제, 및 변이체 HCV NS3 프로테아제를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. "단리된"이라는 용어는 일반적으로 대상 바이러스, 프로테아제, 또는 폴리뉴클레오티드의 천연 환경 성분으로부터 분리되고/거나 회수된 것을 의미한다.

특정 실시태양에서, 변이체 HCV 프로테아제는 야생형 HCV NS3 프로테아제의 36, 41, 43, 54, 148, 155, 또는 156번 위치로부터 하나 이상의 위치에 있는 아미노산(들)이 야생형 HCV NS3 프로테아제의 각각의 상응하는 위치에 있는 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 HCV NS3 프로테아제일 수 있다. 야생형 HCV NS3 프로테아제는 서열번호 2 또는 그의 일부분, 예로서, 서열번호 2의 처음 181개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 단리된 HCV NS3 프로테아제는 HCV NS3 프로테아제의 생물학적으로 활성인 유사체 또는 단편을 포함할 수 있고, 예를 들면, 단리된 HCV NS3 프로테아제는 서열번호 2의 N-말단 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 또는 48개의 아미노산을 갖지 않을 수 있다.

변이체 HCV NS3 프로테아제의 다양한 위치에서의 아미노산 치환 또는 돌연변이의 일례는 표 1-4에 나타낸다. 본원에서 표, 도, 및 실시예는 또한 야생형 HCV NS3 프로테아제 또는 야생형 HCV와 비교하여 변이체 HCV NS3 프로테아제 또는 HCV 바이러스 변이체로부터 수득한 다양한 데이타도 제공한다.

본 발명의 변이체 HCV NS3 프로테아제의 생물학적으로 활성인 유사체 또는 단편 또한 제공한다. (Bartenschlager) 등[(1994, J. Virology 68: 5045-55)]은 HCV NS3 단백질의 다양한 단편을 기재하였는데, 예를 들면, N-말단 7개 또는 23개의 잔기의 결실은 NS4B/5A 부위에서의 절단을 소멸시켰지만, 다른 절단 부위에 대한 어떤 효과도 NS3 프로테아제 활성에는 영향을 주지 않았고, N-말단 39개 잔기의 결실은 NS4B/5A 및 NS5A/5B 부위의 절단을 소멸시키고, NS4A/4B 부위상의 NS3 프로테아제 활성을 감소시켰다. (Failla) 등[1995, J. Virology 69: 1769-77]은, 야생형 NS3 단백질의 N-말단 10개 잔기의 결실이 NS3 프로테아제 활성에는 어떠한 영향도 주지 않았고, N-말단 15개 또는 28개의 잔기의 결실이 부분적인 프로테아제 활성을 갖는(NS5A/5B에서의 절단은 정상이지만, NS4A/4B 및 NS4B/5A 부위에서의 절단은 그보다 낮다) NS3 단백질을 생성하였고, N-말단 49개 잔기의 결실은 NS3 프로테아제를 완전히 불활성화시켰고, NS3 단백질에서 NS3 프로테아제의 C-말단 10개 잔기의 결실 또한 NS3 프로테아제를 완전히 불활성화시켰다.

예를 들면, 본 발명의 변이체 HCV 프로테아제를 제조하는 발현 시스템을 제공한다. 발현 시스템은 본 발명의 HCV 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 HCV 폴리뉴클레오티드(또는 본원에서 "핵산"으로도 상호교환적으로 사용됨)를 포함하는 적합한 원핵 또는 진핵 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 적절한 방법(예컨대, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염)에 의해 적합한 숙주 세포내로 도입시켜 폴리뉴클레오티드를 (예컨대, 벡터내의 또는 숙주 세포 게놈으로 통합된) 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 생산을 위해 숙주 세포를 발현에 적합한 조건(예컨대, 유도인자하의 적절한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충제 등으로 보충된 적합한 배지)하에서 유지시켜 코딩되는 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 원하는 경우, 코딩된 단백질을 (숙주 세포 또는 배지로부터) 회수하고/거나 단리시킬 수 있다. 생산 방법은 트랜스제닉 동물의 숙주 세포에서의 발현을 포함한다는 것을 이해할 것이다(예컨대, WO 92/03918을 참조할 수 있다). 발현 시스템은 무세포 시스템, 예로서, 미국 특허 번호 제6,258,558호에 기재되어 있는 RNA-단백질 융합 기술, 또는 미국 특허 번호 제6,361,943호에 기재된 시험관내 "바이러스"에 기초할 수 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제5,843,701호에 기재되어 있는 것과 같은 리보솜 디스플레이 방법 또한 사용될 수 있다.

HCV의 표현형 분석에 적합한 검정법과 같은 다양한 검정법을 제공한다. 검정법은 바이러스 활성(예컨대, 바이러스 입자의 감염, 복제 및/또는 방출) 또는 효소 활성(예컨대, 프로테아제 활성)을 측정하는 것에 관한 것일 수 있다. 바이러스 활성 검정법은 측정하고자 하는 활성을 갖는 바이러스 또는 바이러스 변이체로 감염된 세포 또는 샘플을 사용할 수 있다. 세포 또는 샘플은 환자, 예로서, 인간 환자로부터 수득할 수 있다. 별법으로, 세포 또는 샘플을 시험관내에서 바이러스 또는 바이러스 변이체와 함께 배양하거나, 그로 감염시킬 수 있다. 바이러스 활성 검정법은 예로서, [Trozzi et al. (13)] 및 미국 특허 출원 공보 번호 제20050136400호에 기재되어 있는 레플리콘-기초 검정법과 같은 레플리콘-기초 시스템을 사용할 수 있다.

효소 활성은 일반적으로 관심의 대상이 되는 효소 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편 또는 유사체, 및 관심의 대상이 되는 효소에 대한 기질을 포함하는 무세포 또는 세포계 시스템에서 측정될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 제20030162169호에는 HCV NS3 프로테아제의 활성을 검정하는 대용 세포계 시스템 및 방법이 기재되어 있다. [Trozzi et al. (13)]에는 펩티드 기질 및 HPLC 시스템을 사용하는 시험관내, 무세포 프로테아제 검정법이 기재되어 있다.

본 발명은 NS3/4A 프로테아제의 3차원적 구조가 해석되었다는 사실을 이용한다(예컨대, WO 98/11134를 참조할 수 있다). 본 발명의 변이체 프로테아제의 3차원적 모델은, 예를 들면, 변이체 프로테아제의 3차원적 구조와 상호작용할 수 있는 화합물의 능력에 기초하여 화합물을 디자인하거나 선택하고, 프로테아제에 결합하거나, 그와 상호작용할 수 있는 능력을 컴퓨터 가상 실험으로 모델링하여 평가하거나, 시험관내 또는 생체 검정법으로 추가로 평가함으로써 수득할 수 있다.

화합물은 조합 화학 라이브러리로부터 동정된 것이거나, 논리적 약물 디자인을 통해 제조된 것일 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 화합물은 논리적 약물 디자인을 통해 제조되고, 공지된 프로테아제 저해제, 예로서, VX-950의 구조로부터 유래된 화합물이다. 또한, 잠정적 프로테아제 저해제 약물 표적을 조합 라이브러리로부터의의 화합물과 함께 시험하는 대규모 스크리닝 실험의 체계적 방법과 논리적 약물 디자인이 조합될 수 있다. 논리적 약물 디자인은 초점이 맞추어진 접근법으로, 이는 약물 수용체 또는 그의 천연 리간드중의 하나의 구조에 관한 정보를 사용하여 후보 약물을 동정 또는 생성한다. 단백질의 3차원적 구조는 X-선 결정술 또는 핵자기공명 분광광도법과 같은 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에 있어서, 36, 41, 43, 54, 148, 155, 또는 156번 잔기에서의 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 변이체 HCV NS3 프로테아제의 3차원적 구조는 통상의 X-선 결정술 및/또는 NMR 분광광도법를 사용하여 용이하게 측정될 수 있다. 논리적 약물 디자인은 또한 잠정적 프로테아제 저해제 약물 표적을 조합 라이브러리로부터의 화합물과 함께 시험하는 대규모 스크리닝 실험의 체계적인 방법과 조합될 수 있다. 컴퓨터 프로그램을 고안하여 다수의 상이한 화학적 화합물의 구조를 포함하는 데이터베이스를 검색할 수 있다. 상기 컴퓨터는 변이체 HCV NS3 프로테아제와 가장 잘 상호작용할 것 같은 화합물을 선택할 수 있으며, 상기와 같이 동정된 화합물은 프로테아제 저해제를 평가하는데 적합한 검정법(예컨대, 바이러스 또는 효소 검정법)으로 시험될 수 있다.

특정 실시태양에서, 동정된 화합물은 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체, 애주번트 또는 비히클을 포함하는 조성물로 제조된다. 바람직하게, 상기 조성물은 HCV NS3 세린 프로테아제의 활성을 감소시키는데 유효한 양으로 상기 화합물을 함유한다. 더욱더 바람직하게, 상기 조성물은 환자에 투여하기 위한 것으로 제조된다. 조성물은 또한 면역조절제; 항바이러스제; HCV 프로테아제의 제2 저해제; HCV 생활 주기중의 또다른 표적에 대한 저해제; 사이토크롬 P-450 저해제; 또는 그 조합으로부터 선택되는 추가의 제제를 포함할 수 있다. 다양한 조성물은 하기에 더욱 상세히 기술된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 HCV 프로테아제, 특히, 야생형 HCV NS3 프로테아제와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 변경된 HCV NS3 프로테아제에 특이적인 항체를 제공한다. 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 제한없이 단일클론 항체, 다중클론 항체, 키메라 항체, 2개 이상의 본래의 항체로부터 형성된 다중특이성(예컨대, 이중특이성 항체) 항체, 및 항체 단편을 포함한다. 용어 "면역글로불린"은 반드시 항체일 필요는 없으며, 여러가지의 구조상 관련된 단백질을 포함한다.

"항체 단편"은 본래 항체의 일부분, 바람직하게, 본래 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편의 일례로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체[Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)]; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 바람직하게, Fv 폴리펩티드는 추가로 scFv가 항원 결합에 대하여 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다. scFv에 대한 리뷰를 위해 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. (Springer- Verlag: New York, 1994), pp. 269-315]를 참조할 수 있다.

용어 "디아바디"는, 단편이 동일한 폴리펩티드 쇄내 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 것(VH-VL)인, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 너무 짧기 때문에 동일 쇄상의 2개의 도메인 사이에 쌍이 이루어지지 못하도록 하는 링커를 사용함으로써 도메인이 또다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 할 수 있고, 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 할 수 있다. 디아바디는 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

변이체 HCV 프로테아제에 대한 항체는 예를 들면, 분자 진화를 통해 HCV NS3 단백질에 대한 공지된 항체로부터 개발될 수 있다. 미국 특허 출원 공보 번호 제20040214994호에는 HCV NS3 단백질에 대한 인간 재조합 항체가 기재되어 있다. 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 공지 항체의 DNA에 도입시키거나, 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러한 변이체로는 예를 들면, 공지 항체의 아미노산 서열내 잔기로부터의 결실, 및/또는 그것으로의 삽입 및/또는 그의 치환을 포함한다. 단, 최종 작제물이 원하는 특징을 갖고 있다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합으로 최종 작제물에 도달하게 된다. 아미노산 변화는 또한 항체의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있고, 예로서, 당화 부위의 갯수와 위치를 변화시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 치료학적 적용 뿐만 아니라, 진단학적 적용도 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표지화된다. 본 개시의 다양한 항체는 변이체 HCV NS3 프로테아제의 발현을 검출하거나 측정하기 위하여 사용될 수 있고, 그러므로, 이는 또한 예로서, 세포 분리 및 영상화(예컨대, 유식 세포 측정, 및 형광 표지 세포 분리)와 같이 진단 또는 연구용으로 유용하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "표지" 또는 "표지된"이라는 용어는 항체내 또다른 분자의 혼입을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 표지는 검출가능한 마커이며, 예컨대, 방사성 표지된 아미노산의 혼입 또는 마킹된 아비딘(예컨대, 광학적 방법 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 효소 활성 또는 형광 마커를 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 부분의 폴리펩티드에 대한 부착이다. 또다른 실시태양에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예컨대, 약물 접합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 일례로는 하기의 방사성 동위 원소 또는 방사성 핵종(예컨대, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 표지(예컨대, FITC, 로다민, 란탄족 원소 인광체), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼록시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼라인 포스파타제), 화학발광 마커, 바이오티닐 기, 2차 리포터(예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태크)에 의해 인식되는 미리결정된 폴리펩티드 에피토프, 자성 물질, 예로서, 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예로서, 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그래미시딘 D, 브롬화 에티듐, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테니포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키친, 미스라마이신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 마이토잔트론, 미스라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신, 및 그의 유사체 또는 동족체를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 일부 실시태양에서, 표지는 잠재적인 입체 방해를 감소시키기 위하여 길이가 다양한 스페이서 암에 의해 부착된다.

특정 측면에서, 생물학적 샘플내 HCV 바이러스, 변이체 HCV NS3 폴리뉴클레오티드, 또는 변이체 HCV 프로테아제의 존재를 검출하는데 사용하기 위한 키트 또한 제조할 수 있다. 그러한 키트는 본 발명의 변이체 HCV NS3 프로테아제를 인식하는 항체 뿐만 아니라, 항체와, 변이체 프로테아제 또는 그의 일부부 사이의 복합체의 존재를 검출하는데 적합한 하나 이상의 부속 시약을 포함할 수 있다. 별법으로, 그러한 키트는 본 발명의 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있으며, 그러한 프로브 또는 프라이머는 엄격한 조건하에서 본 발명의 변이체 HCV NS3 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있다. 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 관심의 대상이 되는 대상을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 PCR 또는 RT-PCR에 적합할 수 있다. 별법으로, 그러한 키트는 상업적으로 구입가능한 PCR 또는 비-PCR 기초 HCV 진단용 키트, 예컨대, RNA 3.0 검정법(RNA 3.0 Assay)(bDNA) 및 RNA 정성 검정법(RNA Qualitative Assay)(TMA)을 비롯한, RNA 로슈 코바스 앰플리코 시스템(Roche Cobas Amplicor system) 및 바이엘 벌상트 시스템(Bayer Versant system)에 기초할 수 있다. 앰플리코 HCV 모니터® 테스트 v2.0(AMPLICOR HCV MONITOR® Test, v2.0)은 인간 혈청 또는 혈장내 HCV RNA의 측량을 위한 시험관내 핵산 증폭 시험이다. 벌상트® HCV RNA 3.0 검정법(VERSANT® HCV RNA 3.0 Assay)(bDNA)은 2 log10 감소를 신뢰성있게 검출하는 것으로 입증되는 바이러스 부하량 검정법이다. 벌상트® HCV RNA 정량 검정법은 최신 전사-매개 증폭(TMA: Transcription-Mediated Amplification) 기술에 기초한다.

약제학적 조성물 및 제제

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 화합물, 예를 들면, VX-950의 활성을 구제할 수 있는 것으로 동정된 제2 화합물, 또는 HCV 변이체에 대하여 유효한 것으로 동정된 화합물(예컨대, 바이러스 변이체의 복제를 감소시킬 수 있는 화합물) 및/또는 변이체 HCV NS3 프로테아제에 대하여 유효한 것으로 동정된 화합물(예컨대, 변이체 프로테아제의 효소 활성을 감소시킬 수 있는 화합물)을 포함하는 약제학적 조성물 또는 제제를 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은 약제, 예로서, 환자의 HCV 감염 치료용 약제의 제조에서 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은 환자의 HCV 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 일반적으로 환자에게 약제학적으로 또는 치료학적으로 유효량인 본 발명의 화합물을 단독으로, 또는 또다른 항바이러스제와 함께(순차적으로 또는 동시에) 투여하는 것을 포함한다. 화합물 또는 제제의 "유효량"은 일반적으로 상기 화합물 또는 제제의 부재하에서 파라미터의 수준과 비교할 때 HCV NS3 프로테아제 발현 또는 활성, HCV 생산, 복제, 또는 병원성, HCV 감염을 재현가능하게 감소시키거나, HCV 감염의 하나 이상의 증상을 재현가능하게 호전시키거나 완화시키는데 유효한 양을 지칭한다.

또다른 측면에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 프로테아제 저해제(예컨대, VX-950) 및 또다른 항바이러스제, 바람직하게, 항-HCV 제제를 포함한다. HCV를 표적하는 병용 요법은 또한 미국 특허 번호 제6,924,270호; 제6,849,254호에 기재되어 있다.

또다른 항바이러스제는 또한 프로테아제 저해제, 특히, HCV 프로테아제 저해제일 수 있다. 당업계에 공지된 HCV 프로테아제 저해제로는 VX-950(도 8), BILN 2061(도 8, 또한 PCT 공개 번호 WO 00/59929; 미국 특허 번호 제6,608,027호를 참조할 수 있다), 화합물 1(13), 저해제 A, B, 및 C(PCT 공개 번호 WO 04/039970)를 포함한다. 잠재적인 HCV 프로테아제 저해제는 또한 PCT 및 미국 특허 출원 공개 번호 WO 97/43310, US 20020016294, WO 01/81325, WO 02/08198, WO 01/77113, WO 02/08187, WO 02/08256, WO 02/08244, WO 03/006490, WO 01/74768, WO 99/50230, WO 98/17679, WO 02/48157, US 20020177725, WO 02/060926, US 20030008828, WO 02/48116, WO 01/64678, WO 01/07407, WO 98/46630, WO 00/59929, WO 99/07733, WO 00/09588, US 20020016442, WO 00/09543, WO 99/07734, US 20020032175, US 20050080017, WO 98/22496, WO 02/079234, WO 00/31129, WO 99/38888, WO 99/64442, WO 2004072243, 및 WO 02/18369, 및 미국 특허 번호 제6,018,020호; 제6,265,380호; 제6,608,027호; 제5,866,684호; [M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, pp. 1713-18 (1998); W. Han et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, 10, 711-13 (2000)]; [R. Dunsdon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1571-79 (2000)]; [M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2267-70 (2000)]; 및 [S. LaPlante et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2271-74 (2000)]에 기재되어 있다. 다수의 NS3 프로테아제 저해제는 또한 셰링 코포레이션(Schering Corp.), 셰링 아게(Schering A.G.), 및 기타 회사에 의해 개발되었고, 이는 미국 특허 출원 공개 번호 제20050249702호; 제20050153900호; 제20050245458호; 제20050222047호; 제20050209164호; 제20050197301호; 제20050176648호; 제20050164921호; 제20050119168호; 제20050085425호; 제20050059606호; 제20030207861호; 제20020147139호; 제20050143439호; 제20050059606호; 제20050107304호; 제20050090450호; 제20040147483호; 제20040142876호; 제20040077600호; 제20040018986호; 제20030236242호; 제20030216325호; 제20030207861호; 미국 특허 번호 제6,962,932호; 제6,914,122호; 제6,911,428호; 제6,846,802호; 제6,838,475호에 기재되어 있다.

항바이러스제는 또한 면역조절제, 예로서, 알파-, 베타-, 및 감마-인터페론, 페길화로 유도체화된 인터페론-알파 화합물, 및 티모신; 다른 항바이러스제, 예로서, 리바비린, 아만타딘, 및 텔비부딘; 다른 C형 간염 프로테아제 저해제(NS2-NS3 저해제 및 NS3-NS4A 저해제); 헬리카제 및 폴리머라제 저해제를 비롯한 HCV 생활 주기중의 다른 표적에 대한 저해제; 내부 리보솜 진입 저해제; 광범위성 바이러스 저해제, 예컨대 IMPDH 저해제(예컨대, 미국 특허 번호 제5,807,876호, 제6,498,178호, 제6,344,465호, 제6,054,472호, WO 97/40028, WO 98/40381, WO 00/56331의 화합물, 및 미코페놀산 및 그의 유도체, 및 VX-497, VX-148, 및/또는 VX-944을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다); 또는 상기의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 [W. Markland et al., Antimicrobial & Antiviral Chemotherapy, 44, p. 859 (2000)] 및 미국 특허 번호 제6,541,496호를 참조할 수 있다.

본원에서 하기의 정의를 사용한다:

"페그-인트론(Peg-Intron)"은 뉴욕주 케닐워스에 소재하는 셰링 코포레이션으로부터 이용가능한 페그-인트론(PEG-Intron)®인 페그인터페론 알파-2b를 의미하고; "인트론(Intron)"은 뉴욕주 케닐워스에 소재하는 셰링 코포레이션으로부터 이용가능한 인트론-A(Intron-A)®인 인터페론 알파-2b를 의미하며; "리바비린"은 캘리포니아주 코스타메이사에 소재하는 ICN 파마슈티칼스 인코포레이티드(ICN Pharmaceuticals, Inc.)로부터 이용가능한 리바비린(1-베타-D-리보푸라노실-1H--1,2,4-트리아졸-3-카복스아미드를 의미하는데; 이는 [Merck Index, entry 8365, Twelfth Edition]에 기재되어 있고; 또한, 뉴욕주 케닐워스에 소재하는 셰링 코포레이션으로부터 레베톨(Rebetol)®로서, 또는 뉴욕주 너틀리에 소재하는 호프만 라 로슈(Hoffmann-La Roche)로부터 코페구스(Copegus)®로서 이용가능하며; "페가시스(Pagasys)"는 뉴욕주 너틀리에 소재하는 호프만 라 로슈로부터 이용가능한 페가시스(Pegasys)®인 페그-인터페론 알파-2a를 의미하고; "로페론(Roferon)"은 뉴욕주 너틀리에 소재하는 호프만 라 로슈로부터 이용가능한 로페론®인 재조합 인터페론 알파-2a를 의미하며; "베로포(Berofor)"는 코네티컷주 리지필드에 소재하는 베링거 인겔하임 파마슈티칼 인코포레이티드(베링거 인겔하임(Boehringher Ingelheim)로부터 이용가능한 베로포(Berofor)®인 인터페론 알파-2a를 의미하고; 스미페론(Sumiferon)®은 일본 수미토모로부터 이용가능한 예로서, 스미페론과 같은 천연 알파 인터페론의 정제된 혼화물이고; 웰페론(Wellferon)®은 영국에 소재하는 글락소 웰컴 리미티드(Glaxo Wellcome Ltd.)로부터 이용가능한 인터페론 알파 n1이고; 알페론(Alferon)®은 코네티컷에 소재하는 퍼듀 프레드릭 코포레이션(Purdue Frederick Co.)으로부터 이용가능한 인토페론 사이언스에 의해 제조된 천연 알파 인터페론의 혼합물이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "인터페론"은 바이러스 복제 및 세포성 증식을 저해하며, 면역 반응을 조절하는, 예로서, 인터페론 알파, 인터페론 베타 또는 인터페론 감마와 같은, 고도로 상동성인 종-특이적 단백질 계열의 일원이다. [Merck Index, entry 5015, Twelfth Edition]. 본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 인터페론은 알파-인터페론이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따라, 본 발명의 치료학적 조합은 천연 알파 인터페론 2a를 이용한다. 별법으로, 본 발명의 치료학적 조합은 천연 인터페론 2b를 이용한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 치료학적 조합은 알파 인터페론 2a 또는 2b를 이용한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 인터페론은 페길화된 알파 인터페론 2a 또는 2b이다. 본 발명에 적합한 인터페론은 (a) 인트론(Intron)(인터페론-알파 2B, Schering Plough), (b) 페그-인트론, (c) 페가시스(Pegasys), (d) 로페론, (e) 베로포, (f) 스미페론, (g) 웰페론(Wellferon), (h) 캘리포니아주 뉴베리에 소재하는 암젠 인코포레이티드(Amgen, Inc.)로부터 이용가능한 콘센서스 알파 인터페론(consensus alpha interferon), (i) 알페론(Alferon), (j) 비라페론(Viraferon)®, (k) 인페르겐(Infergen)®을 포함한다.

프로테아제 저해제는 경구 투여될 수 있는 반면, 인터페론은 전형적으로 경구 투여되지 못한다. 그럼에도 불구하고, 본원의 어떤 것도 본 발명의 방법 또는 조합을 임의의 특정 투약 형태 또는 요법으로 제한하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 조합의 각 성분은 별개로, 함께, 순차적으로 또는 동시에, 또는 그의 임의의 조합으로 투여될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 프로테아제 저해제 및 인터페론은 별도의 투약 형태로 투여된다. 하나의 실시태양에서, 임의의 추가의 제제는 프로테아제 저해제와 함께 단일 투약 형태의 일부로서, 또는 별개의 투약 형태로서 투여된다. 본 발명은 화합물 및/또는 제제의 조합을 포함하기 때문에, 각 화합물 및/또는 제제의 특정 양은 조합에 포함되는 각각의 다른 화합물의 특정한 양에 의존할 수 있다. 인터페론의 투여량은 전형적으로 IU(예컨대, 약 4백만 IU 내지 약 1200만 IU)로 측정된다.

따라서, 본 발명의 화합물과 조합으로 사용될 수 있는 제제(면역조절제 또는 그외 다른 것들)는 인터페론-알파 2B(Intron A, Schering Plough); 레바트론(Rebatron)(Schering Plough, 인터페론-알파 2B + 리바비린(Ribavirin)); 페길화 인터페론 알파[Reddy, K.R. et al. "Efficacy and Safety of pegylated (40-kd) Inteferon alpha-2a compared with Inteferon alpha-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C", Hepatology, 33, pp. 433-438 (2001)]; 콘센서스 인터페론[Kao, J.H., et al., "Efficacy of Consensus Inteferon in the Treatment of Chronic hepatitis" J. Gastroenterol. Hepatol. 15, pp. 1418-1423 (2000], 인터페론 알파 2A(Roferon A; Roche), 림프아형(lymphoblastoid) 또는 "천연" 인터페론; 인터페론 타우[Clayette, P. et al., "IFN-tau, A New Inteferon Type I with Antiretroviral activity" Pathol. Biol. (Paris) 47, pp. 553-559 (1999)]; 인터루킨 2[Davis, G.L. et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)]; 인터루킨 6[Davis, G.L. et al., 상기 동일]; 인터루킨 12[Davis, G.L. et al., 상기 동일]; 리바비린; 및 제1형 헬퍼 T 세포 반응의 발생을 향상시키는 화합물[Davis, G.L. et al., 상기 동일]을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인터페론은 직접 항바이러스 효과를 나타내고/거나 감염에 대한 면역 반응을 변형시킴으로써 바이러스 감염을 호전시킬 수 있다. 인터페론의 항바이러스 효과는 종종 바이러스 침투 또는 피막제거, 바이러스 RNA의 합성, 바이러스 단백질의 번역, 및/또는 바이러스 조립 및 방출의 저해를 매개로 하여 달성된다.

세포에서의 인터페론의 합성을 자극하는 화합물[Tazulakhova, E. B. et al., "Russian Experience in Screening, analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers," J. Interferon Cytokine Res., 21 pp. 65-73]은 더블 스트랜드 RNA 단독 또는 토브라마이신 및 이미퀴모드(Imiquimod)(3M Pharmaceuticals; [Sauder, D.N. "Immunomodulatory and Pharmacologic Properties of Imiquimod" J. Am. Acad. Dermatol., 43 pp. S6-11 (2000)])와의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 비-면역조절성 또는 면역조절성 화합물은 본 발명의 화합물과의 조합으로 사용될 수 있으며, WO 02/18369(본원에서 참고로 인용된다)(예컨대, 본원에서 그의 전문이 참고로 인용되는데, 273면, 9-22줄 및 274면, 4 줄 내지 276면, 11줄을 참조할 수 있다)에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

세포의 인터페론의 합성을 자극하는 화합물[Tazulakhova et al., J. Interferon Cytokine Res. 21, 65-73]은 더블 스트랜드 RNA 단독 또는 토브라마이신 및 이미퀴모드(3M Pharmaceuticals)[Sauder, J. Am. Arad. Dermatol. 43, S6-11 (2000)]와의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

HCV에 대한 항바이러스 활성을 갖거나, 가질 수 있는 것으로 알려져 있는 다른 화합물로는 리바비린(ICN Pharmaceuticals); 이노신 5'-모노포스페이트 데하이드로게나제 저해제(본원에서 제공하는 VX-497 포뮬라); 아만타딘 및 리만타딘[Younossi et al., In Seminars in Liver Disease 19, 95-102 (1999)]; LY217896(미국 특허 번호 제4,835,168호)[Colacino, et al., Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34, 2156-2163 (1990)]; 및 9-하이드록시이미노-6-메톡시-1,4a-디메틸 1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로-페난트렌-1-카복실산 메틸 에스테르; 6-메톡시-1,4a디메틸-9-(4-메틸-피페라진-1-일이미노)-1,2,3,4,4a,9,10,10a-옥타하이드로-p-헤난트렌-1 카복실산 메틸 에스테르-하이드로클로라이드; 1-(2-클로로-페닐)-3-(2,2-바이페닐-에틸)-우레아(미국 특허 번호 제6,127,422호)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

앞서 언급한 분자의 제형, 투여량, 및 투여 경로는 예를 들면, [F. G. Hayden, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 50, pp. 1191-1223], 및 본원에서 인용되는 참고문헌에 개시돠어 있는 바와 같이, 하기 인용되는 참고문헌에 교시되어 있거나, 당업계에 잘 알려져 있다. 별법으로, 일단 HCV 항바이러스 활성, 특히 약물-내성 HCV 균주에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 화합물이 동정되면, 상기 화합물의 약제학적 유효량은 당업자에게 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, [Benet et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 1, pp. 3-27] 및 본원에서 인용되는 참고문헌을 주목할 수 있다. 따라서, 그러한 화합물의 적절한 제형, 투여 범위, 및 투여 요법은 통상의 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 병용 요법과 관련된 조성물은 하나의 세포 또는 세포들, 또는 환자에게 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 별개의 약제학적으로 허용가능하며, 1 초과의 치료제를 포함하는 제형으로, 또는 단일 제제의 조합 및 다수 제형를 포함하는 제형으로 제공될 수 있다. 투여 경로에 상관없이, 이들 약물 조합은 항-HCV에 유효한 양의 성분을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 제형을 형성한다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기타 다수의 면역조절제 및 면역자극제가 현재 사용가능하며, 이는 하기를 포함한다: AA-2G; 아다만틸아미드 디펩티드; 아데노신 데아미나제, 엔존(Enzon) 애주번트(얼라이언스(Alliance); 애주번트(리비(Ribi); 애주번트(박셀(Vaxcel)); 애주박스(Adjuvax); 아겔라스핀-11; AIDS 치료제(키론(Chiron); 알갈 글루칸, SRI; 알가누누눌린(아누테크(Anutech)); 안진리크(Anginlyc); 항세포 인자(예다(Yeda)); 안티코르트(Anticort); 안티가스트린-17 임뉴노젠(Ap); 항원전달 시스템(Vac); 항원 제형(IDBC); 항GnRH 임뉴노젠(암프톤(Aphton)); 안티헤르핀; 아르비돌; 아자롤; 베이(Bay)-q-8939; 베이-r-1005; BCH-1393; 벡타펙틴; 바이오스팀; BL-001; BL-009; 브론코스트타트(Broncostat); 칸타스팀(Cantastim); CDRI-84-246; 쎄포디자임; 케모카인 억제제, ICOS; CMV 펩타이드(시티 오브 호프(City of Hope)); CN-5888; 사이토카인 방출제(St); DHEAS(패러다임(Paradigm)); DISC TA-HSV; J07B; I01A; I01Z; 디티오카르브 소디움; ECA-10-142; ELS-1; 앤도톡신(노바티스(Novartis); FCE-20696; FCE-24089; FCE-24578; FLT-3 리간드(이뮨넥스(Immunex)); FR-900483; FR-900494; FR-901235; FTS-Zn; G-단백질(카두스(Cadus)); 글루댑신; 글루타우린; 글리코포스포펩티칼; GM-2; GM-53; GMDP; 성장인자 백신(엔트레M(EntreM)); H-BIG, NABI; H-CIG, NABI; HAB-439; 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 백신; 헤르페스-특이적 면역인자; HIV 치료법(유나이티드 바이오메드(United Biomed)); HyperGAM+CF; 임뮤맥스(ImmuMax); 이뮨(Immun) BCG; 면역 요법(컨넥티브(Connective)); 면역조절제(에반스(Evans)); 면역조절제(노바셀(Novacell); 임레그(imreg)-1; 임레그-2; 인도뮨(Indomune); 이노신 프라노벡스; 인터페론(동아(Dong-A))(알파 2); 인터페론(글렌테크)(감마); 인터페론, 노바티스(알파); 인터루킨-12(제네틱스 인코포레이티드(Genetics Inc.)); 인터루킨-15(이뮨넥스); 인터루킨-16(리서치 코포레이션(Research Cor); ISCAR-1; J005X; L-644257; 리코마라스민산; 리포테르(LipoTher); LK-409, LK-410; LP-2307; LT(R1926); LW-50020; MAF(시노기(Shionogi)); MDP 유도체(머크); met-엔케팔린(met-enkephalin)(TNI); 메틸푸릴부티로락톤; MIMP; 미리모스팀; 혼합 박테리아 백신(Tem, MM-1); 모닐리아스테트; MPLA(리비); MS-705; 무라부타이드; 마라부타이드(박신(Vacsyn); 무라밀 디펩타이드 유도체; 무라밀 펩타이드 유도체 미엘로이드; -563; NACOS-6; NH-765; NISV(프로테우스(Proteus)); NPT-16416; NT-002; PA-485; PEFA-814; 펩타이드(사이오스(Scios)); 펩티도글리칸(플리바(Pliva)); 페르톤(Perthon)(어드밴스드 플랜트(Advanced Plant)); PGM 유도체(플리바); 파마프로젝트(Pharmaprojects) 번호 1099; 번호 1426; 번호 1549; 번호 1585; 번호 1607; 번호 1710; 번호 1779; 번호 2002; 번호 2060; 번호 2795; 번호 3088; 번호 3111; 번호 3345; 번호 3467; 번호 3668; 번호 3998; 번호 3999; 번호 4089; 번호 4188; 번호 4451; 번호 4500; 번호 4689; 번호 4833; 번호 494; 번호 5217; 번호 530; 피도티모드; 피멜라우티드; 피나파이드; PMD-589; 포도필로톡신(콘팜(Conpharm)); POL-509; 폴리-ICLC; 폴리-ICLC(야마사 쇼부); 야마사 소유(Yamasa Shoyu); 폴리A-폴리U; 폴리사카라이드 A; 단백질 A(베르룩스 바이오사이언스(Berlux Bioscience)); PS34W0; 슈도모나스 Mabs(Pseudomonas MAbs(테이진(Teijin)); 스마글로빈(Psomaglobin); PTL-78419; 피렉솔(Pyrexol); 피리페론; 레트로겐(Retrogen); 레트로펩(Retropep); RG-003; 리노스타트(Rhinostat); 리파막실; RM-06; 롤린(Rollin); 로무르티드; RU-40555; RU-41821; 루벨라 항체(레스코(ResCo)); S-27649; SB-73; SDZ-280-636; SDZ-MRL953; SK&F-107647; SL04; SL05; SM-4333; 솔루테인(Solutein); SRI-62-834; SRL-172; ST-570; ST-789; 스타패이지 라이세이트; 스티물론; 써프레신; T-150R1; T-LCEF; 타빌라우티드; 테무르티드; 테라다임(Theradigm)-HBV; 테라다임-HBV; 테라다임-HSV; THF(팜 & 업존(Pharm & Upjohn)); THF(예다); 티말파신; 흉선 호르몬 분획; 티모카르틴; 티모림포트로핀; 티모펜틴; 티모펜틴 유사체; 티모펜틴(펩테크(Peptech)); 티모신 분획 5(알파(Alpha)); 티모스티물린; 티모트리난; TMD-232; TO-115; 전달 인자(비라젠(Viragen)); 터프친(셀라보(Selavo)); 우베니맥스; 울사스타트(Ulsastat); ANGG-; CD-4+; 콜라그(Collag)+; COLSF+; COM+; DA-A+; GAST-; GF-TH+; GP-120-; IF+; IF-A+; IF-A-2+; IF-B+; IF-G+; IF-G-1B+; IL-2+; IL-12+; IL-15+; IM+; LHRH-; LIPCOR+L LYM-B+; LYM-NK+; LYM-T+; OPI+; PEP+; PHG-MA+; RNA-SYN-; SY-CW-; TH-A-I+; TH-5+; TNF+; UN.

본 발명에 유용한 대표적 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 화합물은 (+)-시스-5-플루오로-1-[2-(하이드록시메틸)-[1,3-란옥사티올-5일]사이토신; (-)-2'-데옥시-3'-티오시티딘-5'-트리포스페이트(3TC); (-)-시스-5-플루오로-1-[2(하이드록시-메틸)-[1,3-란옥사티올-5-일]사이토신(FTC); (-)2',3', 디데옥시-3'-티아시티딘[(-)-SddC]; 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도사이토신(FIAC); 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도사이토신 트리포스페이트(FIACTP); 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노푸라노실)-5-m-에틸우라실(FMAU); 1-베타-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카복스아미드; 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-5-메틸-데옥시시티딘(FddMeCyt); 2',3'-디데옥시-3'-클로로-5-메틸-데옥시시티딘(ClddMeCyt); 2',3'-디데옥시-3'-아미노-5-메틸-데옥시시티딘(AddMeCyt); 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-5-메틸-시티딘(FddMeCyt); 2',3'-디데옥시-3'-클로로-5-메틸-시티딘(ClddMeCyt); 2',3'-디데옥시-3'-아미노-5-메틸-시티딘(AddMeCyt); 2',3'-디데옥시-3'-플루오로티미딘(FddThd); 2',3'-디데옥시-베타-1-5-플루오로시티딘(베타-1-FddC); 2',3'-디데옥시-베타-1-5-티아시티딘; 2',3'-디데옥시-베타-1-5-시티딘(베타-1-ddC); 9-(1,3-디하이드록시-2-프로폭심- 에틸)구아닌; 2'-데옥시-3'-티아-5-플루오로사이토신; 3'-아미노-5-메틸-데옥시시티딘(AddMeCyt); 2-아미노-1,9-[(2-하이드록시메틸-1-(하이드록시메틸)에톡시]메틸]-6H-퓨린-6-온(간사이클로비어); 2-[2-(2-아미노-9H-퓨린-9y)에틸)-1,3-프로판딜 디아세테이트(팜시클로비어); 2-아미노-1,9-디하이드로-9-[(2-하이드록시-에톡시)메틸] 6H-퓨린-6-온(아사이클로비어); 9-(4-하이드록시-3-하이드록시메틸- -부트-1-일)구아닌(펜시클로비어); 9-(4-하이드록시-3-하이드록시메틸- 부트-1-일)-6- -데옥시-구아닌디아세테이트(팜시클로비어); 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT); 3'-클로로-5-메틸-데옥시시티딘(ClddMeCyt); 9-(2-포스포닐-메톡시에틸-)-2',6'-디아미노퓨린-2',3'-디데옥시리보시드; 9-(2-포스포닐메톡시에틸)-아데닌(PMEA); 아사이클로비어 트리포스페이트(ACVTP); D-카르보사이클릭-2'-데옥시구아노신(CdG); 디데옥시-시티딘; 디데옥시-사이토신(ddC); 디데옥시-구아닌(ddG); 디데옥시-이노신 (ddl); E-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘 트리포스페이트; 플루오로-아라비노푸라노실-요오도우라실; 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1- -베타-D- 아라비노푸라노실)-5-요오도-우라실(FIAU); 스타부딘; 9-베타-D-아라비노푸라노실-9H-퓨린-6-아민 모노하이드레이트(Ara-A); 9-베타-D-아라브모푸라노실-9H-퓨린-6-아민-5'-모노포스페이트 모노하이드레이트(Ara-AMP); 2-데옥시-3'-티아-5-플루오로시티딘; 2',3'-디데옥시-구아닌; 및 2',3'-디데옥시-구아노신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 유용한 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 제조를 위한 합성 방법은 ([Acta Biochim PoL, 43, 25-36 (1996)]; [Swed. Nucleosides Nucleotides 15, 361-378 (1996)]; [Synthesis 12, 1465-1479 (1995)]; [Carbohyd. Chem. 27, 242-276 (1995)]; [Chena Nucleosides Nucleotides 3, 421-535 (1994)]; [Ann. Reports in Med. Chena, Academic Press]; 및 [Exp. Opin. Invest. Drugs 4, 95-115 (1995)])에 개시되어 있는 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.

상기 언급한 참조문헌에 기재된 화학 반응은 본 발명의 화합물의 제조에 있어 가장 넓은 범위의 관점에서 일반적인 것을 개시한다. 종종, 상기 반응은 본원에 개시된 화합물의 범주내 포함된 각 화합물에 관하여 기재된 바와 같이 적용되지 않을 수 있다. 당업자는 이러한 상황이 발생되는 화합물을 용이하게 인식할 것이다. 이러한 모든 경우에, 어떤 반응이든, 예컨대, 간섭기의 적절한 보호, 통상의 대체 반응 물질로의 교환, 통상적인 반응 조건의 변형 등 또는 본원에 개시된 다른 반응과 같이 당업자에게 공지된 통상적 변형 방법을 사용하여 성공적으로 수행될 수 있거나, 그렇지 않은 경우라면, 통상의 다른 방법을 본 발명의 상응하는 화합물의 제조에 적용할 수 있을 것이다. 모든 제조 방법에서, 모든 출발 물질은 공지되어 있거나, 공지된 출발 물질로부터 용이하게 제조될 수 있다.

뉴클레오시드 유사체는 일반적으로 있는 그대로 항바이러스제로서 사용되는 반면, 뉴클레오티드(뉴클레오시드 포스페이트)는 때때로 이들을 세포막을 가로지르는 그의 수송을 용이하게 하기 위하여 뉴클레오시드로 전환되어야 한다. 세포로 진입할 수 있는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 예는 S-1-3-하이드록시-2-포스포닐메톡시프로필 사이토신(HPMPC: S-1-3-hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl cytosine, Gilead Sciences)이다. 본 발명에 사용되며 산(acid)인 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 염을 형성할 수 있다. 예로는, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 또는 마그네슘과 같은 알카리 금속 또는 알카리토 금속과의 염, 또는 유기 염기와의 염 또는 염기성 4급 암모늄염을 포함한다.

당업자는 또한 사이토크롬 P450 모노옥시게나제 저해제의 투여를 선택할 수 있다. 상기 저해제는 사이토크롬 P450에 의해 저해되는 화합물의 혈중 농도 및/또는 간 농도를 증가시키는데 유용할 수 있다. CYP 저해제를 포함하는 본 발명의 실시태양의 경우, 관련있는 NS3/4A 프로테아제의 약동학을 향상시키는 임의의 CYP 저해제가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고/거나, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 CYP 저해제는 리토나비르(WO 94/14436), 케토코나졸, 트롤레안도마이신, 4-메틸피라졸, 사이클로스포린, 클로메티아졸, 시메티딘, 이트라코나졸, 플루코나졸, 미코나졸, 플루복사민, 플루옥세틴, 네파조돈, 세르트랄린, 인디나비르, 넬피나비르, 앰프레나비르, 포삼프레나비르, 세퀴나비르, 로피나비르, 델라비르딘, 에리쓰로마이신, VX-944, 및 VX-497을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 CYP 저해제는 리토나비르, 케토코나졸, 트롤레안도마이신, 4-메틸피라졸, 사이클로스포린 및 클로메티아졸을 포함한다. 리토나비르의 바람직한 투약 형태에 관하여는 미국 특허 번호 제6,037,157호 및 이에 인용된 문헌: 미국 특허 번호 제5,484,801호, 미국 특허 출원 번호 08/402,690, 및 국제 출원 WO 95/07696 및 WO 95/09614를 참조할 수 있다.

사이토크롬 P50 모노옥시게나제 활성을 저해할 수 있는 화합물의 능력을 측정하는 방법은 공지되어 있다(US 6,037,157 및 [Yun, et al. Drug Metabolism & Disposition, vol. 21, pp. 403-407 (1993)]를 참조할 수 있다).

면역조절제, 면역자극제 및 기타 본 발명의 병용 요법에 유용한 제제는 당업계의 통상적인 것보다 더 낮은 양으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 인터페론 알파는 전형적으로, 주 3회 1인당 약 1 x 10⁶ 유니트 내지 주 3회 1인당 약 10 x 10⁶ 유니트의 양으로 HCV 감염의 치료를 위해 인간에게 투여된다[Simon et al., Hepatology 25: 445-448 (1997)]. 본 발명의 방법 및 조성물에 있어서, 이러한 투여량은 주 3회 1인당 약 0.1 x 10⁶ 유니트 내지 주 3회 1인당 약 7.5 x 10⁶ 유니트의 양일 수 있으며; 더욱 바람직하게는 주 3회 1인당 약 0.5 x 10⁶ 유니트 내지 주 3회 1인당 약 5 x 10⁶ 유니트의 양이며; 가장 바람직하게는 주 3회 1인당 약 1 x 10⁶ 유니트 내지 주 3회 1인당 약 3 x 10⁶ 유니트의 양일 수 있다. 본 발명의 HCV 세린 프로테아제 저해제의 존재하의 면역조절제, 면역자극제 또는 다른 항-HCV 제제의 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스성 효능의 향상에 기인하여, 상기 면역저해제/면역자극제는 감소된 양으로 본원에서 주시되는 치료 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 유사하게, 면역조절제 및 면역자극제 존재하의 본 발명의 HCV 세린 프로테아제 저해제의 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스성 효능의 향상에 기인하여, 상기 HCV 세린 프로테아제 저해제는 감소된 양으로 본원에서 주시되는 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 상기와 같은 감소된 양은 치료를 받는 감염 환자에서 C형 간염바이러스 역가를 모니터하는 통상의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 이는 환자의 혈청중에서 슬롯-블롯, 도트-블롯, 또는 RT-PCR 기법에 의해 HCV RNA를 모니터하거나, HCV 표면 또는 기타 항원을 측정하여 수행될 수 있다. 유사하게, 이러한 환자에서 병용하여 사용되는 경우, 본원에 개시된 HCV 세린 프로테아제 저해제 및 항-HCV 활성을 갖는 다른 화합물, 예를 들면, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드 항바이러스제를 사용하는 병용 요법시 환자를 모니터하여 이들 각각의 화합물의 최소 유효량을 결정할 수 있다.

본원에 개시된 병용 요법에서 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 항바이러스성 화합물 또는 그의 혼합물은 약 0.1 mg/환자/일 내지 약 500 mg/환자/일; 바람직하게는 약 10 mg/환자/일 내지 약 300 mg/환자/일; 더욱 바람직하게는 약 25 mg/환자/일 내지 약 200 mg/환자/일; 더욱더 바람직하게는 약 50 mg/환자/일 내지 약 150 mg/환자/일; 및 가장 바람직하게는 약 1 mg/환자/일 내지 약 50 mg/환자/일의 범위의 양으로 환자에게 투여될 수 있다.

화합물의 복용량은 단일 투약 또는 일정 비율로 나눈 투약 형태로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 복용 단위 조성물은 하루의 투약량을 여러 회로 나눈 양을 포함한다. 하루에 수회 투여하는 경우, 약물을 처방하는 사람이 필요하다고 판단하면, 1일 총 투여량 또한 증가시킬 수 있다.

HCV 감염을 앓는 환자를 본 발명의 화합물 및/또는 조성물로 치료하는 요법은 환자의 나이, 체중, 성별, 식이, 및 건강 상태, 감염의 중증도, 투여 경로, 사용되는 특정 화합물의 활성, 효능, 약동학적 특성, 및 독성 프로파일과 같은 약리학적 고려사항, 및 약물 전달 시스템의 사용 여부를 포함하는 다양한 요소를 고려하여 선택된다. 본원에 개시된 약물 병용 투여는 일반적으로 수주 내지 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐, 바이러스가 통제되었거나 근절되었음을 나타내는, 바이러스의 역가가 허용가능한 농도에 도달할 때까지 계속되어야 한다. 본원에 개시된 약물 병용법으로 치료를 받는 환자는 요법의 효능을 측정하기 위해, 환자의 혈청중에서 슬롯-블롯, 도트-블롯, 또는 RT-PCR 기법을 사용하여 간염 바이러스 RNA를 모니터하거나 혈청중의 표면 항원과 같은 C형 간염 바이러스 항원을 측정함으로써 통상적으로 모니터될 수 있다. 이러한 방법으로 수득한 데이터를 계속해서 분석하면 치료하는 동안에 치료 요법을 변형함으로써 조합물중 각 성분의 적정량을 투여할 수 있고, 치료 기간 또한 결정할 수 있다. 따라서, 치료 요법/투여 계획은 치료 과정에 걸쳐 논리적으로 변형될 수 있기 때문에, 병용시에 함께 만족할 만한 항-C형 간염 바이러스에 대한 효능을 나타내는 항바이러스 화합물의 각 성분을 최소량으로 투여할 수 있고, 성공적인 치료를 위해서 필요시 되는 경우에 한하여, 상기 항바이러스 화합물의 병용 투여는 계속된다.

본 발명은 상기 언급한 화합물과 유사한 유형의 항-HCV-활성을 갖는 화합물을 다양한 조합으로 하여, 본 발명에 개시된 HCV 세린 프로테아제 저해제를 환자, 특히 VX-950 및 기타 표준 프로테아제 저해제에 의한 치료에 내성을 나타낸 HCV 감염이 있는 환자의 HCV 감염의 치료 또는 예방에 사용하는 용도를 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 HCV 세린 프로테아제 저해제를, 항-HCV 활성을 갖는 하나 이상의 인터페론 또는 인터페론 유도체; 항-HCV 활성을 갖는 하나 이상의 비-인터페론 화합물; 또는 하나 이상의 항-HCV 활성을 갖는 하나 이상의 인터페론 또는 인터페론 유도체 및 하나 이상의 항-HCV 활성을 갖는 하나 이상의 비-인터페론 화합물과의 조합으로 사용할 수 있다. 인간 환자에서의 HCV 감염의 치료 또는 예방을 위해 조합으로 사용되는 경우, 임의의 본원에 개시된 HCV 세린 프로테아제 저해제 및 항-HCV 활성을 갖는 앞서 기술한 화합물은 약제학적으로 또는 항-HCV에 유효한 양으로 존재할 수 있다. 이들의 부가적 또는 상승적 효과에 의하여, 상술한 바와 같이 조합으로 사용되는 경우, 각각은 또한 임상적 유효량보다 적은 양 또는 항-HCV에 유효한 양, 즉, 단독으로 사용되는 경우라면, 상기 약제학적으로 유효한 양의 항-HCV 활성을 갖는 화합물 및 HCV 세린 프로테아제 저해제와 같은 것과 비교하여, 환자에서 HCV 비리온의 축적을 완전히 저해 또는 감소시키는데 있어서 및/또는 HCV 감염 또는 병인과 연관된 상태 또는 증상의 약화 또는 호전에 있어서 약제학적 유효성이 감소되는 양으로 존재할 수 있다. 추가로, 본 발명은 HCV 세린 프로테아제 저해제 및 상술한 항-HCV 활성을 갖는 화합물의 조합을 HCV 감염을 치료 또는 예방에 사용하는 용도를 포함하며, 여기에서 하나 이상의 저해제 또는 화합물은 약제학적으로 유효한 양으로 존재하며, 나머지(들)는 조합으로 인한 부가적 또는 상승적 효과로 인하여 임상적 유효량보다 적은 양 또는 항-HCV 유효량으로 존재한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "부가적 효과"는 주어진 각각의 제제를 단독으로 사용한 경우의 효과의 합과 동일한, 2개(또는 그 이상)의 약제학적으로 활성인 제제의 조합 효과를 기술한다. "상승적 효과"는 주어진 각각의 제제를 단독으로 사용한 경우의 합을 초과하는, 2개(또는 그 이상)의 약제학적으로 활성인 제제의 조합 효과를 기술한다.

환자 증상의 개선시에는, 필요에 따라, 본 발명의 화합물, 조성물 또는 조합물을 유지 용량으로 투여할 수 있다. 이후, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 이들 모두는, 증상이 목적하는 수준으로 개선된 경우 상기 개선된 증상을 유지할 정도로 증상에 따라 감소될 수 있거나, 중단할 수 있다. 그러나, 환자는, 질환의 증상 재발시에는 장기간의 관점에서 간헐적 치료를 필요로 할 수 있다.

임의의 특정 환자에 대한 특정 복용량 및 치료 요법은 사용되는 특정 화합물의 활성, 환자의 나이, 체중, 일반적 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 분비율, 약물의 조합, 및 치료하는 의사의 판단 및 치료를 받는 특정 환자의 질환 중증도를 비롯한 다양한 요소에 의존할 것이다. 활성 성분의 양은 또한 기술된 특정 화합물 및 조성물중의 추가의 항바이러스제의 존재 또는 부재 및 특성에도 의존할 것이다.

따라서, 치료학적 치료법에 유용한 본 출원의 제제는 단독으로, 적합한 약제학적 담체와의 조성물로, 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 투여되는 제제의 유효량은 사례별로 결정될 수 있다. 고려하고자 하는 요소는 일반적으로 나이, 체중, 증상 단계, 다른 질환 상태, 치료 기간, 및 초기 치료에 대한 반응을 포함한다. 전형적으로, 제제는 주사가능한 것으로서, 액상 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 그러나, 주사 이전에 액상 비히클중 용액으로, 또는 현탁액으로 적합한 고체 제형으로도 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 장용-코팅된 정제 또는 겔 캡슐제로 제형화될 수 있다. 본 출원의 제제는 제제의 본질 및/또는 치료하는 질환 증상 또는 상해에 따라 달라질 수 있으며, 의학상 허용가능한 임의 방식으로 투여될 수 있다. 가능한 투여 경로로는 주사, 비경구적 경로, 예로서, 혈관내, 정맥내, 경막내 등과, 그 뿐만 아니라, 비내, 눈, 직장, 국소, 또는 폐, 예컨대, 흡입, 분무 주입, 또는 분무 요법에 의해 투여될 수 있다. 제제는 또한 직접 조직 표면에, 예컨대, 수술시에 적용될 수 있다. 지효성 방출 투여는 또한 구체적으로 데포 주사, 경피용 패취, 또는 침식성 임플란트와 같은 수단에 의해 적용시 포함된다.

또다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 바이러스의 생활 주기에 필요한 바이러스에 의해 코딩되는 세린 프로테아제로 특징되는 바이러스로 감염된 환자에게 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물을 투여함으로써 상기 바이러스로 감염된 환자를 치료하거나, 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 HCV 감염을 앓는 환자의 치료에 사용된다. 상기 치료법은 바이러스 감염을 완전히 근절시키거나 그 중증도를 감소시킨다. 더욱 바람직하게, 환자는 인간이다.

"치료하는"이라는 용어는 예방학적(예컨대, 예방하는) 및/또는 치료학적 치료법을 포함한다. "예방학적 또는 치료학적" 치료법은 당업계에 인지되어 있고, 하나 이상의 대상 조성물을 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 원치않는 용태의 임상적 소견(예컨대, 수용자 동물의 질환 또는 다른 원치않는 용태) 이전에 투여될 경우, 치료법은 예방학적인 것인 반면(즉, 이는 원치않는 용태가 발생하지 못하도록 수용자를 보호하는 것이다), 원치않는 용태의 소견 이후에 투여되는 경우, 치료법은 치료학적인 것이다(즉, 현존의 원치않는 용태 또는 그의 부작용을 감소, 호전, 또는 안정시키고자 하는 것이다).

대체 실시태양에서, 본 발명의 방법은 추가적으로 상기 환자에게 항바이러스제, 바람직하게는 항-HCV제를 투여하는 단계를 포함한다. 그러한 항바이러스제는 예컨대 알파-, 베타- 및 감마-인터페론, 페길화로 유도체화된 인터페론-알파 화합물, 및 싸이모신; 기타 항바이러스제, 예컨대, 리바비린 및 아만타딘; 및 기타 C형 간염 바이러스 프로테아제의 저해제(NS2-NS3 저해제 및 NS3-NS4A 저해제); 헬리카제 및 폴리머라제 저해제를 포함하는 HCV 생활 주기중의 다른 표적에 대한 저해제; 내부리보솜 진입 저해제; 광범위성 바이러스 저해제, 예컨대 IMPDH 저해제(예컨대, VX-497 및 미국 특허 번호 제5,807,876호에 기재된 기타 IMPDH 저해제, 미코페놀산 및 그의 유도체) 또는 상기 화합물의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

그러한 추가의 제제는 상기 환자에게 본 발명의 화합물 및 추가의 항바이러스 제제를 모두를 포함하는 단일 투약 형태의 부분으로서 상기 환자에게 투여될 수 있다. 별법으로, 상기 추가적 제제는 본 발명의 화합물과는 별개로, 추가적 제제를본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 투여 전에, 조성물과 함께 또는 조성물 투여 후에 투여하는, 다중 투약 형태의 일부로서 투여할 수 있다.

추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 생물학적 물질을 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에게 투여하는 것을 목적으로 하는 생물학적 물질을 사전처리하는 방법을 제공한다. 그러한 생물학적 물질은 혈액 및 그 성분, 예컨대 혈장, 혈소판, 혈액 세포의 하위 집단 등; 신장, 간, 심장, 폐 등과 같은 장기; 정자 및 난자; 골수 및 그 성분, 및 기타 환자에게 주입되는 기타 액제, 예컨대 식염수, 덱스트로스 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 바이러스의 생활 주기에 필요한 바이러스가 코딩하는 세린 프로테아제로 특징되는 바이러스와 잠정적으로 접촉할 수 있는 물질을 처리하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 물질을 본 발명의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 그러한 물질은 수술 장비 및 의류; 실험 장비 및 의류; 혈액 수집 장치 및 물질; 및 션트, 스텐트 등과 같은 침습적 장치를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 바이러스가 코딩하는 세린 프로테아제의 단리를 보조하는 실험 도구로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 화합물을 고체 지지체에 부착하여 제공하는 단계; 상기 고체 지지체를 상기 프로테아제가 상기 고체 지지체에 결합하도록 하는 조건하에서 바이러스성 세린 프로테아제를 함유하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및 상기 세린 프로테아제를 상기 고체 지지체로부터 용리시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 이러한 방법에 의해 단리된 바이러스성 세린 프로테아제는 HCV NS3 프로테아제이다. 더욱 특히, 이는 본원에 기술된 바와 같이 VX-905 및/또는 BILN 2061에 의한 치료법에 대하여 내성을 띠는 돌연변이체 HCV NS3 프로테아제이다. 예시적인 상기 프로테아제는 서열번호 2의 단백질의 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및/또는 156번 위치의 잔기에서 돌연변이체(즉, 비-야생형)를 갖는 것으로서 본원에 기술된 것들을 포함한다.

[실시예]

이에 일반적으로 기술된 본 개시 내용은 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 잘 이해될 것이며, 하기 실시예는 본 개시 내용의 특정 측면 및 실시태양을 단지 예시하기 위해 포함된 것이며, 개시 내용을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1 환자 집단 및 연구 디자인

VX-950에 대한 1b 기에서 무작위 맹검 복용량 단계적 확대 시험(연구 VX04-950-101)에 등록한, 유전자형 1의 HCV로 감염된 34명의 환자를 본 연구에 사용하였다. 모든 환자의 연령은 18세 내지 65세 사이였고, 기준선 HCV RNA 수준이 10⁵ IU/mL 이상이고, B형 간염 바이러스(HBV: hepatitis B virus) 및 HIV 음성이였다. 환자를 14일간 연속하여 450(q8h), 750(q8h), 또는 1250(q12h) mg의 VX-950를 투여받는 3개의 군으로 나누고, 각 투여군당 2명의 위약 환자를 포함하였다. 3개의 시점: 투여 전날(기준선 샘플), 투여 14일째 또는 치료 종료시(ETR 샘플), 및 연구 약물의 마지막 투여 후 7일 내지 10일 경과시(추적 관찰 샘플)에 연구 환자로부터 4 밀리리터(mL)의 혈액 샘플 채혈하였다. EDTA(K2) 항응고제를 함유하는 튜브로 팔뚝 정맥을 정맥 천자하여 채혈하였다. 혈장은 10분간 원심분리하여 분리하고, 냉동시키고, 6개월 미만 동안 -80℃에서 저장하였다. 서열 분석을 위해 비리온을 상기 혈장으로부터 단리시켰다.

실시예 2 환자의 혈장으로부터 유래된 HCV NS3 프로테아제의 증폭 및 서열 분석

혈장 바이러스로부터 유래된 전장의 534개의 염기쌍(bp: base pair)의 NS3 세린 프로테아제 영역을 포함하는 HCV RNA 단편의 반-네스티드(semi-nested) 역-전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse-transcriptase polymerase chain reaction) 증폭에 의해 서열 분석을 수행하였다. 변성 조건하에서 비리온을 용해시키고, 시판용의 표준 실리카-겔 막-결합 방법(QIAamp Viral RNA Minikit; 캘리포니아주 발렌시아에 소재하는 Qiagen)을 사용하여 단리시켰다. NS3 세린 프로테아제 영역을 포함하는 상보적인 DNA(cDNA: complementary DNA) 단편은 바이러스 RNA로부터 합성하고, 시판용 1-단계 역전사효소 PCR(Superscript III RNase H-Reverse Transcriptase with High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase; 캘리포니아주 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen Corp)을 사용하여 증폭시켰다. NS3의 912 bp의 코딩 영역은 NS3 영역 측면에 위치하는 프라이머(NS3-1b-1s: GGCGTGTGGGGACATCATC(서열번호 3)); 및 NS3-1b-3a: GGTGGAGTACGTGATGGGGC(서열번호 4))를 사용하여 증폭시켰다. 1x 사유의 반응 완충액중 최종 농도 0.5 μM의 프라이머(Invitrogen Custom Primers), 0.2 mM dNTPs (Invitrogen Corp), 1.2 mM MgSO₄, 및 34.8 유니트의 RNA 가드(Porcine RNase Inhibitor, Amersham Biosciences)로 각 샘플에 대하여 2회의 네스트 PCR을 실시하였다. 먼저 반응 혼합물을 30분 동안 역전사 반응을 위해 47℃에서 인큐베이션시킨 후, 3분간 94℃에서 변성 단계 이후, 94℃에서 30초 동안, 51℃에서 30초 동안, 및 68℃에서 45초 동안 30회의 싸이클을 실시하였다. 제1 PCR 산물을 1:10으로 희석시키고, 1.25 유니트의 AccuPrime Pfx DNA 중합효소, 0.5 μM 프라이머 (NS3-1b-1s 및 NS3-1b-4a; CATATACGCTCCAAAGCCCA(서열번호 5)), 0.3 mM dNTPs, 1 mM MgSO₄, 및 1x 반응 완충액을 사용하는 또다른 세미-네스티드 반응에서 사용하였다. 외부 PCR로부터의 DNA 산물을 3분 동안 94℃에서 변성시키고, 94℃에서 30초 동안, 53℃에서 30초 동안, 및 68℃에서 30초 동안 30회의 싸이클을 실시하여 증폭시켰다. 이러한 PCR로부터 얻은 DNA를 1% 아가로스 겔상에서 분리하고, 적절한 크기의 산물(830 bp)은 퀴아퀵 겔 추출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 이어서, 단리된 DNA는 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit)(Invitrogen Corp)를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝 플레이트를 세크라이트(SeqWright)(텍사스주 휴스톤 소재)로 송부하여, 96개의 클로닝을 증폭시키고 각 시점당 환자 1명에 대하여 서열을 분석하였다.

실시예 3 서열 정렬 및 계통학적 분석

서열을 정렬하고, 소프트웨어 돌연변이 서베이어(Mutational Surveyor)(펜실베이니아주 주립대에 소재하는 SoftGenetics)를 사용하여 돌연변이에 대하여 분석하였다. NS3 프로테아제의 N-말단의 543개 뉴클레오티드(181 아미노산)를 분석하였다. 14일째 및 추적 관찰시(연구 약물의 마지막 투여 후 7일 내지 10일이 경과한 후), 각 환자에 대한 일치 서열을 평균 84개의 기준선 서열로부터 밝혀내고, 각 환자에 대하여 평균 81개의 서열을 수득하였다. 계통수는 PHYLIP(Felsenstein, J. 1993. PHYLIP(Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Distributed by the author. Department of Genetics, University of Washington, Seattle, WA) Dnadist 및 Quick Tree(http://www.hcv.lan1.gov/content/hcv-db, accessed June 2005)을 사용하여 작성하였다.

실시예 4 재조합 NS3 프로테아제 단백질의 발현 및 정제

HCV NS3 프로테아제의 Met¹-Ser¹⁸¹을 코딩하는 DNA 단편은 각 HCV 변이체에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 환자의 단리물의 선택된 플라스미드 클론으로부터 증폭시켰다. DNA 단편을 181-잔기 HCV NS3 프로테아제 도메인에 이어 C-말단 헥사-히스티딘 태그(서열번호 6)로 이르게 되는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 발현 플라스미드 pBEV11로 클로닝하였다. 이어서, 재조합 6X-His-태깅된(서열번호 6) NS3 프로테아제를 종래 공개된 것과 같은(4) 누설 발현 방법을 사용하여 E. 콜라이에서 발현시켰다. NS3 프로테아제 발현 플라스미드로 새로 형질전환된 5 내지 7개의 E. 콜라이 BL21(DE3) 콜로니를 사용하여 100 ㎍/mL 카르베니실린을 포함하는 5 mL LB 배지에 접종하였다. OD₆₂₀이 0.3 내지 1에 도달할 때까지 상기 시드 배양물을 진탕시키면서(250 rpm) 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 이를 사용하여 초기 OD₆₂₀이 ~0.010인 250 mL 삼각플라스크중 100 ㎍/mL 카르베니실린을 함유하는 50 mL 4xTY 브로쓰(32 g/L 트립톤, 20 g/L, 효소 추출물, 5 g/L NaCl)에 접종하였다. 발현 배양물을 250 rpm에서 진탕시키면서 주변 온도(~25℃)에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 300Oxg에서 30분 동안 원심분리하여 수거하고, 펠릿은 -80℃ 에탄올 배쓰에서 급속 냉동시키고, 프로테아제가 정제될 때까지 -80℃에서 저장하였다.

재조합 프로테아제는 공개된 방법(7)을 변형하여 E. 콜라이로부터 정제하였다. 냉동 세포 펠릿을 해동하고, 6.8 mL의 냉 완충액 A(50 mM N-2-하이드록시 에틸 피페라진-N'-에탄설폰산[HEPES, pH 8.0]; 1 M NaCl; 10% [vol/vol] 글리세롤; 5 mM 이미다졸; 5 mM β-머캅토에탄올; 0.1% 옥틸 β-D-글루코피라노시드[미주리주 세인트루이스에 소재하는 Sigma]; 2 ㎍/mL 류펩틴(Leupeptin)[미주리주 세인트루이스에 소재하는 Sigma]; 1 ㎍/mL E-64[미주리주 세인트루이스에 소재하는 Sigma]; 2 ㎍/mL 펩스타틴(Pepstatin) A[미주리주 세인트루이스에 소재하는 Sigma])에 재-현탁시켰다. 0.8 mL 1OX 버그버스터(BugBuster) 시약(위스콘신주 메디슨에 소재하는 Novogen/EMD Biosciences) 및 8 ㎕의 1000X 벤조뉴클레아제(Benzonuclease)(위스콘신주 메디슨에 소재하는 Novogen/EMD Biosciences)를 가하여 세포를 용해시킨 후, 4℃에서 30분 동안 완만히 진동시켰다. 세포 용해물을 16,00Oxg에서 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 각각의 상등액을 1회용 폴리프로필렌 칼럼(캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 Biorad)중 완충액 A로 평형화된, 0.25 mL 상 부피의 탈론(TALON) 금속 친화성 수지(캘리포니아주 팔로알토에 소재하는 BD Biosciences)에 가하였다. 용해물/수지 슬러리를 4℃에서 30분 동안 진동시켰다. 칼럼으로부터 용해물을 배출시키고, 수지를 3-5 mL 부피의 완충액 A로 세척하였다. 2개의 분취량(각각 0.25 mL)의 완충액 B(50 mM HEPES [pH 8.0]; 1 M NaCl; 25% [vol/vol] 글리세롤; 300 mM 이미다졸; 5 mM β-머캅토에탄올; 0.1% 옥틸 β-D- 글루코피라노시드; 2 ㎍/mL 류펩틴; 1 ㎍/mL E-64; 2 ㎍/mL 펩스타틴 A])를 사용하여 칼럼에 결합된 단백질을 용리시키고, 2개의 분획을 풀링하고, 작은 분취량으로 나누고, -80℃에 저장하였다. 용리된 단백질 농도는 소 혈청 알부민 표준을 사용하여 제조사의 설명에 따라 쿠마시(Coomassie) 단백질 검정법(캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 Biorad)을 사용하여 측정하였다. 바이오세이프 쿠마시 블루(Biosafe Coomassie Blue)(캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 Biorad)로 염색된 변성 아크릴아미드 겔(SDS-PAGE) 상에서 분해된 단백질 샘플로부터의 1D 영상 분석 소프트웨어(1D Image Analysis Software)(뉴욕주 로체스터에 소재하는 Kodak)를 사용하여 프로테아제의 순도를 예측하였다.

실시예 5 HCV NS3 세린 프로테아제 도메인에 대한 효소 검정법

공개된 바와 같이(7) VX-950과 BILN 2061 프로테아제 저해제, 둘 모두를 사용하여 96-웰 미량역가 플레이트(Corning NBS 3990)에서 시험관내 프로테아제 활성을 검정하였다. BILN 2061은 캐나다 퀘벡 라발에 소재하는 베링거 인겔하임(Boehringher Ingelheim)에 의해 발견된 HCV NS3·4A 프로테아제 저해제이다. 간략하게, 프로테아제를 25℃에서 10분 동안 및 30℃에서 10분 동안 5 μM 보조인자 KK4A와 함께 인큐베이션시켰다. DMSO중 일련으로 희석된 프로테아제 저해제(VX-950 또는 BILN 2061)를 가하고, 추가의 15분 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 5μM RET-S1(캘리포니아주 산호세에 소재하는 Anaspec Inc.)을 가하여 반응을 개시하고, 형광성 뎁시펩티드 기질을 내부적으로 소광시키고, 30℃에서 인큐베이션시켰다. 테칸 스펙트라 플루오르플러스(Tecan SpectraFluorPlus) 플레이트 판독기에서 30분 동안 산물의 방출을 모니터하였다(360 nm에서 여기 및 500 nm에서 방출). 데이타는 간단한 IC₅₀ 방정식: Y = V₀/(1+(X/IC_5O))으로 피팅하였다.

실시예 6 HCV NS3 세린 프로테아제 도메인 단백질의 K _m 측정

내부적으로 소광된 형광성 뎁시펩티드 기질, RET-S1(Ac-DED(EDANS)EEαAbuψ[COO]ASK (DABCYL)-NH2)(서열번호 7)을 사용하여 기질 속도 변수를 측정하였다[Taliani et al., (1996) Anal. Biochem. 240(1), 60-67]. 프로테아제를 25℃에서 10분 동안, 및 30℃에서 10분 동안 50 mM HEPES(pH 7.8), 100 mM NaCl, 20% 글리세롤, 5 mM 디티오트레이톨중 5 μM 보조인자 펩티드 KK4A(KKGSVVIVGRIVLSGK(서열번호 8)) [Landro et al., (1997) Biochemistry 36(31), 9340-9348]와 함께 사전-인큐베이션시켰다. RET-S1 기질(캘리포니아주 산호세에 소재하는 Anaspec Incorporated)을 첨가하여 반응을 개시하고, 10분 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 전체 검정 부피는 100 ㎕였다. 25 ㎕의 10% 트리플루오로아세트산(TFA: trifluoroacetic acid)을 가하여 반응물을 소광시켰다. 반응 산물을 역상 미세관 고성능 액체 크로마토그래피 칼럼(Penomenex Jupiter 5 μ C18 300 A 칼럼, 150 x 2.0 mm)상에서 분리하고, 이를 30℃로 가열하였다. 유속은 0.2 ml/분이고, H₂O/0.1% TFA(용매 A) 및 아세토니트릴/0.1% TFA(용매 B)를 사용하였다. 하기와 같이 선형 구배를 사용하였다: 1분에 걸쳐 5% 내지 30% 용매 B, 15분에 걸쳐 30% 내지 40% 용매 B, 이어서, 1분에 걸쳐 40% 내지 100% 용매 B, 3분간 동용매, 이어서, 1분에 걸쳐 100% 내지 5% B, 및 10분 동안 5% B에서 평형. DABCYL-펩티드 산물을 500 nm에서 검출하고, 전형적으로는 약 17분에 용리되었다. 그래프-프리즘 소프트웨어(GraphPrism software)를 사용하여 데이타를 미카엘리스-멘텐(Michaelis- Menten) 방정식에 피팅하여 K_m을 측정하였다.

실시예 7 HCV NS3 세린 프로테아제 도메인 변이체의 텔라프레비어(Telaprevir)(VX-950) K_{i(app, 1h)} 측정

종래에 공개되어 있는 바와 같이[Lin et al., (2004) J. Biol. Chem. 279(17), 17508-17514], 텔라프레비어에 대한 프로테아제 도메인 변이체의 감수성을 96-웰 미량역가 플레이트(Corning NBS 3990; 뉴욕주 코닝에 소재하는 Corning)에서 측정하였다. 간략히, NS3 프로테아제 도메인을 25℃에서 10분 동안, 및 30℃에서 10분 동안 50 mM HEPES (pH 7.8), 100 mM NaCl, 20% 글리세롤, 5 mM 디티오트레이톨중 5 μM KK4A 펩티드와 함께 사전-인큐베이션시켰다. DMSO에서 일련의 희석된 텔라프레비어를 프로테아제 혼합물에 가하고, 30℃에서 추가의 60분 동안 인큐베이션시켰다. 5 μM RET-S1 기질을 가하여 반응을 개시하고, 30℃에서 인큐베이션시켰다. 테칸 스펙트라플루오르플러스(Tecan SpectraFluorPlus) 플레이트 판독기(노스캐롤라이나주 더럼에 소재하는 Tecan US)에서 20분 동안 산물 방출을 모니터하였다(360 nm에서 여기, 및 500 nm에서 방출). 검정하는 전체 부피는 100 ㎕였다. 프로테아제 농도는 검정하는 동안 10-20%의 기질이 턴오버(turn over)되도록 선택하였다. 겉보기 저해 상수(K_i(app,1h)) 값을 계산하기 위하여 그래프프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이타를 단단한 결합 효소 저해에 대한 통합형 모리슨(Morrison) 방정식에 피팅하였다(38). 야생형 효소 및 모든 R155K/T/I/S 변이체는 RET-S1에 대하여 검출 한계(100 μM)보다 높은 K_m을 갖는다는 것이 항정-상태 검정법을 통해 밝혀졌다. 따라서, K_i(app,1h) 값을 계산하기 위하여 K_m을 100 μM으로 세팅하였다. K_m보다 현저히 낮은 기질 농도(5 μM)에서 저해제 연구를 수행하였다. 그러므로, 실제 K_m과 계산에서 사용된 K_m 사이의 편차는 K_i(app,1h) 계산에 있어서 무시해도 좋을 정도로 어떤 영향도 미치지 않아야 한다.

실시예 8 기준선 샘플의 서열 분석

각 환자의 HCV 집단에 대한 공통 서열은 HCV cDNA를 함유하는 평균 84개의 독립적인 플라스미드 클론으로부터 유래되었다. 공통 서열의 계통학적 분석은 서열이 환자 특이성이라는 것을 지시하였다(도 1). 평균 환자내 아미노산의 유전자의 다종성(quasispecies) 복합도(새논 엔트로피(Shannon entropy)) 및 다양성(해밍 거리(Hamming distance))은 낮았고(각각 0.332±0.109 및 0.421±0.195), 기준선에서 HCV RNA 혈장 농도와 유전자의 다종성 이질성 사이에는 어떤 상관관계로 관찰되지 않았다. 환자내 아미노산 다양성(본 시험에서 환자의 유전자형 1a 또는 1b 공통 서열과 비교된 개개의 공통 서열)은 유전자형 1a의 경우 1.3%이고, 유전자형 1b의 경우 2%였다. 아형내 모든 환자의 공통 서열 사이에서 관찰되는 아미노산 차이는 VX-950 결합에 거의 영향을 주지 않거나, 전혀 영향을 주지 않는다는 것이 구조 모델링 분석을 통해 예측되었다.

이어서, 환자-특이성인 프로테아제 클론을 발현시키고, VX-950에 의한 저해에 대하여 시험하였다. 모델링 관찰 결과와 동일하게, 특이적인 아형내 상이한 환자 단리물로부터 유래된 이들 프로테아제의 효소 IC_5O 값에 있어서 어떠한 유의적인 차이는 없었다. 그러나, 유전자형 1b 환자에 대한 평균 IC_5O가 유전자형 1a 환자에 대한 값보다 약간 더 높았다(도 2). 이러한 결과는 HCV-H(1a) 및 HCV Con1(1b)에 대한 K_i 값을 측정한 종래의 시험관내 결과와 일치한다(7). 유전자형 1a 대 1b의 모델링 분석을 통해, 저해제/기질 결합에 영향을 미칠 수 있는 중요한 차이는 132번 위치의 잔기에 있지만, 다른 차이는 결합 포켓 밖에 위치한다는 것이 제안되었다. 유전자형 1b 프로테아제의 Val¹³² 측쇄는 VX-950의 P3 t-부틸-글리신 기와 오직 한번의 반 데르 발스 접촉을 하지만, 유전자형 1a 프로테아제의 Ile¹³² 측쇄는 2번 접촉한다. 상호작용에 있어서의 이러한 구조적 차이는, 유전자형 1b 프로테아제와 비교하여 유전자형 1a 프로테아제가 VX-950에 대한 더 낮은 효소 IC_5O을 나타낸다는 실험적 데이타와 일치한다. 아형간에 약간의 차이는 있지만, 두 아형 모두가 VX-950에 대하여 감수성이라는 것은 여전히 명백하다. 결론적으로, HCV NS3 세린 프로테아제에서 관찰된 서열 다양성에도 불구하고, 유전자형 1 환자는 프로테아제 저해제 VX-950을 사용하는 치료법에 대하여 반응성인 것으로 예측된다. VX-950에 대한 바이러스 반응에 있어서 어떠한 유의적 차이도 관찰되지 않은 바, 임상 데이타가 이러한 결과를 지지한다.

실시예 9 유전자형 데이타: ETR 및 추적 관찰 샘플의 서열 분석

치료 종료시의 HCV NS3 프로테아제 서열을 각 환자에 대한 기준선에서의 공통 서열과 비교하여 잠재적인 내성 돌연변이를 동정하였다. 각 ETR 샘플에 대하여 평균 80개의 서열을 관찰하고, 각각의 181번 위치에서의 변이체 백분율(%)을 계산하였다. 초기에, 기준선과 비교하여 ETR 샘플의 임의의 단일 아미노산 위치에서의 빈도가 5% 이상 증가하면 이를 잠재적인 내성 돌연변이로 간주하였다. 5% 절사값은 본 발명의 서열 분석 프로토콜의 감수성보다 더 낮은 수준이기 때문에 이를 분석된 클론의 갯수와 PCR 오류율에 기초하여 사용하였다. 기준선에서 다형인 부위에서의 변화는 내성 돌연변이로 간주되지 않았다. 오직 투여 종료시에만 존재하고 여러 환자에서 관찰된 부위에서의 변화가 잠재적인 내성 돌연변이인 것으로 간주되었고, 이후 모든 환자에서 상기에 대하여 분석하였다.

분석을 위해 VX-950에 대한 바이러스 부하량(혈장 HCV RNA 수준) 반응에 기초하여 환자를 군으로 나누었다. 바이러스의 동적 분석에서 환자를 "초기 반응자" 또는 "연속 반응자"로 분류하였다. 바이러스 서열 분석에서, "초기 반응자" 군은 추가로 초기 감소 이후 혈장 HCV RNA 증가에 기초하여 2개의 군으로 분류하였다. 가장 낮게 측정된 HCV RNA 수준으로부터 투여 종료시까지(14일째) 0.75 log₁₀ 미만으로 증가한 환자는 HCV RNA "편평역(plateau)"을 갖는 환자로 분류되었다. 혈장 HCV RNA가 0.75 log₁₀ 초과로 증가한 환자는 HCV RNA가 "반동"한 환자로 분류되었다. 미처리 환자에서 일반적인 HCV RNA의 변동은 약 0.5 log₁₀이고, 이러한 분류화는 항바이러스 반응 뿐만 아니라, 바이러스 돌연변이 패턴에 기초하였다. 2가지 유형의 분석간에 이들 카테고리가 불일치하는 환자는 2명 존재하였다. 환자 12308에서는 최저점으로부터 투여 종료시까지(14일째) 0.05 log₁₀ 증가하였고, 서열 분석의 경우 이는 "편평역"으로 분류되었지만, 바이러스의 동적 분석의 경우, 12308은 "연속 반응자" 군으로 배치되었다. 환자 3112는 11일째 검출불가능한 혈장 HCV RNA(<10 IU/ml)를 가졌지만, 투여 종료시(14일째)에는 35 IU/ml의 검출가능한 혈장 HCV RNA를 가졌다. 이러한 HCV RNA 증가는 바이러스의 동적 분석의 경우 환자를 "초기 반응자" 군으로 배치시키지만; 서열 분석에 있어서는 HCV RNA 수준이 서열 분석 검정법에 의해 검출불가능한 것으로 남아있는 바, 환자는 "연속 반응자" 군으로 분류되었다.

서열 분석을 통해 환자를 하기와 같이 분류하였다: 무반응(위약); 투여하는 동안 감소한 이후 반동(반동); 투여하는 동안 감소한 이후 편평역(편평역); 및 투여하는 동안 계속하여 연속 감소(연속 반응자)(도 3). 추가로, 이들 군내에서 환자를 투여군과 유전자형 하위군(1a 또는 1b)에 의해 분석하였다. 마지막으로, 기준선 변이체로부터의 변화 뿐만 아니라, 임의 돌연변이의 지속성을 모니터하기 위하여 VX-950 중단 이후 7 내지 10일째 수집된 추적 관찰 샘플에서 돌연변이를 분석하였다. 평균 81개의 클론을 각각의 추적 관찰 샘플을 위해 분석하였다. 완전한 서열 분석은 28명의 환자에 대하여 이용가능하고, 남은 환자 6명에 대한 분석은 현재 진행중에 있다. 반동한 환자 2명, 편평역에 있는 환자 3명, 연속 감소중인 환자 1명에 대한 분석은 진행중이다. 제1군의 위약 환자(n=6)에 있어서 어떤 환자 어떤 위치에서도 기준선으로부터 유의적인 변화는 없었다.

실시예 10 투여하는 동안 HCV RNA가 반동한 환자

13명의 환자에서 초기에는 VX-950에 반응하여 HCV RNA가 2 log₁₀ 초과로 감소하였지만, 결국에는 VX-950을 계속 투여하는 동안에 반동하기 시작하였다. 13명의 환자중 6명은 450 mg q8h 투여군이고, 1명은 750 mg q8h 투여군이며, 6명은 1250 mg q12h 투여군이었다. 완전한 서열 분석은 14일째에 이들 환자중 11명에서 이용가능하다(표 1). 이들 환자 모두 36번 위치에서 돌연변이가 유의적으로 증가하였다. 36번 위치에서 유전자형 1b 환자의 경우, 야생형 발린은 알라닌(V36A)으로 돌연변이되었고(평균 60%, 범위 31%-86%), 유전자형 1a 환자의 경우에는 알라닌 또는 메티오닌(V36M)으로 돌연변이되었다(평균 62%, 범위 18%-90%). 아형 1a에서는 오직 단일 변화인 것과 비교하여 아형 1b에서는 2개의 뉴클레오티드 치환이 요구되기 때문에 아형 1b에 V36M이 존재하지 않는 것일 수 있다. V36A 돌연변이는 아형 1a 또는 1b에서 단일 뉴클레오티드 변화를 필요로 한다. 또한, 유전자형 1b 환자의 경우 36번 위치에서 글리신으로의 돌연변이(V36G)가 관찰되었고, 유전자형 1a 환자의 경우에는 류신으로의 돌연변이(V36L)가 관찰되었지만, 이 빈도수는 더욱더 낮다. 3명의 환자는 또한 54번 위치에서 트레오닌으로부터 알라닌으로의 돌연변이(T54A)(평균 35%, 범위 8%-67%)를 가졌고, 그보다 빈도는 낮지만 세린으로의 돌연변이(T54S)도 가졌다. 흥미롭게도, 36번 및 54번 위치에서의 돌연변이는 상호 배타적인 것으로 보인다. 추가로, 유전자형 1a인 이러한 군의 모든 환자는 155번 위치에서 아르기닌으로부터 리신(R155K) 또는 트레오닌(R155T)으로의 돌연변이(평균 60%, 범위 22%-99%)를 포함하고, 그보다 빈도는 낮지만 이소류신(R155I), 세린(R155S), 메티오닌(R155M), 또는 글리신(R155G)으로의 돌연변이도 가졌다. 1a 환자에서는 오직 단일 변화인 것과 비교하여 아형 1b에서는 2개의 뉴클레오티드 치환이 요구되기 때문에 155번 위치에서의 돌연변이가 아형 1a 환자로만 제한되는 결과를 얻게 되는 것이다. 이러한 군으로부터의 추적 관찰 샘플에서, 야생형 바이러스는 재-출현하기 시작하였지만, 비록 바이러스 적응도상의 차이에 의해 잠재적으로 빈도는 상이할 수 있지만, ETR시 관찰된 돌연변이 모두 존재하였다. 각 환자에 대하여 반동이 최초로 관찰되는 시점에서는 샘플 서열 분석을 이용할 수 없는 바, 이로써 다른 돌연변이 이전에 존재하였는지 여부는 불명확하다.

실시예 11 투여하는 동안 HCV RNA 반응이 편평역에 도달한 환자

다음 군(n=8)에서 환자는 초기에 VX-950에 대하여 반응하였지만, 그의 HCV RNA 반응은 안정화되었고, HCV RNA 증가가 관찰되지도 않았지만, 그의 HCV RNA 반응은 계속 감소하지도 않았다. 이들 환자중 2명은 450 mg q8h 투여군이고, 2명은 750 mg q8h 투여군이며, 4명은 1250 mg q12h 투여군이었다. 14일째 이들 환자중 5명에 대하여 분석이 완료되었다(표 1). 모든 환자의 156번 위치에서 알라닌으로부터 발린(A156V) 또는 트레오닌(A156T)으로의 돌연변이가 발생하였고, 극도로 낮은 빈도로 세린(A156S) 또는 이소류신(A156I)으로의 돌연변이가 발생하였다. 이러한 군에서 A156V/T 돌연변이는 환자중 3명에서 극도로 높은 빈도로 관찰되었고(100%), 이들 환자에서 다른 돌연변이는 관찰되지 않았다. 다른 2명의 환자(02104 및 12308)는 각각 오직 8%의 A156T 및 30%의 A156V 돌연변이체 바이러스를 가졌지만, 이들 환자는 또한 다른 위치에서도 돌연변이를 가졌다(환자 02104의 경우 47%의 V36A/M 및 36%의 R155K/T; 환자 12308의 68% T54A). 반동 군으로부터 1명의 환자는 또한 156번 위치에서 유사한 빈도(11%)로 돌연변이를 가졌다. 추적 관찰 시점에서 156번 위치에서의 돌연변이는, 야생형 바이러스, 또는 36번, 54번 및/또는 155번 위치에 돌연변이를 갖는 바이러스에 의해 거의 완전히 대체되었다. 156번 위치에서 세린으로의 변화(A156S)는 VX-950의 시험관내 내성 연구시 관찰된 우성 돌연변이였다(7). A156V/T 돌연변이는 또한 시험관내 연구에서 VX-950 및 BILN 2061에 대한 교차-내성인 것으로 동정되었다(7).

실시예 12 투여하는 동안 연속 반응하는 환자

남은 7명의 환자는 VX-950에 대하여 반응하였는데, 14일간의 투여 기간 내내HCV RNA 수준이 연속하여 감소하였다. 이들 환자중 5명은 750 mg q8h 투여군이고, 2명은 450 mg q8h 투여군이었다. 이들 환자는 14일째에 극도로 낮은 수준의 HCV RNA를 가졌고(64 IU/mL 내지 검출불가능한 수준(<10 IU/mL)), 이 시점에서 서열 분석 데이타는 얻을 수 없었다. 그러나, 이들 환자에 대하여 추적 관찰 샘플로부터 HCV cDNA를 성공적으로 증폭시키고, 이들 7명의 환자중 6명에 대하여 분석이 완료되었다(표 1). 14일째까지 검출불가능한 수준에 도달한 유전자형 1a 환자(03205)는 추적 관찰 시점에 3개의 돌연변이, V36A/M(67%), T54A(11%), 및 R155K/T(26%)를 가졌다. 2명의 유전자형 1b 환자는 V36A (21% 및 25%) 및 T54A 돌연변이(54% 및 20%)를 가졌고, 또다른 2명의 1b 환자는 추적 관찰시 유일하게 낮은 수준의 V36A(3% 및 9%)과 T54A(6% 및 1%) 돌연변이를 가졌다. 14일째 검출불가능한 HCV RNA 수준을 갖는 마지막 1b 환자에서는 추적 관찰시 어떤 돌연변이도 검출되지 않았다.

실시예 13 이중 돌연변이 빈도

환자에서 발견되는 이중 돌연변이 빈도 또한 분석하였다. 36번 위치에서의 돌연변이는 155번 위치에서의 돌연변이(36/155 이중 돌연변이) 및 156번 위치에서의 돌연변이(36/156 이중 돌연변이)와 함께 발견되었다. 오직 유전자형 1a 환자만이 36/155 이중 돌연변이를 가졌는데, 이는 14일째의 ETR시 반동 군에서 분석된 8명의 1a 환자 모두(평균 27.6%, 범위 10%-77%), 및 편평역 군의 2명의 1a 환자중 1명에서(9%) 관찰되었다. 36/156 이중 돌연변이의 빈도는 더욱더 낮고, 14일째의 ETR시 반동 군중 3명의 환자에서(3%, 범위 1%-5%), 편평역 군중 2명의 환자에서(1% 및 4%) 발견되었다. 이중 돌연변이는 또한 추적 관찰 샘플에서 ETR 샘플과 비교하여 36/155의 경우 유사한 빈도로, 그러나, 36/156의 경우에는 더욱 낮은 빈도로 발견되었다. 연속하여 감소하는 환자 군의 경우 오직 1명의 환자만이 36/155 이중 돌연변이를 가졌고, 이는 5%로 존재하였다.

단독으로 또는 함께 발견된 돌연변이의 빈도를 도 4에 나타낸다. 내성 패턴에 대한 요약을 도 5에 나타내는데, 이는 각 환자군에 대하여 돌연변이화된 아미노산의 평균 백분율로 표시한다.

실시예 14 표현형 데이타: 내성 돌연변이의 효소 IC ₅₀ 분석

평균 82개의 독립적인 서열 분석용 클론을 유전자형 분석에 사용하였기 때문에 표 1에 나타낸 것과 같이 각 환자에 비리온 혼합물이 존재하였다. 상기 서열 분석에서 관찰되는 모든 돌연변이체(V36A/M/G, T54A/S, R155K/T/M/G/S, 및 A156T/V/S) 뿐만 아니라, 이들 돌연변이의 임의의 관찰된 조합의 효소 IC₅₀을 2 이상의 상이한 환자-특이성인 유전적 배경하에서 측정하였다. 유전자형내 모든 환자의 기준선 IC₅₀은 실시예 6에 기록된 바와 같이 유사하였다. 내성 프로테아제의 효소 IC₅₀ 값은 유전자형 1a HCV-H 참조 균주와 비교한 변화 배수로서 기록한다. 이러한 참조 균주의 IC₅₀은 본 효소 검정법에서 64 nM인 것으로 밝혀졌다.

도 5는 단일 내성 돌연변이체의 효소 IC₅₀ 값과 참조 균주와 비교한 변화 배수를 나타낸다. 지정 위치의 임의의 아미노산 변화에 대하여 유사한 값을 갖는 것은 상기 도에서 박스로 함께 분류한다. 36번 위치의 단일 돌연변이는 VX-950에 대하여 낮은 수준의 내성을 부여한다. V36A/M/L 돌연변이는 특정 아미노산 변화와는 상관없이 효소 IC₅₀을 약 1.5배 내지 10배 증가시키는 것으로 나타났다. 54번 위치에서 트레오닌이 세린으로 치환된 것(T54S)은 IC₅₀을 유의적으로 증가시키지는 못했다. 그러나, T54A 돌연변이는 효소 IC₅₀을 약 10배 증가시켰다. 155번 위치에서 아르기닌으로부터 트레오닌(R155T), 리신(R155K), 메티오닌(R155M), 또는 세린(R155S)으로 치환되는 것은 상당히 낮은 수준의 내성을 부여한다(IC₅₀에서 약 5- 내지 15배). 156번 위치에서 알라닌으로부터 발린(A156V), 트레오닌(A156T), 또는 이소류신(A1561)으로의 돌연변이는 높은 수준의 내성을 부여한다(효소 IC₅₀ 약 400- 내지 500배 증가). 흥미롭게도, A156S 돌연변이는 상기 위치에서의 다른 아미노산 변화보다 VX-950에 대하여 더욱더 낮은 내성을 띠는데(IC₅₀ 단지 22배 증가), 이는 시험관내 내성 연구와 일치한다(6, 7).

도 6은 이중 내성 돌연변이체의 실제 효소 IC₅₀ 값 뿐만 아니라, 참조 균주와 비교한 변화 배수를 나타낸다. 이들 위치에서의 이중 돌연변이는 단일 돌연변이보다 더 높은 수준의 내성을 부여한다. 155번 또는 156번 위치에서의 돌연변이와 조합된 36번 위치에서의 돌연변이는 각각의 단일 돌연변이와 비교하여 추가로 약 10배 증가된 내성을 부여한다. 표 2는 VX-950 뿐만 아니라 또다른 HCV 프로테아제 저해제, BILN 2061에 대하여 시험된 모든 돌연변이체에 대한 실제 IC₅₀ 값을 열거한다. 36번 및 54번 위치에서의 돌연변이는 BILN 2061보다도 VX-950에 대한 감수성에 더 영향을 미치는 반면, 155번 잔기에서의 돌연변이는 BILN 2061에 대하여 더욱더 높은 수준의 내성을 부여한다. 156번 위치에서의 돌연변이 뿐만 아니라, 모든 이중 돌연변이는 상기 저해제 둘 모두에 대하여 높은 수준의 내성을 부여한다. 그러나, A156S 돌연변이체는 VX-950에 대하여 더욱 내성을 띠는데, 이는 이전 시험관내에서도 제시되었다(7). 표 3은 지정 위치에서의 모든 돌연변이의 효소 IC₅₀의 평균 및 표준 편차, 및 참조 균주에 비교한 변화 배수를 나타낸다.

실시예 15 각 환자에 대한 평균적인 표현형

본원에서 실시된 유전자형 분석을 통해 각 환자내 상이한 내성 돌연변이체의 상대적인 비율을 상세히 설명할 수 있었다. 이들 바이러스 혼합물에 의해 부여된 표현형 내성 수준을 보다 잘 이해하고자 각 환자에 대한 평균적인 표현형을 얻기 위해 예비 분석을 실시하였다. 각 환자마다, 지정된 단일 또는 이중 돌연변이를 갖는 비리온의 백분율에 상기 지정된 돌연변이체 대한 효소 IC₅₀의 평균 변화 배수를 곱하고(표 3), 이어서 모든 값을 더하였다. 상대 갯수(100으로 나눈 값)는 표 1의 마지막 칼럼에 나타낸다. 반동 환자 군에 대한 평균값은 14일째 27(범위 6-70)이고, 추적 관찰시 15(범위 3-29)였다. 편평역 환자 군에 대한 평균값은 14일째 272(범위 26-466)이고, 추적 관찰시 32(범위 1-126)였다. 계속하여 감소하는 마지막 환자 군의 추적 관찰시 평균값은 4(범위 0-10)였다. 이와 같이 매우 예비적인 계산으로부터 모든 환자 군에서 내성 수준은 마지막 투여 이후(14일째부터 추적 관찰까지) 감소한 것으로 보이는데, 이는 예측된 일이며, 내성 비리온 선택에 대한 약물 압박이 더이상 존재하지 않기 때문이다. 또한 반동 환자 군이 편평역 환자 군보다 더욱 낮은 수준의 내성을 갖는 것으로 나타났다. 약동학적 데이타를 내성 패턴과 서로 관련시키는 분석은 현재 진행중에 있다.

실시예 16 내성 돌연변이의 적응도 분석

바이러스의 내성 프로파일 이외에 이들 바이러스 변이체의 또다른 중요한 측면은 적응도 수준이다. 단일 및 이중 돌연변이체의 바이러스 적응도를 계산하였다(표 4). 지정 시점에 개개 환자에서 각 HCV 변이체의 감염 단위의 절대 갯수 (IU/ml)를 측정하였다. 예를 들면, 14일째 환자 03201에서 A156V/T 돌연변이를 갖는 변이체의 감염 단위의 절대 갯수는 VL_{d14(A156V/T,3201)} = VL_{d14(전체, 3201)} x A156V/T_{d14 (3201)}(%)와 같이 계산하였다. 투여 종료시(14일째, VL_{d14(전체, 3201)}) 또는 추적 관찰시 (21일째, VL_{d21(전체, 3201)})의 전체 HCV RNA는 로슈 코바스 택맨(Roche COBAS Taqman) HCV 검정법에 의해 측정된 바와 같이 혈장 HCV RNA 수준 분석으로부터 수득하였다. HCV RNA의 검출불가능한 수준은 5 IU/mL인 것으로 간주하였다. 투여 종료시(14일째, VL_{d14(전체, 3201)}(%)) 또는 추적 관찰시(21일째, VL_{d21(전체, 3201)}(%)) 각 개개의 변이체 군(예컨대, A156V/T)의 백분율(%)은 상기 기술된 바와 같은 서열 분석으로부터 수득하였다(표 1). 이어서, 투여 후(14일째 또는 21일째) 개개 환자의 혈장내 각각의 HCV 변이체 및 전체 HCV 집단에 대한 혈장 HCV 바이러스 부하량의 순 증가 배수(NVL)를 측정하였다. 예를 들면:

NVL(_{A156V/T, 3201}) = VL_d21(_{A156V/T, 3201})/VL_d14(_{A156V/T, 3201})

NVL(_{전체, 3201}) = VL_d21(_{전체, 3201})/VL_d14(_{전체, 3201})

각 HCV 변이체의 NVL을 각 환자에서의 전체 혈장 HCV 집단의 NVL로 표준화하였다: NVL(_{A156V/T, 3201})(%) = NVL(_{A156V/T, 3201})/NVL(_{전체, 3201}).

이어서, 개개 환자에서 각 HCV 변이체의 바이러스 부하량에 대하여 표준화된 순 증가 배수를 log₁₀-전환된 값: log₁₀[NVL(_{A156V/T, 3201})(%)]으로 전환시키고, 모든 환자로부터 변이체에 대한 평균값을 측정하였다. 이어서, HCV 돌연변이체의 적응도를 계산하였다. A156V/T 돌연변이의 적응도 = 10 _{log(적응도, A156V/T)}. 이러한 상대 적응도 점수는 각 돌연변이체 내성 수준을 사용하여 분석하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 돌연변이체 모두의 적응도는 야생형보다 낮았고, 일반적으로 이러한 분석을 사용하였을 때 단일 돌연변이체의 적응도와 내성 사이에는 역 상관관계가 존재한다. 그러나, 이중 돌연변이체 36/155에서 내성은 유의적으로 증가한 반면, 적응도에는 별 영향을 미치지 않았다. 이는 적응도의 손실을 보상하면서, 동시에 내성을 부여하는 돌연변이의 상호작용 때문일 수 있다.

실시예 17 R155K 변이체 프로테아제의 X-선 구조

결정화 시험을 위해 NS4A 펩티드 보조인자와의 복합체인[Kim et al., (1996) Cell 87(2), 343-355] HCV-H 균주 프로테아제 도메인의 정제된 R155K 변이체를 8.0 mg/ml 농도로 사용하였다. 0.1 M MES(pH 6.2), 1.4 M NaCl, 0.3 M KH₂PO₄, 및 10 mM β-머캅토에탄올의 저장액에서 단백질 결정을 성장시켰다. 2일 동안 평형화시킨 후 현적(hanging droplet)에서 단일 결정을 수득하였다. 저온의 보호제 모액으로 크기가 0.15 x 0.15 x 0.35 mm인 단일 결정을 옮기고, 질소 기체 스트림에서 100K로 급속 냉동시키기 직전에 25% 글리세롤을 가하였다. ALS 빔 라인 5.01 상에 탑재된 CCD4 영상 플레이트기를 사용하여 회절 영상을 수집하였다. 2.5-Å 해상도에서의 데이타를 나타내고, HKL(2000, 버지니아주 샬로츠빌에 소재하는 HKL Incorporated) 및 CCP4 소프트웨어를 사용하여 통합하였다. 결정은 단위 격자 크기가 a=225.31 Å, b=225.31 Å, c=75.66 Å, α=90.00°, β=90.00° 및 γ=120.00°인 공간군 R32에 속한다. 5% 데이타는 추후 정밀화에서의 자유 R-인자 시험을 위해 할당되어 있다. 본원에서 연구된 R155K 변이체의 결정은 종래 공개된 야생형 프로테아제 NS3-4A와 결정학상 일치하는 격자를 갖는다[Kim et al., 상기 동일]. 공개된 NS3-4A 프로테아제 도메인(PDB 코드: 1A1R)을 사용하여 본 모델의 초기 강체 및 위치 정밀화를 실시하였다. 155번 잔기의 측쇄상의 차이는 Arg 대신 Lys라는 것을 전자 밀도 지도에서 확인하였다. 콴타(QUANTA) 프로그램을 사용하여 전자 밀도 지도에 대하여 단백질 분자를 육안으로 검사하였다. 20.0 내지 2.5 Å의 해상도 범위에서의 정밀화 및 개개 B-인자 정밀화에서 용매 분자를 추가로 포함하는 것이 R-인자 및 자유 R-인자를 각각 22.0% 및 24.7%로 감소시켰다. 정밀화된 모델에 포함된 잔기 범위는 NS3 프로테아제 도메인의 아미노산 1 내지 181이고, 결정학상 독립적인 분자 및 2개의 Zn 금속 이온에 대한 NS4A 보조인자는 21 내지 39번 잔기이다.

실시예 18 컴퓨터 모델링

앞서 기술된 방법에 따라[Lin et al., 상기 동일] NS4A 보조인자 펩티드와의 복합체인 R155K 변이체 아포-효소의 X-선 결정 구조를 사용하여 R155K 변이체 NS3 프로테아제 도메인의 활성 부위로 텔라프레비어를 모델링하였다. 텔라프레비어의 케토아미드 기를 모델링하여 si-표면에 Ser¹³⁹ 측쇄가 부착된 고유 부가물을 형성하였다. 유사한 케토아미드 저해제[ Perni et al., (2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 14(6), 1441-1446] 및 케토산 저해제[Di Marco et al., (2000) J. Biol. Chem. 275(10), 7152-7157.]에 대하여 상기의 결합 모드를 관찰하였다. 저해제의 주쇄와 이들 케토아미드 및 케토산 저해제의 유사한 주쇄를 중첩시켜 텔라프레비어 주쇄 모두가 하기 백본 수소 결합: Lys¹⁵⁵ 카보닐을 갖는 P1 NH, Ala¹⁵⁷ NH를 갖는 P3 카보닐, Ala¹⁵⁷ 카보닐을 갖는 P3 NH, Cys¹⁵⁹ NH를 갖는 P4 캡을 만들 수 있도록 하였다. 이러한 결합 모드에서, 텔라프레비어의 P2 기는 Lys¹⁵⁵ 측쇄를 이동시킬 필요없이 S2 포켓에 배치되었다. 텔라프레비어의 t-부틸 및 사이클로헥실 기는 각각 S3 및 S4 포켓에 배치되었다. 2단계로 저해제 에너지가 최소화되었다. 제1 단계에서, 오직 저해제와 프로테아제의 Arg¹²³, Lys¹⁵⁵, 및 Asp¹⁶⁸ 측쇄 원자만이 에너지 최소화시 1000회의 공정 동안 이동할 수 있었다. 제2 단계에서, 프로테아제의 모든 측쇄 원자가 추가의 1000회 공정 동안 저해제와 함께 이동할 수 있었다. 이러한 모델링된 구조는 앞서 기술된 야생형 NS3 프로테아제의 활성 부위에서의 텔라프레비어 모델을 유사하게 모사한다[Lin et al., 상기 동일]. Lys¹⁵⁵ 측쇄 또는 다른 활성 잔기 측쇄 위치에서 어떤 유의적인 변화도 관찰되지 않았다. 텔라프레비어를 NS3 프로테아제 도메인의 R155T 변이체의 활성 부위에 도킹시키기 위하여 동일 방법을 반복하였다. 그러나, 이 경우 효소 구조는 X-선 결정 구조가 아닌, R155K 변이체 결정 구조를 사용하여 구성된 모델이다. Lys¹⁵⁵ 잔기를 Thr 측쇄로 대체하고, Thr¹⁵⁵ 측쇄를 제외하고 효소의 모든 원자를 고정된 상태로 유지시킴으로써 Lys¹⁵⁵ 잔기를 최소화하였다. 이러한 모델에서, Thr¹⁵⁵ 측쇄의 하이드록실 기는 Asp⁸¹ 측쇄와 수소 결합을 형성한다. 모든 모델링 방법과 최소화 방법은 콴타 분자 모델링 소프트웨어(캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 Accelrys Incorporated)를 사용하여 수행하였다.

실시예 19 연구 결과

본 발명의 특정 변이체에 대하여 상기 논의한 것 이외에도, 효소 검정법 및 구조 연구로부터 얻은 결과를 이에 제시한다.

1) NS3 프로테아제의 Arg ¹⁵⁵ 에서의 치환이 HCV 레플리콘 세포에서 텔라프레비어에 대한 낮은 수준의 내성을 부여한다

HCV NS3 프로테아제 도메인의 관찰된 Arg¹⁵⁵의 치환이 텔라프레비어(VX-950)에 대한 내성을 부여하기에 충분하지 여부를 측정하기 위하여 NS3 155번 잔기에 수개의 치환(R155K, R155T, R155S, R155I, R155M, 또는 R155G)을 고효율 서브게놈 레플리콘 플라스미드(Con1-mADE)로 도입하였다. 각각의 이들 변이체에 대한 안정한 HCV 레플리콘 세포가 생성되었는데, 이는 NS3 Arg¹⁵⁵를 상이한 잔기로 대체하는 것이 세포에서 HCV RNA 복제를 소멸시키는 것은 아니라는 것을 시사한다. 야생형 HCV 레플리콘 Con1-mADE 세포에서 텔라프레비어의 평균 48-h IC₅₀ 값은 0.485±0.108 μM인데, 이는 다른 세트의 적응 돌연변이를 갖는 Con1-기초 HCV 레플리콘 세포에서 앞서 측정된 것(0.354 μM)보다 약간 높다(24-2)(25,41). 텔라프레비어 단독의 1b 기 임상 시험에서 관찰된 2개의 주요 Arg¹⁵⁵ 변이체, R155K 및 R155T의 평균 48-h 텔라프레비어 IC_5O 값은 R155K의 경우, 3.59±0.28 μM이고, R155T의 경우, 9.60±0.87 μM이었다. 야생형 Con1-mADE 레플리콘과 비교하여 이는 각각 7.5배 또는 20배 증가한 것에 상응한다(표 I). Arg¹⁵⁵에서 다른 4개의 부수적 변이체: R155S, R155I, R155M, 또는 R155G를 함유하는 HCV 레플리콘 세포에서 텔라프레비어에 대한 감수성이 유사하게 감소된 것이 관찰되었다; 표 I. 이들 4개의 변이체는 텔라프레비어의 1b 기 임상 시험에서 R155K/T보다 더욱더 낮은 빈도로 발견되었다. 이들 4개의 변이체에 대한 레플리콘 48-h IC₅₀ 값은 1.97±0.21 μM(R155S), 11.7±2.5 μM(R155I), 2.68±0.21 μM(R155M), 및 3.58±0.24 μM(R155G)이고, 이는 텔라프레비어에 대한 감수성이 각각 4.1, 24, 5.5, 및 7.4배 감소된 것에 상응한다(표 I). 이러한 결과는 NS3 Arg¹⁵⁵의 치환이, 양전하 잔기(Lys), 친수성 잔기(Thr 또는 Ser), 소수성 잔기(Ile 또는 Met), 또는 측쇄가 없는 잔기(Gly)를 포함하는 치환 잔기의 물리적 성질과는 무관하게 HCV 레플리콘 세포에서 텔라프레비어에 대한 내성을 낮은 수준(<25배)으로 감소시켰다.

표 I. HCV 레플리콘 세포 검정법에서 내성 증명

안정적인 야생형(mADE) 및 변이체 HCV 서브게놈 레플리콘 세포주는 상응하는 고효율의 Con1 레플리콘 플라스미드로부터의 T7 RNA 런오프(runoff) 전사체를 사용하여 생성하였다. 3개의 독립적인 실험으로 48-h 검정법에서 HCV 레플리콘 세포주에 대한 텔라프레비어의 평균 IC₅₀ 값 및 SD를 측정하였다. 지정 변이체의 IC₅₀을 야생형 HCV 레플리콘의 IC₅₀으로 나누어 변화 배수를 측정하였다.

2) HCV NS3 프로테아제의 Arg ¹⁵⁵ 에서의 치환이 효소 검정법에서 텔라프레비어에 대한 감수성을 감소시켰다

HCV NS3 프로테아제 도메인에서 Arg¹⁵⁵에서의 치환이 효소 수준으로 텔라프레비어에 대한 감수성을 감소시키기에 충분하지 여부를 확인하기 위하여 텔라프레비어를 투여하기 이전에 환자의 HCV 샘플로부터 유래된 서열로부터의 NS3 프로테아제 도메인(유전자형 1a)에서 Arg¹⁵⁵를 Lys, Thr, Ser, 또는 Ile로 대체하였다. R155K, R155T, R155S, 또는 R155I 돌연변이를 함유하는 NS3 세린 프로테아제 도메인 단백질을 E. 콜라이에서 발현시키고, 텔라프레비어에 대한 효소 감수성을 측정하기 전에 정제하였다. 텔라프레비어에 대한 내성은 텔라프레비어와 함께 1-h 사전 인큐베이션시킨 후에 측정된 겉보기 K_i인 K_i(app,1h)의 변화-배수에 의해 정의되었다.

KK4A 보조인자 펩티드와의 공-복합체를 형성하는 야생형 HCV 프로테아제 도메인 대 Arg¹⁵⁵이 치환된 변이체의 텔라프레비어 감수성 비교는 표 II에 나타낸다. KK4A 펩티드와 복합체를 형성하는 야생형 유전자형 1a 환자 NS3 프로테아제 도메인에 대한 텔라프레비어의 평균 K_i(app,1h) 값은 0.044±0.033 μM였다(표 II). 대조적으로, 상기 평균 K_i(app,1h) 값은, 텔라프레비어 단독의 1b 기 임상 시험에서 관찰된 2개의 주요 변이체인, R155K 프로테아제에 대한 것보다 약 11배 더 높고, R155T 프로테아제에 대한 것보다 9배 더 높았다(표 II). 텔라프레비어의 1b 기 임상 시험에서 관찰된 2개의 부수적인 변이체, R155S 및 R155I는 야생형 프로테아제의 것과 비교하여 K_i(app,1h) 값이 각각 22배 및 16배 증가한 것으로 나타났다(표 II). 이러한 데이타는, 또다른 양전하 잔기(Lys)의 보존적 치환을 비롯하여 Arg¹⁵⁵이 상이한 아미노산으로 치환되는 것이 텔라프레비어에 대한 감수성을 감소시킨다라는 것을 시사한다.

표 II. HCV NS3 프로테아제 효소 검정법에서의 내성 증명

3 내지 5개의 독립적인 실험으로 KK4A 보조인자 펩티드 및 FRET 기질을 사용하여 정제된 야생형 및 4개의 변이체 HCV NS3 세린 프로테아제 도메인에 대한 텔라프레비어의 평균 K_i(app,1h) 값 및 SD를 측정하였다. 지정 변이체의 K_i(app,1h)를 야생형 프로테아제의 K_i(app,1h)로 나누어 변화 배수를 측정하였다.

3) R155K HCV NS3 프로테아제의 X-선 구조

양전하 아미노산(Lys)을 비롯한 또다른 잔기로 Arg¹⁵⁵를 치환시키는 것이 왜 텔라프레비어에 대한 감수성을 감소시키는지에 대한 이유를 이해하기 위하여 R155K NS3 프로테아제의 X-선 결정 구조를 측정하였다. R155K 돌연변이를 NS4A 보조인자 펩티드와 공-복합체화된 야생형 프로테아제의 구조를 측정하기 위하여 앞서 사용되었던 T7-태그 융합된 HCV-H 프로테아제 작제물로 공학처리하였다. 2.5 Å의 해상도로 NS4A 보조인자 펩티드와 공-복합체화된 R155K 프로테아제 도메인의 전체 구조는 앞서 기술된 야생형 HCV-H 균주 프로테아제 복합체의 것과 매우 유사하다[Kim et al., 상기 동일]. 간략히, NS3 프로테아제 도메인의 한 분자(1 내지 181번 잔기) 및 보조인자 NS4A의 한 분자(21 내지 39번 잔기)는 구형의 엔티티를 형성하고, 결국에는 비대칭 단위로 또다른 구형 엔티티와 함께 동종이량체를 형성한다. NS4A 보조인자와 복합체 형태인 Lys¹⁵⁵ 변이체 프로테아제의 하나의 구형 단위를 야생형 Arg¹⁵⁵ 공복합체와 중첩시켰다. Cα 원자의 rms 편차는 단지 0.314 Å 밖에 안되기 때문에 이들 2개의 프로테아제의 구조상에 있어서 차이는 거의 없었다.

S2 및 S4 포켓내 NS3 프로테아제 123, 168 및 155번 잔기의 측쇄에 대한 근접 영상을 도 25(B)에 나타낸다. 촉매성 3원소 잔기중 하나인 Asp⁸¹의 Cβ와 155번 잔기의 Cδ 사이의 거리에 의해 입증된 바, 155번 잔기의 측쇄(Lys¹⁵⁵ 대 Arg¹⁵⁵)의 전체 변화는 작다: Lys¹⁵⁵의 경우 4.26 Å이고, Arg¹⁵⁵의 경우 4.24 Å이다. R155K 프로테아제에서, Lys¹⁵⁵의 말단 아민(Nz)과 Asp⁸¹의 Cβ 사이의 거리는 3.5 Å이고, Lys¹⁵⁵의 Cδ와 Asp⁸¹의 Cβ 사이의 거리는 3.6 Å이다. 야생형 프로테아제에서, Arg¹⁵⁵의 NH1과 Nz는 Asp⁸¹의 Cβ로부터 각각 5.6 Å 및 5.3 Å 떨어져 있다. 따라서, R155K 프로테아제에서 Lys¹⁵⁵의 말단 아민 기는 Asp⁸¹의 카복실 기에 대하여 Arg¹⁵⁵의 비교 대상인 말단 아지드 기보다 더 근접해 있다. 대조적으로, 야생형 프로테아제에서 상응하는 Arg¹⁵⁵의 말단 NH2와 Asp¹⁶⁸의 Oε2 쌍 사이의 거리가 3.2 Å인 것과 비교하여 R155K 프로테아제에서 Lys¹⁵⁵의 Nz와 Asp¹⁶⁸의 카복실 원자 Oε2 사이의 거리는 5.8 Å이다. 따라서, R155K 프로테아제에서 Lys¹⁵⁵의 말단 아민 기는 Arg¹⁵⁵의 비교 대상인 말단 아지드 기보다 Asp의 카복실기로부터 더 많이 떨어져 있다. 그러므로, 155번 잔기에서 Arg를 Lys로 치환하는 것이 S2의 형상을 변경시키기 때문에 Lys¹⁵⁵의 Nz 원자는 야생형 Arg¹⁵⁵ 및 Asp 쌍의 경우에서와 같이 Asp¹⁶⁸의 인접 측쇄에 의해 중화될 수는 없다.

4) 텔라프레비어에 대한 R155K 또는 R155T 변이체의 내성 기전

텔라프레비어와 NS3 프로테아제 사이의 상호작용에 관한 구조 모델은 앞서 기술된 바 있다(예컨대, [Lin et al., 상기 동일]). 텔라프레비어와 R155K 효소의 공-복합체 모델에서, 155번 잔기의 측쇄가 상이한 것을 제외하면 동일한 상호작용이 유지되었다. 야생형 프로테아제 구조에서, Arg¹⁵⁵ 측쇄는 텔라프레비어의 바이사이클릭 P2 기 쪽으로 굽어 있고, 이로써 수개의 직접적인 반데르 발스 접촉이 이루어지며 텔라프레비어의 P2 기에 소수성 환경을 제공한다(도 26(A)). 그러나, R155K 효소의 Lys¹⁵⁵ 측쇄는 신장된 입체형태를 갖고, P2와 오직 1 또는 2번의 접촉이 이루어지며, 이로써 텔라프레비어의 P2 기는 더 많이 용매에 노출되는 상태로 남게 된다(도 26(B)). 이러한 관찰 결과는 시험관내 효소 검정법에서 나타낸 것과 같이, R155K 효소가 텔라프레비어에 대하여 감수성이 더 작다는 것과 일치한다. R155M 변이체는 신장된 입체형태의 Met¹⁵⁵ 측쇄를 가질 것이며, 그러므로, 유사하게 텔라프레비어의 P2 기와의 상호작용도 더 적고, 일관되게 저해제와의 결합도 감소된 것으로 관찰될 것이라 가정하는 것이 이치에 맞다.

155번 위치에 보다 짧은 측쇄를 갖는 잔기를 포함하는 변이체와 텔라프레비어의 결합 기전을 이해하기 위하여 텔라프레비어와 복합체를 형성하는 R155T 변이체 효소 모델을 사용하였다. 저해제의 P2 기에 소수성 커버를 제공하기에는 Thr¹⁵⁵ 측쇄가 너무 짧다는 것이 상기 모델로부터 명백해졌다(도 26(C)). Ile, Ser 및 Gly와 같이 기타의 보다 짧은 측쇄의 크기는 유사하거나 심지어 그보다 더 짧고, P2 기와의 상호작용을 유지할 수 없고, 텔라프레비어에 대한 결합 친화성은 감소할 것으로 예측된다.

5) NS3 프로테아제의 Arg ¹⁵⁵ 치환을 갖는 HCV 변이체 레플리콘은 IFN-α에 대해 전체적으로 감수성인 상태로 유지된다.

NS3 155번 잔기에서의 치환을 갖는 텔라프레비어-내성 변이체 레플리콘 세포가 IFN-α 또는 리바비린에 대하여 감수성 상태로 유지되는지 여부 또한 측정하였다. 표 III에 나타낸 바와 같이, IFN-α 또는 리바비린의 IC₅₀은 야생형 레플리콘 세포와 비교하여 R155K, R155T, 또는 R155M 돌연변이를 함유하는 HCV 레플리콘 세포에 대해 사실상 동일하게 유지되었다. 이러한 결과는 리바비린을 포함하거나 포함하지 않는 IFN-α과의 조합이 NS3 프로테아제 155번 잔기에서의 치환을 갖는 HCV 변이체의 출현을 억제시킬 수 있는 잠재적인 치료학적 전략법이 될 수 있다는 것을 제안한다.

표 III. HCV 레플리콘 세포에서 기타 항-HCV 제제에 대한 내성 결핍

안정적인 야생형 및 변이체 HCV 서브게놈 레플리콘 세포주는 상응하는 고효율의 Con1 레플리콘 플라스미드로부터의 T7 RNA 런오프 전사체를 사용하여 생성하였다. 3개의 독립적인 실험으로 48-h 검정법에서 HCV 레플리콘 세포주에 대한 IFN-α 및 리바비린의 평균 IC₅₀ 값 및 SD를 측정하였다. 지정 변이체의 IC₅₀을 야생형 HCV 레플리콘의 IC₅₀으로 나누어 변화 배수를 측정하였다.

실시예 20 연구 결과 요약

하나의 연구는 14일 동안 VX-950을 투여받은 유전자형 1의 C형 간염을 앓는 대상자에서 HCV 프로테아제 NS3-4A 영역의 서열 분석을 통해 VX-950 단일요법에 대한 약물 내성 돌연변이의 가능한 출현을 모니터하는 것이었다. 전통적으로 내성 유전자형 분석은 혈장 바이러스에서 우성 서열을 검출하는, 집단-기초 서열 분석에 의해 수행되어 왔다. 20% 미만의 바이러스 집단을 구성하는 임의 서열은 이러한 방법에 의해 검출되지 않을 것이다. 약물-내성 돌연변이가 이와 같이 측정가능한 수준으로 축적되는데는 14일보다 긴 시간이 소요될 수 있기 때문에 부수적인 변이체 집단의 검출을 위해 새로운 방법이 개발되었다. 각 시점마다 대상자 1명당 약 80-85개의 개개의 바이러스 클론으로부터 서열을 수득하였고, 이로써 VX-950을 14일간 투여한 후 출현할 수 있는 내성 돌연변이로서 감수성이 집단의 약 5%까지 감소된 것을 동정할 수 있다.

VX-950에 대한 바이러스 반응에 의해 분류된 대상자에서 전혀 다른 돌연변이 패턴이 관찰되었다. 투여 기간 동안 HCV RNA가 반동된 제1군의 대상자에서, 야생형 바이러스는 거의 완전히 ETR 및 추적 관찰시 36, 54, 또는 155번 위치에 돌연변이를 함유하는 1 내지 3개의 변이체로 대체되었다. V36A 돌연변이는 유전자형 1b 대상자에서 발견된 반면, V36A/M 또는 R155K/T는 유전자형 1a 대상자에서 관찰되었다. 1a 대상자에서 몇몇 변이체는 또한 36 및 155번 위치에서 이중 돌연변이를 함유하였다. T54A 돌연변이는 1a 및 1b 아형, 둘 모두에서 관찰되었다. 36 및 54번 위치에서의 돌연변이가 동일 게놈에서 함께 발견되는 경우는 거의 없기 때문에 이는 상호 배타적인 것으로 보인다. 제2군의 대상자에서는 초기에 HCV RNA가 감소하고, 14일간의 투여 기간 종료시에는 안정되었다. 이들 대상자는 156번 위치에 알라닌으로부터 발린(A156V) 또는 트레오닌(A156T)으로의 돌연변이를 함유하는 바이러스를 포함하였다. 이러한 156번 위치의 돌연변이는 종래에 VX-950의 존재하에 시험관내에서 개발된 것으로 나타나 있다(6, 7). 일부 대상자는 36번 및 156번 위치에 이중 돌연변이도 함유하는 몇몇 변이체를 포함하였다.

대상자-특이성 프로테아제 클론을 발현시키고, VX-950에 의한 저해에 대하여 시험하였다. 아형내 상이한 대상 단리물로부터 유도된 기준선 프로테아제의 효소 IC₅₀ 값에 있어서 유의적인 차이는 없었다. 그러나, 돌연변이체 프로테아제의 IC₅₀ 값는 VX-950에 대한 감수성이 다양한 정도로 감소되었음을 나타낸다. 마지막 대상자 군에서 HCV RNA는 투여 기간 내내 계속하여 감소하고, 일부는 현 검정법의 검출 한계보다 낮은 수준에 도달하였다(10 IU/mL). 본 발명자의 서열 분석 검정법의 감수성 한계 때문에(>100 IU/mL), 투여 14일째에는 이들 대상자에 대한 어떤 바이러스 서열 데이타도 이용불가능하다. 그러나, VX-950 마지막 투여 후 7 내지 10일이 경과한 후에 수득한 샘플을 모든 대상자에 대하여 성공적으로 서열 분석하였다. 처음 2개의 반응군으로부터 얻은 추적 관찰 샘플에서, 내성 돌연변이는 대상자 모두의 혈장에서 지속되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 많은 경우, 야생형 뿐만 아니라, 36번 또는 54번 위치에서의 돌연변이가 비례적으로 증가하기 시작하는 바, 156번 위치에서의 돌연변이 빈도는 유의적으로 감소하였다. 155번 위치에 돌연변이를 갖는 비리온의 비율은 상대적으로 일정하게 유지되었다. 이러한 돌연변이 패턴상의 변화는 약물 선택 압박에 대한 부재하의 변이체 사이의 적응도 차이 때문일 수 있다. 36, 54, 또는 155번 위치에 돌연변이를 갖는 바이러스는 비록 야생형보다는 적응도가 낮지만, 여전히 적응도는 적당한 반면; 156번 잔기의 돌연변이체는 약물 부재하에서 매우 부적당하다. 이러한 데이타로부터 상이한 단일 돌연변이체에 대한 적응도과 내성 수준 사이에는 역 상관관계가 있는 것으로 보인다. 혈장 HCV RNA에서 편평역을 갖는 대상자 군으로부터 유도된 데이타는 지정 임상 반응을 일으키는 바이러스 내성 및 적응도의 영향력을 나타낸다. 따라서, 임상 반응 그 자체로는 내재된 바이러스성을 나타낼 수 없다.

투여하는 동안 HCV RNA는 계속 감소하여 HCV RNA가 낮은 수준에 도달하는 마지막 대상자 군의 분석을 통해 추적 관찰시 제시된 바이러스는 36번 및 54번 위치에서 거의 낮은 수준의 내성 돌연변이로 구성되고, 3명의 대상자는 돌연변이를 거의 포함하지 않지만, 대개는 또한 완전하게는 야생형이라는 것이 밝혀졌다. 14일째 존재한다면 어떤 변이체가 존재하는지에 관해서는 알져진 바 없지만, 상기 결과는 VX-950에 대한 최적의 반응과 함께 단일요법으로 또는 기타 항바이러스 화합물, 예로서, Peg-IFN의 첨가에 의해 임상적인 내성을 회피할 수 있다는 것을 제안한다. 투여 요법을 최적화하는 것이 이러한 반응을 더욱더 많은 환자에게로 확장시킬 수 있다.

요약컨대, 이러한 결과는 본 연구에서 VX-950의 투여 요법을 통해 약물 내성 수준이 다양한 NS3 프로테아제에서의 상이한 돌연변이를 선택될 수 있다는 것을 나타낸다. VX-950의 농도 증가가 내성 수준이 낮은 바이러스(36, 54, 또는 155번 위치에서)의 출현을 방지할 수 있을 것으로 예측된다. 남아있는, 내성 수준이 높은 바이러스(156번 위치에서)는 병용 요법을 비롯한 상이한 치료 옵션을 통해 극복될 수 있다. 보다 고농도의 약물이 바이러스 복제를 더욱 완벽하게 저해할 수 있는데, 이는 초기의 감소 기울기가 보다 급경사를 이루기 때문에, 이로써 내성 돌연변이가 선택될 수 있고, 임상적인 내성을 유발할 수 있는 기회를 감소시키기 때문이다. Peg-IFN을 VX-950 치료법에 첨가하면 바이러스의 면역-매개 제거율은 증진될 수 있는데, 면역-매개 제거율의 효능이 내성 변이체 존재에 의해 영향을 받지 않아야 한다. 비록 156번 위치의 돌연변이가 높은 수준의 내성을 부여하지만, VX-950 부재하에서 그의 상대적인 복제율에 의해 측정된 바에 따르면, 상당한 적응도 손실이 따르는 것으로 보인다. 항바이러스 약물 내성이 바이러스 적응도 손상과 관련이 있다는 증거는 계속 증가하고 있고, 이는 임상적으로 유익한 것으로 해석될 수 있다(1-3, 9). 낮은 수준으로 복제하는 내성 바이러스는 즉시 보상성 적응 돌연변이를 축적시킬 수 없고, 이로써 숙주의 면역계 또는 다른 약물, 예로서, Peg-IFN은 남아있는 바이러스를 제거할 수 있게 된다.

참고문헌

표 1. VX-950 투여 이후 발견된 HCV 프로테아제의 단일 또는 조합형 돌연변이

표 2. VX-950 및 BILN 2061을 사용한 단일 및 이중 돌연변이체의 IC ₅₀ 분석

표 3. 동일 위치상의 상이한 아미노산 돌연변이의 VX-950에 대한 평균 IC ₅₀ 값

표 4. 바이러스 돌연변이체의 적응도

표 5. 돌연변이체 HCV 프로테아제의 내성 요약

참고 문헌에 의한 인용

본원에서 언급한 모든 간행물과 특허는 마치 각 개개의 간행물 또는 특허가참고로 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 제시된 것과 같이 그 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

본 대상 개시내용의 특정 실시태양을 논의하였지만, 상기 명세서는 예시적인 것이며, 제한적인 것이 아니다. 본 명세서와 하기 청구의 범위 리뷰시 당업자에게는 본 개시내용의 다양한 변형이 자명할 것이다. 본 개시내용의 전체적인 범주는 그의 등가물의 전체적인 범주와 함께 청구의 범위를, 그의 변형과 함께는 본 명세서를 참고로 하여 결정되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> VERTEX PHARMACEUTICALS, INC. <120> HEPATITIS C VIRUS VARIANTS <130> VPI/05-01 PCT <140> PCT/US2006/044363 <141> 2006-11-13 <150> 60/854,598 <151> 2006-10-25 <150> 60/735,577 <151> 2005-11-11 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 2055 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 1 gcgcctatta cggcctactc ccaacagacg cgaggcctac ttggctgcat catcactagc 60 ctcacaggcc gggacaggaa ccaggtcgag ggggaggtcc aagtggtctc caccgcaaca 120 caatctttcc tggcgacctg cgtcaatggc gtgtgttgga ctgtctatca tggtgccggc 180 tcaaagaccc ttgccggccc aaagggccca atcacccaaa tgtacaccaa tgtggaccag 240 gacctcgtcg gctggcaagc gccccccggg gcgcgttcct tgacaccatg cacctgcggc 300 agctcggacc tttacttggt cacgaggcat gccgatgtca ttccggtgcg ccggcggggc 360 gacagcaggg ggagcctact ctcccccagg cccgtctcct acttgaaggg ctcttcgggc 420 ggtccactgc tctgcccctc ggggcacgct gtgggcatct ttcgggctgc cgtgtgcacc 480 cgaggggttg cgaaggcggt ggactttgta cccgtcgagt ctatggaaac cactatgcgg 540 tccccggtct tcacggacaa ctcgtcccct ccggccgtac cgcagacatt ccaggtggcc 600 catctacacg cccctactgg tagcggcaag agcactaagg tgccggctgc gtatgcagcc 660 caagggtata aggtgcttgt cctgaacccg tccgtcgccg ccaccctagg tttcggggcg 720 tatatgtcta aggcacatgg tatcgaccct aacatcagaa ccggggtaag gaccatcacc 780 acgggtgccc ccatcacgta ctccacctat ggcaagtttc ttgccgacgg tggttgctct 840 gggggcgcct atgacatcat aatatgtgat gagtgccact caactgactc gaccactatc 900 ctgggcatcg gcacagtcct ggaccaagcg gagacggctg gagcgcgact cgtcgtgctc 960 gccaccgcta cgcctccggg atcggtcacc gtgccacatc caaacatcga ggaggtggct 1020 ctgtccagca ctggagaaat ccccttttat ggcaaagcca tccccatcga gaccatcaag 1080 ggggggaggc acctcatttt ctgccattcc aagaagaaat gtgatgagct cgccgcgaag 1140 ctgtccggcc tcggactcaa tgctgtagca tattaccggg gccttgatgt atccgtcata 1200 ccaactagcg gagacgtcat tgtcgtagca acggacgctc taatgacggg ctttaccggc 1260 gatttcgact cagtgatcga ctgcaataca tgtgtcaccc agacagtcga cttcagcctg 1320 gacccgacct tcaccattga gacgacgacc gtgccacaag acgcggtgtc acgctcgcag 1380 cggcgaggca ggactggtag gggcaggatg ggcatttaca ggtttgtgac tccaggagaa 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16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Lys Lys Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys 1 5 10 15

Claims (1)

1. HCV NS3 프로테아제, 그의 생물학적 활성 유사체, 또는 그의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드로서, 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 코돈 36, 41, 43, 54, 148, 155, 및 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 코돈에 상응하는 하나 이상의 코돈이, 야생형 HCV 폴리뉴클레오티드의 상응하는 코돈에 의해 코딩되는 아미노산과 상이한 아미노산을 코딩하도록 돌연변이된 것인 단리된 HCV 폴리뉴클레오티드.

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