CN101405295A

CN101405295A - 丙型肝炎病毒变种

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Publication number: CN101405295A
Application number: CNA2006800508436A
Authority: CN
Inventors: 林超; T·凯菲尔; C·萨拉兹恩; A·夸恩格
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-11-11
Filing date: 2006-11-13
Publication date: 2009-04-08
Also published as: JP2009515532A; EP2392588A3; RU2012121884A; EP2392590A2; RU2008123606A; EP2392588A2; WO2007059221A3; WO2007059221A2; WO2007059221A9; JP5409008B2; KR20140098867A; AU2006315438A1; EP1951748A2; CA2629343A1; EP2392589A3; JP2012196230A; KR20080072906A; EP2392590A3; EP2392589A2; JP2014217390A

Abstract

本发明涉及HCV变种，特别是对蛋白酶抑制剂例如VX－950有抵抗力的变种。还提供了涉及HCV变种的方法和组合物。进一步提供了分离、鉴定和表征来自患者的多重病毒变种的方法。

Description

丙型肝炎病毒变种

发明领域

本发明涉及丙型肝炎病毒(HCV)变种。

发明背景

丙型肝炎病毒(HCV)感染全世界超过1.7亿人并且是慢性肝炎的主因，所述慢性肝炎最终可以导致末期肝硬化和肝细胞癌。关于HCV感染的标准治疗目前是与病毒唑(RBV)组合的聚乙二醇化干扰素α(Peg-IFN)。HCV治疗的目标是通过获得持久的病毒应答(SVR)来清除病毒感染，如通过在抗病毒治疗6个月后血液中具有检测不到的HCV-RNA。不幸的是，目前治疗在约50％具有基因型1的受试者中无效，并且副作用显著。因此需要新的抗病毒靶和改善的治疗策略(Pawlotsky，J.M.和J.G.McHutchison，2004，Hepatitis C.Development of new drugs and clinical trials：promises andpitfalls.Summary of an AASLD hepatitis single topicconference，Chicago，IL，February 27-March 1，2003，Hepatology39：554-67；Strader等人，2004，Diagnosis，management，andtreatment of hepatitis C.Hepatology 39：1147-71)。

非结构(NS)3-4A蛋白酶是HCV复制所需的并且是关于新型抗HCV治疗的有希望的靶。VX-950，有效和特异性NS3-4A蛋白酶抑制剂在受HCV基因型1感染的受试者的1b期试验中证实基本抗病毒活性(研究VX04-950-101)。观察到的受试者对治疗应答的程度和病毒反弹的速率可能部分是由于对蛋白酶抑制剂的敏感性的基因型差异。HCV的快速复制速率连同其聚合酶的弱保真度引起遍及其基因组的突变的积聚(Simmonds，P.，2004，Genetic diversity and evolution ofhepatitis C virus-15 years on.J.Gen.Virol.85：3173-88)。蛋白酶区域中的序列变异性影响酶的催化效率或抑制剂的结合的程度未知。另外，具有显著序列变异的众多病毒基因组的产生提出了在用抗病毒疗法治疗的受试者中显现的抗药病毒的潜在性问题。事实上，针对抗病毒药物例如HIV蛋白酶抑制剂的抗药性已得到充分证明(Johnson等人，2004，Top.HIV Med.12：119-24)。抗药突变业已显示在HCV蛋白酶抑制剂的存在下在体外发展(Lin等人，2005，In vitro studies of cross-resistance mutations against twohepatitis C virus serine protease inhibitors，VX-950 and BILN2061.J.Biol.Chem.280：36784-36791；Lin等人，2004，Invitroresistance studies of hepatitis C virus serine proteaseinhibitors，VX-950 and BILN 2061：Structural analysis indicatesdifferent resistance mechanisms.J.Biol.Chem.279：17508-17514；Lu等人，2004，Antimicrob.Agents Chemother.48：2260-6；Trozzi等人，2003，In vitro selection andcharacterization of hepatitis C virus serine protease variantsresistant to an active-site peptide inhibitor.J.Virol.77：3669-79)。对蛋白酶抑制剂BILN 2061有抵抗力的突变已在NS3基因的位置R155Q、A156T和D168V/A/Y上发现，但仍未在NS4区域或蛋白酶切割位点中观察到突变。VX-950抗性突变也已在体外位置A156S上发现。针对VX-950和BILN 2061的交叉抗性突变也已显示在体外位置156(A156V/T)上发展(Lin等人，2005，同上)。

因此，存在鉴定显示出对于药物或其他疗法抗性的突变HCVs或其他病毒和开发有效针对这些突变病毒的新型病毒疗法的需要。

发明概述

因此，本发明提供了HCV变种以及相关方法和组合物。特别地，提供了对一种或多种蛋白酶抑制剂例如VX-950具有减少的敏感性的HCV变种和变体HCV蛋白酶。

在一个方面，本发明提供了编码HCV NS3蛋白酶的分离的HCV多核苷酸、其生物活性类似物、或其生物活性片段的。分离的HCV多核苷酸具有突变的对应野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155或156的至少一个密码子，使得它编码与由野生型HCV多核苷酸的相应密码子编码的氨基酸不同的氨基酸。野生型HCV多核苷酸可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其部分例如SEQ ID NO：1的前543个核苷酸。备选地，野生型HCV多核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的序列或其部分至少60％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多等同的核苷酸序列。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子36的密码子，和该密码子不编码V。在某些实施方案中，该密码子编码M、L、A或G。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子41的密码子，和该密码子不编码Q。在某些实施方案中，该密码子编码H。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子43的密码子，和该密码子不编码F。在某些实施方案中，该密码子编码S。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子54的密码子，和该密码子不编码T。在某些实施方案中，该密码子编码S或A。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子148的密码子，和该密码子不编码G。在某些实施方案中，该密码子编码E。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子155的密码子，和该密码子不编码R。在某些实施方案中，该密码子编码K、M、S、T、G、I或L。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子156的密码子，和该密码子不编码A。在某些实施方案中，该密码子编码S、T、V或I。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应选自下述的任何2个密码子的2个密码子：野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156，和所述2个密码子是突变的，使得任一密码子编码与由野生型HCV多核苷酸的相应密码子编码的氨基酸不同的氨基酸。例如，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子36的密码子，和该密码子编码A或M；分离的HCV多核苷酸进一步包含对应野生型多核苷酸的密码子155的密码子，和该密码子编码K或T；备选地，分离的HCV多核苷酸进一步包含对应野生型多核苷酸的密码子156的密码子，和该密码子编码T。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应选自下述的任何3个密码子的3个密码子：野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156，和所述3个密码子是突变的，使得3个密码子各自编码与由野生型HCV多核苷酸的相应密码子编码的氨基酸不同的氨基酸。

在某些实施方案中，分离的HCV多核苷酸包含对应野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156的4个密码子，和所述4个密码子是突变的，使得4个密码子各自编码与由野生型HCV多核苷酸的相应密码子编码的氨基酸不同的氨基酸。

在进一步的实施方案中，本发明提供了涉及本发明的HCV多核苷酸的方法和组合物。例如，提供了包含HCV多核苷酸的表达系统，且此类表达系统可以包括包含与启动子可操作地连接的HCV多核苷酸的载体；还提供了用该载体转染、转化或转导的宿主细胞。备选地，本发明的表达系统基于mRNA展示技术，例如如美国专利号6,258,558中描述的RNA-蛋白质融合技术，或如美国专利号6,361,943中描述的体外“病毒”技术。

在另一个方面，本发明提供了分离的HCV变种。分离的HCV变种可以包含编码HCV NS3蛋白酶的多核苷酸，其中对应选自下述的密码子的多核苷酸的至少一个密码子是突变的：野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156，使得它编码与由野生型HCV多核苷酸的相应密码子编码的氨基酸不同的氨基酸。本发明的进一步的实施方案提供了涉HCV变种的方法和组合物。例如，提供了鉴定可以抑制本发明的HCV变种复制的化合物的方法；提供了被本发明的HCV变种感染的细胞。

在另一个方面，本发明提供了分离的HCV蛋白酶，特别是HCV NS3蛋白酶。分离的HCV NS3蛋白酶可以包含这样的氨基酸序列，其中在选自下述的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。野生型HCV NS3蛋白酶可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分，例如SEQ ID NO：2的前181个氨基酸。分离的HCV NS3蛋白酶可以包含HCV NS3蛋白酶的生物活性类似物或片段，例如分离的HCV NS3蛋白酶可以不具有SEQ ID NO：2的N末端的5、10、15、20、30、35、40、45或48个氨基酸。

分离的HCV NS3蛋白酶还可以包括NS4A辅因子，例如，如由SEQID NO：2的后54个氨基酸表示的NS4A蛋白质。分离的HCV NS3蛋白酶可以是通过使NS4A辅因子与NS3蛋白酶结构域栓系形成的蛋白质复合物，例如如美国专利号6,653,127和6,211,338中描述的。

在一个进一步的方面，本发明提供了对本发明的HCV蛋白酶特异的抗体。该抗体可以识别包含这样的氨基酸序列的HCV NS3蛋白酶，其中在选自下述的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。本发明的进一步实施方案提供了涉及本发明的抗HCV蛋白酶抗体的方法和组合物。例如，提供了包含本发明的抗体的诊断试剂盒、以及包含本发明的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一个方面，本发明提供了能够在严格条件下与本发明的HCV多核苷酸的核酸序列杂交的核苷酸探针或引物。本发明的进一步的实施方案提供了涉及该探针或引物的方法和组合物。例如，提供了包含本发明的探针或引物的诊断或检测试剂盒，和该试剂盒在例如测定本发明的HCV变种或HCV NS3蛋白酶是否存在于样品中有用。

在一个进一步的方面，本发明提供了用于评估患者中对HCV感染的蛋白酶抑制剂的抗药性或敏感性的方法。此类方法可以包括收集来自HCV感染的患者的生物样品，和评估或测定样品是否包含编码HCVNS3蛋白酶的核酸，所述HCV NS3蛋白酶包含这样的氨基酸序列，其中在选自下述的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。蛋白酶抑制剂可以是VX-950或另一种蛋白酶抑制剂。

还提供了用于指导治疗或设计关于患者中的HCV感染的治疗方案的方法。该方法可以包括评估患者对蛋白酶抑制剂的抗药性或敏感性，和基于抗药性或敏感性确定关于患者的方案。例如，如果预测或检测到抗药性(例如，对蛋白酶抑制剂例如VX-950减少的敏感性)，可以在患者的治疗计划或治疗方案中包括一种或多种其他化合物或试剂。该方法可以包括下述的任何组合：测定患者中的HCV NS3蛋白酶的序列(例如，基因分型)、测定患者中对HCV NS3蛋白酶的蛋白酶抑制剂的敏感性(例如，表型分型)、或测定患者的HCVs的病毒适合度水平。表型分型可以在无细胞系统(例如，体外蛋白酶测定法)以及基于细胞的系统(例如，复制子测定法或病毒感染或复制测定法)中进行。

在另一个方面，本发明提供了用于鉴定用于治疗患者中的HCV感染的候选化合物的方法。此类方法可以包括提供由本发明的HCV变种感染的样品，和测定候选化合物抑制样品中的HCV变种的活性的能力。由HCV变种感染的样品可以得自患者，例如细胞或血浆样品。由HCV变种感染的样品也可以是培养细胞。HCV变种的活性可以通过其感染、复制和/或变得被释放的能力测定。

备选地，此类方法可以包括提供包含本发明的HCV多核苷酸的复制子RNA，和在合适的测定法中测定候选化合物是否抑制复制子RNA的复制。

另一种备选方法可以包括提供本发明的分离的HCV NS3蛋白酶和蛋白酶底物，和测定HCV NS3蛋白酶活性在候选化合物的存在下是否减少；HCV NS3蛋白酶和/或蛋白酶底物可以在基于细胞的系统中，例如在培养细胞中表达，或HCV NS3蛋白酶和/或蛋白酶底物可以在无细胞系统中，例如包括HCV NS3蛋白酶和肽底物的反应混合物。HCV NS3蛋白酶可以是如美国专利号6,258,558中描述的RNA-蛋白质融合分子，和此类融合分子可以包括在评估蛋白酶活性的无细胞测定法中。

用于评估用于治疗患者中的HCV感染的候选化合物的进一步备选方法可以包括：将包含本发明的HCV多核苷酸的载体和编码指示物的指示基因引入宿主细胞内，和在候选化合物的存在和不存在下测量指示物。

本发明的另一个方面提供了用于鉴定能够援救VX-950针对HCVNS3蛋白酶的活性的化合物的方法，所述HCV NS3蛋白酶例如已变得对VX-950有抵抗力的HCV NS3蛋白酶。此类化合物也称为“次级化合物”。该方法可以包括使本发明的HCV NS3蛋白酶与候选化合物接触，和测定VX-950抑制HCV NS3蛋白酶的活性的能力。该方法还可以包括下述步骤：在计算机上模拟对VX-950具有减少的敏感性(例如如通过测量IC₅₀和/或K_i测定的)的变体HCV NS3蛋白酶，和设计和/或选择可以援救VX-950的活性的化合物。

还提供了用于治疗患者中的HCV感染的方法，和该方法包括给患者施用药学有效量的次级化合物，所述次级化合物可以援救VX-950的活性。次级化合物可以单独或与VX-950组合施用于患者。次级化合物可以在患者的治疗方案中暂时或永久地代替VX-950。例如，在暂时代替治疗方案中，在化合物施用于患者并且已援救VX-950的活性后，将VX-950施用于患者。

进一步提供了用于鉴定在减少HCV NS3蛋白酶活性中有效的化合物的方法。该方法可以包括获得本发明的HCV NS3蛋白酶的三维模型，和设计或选择化合物。该方法可以进一步包括在计算机上、体外和/或体内评估化合物与蛋白酶结合或相互作用的能力。该方法还可以涉及测定设计或选择的化合物在无细胞或基于细胞的测定法中是否可以抑制HCV NS3蛋白酶活性的能力，所述HCV NS3蛋白酶特别是对蛋白酶抑制剂例如VX-950具有减少的敏感性的变体HCV NS3蛋白酶。该方法可以进一步或备选包括测定设计或选择的化合物抑制细胞或样品中的HCV复制的能力。HCV复制可以通过测量本发明的HCV变种或本发明的HCV复制子的复制来测定。

本发明的另一个方面提供了用于消除或减少生物样品、或者医学或实验室设备的HCV污染的方法。该方法可以包括使生物样品、或者医学或实验室设备与本发明的化合物，例如通过本文描述的方法鉴定的化合物接触的步骤。

本发明的一个进一步的方面提供了用于治疗患者中的HCV感染的方法。该方法可以包括给患者单独或与另一种抗病毒剂组合施用药学或治疗有效量的通过本发明方法鉴定的化合物。

本发明的另一个方面涉及计算机工具，其提供了包含用机器可读数据编码的数据存储材料的机器可读数据存储媒体，其中机器可读数据包含关于与HCV变种或生物样品相关的至少2个特征的指数值。该特征选自：a)显示对蛋白酶抑制剂减少的敏感性的抗性的能力；b)HCV蛋白酶包含这样的氨基酸序列，其中在选自下述的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156；c)患者的发病或恢复潜力；和d)HCV变种改变的复制能力(增加或减少)。

本发明的一个进一步的方面提供了获得受HCV感染患者中的HCV变种谱的方法。该方法可以包括获得来自患者的样品(例如，血浆样品)，和基因分型和/或表型分型来自样品的至少2、20、50、100、200、500个或更多HCV病毒粒子的HCV蛋白酶。例如，此类基因分型可以包括测定来自血浆样品的至少2、20、50、100、200、500个或更多HCV病毒粒子的HCV蛋白酶的核苷酸序列。

在某些实施方案中，实施此类分谱的患者可以已用或选择将用蛋白酶抑制剂例如VX-950进行治疗。在某些实施方案中，在2个或更多不同时间点上获得来自实施此类分谱的患者的血浆样品。

附图简述

图1举例说明来自未处理的受基因型1HCV感染的受试者中NS3蛋白质N末端543个核苷酸的基线序列的系统进化分析。

图2显示对于基因型1a和1b蛋白酶变体的Telaprevir(VX-950)的基线IC₅₀s。

图3举例说明基于对VX-950的病毒应答的受试者分组。

图4(彩色)概括了对应突变模式的病毒应答。

图5显示来自针对VX-950的蛋白酶单重抗性突变体的HCV-H参照基因型1a毒株的酶促IC₅₀s和倍数变化。

图6显示来自针对VX-950的蛋白酶双重抗性突变体的HCV-H参照基因型1a毒株的酶促IC₅₀s和倍数变化。

图7显示对于VX-950的抗性和适合度之间的反相关。

图8举例说明2种HCV蛋白酶抑制剂的结构：VX-950和BILN 2061。

图9举例说明根据结构研究在HCV蛋白酶中的VX-950变异的位置。

图10概述用于HCV病毒变种的表型分析的方法。

图11显示V36置换给予针对VX-950的低水平的抗性。

图12显示V36M变体蛋白酶的X射线结构。

图13显示V36与VX-950不进行直接接触。

图14显示V36M变体在G1a中具有低水平的抗性和更好的适合度。

图15显示V36A变体在G1a/b中具有低水平的抗性和更差的适合度。

图16显示V36G变体在G1b中具有低水平的抗性和更差的适合度。

图17显示V36L变体没有抗性，这在G1中也是罕见的。

图18也概述用于HCV病毒变种的表型分析的方法。

图19显示R155置换给予针对VX-950的低水平的抗性。

图20显示R155K变体蛋白酶的X射线结构。

图21显示与R155K变体蛋白酶结合的VX-950的计算机模型。

图22显示V36或T54置换给予针对VX-950的低水平的抗性。

图23显示与V36M变体蛋白酶结合的VX-950的计算机模型。

图24显示V36M和R155K置换在给予针对VX-950的抗性方面是累加的。

图25显示结构研究的结果：(A)与NS4A辅因子复合的Lys¹⁵⁵变体和Arg¹⁵⁵野生型NS3蛋白酶结构域的X射线结构的重叠。野生型(蓝色)和R155K变体(红色)蛋白酶的Cα原子踪迹显示为线。残基155用球棍模型(Arg¹⁵⁵)或Liquorice模型(Lys¹⁵⁵)突出显示，其中氮为蓝色和氧为红色。(B)野生型NS3-4A的Arg¹⁵⁵、Asp¹⁶⁸和Arg¹²³的侧链与R155K变体中相应的Lys¹⁵⁵、Asp¹⁶⁸和Arg¹²³的侧链的重叠。R155K变体蛋白酶的3个残基(Arg¹²³、Asp¹⁶⁸和Lys¹⁵⁵)显示于Liquorice模型中，野生型蛋白酶的Arg1⁵⁵也是如此。野生型蛋白酶的Arg¹²³和Asp¹⁶⁸残基显示为细线。所有氮都是蓝色的和氧是红色的。

图26显示了特拉匹韦(telaprevir)与HCV NS3蛋白酶结构域的共同复合物(co-complex)的计算模型，所述HCV NS3蛋白酶结构域与NS4A辅因子复合。在所有三维模型中，包括野生型(A)、R155K(B)或R155T(C)变体蛋白酶，特拉匹韦在棍图中以浅蓝色显示，而氮为蓝色和氧为红色。活性位点残基(His⁵⁷、Asp⁸¹和Ser¹³⁹)显示为灰色棍。Arg¹²³和Asp¹⁶⁸残基为紫色，而残基155侧链为黄色。Lys¹⁵⁵或Thr¹⁵⁵侧链保持伸展构象，使得与特拉匹韦的P2基团最低限度的接触。

图27显示VX-950抗性复制子变体保持对IFN-α非常敏感。

图28显示VX-950抗性复制子变体保持对病毒唑非常敏感。

图29显示VX-950组合疗法在给药期间抑制病毒抗性的出现并阻止病毒突破。

图30提供关于HCV序列多样性和抗性突变的概括点。

图31概括针对HCV蛋白酶抑制剂的病毒变种抗性的机制，包括先前研究。

图32概括关于针对HCV蛋白酶抑制剂的病毒变种抗性的机制的结论，包括先前的研究和本研究。

图33概括基于本研究的某些结论。

发明详述

本发明涉及HCV变种。特别地，提供了显示对蛋白酶抑制剂的抗性的HCV变种。还提供了涉及HCV变种的方法和组合物。该方法和组合物在下述方面有用，鉴定病毒变种，包括HCV和其他病毒变种，评估并鉴定抗病毒化合物，和发展并优化针对病毒感染的疗法。

本发明基于下述研究：首先表征在用VX-950给药前从34个受试者中分离的HCV NS3蛋白酶结构域内的序列多样性的程度，所述受试者参与临床试验，研究VX04-950-101。随后通过在用VX-950给药14天后受试者中的蛋白酶NS3-4A区域的序列分析监控在体内针对VX-950的抗性的出现。在给药结束后7-10天进一步收集随访样品，以察看在给药期间发展的任何抗药突变在VX-950去除后是否维持在血浆中。发现在群体中已增加超过基线的任何突变视为潜在抗药突变。因为抗药性突变可能需要一定时间积聚至可测量的水平，所以该研究包括检测变种的较小群体(而不是野生型病毒和病毒变种群体中的占优势种类)的新方法，所述方法涉及获得来自许多(例如，80-85)单个病毒克隆/受试者/时间点的序列，使得可以检测并鉴定在用VX-950给药14天中可能出现的病毒变种，其敏感性下至约5％的群体。此类80/85单个病毒克隆可以代表高达80/85个不同的病毒粒子。

HCV变种以及相关多核苷酸和蛋白酶

本发明提供了HCV变种。在具体实施方案中，HCV变种包括编码对蛋白酶抑制剂例如VX-950具有减少的敏感性的HCV蛋白酶(也称为“变体HCV蛋白酶”)的多核苷酸序列。如本文所使用的，野生型HCV指包含编码对蛋白酶抑制剂具有正常或所需敏感性的HCV蛋白酶的多核苷酸(也称为“野生型多核苷酸”)的HCV，并且在具体实施方案中，蛋白酶抑制剂是VX-950。类似地，野生型HCV蛋白酶指对蛋白酶抑制剂具有正常或所需敏感性的HCV蛋白酶，并且在具体实施方案中，蛋白酶抑制剂是VX-950。

如本文所使用的，HCV可以是任何基因型或亚型的HCV，例如基因型1-6。

如本文所使用的，“NS3蛋白酶”或“HCV NS3蛋白酶”指HCV NS蛋白质3或其具有丝氨酸蛋白酶活性的部分。例如，NS3蛋白酶可以是如SEQ ID NO：2(685个氨基酸)的前631个氨基酸序列表示的NS3蛋白质；备选地，NS3蛋白酶可以是如SEQ ID NO：2的前181个氨基酸表示的蛋白质；181-氨基酸片段在本领域中也称为NS3蛋白酶结构域。NS3蛋白酶也可以是NS3-NS4A蛋白质复合物，例如美国专利号6,653,127；6,211,338中描述的复合物。“NS3蛋白酶活性”指在NS4A蛋白质或其生物活性部分的存在或不存在下HCV NS蛋白质3或其部分的蛋白酶活性。NS4A蛋白质，例如如由SEQ ID NO：2的后54氨基酸序列表示的，通常充当NS3蛋白酶的辅因子，并且可以形成NS3-NS4A丝氨酸蛋白酶复合物；NS4A蛋白质的生物活性部分指NS4A蛋白质的片段，其保留NS4A蛋白质作为NS3蛋白酶的辅因子的功能。

本发明还提供了分离的HCV变种，分离的变种HCV NS3蛋白酶，和编码变种HCV NS3蛋白酶的分离的多核苷酸。术语“分离的”一般指从受试病毒、蛋白酶或多核苷酸的天然环境的组分中分离的和/或回收的。

在某些实施方案中，变体HCV蛋白酶可以是包含这样的氨基酸序列的变体HCV NS3蛋白酶，其中在来自野生型HCV NS3蛋白酶的位置36、41、43、54、148、155和156的一个或多个位置上的一个或多个氨基酸不同于野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的氨基酸。野生型HCV NS3蛋白酶可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分，例如SEQ ID NO：2的前181个氨基酸。分离的HCV NS3蛋白酶可以包含HCV NS3蛋白酶的生物活性类似物或片段，例如分离的HCV NS3蛋白酶可以不具有SEQ ID NO：2的N末端的5、10、15、20、30、35、40、45或48个氨基酸。

在变体HCV NS3蛋白酶的各个位置上的氨基酸置换或突变的例子显示于表1-4中。本文的表、图和实施例也提供了与野生型HCV NS3蛋白酶或野生型HCVs比较，用变体HCV NS3蛋白酶或HCV病毒变种获得的各种数据。

还提供了本发明的变体HCV NS3蛋白酶的生物活性片段或类似物。Bartenschlager等人(1994，J.Virology 68：5045-55)描述了HCV NS3蛋白质的各种片段，例如，N末端7或23个残基的删除取消在NS4B/5A位点上的切割，但对实施NS3蛋白酶活性的其他切割位点没有影响；和N末端39个残基的删除取消在NS4B/5A和NS5A/5B位点上的切割，并减少在NS4A/4B位点上的NS3蛋白酶活性。Failla等人(1995，J.Virology 69：1769-77)描述了野生型NS3蛋白质的N末端10个残基的删除对NS3蛋白酶活性没有影响，N末端15或28个残基的删除导致NS3蛋白质具有部分蛋白酶活性的NS3蛋白质(在NS5A/5B位点上正常切割，但在NS4A/4B和NS4B/5A位点上较低)，N末端49个残基的删除导致完全失活的NS3蛋白酶，和NS3蛋白质中NS3蛋白酶结构域的C末端10个残基的删除也导致完全失活的NS3蛋白酶。

提供了例如制备本发明的变体HCV蛋白酶的表达系统。表达系统还可以包括包含本发明的HCV多核苷酸的表达载体。包含本发明的HCV多核苷酸(或“核酸”，在本文中可互换使用)的合适原核或真核载体(例如，表达载体)可以通过合适的方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)引入合适的宿主细胞内，使得多核苷酸与一种或多种表达控制元件可操作地连接(例如，在载体中或整合到宿主细胞基因组内)。对于生产，宿主细胞可以维持在适合于表达的条件下(例如，在诱导物，补充有合适的盐、生长因子、抗生素、营养补充物等的合适培养基的存在下)，由此生产编码的多核苷酸。需要时，可以回收和/或分离(例如，从宿主细胞或培养基中)编码的蛋白质。应当理解生产方法包括在转基因动物的宿主细胞中表达(参见例如，WO92/03918)。表达系统可以基于无细胞系统例如美国专利号6,258,558中描述的RNA-蛋白质融合技术，或美国专利号6,361,943中描述的体外“病毒”。也可以使用核糖体展示法，例如美国专利号5,843,701中描述的方法。

提供了各种测定法，例如适合于HCVs表型分型的测定法。该测定法可以指向测量病毒活性(例如，感染、复制和/或病毒颗粒的释放)或酶促活性(例如，蛋白酶活性)。病毒活性测定法可以使用由待测活性的病毒或病毒变种感染的细胞或样品。细胞或样品可以得自患者例如人患者。备选地，细胞或样品可以进行培养并在体外用病毒或病毒变种进行感染。病毒活性测定法可以使用基于复制子的系统，例如Trozzi等人(13)和美国专利申请公开号20050136400中描述的基于复制子的系统。

酶促活性可以在无细胞或基于细胞的系统中进行测定，其一般包括目的酶或其生物活性片段或类似物和目的酶的底物。例如，美国专利申请公开号20030162169描述了用于测定HCV NS3蛋白酶的活性的基于替代细胞的系统和方法。Trozzi等人(13)描述了使用肽底物和HPLC系统的体外、无细胞蛋白酶测定法。

本发明利用NS3/4A蛋白酶的三维结构已得到解决(参见例如，WO98/11134)的事实。可以获得本发明的变体蛋白酶的三维模型；例如基于其与变体蛋白酶的三维结构相互作用的能力设计或选择化合物，并且与蛋白酶结合或相互作用的能力通过在计算机上模拟进行评估，并可以通过体外或体内测定法中进一步进行评估。

化合物可以是从组合化学文库中鉴定或通过合理药物设计制备的化合物。在示例性实施方案中，该化合物是通过合理药物设计制备的化合物并且衍生自已知蛋白酶抑制剂例如VX-950的结构。合理药物设计也可以与大规模筛选实验的系统方法组合，在所述大规模筛选实验中潜在的蛋白酶抑制剂药物靶用来自组合文库的化合物进行测试。合理药物设计是集中方法，其使用关于药物受体的结构或其天然配体的结构的2以鉴定或制备候选药物。蛋白质的三维结构可以使用X射线晶体学或核磁共振波谱学方法进行测定。在本发明中，包含残基36、41、43、54、148、155或156中的一个或多个突变的变体HCV NS3蛋白酶的三维结构现在可以使用常规X射线晶体学和/或NMR波谱学技术容易地进行测定。合理药物设计也可以与大规模筛选实验的系统方法组合，在所述大规模筛选实验中潜在的蛋白酶抑制剂药物靶用来自组合文库的化合物进行测试。可以设计计算机程序以搜索包含许多不同化学化合物的结构的数据库。该计算机可以选择最可能与变体HCV NS3蛋白酶相互作用的那些化合物，和此类鉴定的化合物可以在适合于评估蛋白酶抑制剂的测定法(例如，病毒或酶促测定法)中进行测试。

在某些实施方案中，将鉴定的化合物配制到包含该化合物和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合物内。优选地，该组合物包含有效减少HCV NS3丝氨酸蛋白酶的活性的量的化合物。更加优选地，该组合物配制用于给患者施用。该组合物还可以包含选自下述的另外试剂：免疫调节剂；抗病毒剂；HCV蛋白酶的第二种抑制剂；和HCV生命周期中的另一种靶的抑制剂；细胞色素P-450抑制剂；或其组合。各种组合物在下文更详细地进行描述。

在另一个方面，本发明提供了对HCV蛋白酶特异的抗体，所述HCV蛋白酶特别是与野生型HCV NS3蛋白酶比较，具有改变的一个或多个氨基酸的HCV NS3蛋白酶。术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且具体包含但不限于，完整的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、由至少2种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所需生物活性。术语“免疫球蛋白”包括不一定是抗体的各种结构上相关的蛋白质。

“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选地完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽连接体，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore，编辑(Springer-Verlag：New York，1994)，第269-315页。

术语“双抗体”指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一条链上的2个结构域配对的连接体，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生2个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中更充分地描述。

由针对HCV NS3蛋白质的已知抗体可以开发针对变体HCV蛋白酶的抗体，例如通过分子进化。美国专利申请公开号20040214994描述了针对HCV NS3蛋白质的人重组抗体。通过将合适的核苷酸变化引入已知抗体的DNA内或通过肽合成制备氨基酸序列变体。此类变体包括例如，从已知抗体的氨基酸序列的残基的删除，或在已知抗体的氨基酸序列内的残基插入和/或残基的置换。制备删除、插入和置换的任何组合以取得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征。氨基酸变化也可以改变抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。

本发明的抗体可以具有诊断以及治疗应用。在某些实施方案中，本发明的抗体是标记的。本公开内容的各种抗体可以用于检测或测量变体HCV NS3蛋白酶的表达，且因此，它们也在下述应用例如细胞分选和成像(例如流式细胞计量术和荧光活化细胞分选)中有用，以用于诊断或研究目的。如本文所使用的，术语“标记”或“标记的”指抗体中另一种分子的掺入。在一个实施方案中，标记是可检测标记，例如放射性标记的氨基酸的掺入或与生物素基部分的多肽附着，所述生物素基部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如包含可以通过光学或比色法进行检测的荧光标记或酶促活性的链霉亲和素)进行检测。在另一个实施方案中，标记或标记物可以是治疗剂，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记的例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)，荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素基，由次级报道分子(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位)识别的预定多肽表位，磁性试剂例如钆螯合物，毒素例如百日咳毒素，紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙啶，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，多柔比星，道诺红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同系物。在某些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂进行附着以减少潜在的空间位阻。

在某些方面，也可以制备用于检测生物样品中的HCV病毒、变体HCV NS3多核苷酸、或变体HCV蛋白酶的存在的试剂盒。此类试剂盒可以包括识别本发明的变体HCV NS3蛋白酶的抗体，以及适合于检测抗体和变体蛋白酶或其部分之间的复合物存在的一种或多种辅助试剂。备选地，此类试剂盒可以包括本发明的探针或引物，此类探针或引物可以在严格条件下与本发明的变体HCV NS3多核苷酸杂交。本发明的探针或引物可以适合于可以用于检测目的受试者的PCR或RT-PCR。备选地，此类试剂盒可以商购可得的基于PCR或非基于PCR的HCV诊断试剂盒，例如，Roche Cobas Amplicor系统和Bayer Versant系统，包括RNA 3.0测定法(bDNA)和RNA Qualitative Assay(TMA)。AMPLICOR HCV

Test，v2.0是用于定量人血清或血浆中的HCV RNA的体外核酸扩增测试。

HCV RNA 3.0 Assay(bDNA)是已证明可靠检测2log10滴的病毒载量测定法。

HCV RNAQualitative Assay是基于技术发展水平的Transcription-MediatedAmplification(TMA)技术。

药物组合物和制剂

本发明的另一个方面提供了包括本发明的化合物的药物组合物或制剂，例如鉴定为能够援救VX-950活性的次级化合物，或鉴定为有效针对HCV变种(例如，能够减少病毒变种的复制)和/或变体HCV NS3蛋白酶(例如，能够减少变体蛋白酶的酶促活性)的化合物。

本发明的另一个方面提供了本发明的化合物在药物制备中的用途，例如用于治疗患者中的HCV感染的药物。

本发明的另一个方面提供了用于治疗患者中的HCV感染的方法。此类方法一般包括给患者单独或与另一种抗病毒剂组合(顺次或同时)施用药学或治疗有效量的本发明的化合物。化合物或试剂的“有效量”一般指与在不存在此类化合物或试剂的情况下这些参数的水平比较，有效地重现性减少HCV NS3蛋白酶表达或活性、HCV产生、复制或毒力、或HCV感染，或产生HCV感染的一种或多种症状改善或减轻的那些量。

在另一个方面，本发明的方法和组合物包括蛋白酶抑制剂(例如，VX-950)和另一种抗病毒剂，优选地抗HCV试剂。靶向HCV的组合疗法也在美国专利号6,924,270；6,849,254中得到描述。

另一种抗病毒试剂也可以是蛋白酶抑制剂，特别是HCV蛋白酶抑制剂。本领域已知的HCV蛋白酶抑制剂包括VX-950(图8)，BILN 2061(图8，也参见PCT公开号WO 00/59929；美国专利号6,608,027)，化合物1(13)，抑制剂A、B和C(PCT公开号WO 04/039970)。潜在的HCV蛋白酶抑制剂也已在下述参考文献中得到描述：PCT和美国专利申请公开号WO 97/43310，US 20020016294，WO 01/81325，WO02/08198，WO 01/77113，WO 02/08187，WO 02/08256，WO 02/08244，WO 03/006490，WO 01/74768，WO 99/50230，WO 98/17679，WO 02/48157，US 20020177725，WO 02/060926，US 20030008828，WO 02/48116，WO 01/64678，WO 01/07407，WO 98/46630，WO 00/59929，WO 99/07733，WO 00/09588，US 20020016442，WO 00/09543，WO 99/07734，US20020032175，US 20050080017，WO 98/22496，WO 02/079234，WO00/31129，WO 99/38888，WO 99/64442，WO 2004072243和WO 02/18369，以及美国专利号6,018,020；6,265,380；6,608,027；5,866,684；M.Llinas-Brunet等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8，第1713-18页(1998)；W.Han等人，Bioorg.Med.Chem.Lett，10，711-13(2000)；R.Dunsdon等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，第1571-79页(2000)；M.Llinas-Brunet等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，第2267-70页(2000)；和S.LaPlante等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，第2271-74页(2000)。许多NS3蛋白酶抑制剂已也由Schering Corp.、Schering A.G.和其他公司开发，并且它们在下述专利中得到描述：美国专利申请公开号20050249702；20050153900；20050245458；20050222047；20050209164；20050197301；20050176648；20050164921；20050119168；20050085425；20050059606；20030207861；20020147139；20050143439；20050059606；20050107304；20050090450；20040147483；20040142876；20040077600；20040018986；20030236242；20030216325；20030207861；美国专利号6,962,932；6,914,122；6,911,428；6,846,802；6,838,475。

抗病毒剂也可以包括但不限于，免疫调节剂，例如α-、β-和γ-干扰素，聚乙二醇化衍生的干扰素-α化合物，和胸腺素；其他抗病毒剂，例如病毒唑，金刚烷胺和telbivudine；丙型肝炎蛋白酶的其他抑制剂(例如NS2-NS3抑制剂和NS3-NS4A抑制剂)；HCV生命周期中的其他靶的抑制剂，包括解旋酶和聚合酶抑制剂；内部核糖体进入抑制剂；广谱病毒抑制剂，例如IMPDH抑制剂(例如，美国专利号5,807,876、6,498,178、6,344,465、6,054,472、WO 97/40028、WO98/40381、WO 00/56331的化合物，以及霉酚酸及其衍生物，并且包括但不限于，VX-497、VX-148、和/或VX-944)；或上述的任何一种的组合。还参见W.Markland等人，Antimicrobial & AntiviralChemotherapy，44，第859页(2000)和美国专利号6,541,496。

下述定义在本文中使用：

“Peg-Intron”意指PEG-

可从Schering Corporation，Kenilworth，N.J.获得的peginteferonα-2b；“Intron”意指Intron-

可从Schering Corporation，Kenilworth，N.J.获得的干扰素α-2b；“病毒唑”意指可从ICN Pharmaceuticals，Inc.，CostaMesa，Calif.获得的病毒唑(1-β-D呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)；在Merck Index，条目8365，第12版中得到描述；也可作为

从Schering Corporation，Kenilworth，N.J.获得，或作为

从Hoffmann-La Roche，Nutely，N.J.获得；“Pagasys”意指

可从Hoffmann-La Roche，Nutely，N.J.获得的peg-干扰素α-2a；“Roferon”意指可从Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ.获得的重组干扰素α-2a；“Berofor”意指

可从Boehringer Ingelheim Pharmceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.获得的干扰素α-2；

可从例如Sumitomo，日本获得的天然α干扰素的纯化掺合物，例如Sumiferon；

可从GlaxoWellcome Ltd.，英国获得的干扰素αn1；由InterferonSciences制备，并可从Purdue Frederick Co.，CT获得的天然α干扰素的混合物。

如本文所使用的，术语“干扰素”意指高度同源的物种特异性蛋白质的家族成员，其抑制病毒复制和细胞增殖，并调节免疫应答，例如干扰素α、干扰素β、或干扰素γ。Merck Index，条目5015，第12版。根据本发明一个实施方案，干扰素是α-干扰素。根据另一个实施方案，本发明的治疗组合利用天然α干扰素2a。备选地，本发明的治疗组合利用天然α干扰素2b。在另一个实施方案中，本发明的治疗组合利用重组α干扰素2a或2b。在另外一个实施方案中，干扰素是聚乙二醇化的α干扰素2a或2b。适合于本发明的干扰素包括：(a)Intron(干扰素-α2B，Schering Plough)，和(b)Peg-Intron，(c)Pegasys，(d)Roferon，(e)Berofor，(f)Sumiferon，(g)Wellferon，(h)可从Amgen，Inc.，Newbury Park，Calif.获得的复合α干扰素，(i)Alferon；(j)

(k)

蛋白酶抑制剂可以口部施用，而干扰素一般不口部施用。然而，本文没有任何事物将本发明的方法或组合限制于任何具体剂型或方案。因此，根据本发明的组合的每种组分可以分开、一起、顺次或同时或以其任何组合施用。

在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂和干扰素在分开的剂型中施用。在一个实施方案中，任何另外的试剂与蛋白酶抑制剂一起作为单一剂型的部分施用或作为分开的剂型施用。因为本发明涉及化合物和/或试剂的组合，所以每种化合物或试剂的具体量可以依赖组合中的每种其他化合物的具体量。干扰素的剂量一般以IU(例如，约4百万IU/约12百万IU)测量。

因此，可以与本发明的化合物组合使用的试剂(无论充当免疫调节剂或其他方面)包括但不限于，干扰素-α2B(Intron A，ScheringPlough)；Rebatron(Schering Plough，干扰素-α2B+病毒唑)；聚乙二醇化干扰素α(Reddy，K.R.等人″Efficacy and Safety ofPegylated(40-kd)interferon alpha-2a compared with interferonalpha-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C，″Hepatology，33，第433-438页(2001))；复合干扰素(Kao，J.H.等人，″Efficacy of Consensus Interferon in the Treatment ofChronic Hepatitis，″J.Gastroenterol.Hepatol.15，第1418-1423页(2000))，干扰素-α2A(Roferon A；Roche)，成淋巴细胞样或“天然”干扰素；干扰素τ(Clayette，P.等人，″IFN-tau，A NewInterferon Type I with Antiretroviral activity，″Pathol.Biol.(Paris)47，第553-559页(1999))；白介素2(Davis，G.L.等人，″Future Options for the Management of Hepatitis C，″Seminarsin Liver Disease，19，第103-112页(1999))；白介素6(Davis，G.L.等人，同上)；白介素12(Davis，G.L.等人，同上)；病毒唑；和增强1型辅助T细胞应答发展的化合物(Davis，G.L.等人，同上)。干扰素可以通过发挥直接的抗病毒效应和/或修饰对感染的免疫应答来改善病毒感染。干扰素的抗病毒效应通常通过抑制病毒穿入或脱壳、病毒RNA合成、病毒蛋白质翻译和/或病毒装配和释放来介导。

刺激细胞中的干扰素合成的化合物(Tazulakhova，E.B.等人，″Russian Experience in Screening，analysis，and ClinicalApplication of Novel Interferon Inducers，″J.InterferonCytokine Res.，21第65-73页)包括但不限于，双链RNA、单独或与托普霉素组合、和咪喹莫特(3M Pharmaceuticals；Sauder，D.N.，″Immunomodulatory and Pharmacologic Properties of Imiquimod，″J.Am.Acad.Dermatol.，43第S6-11页(2000))。

其他非免疫调节或免疫调节化合物可以与本发明的化合物组合使用，包括但不限于，WO 02/18369中详细说明的那些，所述专利通过引用合并入本文(参见例如，第273页第9-22行，和第274页第4行至第276页第11行，所述专利整体通过引用合并入本文)。

刺激细胞中的干扰素合成的化合物(Tazulakhova等人，J.Interferon Cytokine Res.21，65-73))包括但不限于，双链RNA、单独或与托普霉素组合、和咪喹莫特(3M Pharmaceuticals)(Sauder，J.Am.Arad.Dermatol.43，S6-11(2000))。

已知具有或可能具有HCV抗病毒活性的其他化合物包括但不限于，病毒唑(ICN Pharmaceuticals)；肌苷5′-单磷酸脱氢酶抑制剂(本文提供的VX-497制剂)；金刚烷胺和金刚烷乙胺(Younossi等人，In Seminars in Liver Disease 19，95-102(1999))；LY217896(美国专利号4,835,168)(Colacino等人，Antimicrobial Agents& Chemotherapy 34，2156-2163(1990))；和9-肟基-6-甲氧基-1，4a-二甲基1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氢-菲-1羧酸甲酯；6-甲氧基-1，4a 二甲基-9-(4-甲基-哌嗪-1-基亚氨基)-1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氢-菲-1羧酸甲酯-盐酸盐；1-(2-氯-苯)-3-(2，2-联苯-乙基)-尿素(美国专利号6,127,422)。

关于前述分子的制剂、剂量和施用途径在下文引用的参考文献中教导，或是本领域众所周知的，如例如F.G.Hayden，in Goodman &Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，NinthEdition，Hardman等人，编辑，McGraw-Hill，New York(1996)，第50章，第1191-1223页中公开的，以及其中引用的参考文献。备选地，一旦显示出HCV抗病毒活性，特别是针对HCV抗药性毒株的抗病毒活性的化合物已得到鉴定，那种化合物的药学有效量就可以使用技术人员众所周知的技术进行测定。注意例如Benet等人，in Goodman &Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，NinthEdition，Hardman等人，编辑，McGraw-Hill，New York(1996)，第1章，第3-27页，和其中引用的参考文献。因此，此类化合物的合适制剂、剂量范围和给药方案可以通过常规方法容易地测定。

涉及本发明的组合疗法的组合物可以提供给一种或多种细胞、或人患者，在同时或顺次施用的分开的药学上可接受的制剂中，包含超过一种治疗剂的制剂中，或通过各式各样的单一试剂和多重试剂制剂。与施用途径无关，这些药物组合形成抗HCV有效量的药学上可接受的制剂的组分。

可以在本发明的方法中使用的大量其他免疫调节剂和免疫刺激剂是目前可获得的并包括：AA-2G；金刚烷酰胺二肽；腺苷脱氨酶，Enzon佐剂，Alliance；佐剂，Ribi；佐剂，Vaxcel；Adjuvax；agelasphin-11；AIDS疗法，Chiron；海藻葡聚糖，SRI；alganunulin，Anutech；Anginlyc；抗细胞因子，Yeda；Anticort；抗胃泌素-17免疫原，Ap；抗原递送系统，Vac；抗原制剂，IDBC；抗GnRH免疫原，Aphton；Antiherpin；Arbidol；氮双吡咯；Bay-q-8939；Bay-r-1005；BCH-1393；Betafectin；Biostim；BL-001；BL-009；Broncostat；Cantastim；CDRI-84-246；头孢地嗪；趋化因子抑制剂，ICOS；CMV肽，City of Hope；CN-5888；细胞因子释放试剂，St；DHEAS，Paradigm；DISC TA-HSV；J07B；I01A；I01Z；二硫卡钠；ECA-10-142；ELS-1；内毒素，Novartis；FCE-20696；FCE-24089；FCE-24578；FLT-3配体，Immunex；FR-900483；FR-900494；FR-901235；FTS-Zn；G-蛋白质，Cadus；gludapcin；碘乙谷酰胺；glycophosphopeptical；GM-2；GM-53；GMDP；生长因子疫苗，EntreM；H-BIG，NABI；H-CIG，NABI；HAB-439；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)疫苗；疱疹特异性免疫因子；HIV疗法，UnitedBiomed；HyperGAM+CF；ImmuMax；Immun BCG；免疫疗法，Connective；免疫调节剂，Evans；免疫调节剂，Novacell；伊姆雷-1；伊姆雷-2；Indomune；肌酐普拉诺贝；干扰素，Dong-A(α2)；干扰素，Genentech(γ)；干扰素，Novartis(α)；白介素-12，Genetics Ins；白介素-15，Immunex；白介素-16，Research Cor；ISCAR-1；J005X；L-644257；licomarasminic acid；LipoTher；LK-409，LK-410；LP-2307；LT(R1926)；LW-50020；MAF，Shionogi；MDP衍生物，Merck；甲硫啡肽，TNI；甲基呋喃基丁内酯；MIMP；米立司亭；混合细菌疫苗，Tem，MM-1；moniliastat；MPLA，Ribi；MS-705；莫拉丁酯；marabutide，Vacsyn；胞壁酰二肽衍生物；胞壁酰肽衍生物myelopid；-563；NACOS-6；NH-765；NISV，Proteus；NPT-16416；NT-002；PA-485；PEFA-814；肽，Scios；肽聚糖，Pliva；Perthon，Advanced Plant；PGM衍生物，Pliva；药物开发号1099；No.1426；No.1549；No.1585；No.1607；No.1710；No.1779；No.2002；No.2060；No.2795；No.3088；No.3111；No.3345；No.3467；No.3668；No.3998；No.3999；No.4089；No.4188；No.4451；No.4500；No.4689；No.4833；No.494；No.5217；No.530；匹多莫德；匹美劳肽；吡萘非特；PMD-589；鬼臼毒素，Conpharm；POL-509；多-ICLC；多-ICLC，Yamasa Shoyu；PolyA-PolyU；多糖A；蛋白质A，Berlux Bioscience；PS34W0；假单胞菌(Pseudomonas)MAbs，Teijin；Psomaglobin；PTL-78419；Pyrexol；pyriferone；Retrogen；Retropep；RG-003；Rhinostat；rifamaxil；RM-06；Rollin；罗莫肽；RU-40555；RU-41821；风疹抗体，ResCo；S-27649；SB-73；SDZ-280-636；SDZ-MRL953；SK&F-107647；SL04；SL05；SM-4333；Solutein；SRI-62-834；SRL-172；ST-570；ST-789；葡萄球菌噬菌体溶解物；Stimulon；抑制素；T-150R1；T-LCEF；他比劳肽；替莫肽；Theradigm-HBV；Theradigm-HBV；Theradigm-HSV；THF，Pharm & Upjohn；THF，Yeda；胸腺法新；胸腺激素组分；胸腺卡汀；thymolymphotropin；胸腺喷丁；胸腺喷丁类似物；胸腺喷丁，Peptech；胸腺素组分5，α；胸腺刺激素；胸腺曲南；TMD-232；TO-115；转移因子，Viragen；促吞噬肽，Selavo；乌苯美司；Ulsastat；ANGG-；CD-4+；Collag+；COLSF+；COM+；DA-A+；GAST-；GF-TH+；GP-120-；IF+；IF-A+；IF-A-2+；IF-B+；IF-G+；IF-G-1B+；IL-2+；IL-12+；IL-15+；IM+；LHRH-；LIPCOR+LLYM-B+；LYM-NK+；LYM-T+；OPI+；PEP+；PHG-MA+；RNA-SYN-；SY-CW-；TH-A-I+；TH-5+；TNF+；UN。

在本发明中有用的代表性核苷和核苷酸化合物包括但不限于：(+)-顺-5-氟-1-[2-(羟甲基)-[1，3-氧硫烷-5基]胞嘧啶；(-)-2′-脱氧-3′-巯基胞苷-5′-三磷酸盐(3TC)；(-)-顺-5-氟-1-[2(羟甲基)-[1，3-氧硫烷-5-基]胞嘧啶(FTC)；(-)2′，3′，二脱氧-3′-硫代胞苷[(-)-SddC]；1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶(FIAC)；1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶三磷酸盐(FIACTP)；1-(2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-间-乙基尿嘧啶(FMAU)；1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺；2′，3′-二脱氧-3′-氟-5-甲基-脱氧胞苷(FddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氯-5-甲基-脱氧胞苷(ClddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氨基-5-甲基-脱氧胞苷(AddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氟-5-甲基胞苷(FddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氯-5-甲基胞苷(ClddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氨基-5-甲基胞苷(AddMeCyt)；2′，3′-二脱氧-3′-氟胸苷(FddThd)；2′，3′-二脱氧-β-L-5-氟-胞苷(β-L-FddC)；2′，3′-二脱氧-β-L-5-硫代胞苷；2′，3′-二脱氧-β-L-5-胞苷(β-L-ddC)；9-(1，3-二羟基-2-丙氧基间乙基)鸟嘌呤；2′-脱氧-3′-硫代-5-氟胞嘧啶；3′-氨基-5-甲基-脱氧胞苷(AddMeCyt)；2-氨基-1，9-[(2-羟甲基-1-(羟甲基)乙氧基]甲基]-6H-嘌呤-6-酮(丙氧鸟苷)；2-[2-(2-氨基-9H-嘌呤-9基)乙基)-1，3-丙二醇二乙酯(泛昔洛韦)；2-氨基-1，9-二氢-9-[(2-羟基-乙氧基)甲基]6H-嘌呤-6-酮(阿昔洛韦)；9-(4-羟基-3-羟甲基-丁基)鸟嘌呤(喷昔洛韦)；9-(4-羟基-3-羟甲基-丁基)-6--脱氧-鸟嘌呤二乙酯(泛昔洛韦)；3′-叠氮-3′-脱氧胸苷(AZT)；3′-氯-5-甲基-脱氧胞苷(ClddMeCyt)；9-(2-膦酰甲氧乙基-)-2′，6′-二氨基嘌呤-2′，3′-二脱氧核苷；9-(2-膦酰甲氧乙基)-腺嘌呤(PMEA)；阿昔洛韦三磷酸盐(ACVTP)；D-碳环-2′-脱氧鸟苷(CdG)；二脱氧-胞苷；二脱氧-胞嘧啶(ddC)；二脱氧-鸟嘌呤(ddG)；二脱氧-肌苷(ddI)；E-5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷三磷酸；氟-阿拉伯呋喃糖基-碘尿嘧啶；1-(2′-脱氧-2′-氟-1--β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)；司他夫定；9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-9H-嘌呤-6-胺一水合物(Ara-A)；9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-9H-嘌呤-6-胺-5′-单磷酸一水合物(Ara-AMP)；2-脱氧-3′-硫代-5-氟胞苷；2′，3′-二脱氧-鸟嘌呤；和2′，3′-二脱氧-鸟苷。

用于制备在本发明中有用的核苷和核苷酸的合成方法是本领域众所周知的，如下述参考文献中公开的：Acta Biochim Pol，43，25-36(1996)；Swed.Nucleosides Nucleotides 15，361-378(1996)；Synthesis 12，1465-1479(1995)；Carbohyd.Chem.27，242-276(1995)；Chena Nucleosides Nucleotides 3，421-535(1994)；Ann.Reports in Med.Chena，Academic Press；和Exp.Opin.Invest.Drugs 4，95-115(1995)。

上文引用的参考文献中描述的化学反应一般依据其最广泛的应用公开以制备本发明的化合物。偶尔地，反应可以不与所述的一样应用于本文公开的化合物的范围内包括的每种化合物。发生此类情况的化合物将由本领域技术人员容易地识别。在所有此类情况下，反应可以通过本领域技术人员已知的常规修饰成功地进行，例如通过干扰基团的合适保护，通过改变成备选的常规试剂，通过反应条件的常规修改等，或者本文公开的或其他方面常规的其他反应将可应用于本发明的相应化合物的制备。在所有制备方法，所有原材料是已知的或可容易地由已知原材料制备。

尽管核苷类似物一般用作抗病毒剂，但核苷酸(核苷磷酸盐)有时必须转变成核苷以便促进其跨越细胞膜的运输。能够进入细胞的化学修饰的核苷酸的例子是S-1-3-羟基-2-膦酰甲氧丙基胞嘧啶(HPMPC，Gilead Sciences)。本发明中使用的酸类的核苷和核苷酸化合物可以形成盐。例子包括与碱金属或碱土金属例如钠、钾、钙或镁的盐，或与有机碱的盐或碱性季胺盐。

技术人员还可以选择施用细胞色素P450单加氧酶抑制剂。此类抑制剂可以在增加肝浓度和/或增加受细胞色素P450抑制的化合物的血液水平方面有用。对于涉及CYP抑制剂的本发明的实施方案，改善相关NS3/4A蛋白酶的药代动力学的任何CYP抑制剂可以包括在本发明的组合物中和/或可以在本发明的方法中使用。这些CYP抑制剂包括但不限于，利托那韦(WO 94/14436)、酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、环孢素、氯美噻唑、西咪替丁、伊曲康唑、氟康唑、咪康唑、氟伏沙明、氟西汀、奈法唑酮、舍曲林、茚地那韦、奈非那韦、氨普那韦、呋山那韦、沙奎那韦、洛匹那韦、地拉韦定、红霉素VX-944和VX-497。优选的CYP抑制剂包括利托那韦、酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、环孢素和氯美噻唑。关于利托那韦的优选剂型，参见美国专利号6,037,157，和其中引用的文件：美国专利号5,484,801，美国申请序列号08/402,690，以及国际申请WO 95/07696和WO 95/09614)。

用于测量化合物抑制细胞色素P50单加氧酶活性的能力的方法是已知的(参见美国专利号6,037,157和Yun等人，Drug Metabolism &Disposition，第21卷，第403-407页(1993))。

在本发明的组合治疗方法中有用的免疫调节剂、免疫刺激剂和其他试剂可以以低于本领域常规的那些的量施用。例如，干扰素α一般以约1x10⁶单位/人每周3次-约10x10⁶单位/人每周3次的量施用于人用于治疗HCV感染(Simon等人，Hepatology 25：445-448(1997))。在本发明的方法和组合物中，这个剂量可以为约0.1x10⁶单位/人每周3次-约7.5x10⁶单位/人每周3次；更优选地约0.5x10⁶单位/人每周3次-约5x10⁶单位/人每周3次；最优选地约1x10⁶单位/人每周3次-约3x10⁶单位/人每周3次。由于在本发明的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在下，免疫调节剂、免疫刺激剂或其他抗HCV试剂增强的丙型肝炎病毒抗病毒有效性，可以在本文预期的治疗方法和组合物中使用减少量的这些免疫调节剂/免疫刺激剂。类似地，由于在免疫调节剂和免疫刺激剂的存在下，HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂增强的丙型肝炎病毒抗病毒有效性，可以在本文预期的方法和组合物中使用减少量的这些HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂。此类减少的量可以通过常规监控经历治疗的受感染患者中的丙型肝炎病毒滴度来测定。这可以通过下述来进行，例如通过槽印迹、斑点印迹或RT-PCR技术监控患者的血清中的HCVRNA，或通过测量HCV表面或其他抗原。患者可以在组合治疗期间类似地进行监控，所述组合治疗使用本文公开的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和具有抗HCV活性的其他化合物，例如核苷和/或核苷酸抗病毒剂，以测定组合使用时各自的最低有效剂量。

在本文公开的组合治疗的方法中，核苷或核苷酸抗病毒化合物、或其混合物可以以约0.1mg/人/天-约500mg/人/天的量施用于人；优选地约10mg/人/天-约300mg/人/天；更优选地约25mg/人/天-约200mg/人/天；更加优选地约50mg/人/天-约150mg/人/天；和最优选地约1mg/人/天-约50mg/人/天。

化合物的剂量可以以单次剂量或成比例的剂量施用于患者。在后面一种情况下，剂量单位组合物可以包含其约数的此类量以补足日剂量。多重剂量/天也可以增加日总剂量，如果这是开药物处方的人希望的。

用于由本发明的化合物和/或组合物治疗患有HCV感染的患者的方案依照各种因素进行选择，包括患者的年龄、重量、性别、饮食和医疗条件，感染的严重度，施用途径，药理学考虑如使用的具体化合物的活性、功效、药代动力学和毒物学特征，以及是否使用药物递送系统。本文公开的药物组合的施用一般应持续数周至数月或年的时间段，直至病毒滴度达到可接受的水平，显示感染已受到控制或被消除。经历用本文公开的药物组合的治疗的患者可以下述进行常规监控，通过槽印迹、斑点印迹或RT-PCR技术测量患者的血清中的肝炎病毒RNA，或通过测量血清中的丙型肝炎病毒抗原如表面抗原，以测定治疗的有效性。通过这些方法获得的数据的连续分析允许在治疗期间修改治疗方案，使得施用组合中的每种组分的最佳量，和使得同样可以测定治疗的持续时间。因此，治疗方案/给药时间表可以在治疗过程中进行理性修改，使得施用共同显示出满意的抗丙型肝炎病毒有效性的组合中使用的抗病毒化合物各自的最低量，和使得组合中的此类抗病毒化合物的施用继续，只要是成功治疗感染所需的。

本发明包含本文公开的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂与具有抗HCV活性的前述和相似类型化合物的各种组合的使用，以治疗或预防患者中的HCV感染，特别是具有已发展出针对经由VX-950和其他标准蛋白酶抑制剂治疗的抗性的HCV感染的那些患者。例如，一种或多种HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂可以与下述组合使用：具有抗HCV活性的一种或多种干扰素或干扰素衍生物；具有抗HCV活性的一种或多种非干扰素化合物；或具有抗HCV活性的一种或多种干扰素或干扰素衍生物和具有抗HCV活性的一种或多种非干扰素化合物。当在组合中用于治疗或预防人患者中的HCV感染时，目前公开的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和具有抗HCV活性的前述化合物中的任何一种可以以药学或抗HCV有效量存在。由于其累加或协同效应，当在上文描述的组合中使用时，各自还可以以亚临床药学有效或抗HCV有效量存在，即，与此类HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和具有抗HCV活性的化合物以药学有效量使用时比较，单独使用时在完全抑制或减少HCV病毒粒子的积聚和/或减少或改善与患者中的HCV感染或发病机理相关的病状或症状方面提供减少的药学有效性的量。此外，本发明包含HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂和如上所述具有抗HCV活性的化合物的组合治疗或预防HCV感染的用途，由于其累加或协同效应，其中一种或多种这些抑制剂或化合物以药学有效量存在，和另一种或多种以亚临床药学有效或抗HCV有效量使用。如本文所使用的，术语“累加效应”描述2种(或多种)药学活性剂的组合效应，其等于单独给予的每种试剂的效应总和。“协同效应”是其中2种(或多种)药学活性剂的组合效应大于单独给予的每种试剂的效应总和。

患者的病状改善后，必要时可以施用本发明的化合物、组合物或组合的维持剂量。随后，根据症状可以减少施用剂量或频率或两者至在其上保持改善的病状的水平，当症状已减轻至所需水平，治疗应停止。然而，在疾病症状的任何复发后在长期基础上患者可能需要间歇疗法。

用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将依赖各种因素，包括使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、以及治疗医师的判断和待治疗的具体疾病的严重度。活性成分的量还将依赖具体描述的化合物以及组合物中的另外抗病毒剂的存在或不存在和性质。

因此，对于治疗处理有用的本申请的试剂可以单独、在具有合适的药学载体的组合物中、或与其他治疗剂组合施用。待施用的试剂的有效量可以基于具体情况来确定。考虑因素通常包括年龄、体重、病状阶段、其他疾病状况、治疗持续时间和对初始治疗的应答。一般地，试剂制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液。然而，也可以制备适合于在注射前溶解于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。试剂还可以根据本领域已知的方法配制成肠溶片或凝胶胶囊。本申请的试剂可以以医学上可接受的任何方式施用，所述方式可以依赖试剂特性和/或待治疗的疾病状况或损害。可能的施用途径包括注射，通过肠胃外途径例如血管内、静脉内、硬膜内(intraepidural)或其他，以及口部、鼻、眼、直肠、局部或肺，例如通过吸入、烟雾化或喷雾法。试剂可以直接应用于组织表面例如在手术期间。持续释放施用也特别包括在本申请中，通过此类方式如积存注射，经皮贴剂或易蚀埋植剂。

根据另一个实施方案，本发明提供了通过给所述患者施用本发明的药学上可接受的组合物用于治疗被病毒感染的患者，或预防由病毒的感染的方法，所述病毒的特征在于病毒编码的丝氨酸蛋白酶是该病毒的生命周期所需的。优选地，本发明的方法用于治疗患有HCV感染的患者。此类治疗可以完全消除病毒感染或减少其严重性。更优选地，患者是人类。

术语“治疗”包括预防性(例如，防止)和/或治疗性处理。术语“预防性或治疗性”处理是领域公认的并包括给宿主施用一种或多种主题组合物。如果它在不希望的病状(例如，宿主动物的疾病或其他不希望的状态)的临床表现前施用，那么治疗是预防性的，(即，它使宿主免于发展不希望的病状)，而如果它在不希望的病状表现后施用，那么治疗是治疗性的，(即，它预期减少、改善或稳定现有的不希望的病状或其副作用)。

在一个备选的实施方案中，本发明的方法另外包括给所述患者施用抗病毒剂优选抗HCV试剂的步骤。此类抗病毒剂包括但不限于，免疫调节剂，例如α-、β-和γ-干扰素，聚乙二醇化衍生的干扰素-α化合物，和胸腺素；其他抗病毒剂，例如病毒唑和金刚烷胺；丙型肝炎蛋白酶的其他抑制剂(NS2-NS3抑制剂和NS3-NS4A抑制剂)；HCV生命周期中的其他靶的抑制剂，包括解旋酶和聚合酶抑制剂；内部核糖体进入抑制剂；广谱病毒抑制剂，例如IMPDH抑制剂(例如，美国专利号5,807,876中公开的VX-497和其他IMPDH抑制剂，霉酚酸及其衍生物)；或上述的任何一种的组合。

此类另外的试剂可以作为单一剂型的部分施用于所述患者，所述单一剂型包含本发明的化合物和另外的抗病毒剂。备选地另外的试剂可以作为多重剂型的部分与本发明的化合物分开施用，其中所述另外的试剂在包含本发明的化合物的组合物施用之前、一起或之后施用。

在另外一个实施方案中，本发明提供了预处理预期用于给患者施用的生物物质的方法，所述方法包括使所述生物物质与包含本发明的化合物的药学上可接受的组合物接触。此类生物物质包括但不限于，血液及其组分如血浆、血小板、血细胞亚群等；器官如肾、肝、心脏、肺等；精子和卵子；骨髓及其组分，以及被输注到患者内的其他流体如盐水、葡聚糖等。

根据另一个实施方案，本发明提供了处理可能潜在与病毒接触的材料的方法，所述病毒的特征在于病毒编码的丝氨酸蛋白酶是其生命周期所需的。这种方法包括使所述材料与根据本发明的化合物接触的步骤。此类材料包括但不限于，外科器械和衣服；实验室器械和衣服；采血装置和材料；和侵入装置如分流器、支架等。

在另一个实施方案中，本发明的化合物可以用作实验室工具以帮助分离病毒编码的丝氨酸蛋白酶。这种方法包括下述步骤：提供与固体载体附着的本发明的化合物；在引起所述蛋白酶与所述固体载体结合的条件下，使所述固体载体与包含病毒丝氨酸蛋白酶的样品接触；和从所述固体载体中洗脱所述丝氨酸蛋白酶。优选地，通过这种方法分离的病毒丝氨酸蛋白酶是HCV NS3蛋白酶。更优选地，它是如本文所描述的对经由VX-905和/或BILN 2061的治疗有抵抗力的突变型HCVNS3蛋白酶。示例性的此类蛋白质包括本文描述的那些，如在SEQ IDNO：2的蛋白质的位置36、41、43、54、148、155和/或156上具有突变型(即，非野生型)残基。

实施例

尽管公开内容目前已得到一般描述，但它通过参考下述实施例将更容易理解，所述实施例仅为了举例说明本公开内容的某些方面和实施方案的目的而包括，并且不希望限制公开内容。

实施例1患者群体和研究设计

参与关于VX-950的1b期随机化、不知情、剂量逐步增加的临床试验(研究VX04-950-101)且被基因型1HCV感染的34个患者是本研究的受试者。所有患者为18-65岁，具有至少10⁵IU/mL的基线HCVRNA水平，并且是乙型肝炎病毒(HBV)和HIV阴性的。将患者分成连续14天接受450(q8h)、750(q8h)或1250(q12h)mg VX-950的3个组，在每个给药组中具有2个安慰剂患者。在3个时间点上从研究患者中收集4毫升(mL)血液样品：给药前一天(基线样品)，给药第14天或治疗结束时(ETR样品)，和研究药物的最后一次剂量后7-10天(随访样品)。血液通过前臂静脉的静脉穿刺收集到包含EDTA(K₂)抗凝剂的管内。血浆通过10分钟离心进行分离，冷冻并贮藏于-80℃少于6个月。从这种血浆中分离病毒粒子用于序列分析。

实施例2来自患者血浆的HCV NS3蛋白酶的扩增和测序

HCV的序列分析通过半巢式逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增HCV RNA片段来完成，所述HCV RNA片段包含来自血浆病毒的全部534碱基对(bp)NS3丝氨酸蛋白酶区域。病毒粒子在变性条件下进行裂解，并且HCV RNA使用标准的商业硅胶膜结合法(QIAamp ViralRNA Minikit；Qiagen，Valencia，CA)进行分离。包含NS3丝氨酸蛋白酶区域的互补DNA(cDNA)片段由病毒RNA进行合成，并使用商业1步逆转录酶PCR(Superscript III RNase H-ReverseTranscriptase with High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase；Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)进行扩增。NS3的912bp编码区使用NS3区域侧翼的引物(NS3-1b-1s：GGCGTGTGGGGACATCATC；和NS3-1b-3a：GGTGGAGTACGTGATGGGGC)进行扩增。对于每种样品以在1x所有权的(proprietary)反应缓冲液中0.5μM引物(InvitrogenCustom Primers)、0.2mM dNTPs(Invitrogen Corp)、1.2mM MgSO₄和34.8单位RNA guard(Porcine RNase Inhibitor，AmershamBiosciences)的终浓度进行2轮巢式PCR。对于逆转录酶转录反应，将反应混合物于47℃最初温育30分钟，随后为于94℃3分钟的变性步骤，以及随后94℃30秒、51℃30秒和68℃45秒的30个循环。将第一种PCR产物以1∶10稀释并在另一个半巢式反应中使用，所述另一个半巢式反应使用1.25单位AccuPrime Pfx DNA聚合酶、0.5M引物(NS3-1b-1s和NS3-1b-4a；CATATACGCTCCAAAGCCCA)、0.3mMdNTPs、1mM MgSO₄和1x反应缓冲液。来自外部PCR的DNA产物于94℃变性3分钟，并且使用94℃30秒、53℃30秒和68℃30秒的30个循环进行扩增。来自这个PCR的DNA随后在1％琼脂糖凝胶上进行分离，并且合适大小的产物(830bp)使用QIAquick Gel ExtractionKit(Qiagen)进行纯化。分离的DNA随后使用Zero Blunt TOPO PCRCloning Kit(Invitrogen Corp)进行克隆。将克隆平板送至扩增并测序96个克隆/患者/时间点的SeqWright(Houston，TX)。

实施例3序列比对和系统进化分析

使用软件Mutational Surveyor(SoftGenetics，State College，PA)就突变比对并分析序列。分析NS3蛋白酶的N末端543个核苷酸(181个氨基酸)。关于每个患者的共有序列从平均84个基线序列发展，并且在第14天和随访(研究药物的最后一次剂量后7-10天)时对于每个患者获得平均81个序列。系统进化树使用PHYLIP(Felsenstein，J.1993.PHYLIP(Phylogeny Inference Package)版本3.5c。由作者分布。Department of Genetics，University ofWashington，Seattle，WA)Dnadist和Quick Tree(http://www.hcv.lanl.gov/content/hcv-db，2005年6月存取)来制备。

实施例4重组NS3蛋白酶蛋白质的表达和纯化

使用对每个HCV变种特异的寡核苷酸由患者分离物的所选质粒克隆扩增编码HCV NS3蛋白酶的Met¹-Ser¹⁸¹的DNA片段。将DNA片段克隆到大肠埃希杆菌(Escherichia coli)表达质粒pBEV11内，产生181-残基HCV NS3蛋白酶结构域，随后为C末端六组氨酸标记。重组6X-His-标记的NS3蛋白酶随后使用如先前公开的(4)遗漏(leaky)表达法在大肠杆菌中进行表达。用NS3蛋白酶表达质粒新转化的大肠杆菌BL21(DE3)的5-7个分离的菌落用于接种含有100μg/mL羧苄西林的5mL LB培养基。这些种子培养物于37℃伴随震荡(250rpm)进行温育直至达到OD₆₂₀0.3-1，随后以～0.010的起始OD₆₂₀用于接种在250mL埃伦迈尔(Erlenmeyer)烧瓶中包含100μg/mL羧苄西林的50mL 4xTY肉汤(32g/L胰蛋白胨，20g/L酵母提取物，5g/L NaCl)。表达培养物于环境温度(～25℃)伴随在250rpm下的震荡温育24小时。细胞通过在3000xg下离心30分钟进行收集，将团块快速冷冻于-80℃乙醇浴中并贮藏于-80℃直至蛋白酶被纯化。

重组蛋白酶使用公开方法(7)的修改从大肠杆菌中进行纯化。将冷冻的细胞团块解冻并重悬浮于6.8mL冷缓冲液A(50mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-乙磺酸[HEPES，pH 8.0]；1M NaCl；10％[体积/体积]甘油；5mM咪唑；5mMβ-巯基乙醇；0.1％辛基β-D-吡喃葡萄糖苷[Sigma，Saint Louis，MO]；2μg/mL亮抑酶肽[Sigma，Saint Louis，MO]；1μg/mL E-64[Sigma，Saint Louis，MO]；2μg/mL胃酶抑素A[Sigma，Saint Louis，MO])中。细胞通过添加0.8mL 10XBugBuster试剂(Novogen/EMD Biosciences，Madison，WI)和8μL 1000X Benzonuclease(Novogen/EMD Biosciences，Madison，WI)进行裂解，随后于4℃轻微摇动30分钟。细胞裂解物在16,00oxg下离心以去除不溶性材料。将每种上清液施加于在一次性聚丙烯柱(Biorad，Hercules，CA)中平衡至缓冲液A的0.25mL柱床体积的TALON金属亲和力树脂(BD Biosciences，Palo Alto，CA)。裂解物/树脂浆于4℃摇动30分钟。将裂解物从柱中排出并且用3-5mL体积的缓冲液A洗涤树脂。2个等分试样(各0.25mL)的缓冲液B(50mM HEPES[pH 8.0]；1M NaCl；25％[体积/体积]甘油；300mM咪唑；5mM β-巯基乙醇；0.1％辛基β-D-吡喃葡萄糖苷；2μg/mL亮抑酶肽；1μg/mL E-64；2μg/mL胃酶抑素A])用于洗脱与柱结合的蛋白质，合并2个部分，分成小等分试样并贮藏于-80℃。洗脱蛋白质的浓度使用考马斯蛋白质测定法(Biorad，Hercules，CA)根据制造商的说明书进行测定，使用牛血清白蛋白标准。蛋白酶的纯度使用1D Image Analysis Software(Kodak，Rochester，NY)根据在变性丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上分开的用Biosafe考马斯蓝(Biorad，Hercules，CA)染色的蛋白质样品进行估计。

实施例5用于HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域的酶促测定法

体外蛋白酶活性如公开的(7)在96孔微量滴定板(Corning NBS3990)中用VX-950和BILN 2061蛋白酶抑制剂进行测定。BILN 2061是由Boehringher Ingelheim，Laval，Quebec，Canada开发的HCVNS3·4A蛋白酶抑制剂。简言之，蛋白酶与5μM辅因子KK4A一起于25℃温育10分钟并于30℃温育10分钟。添加在DMSO中系列稀释的蛋白酶抑制剂(VX-950或BILN 2061)并于30℃另外温育15分钟。反应通过添加5μM RET-S1(Anaspec Inc.San Jose，CA)-内部猝灭的荧光酯肽底物来起始，并且于30℃进行温育。产物释放在TecanSpectraFluorPlus平板阅读仪中监控20分钟(在360nm处激发和在500nm处发射)。数据用简单的IC₅₀等式：Y＝V₀/(1+(X/IC₅₀))进行拟合。

实施例6HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域蛋白质的K_m测定

底物动力学参数用内部猝灭的荧光酯肽底物RET-S1(Ac-DED(EDANS)EEαAbuψ[COO]ASK(DABCYL)-NH2)(Taliani等人(1996)Anal.Biochem.240(1)，60-67)来测定。蛋白酶在50mM HEPES(pH 7.8)、100mM NaCl、20％甘油、5mM二硫苏糖醇中与5μM辅因子肽KK4A(KKGSVVIVGRIVLSGK)(Landro等人(1997)Biochemistry36(31)，9340-9348)一起于25℃预温育10分钟并于30℃预温育10分钟。反应通过添加RET-S1底物(Anaspec Incorporated，San Jose，CA)来起始，并且于30℃温育10分钟。测定总体积为100μL。反应通过添加25μL 10％三氟乙酸(TFA)进行猝灭。反应产物在反相微孔高效液相层析柱(Penomenex Jupiter 5μC18 300A柱，150x2.0mm)上进行分离，所述柱加热至40℃。流速为0.2ml/分钟，使用H2O/0.1％TFA(溶剂A)和乙腈/0.1％TFA(溶剂B)。如下使用线性梯度：5％-30％溶剂B经过1分钟，30％-40％溶剂B经过15分钟，随后40％-100％溶剂B经过1分钟，3分钟等度，随后为100％-5％B1分钟，并且在5％B时平衡10分钟。DABCYL-肽产物在500nm处进行检测并且一般洗脱约17分钟。K_m通过用GraphPrism软件使数据与米-曼氏(Michaelis-Menten)等式拟合来测定。

实施例7HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域变体的特拉匹韦(Telaprevir)(VX-950)K_i(app，1h)的测定

NS3蛋白酶结构域变体对特拉匹韦的敏感性如先前公开的(Lin等人(2004)J.Biol.Chem.279(17)，17508-17514)在96孔微量滴定板(Corning NBS 3990；Corning，NY)中进行测定。简言之，NS3蛋白酶结构域在50mM HEPES(pH 7.8)、100mM NaCl、20％甘油、5mM二硫苏糖醇中与5μM KK4A肽一起于25℃预温育10分钟并于30℃预温育10分钟。向蛋白酶混合物中添加在DMSO中系列稀释的特拉匹韦，并且于30℃另外温育60分钟。反应通过添加5μMRET-S1底物来起始，并且于30℃进行温育。产物释放在TecanSpectraFluorPlus平板阅读仪(Tecan US，Durham，NC)中监控20分钟(在360nm处激发和在500nm处发射)。测定总体积为100μL。选择蛋白酶浓度使得10-20％的底物在测定过程期间周转。为了计算表观抑制常数K_i(app，1h)值，使用GraphPrism软件使数据与用于紧密结合抑制(38)的莫里森氏(Morrison′s)等式的整合形式拟合。稳态测定法显示野生型酶和所有R155K/T/I/S变体对于RET-S1具有高于检测极限(100μM)的K_m。因此，K_m设定为100μM用于计算K_i(app， _1h)值。抑制剂研究在明显低于K_m的底物浓度(5μM)下进行。因此，真实的K_m和在计算中使用的K_m之间的偏差在K_i(app，1h)计算中应具有可忽略的影响。

实施例8基线样品的序列分析

关于每个患者的HCV群体的共有序列衍生自包含HCV cDNA的平均84个独立的质粒克隆。共有序列的系统进化分析指出序列是患者特异性的(图1)。平均的患者内氨基酸准种复杂性(香农(Shannon)熵)和多样性(哈明(Hamming)距离)很低(分别为0.332±0.109和0.421±0.195)，并且没有观察到准种异质性与基线时的HCV RNA血浆浓度的关联。患者间氨基酸多样性(在这个试验中与患者的基因型1a或1b共有序列比较的个别共有区)对于基因型1a是1.3％和对于基因型1b是2％。结构模拟分析预测在亚型内的所有患者的共有序列之间观察到的氨基酸差异将对VX-950结合具有很少的影响或无影响。

患者特异性蛋白酶克隆随后进行表达并就经由VX-950的抑制进行测试。与模拟观察一致，在衍生自特定亚型内的不同患者分离物的这些蛋白酶的酶促IC₅₀值中没有显著差异。然而，关于基因型1b患者的平均IC₅₀略微高于关于基因型1a患者(图2)。这个发现与先前测量关于HCV-H(1a)和HCV Con1(1b)的K_i值(7)的体外结果一致。1a对1b基因型的模拟分析暗示可能影响抑制剂/底物结合的关键差异在残基位置132上，而其他差异位于结合袋外部。基因型1b蛋白酶的Val¹³²侧链与VX-950的P3叔丁基-甘氨酸基团仅进行1个范德华(vander Waals)接触，而基因型1a蛋白酶的Ile¹³²侧链进行2个接触。相互作用中的这个结构差异与实验数据一致，所述实验数据显示与基因型1b蛋白酶比较，VX-950与基因型1a蛋白酶的较低酶IC₅₀。尽管在亚型之间存在轻微差异，但2种亚型仍明显对VX-950敏感。总之，尽管在HCV NS3丝氨酸蛋白酶中观察到序列多样性，基因型1患者预期对使用蛋白酶抑制剂VX-950的治疗响应。临床数据支持到这个发现，因为没有观察到对VX-950的病毒应答中的显著差异。

实施例9基因型数据：ETR和随访样品的序列分析

在治疗结束(ETR)时对于每个患者将HCV NS3蛋白酶序列与基线时的共有序列比较，以鉴定潜在的抗性突变。对于每个ETR样品获得平均80个序列，并计算在ETR样品181个位置的每一个上的变异百分比。最初，与基线比较，在任何单个氨基酸位置上5％或更大的频率的增加视为潜在的抗性突变。使用5％的截断值是因为基于分析的克隆数目和PCR的错误率，这是我们的测序方案的敏感性的较低水平。在基线的多态的位点上的改变不视为抗性突变。仅在给药结束时存在和在多个患者中观察到的位点上的改变视为潜在的抗性突变，并且这些随后在所有患者中进行分析。

为了分析，基于对VX-950应答的病毒载量(血浆HCV RNA水平)将患者分组。在病毒动态分析中将患者分组成“初始应答者”或“持续应答者”。在病毒序列分析中，基于最初下降后血浆HCV RNA中的增加，将“初始应答者”进一步分成2个组。从测量的最低HCV RNA水平到给药结束时(第14天)具有小于0.75log₁₀增加的患者分类为具有HCV RNA“稳定水平”的患者。在血浆HCV RNA中具有大于0.75log₁₀增加的那些分类为具有HCV RNA“反弹”的患者。在未处理患者中HCVRNA的正常波动为约0.5log₁₀，且这些分组基于抗病毒应答以及病毒突变模式。存在关于其这些分类在2类分析之间不一致的2个患者。对于序列分析患者12308从最低值到给药结束时(第14天)具有0.05log₁₀的增加并且分类为“稳定水平”，而对于病毒动态分析12308置于“持续应答者”组中。患者3112在第11天时具有无法检测的血浆HCV RNA(＜10IU/ml)，但在给药结束时(第14天)具有35IV/ml可检测的血浆HCV RNA。对于病毒动态分析HCV RNA的增加使得该患者置于“初始应答者”组中；然而，在序列分析中，HCV RNA水平通过测序测定法仍无法检测并且该患者因此分到“持续应答者”组内。

序列分析将患者分组为：无应答(安慰剂)；在给药期间下降随后反弹(反弹)；在给药期间下降随后稳定水平(稳定水平)；和给药自始至终持续下降(持续应答者)(图3)。此外，在这些组内，患者通过剂量组和基因型亚组(1a或1b)进行分析。最后，在VX-950撤药后7-10天收集的随访样品中分析突变，以监控任何突变的持久性以及从基线变种的任何转变。对于每个随访样品分析平均81个克隆。全序列分析对于28个患者可获得，和其余6个患者的分析目前在进行中。分析对于具有反弹的2个患者，具有稳定水平的3个和具有持续下降的1个正在进行的。在安慰剂患者(n＝6)的第一个组中，在任何患者的任何位置上没有从基线的显著改变。

实施例10在给药期间具有HCV RNA反弹的患者

存在最初对VX-950应答在HCV RNA中具有大于2log₁₀下降，但在仍用VX-950给药的时候最后开始反弹的13个患者。在这13个患者中，6个在450mg q8h剂量组中，1个在750mg q8h剂量组中，和6个在1250mg q12h剂量组中。全序列分析对于这些患者中的11个在第14天时可获得(表1)。所有这些患者具有在位置36上的突变中的显著增加。在位置36上，野生型缬氨酸在基因型1b患者中突变成丙氨酸(V36A)(平均值60％，范围31％-86％)，和在基因型1a患者中突变成丙氨酸或甲硫氨酸(V36M)(平均值62％，范围18％-90％)。V36M在亚型1b中的不存在可能是由于亚型1b中的2核苷酸置换对亚型1a中的仅仅单个变化的需要。V36A突变需要亚型1a或1b中的单个核苷酸变化。位置36上突变成甘氨酸(V36G)在基因型1b患者中也可见，并且在1a患者中突变成亮氨酸(V36L)，但频率低得多。3个患者还具有在位置54上从苏氨酸到丙氨酸的突变(T54A)(平均值35％，范围8％-67％)，和较不频繁地至丝氨酸(T54S)。有趣的是，在位置36和54上的突变似乎是互相排斥的。此外，这个组中是基因型1a的所有患者包含在位置155上从精氨酸到赖氨酸(R155K)或苏氨酸(R155T)的突变(平均值60％，范围22％-99％)，和较不频繁地至异亮氨酸(R155I)、丝氨酸(R155S)、甲硫氨酸(R155M)或甘氨酸(R155G)。在R155上的这些突变限制于亚型1a患者的观察再次可能是由于1b患者中来自基线的2核苷酸变化对1a患者中的单个核苷酸变化的需要。在来自这个组的随访样品中，野生型病毒开始再度出现，但在ETR时可见的所有突变仍存在，尽管处于不同的频率，可能是由于病毒适合度中的差异。关于在其上对于每个患者首次观察到反弹的时间点没有可用的测序样品，因此其他突变是否更早出现仍不明了。

实施例11在给药期间具有稳定水平的HCV RNA应答的患者

在下一个组(n＝8)中，患者最初对VX-950应答，但他们的HCV RNA应答稳定并且不继续下降，尽管没有看到HCV RNA中的增加。这些患者中的2个在450mg q8h剂量组中，2个在750mg q8h剂量组中，和4个在1250mg q12h剂量组中。分析对于这些患者中的5个在第14天时完成(表1)。所有患者在位置156上发展出从丙氨酸到缬氨酸(A156V)或苏氨酸(A156T)的突变，和非常罕见地至丝氨酸(A156S)或异亮氨酸(A156I)。A156V/T突变在这个组的3个患者中以非常高的频率(100％)看到，并且在这些患者中没有看到其他突变。其他2个患者(02104和12308)仅分别具有8％的A156T和30％的A156V突变型病毒，但这些患者也具有在其他位置上的突变(关于患者0210447％的V36A/M和36％的R155K/T；关于患者1230868％的T54A)。来自反弹组的1个患者02102在位置156上也具有类似频率的突变(11％)。在随访时间点上，位置156上的突变几乎被野生型病毒或在位置36、54和/或155上具有突变的病毒完全替换。在位置156上至丝氨酸的改变(A156S)是VX-950的体外抗性研究(7)期间可见的显性突变。A156V/T突变在体外研究(7)中也鉴定为对VX-950和BILN 2061的交叉抗性。

实施例12在给药期间具有持续应答的患者

其余7个患者对VX-950应答，在14天给药期自始至终具有HCVRNA水平的持续下降。这些患者中的5个在750mg q8h剂量组中，和2个在450mg q8h剂量组中。这些患者在第14天时具有非常低水平的HCV RNA(64IU/mL至无法检测(＜10IU/mL))，和测序数据在这个时间点上无法获得。然而，从关于这些患者的随访样品中成功扩增HCV cDNA，并且分析对于这7个患者中的6个完成(表1)。到第14天时已达到无法检测水平的基因型1a患者(03205)在随访时间点上具有3个突变：V36A/M(67％)、T54A(11％)和R155K/T(26％)。2个基因型1b患者具有V36A(21％和25％)和T54A突变(54％和20％)，和另2个1b患者在随访时仅具有低水平的V36A(3％和9％)和T54A(6％和1％)突变。在第14天时具有无法检测的HCV RNA水平(＜10IU/mL)的最后1个1b患者中，在随访时没有检测到突变。

实施例13双重突变的频率

同样分析了在患者中发现的双重突变的频率。在位置36上的突变与在位置155(36/155双重突变)和156(36/156双重突变)上的突变组合发现。只有基因型1a患者具有36/155双重突变，这在第14天ETR时在反弹组中分析的所有8个1a患者(平均值27.6％，范围10％-77％)和稳定水平组中的2个1a患者之一(9％)中可见。36/156双重突变的频率少得多，并且在第14天ETR时在反弹组的3个患者(3％，范围1％-5％)和稳定水平组的2个患者(1％和4％)中发现。与ETR样品比较，双重突变也在随访样品中对于36/155以类似频率发现但对于36/156以较低频率发现。对于持续下降的患者组，只有1个患者具有36/155双重突变，其以5％出现。

单独或组合发现的突变频率显示于图4中。抗性模式的概括显示于图5中，其描述了关于每个患者组的突变氨基酸的平均百分比。

实施例14表型数据：抗性突变的酶促IC₅₀分析

因为对平均82个独立测序克隆实施基因型分析，所以如表1中所示，在每个患者中存在病毒粒子的混合物。在上文序列分析中可见的所有突变株(V36A/M/G、T54A/S、R155K/T/M/G/S和A156T/V/S)的酶IC₅₀以及在体内发现的这些突变的任何观察到的组合在至少2个不同的患者特异性遗传背景中进行测定。如实施例6中报告的，关于基因型内的所有患者的基线IC₅₀类似。抗性蛋白酶的酶IC₅₀值报告为与基因型1a HCV-H参照株比较的倍数变化。这种参照株的IC₅₀在这种酶测定法中发现为64nM。

图5显示关于单重突变株的酶IC₅₀值和超过参照株的倍数变化。在给定位置上对于任何氨基酸变化类似的值在这个图中集合在方框中。在位置36上的单重突变给予对VX-950的低水平的抗性。V36A/M/L突变显示出酶IC₅₀中约1.5-10倍的增加，与具体的氨基酸变化无关。在位置54上从苏氨酸到丝氨酸的置换(T54S)不显著增加IC₅₀。然而，T54A突变产生酶IC₅₀中约10倍的增加。对于从精氨酸到苏氨酸(R155T)、赖氨酸(R155K)、甲硫氨酸(R155M)或丝氨酸(R155S)的变化中的任何一种，在位置155上的置换也给予相当低水平的抗性(IC₅₀中约5-15倍的增加)。在位置156上从丙氨酸到缬氨酸(A156V)、苏氨酸(A156T)或异亮氨酸(A156I)的突变给予高水平的抗性(酶IC₅₀中约400-500倍的增加)。有趣的是，A156S突变对VX-950的抵抗力比在这个位置上的其他氨基酸变化小得多(IC₅₀中仅22倍的增加)，这与体外抗性研究(6，7)一致。

图6显示关于双重突变株的实际酶IC₅₀值和超过参照株的倍数变化。在这些位置上的双重突变产生比任何单重突变更高水平的抗性。与在位置155或156上的突变组合的在位置36上的突变产生在抗性方面超过分别的单重突变株的另外10倍的增加。表2列出了关于针对VX-950以及另一种HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061测试的所有突变株的实际IC₅₀值。在位置36和54上的突变对VX-950的敏感性的影响比BILN 2061多得多，而在残基155上的突变给予对BILN 2061高得多水平的抗性。在位置156上的突变以及双重突变都给予针对2种抑制剂的高水平的抗性。然而，A156S突变株对VX-950更有抵抗力，这已先前在体外(7)显示。表3显示了在给定位置上所有突变的酶IC₅₀的平均值和标准差值以及超过参照株的倍数变化。

实施例15关于每个患者的平均表型

本文进行的基因型分析允许详细检查每个患者内的不同抗性突变株的相对比例。为了更好地了解由这些病毒混合物给予的表型抗性的水平，进行探索性分析以获得关于每个患者的平均表型。具有给定单重或双重突变的病毒粒子的百分比乘以关于那种给定突变株的酶IC₅₀中的平均倍数变化(表3)，随后将关于每个患者的所有值相加。相对数目(值除以100)显示于表1的最后1列中。关于反弹组患者的平均值在第14天时为27(范围6-70)和在随访时为15(范围3-29)。关于稳定水平组患者的平均值在第14天时为272(范围26-466)和在随访时为32(范围1-126)。持续下降的最后一组患者在随访时具有4的平均值(范围0-10)。根据这些非常初步的计算，看起来在所有患者组中的抗性水平在最后一次剂量后(从第14天到随访)下降，这并非未预料到的，因为对于抗性病毒粒子选择的药物压力不再存在。还似乎反弹组患者具有比稳定水平的患者更低水平的抗性。使药代动力学数据与抗性模式关联的分析目前在进行中。

实施例16抗性突变的适合度分析

除其抗性特征外这些病毒变种的另一个重要方面是适合度水平。计算单重和双重突变的病毒适合度(表4)。测定在给定时间点上单个患者中的每个HCV变种的感染单位(IU/mL)的绝对数。例如，在第14天时在患者03201中具有A156V/T突变的变种的感染单位的绝对数计算为：VL_{d14(A156V/T，3201)}＝VL_{d14(整体，3201)}x％A156V/T_d14(3201)。在给药结束(第14天，VL_{d14(整体，3201)})或随访(第21天，VL_{d21(整体，3201)})时的总HCV RNA取自血浆HCV RNA水平的分析，如通过Roche COBAS TaqmanHCV测定法测定的。HCV RNA无法检测的水平视为5IU/mL。在给药结束(第14天，％A156V/T_d14(3201)或随访(第21天，％A156V/T_d21(3201))时每个单个变种组(例如，A156V/T)的百分比取自上述序列分析(表1)。接下来，测定关于每个HCV变种的血浆HCV病毒载量(NVL)的净增加倍数和给药后(第14天-第21天)单个患者的血浆中的HCV的整个群体。例如：

NVL_{(A156V/T，3201)}＝VL_{d21(A156V/T，3201)}/VL_{d14(A156V/T，3201)}

NVL_{(整体，3201)}＝VL_{d21(整体，3201)}/VL_{d14(整体，3201)}

每个HCV变种的NVL对每个患者中的整个血浆HCV群体的那种进行标准化：％NVL_{(A156V/T，3201)}＝NVL_{(A156V/T，3201)}/NVL_{(整体，3201)}。

随后将单个患者中每个HCV变种的病毒载量的净增加的标准化倍数转化成log₁₀转化值：Log₁₀[％NVL_{(A156V/T，3201)}]，和测定来自所有患者的关于变种的平均值。随后计算HCV突变株的适合度：关于A156V/T突变的适合度＝10_{Log(适合度，A156V/T)}。这种相对适合度得分与每个突变株的抗性水平一起进行分析。如图7中所示，与野生型比较，所有突变株较不适合，并且一般而言，使用这种分析，单重突变株的适合度和抗性之间存在反相关。然而，双重突变株36/155在抗性中具有显著增加而对适合度的影响较少。这可能是由于补偿适合度丧失的突变的相互作用，同时仍给予抗性。

实施例17R155K变体蛋白酶的X射线结构

以8.0mg/ml的浓度与NS4A肽辅因子(Kim等人(1996)Cell 87(2)，343-355)复合的HCV-H株蛋白酶结构域的纯化的R155K变体用于结晶试验。蛋白质晶体在0.1M MES(pH 6.2)、1.4M NaCl、0.3M KH₂PO4和10mM β-巯基乙醇的储库液体上生长。单晶经过2天平衡后在悬滴中获得。将具有0.15x0.15x0.35mm尺度的单晶转移到含25％甘油的母液的冷冻保护剂溶液内，在氮气流中冲洗冷却(flush-cooled)至100K前不久加入。衍射图像使用安装在ALS束线5,01上的CCD4图像板器械进行收集。在

分辨率时的数据使用HKL(2000，HKL Incorporated，Charlottesville，VA)和CCP4软件编入索引并整合。该晶体属于空间群R32，具有

α＝90.00°，β＝90.00°和γ＝120.00°的晶胞尺度。存在在随后的精炼中指定用于测试游离R因子的5％数据。本文研究的R155K变体的晶体具有与先前公开的野生型蛋白酶NS3-4A的那种(Kim等人，同上)相同的晶体学晶格。公开的NS3-4A蛋白酶结构域(PDB编码：1A1R)用于进行模拟的最初刚体和位置精炼。残基155的侧链中的差异在电子密度图中证实为Lys而不是Arg。使用QUANTA程序针对电子密度图视觉检查蛋白质分子。精炼中溶剂分子的进一步包括和在分辨率范围处的个别B因子精炼分别使R因子和游离R因子减少至22.0％和24.7％。对于晶体学独立分子和2个Zn金属离子，包括在精炼模拟中的残基为NS3蛋白酶结构域的氨基酸1-181和NS4A辅因子的残基21-39。

实施例18计算模拟

根据先前描述的操作(Lin等人，同上)，使用与NS4A辅因子肽复合的R155K变体脱辅基酶的X射线晶体结构，将特拉匹韦模拟到R155K变体NS3蛋白酶结构域的活性位点内。模拟特拉匹韦的酮酰胺基以用si面附着与Ser¹³⁹侧链形成共价加合物。对于类似的酮酰胺抑制剂(Perni等人(2004)Bioorg.Med.Chem.Lett.14(6)，1441-1446)和酮酸抑制剂(Di Marco等人(2000)J.Biol.Chem.275(10)，7152-7157.)观察到这种结合模式。抑制剂的主链与这些酮酰胺和酮酸抑制剂的类似主链重叠，使得特拉匹韦主链构成所有下述主链氢键：P1NH与Lys¹⁵⁵羰基，P3羰基与Ala¹⁵⁷NH，P3NH与Ala¹⁵⁷羰基，和P4帽羰基与Cys¹⁵⁹的NH。在这个结合模型中，特拉匹韦的P2基团置于S2袋中，而没有去除Lys¹⁵⁵侧链的任何需要。特拉匹韦的叔丁基和环己基分别置于S3和S4袋中。该抑制剂在2个阶段中使能量最小化。在第一个阶段中，对于1000个步骤只允许抑制剂和蛋白酶的Arg¹²³、Lys¹⁵⁵和Asp¹⁶⁸的侧链原子在能量最小化期间移动。在第二个阶段中，对于另外1000个步骤允许蛋白酶的所有侧链原子连同抑制剂一起移动。这种模拟结构紧密地模仿先前描述的(Lin等人，同上)野生型NS3蛋白酶的活性位点中的特拉匹韦模拟。没有观察到Lys¹⁵⁵侧链或其他活性残基侧链位置的显著移动。重复相同操作用于将特拉匹韦对接到NS3蛋白酶结构域的R155T变体的活性位点内。然而，这种情况下的酶结构不是X射线晶体结构，而是使用R155K变体晶体结构的模型建造。Lys¹⁵⁵残基用Thr侧链替换，并且通过使除了Thr¹⁵⁵侧链外的酶的所有原子固定最小化。在这个模型中，Thr¹⁵⁵侧链的羟基与Asp⁸¹的侧链形成氢键。所有模拟和最小化操作使用QUANTA分子模拟软件(Accelrys Incorporated，San Diego，CA)来进行。

实施例19研究结果

除了关于本发明的某些变体的上文讨论外，此处呈现来自酶促测定法和结构研究的结果。

1)在NS3蛋白酶的Arg ¹⁵⁵ 上的置换在HCV复制子细胞中给予针对特拉匹韦的低水平的抗性

为了测定观察到的HCV NS3蛋白酶结构域的Arg¹⁵⁵置换是否足以给予针对特拉匹韦(VX-950)的抗性，将在NS3残基155(R155K、R155T、R155S、R155I、R155M或R155G)上的几种置换引入高效率亚基因组复制子质粒(Con1-mADE)内。对于这些变种中的每一种产生稳定的HCV复制子细胞，指出用不同残基置换NS3 Arg¹⁵⁵不取消细胞中的HCV RNA复制。野生型HCV复制子Con1-mADE细胞中的特拉匹韦的平均48小时IC₅₀值为0.485±0.108μM，这略微高于在基于Con1的HCV复制子细胞中使用不同的适应性突变组(24-2)(25，41)先前已测定的那种(0.354μM)。在单独的特拉匹韦的1b期试验中观察到的2种主要的Arg¹⁵⁵变体R155K和R155T对于R155K具有3.59±0.28μM的平均48小时特拉匹韦IC₅₀值，和对于R155T为9.60±0.87μM。这分别对应7.4或20倍增加，与野生型Con1-mADE复制子比较(表I)。在包含在Arg¹⁵⁵上的其他4种次要变体的HCV复制子细胞中观察到针对特拉匹韦的敏感性中的类似增加：R155S、R155I、R155M或R155G；表I。在特拉匹韦1b期试验中这4种变体以比R155K/T低得多的频率发现。关于这4种变体的复制子48小时IC₅₀值为1.97±0.21μM(R155S)、11.7±2.5μM(R155I)、2.68±0.21μM(R155M)和3.58±0.24μM(R155G)，这分别对应4.1、24、5.5和7.4倍增加，丧失对特拉匹韦的敏感性(表I)。这些结果指出NS3 Arg¹⁵⁵的置换导致HCV复制子细胞中针对特拉匹韦的低水平(＜25倍)的抗性，不依赖置换残基的物理性质，这包括正电荷残基(Lys)、亲水性残基(Thr或Ser)、疏水性残基(Ile或Met)或缺乏侧链的残基(Gly)。

表I.HCV复制子细胞测定法中抗性的证实

稳定的野生型(mADE)和变体HCV亚基因组复制子细胞系使用T7RNA失控(runoff)转录物由相应的高效率Con1复制子质粒产生。在3次独立实验中在48小时测定法中测定关于HCV复制子细胞系的特拉匹韦的平均IC₅₀值和SD。倍数变化通过将给定变体的IC₅₀除以野生型HCV复制子的那种进行测定。

2)HCV NS3蛋白酶在Arg ¹⁵⁵ 上的置换导致酶测定法中针对特拉匹韦减少的敏感性

为了证实HCV NS3蛋白酶结构域中在Arg¹⁵⁵上的置换是否足以在酶水平上引起针对特拉匹韦的敏感性的丧失，在NS3蛋白酶结构域(基因组1a)中将Arg¹⁵⁵替换为Lys、Thr、Ser或Ile，关于其序列衍生自用特拉匹韦给药前的患者中的HCV样品。包含R155K、R155T、R155S或R155I突变的NS3丝氨酸蛋白酶结构域蛋白质在大肠杆菌中进行表达，并且在测定针对特拉匹韦的酶敏感性前进行纯化。针对特拉匹韦的抗性通过K_i(app，1h)中的倍数变化来限定，所述K_i(app，1h)是在与特拉匹韦一起1小时预温育后测量的表观K_i。

关于与KK4A辅因子肽共复合的野生型HCV蛋白酶结构域的特拉匹韦敏感性对在Arg¹⁵⁵上具有置换的变体的比较显示于表II中。针对与KK4A肽复合的野生型基因型1a患者NS3蛋白酶结构域的特拉匹韦的平均K_i(app，1h)值为0.044±0.033μM(表II)。相比之下，特拉匹韦的平均K_i(app，1h)值对于R155K蛋白酶高约11倍，和对于R155T蛋白酶高9倍(表II)，在单独的特拉匹韦1b期试验中观察到的2种主要变体。与野生型蛋白酶的那种比较，在特拉匹韦1b期试验中观察到的2种次要Arg¹⁵⁵变体R155S和R155I分别显示出在K_i(app，1h)值中22倍和16倍的增加(表II)。这些数据指出用不同氨基酸置换Arg¹⁵⁵，包括另一种正电荷残基(Lys)的保守置换，导致针对特拉匹韦减少的敏感性。

表II.HCV NS3蛋白酶酶测定法中抗性的证实

在3-5次独立实验中使用KK4A辅因子肽和FRET底物测定关于纯化的野生型和关于4种变体HCV NS3丝氨酸蛋白酶结构域的特拉匹韦的平均K_i(app，1h)值和SD。倍数变化通过将给定变体的K_i(app，1h)除以野生型蛋白酶的那种进行测定。

3)R155K HCV NS3蛋白酶的X射线结构

为了了解用另一种残基包括正电荷氨基酸(Lys)置换Arg¹⁵⁵为何导致针对特拉匹韦的敏感性丧失，测定R155K NS3蛋白酶的X射线晶体结构。将R155K突变改造成T7标记融合的HCV-H蛋白酶构建体，其先前已用于确定与NS4A辅因子肽共复合的野生型蛋白酶的结构。分辨率为

的与NS4A辅因子肽共复合的R155K蛋白酶结构域的总体结构，非常类似于先前描述的野生型HCV-H株蛋白酶复合物的那种(Kim等人，同上)。简言之，NS3蛋白酶结构域的1个分子(残基1-181)和辅因子NS4A的1个分子(残基21-39)形成球形实体，这依次与不对称单位中的另一个球形实体形成同二聚体。与NS4A辅因子复合的Lys¹⁵⁵变体蛋白酶的1个球形单位与野生型Arg¹⁵⁵共复合物重叠。因为Cα原子的rms偏差仅为

所以在这2种蛋白酶的结构中存在很少差异。

S2和S4袋中的NS3蛋白酶残基123、168和155的侧链的局部放大图显示于图25(B)中。残基155侧链(Lys¹⁵⁵对Arg¹⁵⁵)的总体移动很小，如通过残基155的Cδ和Asp⁸¹的Cβ之间的距离证明的，催化三联残基之一：对于Lys¹⁵⁵的和对于Arg¹⁵⁵的

在R155K蛋白酶中，Lys¹⁵⁵的末端胺(Nz)和Asp⁸¹的Cβ之间的距离为

和Lys¹⁵⁵的Cδ和Asp⁸¹的Cβ之间的距离为在野生型蛋白酶中，Arg¹⁵⁵的NH1和Nz分别远离其Asp⁸¹的Cβ

和

因此，R155K蛋白酶中Lys¹⁵⁵的末端胺基比Arg¹⁵⁵的相当末端叠氮基更接近于Asp⁸¹的羧基。相比之下，在R155K蛋白酶中Lys¹⁵⁵的Nz和Asp¹⁶⁸的羧基原子Oε2之间的距离为

与野生型蛋白酶中Arg¹⁵⁵的末端NH2和Asp¹⁶⁸的Oε2的相应对之间的比较。因此，在R155K蛋白酶中Lys¹⁵⁵的末端胺基比Arg¹⁵⁵的相当末端叠氮基更进一步远离Asp¹⁶⁸的羧基。因此，在残基155上用Lys替换Arg改变S2结合袋的形状，使得Lys¹⁵⁵的Nz原子上的正电荷不能被Asp¹⁶⁸的邻近侧链中和，如在野生型Arg¹⁵⁵和Asp¹⁶⁸对的情况下。

4)R155K或R155T变体对特拉匹韦的抗性机制

特拉匹韦和NS3蛋白酶之间的相互作用的结构模型先前已得到描述(例如，Lin等人，同上)。在特拉匹韦与R155K酶的共复合物的模型中，相同的相互作用得到维持，除了残基155的侧链上的差异。在野生型蛋白酶结构中，Arg¹⁵⁵侧链屈向特拉匹韦的二环P2基团以进行几个直接的范德华接触，并提供关于特拉匹韦的P2基团的疏水环境(图26(A))。然而，R155K的Lys¹⁵⁵侧链具有扩展的构象并且只与P2基团进行1个或2个直接接触，从而使得特拉匹韦的P2基团更暴露于溶剂(图26(B))。这个观察与R155K酶对特拉匹韦较不敏感一致，如用体外酶测定法显示的。假定R155M变体将具有Met¹⁵⁵侧链的扩展构象，并因此类似地与特拉匹韦的P2基团具有较少的相互作用，这是合理的，与在抑制剂的结合中观察到的减少一致。

为了了解特拉匹韦与在位置155上具有较短侧链的残基的变体的结合机制，使用与特拉匹韦复合的R155T变体酶的模型。根据模型显而易见的是Thr¹⁵⁵侧链太短而不能提供关于抑制剂的P2基团的疏水性覆盖(图26(C))。其他较短的侧链如Ile、Ser和Gly是在尺寸方面类似的或甚至更短，并且预期丧失与P2基团的相互作用并对特拉匹韦具有减少的结合亲和力。

5)在NS3蛋白酶的Arg ¹⁵⁵ 上具有置换的HCV变种复制子保持对 IFN-α非常敏感

同样测定在NS3残基155上具有置换的特拉匹韦抗性变体复制子细胞是否保持对IFN-α或病毒唑的敏感性。如表III中所示，与野生型复制子细胞比较，对于包含R155K、R155T或R155M突变的HCV复制子细胞，IFN-α或病毒唑的IC₅₀保持基本上相同。这些结果暗示与IFN-α包括或不包括病毒唑的组合可以是潜在的治疗策略，以抑制在NS3蛋白酶残基155上具有置换的HCV变种的出现。

表III.在HCV复制子细胞中缺乏对其他抗HCV试剂的抗性

稳定的野生型和变体HCV亚基因组复制子细胞系使用T7RNA失控转录物由相应的高效率Con1复制子质粒产生。在3次独立实验中在48小时测定法中测定关于HCV复制子细胞系的IFN-α和病毒唑的平均IC₅₀值和SD。倍数变化通过将给定变体的IC₅₀除以野生型HCV复制子的那种进行测定。

实施例20研究结果概括

一项研究是通过具有基因型1丙型肝炎的受试者中HCV蛋白酶NS3-4A区域的序列分析，监控针对VX-950单一疗法的抗药性突变的可能出现，所述受试者用VX-950给药14天。通常地，抗性基因分型已通过基于群体的测序来进行，这检测血浆病毒中占优势的序列。构成少于20％的病毒群体的任何序列不能通过这种方法进行检测。因为抗药性突变可能需要超过14天积聚至这种可测量的水平，所以开发了新方法以检测变种的较小群体。从约80-85个单个病毒克隆/受试者/时间点获得序列，使得可以鉴定在用VX-950给药的14天中可能出现的抗性突变，而敏感性下至约5％的群体。

在通过对VX-950的病毒应答分组的受试者中，观察到不同的突变模式。在其HCV RNA在给药期间反弹的第一组受试者中，在ETR和随访时野生型病毒几乎完全由包含在位置36、54或155上的突变的3个病毒变种之一替换。V36A突变在基因型1b受试者中发现，而V36A/M或R155K/T在基因型1a受试者中可见。某些变种还包含在1a受试者中的位置36和155上的双重突变。T54A突变在1a和1b亚型中可见。在位置36和54上的突变看起来是互相排斥的，因为它们很少在同一基因组中一起发现。第二组受试者具有初始的HCV RNA下降，这在14天给药期结束时恢复水平。这些受试者具有包含在位置156上从丙氨酸到缬氨酸(A156V)或苏氨酸(A156T)的突变的病毒。在位置156上的这种突变先前已显示在体外在VX-950的存在下发展(6，7)。某些受试者具有也包含在位置36和156上的双重突变的少数变种。

受试者特异性蛋白酶克隆进行表达并就经由VX-950的抑制进行测试。在衍生自亚型内的不同患者分离物的基线蛋白酶的酶IC₅₀值中没有显著差异。然而，突变型蛋白酶的IC₅₀值指出对VX-950不同程度减少的敏感性。最后一组受试者中的HCV RNA在给药期自始至终持续下降，并且某些达到低于目前测定法的检测极限(10IU/mL)的水平。由于我们的测序测定法的敏感性极限(＞100IU/mL)，在给药第14天时关于这些受试者没有可用的病毒序列数据。然而，对于所有患者在VX-950的最后一次剂量后7-10天获取的样品成功地进行测序。在来自前2个应答组的随访样品中，发现抗性突变在所有受试者的血浆中持续。然而，在许多情况下，在位置156上的突变频率明显减少，因为野生型以及在位置36或54上的突变开始成比例增加。在位置155上具有突变的病毒粒子的比例保持相对不变。突变模型中的这些变化可能是由于在不存在药物选择压力的情况下变种之间的适合度差异。看起来在位置36、54或155上具有突变的病毒，尽管与野生型比较较不适合，但仍适度地适合，而残基156突变株在不存在药物的情况下相当不适合。根据这些数据，看起来对于不同的单重突变株在抗性水平和适合度之间存在反相关。衍生自在血浆HCV RNA中具有稳定水平的受试者组的数据指出病毒抗性和适合度在产生给定临床应答中的影响。因此，临床应答其自身不能指示潜在的病毒学。

在给药期间具有持续的HCV RNA下降并达到低水平的HCV RNA的最后一组受试者的分析揭示在随访时存在的病毒由大部分低水平的在位置36和54上的抗性突变组成，并且3个受试者具有少数突变但大部分或完全是野生型的。尽管何种变种(若有的话)在第14天时存在是未知的，但这个结果暗示关于对VX-950的最佳应答，可以避免使用单一疗法的临床抗性或通过添加其他抗病毒化合物如Peg-IFN。优化的给药方案可以使这种应答扩展至更多数目的患者。

总之，这些结果指出在这项研究中VX-950的给药方案可以导致具有不同水平的抗药性的NS3蛋白酶中不同突变的选择。增加的VX-950浓度预期阻止具有低水平抗性的病毒(在位置36、54和155上)的出现。其余的高水平抗性病毒(在位置156上)可能通过不同治疗选择，包括组合疗法被克服。较高的药物浓度可以更完全地抑制病毒复制，引起初始下降的较陡的斜度；因此减少了抗性突变将被选择并引起临床抗性的机会。向VX-950治疗中添加Peg-IFN可以增强病毒的免疫介导的清除，并且免疫介导的清除的有效性应不受抗性变种存在的影响。尽管在位置156上的突变给予高水平的抗性，但看起来伴随显著的适合度成本发生，如通过在不存在VX-950的情况下其相对的复制速率测量的。存在越来越多的证据，抗病毒抗药性与受损的病毒适合度相关，这可以转化为临床利益(1-3，9)。以如此低水平复制的抗性病毒可能不立即积聚补偿性的适合度突变，允许宿主免疫系统或其他药物如Peg-IFN清除剩余病毒。

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表1.在用VX-950给药后发现的单独或组合的HCV蛋白酶中的突变

^aHCV RNA从最低值到第14天(给药结束)的对数变化。患者3108没有第14天的HCV RNA值，并因此使用第11天和第17天的值推断。

^bVX-950的第一次剂量后的天数

^c基于平均82个克隆的百分比

^d(在氨基酸位置上的突变％)总和x(关于所有单重和双重突变株的氨基酸位置的IC₅₀中的平均倍数变化)/100

^eETR＝治疗结束(第14天)

^fFU＝随访(ETR后7-10天)

^gn/a＝未获得(进行中)

^hnd＝无法检测

表2.使用VX-950和BILN 2061的单重和双重突变体的IC₅₀分析

^*nd＝未测定

表3.关于在相同位置上的不同氨基酸突变的VX-950的平均IC₅₀值

表4.病毒突变株的适合度

病毒突变	适合度	相对野生型的适合度的倍数减少	适合度(野生型设为100)
病毒突变	适合度	相对野生型的适合度的倍数减少	适合度(野生型设为100)	无(野生型)	4.17	--	100
V36A/M	2.82	-1.48	68	无(野生型)	4.17	--	100
V36A/M	2.82	-1.48	68	R155K/T+V36A/M	2.0	-2.09	48
T54A	1.86	-2.24	45	R155K/T+V36A/M	2.0	-2.09	48
T54A	1.86	-2.24	45	R155K/T	1.58	-2.64	38
A156V/T	0.1	-41.70	2.4	R155K/T	1.58	-2.64	38

表5.突变型HCV蛋白酶的抗性概括

通过引用合并

本文提及的所有出版物和专利通过引用在此整体合并，如同每个单个出版物或专利特别并个别指出通过引用合并。

尽管本公开内容的具体实施方案已得到讨论，但上文说明书是举例说明性的而非限制性的。在检查本说明书和下文的权利要求后，公开内容的许多变化对于本领域技术人员将是显而易见的。本公开内容的全部范围应通过参考权利要求连同其等价物的全部范围，以及说明书连同此类变化来确定。

Claims

1.编码HCV NS3蛋白酶、其生物活性类似物、或其生物活性片段的分离的HCV多核苷酸，其中对应选自下述的密码子的至少一个密码子是突变的：野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156，使得它编码与由所述野生型HCV多核苷酸的所述相应密码子编码的所述氨基酸不同的氨基酸。

2.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中所述野生型HCV多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核酸序列或其部分。

3.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中对应所述野生型HCV多核苷酸的密码子36的所述密码子不编码V。

4.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中对应所述野生型HCV多核苷酸的密码子54的所述密码子不编码T。

5.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中对应所述野生型HCV多核苷酸的密码子155的所述密码子不编码R。

6.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中对应所述野生型HCV多核苷酸的密码子156的所述密码子不编码A。

7.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中对应选自下述的任何2个密码子的2个密码子是突变的：野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156，使得任一密码子编码与由所述野生型HCV多核苷酸的所述相应密码子编码的所述氨基酸不同的氨基酸。

8.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中对应选自下述的任何3个密码子的3个密码子是突变的：野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156，使得3个密码子各自编码与由所述野生型HCV多核苷酸的所述相应密码子编码的所述氨基酸不同的氨基酸。

9.权利要求1的分离的HCV多核苷酸，其中对应野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156的所述密码子是突变的，使得所述4个密码子各自编码与由所述野生型HCV多核苷酸的所述相应密码子编码的所述氨基酸不同的氨基酸。

10.包含编码HCV NS3蛋白酶的多核苷酸的分离的HCV变种，其中对应选自下述的密码子的所述多核苷酸的至少一个密码子是突变的：野生型HCV多核苷酸的密码子36、41、43、54、148、155和156，使得它编码与由所述野生型HCV多核苷酸的所述相应密码子编码的所述氨基酸不同的氨基酸。

11.分离的HCV蛋白酶，其包含这样的氨基酸序列，其中在选自下述的至少一个位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的所述氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。

12.权利要求11的HCV蛋白酶，其中所述野生型HCV NS3蛋白酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分。

13.权利要求11的HCV蛋白酶，其包含HCV NS3蛋白酶的生物活性类似物。

14.权利要求11的HCV蛋白酶，其包含HCV NS3蛋白酶的生物活性片段。

15.权利要求11的HCV蛋白酶，其包含NS4A辅因子。

16.识别HCV NS3蛋白酶的抗HCV蛋白酶抗体，所述HCV NS3蛋白酶包含这样的氨基酸序列，其中在选自下述的至少一个位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的所述氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。

17.核苷酸探针或引物，其能够在严格条件下与权利要求1的HCV多核苷酸的核酸序列杂交。

18.表达系统，其包含权利要求1的HCV多核苷酸。

19.权利要求18的表达系统，其包含载体，其中所述载体包含与启动子可操作地连接的权利要求1的HCV多核苷酸。

20.宿主细胞，其用权利要求19的载体转染、转化或转导。

21.权利要求18的表达系统，其是mRNA展示系统。

22.用于评估患者中对HCV感染的蛋白酶抑制剂的抗药性或敏感性的方法，其包括：

a)收集来自所述HCV感染的患者的生物样品；和

b)评估所述样品是否包含编码HCV NS3蛋白酶的核酸，所述HCVNS3蛋白酶包含这样的氨基酸序列，其中在选自下述的至少一个位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的所述氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。

23.用于指导关于患者中的HCV感染治疗的方法，其包括：

a)根据权利要求22的方法评估所述患者对蛋白酶抑制剂的抗药性或敏感性；

b)基于a)中评估的所述抗药性或敏感性优化关于所述患者的所述治疗方案。

24.用于鉴定用于治疗患者中的HCV感染的候选化合物的方法，其包括：

a)提供由权利要求10的HCV变种感染的样品；

b)测定所述候选化合物抑制所述样品中的所述HCV变种的活性的能力。

25.权利要求24的方法，其中所述HCV变种的所述活性是复制。

26.用于鉴定用于治疗或预防患者中的HCV感染的候选化合物的方法，其包括：

a)提供包含权利要求1的多核苷酸的复制子RNA；

b)测定所述候选化合物是否抑制a)的所述复制子RNA的复制。

27.用于鉴定用于治疗患者中的HCV感染的候选化合物的方法，其包括：

a)提供权利要求11的分离的HCV NS3蛋白酶和蛋白酶底物，其中所述蛋白酶和所述底物在基于细胞的系统或无细胞系统中；

b)使所述HCV NS3蛋白酶与所述候选化合物在所述底物的存在下接触；和

c)测定所述HCV NS3蛋白酶活性是否减少。

28.用于评估用于治疗患者中的HCV感染的候选化合物的方法，其包括：

a)将包含根据权利要求1的多核苷酸的载体和编码指示物的指示基因引入宿主细胞内；

b)培养所述宿主细胞；和

c)在所述候选化合物的存在和不存在下测量所述指示物。

29.用于消除或减少生物样品、或者医学或实验室设备的HCV污染的方法，其包括使所述生物样品、或者所述医学或实验室设备与根据权利要求24-28中任一项鉴定的化合物接触的步骤。

30.治疗患者中的HCV感染的方法，其包括给所述患者施用药学有效量的根据权利要求24-28中任一项鉴定的化合物。

31.用于鉴定能够援救VX-950针对HCV NS3蛋白酶的活性的化合物的方法，所述HCV NS3蛋白酶已变得对VX-950有抵抗力，所述方法包括：

a)使权利要求1的HCV NS3蛋白酶与候选化合物接触；

b)测定VX-950抑制a)的所述蛋白酶的所述活性的能力。

32.治疗患者中的HCV感染的方法，其包括给所述患者施用药学有效量的根据权利要求31鉴定的化合物。

33.权利要求32的方法，其中所述化合物与VX-950组合施用于所述患者。

34.权利要求32的方法，其中所述化合物在所述患者治疗中代替VX-950。

35.权利要求34的方法，其中在所述化合物施用于所述患者并且已援救VX-950的所述活性后，将VX-950施用于所述患者。

36.用于鉴定在减少HCV NS3蛋白酶活性中有效的化合物的方法，其包括：

a)获得权利要求1的HCV NS3蛋白酶的三维模型；

b)设计或选择化合物；

c)评估所述化合物与a)的所述蛋白酶结合或相互作用的能力。

37.权利要求36的方法，其进一步包括评估设计或选择的化合物在无细胞或基于细胞的测定法中抑制HCV NS3蛋白酶活性的能力。

38.权利要求36的方法，其进一步包括测定设计或选择的化合物抑制受感染细胞或样品中的HCV复制的能力。

39.包含用机器可读数据编码的数据存储材料的机器可读数据存储媒体，其中所述机器可读数据包含关于与HCV变种或生物样品相关的至少2个特征的指数值；其中所述特征选自：

a)显示对蛋白酶抑制剂减少的敏感性的抗性的能力；

b)HCV蛋白酶包含这样的氨基酸序列，其中在选自下述的至少一个位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCV NS3蛋白酶的每个相应位置上的所述氨基酸：野生型HCV NS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156；

c)患者的发病或恢复潜力；和

d)所述HCV变种改变的复制能力(增加或减少)。

40.获得受HCV感染患者中的HCV变种谱的方法，其包括：

a)获得来自所述患者的血浆样品；

b)测定来自所述血浆样品的至少2个HCV病毒粒子的HCV蛋白酶的所述核苷酸序列。

41.权利要求40的方法，其中鉴定至少20个HCV病毒粒子。

42.权利要求40的方法，其中鉴定至少50个HCV病毒粒子。

43.权利要求40的方法，其中鉴定至少100个HCV病毒粒子。

44.权利要求40的方法，其中鉴定至少200个HCV病毒粒子。

45.权利要求40的方法，其中鉴定至少500个HCV病毒粒子。

46.权利要求40的方法，其中HCV蛋白酶的所述核苷酸序列包含权利要求1的多核苷酸的序列。

47.权利要求40的方法，其中所述患者已用蛋白酶抑制剂进行治疗。

48.权利要求40的方法，其中在至少2个不同时间点上获得来自所述患者的至少2个血浆样品。

49.用于检测生物样品中的HCV变种存在的方法，其包括检测所述生物样品中根据权利要求1的多核苷酸的存在。

50.诊断试剂盒，其包含权利要求16的抗体。

51.诊断试剂盒，其包含权利要求17的核苷酸探针或引物。