JP2012196230A - C型肝炎ウイルス改変体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、HCV改変体、および関連の方法および組成物を提供する。特に、VX−950のような1種以上のプロテアーゼインヒビターに対する感受性が低下している、HCV改変体および改変体HCVプロテアーゼが、提供される。1つの局面において、本発明は、単離されたHCV NS3プロテアーゼをコードするHCVポリヌクレオチド、その生物学的に活性なアナログ、またはその生物学的に活性なフラグメントを提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)改変体に関する。
C型肝炎ウイルス(HCV)は、世界中で1億7千万人を超える人々に感染し、慢性肝炎の主要な原因であり、この慢性肝炎は、最終的に、末期の肝硬変および肝細胞癌をもたらす。HCV感染についての現在の標準的な処置は、ペグ化インターフェロンα(Peg−IFN)とリバビリン(RBV)との組み合わせである。HCV治療の目標は、持続的ウイルス応答(sustained viral response)(SVR)を得ることによってウイルス感染を消滅させることであり、抗ウイルス処置の6ヵ月後に血液中にHCV−RNAが検出されないことによって定義される。不運なことに、現在の処置は、遺伝子型1を有する被験体の約50%において有効でなく、そして副作用が大きい。したがって、新しい抗ウイルス標的および改善された処置戦略が、必要とされている(非特許文献1、非特許文献2)。
非構造(NS)3−4Aプロテアーゼは、HCV複製のために必須であり、そして新規な抗HCV治療についての有望な標的である。強力かつ特異的なNS3−4AプロテアーゼインヒビターであるVX−950は、HCV遺伝子型1に感染した被験体の第1b相臨床試験(Study VX04−950−101)において実質的な抗ウイルス活性を示した。被験体が処置に応答する程度およびウイルスの跳ね返りが観察される割合は、プロテアーゼインヒビターに対する感受性における遺伝子型による相違に部分的に起因し得る。HCVの迅速な複製速度およびHCVのポリメラーゼの忠実度の低さは、HCVのゲノム全体の変異の蓄積をもたらす(非特許文献3)。プロテアーゼ領域における配列の変化性が、酵素の触媒効率またはインヒビターの結合に影響する程度は、知られていない。さらに、顕著な配列変化を有する多くのウイルスゲノムの産生は、抗ウイルス治療によって処置される被験体における薬物耐性ウイルスの出現の問題の可能性を提示する。実際、抗ウイルス薬物(例えば、HIVプロテアーゼインヒビター)に対する薬物耐性は、よく報告されている(非特許文献4)。薬物耐性変異は、HCVプロテアーゼインヒビターの存在下でインビトロで発生することが、既に示されている(非特許文献5〜8)。プロテアーゼインヒビターBILN 2061に対して耐性である変異が、NS3遺伝子におけるR155Q、A156T、およびD168V/A/Yの位置において見出されているが、NS4領域またはNS4プロテアーゼ切断部位においては変異は未だ観察されていない。VX−950耐性変異もまた、A156Sの位置においてインビトロで見出されている。VX−950およびBILN 2061の両方に対する交差耐性変異もまた、156位(A156V/T)においてインビトロでの発生が示されている(非特許文献5)。
したがって、本発明は、HCV改変体、および関連の方法および組成物を提供する。特に、VX−950のような1種以上のプロテアーゼインヒビターに対する感受性が低下している、HCV改変体および改変体HCVプロテアーゼが、提供される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
HCV NS3プロテアーゼをコードする単離されたHCVポリヌクレオチド、その生物学的に活性なアナログ、またはその生物学的に活性なフラグメントであって、野生型HCVポリヌクレオチドのコドン36、コドン41、コドン43、コドン54、コドン148、コドン155、およびコドン156からなる群から選択されるコドンに対応する少なくとも1つのコドンは、対応する該野生型HCVポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、ポリヌクレオチド、その生物学的に活性なアナログ、またはその生物学的に活性なフラグメント。
(項目2)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、前記野生型HCVポリヌクレオチドは、配列番号1の核酸配列またはその一部分を含む、HCVポリヌクレオチド。
(項目3)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、前記野生型HCVポリヌクレオチドのコドン36に対応するコドンは、Vをコードしない、HCVポリヌクレオチド。
(項目4)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、野生型HCVポリヌクレオチドのコドン54に対応するコドンは、Tをコードしない、HCVポリヌクレオチド。
(項目5)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、前記野生型HCVポリヌクレオチドのコドン155に対応するコドンは、Rをコードしない、HCVポリヌクレオチド。
(項目6)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、前記野生型HCVポリヌクレオチドのコドン156に対応するコドンは、Aをコードしない、HCVポリヌクレオチド。
(項目7)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、野生型HCVポリヌクレオチドのコドン36、コドン41、コドン43、コドン54、コドン148、コドン155、およびコドン156からなる群より選択される任意の2つのコドンに対応する2つのコドンが、いずれかのコドンが対応する該野生型HCVポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、HCVポリヌクレオチド。
(項目8)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、野生型HCVポリヌクレオチドのコドン36、コドン41、コドン43、コドン54、コドン148、コドン155、およびコドン156からなる群より選択される任意の3つのコドンに対応する3つのコドンが、該3つのコドンの各々が対応する該野生型HCVポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、HCVポリヌクレオチド。
(項目9)
項目1に記載の単離されたHCVポリヌクレオチドであって、野生型HCVポリヌクレオチドのコドン36、コドン41、コドン43、コドン54、コドン148、コドン155、およびコドン156に対応するコドンが、4つのコドンの各々が、対応する該野生型HCVポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、HCVポリヌクレオチド。
(項目10)
HCV NS3プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたHCV改変体であって、野生型HCVポリヌクレオチドのコドン36、コドン41、コドン43、コドン54、コドン148、コドン155、およびコドン156からなる群より選択されるコドンに対応する該ポリヌクレオチドの少なくとも1つのコドンが、対応する該野生型HCVポリヌクレオチドのコドンによってコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸をコードするように変異されている、HCV改変体。
(項目11)
単離されたHCVプロテアーゼであって、野生型HCV NS3プロテアーゼの36位、41位、43位、54位、148位、155位、および156位からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸が、該野生型HCV NS3プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含む、HCVプロテアーゼ。
(項目12)
項目11に記載のHCVプロテアーゼであって、前記野生型HCV NS3プロテアーゼは、配列番号2のアミノ酸配列またはその一部分を含む、HCVプロテアーゼ。
(項目13)
項目11に記載のHCVプロテアーゼであって、HCV NS3プロテアーゼの生物学的に活性なアナログを含む、HCVプロテアーゼ。
(項目14)
項目11に記載のHCVプロテアーゼであって、HCV NS3プロテアーゼの生物学的に活性なフラグメントを含む、HCVプロテアーゼ。
(項目15)
項目11に記載のHCVプロテアーゼであって、NS4A補因子を含む、HCVプロテアーゼ。
(項目16)
抗HCVプロテアーゼ抗体であって、野生型HCV NS3プロテアーゼの36位、41位、43位、54位、148位、155位、および156位からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸が、該野生型HCV NS3プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含むHCV NS3プロテアーゼを認識する、抗HCVプロテアーゼ抗体。
(項目17)
ストリンジェントな条件下で、項目1に記載のHCVポリヌクレオチドの核酸配列にハイブリダイズ可能である、ヌクレオチドプローブまたはヌクレオチドプライマー。
(項目18)
項目1に記載のHCVポリヌクレオチドを含む発現系。
(項目19)
項目18に記載の発現系であって、ベクターを含み、該ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した項目1に記載のHCVポリヌクレオチドを含む、発現系。
(項目20)
項目19に記載のベクターでトランスフェクトされたか、形質転換されたか、または形質導入された宿主細胞。
(項目21)
mRNAディスプレイ系である、項目18に記載の発現系。
(項目22)
患者においてHCV感染のプロテアーゼインヒビターに対する薬物耐性または感受性を評価するための方法であって、該方法は、以下:
a)HCV感染患者からの生物学的サンプルを収集する工程;および
b)該サンプルが、野生型HCV NS3プロテアーゼの36位、41位、43位、54位、148位、155位、および156位からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸が、該野生型HCV NS3プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含むHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸を含むか否かを評価する工程
を包含する方法。
(項目23)
患者におけるHCV感染のための処置を指示するための方法であって、該方法は、以下:
a)項目22に記載の方法にしたがって、該患者のプロテアーゼインヒビターに対する薬物耐性または感受性を評価する工程;
b)a)において評価した該薬物耐性または感受性に基づいて、該患者のための処置レジメンを最適化する工程
を包含する方法。
(項目24)
患者におけるHCV感染を処置するための候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下:
a)項目10に記載のHCV改変体に感染したサンプルを提供する工程;
b)該サンプルにおける該HCV改変体の活性を阻害する該候補化合物の能力をアッセイする工程
を包含する方法。
(項目25)
項目24に記載の方法であって、前記HCV改変体の前記活性は、複製である、方法。
(項目26)
患者におけるHCV感染を処置または予防するための候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下:
a)項目1に記載のポリヌクレオチドを含むレプリコンRNAを提供する工程;
b)該候補化合物が、a)の該レプリコンRNAの複製を阻害するか否かを決定する工程を包含する方法。
(項目27)
患者におけるHCV感染を処置するための候補化合物を同定する方法であって、該方法は、以下:
a)項目11に記載の単離されたHCV NS3プロテアーゼおよびプロテアーゼ基質を提供する工程であって、該プロテアーゼおよび該基質は、細胞ベースの系または無細胞系の中に存在する、工程;
b)該HCV NS3プロテアーゼを該候補化合物と、該基質の存在下で接触させる工程;および
c)該HCV NS3プロテアーゼの活性が低下するか否かを決定する工程
を包含する方法。
(項目28)
患者におけるHCV感染を処置するための候補化合物を評価するための方法であって、該方法は、以下:
a)項目1に記載のポリヌクレオチドおよびインジケーターをコードする指示遺伝子を含むベクターを、宿主細胞に導入する工程;
b)該宿主細胞を培養する工程;および
c)該インジケーターを、該候補化合物の存在下および該候補化合物の非存在下で測定する工程
を包含する方法。
(項目29)
生物学的サンプルまたは医療用装置もしくは研究室装置のHCV汚染を除去するかまたは減少させる方法であって、該生物学的サンプルまたは該医療用装置もしくは該研究室装置を、項目24〜28のいずれか1項に記載の化合物と接触させる工程を包含する方法。
(項目30)
患者におけるHCV感染を処置する方法であって、該患者に、項目24〜28のいずれか1項に記載の化合物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目31)
VX−950に対し耐性であるHCV NS3プロテアーゼに対するVX−950の活性をレスキューし得る化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下:
a)項目1に記載のHCV NS3プロテアーゼを候補化合物と接触させる工程;
b)a)の該プロテアーゼの該活性を阻害するVX−950の能力をアッセイする工程
を包含する方法。
(項目32)
患者におけるHCV感染を処置する方法であって、該方法は、該患者に、薬学的有効量の項目31に記載の化合物を投与する工程を包含する方法。
(項目33)
項目32に記載の方法であって、前記化合物は、前記患者に、VX−950と組み合わせて投与される、方法。
(項目34)
項目32に記載の方法であって、前記化合物は、前記患者の処置においてVX−950と置き換わる、方法。
(項目35)
項目34に記載の方法であって、VX−950は、前記化合物が前記患者に投与された後に該患者に投与され、そしてVX−950の該活性がレスキューされている、方法。
(項目36)
HCV NS3プロテアーゼ活性を低減するために有効な化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下:
a)項目1に記載のHCV NS3プロテアーゼの三次元モデルを得る工程;
b)化合物を設計もしくは選択する工程;
c)a)の該プロテアーゼに結合するか、または該プロテアーゼと相互作用する該化合物の能力を評価する工程
を包含する、方法。
(項目37)
項目36に記載の方法であって、前記設計されたかもしくは選択された化合物のHCV
NS3プロテアーゼ活性を阻害する能力を、無細胞アッセイもしくは細胞ベースのアッセイで評価する工程をさらに包含する、方法。
(項目38)
項目36に記載の方法であって、前記設計されたかもしくは選択された化合物のHCV複製を阻害する能力を、感染細胞もしくは感染サンプル中でアッセイする工程をさらに包含する、方法。
(項目39)
機械読み取り可能データでコードされたデータ記憶マテリアルを含む機械読み取り可能データ記憶媒体であって、該機械読み取り可能データは、HCV改変体または生物学的サンプルに関連する少なくとも2つの特徴についての指標値を含み、ここで、該特徴は、以下:
a)プロテアーゼインヒビターに対する感受性の低下について耐性を示す能力;
b)野生型HCV NS3プロテアーゼの36位、41位、43位、54位、148位、155位、および156位からなる群より選択される少なくとも1つの位置におけるアミノ酸が、該野生型HCV NS3プロテアーゼの対応する各位置におけるアミノ酸と異なっているアミノ酸配列を含む、HCVプロテアーゼ;
c)患者の病的状態または回復可能性;ならびに
d)該HCV改変体の改変された(増大したかまたは減少した)複製能力
からなる群より選択される、機械読み取り可能データ記憶媒体。
(項目40)
HCV感染患者におけるHCV改変体のプロフィールを得る方法であって、該方法は、以下:
a)該患者から血漿サンプルを得る工程;
b)該血漿サンプルからの少なくとも2種のHCVビリオン由来のHCVプロテアーゼのヌクレオチド配列を決定する工程
を包含する方法。
(項目41)
項目40に記載の方法であって、少なくとも20種のHCVビリオンが同定される、方法。
(項目42)
項目40に記載の方法であって、少なくとも50種のHCVビリオンが同定される、方法。
(項目43)
項目40に記載の方法であって、少なくとも100種のHCVビリオンが同定される、方法。
(項目44)
項目40に記載の方法であって、少なくとも200種のHCVビリオンが同定される、方法。
(項目45)
項目40に記載の方法であって、なくとも500種のHCVビリオンが同定される、方法。
(項目46)
項目40に記載の方法であって、前記HCVプロテアーゼのヌクレオチド配列が、項目1に記載のポリヌクレオチドの配列を含む、方法。
(項目47)
項目40に記載の方法であって、前記患者が、プロテアーゼインヒビターで処置されている、方法。
(項目48)
項目40に記載の方法であって、少なくとも2つの血漿サンプルが、前記患者から少なくとも2回の異なる時点で得られる、方法。
(項目49)
生物学的サンプル中のHCV改変体の存在を検出するための方法であって、該生物学的サンプル中の項目1に記載のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を包含する、方法。
(項目50)
項目16に記載の抗体を含む、診断キット。
(項目51)
項目17に記載のヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む、診断キット。
本発明は、HCV改変体に関する。詳細には、プロテアーゼインヒビターに対する耐性を示すHCV改変体が、提供される。また、このHCV改変体に関する方法および組成物も、提供される。この方法および組成物は、ウイルス改変体(HCVおよび他のウイルスの改変体を含む)を同定し、そして抗ウイルス化合物を評価しそして同定し、そしてウイルス感染に対する治療を開発しそして最適化するために有用である。
本発明は、臨床試験(Study VX04−950−101)に含められた34人の被験体から、VX−950を投薬する前に単離されたHCVのNS3プロテアーゼドメインにおける配列ダイバーシティの程度を最初に特徴付けた研究に基づく。次いで、インビボでのVX−950に対する耐性の出現は、X−950を投薬する14日間の後の被験体におけるプロテアーゼNS3−4Aの配列分析によってモニタリングされた。フォローアップサンプルを、投薬の終了後さらに7〜10日間収集し、投薬の間に発生した何らかの薬物耐性変異が、VX−950の除去後も血漿中に維持されたか否かを見た。集団において基線より高く増大したことが見出された任意の変異を、潜在的薬物耐性変異とみなした。薬物耐性変異は、測定可能レベルまで蓄積するのに時間を要し得るので、この研究は、(野生型ウイルスおよびウイルス改変体の集団における優勢種ではなく)改変体の少数集団を検出するための新しい方法を含んだ。この方法は、1回の時点あたり、1人の被験体あたり多くの(例えば、80〜85個の)個々のウイルスクローンから配列を得、それによって、VX−950を投薬した14日間に出現し得たウイルス改変体を、集団の約5%の感度で検出し得そして同定し得た。このような80/85の個々のウイルスクローンは、80/85の異なるビリオンを表し得る。
本発明は、HCV改変体を提供する。詳細な実施形態において、HCV改変体は、プロテアーゼインヒビター(「改変体HCVプロテアーゼ」とも呼ばれる)、例えばVX−950に対する低下した感受性を有するHCVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書中で使用される場合、野生型HCVとは、プロテアーゼインヒビター(詳細な実施形態において、このプロテアーゼインヒビターは、VX−950である)に対する通常のまたは望ましい感受性を有するHCVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド(「野生型ポリヌクレオチド」とも呼ばれる)を含むHCVをいう。同様に、野生型HCVプロテアーゼとは、プロテアーゼインヒビター(詳細な実施形態において、このプロテアーゼインヒビターは、VX−950である)に対する通常のまたは望ましい感受性を有するHCVプロテアーゼをいう。
NSタンパク質3の部分をいう。例えば、NS3プロテアーゼは、配列番号2(685アミノ酸)の最初の631アミノ酸配列によって表されるNS3タンパク質であってもよい;あるいは、NS3プロテアーゼは、配列番号2の最初の181アミノ酸によって表されるタンパク質であってもよい;この181アミノ酸のフラグメントはまた、当該分野で、NS3プロテアーゼドメインとも呼ばれる。NS3プロテアーゼはまた、米国特許第6,653,127号;同第6,211,338号において記載される複合体のような、NS3−NS4Aタンパク質複合体であってもよい。「NS3プロテアーゼ活性」は、HCV NSタンパク質3またはその部分の、NS4Aタンパク質またはその生物学的に活性な部分の存在下もしくは非存在下におけるプロテアーゼ活性を意味する。NS4Aタンパク質(例えば、配列番号2の最後の54アミノ酸配列で表される)は、通常、NS3プロテアーゼについての補因子として機能し、そしてNS3−NS4Aセリンプロテアーゼ複合体を形成し得る;NS4Aタンパク質の生物学的に活性な部分とは、NS3プロテアーゼに対する補因子としてのNS4Aタンパク質の機能を維持する、NS4Aタンパク質のフラグメントを意味する。
本発明の別の局面は、本発明の化合物(例えば、VX−950の活性をレスキューし得ると同定された二次化合物、もしくはHCV改変体に対して有効であると同定された化合物(例えば、ウイルス改変体の複製を減少させ得る化合物)および/または改変体HCV
NS3プロテアーゼに対して有効であると同定された化合物(例えば、改変体プロテアーゼの酵素活性を低下させ得る化合物))を含有する薬学的組成物または処方物を提供する。。
「Peg−Intron」は、PEG−Intron(登録商標)(pegインターフェロンα−2b)を意味し、Schering Corporation、Kenilworth、NJ.から入手可能である;「Intron」は、Intron−A(登録商標)(インターフェロンα−2b)を意味し、Schering Corporation、Kenilworth、NJ.から入手可能である;「リバビリン」は、リバビリン(1−β−D−リボフラノシル−lH−l,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)を意味し、ICN Pharmaceuticals,Inc.、CostaMesa、Calif.から入手可能である;Merck Index、記載番号8365、第12版に記載される;また、Schering Corporation、Kenilworth、NJ.からのRebetol(登録商標)、またはHoffmann−La Roche、Nutley、NJ.からのCopegus(登録商標)としても入手可能である;「Pagasys」は、Pegasys(登録商標)(peg−インターフェロンα−2a)を意味し、Hoffmann−La Roche、Nutley、NJ.ぁら入手可能である;「Roferon」は、Roferon(登録商標)(組換えインターフェロンα−2a)を意味し、Hoffmann−La Roche、Nutley、NJ.から入手可能である;「Berofor」は、Berofor(登録商標)(インターフェロンα−2)を意味し、Boehringer Ingelheim Pharmaceutical,Inc.、Ridgefield、Conn.から入手可能である;Sumiferon(登録商標)(天然のαインターフェロン(例えばSumiferon)の精製混合物)は、Sumitomo、Japanから入手可能である;Wellferon(登録商標)(インターフェロンα n1)は、Glaxo Wellcome Ltd.、GreatBritainから入手可能である;Alferon(登録商標)(天然αインターフェロンの混合物)は、Interferon Sciencesによって製造され、Purdue Frederick Co.、CT.から入手可能である。
VX−950(研究VX04−950−101)についての、第1b相の無作為化盲検の用量増加臨床試験に参加した、遺伝子型1のHCVに感染した34人の患者が、この研究の被験体であった。全ての患者は、18歳と65歳との間の年齢であり、少なくとも105IU/mLの基線HCV RNAレベルを有し、そして、B型肝炎ウイルス(HBV)およびHIVに対してはネガティブであった。患者を3つの群に分け、連続した14日間にわたり、450(q8h)mg、750(q8h)mg、または1250(ql2h)mgのVX−950を与えた。各投薬群に、2人のプラシーボの患者を含んだ。研究の患者から、3つの時点において4ミリリットル(mL)の血液サンプルを採取した:投薬前日(基線サンプル)、投薬の14日目すなわち処置の終了時(ETRサンプル)、および、研究薬物の最後の投薬から7〜10日目(追跡サンプル)。血液を前腕の静脈の静脈穿刺によりEDTA(K2)抗凝固薬を含むチューブに採取した。10分間の遠心分離により血漿を分離し、凍結し、そして、−80℃にて6ヶ月を下回る期間にわたり保存した。配列解析のために、この血漿からビリオンを単離した。
HCVの配列解析を、血漿ウイルスからの534塩基対(bp)の全NS3セリンプロテアーゼ領域を含むHCV RNAフラグメントの半ネスト化逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)による増幅によって行った。変性条件下でビリオンを溶解し、そして、標準的な市販のシリカゲル膜結合法(QIAamp Viral RNA Minikit;Qiagen,Valencia,CA)を用いて、HCV RNAを単離した。ウイルスRNAからNS3セリンプロテアーゼ領域を含む相補鎖DNA(cDNA)フラグメントを合成し、そして、市販の1段階逆転写酵素PCR(Superscript III RNase H−Reverse Transcriptase with High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase;Invitrogen Corp,Carlsbad,CA)を用いて増幅した。912bpのNS3のコード領域を、NS3領域に隣接するプライマー(NS3−1b−1s:GGCGTGTGGGGACATCATC(配列番号3);およびNS3−1b−3a:GGTGGAGTACGTGATGGGGC(配列番号4))を用いて増幅した。1×専売反応緩衝液中0.5μMのプライマー(Invitrogen Custom Primers)、0.2mMのdNTPs(Invitrogen Corp)、1.2mMのMgSO4および34.8単位のRNAガード(guard)(ブタRNaseインヒビター,Amersham Biosciences)の最終濃度において、各サンプルにつき2ラウンドのネストPCRを行った。反応混合物を、まず、30分間の逆転写反応のために47℃でインキュベートし、その後、94℃での変性段階を3分間、次いで、94℃で30秒間、51℃で30秒間そして68℃で45秒間の30サイクルを行った。最初のPCR産物を1:10に希釈し、そして、1.25単位のAccuPrime Pfx DNAポリメラーゼ、0.5μMのプライマー(NS3−1b−1sおよびNS3−1b−4a;CATATACGCTCCAAAGCCCA(配列番号5))、0.3mMのdNTPs、1mMのMgSO4、および1×反応緩衝液を用いた、別の半ネスト化反応において使用した。外側PCRからのDNA産物を、94℃で3分間変性させ、そして、94℃で30秒間、53℃で30秒間そして68℃で30秒間の30サイクルで増幅した。次いで、このPCRからのDNAを、1%アガロースゲル上で分離し、そして、QIAquick Gel Extractionキット(Qiagen)を用いて、適切なサイズの生成物(830bp)を精製した。次いで、単離したDNAを、Zero Blunt TOPO PCR Cloningキット(Invitrogen Corp)を用いてクローニングした。クローニングプレートを、SeqWright(Houston,TX)に送り、ここで、96個のクローンを増幅し、そして、患者ごと時点ごとに配列決定した。
配列を整列させ、そして、ソフトウェアMutational Surveyor(SoftGenetics,State College,PA)を用いて変異について解析した。NS3プロテアーゼのN末端の543個のヌクレオチド(181アミノ酸)を解析した。各患者についてのコンセンサス配列を、84個の基線配列の平均から明らかにし、そして、14日目と、追跡中(研究薬物の最終投薬から7〜10日後)に各患者について81個の配列の平均を得た。PHYLIP(Felsenstein,J.1993.PHYLIP(Phylogeny Inference Package)バージョン3.5c.著者により配布。Department of Genetics,University of Washington,Seattle,WA)Dnadist and Quick Tree(http://www.hcv.lanl.gov/content/hcv−db,2005年6月にアクセスした)を用いて、系統樹を作製した。
HCV NS3プロテアーゼのMet1〜Ser181をコードするDNAフラグメントを、各HCV改変体に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、患者からの単離体の選択されたプラスミドクローンから増幅した。DNAフラグメントを、前にはHCV NS3プロテアーゼの181残基が、そして、後ろにはC末端のヘキサヒスチジンタグ(配列番号6)がある状態でEscherichia coli発現プラスミドpBEV11へとクローニングした。次いで、組換え6×Hisタグ(配列番号6)化NS3プロテアーゼを、以前に刊行された漏出発現法(4)を用いて、E.coliにおいて発現させた。NS3プロテアーゼ発現プラスミドを用いて新たに形質転換したE.coli BL21(DE3)の5〜7個の単離したコロニーを用いて、100μg/mLのカルベニシリンを含む5mLのLB培地を播種した。これらの接種培養物を、OD620が0.3と1との間に達するまで、振盪させながら(250rpm)、37℃にてインキュベートし、次いで、これを用いて、250mLのエルレンマイアーフラスコ中で、100μg/mLのカルベニシリンを含有する50mLの4×TY培地(32g/Lのトリプトン、20g/Lの酵母抽出物、5g/LのNaCl)を播種した(最初のOD620は約0.010であった)。この発現培養物を、周囲温度(約25℃)にて250rpmで振盪させながら24時間インキュベートした。3000×gで30分間遠心分離させることにより細胞を回収し、このペレットを即座に−80℃のエタノール浴内で凍結し、そして、プロテアーゼを精製するまで−80℃にて保存した。
VX−950プロテアーゼインヒビターおよびBILN 2061プロテアーゼインヒビターの両方を含む96ウェルマイクロタイタープレート(Corning NBS 3990)において、刊行されたように(7)して、インビトロプロテアーゼ活性をアッセイした。BILN 2061は、Boehringher Ingelheim,Laval,Quebec,Canadaにより発見されたHCV NS3・4Aプロテアーゼインヒビターである。簡単に述べると、プロテアーゼを5μMの補因子KK4Aと共に25℃にて10分間、そして、30℃にて10分間インキュベートした。DMSO中で段階希釈したプロテアーゼインヒビター(VX−950またはBILN 2061)を加え、そして、30℃にてさらに15分間インキュベートした。5μMのRET−S1(Anaspec Inc.San Jose,CA)および内部クエンチした蛍光デプシペプチド基質を加えることにより反応を開始し、30℃にてインキュベートした。Tecan SpectraFluorPlusプレートリーダーにおいて、生成物の放出を20分間モニターした(360nmにおいて励起、そして500nmにおいて放射)。データを、シンプルなIC50の式:Y=V0/(1+(X/IC50))にフィットさせた。
内部でクエンチした蛍光デプシペプチド基質であるRET−S1(Ac−DED(EDANS)EEαAbuψ[COO]ASK(DABCYL)−NH2(配列番号7))(Talianiら(1996)Anal.Biochem.240(1),60−67)を用いて、基質の反応速度論パラメーターを決定した。プロテアーゼを、50mM HEPES(pH7.8)、100mM NaCl、20% グリセロール、5mM ジチオスレイトール中5μMの補因子ペプチドKK4A(KKGSVVIVGRIVLSGK(配列番号8))(Landroら(1997)Biochemistry 36(31),9340−9348)と共に、25℃にて10分間、そして、30℃にて10分間事前インキュベートした。RET−S1基質(Anaspec Incorporated,San Jose,CA)を加えることにより反応を開始し、30℃にて10分間インキュベートした。アッセイの総容量は100μLであった。この反応を、25μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えることによりクエンチした。反応生成物を、40℃に加熱した逆相マイクロボア高速液体クロマトグラフィーカラム(Penomenex Jupiter 5μ C18 300 Aカラム,150×2.0mm)において分離した。H2O/0.1% TFA(溶媒A)およびアセトニトリル/0.1% TFA(溶媒B)を用い、流速は0.2ml/分であった。以下のとおりに線形勾配を用いた:1分間にわたり5%〜30%の溶媒B、15分間にわたり30%〜40%の溶媒B、次いで、1分間にわたり、40%〜100%の溶媒B、3分間の定組成、その後、1分間で100%〜5%のB、そして、10分間5%のBにおける平衡。DABCYL−ペプチド生成物を500nmにおいて検出し、そして、代表的には、17分付近で溶出した。GraphPrismソフトウェアを用いてデータをミカエリス−メンテン式にフィットさせることにより、Kmを決定した。
以前に刊行されたようにして(Linら(2004)J.Biol.Chem.279(17),17508−17514)、NS3プロテアーゼドメイン改変体のテラプレビルに対する感受性を96ウェルマイクロタイタープレート(Corning NBS 3990;Corning,NY)において決定した。簡単に述べると、NS3プロテアーゼドメインを、50mM HEPES(pH7.8)、100mM NaCl、20% グリセロール、5mM ジチオスレイトール中5μMのKK4Aと共に、25℃にて10分間、そして、30℃にて10分間事前インキュベートした。DMSO中で段階希釈したテラプレビルをこのプロテアーゼ混合物に加え、そして、30℃にてさらに60分間インキュベートした。5μMのRET−S1基質を加えることにより反応を開始し、30℃にてインキュベートした。Tecan SpectraFluorPlusプレートリーダー(Tecan US,Durham,NC)において、生成物の放出を20分間モニターした(360nmにおいて励起、そして500nmにおいて放射)。アッセイの総容量は100μlであった。アッセイの経過の間に、10〜20%の基質がターンオーバーするように、プロテアーゼの濃度を選択した。見かけの阻害定数(Ki(aap,1h))の値を計算するために、GraphPrismソフトウェアを用いて、密な結合阻害についてのMorrisonの式(38)の積分形態にデータをフィットさせた。定常状態アッセイは、野生型の酵素と、全てのR155K/T/I/S改変体とが、検出限界(100μM)よりも高いRET−S1についてのKmを有したことを示した。従って、Ki(aap,1h)値を計算するために、Kmを100μMに設定した。Kmを有意に下回る基質濃度(5μM)において、インヒビター研究を行った。それゆえ、真のKmと、計算に使用したKmとの間の偏差は、Ki(aap,1h)の計算において無視できる作用を有するはずである。
各患者のHCV集団についてのコンセンサス配列を、HCV cDNAを含む84の独立したプラスミドクローンの平均から導いた。コンセンサス配列の系統解析は、配列が患者特異的であったことを示した(図1)。平均した患者間のアミノ酸準種の複雑性(intra−patient amino acid quasispecies complexity)(Shannonエントロピー)および多様性(Hamming距離)は低く(それぞれ、0.332±0.109および0.421±0.195)、準種の異質性と、基線におけるHCV RNA血漿濃度との相関性は観察されなかった。患者内のアミノ酸の多様性(この試行においては、個々のコンセンサスを、患者の遺伝子型1aまたは1bのコンセンサス配列と比較した)は、遺伝子型1aについて1.3%であり、そして、遺伝子型1bについて2%であった。構造モデリング解析は、全ての患者のコンセンサス配列間で観察されるサブタイプ内のアミノ酸の差は、VX−950の結合に対してほとんど影響を有さないか、または、影響がないものと予測した。
処理終了時(ETR)のHCV NS3プロテアーゼ配列を、各患者について基線でのコンセンサス配列と比較して、潜在的耐性変異を同定した。80配列の平均を各ETRサンプルについて得て、そして181の位置の各々での改変体のパーセントを計算した。最初に、ETRサンプルの任意の1アミノ酸位置での、基線と比較して5%以上の頻度の増加を、潜在的耐性変異であると考えた。5%カットオフ値を用いた。なぜなら、これは、分析したクローン数およびPCRの誤りの割合に基づく本発明者らの配列決定プロトコルのより低いレベルの感度であったからである。基線で多型である部位での変化は、耐性変異とは考えなかった。投薬の終了時のみに存在して複数の患者において観察された部位での変化を、潜在的耐性変異であると考え、次いでこれらを全ての患者において分析した。
HCV RNAにおいて2より大きなlog10低下でVX−950に対して最初に応答したが、VX−950を投薬しながらも最終的に跳ね返りし始めた、13人の患者が存在した。これらの13人の患者のうち、6人は450mgのq8h用量群であり、1人は750mgのq8h用量群であり、そして6人は1250mgのq12h用量群であった。完全な配列分析は、14日目のこれらの患者のうち11人について利用可能である(表1)。これらの患者の全てが、36位の変異における顕著な増加を有した。36位では、遺伝子型1bの患者では、野生型バリンがアラニン(V36A)に変異し(平均60%、範囲31%〜86%)、そして遺伝子型1aの患者では、アラニンまたはメチオニン(V36M)のいずれかに変異した(平均62%、範囲18%〜90%)。サブタイプ1bにおいてV36Mが存在しないのは、サブタイプ1aにおいてはほんの1つの変化であるのに対して、サブタイプ1bにおいては2つのヌクレオチド置換が必要であることによるようである。V36A変異は、サブタイプ1aまたは1bのいずれにおいても1ヌクレオチド変化を必要とする。36位でのグリシンへの変異(V36G)もまた、遺伝子型1bの患者においてみられ、ロイシンへの変異(V36L)は1a患者においてみられたが、その頻度はずっと低かった。3人の患者はまた、54位において、トレオニンからアラニンへの変異(T54A)(平均35%、範囲8%〜67%)を有し、より低い頻度でセリンへの変異(T54S)を有した。興味深いことに、36位および54位での変異は、相互に排他的であるようである。さらに、遺伝子型1aである、この群における全ての患者は、155位においてアルギニンからリジン(R155K)またはトレオニン(R155T)のいずれかへの変異(平均60%、範囲22%〜99%)を、そしてより低い頻度でイソロイシン(R155I)、セリン(R155S)、メチオニン(R155M)またはグリシン(R155G)への変異を含んだ。R155におけるこれらの変異がサブタイプ1a患者に制限されるという観察もまた、1b患者においては基線からの2つのヌクレオチドの変化を必要とするのに対して、1a患者においては1ヌクレオチドの変化を必要とすることによるようである。この群からの追跡サンプルにおいては、野生型ウイルスは、再度出現し始めたが、ETRにおいて見られた全ての変異は、おそらくウイルスの適応度の相違に起因して頻度は異なるが、依然として存在した。配列決定サンプルは、各患者に関して跳ね返りが最初に観察された時点では利用可能ではなく、それゆえ、他の変異がそれよりも前に存在していたのかは明確ではない。
次の群(n=8)において、患者は、VX−950に最初は応答したが、それらのHCV RNA応答は安定化され、低下し続けなかったが、HCV RNAの増加はみられなかった。これらの患者のうちの2人は450mg q8h用量群であり、2人は750mg q8h用量群であり、そして4人は1250mg q12h用量群であった。分析は、14日目にこれらの患者のうちの5人について完了する(表1)。全ての患者は、156位においてアラニンからバリン(A156V)またはトレオニン(A156T)への変異を発達させ、そして非常に稀な頻度でセリン(A156S)またはイソロイシン(A156I)への変異を発達させた。このA156V/T変異は、この群における患者のうちの3人において非常に高い頻度(100%)で見られ、そして他の変異はこれらの患者において見られなかった。他の2人の患者(02104および12308)は、それぞれ、8%のA156T変異ウイルスおよび30%のA156V変異ウイルスを有するのみであったが、これらの患者はまた、他の位置において変異を有した(患者02104に関しては47%のV36A/Mおよび36%のR155K/T;患者12308に関しては68%のT54A)。跳ね返り群からの1人の患者02102はまた、類似の頻度(11%)の変異を156位に有した。追跡時間点では、156位の変異は、野生型ウイルスまたは36位、54位および/もしくは155位の変異を有する変異のいずれかによってほぼ完全に置き換えられた。156位のセリンへの変化(A156S)は、VX−950のインビトロ耐性研究(7)の間に見られた優勢な変異であった。A156V/T変異もまた、インビトロ研究(7)においてVX−950およびBILN 2061の両方に対する交差耐性として同定された。
残りの7人の患者は、HCV RNAレベルが14日間の投薬期間全体を通して継続的に減少して、VX−950に応答した。これらの患者のうちの5人は、750mg q8h用量群であり、そして2人は450mg q8h用量群であった。これらの患者は、14日目に非常に低いレベルのHCV RNA(64IL/mLから検出不可能(<10 IL/mL))を有し、そして配列決定データは、この時点では得られなかった。しかし、HCV cDNAは、これらの患者に関して追跡サンプルから成功裏に増幅された。そして分析は、これらの7人の患者のうち6人について完了している(表1)。14日目までに検出不可能なレベルに達した遺伝子型1aの患者(03205)は、追跡の時点で3つの変異(V36A/M(67%)、T54A(11%)、およびR155K/T(26%))を有した。追跡において、2人の遺伝子型1bの患者は、V36A変異(21%および25%)およびT54A変異(54%および20%)を有し、そして別の2人の1b患者は、ほんの低レベルのV36A変異(3%および9%)およびT54A変異(6%および1%)を有した。14日目に検出不可能なHCV RNAレベル(<10IL/mL)を有した最後の1b患者においては、変異は、追跡において検出されなかった。
患者において見出された二重変異の頻度もまた分析した。36位の変異が、155位(36/155二重変異)および156位(36/156二重変異)の両方での変異と組み合わせて見出された。遺伝子型1aの患者のみが、36/155二重変異を有した。これは、14日目のETRにおいて、跳ね返り群において分析された8人全ての1a患者(平均27.6%、範囲10%〜77%)およびプラトー群における2人の1a患者のうちの1人(9%)において見られた。36/156二重変異は、ずっと頻度が低く、そして14日目のETRにおいて、跳ね返り群において3人の患者(3%、範囲1%〜5%)およびプラトー群において2人の患者(1%および4%)において見出された。二重変異もまた、追跡サンプルにおいて、36/155については類似の頻度で見出されたが、36/156については、ETRサンプルと比較してより低い頻度で見出された。低下し続けた患者の群に関しては、ほんの1人の患者が36/155二重変異を有したが、これは、5%で存在した。
82個の独立した配列決定クローンの平均を遺伝子型分析に供したので、表1に示すように、各患者においてビリオンの混合物が存在した。上記配列分析において見られた全ての変異体(V36A/M/G、T54A/S、R155K/T/M/G/S、およびA156T/V/S)の酵素、ならびにインビボで見出されたこれらの変異の任意の観察された組み合わせのIC50を、少なくとも2つの異なる患者特異的な遺伝的背景において決定した。1つの遺伝子型内の全ての患者に関する基線IC50は、実施例6において報告されたとおり類似していた。耐性プロテアーゼの酵素のIC50値は、遺伝子型1a HCV−H参照株と比較して倍数変化と報告されている。この参照株のIC50は、この酵素アッセイにおいて64nMであることが見出された。
ここで行った遺伝子型分析は、各患者内での異なる耐性変異の相対比率の詳細な実験を可能にした。これらのウイルス混合物によって付与される表現型耐性のレベルをより良く理解するために、調査分析を行って、各患者に関する平均表現型を得た。所定の単一変異または二重変異内のビリオンのパーセントに、所定のその変異体に関する酵素IC50内の平均倍率変化(表3)をかけ、次いで全ての値を各患者に加えた。相対数(100によって割った値)を、表1の最後の欄に示す。跳ね返り群の患者に関する平均値は、14日目に27(範囲6〜70)であり、そして追跡において15(範囲3〜29)であった。プラトー群の患者に関する平均値は、14日目に272(範囲26〜466)であり、そして追跡において32(範囲1〜126)であった。低下し続けた最後の群の患者は、追跡において平均値4を有した(範囲0〜10)。これらの非常に予備的な計算から、全ての患者群における耐性のレベルは、最後の用量の後に(14日目から追跡まで)低下したようである。このことは、予想外ではない。なぜなら、薬物圧は、耐性ビリオンの選択に関してもはや存在しないからである。跳ね返り群の患者が、プラトーである患者よりも低いレベルの耐性を有するようでもある。薬物動態学的データと耐性パターンとを相関させる分析が現在行われている。
これらのウイルス改変体の耐性プロファイルに加えて、これらのウイルス改変体の別の重要な局面は、適応度のレベルである。単一変異体および二重変異体のウイルス適応度を計算した(表4)。所定の時点での個々の患者における各HCV改変体の感染単位の絶対数(IU/mL)を決定した。例えば、14日目の患者03201におけるA156V/T変異内の改変体の感染単位の絶対数を以下の通りに計算した:VLd14(A156V/T,3201)=VLd14(全体,3201)×% A156V/Td14(3201)。投薬終了時(14日目,VLd14(全体,3201))または追跡(21日目,VLd21(全体,3201))のいずれかでの総HCV RNAを、Roche COBAS Taqman HCVアッセイによって決定したとおりの血漿HCV RNAレベルの分析から得た。検出不可能なレベルのHCV RNAは、5IU/mLであると考えられた。投薬終了時(14日目,%A156V/Td14(3201))または追跡(21日目,%A156V/Td21(3201))のいずれかでの各個々の改変体群(例えば、A156V/T)の百分率を、上記の配列分析から得た(表1)。次に、投薬後(14日目〜21日目)の個々の患者の血漿中の各HCV改変体およびHCV集団全体に関する血漿HCVウイルス量の正味の増加倍率(NVL)を決定した。例えば、
NVL(A156V/T,3201)=VLd21(A156V/T,3201)/VLd14(A156V/T,3201)
NVL(全体,3201)=VLd21(全体,3201)/VLd14(全体,3201)
各HCV改変体のNVLを、各患者における血漿HCV集団全体のNVLに対して正規化した:%NVL(A156V/T,3201)=NVL(A156V/T,3201)/NVL(全体,3201)。
NS4Aペプチド補因子との複合体におけるHCV−H株プロテアーゼドメインの精製されたR155K改変体(Kimら,(1996)Cell 87(2),343−355)(濃度8.0mg/ml)を、結晶化試験に用いた。このタンパク質の結晶を、0.1M MES(pH6.2)、1.4M NaCl、0.3M KH2PO4、および10mM β−メルカプトエタノールのレザバ液体で成長させた。単結晶を、2日間にわたる平衡化後にぶら下げた液滴において得た。0.15×0.15×0.35mmの寸法の単結晶を、窒素ガス流中で100Kまで瞬間冷却(flush−cool)される直前に25%グリセロールが添加された母液の凍結防止剤溶液中に移した。回折像を、ALSビームライン5,01に取り付けられたCCD4画像プレート機器を用いて収集した。2.5Åの解像度でのデータを指数化し、そしてHKL(2000,HKL Incorporated,Charlottesville,VA)およびCCP4ソフトウェアを用いて統合した。これらの結晶は、a=225.31Å、b=225.31Å、c=75.66Å、α=90.00°,β=90.00°およびγ=120.00°の単位格子寸法を有する空間群R32に属する。後の精密化において試験自由R因子に割り当てられたデータの5%が存在する。ここで研究したR155K改変体の結晶は、以前に公開された野生型プロテアーゼNS3−4Aの結晶格子(Kimら,前出)と同一の結晶格子を有する。公開されたNS3−4Aプロテアーゼドメイン(PDBコード:1A1R)を用いて、このモデルの最初の剛体および位置精密化を行った。残基155の側鎖における相違がArgの代わりのLysであることを電子密度地図において確認した。このタンパク質分子を、QUANTAプログラムを用いて電子密度地図に対して視覚的に調べた。さらに、20.0から2.5Åの解像度の範囲で精密化および個々のB因子精密化において溶媒分子を含ませることにより、R因子および自由R因子がそれぞれ22.0%および24.7%に減少した。精密化モデルに含まれた残基は、結晶非依存性分子および2つのZn金属イオンに関して、NS3プロテアーゼドメインのアミノ酸1〜181およびNS4A補因子の残基21〜39の範囲に及ぶ。
テラプレビルを、以前に記載された手順(Linら,前出)に従って、NS4A補因子ペプチドとの複合体におけるR155K改変体アポ酵素のX線結晶構造を用いてR155K改変体NS3プロテアーゼドメインの活性部位にモデル化した。テラプレビルのケトアミド基をモデル化して、si面付着のSer139側鎖を有する共有結合付加物を形成した。この結合モードは、類似のケトアミドインヒビター(Perniら,(2004)Bioorg.Med.Chem.Lett.14(6),1441−1446)およびケト酸インヒビター(Di Marcoら,(2000)J.Biol.Chem.275(10),7152−7157)に関して観察された。このインヒビターの主鎖は、これらのケトアミドインヒビターおよびケト酸インヒビターの類似の主鎖上に重ねられた。その結果、テラプレビル主鎖は、以下の骨格水素結合の全てを作成する:Lys155カルボニルとのP1 NH、Ala157 NHとのP3カルボニル、Ala157カルボニルとのP3 NH、およびCys159のNHとのP4キャップカルボニル。この結合モードでは、Lys155側鎖を移動することを全く必要とせずに、テラプレビルのP2基をS2ポケットに配置した。テラプレビルのt−ブチル基およびシクロヘキシル基を、それぞれ、S3ポケットおよびS4ポケットに配置した。このインヒビターを、2段階でエネルギーを最小化した。第1段階では、このインヒビターおよびこのプロテアーゼのArg123、Lys155、およびAsp168の側鎖原子のみを、1000工程のエネルギー最小化中に移動させた。第2段階では、このプロテアーゼの全ての側鎖原子を、さらに1000工程についてこのインヒビターとともに移動させた。このモデル化構造は、以前に記載された野生型NS3プロテアーゼの活性部位でのテラプレビルモデル(Linら,前出)を密接に模倣する。Lys155側鎖または他の活性な残基の側鎖の位置での有意なシフトは観察されなかった。同じ手順をテラプレビルを、NS3プロテーアゼドメインのR155T改変体の活性部位にドッキングさせるために繰り返した。しかし、この場合の酵素の構造は、X線結晶構造ではなく、R155K改変体結晶構造を用いて構築されたモデルである。Lys155残基をThr側鎖で置換し、そしてThr155側鎖以外の固定された酵素の全ての原子を保持することにより最小化した。このモデルでは、Thr155側鎖のヒドロキシル基は、Asp81の側鎖と水素結合を形成する。全てのモデリングおよび最小化の手順を、QUANTA分子モデリングソフトウェア(Accelrys Incorporated,San Diego,CA)を用いて実施した。
酵素アッセイおよび構造研究からの結果を、本発明の特定の改変体についての上記の考察に加えてここに提示する。
正に荷電したアミノ酸(Lys)を含めた別の残基によるArg155の置換が、テラプレビルに対する感受性の欠如をなぜもたらすのかを理解するために、R155K NS3プロテアーゼのX線結晶構造を決定した。R155K変異を操作して、NS4A補因子ペプチドと共複合体化した野生型プロテアーゼの構造を決定するために以前に用いられたT7−タグ融合HCV−Hプロテアーゼ構築物にした。2.5Åの解像度での、NS4A補因子ペプチドと共複合体化したR155Kプロテアーゼドメインのアンサンブル構造は、以前に記載された野生型HCV−H株プロテアーゼ複合体のアンサンブル構造(Kimら,前出)と非常に類似する。手短に述べると、1分子のNS3プロテアーゼドメイン(残基1〜181)および1分子の補因子NS4A(残基21〜39)は、球状の実体を形成し、これは次いで、非対称単位において、別の球状実体とのホモダイマーを形成する。NS4A補因子との複合体におけるLys155改変体プロテアーゼの1つの球状単位は、野生型Arg155共複合体と重なった。Cα原子のrms偏差はほんの0.314Åであったので、これらの2つのプロテアーゼの構造にはほとんど相違が存在しない。
テラプレビルとNS3プロテアーゼとの間の相互作用の構造モデルが以前に記載されている(例えば、Linら,前出)。R155K酵素とのテラプレビルの共複合体のモデルでは、残基155の側鎖での相違以外は、同じ相互作用が維持された。野生型プロテアーゼ構造では、Arg155側鎖は、テラプレビルの二環式P2基上で曲がって、いくつかの直接的ファンデルワールス接触を行い、そしてテラプレビルのP2基に疎水性環境を提供する(図26(A))。しかし、R155K酵素のLys155側鎖は、伸びたコンホメーションを有し、そしてP2基との1つまたは2つのみの直接接触を行い、従って、テラプレビルのP2基を、溶媒に対してより露出させたままにする(図26(B))。この観察は、インビトロ酵素アッセイで示されたように、R155K酵素がテラプレビルに対して感受性がより低いことと一貫している。R155M改変体がMet155側鎖の伸びたコンホメーションを有し、それゆえ、インヒビターの結合の観察された減少と一貫して、テラプレビルのP2基との同様により少ない相互作用を有すると仮定することは合理的である。
1つの研究は、VX−950が14日間投薬された遺伝子型1のC型肝炎を有する被験体におけるHCVプロテアーゼNS3−4A領域の配列分析により、VX−950単独療法に対する薬物耐性変異の可能な出現をモニタリングすることであった。伝統的に、抵抗性遺伝子型決定は、集団ベースの配列決定によって行われている。これは、血漿ウイルスにおける優勢な配列を検出する。ウイルス集団のうちの20%未満を構成するあらゆる配列は、この方法によっては検出されない。薬物耐性変異は、14日間よりも長くかかって、この測定可能なレベルを蓄積し得るので、改変体のマイナーな集団を検出するための新たな方法が開発された。配列を、1つの時点で1人の被験体から約80〜85の個々のウイルスクローンから得て、その結果、集団のうちの約5%まで低下した感度で、VX−950の14日間の投薬中に出現し得る耐性変異が同定され得る。
bVX−950の最初の投薬からの日数
c82クローンの平均に基づく割合
d(アミノ酸位置の変異%)×(全ての単一および二重変異についてのアミノ酸についてのIC50の平均の倍数変化)/100の合計
eETR=処置の終了(14日目)
fFU=追跡(ETR後、7〜10日)
gn/a=利用可能ではない(進行中)
hnd=検出不能。
Claims (22)
- セリンプロテアーゼ活性を有するHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたC型肝炎ウイルス(HCV)ポリヌクレオチドであって、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つのコドン位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、ポリヌクレオチド。
- 前記核酸配列が、配列番号1の核酸配列の1位〜543位までの領域と少なくとも60%の配列同一性を有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記核酸配列が、配列番号1の核酸配列の1位〜543位までの領域と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記核酸配列が、配列番号1の核酸配列の1位〜543位までの領域と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- セリンプロテアーゼ活性を有するHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む単離されたC型肝炎ウイルス(HCV)改変体であって、該核酸配列は、配列番号2のアミノ酸位置36位または156位に対応する配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つのコドン位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、HCV改変体。
- セリンプロテアーゼ活性を有する単離されたC型肝炎ウイルス(HCV)プロテアーゼであって、該プロテアーゼは核酸配列によってコードされ、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つのコドン位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置におけるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、HCVプロテアーゼ。
- セリンプロテアーゼ活性を有するC型肝炎ウイルス(HCV)NS3プロテアーゼに対して特異的に結合する抗HCVプロテアーゼ抗体であって、該プロテアーゼは、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位および156位からなる群より選択される位置に対応する少なくとも1つの位置において、アミノ酸残基が、配列番号2の対応する各位置におけるアミノ酸残基と異なっているアミノ酸配列を含み、但し、該抗体は、配列番号2のアミノ酸位置79〜83位からなるエピトープに結合する抗体を除く、抗HCVプロテアーゼ抗体。
- 請求項1に記載のHCVポリヌクレオチドを含む発現系。
- 請求項8に記載の発現系であって、ベクターを含み、該ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した請求項1に記載のHCVポリヌクレオチドを含む、発現系。
- 請求項9に記載のベクターでトランスフェクトされたか、形質転換されたか、または形質導入された宿主細胞。
- mRNAディスプレイ系である、請求項8に記載の発現系。
- 患者においてC型肝炎ウイルス(HCV)感染のプロテアーゼインヒビターに対する薬物の耐性または感受性を評価するための指標として、セリンプロテアーゼ活性を有するHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸配列であって、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応するコドン位置においてコドン変化を有する核酸配列、の存在または不在を用いる方法であって、該方法は、以下:
a)該HCV感染患者から収集した生物学的サンプルが、セリンプロテアーゼ活性を有するHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸配列を含むか否かを評価する工程であって、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位および156位からなる群から選択されるコドン位置に対応する少なくとも1つのコドン位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、工程
を包含する方法。 - 患者におけるC型肝炎ウイルス(HCV)感染を処置するための候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下:
a)セリンプロテアーゼ活性を有するHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むHCV改変体に感染したサンプルを提供する工程であって、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つのコドン位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、工程;
b)該サンプルにおける該HCV改変体の活性を阻害する該候補化合物の能力をアッセイする工程
を包含する方法。 - 請求項13に記載の方法であって、前記HCV改変体の前記活性は、複製である、方法。
- 患者におけるC型肝炎ウイルス(HCV)感染を処置または予防するための候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下:
a)セリンプロテアーゼ活性を有するHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むレプリコンRNAを提供する工程であって、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つの位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、工程;
b)該候補化合物が、a)の該レプリコンRNAの複製を阻害するか否かを決定する工程を包含する方法。 - 患者におけるC型肝炎ウイルス(HCV)感染を処置するための候補化合物を同定する方法であって、該方法は、以下:
a)セリンプロテアーゼ活性を有する単離されたHCV NS3プロテアーゼおよびプロテアーゼ基質を提供する工程であって、該プロテアーゼは1位〜543位までの核酸配列によってコードされ、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つの位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、該プロテアーゼおよび該基質は、細胞ベースの系または無細胞系の中に存在する、工程;
b)該HCV NS3プロテアーゼを該候補化合物と、該基質の存在下で接触させる工程;および
c)該HCV NS3プロテアーゼの活性が低下するか否かを決定する工程
を包含する方法。 - 患者におけるC型肝炎ウイルス(HCV)感染を処置するための候補化合物を評価するための方法であって、該方法は、以下:
a)セリンプロテアーゼ活性を有するHCV NS3プロテアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよびインジケーターをコードする指示遺伝子を含むベクターを、宿主細胞に導入する工程であって、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つの位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、工程;
b)該宿主細胞を培養する工程;および
c)該インジケーターを、該候補化合物の存在下および該候補化合物の非存在下で測定する工程
を包含する方法。 - C型肝炎ウイルス(HCV)感染患者から収集した生物学的サンプルまたは医療用装置もしくは研究室装置のHCV汚染を除去するかまたは減少させる方法であって、該生物学的サンプルまたは該医療用装置もしくは該研究室装置を、請求項13〜17のいずれか1項に記載の化合物と接触させる工程を包含する方法。
- C型肝炎ウイルス(HCV)感染患者から収集した生物学的サンプル中のHCV改変体の存在を検出するための方法であって、該生物学的サンプル中のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を包含し、該ポリヌクレオチドは、セリンプロテアーゼ活性を有するHCV
NS3プロテアーゼをコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、配列番号1のコドン位置36位または156位に対応する少なくとも1つの位置においてコドン変化を有し、そして該コドン変化は、配列番号2のHCV NS3プロテアーゼアミノ酸配列の36位または156位に対応する位置における対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置36位における該コドン変化は、MおよびGからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じ、そして、配列番号1のコドン位置156位における該コドン変化は、SおよびIからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする核酸配列を生じる、方法。 - 前記核酸配列が、配列番号1のコドン位置36位、54位および156位からなる群から選択されるコドン位置に少なくとも1つのさらなるコドン変化を有し、該コドン位置が、それぞれ、配列番号2のアミノ酸位置36位、54位および156位に対応する、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記核酸配列が、配列番号1のコドン位置36位、54位および156位からなる群から選択されるコドン位置に少なくとも1つのさらなるコドン変化を有し、該コドン位置が、それぞれ、配列番号2のアミノ酸位置36位、54位および156位に対応する、請求項5に記載の単離されたHCV改変体。
- 前記プロテアーゼが、配列番号1のコドン位置36位、54位および156位からなる群から選択されるコドン位置に少なくとも1つのさらなるコドン変化を有する核酸配列によってコードされ、該コドン位置が、それぞれ、配列番号2のアミノ酸位置36位、54位および156位に対応する、請求項6に記載の単離されたHCVプロテアーゼ。
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