DE69829381T2

DE69829381T2 - Hepatitis c inhibitor peptide

Info

Publication number: DE69829381T2
Application number: DE69829381T
Authority: DE
Inventors: Montse Llinas-Brunet; Marc-Andre Vimont POUPART; Jean Rancourt; Bruno Simoneau; Youla Tsantrizos; Dominik Wernic
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1997-08-11
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: EP1003775A2; HUP0004853A3; EP1003775B1; WO1999007733A2; ES2241157T3; AU757783B2; CA2294049A1; AU8795698A; PT1003775E; WO1999007733A3; DK1003775T3; DE69829381D1; HUP0004853A2; JP4354632B2; IL134232A0; NZ503262A; ATE291032T1; JP2001512743A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Hepatitis C-Virus(HCV)-Infektionen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung neuartige Peptide und deren Analoge, pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige Peptide enthalten, und Verfahren zur Verwendung dieser Peptide bei der Behandlung von HCV-Infektionen bereit.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis C-Virus (HCV) ist weltweit der wichtigste ätiologische Auslöser von durch Transfusion und durch allgemeine Umstände erworbene Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis. Es wird angenommen, dass weltweit mehr als 100 Millionen Personen von dem Virus infiziert sind. Bei einem hohen prozentualen Anteil von Virusträgern entsteht eine chronische Infektion, wobei es in zahlreichen Fällen zu einer chronischen Leberkrankheit kommt, der sogenannten chronischen Hepatitis C. Bei dieser Gruppe besteht wiederum die starke Gefahr von ernsthaften Leberkrankheiten, wie Leberzirrhose, hepatozellulärem Karzinom und zum Tod führenden terminalen Stadien von Lebererkrankungen.
Der Mechanismus, gemäß dem HCV seinen viralen Fortbestand gewährleistet und eine hohe Rate an chronischen Lebererkrankungen hervorruft, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist nicht bekannt, wie HCV mit dem Wirtsimmunsystem in Wechselwirkung tritt und diesem ausweicht. Ferner müssen die Rollen der zellulären und humoralen Immunreaktionen beim Schutz gegen HCV-Infektionen und -Krankheiten noch aufgeklärt werden. Es wurde berichtet, dass Immunoglobuline eine Prophylaxe bei transfusionsbedingter viraler Hepatitis bewirken, jedoch empfiehlt das Center for Disease Control gegenwärtig zu diesem Zweck nicht die Behandlung mit Immunoglobulinen.
Das Fehlen einer wirksamen schützenden Immunreaktion behindert die Entwicklung eines Impfstoffes oder angemessener Prophylaxemaßnahmen nach der Belastung, so dass in naher Zukunft die ganze Hoffnung fest auf antivirale Eingriffe gesetzt wird.
Es wurden verschiedene klinische Studien mit dem Ziel durchgeführt, pharmazeutische Mittel zu identifizieren, die in wirksamer Weise zur Behandlung von HCV-Infektionen bei von chronischer Hepatitis C betroffenen Patienten befähigt sind. Bei diesen Untersuchungen verwendete man Interferon-alpha, allein und in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln. Derartige Untersuchungen haben ergeben, dass eine erhebliche Anzahl der Teilnehmer auf diese Therapien nicht reagiert und dass von den Teilnehmern, die eine günstige Reaktion zeigen, ein großer Anteil nach Beendigung der Behandlung einen Rückfall erleidet.
Bis vor einigen Jahren stellte die Behandlung mit Interferon (IFN) die einzige verfügbare Therapie mit nachgewiesenem Nutzen dar, die in der Klinik für Patienten mit chronischer Hepatitis C anerkannt war. Jedoch ist die anhaltende Reaktionsrate gering und ferner führt die Behandlung mit Interferon auch zu schweren Nebenwirkungen (d. h. Retinopathie, Thyreoiditis, akute Pankreatitis, Depressionen), die die Lebensqualität der behandelten Patienten beeinträchtigen. Interferon in Kombination mit Ribavirin wurde ursprünglich für Patienten, die auf IFN allein nicht reagieren, zugelassen. Jedoch werden mit dieser Kombinationstherapie die durch IFN verursachten Nebenwirkungen nicht gelindert.
Somit besteht ein Bedürfnis zur Entwicklung wirksamer antiviraler Mittel zur Behandlung von HCV-Infektionen, mit denen die Einschränkungen vorhandener pharmazeutischer Therapien überwunden werden können.
HCV ist ein umhülltes Plusstrang-RNA-Virus der Familie Flaviviridae. Das einzelsträngige HCV-RNA-Genom weist eine Länge von etwa 9500 Nucleotiden auf und besitzt einen einzigen offenen Leseraster (ORF), der für ein einziges großes Polyprotein mit etwa 3000 Aminosäuren kodiert. In infizierten Zellen wird dieses Polyprotein an mehreren Stellen durch zelluläre und virale Proteasen gespalten, wodurch strukturelle und nicht-strukturelle (NS) Proteine entstehen. Im Fall von HCV wird die Erzeugung von reifen, nicht-strukturellen Proteinen (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B) durch zwei virale Proteasen erreicht. Die erste Protease, die noch schlecht charakterisiert ist, spaltet an der NS2-NS3-Verbindungsstelle. Die zweite Protease ist eine Serin-protease, die innerhalb der N-terminalen Region von NS3 enthalten ist (und daher als NS3-Protease bezeichnet wird), und vermittelt sämtliche anschließenden Spaltungen stromabwärts von NS3, sowohl in cis, an der NS3-NS4A-Spaltungsstelle, als auch in trans, für die restlichen NS4A-NS4B-, NS4B-NS5A- und NS5A-NS5B-Stellen. Das NS4A-Protein scheint mehrere Funktionen auszuüben, nämlich die Wirkung als Kofaktor für die NS3-Protease und möglicherweise die Unterstützung der Membranlokalisierung von NS3 und anderen viralen Replicase-Komponenten. Die Komplexbildung des NS3-Proteins mit NS4A scheint für die Prozessierungsereignisse notwendig, die die proteolytische Wirksamkeit an sämtlichen Stellen verstärken. Das NS3-Protein besitzt auch Nucleosid-triphosphatase- und RNA-Helicase-Aktivitäten. NS5B ist eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, die an der Replikation von HCV beteiligt ist.
Eine allgemeine Strategie zur Entwicklung von antiviralen Mitteln besteht in der Inaktivierung von viral kodierten Enzymen, die für die Replikation des Virus erforderlich sind. Diesbezüglich beschreibt die Patentanmeldung WO-97/06804 das (–)-Enantiomere des Nucleosidanalogen Cytosin-1,3-oxathiolan (auch bekannt als 3TC) mit Aktivität gegen HCV. Diese Verbindung wird zwar in früheren klinischen Untersuchungen gegen HIV und HBV als sicher bezeichnet, ihre klinische Aktivität gegen HCV ist jedoch nicht erwiesen und ihr Wirkungsmechanismus gegen das Virus bedarf noch der Aufklärung.
Intensive Bemühungen zum Auffinden von Verbindungen, die die NS3-Protease oder die RNA-Helicase von HCV hemmen, haben zu folgenden Arbeiten geführt:

• US-Patent 5 633 388 beschreibt heterocyclisch substituierte Carboxamide und Analoge mit Wirksamkeit gegen HCV. Diese Verbindungen sind gegen die Helicase-Aktivität des NS3-Proteins des Virus gerichtet, wobei aber bisher nicht über klinische Tests berichtet wird.
• Chu et al. (Tet. Lett., (1996), S. 7229–7232) berichten über ein Phenanthrenchinon, das in vitro gegen die HCV-NS3-Protease wirksam ist. Bezüglich dieser Verbindung gibt es keine Berichte über weitere Entwicklungen.
• Bei der Ninth International Conference on Antiviral Research, Urabandai, Fukyshima, Japan (1996) (Antiviral Research, Bd. 30 (1) (1996), A23 (Abstract 19)) wurde eine Arbeit vorgelegt, die über Thiazolidin-Derivate mit Hemmwirkung gegen die HCV-Protease berichtet.

Es gibt mehrere Untersuchungen über Verbindungen mit Hemmwirkung gegen andere Serin-proteasen, wie humane Leukozyten-elastase. Über eine Familie dieser Verbindungen wird in WO-95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995) berichtet. Bei den in dieser Anmeldung beschriebenen Peptiden handelt es sich um Morpholinylcarbonyl-benzoyl-Peptidanaloge, die sich strukturell von den erfindungsgemäßen Peptiden unterscheiden.

• WO-98/17679 der Fa. Vertex Pharmaceuticals Inc. beschreibt Inhibitoren von Serin-protease, insbesondere von Hepatitis C-Virus-NS3-Protease. Bei diesen Inhibitoren handelt es sich um Peptidanaloge auf der Basis des natürlichen NS5A/5B-Substrats, die eine C-terminale aktivierte Carbonylfunktion als wesentliches Merkmal enthalten. Von diesen Peptiden wurde ferner berichtet, dass sie gegen andere Serin-proteasen aktiv sind und daher nicht spezifisch für HCV-NS3-Protease sind.
• Hoffman LaRoche berichtet ebenfalls über Hexapeptide, bei denen es sich um Proteinase-Inhibitoren handelt, die sich als antivirale Mittel zur Behandlung von HCV-Infektionen eignen. Diese Peptide enthalten einen Aldehyd oder eine Boronsäure am C-Terminus.
• Steinkühler et al. und Ingallinella et al. beschrieben eine NS4A-4B-Produkthemmung (Biochemistry, Bd. 37 (1998), S. 8899–8905 und 8906–8914). Jedoch wurden diese Peptide und Analoge nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Peptiden, die die NS3-Protease des Hepatitis C-Virus hemmen.
Ein weiterer Vorteil eines Aspekts der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass diese Peptide spezifisch die NS3-Protease hemmen und in Konzentrationen bis zu 300 μM keine signifikante Hemmwirkung gegen andere Serin-proteasen ausüben, z. B. gegen humane Leukozyten-elastase (HLE), Schweinepankreas-elastase (PPE) oder Rinderpankreas-chymotrypsin, oder gegen Cystein-proteasen, wie Humanlebercathepsin B (Cat B).
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Wir untersuchten Peptide mit potentieller Hemmwirkung gegen die NS3-Protease. Der Befund, dass das N-terminale Spaltungsprodukt (Ac-D-D-I-V-P-C-OH) eines Analogen eines natürlichen Substrats der NS3-Protease eine Hemmwirkung zeigte, führte uns zu den erfindungsgemäßen Peptidanalogen.
Es werden Verbindungen der Formel (I) beschrieben:
worin Q CH₂ oder N-Y ist, worin Y H oder C_1-6-Alkyl ist;

a) wenn Q CH₂ ist, a 0 ist, b 0 ist und B ein Amidderivat der Formel R_11aN(R_11b)-C(O)- ist, worin R_11a H; C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder Di(C_1-6-alkyl)amino; C₆-Aryl; C_7-10-Alkylaryl; C_3-7-Cycloalkyl; (C_3-7-Cycloalkyl)-(C_1-6-alkyl); Heterocyclus-C_1-6-alkyl, z. B.
ist; und R_11b C_1-6-Alkyl, substituiert mit Carboxyl, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl oder Phenylmethoxycarbonyl; oder C_7-16-Aralkyl, substituiert am aromatischen Teil mit Carboxyl, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl, Phenylmethoxycarbonyl oder Heterocyclus-C_1-6-alkyl, ist; oder R_11a und R_11b unter Bildung eines 3- bis 7-gliedrigen, Stickstoff enthaltenden Rings, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder (C_1-6-Alkoxy)carbonyl, verbunden sind; oder
b) wenn Q N-Y ist; a 0 oder 1 ist, b 0 oder 1 ist und B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin R₁₁ (i) C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy (z.B. AcOCH₂) oder C_1-6-Alkoxy (z.B. Boc); (ii) C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl oder Phenylmethoxycarbonyl; (iii) C_3-7-Cycloalkyl, substituiert mit Carboxyl und einem bis drei C_1-6-Alkylsubstituenten; (iv) C_4-10-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert am Cycloalkylteil mit Carboxy, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl oder Phenylmethoxycarbonyl; (v)
(vi) C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, ist; R₆, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, substituiert mit Carboxyl ist; und R₅, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl ist; oder
c) wenn Q entweder CH₂ oder N-Y ist; R₄ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; Z Oxo oder Thioxo ist; R₃ C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; W eine Gruppe der Formel III' ist:
Formel III' worin R₁₃ OH; SH; NH₂; Carboxyl; R₁₂; OR₁₂, SR₁₂, NHR₁₂ oder NR₁₂R₁₂' ist, worin R₁₂ und R₁₂' unabhängig sind: cyclisches C_3-16-Alkyl oder acyclisches C_1-16-Alkyl oder cyclisches C_3-16-Alkenyl oder acyclisches C_2-16-Alkenyl, wobei das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls substituiert sind mit NH₂, OH, SH, Halogen oder Carboxyl; wobei Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; oder R₁₂ und R₁₂' unabhängig C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy-niederalkyl sind; wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; wobei das cyclische Alkyl, cyclische Alkenyl, Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring kondensiert sind, um ein cyclisches System oder ein heterocyclisches System zu bilden, wobei der zweite Ring gegebenenfalls substituiert ist mit NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy-C_1-6-alkyl; wobei der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; R₁' Wasserstoff ist und R₁ Propyl ist; oder R₁' und R₁ zusammen einen 3-gliedrigen Ring gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl bilden; und A Hydroxy oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Ester davon ist.

Unter den Umfang der Erfindung fällt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine gegen Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel oder Hilfsmittel umfasst.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Behandlung einer viralen Hepatitis C-Infektion bei einem Säuger durch Verabreichung einer gegen Hepatitis C antiviral wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon oder einer Zusammensetzung gemäß den vorstehenden Ausführungen an den Säuger.
Ein weiterer wichtiger Aspekt beinhaltet ein Verfahren zur Inhibierung der Replikation des Hepatitis C-Virus, indem das Virus einer Hepatitis-C-Virus-NS3-Protease inhibierenden Menge der Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon oder einer Zusammensetzung gemäß den vorstehenden Ausführungen ausgesetzt wird.
Ein weiterer Aspekt beinhaltet ein Verfahren zur Behandlung einer viralen Hepatitis C-Infektion bei einem Säuger, indem man eine gegen Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Kombination aus der Verbindung der Formel I oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon und ein Interferon verabreicht. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Kombination im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel oder Hilfsstoff enthält, fällt ebenfalls unter den Umfang der Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Sofern nichts anderes angegeben wird, gelten für die hier verwendeten Ausdrücke die folgenden Definitionen:
Für die Fälle, in denen die Symbole (R) oder (S) zur Bezeichnung der Konfiguration eines Restes, z. B. von R₄ der Verbindung der Formel I, verwendet werden, gilt die Bezeichnung im Zusammenhang mit der Verbindung und nicht im Zusammenhang mit dem Rest allein.
Die natürlichen Aminosäuren, ausgenommen Glycin, enthalten ein chirales Kohlenstoffatom. Sofern nicht speziell etwas anderes angegeben ist, werden die Verbindungen, die die natürlichen Aminosäuren mit der L-Konfiguration enthalten, bevorzugt. Jedoch zieht es die Anmelderin in Betracht, dass, sofern angegeben, einige Aminosäuren der Formel I in der D- oder L-Konfiguration oder in Form von Gemischen von D- und L-Isomeren, einschließlich der racemischen Gemische, vorliegen können.
Die hier verwendeten Bezeichnungen "P1, P2, P3 und dergl." beziehen sich auf die Position der Aminosäurereste, die vom C-Terminus der Peptidanalogen beginnen und sich bis zum N-Terminus erstrecken (d. h. P1 bedeutet die Position 1 vom C-Terminus aus; P2: zweite Position vom C-Terminus aus; und dergl.) (vergl. A. Berger und I. Schechter, Transactions of the Royal Society London Series, Bd. 257 (1970), S. 249–264).
Die Abkürzungen für die α-Aminosäuren sind in Tabelle A aufgeführt.
Tabelle A
Der hier verwendete Ausdruck "Aminobuttersäure" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel:
Der hier verwendete Ausdruck "Allylglycin" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel:
Der hier verwendete Ausdruck "1-Aminocyclopropylcarbonsäure" (Acca) bezieht sich auf eine Verbindung der Formel:
Der hier verwendete Ausdruck "tert.-Butylglycin" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel:
Der Ausdruck "Rest" im Zusammenhang mit einer Aminosäure oder einem Aminosäurederivat bedeutet einen Rest, der sich von der entsprechenden α-Aminosäure durch Entfernung der Hydroxylgruppe der Carboxylgruppe und eines Wasserstoffatoms von der α-Aminogruppe ergibt. Beispielsweise bedeuten die Ausdrücke Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar und Tyr die "Reste" von L-Glutamin, L-Alanin, Glycin, L-Isoleucin, L-Arginin, L-Asparaginsäure, L-Phenylalanin, L-Serin, L-Leucin, L-Cystein, L-Asparagin, Sarcosin bez. L-Tyrosin.
Der Ausdruck "Seitenkette" in bezug auf eine Aminosäure oder einen Aminosäurerest bedeutet eine Gruppe, die an das α-Kohlenstoffatom der α-Aminosäure gebunden ist. Beispielsweise handelt es sich bei der Seitenketten-R-Gruppe für Glycin um Wasserstoff, für Alanin um Methyl und für Valin um Isopropyl. Für die speziellen R-Gruppen oder Seitenketten der α-Aminosäuren wird auf A. L. Lehninger, Biochemistry, Kapitel 4, verwiesen.
Der hier verwendete Ausdruck "Halogen" bedeutet einen unter Brom, Chlor, Fluor oder Jod ausgewählten Halogenrest.
Die hier verwendeten Ausdrücke "C_1-6-Alkyl" oder "(nieder)-Alkyl" bedeuten allein oder in Kombination mit einem anderen Rest geradkettige oder verzweigte Alkylreste mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele hierfür sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, 1-Methylethyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl und 1,1-Dimethylethyl.
Gleichermaßen werden die Ausdrücke "C_1-3-Alkyl", "C_1-4-Alkyl" und "C_1-10-Alkyl" zur Bezeichnung von Alkylresten mit bis zu 3, 4 bzw. 10 Kohlenstoffatomen verwendet.
Der hier verwendete Ausdruck "C_3-7-Cycloalkyl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Cycloalkylrest mit drei bis sieben Kohlenstoffatomen. Zu Beispielen hierfür gehören Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C_4-10-(Alkylcycloalkyl)" bedeutet einen Cycloalkylrest mit drei bis sieben Kohlenstoffatomen, der an einen Alkylrest gebunden ist. Die gebundenen Reste enthalten bis zu zehn Kohlenstoffatome. Beispiele hierfür sind Cyclopropylmethyl, Cyclopentylethyl, Cyclohexylmethyl, Cyclohexylethyl oder Cycloheptylethyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C_2-10-Alkenyl" bedeutet allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Alkylrest gemäß der vorstehenden Definition mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, der ferner mindestens eine Doppelbindung enthält. Ein Beispiel für Alkenyl ist Allyl.
Der hier verwendete Ausdruck "C_3-4-Alkylen" bedeutet einen zweiwertigen Alkylrest, der sich durch Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von einem geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit drei bis vier Kohlenstoffatomen ableitet. Zu Beispielen hierfür gehören -CH₂CH₂CH₂-, -CH(CH₃)CH₂CH₂-, -CH₂C(CH₃)₂- und -CH₂CH₂CH₂CH₂-.
Der hier verwendete Ausdruck "C_1-6-Alkoxy" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest den Rest -O-C_1-6-Alkyl, wobei Alkyl der vorstehenden Definition entspricht und bis zu sechs Kohlenstoffatome enthält. Beispiele für Alkoxyreste sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy und 1,1-Dimethylethoxy. Der letztgenannte Rest ist allgemein als tert.-Butoxy bekannt.
Der hier verwendete Ausdruck "C₆- oder C₁₀-Aryl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest ein aromatisches monocyclisches System mit einem Gehalt an sechs Kohlenstoffatomen oder ein aromatisches cyclisches System mit einem Gehalt an zehn Kohlenstoffatomen. Beispielsweise umfasst der Ausdruck Aryl Phenyl und Naphthalin.
Der hier verwendete Ausdruck "C_7-16-Aralkyl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Arylrest gemäß der vorstehenden Definition, der über eine Alkylgruppe gebunden ist, wobei es sich beim Alkylrest um einen der vorstehend definierten Reste mit einem Gehalt an 1 bis 6 Kohlenstoffatomen handelt. Beispiele für Aralkylreste sind Benzyl und Butylphenyl.
Der hier verwendete Ausdruck "Carboxy(nieder)-alkyl" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest eine Carboxylgruppe (COOH), die über eine (nieder)-Alkylgruppe der vorstehenden Definition verbunden ist. Zu Beispielen hierfür gehören Buttersäure oder die folgenden Gruppen:
Die hier verwendeten Ausdrücke "cyclisch" oder "cyclisches System" bedeuten entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen einwertigen Rest, der sich durch Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem gesättigten oder ungesättigten cyclischen Kohlenwasserstoff mit einem Gehalt an 3 bis 7 Kohlenstoffatomen ableitet, sofern nichts anderes angegeben ist, wobei gegebenenfalls ein oder mehr Heteroatome enthalten sind. Die Ausdrücke "cyclisch" oder "cyclisches System" umfassen beispielsweise Cyclopropan, Cyclopentan, Cyclohexan, Cyclohexen, Decalin, Tetralin, Inden und Naphthalin.
Der hier verwendete Ausdruck "Heterocyclus" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen einwertigen Rest, der sich durch Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem fünf-, sechs- oder sieben-gliedrigen, gesättigten oder ungesättigten Heterocyclus mit einem Gehalt an 1 bis 4 Heteroatomen, die unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind, ableitet. Zu Beispielen für geeignete Heterocyclen gehören: Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Thiazolidin, Pyrrol, Thiophen, Diazepin, 1H-Imidazol, 1-Methyl-1H-imidazol, Isoxazol, Thiazol, 2-Methylthiazol, 2-Aminothiazol, Piperidin, 1,4-Dioxan, 4-Morpholin, Pyridin, 2-Methylpyridin, Pyrimidin, 4-Methylpyrimidin und 2,4-Dimethylpyrimidin.
Der hier verwendete Ausdruck "heterocylisches System" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest einen Heterocyclus gemäß der vorstehenden Definition, der mit einem oder mehreren anderen Cyclen, bei denen es sich um einen Heterocyclus oder einen anderen Cyclus handelt, kondensiert sein kann. Zu Beispielen für geeignete heterocyclische Systeme gehören Thiazolo[4,5-b]pyridin, Chinolin oder Indol.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch annehmbare Ester" bedeutet entweder allein oder in Kombination mit einem anderen Rest Ester der Verbindung der Formel I, wobei eine der Carboxylfunktionen des Moleküls und vorzugsweise die am Carboxyende durch eine Alkoxycarbonylfunktion ersetzt ist
worin der R-Rest des Esters ausgewählt ist unter: Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, tert.-Butyl und n-Butyl); Alkoxyalkyl (z. B. Methoxymethyl); Alkoxyacyl (z. B. Acetoxymethyl); Aralkyl (z. B. Benzyl); Aryloxyalkyl (z. B. Phenoxymethyl); Aryl (z. B. Phenyl), das gegebenenfalls durch Halogen, C_1-4-Alkyl oder C_1-4-Alkoxy substituiert ist. Weitere geeignete Ester-Arzneistoffvorstufen finden sich in Design of prodrugs, Hrsg. H. Bundgaard, Elsevier (1985). Derartige, pharmazeutisch annehmbare Ester werden üblicherweise dann, wenn sie einem Säuger injiziert werden, in vivo hydrolysiert und in die Säureform der Verbindung der Forme I umgewandelt.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch annehmbares Salz" umfasst Salze, die sich von pharmazeutisch annehmbaren Basen ableiten. Zu Beispielen für geeignete Basen gehören Cholin, Ethanolamin und Ethylendiamin. Na⁺-, K⁺- und Ca⁺⁺-Salze fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung (vergl. auch Pharmaceutical salts, S. M. Birge et al., J. Pharm. Sci., Bd. 66 (1977), S. 1–19).
Bevorzugte Ausführungsformen
Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen wird durch die allgemeine Formel Ia wiedergegeben
worin Y H oder C_1-6-Alkyl ist;
a 0 oder 1 ist;
b 0 oder 1 ist;
B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin
R₁₁ folgende Bedeutungen hat: (i) C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy oder C_1-6-Alkoxy; (ii) C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, (C_1-6-Alkoxy)-carbonyl oder Phenylmethoxycarbonyl; (iii) C_3-7Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl und einem bis drei C_1-6- Alkylsubstituenten; (iv) C_4-10-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert am Cycloalkylteil mit Carboxy, (C_1-6-Alkoxy)-carbonyl oder Phenylmethyoxycarbonyl; (v)
(vi) C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl;
R₆, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, substituiert mit Carboxyl ist;
R₅, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl ist; und
R₄ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist;
R₃, W, R₁, R_1' und A die vorstehend definierten Bedeutungen haben.
Vorzugsweise handelt es sich bei B um ein Acylderivat der Formel R₁₁C(O), worin R₁₁ folgende Bedeutungen hat: C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy oder C_1-6-Alkoxy;
C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, MeOC(O), EtOC(O) oder BnOC(O); 3-Carboxypropionyl (DAD) oder 4-Carboxybutyryl (DAE); oder
Insbesondere bedeutet B Acetyl, 3-Carboxypropionyl, 4-Carboxylbutyryl, AcOCH₂C(O), Me₃COC(O),
Besonders bevorzugt für B sind die Bedeutungen Acetyl, 3-Carboxypropionyl (DAD), 4-Carboxybutyryl (DAE), AcOCH₂C(O),
Insbesondere bevorzugt ist für B die Bedeutung Acetyl.
Vorzugsweise bedeutet R₆, wenn vorhanden, die Seitenkette von Asp oder Glu.
Insbesondere bedeutet R₆, wenn vorhanden, die Seitenkette von Asp.
Alternativ hat a vorzugsweise den Wert 0, wobei dann R₆ fehlt. Vorzugsweise bedeutet R₅, wenn vorhanden, die Seitenkette einer Aminosäure, die aus der Gruppe D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-tert.-Butylglycin (Tbg) und L-Tbg ausgewählt ist.
Insbesondere bedeutet R₅, wenn vorhanden, die Seitenkette von D-Asp, D-Val, oder D-Glu.
Ganz besonders bedeutet R₅, wenn vorhanden, die Seitenkette von D-Glu.
Alternativ hat vorzugsweise a den Wert 0 und b den Wert 0, wobei dann R₆ und R₅ beide fehlen.
Alternativ wird eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen durch die Formel (Ib) wiedergegeben
worin B vorzugsweise ein Amid der Formel R_11aN(R_11b)C(O)- bedeutet, worin R_11a vorzugsweise C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxy, C₆-Aryl, C_7-10-Arylalkyl, 2-Tetrahydrofuranylmethyl oder 2-Thiazolidylmethyl bedeutet; und R_11b vorzugsweise C_1-4-Alkyl, das gegebenenfalls mit Carboxyl substituiert ist, bedeutet.
Insbesondere bedeutet R_11a Isopropyl, Carboxyethyl, Benzylmethyl, Benzyl oder 2-Tetrahydrofuranylmethyl. Ganz besonders bevorzugt ist für R_11b die Bedeutung C_1-4-Alkyl, das mit Carboxyl substituiert ist. Insbesondere bedeutet R_11b Ethylcarboxyl.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Verbindungen der Formel I, worin vorzugsweise R₄ aus der Gruppe Isopropyl, Cyclopropyl, Cyclohexyl, tert.-Butyl, 1-Methylpropyl und 2-Methylpropyl ausgewählt ist. Insbesondere bedeutet R₄ Cyclopropyl oder 1-Methylpropyl. Besonders bevorzugt ist für R₄ die Bedeutung Cyclopropyl.
Die Verbindungen der Erfindung umfassen Verbindungen der Formel I, worin Z vorzugsweise Oxo bedeutet.
Die Verbindungen der Erfindung umfassen Verbindungen der Formel I, worin vorzugsweise R₃ die Seitenkette einer Aminosäure bedeutet, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Ile, allo-Ile, Chg, Cha, Val, Tbg oder Glu.
Insbesondere bedeutet R₃ die Seitenkette von Val, Tbg oder Chg.
Besonders bevorzugt ist für R₃ die Bedeutung der Seitenkette von Val.
In der Formel III'
hat R₁₃ die folgenden Bedeutungen: OH, SH, NH₂, Carboxyl, R₁₂, OR₁₂, SR₁₂, NHR₁₂ oder NR₁₂R_12' wobei R₁₂ und R_12' unabhängig voneinander folgende Bedeutungen haben:
cyclisches C_3-16-Alkyl oder acyclisches C_1-16-Alkyl oder cyclisches C_3-16-Alkenyl oder acyclisches C_2-16-Alkenyl, wobei das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls durch NH₂, OH, SH, Halogen oder Carboxy) substituiert sind, wobei das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom, das unabhängig voneinander aus der Gruppe O, S und N ausgewählt ist, enthalten, oder
R₁₂ und R_12' unabhängig voneinander C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, das gegebenenfalls durch C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxy) oder Carboxy-(C_1-6-alkyl) substituiert ist, bedeutet, wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig voneinander aus der Gruppe O, S und N ausgewählt ist,
wobei das cyclische Alkyl, cyclische Alkenyl, Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring unter Bildung eines cyclischen Systems oder heterocyclischen Systems kondensiert sind, wobei der zweite Ring gegebenenfalls durch NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy-(nieder)-alkyl substituiert ist, wobei der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom, das unabhängig voneinander aus der Gruppe O, S und N ausgewählt ist, enthält.
Insbesondere hat R₁₃ die Bedeutung OR₁₂ oder SR₁₂, wobei R₁₂ C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl bedeutet, wobei das erste Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls durch C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, C_1-6-Alkoxy, Carboxy), Carboxy-(nieder)-alkyl oder ein zweites Aryl oder Aralkyl substituiert sind, wobei das erste und zweite Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig voneinander aus der Gruppe O, S und N ausgewählt ist.
Insbesondere hat R₁₃ folgende Bedeutungen: Bn; PhCH₂CH₂; PhCH₂CH₂CH₂; O-Bn; o-Tolylmethoxy; m-Tolylmethoxy; p-Tolylmethoxy; 1-Naphtyloxy; 2-Naphtyloxy; 1-Naphthalinylmethoxy; 2-Naphthalinylmethoxy; (4-tert.-Butyl)-methoxy; (3I-Ph)CH₂O; (4Br-Ph)O; (2Br-Ph)O; (3Br-Ph)O ; (4I-Ph)O; (3Br-Ph)CH₂O; (3,5-Br₂-Ph)CH₂O;
Ganz besonders bevorzugt sind für R₁₃ folgende Bedeutungen: PhCH₂CH₂CH₂; O-Bn; 1-Naphtyloxy; 2-Naphtyloxy; 1-Naphthalinylmethoxy; 2-Naphthalinylmethoxy;
R_1' bedeutet Wasserstoff und R₁ bedeutet Propyl.
Alternativ bilden R_1' und R₁ zusammen einen 3-gliedrigen Ring, wobei der Ring gegebenenfalls durch C_1-6-Alkyl, wie Ethyl, substituiert ist. Beispielsweise können R_1' und R₁ zusammen die Seitenkette (in Fettdruck dargestellt) der folgenden Aminosäure bedeuten:
die als 1-Aminocyclopropylcarbonsäure (Acca) bezeichnet wird.
Unter die vorliegende Erfindung fallen ferner Verbindungen der Formel I, worin A vorzugsweise Hydroxy, ein Salz oder einen Ester davon bedeutet. Insbesondere bedeutet A Hydroxy oder einen Ester davon. Ganz besonders bevorzugt ist für A die Bedeutung Hydroxy.
Insbesondere handelt es sich beim Ester um C_1-6-Alkoxy oder (Aryl-C_1-6-alkoxy). Besonders bevorzugt ist für den Ester Methoxy, Ethoxy, Phenoxy oder Benzyloxy.
Unter den Umfang der Erfindung fallen Verbindungen der Formel I, worin Q CH₂ bedeutet, a 0 ist, b 0 ist und es sich dabei bei B um ein Amid der Formel R_11aN(R_11b)-C(O)- handelt, worin R_11a C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, C_3-7-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert durch Carboxy, C_1-3-Carboxyalkyl, Phenyl, C_7-10-Arylalkyl, 2-Tetrahydrofuranylmethyl, oder 2-Thiazolidylmethyl bedeutet; und R_11b Phenyl oder C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls mit Carboxyl oder C_1-4-Carboxyalkyl substituiert, bedeutet; oder
Q die Bedeutung N-Y hat, worin Y H oder C_1-6-Alkyl bedeutet, a 0 oder 1 ist, b 0 oder 1 ist und B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- bedeutet, worin R₁₁ folgende Bedeutungen hat (i) C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkyl, substituiert mit Carboxyl, MeC(O)O-, MeO-, EtO-, MeCH₂CH₂O- oder Me₃C-O-; (ii) Cyclopentyl oder Cyclohexyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; (iv) C_4-10-(Alkylcycloalkyl) gegebenenfalls substituiert am Cycloalkylteil mit Carboxyl; (v)
(vi) Phenyl, Benzyl oder Phenylethyl;
R₆, wenn vorhanden, CH₂COOH oder CH₂CH₂COOH bedeutet,
R₅, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl oder CH₂COOH oder CH₂CH₂COOH bedeutet
und, wenn Q entweder CH₂ oder N-Y bedeutet, R₄ C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) bedeutet;
Z Oxo oder Thio bedeutet;
R₃ C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) bedeutet;
W eine Gruppe der Formel III' gemäß der vorstehenden Definition bedeutet;
R_1' Wasserstoff bedeutet und R₁ Propyl bedeutet oder R_1' und R₁ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Cyclopropylrest bilden, der gegebenenfalls durch Ethyl substituiert ist; und
A Hydroxy oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, C_1-6-Alkoxy oder (Aryl-C_1-6-alkoxy) bedeutet.
Unter den Umfang der Erfindung fallen Verbindungen der Formel Ia, worin B eine Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- bedeutet, wobei R₁₁ C_1-6-Alkoxy, C_1-10-Alkyl, das gegebenenfalls durch Carboxyl substituiert ist, C_3-7-Cycloalkyl, das gegebenenfalls durch Carboxyl oder Benzylcarboxy substituiert ist, oder
bedeutet;
R₆ fehlt;
R₅ fehlt;
R₄ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) bedeutet;
R₃ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) bedeutet;
W eine Gruppe der Formel III' gemäß der vorstehenden Definition darstellt; und
A Hydroxy oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, Methoxy, Ethoxy, Phenoxy oder Benzyloxy bedeutet.
Unter den Umfang der Erfindung fallen Verbindungen der Formel Ia, worin B Acetyl, 3-Carboxypropionyl, 4-Carboxylbutyryl, AcOCH₂C(O), Me₃COC(O),
bedeutet;
Y H oder Me bedeutet, a 0 oder 1 ist, b 0 oder 1 ist,
R₆, wenn vorhanden, die Seitenkette von Asp oder Glu bedeutet,
R₅, wenn vorhanden, die Seitenkette von Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Val, D-Val oder Tbg bedeutet,
R₄ die Seitenkette von Val, Chg, Tbg, Ile oder Leu bedeutet,
Z Oxo oder Thioxo bedeutet,
R₃ Wasserstoff oder die Seitenkette von Ile, Chg, Val oder Glu bedeutet,
W eine Gruppe der Formel III' bedeutet
worin R₁₃ folgende Bedeutungen hat:
Bn, PhCH₂CH₂, PhCH₂CH₂CH₂, O-Bn, o-Tolylmethoxy, m-Tolylmethoxy, p-Tolylmethoxy, 1-Naphthalinylmethoxy, 2-Naphthalinylmethoxy, (4-tert.-Butyl)benzyloxy, (3I-Ph)CH₂O, (4Br-Ph)O, (2Br-Ph)O, (3Br-Ph)O, (4I-Ph)O, (3Br-Ph)CH₂O, (3,5-Br₂-Ph)CH₂O;
R_1' H bedeutet und R₁ Propyl bedeutet oder
R_1' und R₁ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Cyclopropylrest bilden und
A Hydroxyl bedeutet.
Unter den Umfang der Erfindung fallen ferner Verbindungen der Formel Ib, worin B ein Amid der Formel R_11aN(R_11b)C(O)- bedeutet, wobei R_11a folgendes bedeutet: C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl, C_3-7-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert mit Carboxy, C_1-3-Carboxyalkyl, Phenyl, C_7-10-Arylalkyl, 2-Tetrahydrofuranylmethyl oder 2-Thiazolidylmethyl, und
R_11b Phenyl oder C_1-6-Alkyl bedeutet, das mit Carboxyl oder C_1-4-Carboxyalkyl substituiert ist,
R₄ Cyclohexyl bedeutet;
Z Oxo bedeutet;
R₃ Wasserstoff oder die Seitenkette von Ile, Chg, Val oder Glu bedeutet;
W eine Gruppe der Formel III' bedeutet
worin R₁₃ folgendes bedeutet:
Bn, PhCH₂CH₂, PhCH₂CH₂CH₂, O-Bn, o-Tolylmethoxy, m-Tolylmethoxy, p-Tolylmethoxy, 1-Naphthalinylmethoxy, 2-Naphthalinylmethoxy, (4-tert.-Butyl)benzyloxy, (3I-Ph)CH₂O, (4Br-Ph)O, (2Br-Ph)O, (3Br-Ph)O, (4I-Ph)O, (3Br-Ph)CH₂O, (3,5-Br₂-Ph)CH₂O,
R_1' H bedeutet und R₁ Propyl bedeutet oder
R_1' und R₁ zusammen mit dem Kohlenstoffatom an das sie gebunden sind, einen Cyclopropylrest bilden und
A Hydroxyl bedeutet.
Beschrieben werden ferner Verbindungen der Formel I,
worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- bedeutet, wobei R₁₁ folgendes bedeutet: C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert am Cycloalkylteil mit Carboxyl;
oder R₁₁ C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, bedeutet;
a 0 oder 1 ist;
R₆, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, bedeutet;
b 0 oder 1 ist;
R₅, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, bedeutet;
Q N-Y bedeutet, wobei Y H oder C_1-6-Alkyl bedeutet;
R₄ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) bedeutet;
Z Oxo bedeutet;
R₃ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) bedeutet;
W eine Gruppe der Formel III' gemäß der vorstehenden Definition bedeutet;
R_1' Wasserstoff bedeutet und R₁ Propyl bedeutet oder R_1' und R₁ zusammen einen 3-gliedrigen Ring, der gegebenenfalls durch C_1-6-Alkyl substituiert ist, bilden; und
A OH oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einen Ester davon bedeutet.
Schließlich fallen unter den Umfang der Erfindung sämtliche Verbindungen der Formel I, die in den Tabellen 1 bis 4 aufgeführt sind, wobei P1 Nva oder Acca bedeutet.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich ein antivirales Mittel enthalten. Zu Beispielen für antivirale Mittel gehören Ribavirin und Amantadin.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich weitere Inhibitoren von HCV-Protease enthalten.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich einen Inhibitor anderer Ziele im HCV-Lebenszyklus, wie Helicase, Polymerase oder Metalloprotease, enthalten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral, parenteral oder über ein implantiertes Reservoir verabreicht werden. Wir bevorzugen die orale Verabreichung oder die Verabreichung durch Injektion. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Adjuvantien oder Vehikel enthalten. In einigen Fällen kann der pH-Wert der Zubereitung mit pharmazeutisch verträglichen Säuren, Basen oder Puffern eingestellt werden, um die Stabilität der zubereiteten Verbindung oder deren Abgabeform zu erhöhen. Der hier verwendete Ausdruck "parenteral" umfasst eine subkutane, intrakutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale und intraläsionale Injektion oder Infusionstechniken.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form eines sterilen injizierbaren Präparats vorliegen, z. B. in Form einer sterilen, injizierbaren, wässrigen oder ölartigen Suspension. Diese Suspension kann gemäß bekannten Techniken unter Verwendung von geeigneten Dispergier- oder Netzmitteln (z. B. Tween 80) und Suspendiermitteln zubereitet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral in einer beliebigen oral verträglichen Dosierungsform verabreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen und Lösungen gehören. Im Fall von Tabletten für die orale Anwendung gehören zu üblichen Trägerstoffen Lactose und Maisstärke. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden ebenfalls typischerweise zugesetzt. Für eine orale Verabreichung in Kapselform gehören zu geeigneten Verdünnungsmitteln Lactose und getrocknete Maisstärke. Bei oraler Verabreichung von wässrigen Suspensionen wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermittein vereinigt. Gegebenenfalls können bestimmte Süßungsmittel und/oder Aromastoffe und/oder farbgebende Mittel zugesetzt werden.
Weitere geeignete Vehikel oder Trägerstoffe für die vorerwähnten Zubereitungen und Zusammensetzungen finden sich in üblichen pharmazeutischen Handbüchern, z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19. Auflage, Mack Publishing Company, Easton Penn., (1995).
Dosierungen von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag und vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 75 mg/kg Körpergewicht pro Tag der hier beschriebenen Protease-Inhibitorverbindungen eignen sich bei einer Monotherapie zur Verhinderung und Behandlung einer durch HCV vermittelten Krankheit. Typischerweise werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 1 bis etwa 5 Mal täglich oder alternativ in Form einer kontinuierlichen Infusion verabreicht. Eine derartige Verabreichung kann als eine chronische oder akute Therapie vorgenommen werden. Die Menge des Wirkstoffes, der mit den Trägermaterialien zur Bildung einer einzelnen Dosierungsform vereinigt wird, hängt vom behandelten Wirt und vom speziellen Verabreichungsweg ab. Ein typisches Präparat enthält etwa 5 bis etwa 95% Wirkstoff (Gew./Gew.). Vorzugsweise enthalten derartige Präparate etwa 20 bis etwa 80% Wirkstoff.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass niedrigere oder höhere Dosen, als sie vorstehend erwähnt wurden, erforderlich sein können. Spezielle Dosierungs- und Behandlungsschemata für jeden speziellen Patienten hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, wozu folgendes gehört: Aktivität der speziellen verwendeten Verbindung; Alter, Körpergewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneistoffkombination, Schwere und Verlauf der Infektion, Disposition des Patienten gegenüber der Infektion, Beurteilung durch den behandelnden Arzt. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Dosen eingeleitet, die wesentlich unter der optimalen Dosis des Peptids liegen. Anschließend wird die Dosierung in kleinen Schritten erhöht, bis die optimale Wirkung unter den gegebenen Umständen erreicht wird. Im allgemeinen wird die Verbindung in besonders zweckmäßiger Weise in einem Konzentrationsbereich verabreicht, der allgemein antiviral wirkende Ergebnisse liefert, ohne dass schädliche oder nachteilige Nebenwirkungen hervorgerufen werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine Kombination aus der Verbindung der Formel I und einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln enthalten, sollen sowohl die Verbindung als auch das zusätzliche Mittel in Dosierungskonzentrationen von etwa 10 bis 100% und insbesondere von etwa 10 bis etwa 80% der Dosierung vorliegen, die normalerweise bei einem Monotherapie-Schema verabreicht wird.
Wenn diese Verbindungen oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff zubereitet werden, kann die erhaltene Zusammensetzung in vivo an Säugetiere verabreicht werden, z. B. an Menschen, um HCV-NS3-Protease zu hemmen oder um eine HCV-Virusinfektion zu behandeln oder zu verhindern. Eine derartige Behandlung kann auch unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit weiteren Mitteln erreicht werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) folgende Mittel gehören: immunomodulatorische Mittel, wie α-, β- oder γ-Interferone; andere antivirale Mittel, wie Ribavirin und Amantadin; andere Inhibitoren von HCV-NS3-Protease; Inhibitoren von anderen Zielen im HCV-Lebenscyclus, wie Helicase, Polymerase, Metalloprotease oder ein interner "Ribosomen-Entry"; oder Kombinationen davon. Die zusätzlichen Mittel können mit den erfindungsgemäßen Verbindungen unter Bildung einer einzigen Dosierungsform verenigt werden. Alternativ können diese zusätzlichen Mittel getrennt an einen Säuger als Bestandteil einer mehrfachen Dosierungsform verabreicht werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Hemmung der HCV-NS3-Protease-Aktivität in Säugern bereitgestellt, indem man eine Verbindung der Formel I verabreicht, wobei die Substituenten den vorstehenden Definitionen entsprechen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform eignen sich diese Verfahren zur Verringerung der HCV-NS3-Protease-Aktivität bei einem Säuger. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung nur eine erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff enthält, können derartige Verfahren die zusätzliche Stufe der Verabreichung eines weiteren Mittels an den Säuger umfassen, wobei dieses Mittel unter immunomodulatorischen Mitteln, antiviralen Mitteln, HCV-Protease-Inhibitoren oder Inhibitoren anderer Ziele im HCV-Lebenszyklus, wie Helicase, Polymerase oder Metallo-protease, ausgewählt ist. Ein derartiges zusätzliches Mittel kann dem Säuger vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht werden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform eignen sich diese Verfahren zur Hemmung der viralen Replikation in einem Säugetier. Derartige Verfahren eignen sich zur Therapie oder Prophylaxe einer HCV-Krankheit. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung nur eine erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff umfasst, können derartige Verfahren zusätzlich die Stufe der Verabreichung eines Mittels an das Säugetier umfassen, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist: immunomodulatorische Mittel, antivirale Mittel, HCV-Protease-Inhibitoren oder Inhibitoren anderer Ziele des HCV-Lebenszyklus. Derartige zusätzliche Mittel können dem Säugetier vor, gleichzeitig oder nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabfolgt werden.
Die vorstehend aufgeführten Verbindungen können ferner als Laboratoriumsreagentien verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Behandlung oder Verhinderung einer viralen Kontamination von Materialien verwendet werden und verringern somit die Gefahr einer viralen Infektion von Laboratoriumspersonal oder medizinischem Personal oder Patienten, die in Kontakt mit derartigen Materialien kommen (z. B. Blut, Gewebe, chirurgische Instrumente und Kleidungsstücke, Laboratoriumsinstrumente und -kleidungsstücke sowie Blutsammelvorrichtungen und -materialien).
Verfahren
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden gemäß einem im Schema I dargelegten Verfahren synthetisiert (wobei PG1 eine Carboxylschutzgruppe und PG2 eine Aminoschutzgruppe bedeuten):
Schema I
Kurz zusammengefasst, P1, P2, P3, P4 sowie gegebenenfalls P5 und P6 können nach bekannten Peptid-Kupplungstechniken verknüpft werden. Die P1-, P2-, P3-, P4-, P5- und P6-Reste können in einer beliebigen Reihenfolge miteinander verknüpft werden, sofern die Endverbindung den Peptiden der Formel I entspricht. Beispielsweise kann P6 mit P5 unter Bildung von P5-P6 verknüpft werden, das dann mit P4-P3-P2-P1 verknüpft wird. Oder P6 kann mit P5-P4-P3-P2 verknüpft werden und anschließend mit einem in geeigneter Weise C-terminal geschützten P1 verknüpft werden.
Im allgemeinen werden Peptide verlängert, indem man die Schutzgruppe der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes entfernt und die ungeschützte Carboxylgruppe der nächsten, in geeigneter Weise N-geschützten Aminosäure durch eine Peptidverknüpfung unter Anwendung der beschriebenen Verfahren ankuppelt. Diese Vorgehensweise zur Schutzgruppenentfernung und Kupplung wird wiederholt, bis die angestrebte Sequenz erhalten worden ist. Diese Kupplung kann mit den als Bestandteilen dienenden Aminosäuren stufenweise durchgeführt werden, wie im Schema I dargestellt ist, oder sie kann durch Kondensation von Fragmenten (2 oder mehrere Aminosäuren) oder durch eine Kombination beider Verfahren oder durch eine Festphasen-Peptidsynthese gemäß dem ursprünglich von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Bd. 85 (1963), S. 2149–2154, durchgeführt werden.
Eine Kupplung zwischen zwei Aminosäuren, einer Aminosäure und einem Peptid oder zwei Peptidfragmenten kann unter Anwendung herkömmlicher Kupplungsverfahren durchgeführt werden, z. B. durch das Azid-Verfahren, das gemischte Carbonsäure-Carbonsäureanhydrid-Verfahren (Isobutylchlorformiat-Verfahren), das Carbodiimid-Verfahren (Dicyclohexylcarbodiimid-, Diisopropylcarbodiimid- oder wasserlösliches Carbodiimid-Verfahren), das aktive Esterverfahren (p-Nitrophenylester- und N-Hydroxysuccinimidoester-Verfahren), das Woodward-Reagenz-K-Verfahren, das Carbonyldiimidazol-Verfahren, das Verfahren mit Phosphorreagenzien oder das Oxidations-Reduktions-Verfahren. Einige dieser Verfahren (insbesondere das Carbodiimid-Verfahren) können durch Zugabe von 1-Hydroxybenzotriazol verstärkt werden. Diese Kupplungsreaktionen können entweder in Lösung (in flüssiger Phase) oder in fester Phase durchgeführt werden.
Im einzelnen umfasst die Kupplungsstufe die dehydratisierende Kupplung einer freien Carboxylgruppe eines Reaktanten mit der freien Aminogruppe des anderen Reaktanten in Gegenwart eines Kupplungsmittels unter Bildung einer verknüpfenden Amidbindung. Eine Beschreibung von derartigen Kupplungsmitteln findet sich in allgemeinen Handbüchern über die Peptidchemie, z. B. M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 2. überarbeitete Auflage, Springer-Verlag, Berlin, Deutschland (1993). Zu Beispielen für geeignete Kupplungsmittel gehören N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Hydroxybenzotriazol in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N-Ethyl-N'-[(3-dimethylamino)-propyl]-carbodiimid. Ein sehr zweckmäßiges und geeignetes Kupplungsmittel ist das handelsübliche (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorphoshat, entweder als solches oder in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol. Ein weiteres sehr zweckmäßiges und geeignetes Kupplungsmittel ist das handelsübliche 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat. Ein weiteres sehr zweckmäßiges und geeignetes Kupplungsmittel ist handelsübliches O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat.
Die Kupplungsreaktion wird in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, Acetonitril oder Dimethylformamid, durchgeführt. Ein Überschuß eines tertiären Amins, z. B. Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin oder N-Methylpyrrolidin, wird zugesetzt, um das Reaktionsgemisch auf einem pH-Wert von etwa 8 zu halten. Die Reaktionstemperatur liegt üblicherweise im Bereich von 0 bis 50°C und die Reaktionszeit üblicherweise im Bereich von 15 Minuten bis 24 Stunden.
Bei Anwendung eines synthetischen Festphasenverfahrens wird die C-terminale Carbonsäure an einen unlöslichen Träger (üblicherweise Polystyrol) gebunden. Diese unlöslichen Träger enthalten eine Gruppe, die mit der Carbonsäure unter Bildung einer Bindung reagiert, die unter den Verlängerungsbedingungen stabil ist, die jedoch später leicht gespalten wird. Zu Beispielen hierfür gehören: Chlor- oder Brommethylharze, Hydroxymethylharze und Aminomethylharze. Zahlreiche dieser Harze sind im Handel erhältlich, wobei die angestrebte C-terminale Aminosäure bereits eingebaut ist. Alternativ kann die Aminosäure dem festen Träger durch bekannte Verfahren einverleibt werden; vergl. S.-S- Wang, J. Am. Chem. Soc., Bd. 95 (1973), S. 1328; E. Atherton, R. C. Shepard, "Solid phase peptide synthesis; a practical approach", IRL Press, Oxford (1989), S. 131–148. Zusätzlich zu den vorstehenden Verfahren sind weitere Verfahren der Peptidsynthese in folgenden Literaturstellen beschrieben: Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Auflage, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Herausgeber, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Bd. 1, 2, 3, 5 und 9, Academic Press, New York (1980–1987); Bodansky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, New York (1984).
Die funktionellen Gruppen der als Bestandteile dienenden Aminosäuren müssen im allgemeinen während der Kupplungsreaktionen geschützt werden, um die Bildung von unerwünschten Bindungen zu vermeiden. Die Schutzgruppen, die verwendet werden können, sind in folgenden Druckschriften aufgeführt: Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) und "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Bd. 3, Academic Press, New York (1981).
Die α-Carboxylgruppe des C-terminalen Restes wird üblicherweise durch einen Ester (PG1) geschützt, der unter Bildung der Carbonsäure gespalten werden kann. Zu Schutzgruppen, die verwendet werden können, gehören: 1) Alkylester, wie Methyl, Trimethylsilylethyl und tert.-Butyl; 2) Aralkylester, wie Benzyl und substituiertes Benzyl; oder 3) Ester, die durch Behandlung mit einer schwachen Base oder durch schwache reduktive Mittel gespalten werden können, wie Trichlorethyl- und Phenacylester.
Die α-Aminogruppe jeder Aminosäure, die an die wachsende Peptidkette zu kuppeln ist, muß mit einer Schutzgruppe versehen werden (PG2). Es können beliebige, aus dem Stand der Technik bekannte Schutzgruppen verwendet werden. Zu Beispielen für derartige Gruppen gehören: 1) Acylgruppen, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl und p-Toluolsulfonyl; 2) aromatische Carbamatgruppen, wie Benzyloxycarbonyl (Cbz oder Z) und substituierte Benzyloxycarbonyle, und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc); 3) aliphatische Carbamatgruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), Ethoxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl; 4) cyclische Alkylcarbamatgruppen, wie Cyclopentyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl; 5) Alkylgruppen, wie Triphenylmethyl und Benzyl; 6) Trialkylsilyl, wie Trimethylsilyl; und 7) thiolhaltige Gruppen, wie Phenylthiocarbonyl und Dithiasuccinoyl. Bei den bevorzugten α-Aminoschutzgruppen handelt es sich entweder um Boc oder Fmoc. Zahlreiche Aminosäurederivate, die in geeigneter Weise für die Peptidsynthese geschützt sind, sind im Handel erhältlich.
Die α-Aminoschutzgruppe des neu addierten Aminosäurerestes wird vor der Kupplung der nächsten Aminosäure abgespalten. Sei Verwendung der Boc-Gruppe handelt es sich bei dem Verfahren der Wahl um die Verwendung von Trifluoressigsäure in Reinsubstanz oder in Dichlormethan oder um die Verwendung von HCl in Dioxan oder Ethylacetat. Das erhaltene Ammoniumsalz wird sodann entweder vor der Kupplung oder in situ mit basischen Lösungen, wie wässrigen Puffern, oder tertiären Aminen in Dichlormethan oder Acetonitril oder Dimethylformamid, neutralisiert. Bei Verwendung der Fmoc-Gruppe handelt es sich bei den Reagentien der Wahl um Piperidin oder substituiertes Piperidin in Dimethylformamid, wobei aber beliebige sekundäre Amine verwendet werden können. Die Schutzgruppeneinführung wird bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur (RT), üblicherweise 20–22°C, durchgeführt.
Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten müssen während der Herstellung des Peptids unter Verwendung beliebiger der vorerwähnten Gruppen geschützt werden. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die Auswahl und die Verwendung geeigneter Schutzgruppen für diese funktionellen Seitenketten von der Aminosäure und dem Vorliegen von anderen Schutzgruppen im Peptid abhängen. Die Auswahl derartiger Schutzgruppen ist insofern wichtig, als die Gruppe während der Schutzgruppenentfernung und Kupplung der α-Aminogruppe nicht entfernt werden darf.
Beispielsweise eignen sich bei Verwendung von Boc als α-Aminoschutzgruppe die folgenden Seitenkettenschutzgruppen: p-Toluolsulfonyl (Tosyl)-Reste können zum Schutz der Aminoseitenkette von Aminosäuren, wie Lys und Arg, verwendet werden; Acetamidomethyl-, Benzyl (Bn)- oder tert.-Butylsulfonyl-Reste können zum Schutz der sulfidhaltigen Seitenkette von Cystein verwendet werden; Benzyl (Bn)-ether können zum Schutz der hydroxylhaltigen Seitenketten von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin verwendet werden; und Benzylester können zum Schutz der carboxylhaltigen Seitenketten von Asparaginsäure und Glutaminsäure verwendet werden.
Wenn Fmoc für den Schutz der α-Aminogruppe verwendet wird, sind im allgemeinen Schutzgruppen auf der Basis von tert.-Butyl akzeptabel. Beispielsweise können Boc für Lysin und Arginin, tert.-Butylether für Serin, Threonin und Hydroxyprolin sowie tert.-Butylester für Asparaginsäure und Glutaminsäure verwendet werden. Der Triphenylmethyl(Trityl)-Rest kann zum Schutz der sulfidhaltigen Seitenkette von Cystein verwendet werden.
Nachdem die Verlängerung des Peptids beendet ist, werden sämtliche Schutzgruppen entfernt. Bei Anwendung einer Synthese in flüssiger Phase werden die Schutzgruppen auf beliebige Weise entsprechend der durch die Wahl der Schutzgruppen festgelegten Bedingungen entfernt. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
Bei Anwendung einer Festphasensynthese wird das Peptid vom Harz gleichzeitig mit der Entfernung der Schutzgruppen abgespalten. Wenn das Boc-Schutzgruppenverfahren bei der Synthese herangezogen wird, stellt die Behandlung mit wasserfreiem HF mit einem Gehalt an Additiven, wie Dimethylsulfid, Anisol, Thioanisol oder p-Cresol, bei 0°C das bevorzugte Verfahren zur Abspaltung des Peptids vom Harz dar. Die Abspaltung des Peptids kann auch durch andere Säurereagenzien, wie Trifluormethansulfonsäure/Trifluoressigsäure-Gemische, erreicht werden. Wenn das Fmoc-Schutzgruppenverfahren herangezogen wird, wird die N-terminale Fmoc-Gruppe mit früher beschriebenen Reagenzien abgespalten. Die übrigen Schutzgruppen und das Peptid werden vom Harz unter Verwendung einer Lösung von Trifluoressigsäure und verschiedenen Additiven, wie Anisol und dergl., gespalten.
Wenn Q CH₂ bedeutet, a den Wert 0 hat, b den Wert 0 hat und B R_11aN(R_11b)C(O) bedeutet, werden die Verbindungen nach einem Verfahren hergestellt, das analog zu dem allgemeinen Verfahren ist, das für die Peptide in Schema I beschrieben wurde, wobei ein leicht zugängliches Succinyl-Zwischenprodukt, nämlich t-BuO-C(O)CH₂CH(R₄)-CO-PG1, verwendet wird (z. B. PG1 = 2-Oxo-4-subst.-oxazolidin-3-yl). Dieses Succinyl-Zwischenprodukt lässt sich leicht gemäß dem Verfahren von Evans et al. (J. Am. Chem. Soc., Bd. 104 (1982) S. 1737) unter Verwendung des entsprechenden, in der 4-Stellung substituierten 3-Acyl-2-oxazolidinons in Gegenwart einer starken Base, wie Lithiumdiisopropylamid oder Natrium-bis-(trimethylsilyl)-amid, und von tert.-Butylbromacetat herstellen. Nach Abspaltung des 2-Oxazolidinon-Restes mit LiOOH (Evans et al., Tetrahedron Lett., Bd. 28 (1987), S. 6141) wurde die erhaltene Säure an das P3-P2-P1-PG1-Segment gekuppelt, wodurch man t-BuO-C(O)-CH₂CH(R₄)-CO-P3-P2-P1-PG1 erhielt. Das letztgenannte Produkt wurde mit Chlorwasserstoff behandelt, um den terminalen tert-Butylester selektiv in die entsprechende Säure umzuwandeln, die schließlich an R_11aNH(R_11b) gekuppelt wurde, wonach man nach Entfernung der Schutzgruppe(n) das angestrebte Peptidderivat erhielt. Die Amine R_11aNH(R_11b) stellen handelsübliche Verbindungen dar oder lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen. Eine spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens ist in Beispiel 18 aufgeführt.
Alternativ lässt sich unter Verwendung des gleichen Succinyl-Zwischenprodukts (t-BuO-C(O)CH₂CH(R₄)-CO-PG1) die Reaktionsfolge umkehren, um zunächst R_11aNH(R_11b) und anschließend P3-P2-P1-PG1 einzuführen und das angestrebte Peptidderivat zu bilden.
Synthese der Verkappungsgruppe B und der P6-, P5-, P4- und P3-Reste
Verschiedene Verkappungsgruppen B werden in das geschützte P6, P5, P4, das gesamte Peptid oder in ein beliebiges Peptidsegment mit einem geeigneten Acylchlorid, das entweder handelsüblich ist oder dessen Synthese aus dem Stand der Technik bekannt ist, eingeführt.
Verschiedene P6- bis P3-Reste sind im Handel erhältlich oder lassen sich nach bekannten Verfahren synthetisieren.
Synthese von P2-Resten
1. Synthese von Vorläufern
A) Synthese von Halogenarylmethan-Derivaten
Die Herstellung eines Halogenmethyl-8-chinolins Ild wurde gemäß dem Verfahren von K. N. Campbell et al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 68 (1946), S. 1844, durchgeführt. Schema 11
(halo = Halogen)
Kurz zusammengefasst, 8-Chinolincarbonsäure IIa wurde in den entsprechenden Alkohol IIc umgewandelt, indem man das entsprechende Säurehalogenid IIb mit einem Reduktionsmittel, wie Lithiumaluminiumhydrid behandelte. Die Behandlung des Alkohols IIc mit der entsprechenden Halogenwasserstoffsäure ergibt das gewünschte Halogenderivat IId. Eine spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens wird in Beispiel 1 dargelegt.
2. Synthese von P2

A) Die Synthese eines 4-substituierten Prolins (wobei R² über ein Kohlenstoffatom an den Ring gebunden ist) (mit der dargestellten Stereochemie)
wird gemäß Schema III entsprechend dem von J. Ezquerra et al. (Tetrahedron, Bd. 38 (1993), S. 8665–8678) und von C. Pedregal et al. (Tetrahedron Lett., Bd. 35 (1994), S. 2053–2056) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Schema III
Kurz zusammengefasst, Boc-Pyroglutaminsäure wird in Form eines Benzylesters geschützt. Die Behandlung mit einer starken Base, wie Lithiumdiisopropylamid und die anschließende Zugabe eines Alkylierungsmittels (Br-R² oder I-R²) ergibt nach Reduktion des Amids und Entfernung der Esterschutzgruppe die erwünschten Verbindungen IIIe.
B) Die Synthese von O-alkyliertem 4-(R)-Hydroxyprolin:
kann unter Anwendung verschiedener, nachstehend beschriebener Verfahren durchgeführt werden.
B.1) Wenn R¹² die Bedeutung Aralkyl hat, lässt sich das Verfahren gemäß der von E. M. Smith et al. (J. Med. Chem., Bd. 31 (1988), S. 875–885) beschriebenen Vorgehensweise durchführen. Kurz zusammengefasst, handelsübliches Boc-4(R)-Hydroxyprolin wird mit einer Base, wie Natriumhydrid, behandelt, und das erhaltene Alkoxid wird mit einem Alkylierungsmittel (Br-R¹² oder I-R¹²) unter Bildung der gewünschten Verbindungen umgesetzt. Spezielle Ausführungsformen für dieses Verfahren sind in den Beispielen 3 und 4 dargelegt.
B.2) Wenn R¹² Aryl bedeutet, lassen sich die Verbindungen über eine Mitsunobu-Reaktion herstellen (Mitsunobu, Synthesis, Januar 1981, S. 1–28; Rano et al., Tet. Lett. Bd. 36(22) (1995), S. 3779–3792; Krchnak et al., Tet. Lett., Bd. 36(5) (1995), S. 6193–6196; Richter et al., Tet. Lett., Bd. 35(27) (1994), S. 4705–4706). Kurz zusammengefasst, handelsüblicher Boc-4(S)-Hydroxyprolinmethylester wird mit dem entsprechenden Arylalkohol oder -thiol in Gegenwart von Triphenylphosphin und Diethylazodicarboxylat (DEAD) behandelt und der erhaltene Ester wird zur Säure hydrolysiert. Eine spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens ist in den Beispielen 5 und 6 dargestellt. Schema IV
Alternativ kann die Mitsunobu-Reaktion in fester Phase durchgeführt werden (gemäß Darstellung in Schema IV). Der Block mit 96 Vertiefungen des Modell 396-Synthesegeräts ("Advanced ChemTech") wird mit Aliquotmengen der harzgebundenen Verbindung (IVa) versetzt und verschiedene Arylalkohole oder -thiole und entsprechende Reagenzien werden zugegeben. Nach Inkubation werden die einzelnen harzgebundenen Produkte (IVb) gewaschen, getrocknet und vom Harz abgespalten.
B.2.a) Eine Suzuki-Reaktion kann ebenfalls zur weiteren Funktionalisierung des Arylsubstituenten herangezogen werden (Miyaura et al., Synth. Comm. Bd. 11 (1981), S. 513; Sato et al., Chem. Lett., (1989), S. 1405; Watanabe et al., Synlett., (1992), S. 207; Takayuki et al., J. Org. Chem., Bd. 58 (1993), S. 2201; Frenette et al., Tet. Lett., Bd. 35(49) (1994), S. 9177–9180; Guiles et al., J. Org. Chem., Bd. 61 (1996), S. 5169–5171).

Beispiele
Nachstehend wird die Erfindung durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele näher erläutert.
Temperaturen werden in Grad Celsius (°C) angegeben. Die Prozentangaben für Lösungen geben das Verhältnis von Gewicht zu Volumen wieder und Verhältnisangaben für Lösungen ergeben das Verhältnis von Volumen zu Volumen wieder, sofern nichts anderes angegeben ist. Kernmagnetische Resonanzspektren (NMR-Spektren) wurden an einem Bruker 400 MHz-Spektrometer aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen (δ) sind in Teilen pro Million (ppm) angegeben. Eine Flash-Chromatographie wurde an Kieselgel (SiO₂) gemäß der Still-Flash-Chromatographietechnik durchgeführt (W. C. Still et al., J. Org. Chem., Bd. 43, (1978), S. 2923).
Zu den Abkürzungen, die in den Beispielen verwendet werden, gehören folgende Abkürzungen:
Bn: Benzyl; Boc: tert.-Butyloxycarbonyl {Me₃COC(O)}; BSA: Rinderserumalbumin; CHAPS: 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat; DBU: 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en; CH₂Cl₂ = DCM: Methylenchlorid; DIAD: Diisopropylazodicarboxylat; DIPEA: Diisopropylethylamin; DMAP: Dimethylaminopyridin; DCC: 1,3-Dicyclohexyl-carbodiimid; DME: 1,2-Dimethoxyethan; DMF: Dimethylformamid; DMSO: Dimethylsulfoxid; DTT: Dithiothreit oder Threo-1,4-dimercapto-2,3-butandiol; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure; Et: Ethyl; EtOH: Ethanol; EtOAc: Ethylacetat; Et₂O: Diethylether; HPLC: Hochleistungs-Flüssigchromatograpie; MS: Massenspektrometrie; (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Disorption Ionisation-Time of Flight, FAB: Fast Atom Bombardment); LAH: Lithiumaluminumhydrid; Me: Methyl; MeOH: Methanol; MES: (2-{N-Morpholino}-ethan-sulfonsäure); NaHMDS: Natrium-bis-(trimethylsilyl)-amid; NMM: N-Methylmorpholin; NMP: N-Methylpyrrolidin; Pr: Propyl; Succ: 4-Hydroxy-1,4-dioxobutyl; PNA: 4-Nitrophenylamino- oder p-Nitroanilid; TBAF: Tetra-n-butylammoniumfluorid; TCEP: Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid; TFA: Trifluoressigsäure; THF: Tetrahydrofuran; TIS: Triisopropylsilan; TLC: Dünnschichtchromatographie; TMSE: Trimethylsilylethyl; Tris/HCl: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid.
Beispiel 1 Synthese von Brommethyl-8-chinolin (1):
Handelsübliche 8-Chinolincarbonsäure (2,5 g, 14,4 mmol) wurde zu reinem Thionylchlorid (10 ml, 144 mmol) gegeben. Dieses Gemisch wurde 1 Stunde auf 80°C erwärmt, wonach überschüssiges Thionylchlorid unter vermindertem Druck abdestilliert wurde. Der erhaltene braunstichige Feststoff wurde mit absolutem EtOH (15 ml) versetzt. Nach 1-stündigem Erwärmen auf 80°C wurde das Gemisch unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit EtOAc und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt ein braunstichiges Öl, (2,8 g). Dieses Material (etwa 14,4 mmol) wurde tropfenweise innerhalb von 35 Minuten zu einer LAH (0,76 g, 20,2 mmol)/Et₂O-Suspension, die auf –60°C gekühlt war, gegeben. Sodann wurde das Reaktionsgemisch langsam innerhalb von 1,5 Stunden auf –35°C erwärmt, bevor die Umsetzung vollständig war. Sodann wurde das Reaktionsgemisch langsam innerhalb von 30 Minuten mit MgSO₄ × 10H₂O und anschließend mit feuchtem THF versetzt. Das Gemisch wurde mit Et₂O und 10-prozentiger wässriger NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt einen gelbstichigen Feststoff (2,31 g, 80% über 2 Stufen), der dem Alkohol entsprach. Der Alkohol (2,3 g, 11,44 mmol) wurde in AcOH/HBr (20 ml, 30-prozentige Lösung, Fa. Aldrich) gelöst und 2,5 Stunden auf 70°C erwärmt. Sodann wurde das Gemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und mit EtOAc (100 ml) und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung ausgeschüttelt. Nach Trocknen (MgSO₄), Filtrieren und Einengen erhielt man die angestrebte Verbindung (1) in Form eines braunstichigen Feststoffes (2,54 g, 100%)
Beispiel 2 Synthese von Boc-4(R)-(3-phenylpropyl)-prolin (2d)
a) Synthese der Verbindung 2b
Eine Lösung von Boc-Pyroglutaminsäurebenzylester (2a) (hergestellt gemäß A. L. Johnson et al., J. Med. Chem., Bd. 28 (1985), S. 1596–1602) (500 mg, 1,57 mmol) in THF (10 ml) wurde bei –78°C langsam mit Lithiumhexamethyldisilylazid (1,72 ml, 1 M Lösung in THF) versetzt. Nach 1-stündigem Rühren bei –78°C wurde Cinnamylbromid (278 μl, 1,88 mmol) zugegeben. Der Rührvorgang wurde weitere 2 Stunden fortgesetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit gesättiger Ammoniumchloridlösung versetzt und mit Ethylether (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie (8:2 Hexan:Ethylacetat) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 2b in Form eines gebrochen weissen Feststoffes (367 mg, Ausbeute 54%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,35–7,19 (m, 10H), 6,43 (d, J = 15 Hz, 1H), 6,11 (ddd, J = 15, J' = J'' = 8 Hz, 1H), 5,26 (d, J = 16 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 16 Hz, 1H), 4,59 (dd, J = 9,5, J' = 2 Hz, 1H), 2,83–2,70 (m, 2H), 2,41–2,34 (m, 1H), 2,22–2,16 (m, 1H), 2,10–2,02 (m, 1H), 1,42 (s, 9H).
b) Synthese der Verbindung 2c
Bei –78°C wurde Lithiumtriethylborhydrid (1 M Lösung in THF, 1,01 ml, 1,01 mmol) unter einer Stickstoffatmosphäre zu einer Lösung der Verbindung 2b (367 mg, 0,843 mmol) in THF (5 ml) gegeben. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit gesättiger wässriger NaHCO₃-Lösung (2 ml) versetzt und auf 0°C erwärmt. Sodann wurde 30 prozentiges H₂O₂ (5 Tropfen) zugegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten bei 0°C gerührt. Die organischen flüchtigen Bestandteile wurden unter Vakuum entfernt und die wässrige Phase wurde mit CH₂Cl₂ (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Eine kalte (–78°C) Lösung des Rückstands und von Triethylsilan (134 μl, 0,843 mmol) in CH₂Cl₂ (3 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre tropfenweise mit Bortrifluoridetherat (118 μl, 0,927 mmol) versetzt. Nach 30 Minuten wurden weiteres Triethylsilan (134 μl) und Bortrifluoridetherat (118 μl) zugegeben. Nach 2-stündigem Rühren bei –78°C wurde das Reaktionsgemisch mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2 ml) versetzt und mit DCM (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Das rohe Produkt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (8:2 Hexan:Ethylacetat) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 2c in Form eines farblosen Öls (140 mg, Ausbeute 40%), ¹H-NMR (CDCl₃) (Hinweis auf die Anwesenheit von 2 Rotameren) δ: 7,34–7,22 (m, 10H), 6,38 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 6,15–6,08 (m, 1H), 5,29–5,07 (m, 2H), 4,44 (d, J = 7 Hz, 1/3H), 4,33 (d, J = 7 Hz, 2/3H), 3,76 (dd, J = 10,5, J' = 8,5 Hz, 2/3H), 3,69 (dd, J = 10,5, J' = 8,5 Hz, 1/3H), 3,13 (dd, J = 9, J' = 8,5 Hz, 2/3H), 3,05 (dd, J = 9, J' = 8,5 Hz, 1/3H), 2,47–2,40 (m, 1H), 2,35–2,2 (m, 2H) 2,15–1,85 (m, 2H), 1,45 (s, (3/9) 9H), 1,33 (s, (6/9) 9H).
c) Synthese der Verbindung 2d
Eine Lösung der Verbindung 2c (140 mg, 0,332 mmol) in Ethanol (4 ml) wurde mit 10% Palladium-auf-Aktivkohle (30 mg) versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der Katalysator wurde entfernt, indem man das Gemisch über einen Millipore-Millex-HV-0,45 μm-Filter leitete. Die klare Lösung wurde eingeengt. Man erhielt die angestrebte Verbindung 2d in Form eines farblosen Öls (115 mg, quantitative Ausbeute).
¹H-NMR (DMSO-d₆) (Hinweis auf die Anwesenheit von 2 Rotameren): δ 7,28–7,14 (m, 5H), 4,33 (br, s, 1H), 4,06–4,10, (m, 1H), 3,56–3,42 (m, 3H), 2,89–2,79 (m, 1H), ), 2,53–2,49 (m, 1H, unter DMSO-d₆), 2,24–2,10 (m, 1H), 2,03–1,93 (m, 1H), 1,871,75 (m, 1H), 1,62–1,45 (m, 2H), 1,38 (s, (3/9) 9H), 1,33 (s, (6/9) 9H),
Beipiel 3 Synthese von Boc-4(R)-(Naphthalin-1-ylmethoxy)-prolin (3)
Handelsübliches Boc-4(R)-Hydroxyprolin (5,00 g, 21,6 mmol) wurde in THF (100 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Natriumhydrid (60 prozentige Dispersion in Öl, 1,85 g, 45,4 mmol) wurde portionsweise innerhalb von 10 Minuten zugegeben. Die Suspension wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde 1-(Brommethyl)-naphthalin (8,00 g, 36,2 mmol) (hergestellt gemäß E. A. Dixon et al., Can. J. Chem., Bd. 59 (1981), S. 2629–2641) zugegeben und das Gemisch wurde 18 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Sodann wurde das Gemisch in Wasser (300 ml) gegossen und mit Hexan gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit 10-prozentiger wässriger HCl angesäuert und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (49:49:2 Hexan:Ethylacetat:Essigsäure) gereinigt. Man erhielt die Titelverbindung in Form eines farblosen Öls (4,51 g, Ausbeute 56%).
¹H-NMR (DMSO-d₆) (Hinweis auf die Anwesenheit von 2 Rotameren): δ 8,05 (m, 1H), 7,94 (m, 1H), 7,29 (d, J = 14 Hz, 1H), 7,55–7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2H), 4,26 (br, s, 1H), 4,12 (dd, J = J = 8 Hz, 1H), 3,54–3,42 (m, 2H), 2,45–2,34 (m, 1H), 2,07–1,98 (m, 1H) 1,36 (s, (3/9) 9H), 1,34 (s, (6/9) 9H).
Beispiel 4 Synthese von Boc-4(R)-(8-Chinolinmethyloxy)-prolin (4)
Boc-4(R)-Hydroxyprolin (1,96 g, 8,5 mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) wurde zu einer Suspension von NaH (1,4 g, 60% in Öl, 34 mmol) in THF (100 ml) gegeben. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, wonach Brommethyl-8-chinolin von Beispiel 1 (2,54 g, 11,44 mmol) in THF (30 ml) zugegeben wurde. Sodann wurde das Reaktionsgemisch auf 70°C (5 Stunden) erwärmt, wonach überschüssiges NaH vorsichtig mit feuchtem THF zerstört wurde. Sodann wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingeengt und das erhaltene Material wurde in EtOAc and H₂O gelöst. Die basische wässrige Phase wurde abgetrennt und mit 10-prozentiger wässriger HCl auf den pH-Wert ~5 angesäuert, wonach eine Extraktion mit EtOAc (150 ml) vorgenommen wurde. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt ein braunes Öl. Nach Reinigung durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel: 10% MeON/CHCl₃) erhielt man die angestrebte Verbindung in Form eines blassgelben Feststoffes (2,73 g, 86%).
HPLC (97,5%); ¹H-NMR (DMSO-d₆) (zeigt die Anwesenheit von Rotamerpopulationen in einem Verhältnis von 6:4) δ 12–11,4 (bs, 1H), 8,92 (2 × d, J = 4,14 and 4,14 Hz, 1H), 8,38 (2 × d, J = 8,27 and 8,27 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 7,94 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,63–7,54 (m, 2H), 5,14 (2 × s, 2H), 4,32–4,29 (m, 1H), 4,14–4,07 (m, 1H), 3,52–3,44 (m, 2H), 2,43–2,27 (m, 1H), 2,13–2,04 (m, 1H), 1,36 und 1,34 (2 × s, 9H).
Beispiel 5 Herstellung von Boc-4(R)-(7-Chlorchinolin-4-oxo)-prolin (5)
Handelsüblicher Boc-4(S)-Hydroxyprolinmethylester (500 mg, 2,04 mmol) und 7-Chlor-4-hydroxychinolin (440 mg, 2,45 mmol) wurden bei 0°C in trockenes THF (10 ml) gegeben. Sodann wurden Triphenylphosphin (641 mg, 2,95 mmol) zugesetzt, wonach die langsame Zugabe von DIAD (426 mg, 2,45 mmol) folgte. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch eingeengt, in Ethylacetat aufgenommen und dreimal mit 1 N HCl extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit Na₂CO₃ alkalisch gemacht und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt ein gelbes Öl. Dieses Öl wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt. Man erhielt den Methylester der Verbindung (5) in Form eines weißen Feststoffes. 498 mg, Ausbeute 58%.
Dieser Methylester (400 mg, 0,986 mmol) wurde mit einer 1 M wässrigen Natriumhydroxidlösung (1,7 ml, 1,7 mmol) in Methanol (4 ml), 3 Stunden bei 0°C hydrolysiert. Sodann wurde die Lösung zur Entfernung des Methanols eingeengt und mit 1 M wässriger HCl neutralisiert. Die Suspension wurde zur Trockne eingeengt und in Methanol (20 ml) aufgenommen. Die Salze wurden filtriert und das Filtrat wurde eingeengt. Man erhielt die angestrebte Verbindung (5) in Form eines weißen Feststoffes. 387 mg, quantitative Ausbeute.
¹H-NMR (DMSO-d₆) (etwa 1:1-Gemisch von Rotameren) δ 8,74 (d, J = 5 Hz, 1 H), 8,13–8,09 (m, 1H), 7,99 und 7,98 (s, 1H), 7,58 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 5 Hz, 1H), 5,26–5,20 (m, 1H), 4,10–4,01 (m, 1H), 3,81–3,72 (m, 1H), 3,59 (dd, J = 12, 10 Hz, 1H), 2,41–2,31 (m, 2H), 1,34 und 1,31 (s, 9H).
Beispiel 6
Allgemeines Verfahren zur Mitsunobu-Reaktion in fester Phase (Schema IV)
Das polymergebundene Peptid der allgemeinen Struktur IVa (0,327 mmol Peptid pro 1 g Wang-Harz) wurde unter Hochvakuum in einem Exsikkator über P₂O₅ getrocknet. Der Block mit 96 Vertiefungen des Synthesegeräts Advanced ChemTech Model 396 wurde mit Aliquotanteilen der Verbindung IVa (120 mg, 0,04 mmol Peptid pro Vertiefung) beschickt. Die einzelnen Proben wurden 5 Minuten mit wasserfreiem CH₂Cl₂ (5 × 1200 μl) und sodann mit wasserfreiem THF (5 × 1500 μl) gewaschen. Wasserfreies THF (200 μl) wurde zu jeder Probe gegeben. Das Synthesegerät wurde zeitweilig gestoppt, um die manuelle Zugabe von Reagenzien zu ermöglichen. Ph₃P (5 äq. in 400 μl wasserfreiem THF) und Diethylazodicarboxylat (DIAD, 5 äq. in 250 μl wasserfreiem THF) wurden zu jeder Probe gegeben, bevor die Zugabe eines Phenol- oder Thiophenol-Reagenz (5 äq., 0,2 mmol, gelöst in 500 μl wasserfreiem THF) folgte. Eine Bibliothek von Reagenzien wurde zur Herstellung der Bibliothek von HCV-Protease-Inhibitoren, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, verwendet. Nach Zugabe sämtlicher Reagenzien wurden die Gemische insgesamt 4 Stunden mit einer Pause von 10 Minuten nach jeder Stunde geschüttelt. Die einzelnen harzgebundenen Produkte wurden mit THF (2 × 1500 μl), DMF (4 × 1500 μl), Isopropanol (4 × 1500 μl), CH₂Cl₂ (4 × 1500 μl) und schließlich mit Methanol (2 × 1500 μl) gewaschen. Sodann wurde die Probe unter Vakuum getrocknet und 1 Stunde mit 40% TFA in CH₂Cl₂ behandelt, um das Peptidprodukt (allgemeine Strukturformel IVb) vom Harz abzuspalten. Sämtliche Produkte wurden durch präparative HPLC an einer Umkehrphasen-C18-Säule unter Verwendung eines linearen Lösungsmittelgradienten von 5% wässrigem CH₃CN bis 100% CH₃CN gereinigt.
Die folgende Beschreibung stellt ein Beispiel für die weitere Ausbildung der Seitenkette R₁₂ an P2 durch Anwendung der Biarylsynthese über eine Suzuki-Kupplung an einem festen Träger dar (vergl. R. Frenette und R. W. Friesen, Tetrahedron Lett., Bd. 35 (1994), S. 9177).
Die Vorstufe, nämlich die aromatische Bromidverbindung 238 von Tabelle 2, wurde zunächst aus dem polymergebunden Tetrapeptid mit cis-Hydroxyprolin in der P2-Position und aus 4-Bromphenol unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Mitsunobu-Verfahrens synthetisiert.
Beispiel 7
Suzuki-Bibliothek von Reaktionen bei der Festphasensynthese
Sämtliche Reaktionen wurden in Hochdruck-Schraubverschluss-Teströhrchen (mit Teflon-Verschlüssen) der Abmessungen 16 × 100 mm, die mit kleinen magnetischen Rührstäben ausgerüstet waren, durchgeführt. Für jede Umsetzung wurde eine entgaste Suspension des palymergebundenen Peptids (100 mg Wang-Harz mit 0,033 mmol gebundenem Peptid) zunächst in das Teströhrchen gegeben, wonach die Zugabe von DME (2 ml), Pd(Ph₃P)₃ (~3 mg, 0,05 äq.), Na₂CO₃ (70 μl einer 2 M Lösung in H₂O, 2,5 äq.) und eines der Phenylboronsäure-Reagenzien aus unserer Bibliothek folgte. Die Teströhrchen wurden mit Stickstoffgas gespült, verschlossen und in ein Ölbad von 80°C gestellt. Bei sämtlichen Umsetzungen wurde vorsichtig gerührt und für einen Reaktionsablauf von 15 bis 18 Stunden gesorgt. Die einzelnen harzgebundenen Peptidprodukte wurden sodann in ein Filtrationsröhrchen aus Kunststoff übertragen, mit DME:H₂O (1:1, 5 × 2 ml), DME (5 × 2 ml), Methanol (5 × 2 ml), CH₃CN (5 × 2 ml) und CH₂Cl₂ (5 × 2 ml) gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Die einzelnen Produkte wurden durch 1-stündige Behandlung der Probe mit 45% TFA in CH₂Cl₂ (1 ml) vom Harz abgespalten. Sämtliche Produkte wurden durch präparative HPLC an einer Umkehrphasen-C18-Säule unter Verwendung eines linearen Lösungsmittelgradienten von 5% wässrigem CH₃CN bis 100% CH₃CN gereinigt.
Beispiel 8
Herstellung einer Bibliothek von Ac-Chg-Val-Hyp(aryl)-Acca-OH
Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 6 hergestellt, wobei geeignete Peptide verwendet wurden.
Beispiel 9 Synthese der polymergebundenen Verbindung #246 von Tabelle 2
Die Synthese der Verbindung 246 wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 durchgeführt.
Verbindung 246:

ES^– MS m/z 675,3 [(M – H)^–]; ~95% rein durch C18-Umkehrphasen-HPLC; Gemisch von 2 Rotameren in einem Verhältnis von ~1:3, auf der Basis von ¹H-NMR
¹H-NMR des Hauptrotameren (400 MHz, DMSO): δ 8,44 (s, 1H), 7,84 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,82 (d, J = ~8,6 Hz, 1H), 7,54 (bd, J = 8,3 Hz, 4H), 6,99 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,98 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,11 (bs, 1H), 4,29–4,34 (m, 2H), 4,21 (bt, J = 7,8 Hz, 1H), 3,94–4,02 (m, 2H), 3,78 (s, 3H), 2,29–2,33 (m, 2H), 2,15–2,21 (m, 1H), 1,95–1,99 (m, 1H), 1,83 (s, 3H), 1,45–1,70 (m, 8H), 1,33–1,40 (m, 1H), 1,20–1,29 (m, 1H), 1,02–1,18 (m, 2H), ~0,9–1,02 (m, 2H), 0,90 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,84 (d, J = 6,7 Hz, 3H).

Beispiel 10
Allgemeines Verfahren für in Lösung durchgeführte Kupplungsreaktionen (vergl. auch R. Knorr et al., Tetrahedron Letters, Bd. 30 (1989), S. 1927)
Die Reaktanten, d. h. ein freies Amin (1 äq.) (oder dessen Hydrochloridsalz) und die freie Carbonsäure (1 äq.), wurden in CH₂Cl₂, CH₃CN oder DMF gelöst. Unter einer Stickstoffatmosphäre wurden 4 Äquivalente N-Methylmorpholin und 1,05 Äquivalent des Kupplungsmittels zu der gerührten Lösung gegeben. Nach 20 Minuten wurde 1 Äquivalent des zweiten Reaktanten, d. h. eine freie Carbonsäure, zugegeben. Zweckmäßige und wirksame Kupplungsreagenzien für diesen Zweck sind (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorphosphat (HOBT) oder vorzugsweise 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat (TBTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat (HATU). Die Umsetzung wurde durch TLC überwacht. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit 10%iger wässriger Citronensäure, gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Die Reinigung des Rückstands erfolgte durch Flash-Chromatographie gemäß den vorstehenden Angaben.
Beispiel 11 Synthese des "Tripeptidsegments": Ac-Chg-Chg-Pro(4(R)-naphthalin-1-ylmethoxy)-OH (11g)
Die Verbindung 11a (4,45 g, 11,98 mmol) wurde in wasserfreiem CH₃CN (60 ml) gelöst. DBU (2,2 ml, 14,38 mmol) und Allylbromid (1,1 ml, 13,18 mmol) wurden nacheinander zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann eingeengt. Das erhaltene Öl wurde mit EtOAc und Wasser verdünnt und nacheinander mit Wasser (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die EtOAc-Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingeengt. Das gelbe Öl wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan:EtOAc, 90:10 bis 85:15) gereinigt. Man erhielt das Produkt 11b in Form eines gelben Öls (2, 4,17 g; Ausbeute 85%). MS (FAB) 412 MH⁺
¹H-NMR (CDCl₃), Gemisch von Rotameren etwa 1:2, δ (d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,55–7,41 (m, 4H), 5,95–5,85 (m, 1H), 5,34–5,21 (m, 2H), 5,03–4,88 (m, 2H), 4,70-4,56 (m, 2H), 4,48 & 4,39 (t, J = 8, 15 Hz, 1H), 4,28–4,23 (m, 1H), 3,81–3,55 (m, 2H), 2,46–2,36 (m, 1H), 2,13–2,05 (m, 1H), 1,44 & 1,41 (s, 9H).
Die Verbindung 11b (2,08 g, 5,05 mmol) wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 N HCl/Dioxan behandelt. Nach Eindampfen zur Trockne erhielt man das entsprechende Amin-HCl in Form eines Öls. Das Amin-HCl 11c wurde in wasserfreiem DCM (25 ml) gelöst und nacheinander mit NMM (2,2 ml, 20,22 mmol), Boc-Chg-OH·H₂O (1,53 g, 5,56 mmol) und TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit EtOAc verdünnt und nacheinander mit 10%iger wässriger Citronensäure (2×), gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2×), Wasser (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die EtOAc-Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Man erhielt das rohe Produkt 11d in Form eines gelbstichig-weißen Schaums (etwa 2,78 g, Ausbeute 100%).
MS (FAB) 551,4 MH⁺
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,03 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,86 (b d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,84 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,56–7,40 (m, 4H), 5,92–5,85 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,22 (dd, J = 1, 10 Hz; 1H), 5,17 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,67–4,60 (m, 3H), 4,31–4,27 (m, 2H), 4,16 (b d, J = 11 Hz, 1H), 3,71 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,47–2,41 (m, 1H), 2,08–1,99 (m, 1H), 1,85–1,63 (m, 5H), 1,44–1,40 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,28–1,00 (m, 5H).
Das rohe Dipeptid 11d (etwa 5,05 mmol) wurde gemäß den Angaben für Verbindung 11c mit 4 N HCl/Dioxan (25 ml) behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde an Boc-Chg-OH·H₂O (1,53 g, 5,55 mmol) mit NMM (2,22 ml, 20,22 mmol) und TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) in DCM (25 ml) gemäß den Angaben für die Verbindung 11d gekuppelt. Man erhielt das rohe Tripeptid in Form eines gelben ölartigen Schaums. Das rohe Material wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan:EtOAc; 80:20 bis 75:25) gereinigt. Man erhielt das Tripeptid 11e in Form eines weißen Schaums (2,75 g; Ausbeute 79% über 2 Stufen).
MS (FAB) 690,5 MH⁺.
¹H-NMR (CDCl₃), hauptsächlich ein Rotameres, δ 8,06 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,57–7,40 (m, 4H), 6,41 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,92–5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H), 5,04 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,98 (b d, J = 7 Hz, 1H), 4,93 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,63–4,58 (m, 4H), 4,29–4,25 (m, 1H), 4,10–4,07 (m, 1H), 3,90–3,84 (m, 1H), 3,72 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,48–2,40 (m, 1H), 2,07–1,99 (m, 1H), 1,83–1,55 (m, 12H), 1,43 (s, 9H), 1,23–0,89 (m, 10H)
Das Tripeptid 11e (2,75 g, 3,99 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (20 ml) gemäß den Angaben für die Verbindung 11c behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde in wasserfreiem DCM (20 ml) gelöst. NMM (1,75 ml, 15,94 mmol) und Essigsäureanhydrid (752 μl, 7,97 mmol) wurden nacheinander zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit EtOAc verdünnt. Die organische Phase wurde nacheinander mit 10%iger wässriger Citronensäure (2×), gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2×), Wasser (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Man erhielt das rohe Tripeptid 11f in Form eines weißen Schaums (2,48 g, Ausbeute 98%).
MS (FAB) 632,4 MH⁺¹.
¹H-NMR (CDCl₃), hauptsächlich ein Rotameres, δ 8,06 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,58–7,40 (m, 4H), 6,36 (d, J = 9 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,94–5,83 (m, 1H), 5,34–5,28 (m, 1H), 5,25–5,21 (m, 1H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,64–4,57 (m, 4H), 4,30–4,23 (m, 2H), 4,12–4,08 (m, 1H), 3,73 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,49–2,42 (m, 1H), 2,08–2,01 (m, 1H), 1,99 (s, 3H), 1,85–1,53 (m, 11H), 1,25–0,88 (m, 11H)
Das rohe Tripeptid 11f (2,48 g, 3,93 mmol) wurde in einem wasserfreien Gemisch aus CH₃CN:DCM (20 ml) gelöst. Triphenylphosphin (53,5 mg, 0,200 mmol) und Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium(0)-Katalysator (117,9 mg, 0,102 mmol) wurden nacheinander zugegeben, wonach die Zugabe von Pyrrolidin (353,9 μl, 4,24 mmol) folgte. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc und 10%iger wässriger Citronensäure gelöst und sodann 2-mal mit 10%iger wässriger Citronensäure, Wasser (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft. Das rohe Produkt wurde in Et₂O:DCM (85:15) verrieben. Nach Filtration erhielt man das Tripeptid 11g in Form eines weißen Feststoffes (2,09 g, Ausbeute 90%).
MS (FAB) 592,4 MH⁺ 614,3 (M + Na)⁺.
¹H-NMR (CDCl₃), hauptsächlich ein Rotameres, δ 8,08 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,93 (b d, J = 9 Hz, 1H), 7,88 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,57–7,41 (m, 4H), 6,47 (d, J = 8, 5 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,73 (t, J = 9,5, 19 Hz, 1H), 4,44–4,35 (m, 2H), 4,26 (b s, 1H), 4,19 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 3,75 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,47 (b dd, J = 7,5, 13,5 Hz, 1H), 2,20–2,11 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,88–1,41 (m, 11H), 1,30–0,80 (11H).
Beispiel 12 Synthese des "Tripeptidsegments" -Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-naphthalin-1-ylmethoxy)-OH (12e)
Die Verbindung 12a (2,89 g, 7,02 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (30 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 11c behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde an Boc-Val-OH (1,53 g, 7,73 mmol) mit NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) und TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) in DCM (35 ml) für 3,5 Stunden gemäß den Angaben für Verbindung 3 gekuppelt. Man erhielt das rohe Dipeptid 12b in Form eines elfenbeinfarbenen ölartigen Schaums (etwa 3,60 g, Ausbeute 100%).
MS (FAB) 509,3 MH^– 511,3 MH⁺ 533,2 (M + Na)⁺.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,04 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 7 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,56–7,40 (m, 4H), 5,93–5,85 (m, 1H), 5,34–5,28 (m, 1H), 5,24–19 (m, 2H), 5,04 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,67–4,60 (m, 3H), 4,31–4,26 (m, 2H), 4,11–4,09 (m, 1H), 3,72 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,48–2,41 (m, 1H), 2,07–1,99 (m, 1H), 1,44–1,36 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,01 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H).
Das rohe Dipeptid 12b (etwa 7,02 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (30 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 11c behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde an Boc-Chg-OH·H₂O (2,13 g, 7,73 mmol) mit NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) und TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) in CH₂Cl₂ (35 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 3 gekuppelt. Man erhielt das rohe Tripeptid 12c in Form eines elfenbeinfarbenen Schaums (etwa 4,6 g, Ausbeute 100%).
MS (FAB) 648,5 MH^– 672,4 (M + Na)⁺.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,06 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,87 (b d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,82 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,57–7,40 (m, 4H), 6,46 (b d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,94–5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H), 5,03 (d, J = 12 Hz, 1H), 5,00–4,97 (m, 1H), 4,93 (d, J =, 12 Hz, 1H), 4,63–4,59 (m, 4H), 4,29–4,27 (m, 1H), 4,10–4,07 (m, 1H), 3,92–3,86 (m, 1H), 3,72 (dd, J = 5, 11 Hz, 1H), 2,48–2,41 (m, 1H), 2,10–1,99 (m, 1H), 1,76–1,57 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,20–0,92 (m, 6H), 1,00 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H).
Das rohe Tripeptid 12c (etwa 7,02 mmol) wurde mit 4 N HCl/Dioxan (30 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 11c behandelt. Das rohe Hydrochloridsalz wurde ferner mit Essigsäureanhydrid (1,33 ml, 14,05 mmol) und NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) in CH₂Cl₂ (35 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 11f behandelt. Das rohe Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan:EtOAc; 30:70) gereinigt. Man erhielt das acetylierte geschützte Tripeptid 12d in Form eines weißen Schaums (3,39 g, Ausbeute 81% über 3 Stufen).
MS (FAB) 590,3 MH^– 592,4 MH⁺ 614,4 (M + Na)⁺
¹H-NMR (CDCl₃), hauptsächlich ein Rotameres, δ 8,06 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,88 (b d, J = 8 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,58–7,41 (m, 4H), 6,37 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,94–5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 1, 17 Hz, 1H), 5,24 (dd, J = 1, 10,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,66–4,57 (m, 4H), 4,31–4,22 (m, 2H), 4,11–4,05 (m, 1H), 3,73 (dd, J = 4,5, 11 Hz, 1H), 2,50–2,43 (m, 1H), 2,09–2,01 (m, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,68–1,55 (m, 5H), 1,15–0,89 (m, 6H), 0,99 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,91 (d, J = 7 Hz, 3H).
Das acetylierte Tripeptid 12d (3,39 g, 5,73 mmol) wurde mit Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium(0)-Katalysator (172,1 mg, 0,149 mmol) unter Verwendung von Triphenylphosphin (78,1 mg, 0,298 mmol) und Pyrrolidin (516 μl, 6,19 mmol) in einem 1:1-Gemisch aus wasserfreiem CH₃CN:DCM (30 ml) gemäß den Angaben für Verbindung 11g einer Schutzgruppenentfernung unterzogen. Das rohe hellgelbe Schaumprodukt wurde in Et₂O:DCM (85:15) verrieben. Nach Filtration erhielt man das Tripeptid 12e in Form eines gebrochen weißen Feststoffes (3,0 g; Ausbeute 95%).
MS (FAB) 550,3 MH^–
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,08 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,04 (b d, J = 9 Hz, 1H), 7,88 (b d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,58–7,37 (m, 5H), 5,05 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 9,5, 19,5 Hz, 1H), 4,46–4,37 (m, 2H), 4,27 (b s, 1H), 4,17 (d, J = 11 Hz, 1H), 3,74 (dd, J = 4, 11 Hz, 1H), 2,49 (b dd, J = 7,5, 13 Hz, 1H), 2,17–2,09 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 2,03–1,94 (m, 1H), 1,79 (b d, J = 12,5 Hz, 1H), 1,62–1,43 (m, 5H), 1,08–0,85 (m, 5H), 1,00 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 7 Hz, 3H).
Beispiel 13
Allgemeines Verfahren für Kupplungsreaktionen an einem festen Träger
Die Synthese wurde an einem parallelen Synthesegerät Modell ATC396 der Firma Advanced ChemTechs^® mit dem Block mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Typischerweise wurden 24 Peptide unter Anwendung von üblichen Festphasentechniken parallel synthetisiert. Das als Ausgangsprodukt verwendete Fmoc-Nva-Wang-Harz und das 1-(Fmoc-Amino)-cyclopropancarbonsäure-Wangharz wurden durch das DCC/DMAP-Kupplungsverfahren hergestellt. (E. Atherton, R. C. Scheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, Practical Approach; IRL Press, Oxford 1989, S. 131–148). Weitere Aminosäuren-Wang-Harze wurden im Handel bezogen.
Die einzelnen Vertiefungen wurden mit 100 mg des Ausgangsharzes (etwa 0,05 mmol) beschickt. Die Harze wurden nacheinander mit 1,5 ml-Portionen NMP (1×) und DMF (3×) gewaschen. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch 20-minütige Behandlung mit 1,5 ml einer 25 prozentigen (Vol/Vol.) Lösung von Piperidin in DMF entfernt. Die Harze wurden mit 1,5 ml-Portionen DMF (4×), MeOH (3×) und DMF (3×) gewaschen. Die Kupplung wurde in DMF (350 μl) unter Verwendung von 400 μl (0,2 mmol) einer 0,5 M-Lösung von Fmoc-Aminosäure/HOBt-hydrat in DMF, 400 μl (0,4 mmol) einer 0,5 M-Lösung von DIPEA in DMF und 400 μl (0,2 mmol) einer 0,5 M-Lösung von TBTU in DMF durchgeführt. Nach 1-stündigem Schütteln wurden die Vertiefungen entleert. Die Harze wurden mit 1,5 ml DMF gewaschen und anschließend wurde die Kupplung unter den gleichen Bedingungen wiederholt. Sodann wurden die Harze auf die vorstehend angegebene Weise gewaschen und der Zyklus wurde mit der nächsten Aminosäure wiederholt.
Die Verkappungsgruppen wurden auf zwei Wegen eingeführt:

1. In Form einer Carbonsäure unter Anwendung des vorstehenden Verfahrens (z. B. Essigsäure) oder
2. als Acylierungsmittel, wie ein Anhydrid oder ein Säurechlorid.

Das folgende Beispiel erläutert die Verkappung mit Bernsteinsäureanhydrid: Nach Fmoc-Schutzgruppenentfernung und anschließendem Waschvorgang wurde DMF (350 μl) zugegeben, wonach die Zugabe von jeweils 400 μl einer DMF-Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (0,5 M, 0,2 mmol) und DIPEA (1,0 M, 0,4 mmol) folgte.
Die Harze wurden 2 Stunden gerührt und eine erneute Kupplungsstufe wurde durchgeführt.
Am Ende der Synthese wurde das Harz mit 1,5 ml-Portionen DCM (3×), MeOH (3×) und DCM (3×) gewaschen und 2 Stunden unter Vakuum getrocknet.
Die Abspaltung vom Harz und die gleichzeitige Seitenketten-Schutzgruppenentfernung wurden durch Zugabe von 1,5 ml eines Gemisches aus TFA, H₂O, DTT und TIS (92,5:2,5:2,5:2,5) durchgeführt. Nach 2,5-stündigem Schütteln wurde das Harz abfiltriert und mit 1,5 ml DCM gewaschen. Die Filtrate wurden vereinigt und durch Vakuumzentrifugation eingeengt.
Die einzelnen Verbindungen wurden durch präparative Umkehrphasen-HPLC und unter Verwendung einer C18-Säule (22 mm × 500 mm) gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie identifiziert, vereinigt und lyophilisiert.
Beispiel 14 Synthese der Verbindung 210 (Tabelle 2) (nicht Gegenstand der Erfindung)
Gemäß dem in Beispiel 11 beschriebenen allgemeinen experimentellen Verfahren wurde unter Verwendung von Fmoc-Cys(Trityl)-Wang-Harz die vorstehende Verbindung in Form eines weißen Feststoffes (15,7 mg) erhalten.
MS (FAB) 849,2 (MH⁺).
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 12, 8 (breites s, 1H), 12,1 (breites s, 2H), 8,27 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,34–7,27 (m, 5H), 4,54–4,39 (m, 5H), 4,31–4,18 (m, 4H), 4,10 (d, J = 11 Hz, 1H), 3,68 (dd, J = 3,9 Hz, J' = 10,8 Hz, 1H), 2,90–2,82 (m, 1H), 2,78–2,70 (m, 1H), 2,67–2,42 (m, 4H), 2,21–2,17 (m, 3H), 2,00–1,85 (m, 3H), 1,83 (s, 3H), 1,80–1,67 (m, 1H), 1,67–1,42 (m, 6H), 1,15–0,95 (m, 4H), 0,88 (dd, J = 6,9 Hz, J' = 8,9 Hz, 6H).
Beispiel 15 Synthese der Verbindung 215 (Tabelle 2)
Die Synthese wurde auf die nachstehend angegebene Weise durchgeführt:
a) Synthese der Verbindung 15b:
1-(N-tert.-Boc-amino)-cyclopropancarbonsäure (15a) (997 mg, 4,96 mmol) wurde in einem Gemisch aus wasserfreiem CH₂Cl₂ (25 ml) und THF (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und nacheinander mit 2-Trimethylsilylethanol (0,852 ml, 5,95 mmol), DMAP (121,1 mg, 0,991 mmol) und einer DCC/CH₂Cl₂-Lösung (3,65 M, 1,63 ml, 5,95 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde etwa 4 Stunden bei 0°C und sodann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die weiße Suspension wurde durch eine Schicht Diatomeenerde filtriert. Die Filterschicht wurde mit CH₂Cl₂ gespült. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und nacheinander mit 10%iger wässriger Citronensäure (2×), gesättigter NaHCO₃-Lösung (2×), Wasser (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft. Man erhielt den Ester 15b in Form eines Öls (etwa 1,5 g, 100%). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 5,08 (s, 1H), 4,20–4,16 (m, 2H), 1,57–1,43 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,17–1,12 (m, 2H), 1,00–0,94 (m, 2H), 0,04 (s, 9H).
b) Synthese Der Verbindung 15c
Der Ester 15b (etwa 700 mg, 2,33 mmol) wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 N HCl/Dioxan (11 ml) behandelt. Die Lösung wurde zur Trockne eingeengt. Man erhielt das Amin-hydrochlorid in Form eines weißen Feststoffes, der sodann den in Beispiel 6 beschriebenen Reaktionsbedingungen unterworfen wurde. Das rohe Hydrochloridsalz (950 mg, 2,55 mmol) und Boc-4-(R)-(naphthalin-1-ylmethoxy)-prolin (3) wurden in wasserfreiem CH₂Cl₂ gelöst. NMM (1,02 ml, 9,30 mmol) und HATU (1,06 g, 2,79 mmol) wurden nacheinander zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1,75 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc verdünnt und nacheinander mit 10%iger wässriger Citronensäure (2×), gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2×), Wasser (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die EtOAc-Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingeengt. Man erhielt das rohe Dipeptid (15c) in Form eines gebrochen weißen Schaums (1,22 g).
MS (FAB) 555,4 (MH⁺).
¹H-NMR (CDCl₃); Gemisch von Rotameren, δ 8,06–8,04 (m, 1H), 7,87–7,80 (m, 2H), 7,55–7,41 (m, 5H), 4,99–4,93 (m, 2H), 4,45–4,21 (m, 2H), 4,16–4,11 (m, 2H), 3,97–3,45 (m, 2H), 2,70–1,80 (m, 2H), 1,73–1,40 (m, 2H), 1,53 (s, (6/9) 9H), 1,44 (s, (3/9) 9H), 1,20–1,05 (m, 2H), 0,97–0,93 (m, 2H), 0,02 (s, 9H).
c) Synthese der Verbindung 15d
Das rohe Dipeptid 15d (etwa 2,20 mmol) wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 N HCl/Dioxan (11 ml) behandelt. Das erhaltene Hydrochloridsalz wurde mit NMM (968 ml, 8,80 mmol) und HATU (1,00 g, 2,64 mmol) gemäß den Angaben in Beispiel 15 (unter der Modifikation einer 2,5-stündigen Kupplungszeit) an Boc-Val-OH (525 mg, 2,42 mmol) gekuppelt. Man erhielt das rohe Tripeptid 15d in Form eines gebrochen weißen Schaums (1,5 g).
MS (FAB) 654,4 (MH⁺).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,05–8,02 (m, 1H), 7,87–7,80 (m, 2H), 7,55–7,40 (m, 5H), 7,30–7,28 (m, 1H), 5,19–4,62 (m, 4H), 4,41–3,70 (m, 1H), 4,35–4,27 (m, 1H), 4,09–3,95 (m, 1H), 3,73–3,62 (m, 2H), 2,69–2,60 (m, 1H), 2,14–1,94 (m, 2H), 1,55–1,38 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 1,22–1,18 (m, 1H), 1,11–1,07 (m, 1H), 0,98–0,90 (m, 8H), 0,02 (s, 9H).
d) Synthese der Verbindung 15e
Das rohe Tripeptid 15d (etwa 2,20 mmol) wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 N HCl/Dioxan (11 ml) behandelt, Das erhaltene Hydrochloridsalz wurde mit NMM (968 ml, 8,80 mmol) und TBTU (847 mg, 2,64 mmol) gemäß den Angaben für die Verbindung 15c (unter den Modifikationen der Verwendung von TBTU als Kupplungsmittel und einer Rührzeit von etwa 64 Stunden bei Raumtemperatur vor dem Aufarbeiten) an Boc-Chg-OH (622 mg, 2,42 mmol) gekuppelt. Der schaumartige Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan:EtOAc; 6:4) gereinigt. Man erhielt das Tetrapeptid 15e in Form eines weißen Schaums (710,8 mg; Ausbeute 41% innerhalb von 3 Stufen).
MS (FAB) 793,4 (MH⁺).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,07–8,05 (m, 1H), 7,87–7,80 (m, 2H), 7,57–7,41 (m, 4H), 7,35 (s, 1H), 6,72–6,64 (m, 1H), 5,02–4,95 (m, 3H), 4,68–4,62 (m, 2H), 4,43–4,40 (m, 1H), 4,15–4,00 (m, 2H), 3,96–3,93 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 11, J' = 5 Hz, 1H), 2,62–2,56 (m, 1H), 2,16–2,00 (m, 2H), 1,70–1,54 (m, 6H), 1,49–1,42 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,14–1,02 (m, 5H), 0,95–0,88 (m, 10H), 0,02 (s, 9H).
e) Synthese der Verbindung 15f
Das Tetrapeptid 15e (168,1 mg, 0,212 mmol) wurde mit einer 4 N HCl/Dioxan-Lösung (2 ml) behandelt. Das erhaltene Hydrochloridsalz wurde mit NMM (94 ml, 0,848 mmol) und TBTU (81,7 mg, 0,254 mmol) gemäß den Angaben für die Verbindung 15e (unter der Modifikation einer Kupplungszeit von 17 Stunden) an Boc-(D)Glu(OTMSE)-OH (81,0 mg, 0,233 mmol) gekuppelt. Das rohe Pentapeptid 15f wurde in Form eines gebrochen weißen Schaums erhalten (220 mg, 0,212 mmol).
MS (FAB) 1022,8 (MH⁺) 1044,8 (MNa⁺).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,07–8,05 (m, 1H), 7,88–7,81 (m, 2H), 7,57–7,41 (m, 4H), 7,29 (s, 1H), 6,70–6,55 (m, 2H), 5,45–5,35 (m, 1H), 4,99–4,98 (m, 2H), 4,66–4,57 (m, 2H), 4,44–4,40 (m, 1H), 4,30–4,01 (m, 5H), 3,91 (dd, J = 11, J' = 4 Hz, 1H), 3,76–3,62 (m, 2H), 2,62–2,56 (m, 1H), 2,50–2,30 (m, 3H), 2,18–2,09 (m, 2H), 2,06–1,90 (m, 2H), 1,67–1,53 (m, 4H), 1,50–1,42 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,14–0,86 (m, 10H), 0,93 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,87 (d, J = 7 Hz, 3H), 0,04 (s, 9H), 0,02 (s, 9H).
f) Synthese der Verbindung 15g
Das rohe Pentapeptid 15f (etwa 0,212 mmol) wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 4 N HCl/Dioxan-Lösung (2,5 ml) behandelt. Das erhaltene Hydrochloridsalz wurde mit NMM (93 ml, 0,848 mmol) und TBTU (81,7 mg, 0,254 mmol) gemäß den Angaben für Verbindung 15e (unter der Modifikation einer Kupplungszeit von 2,5 Stunden) an Boc-Asp(OTMSE)-OH (77,8 mg, 0,233 mmol) gekuppelt. Es wurde das rohe Hexapeptid 15g in Form eines bernsteinfarbenen Schaums erhalten (278 mg, 0,212 mmol).
MS (FAB) 1237,5 (MH⁺) 1259 (MNa⁺).
g) Synthese der Verbindung 15h
Das rohe Hexapeptid 15 g (etwa 0,2 mmol) wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur mit 2,5 ml 4 N HCl/Dioxan-Lösung behandelt. Nach Einengen zur Trockne erhielt man das Amin-hydrochlorid in Form eines weißen Feststoffes. Das rohe Hydrochloridsalz wurde in wasserfreiem DMF (2,5 ml) gelöst und nacheinander mit Pyridin (377 μl, 4,66 mmol) und Essigsäureanhydrid (378 μl, 4,01 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann in Kochsalzlösung gegossen und mit EtOAc (3×) extrahiert Die vereinigte organische Phase wurde nacheinander mit 10%iger wässriger Citronensäure (2×), gesättigter NaHCO₃-Lösung (2×), Wasser (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und zur Trockne eingedampft. Der schaumartige Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Elutionsmittel Hexan:EtOAc, 3:7) gereinigt. Man erhielt das acetylierte Hexapeptid 15h in Form eines gebrochen weißen Schaums (78,5 mg, Ausbeute 31% über 3 Stufen).
MS (FAB) 1179,6 (MH⁺) 1201,5 (MNa⁺).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,11–8,09 (m, 1H), 7,86–7,79 (m, 2H), 7,55–7,41 (m, 5H), 7,28 (s, 1H), 7,02–6,96 (m, 2H), 6,70–6,68 (m, 1H), 5,13–5,10 (m, 1H), 4,96–4,91 (m, 2H), 4,58–4,41 (m, 4H), 4,22–4,08 (m, 8H), 3,77 (dd, J = 10,5, J' = 5 Hz, 1H), 3,09 (dd, J = 18, J' = 4 Hz, 1H), 2,76 (dd, J = 17,5, J' = 8 Hz, 1H), 2,51–2,20 (m, 3H), 2,12–2,08 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,73–1,53 (m, 8H), 1,27–1,09 (m, 7H), 1,01–0,85 (m, 8H), 0,98 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,97 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,04 (s, 9H), 0,03 (s, 9H), 0,01 (s, 9H).
h) Synthese der Verbindung 215
Das acetylierte Hexapeptid 15h (76,5 mg, 0,065 mmol) wurde in wasserfreiem THF (2 ml) gelöst und mit einer TBAF-Lösung (1 M in THF; 389 μl, 0,389 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde die Lösung unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Eisessig gelöst und durch eine Millipore^®:Millex^®-HV-0,45 μm-Filteranlage filtriert und auf eine äquilibrierte Whatman Partisil^® 10-ODS-3 (2,2 × 50 cm)-C18-Umkehrphasensäule aufgesetzt. Reinigungsprogramm: Linearer Gradient mit 15 ml/min, λ 230 nm, Programm bei 5% A für 10 Minuten, 5–30% A in 10 Minuten, bei 30% A für 10 Minuten, 30–60% A in 90 Minuten. A: 0,06% TFA/CH₃CN; B: 0,06% TFA/H₂O. Die Fraktionen wurden durch analytische HPLC analysiert. Das gewonnene Produkt wurde lyophilisiert. Man erhielt die Hexapeptidsäure 215 in Form eines weißen amorphen Feststoffes (26,9 mg, mit einem Gehalt an 41 Gew.-% Tetrabutylammoniumsalzen, Ausbeute 28%).
MS (FAB) 879,4 (MH⁺) 901,3 (MNa⁺).
Um das Tetrabutylammoniumsalz zu entfernen, wurde das vorstehende Produkt (etwa 18 mg) in EtOAc gelöst und mit 10% HCl (2×) gewaschen. Die EtOAc-Phase wurde eingedampft und anschließend mit Wasser lyophilisiert. Man erhielt das salzfreie Produkt in Form eines weißen amorphen Feststoffes (3,8 mg, Ausbeute 36%).
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,39 (s, 1H), 8,10–7,81 (m, 7H), 7,57–7,45 (m, 4H), 5,07–4,87 (m, 2H), 4,55–4,00 (m, 7H), 3,76–3,71 (m, 1H), 2,67–2,62 (m, 1H), 2,33–2,10 (m, 3H), 2,05–1,42 (m, 8H), 1,79 (s, 3H), 1,38–0,71 (m, 1H), 0,89 (d, J = 6,68 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 6,36 Hz, 3H).
Beispiel 16 Synthese der Verbindung 214 (Tabelle 2)
Für die Synthese der Verbindung 214 wurde das Verfahren von Beispiel 15 eingehalten, wobei Boc-4(R-(Naphthalin-2-ylmethoxy)-prolin zur Einführung des P2-Fragments verwendet wurde und verschiedene Schutzgruppen an den Seitenketten-Carbonsäureresten eingesetzt wurden.
Die Synthese ist nachstehend dargestellt:
a) Synthese der Verbindung 16b
Bei 0°C wurde Benzylbromid (5,74 ml, 48,3 mmol) zu einem Gemisch aus Boc-Norvalin (16a) (10,0 g, 46,0 mmol) und DBU (7,57 ml, 50,6 mmol) in Acetonitril (200 ml) gegeben. Nach 20-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung eingeengt. Der Rückstand wurde in Ether gelöst. Die organische Lösung wurde nacheinander mit 10%iger wässriger Citronensäurelösung (2×), gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt den gewünschten Benzylester 16b in Form eines farblosen Öls (13,7 g, Ausbeute 97%).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,40–7,32 (m, 5H), 5,16 (dd, J = 26,7, J' = 12,4 Hz, 2H), 4,99 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,35–4,32 (m, 1H), 1,82–1,73 (m, 1H), 1,66–1,57 (rr, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,41–1,32 (m, 2H), 0,90 (t, J = 7,3 Hz, 3H).
b, c, d, e, f, g) Synthese der Verbindung 16h
Der vorstehende Boc-Nva-Benzylester (121 mg, 0,48 mmol) wurde der gleichen Reaktionsfolge wie in Beispiel 7 unterworfen. Jedoch wurde für die Einführung von P2 (Stufe b) Boc-4(R)-(Naphthalin-2-ylmethoxy)-prolin verwendet. Ferner wurden für die Einführung von P5 (Stufe e) und P6 (Stufe f) die entsprechenden Boc-D-Glu-OH- und Boc-Asp-OH-Reste als Benzylester an der Carbonsäurekette geschützt.
h) Synthese der Verbindung 214
Eine Lösung des Hexapeptids 16h (etwa 0,210 mmol) in Ethanol (3 ml) wurde mit 10% Palladium-auf-Aktivkohle (10 mg) und Ammoniumacetat (10 mg) versetzt. Das Gemisch wurde 5 Stunden unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt, anschließend durch eine Millipore^®:Millex^®-HV-0,45 μm-Filteranlage filtriert und auf eine äquilibrierte Whatman-Partisil^®-10-ODS-3 (2,2 × 50 cm)-C18 Umkehrphasensäule aufgesetzt. Reinigungsprogramm: Linearer Gradient mit 15 ml/min, λ 230 nm, mit 5 bis 50% A in 60 min. A: 0,06% TFA/CH₃CN; B: 0,06% TFA/H₂O. Die Fraktionen wurden durch HPLC analysiert. Das gewonnene Produkt wurde lyophilisiert. Man erhielt die Verbindung 214 in Form eines weißen Feststoffes (20 mg, 0,02 mmol).
MS (FAB) 895,5 (MH⁺).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,16 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,91–7,88 (m, 3H), 7,85 (s, 1H), 7,77 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,51–7,46 (m, 3H), 4,70 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,53–4,45 (m, 2H), 4,33–4,10 (m, 6H), 3,69 (dd, J = 19, J' = 4,4 Hz, 1H), 2,66–2,60 (m, 1H), 2,49–2,43 (m, 1H), 2,21–2,18 (m, 3H), 2,07–1,94 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,76–1,33 (m, 10H), 1,04–0,86 (m, 15H).
Beispiel 17 Synthese der Verbindung 221 (Tabelle 2)
Monobenzylbernsteinsäure (hergestellt gemäß V. Bischoff et al., Chem. Ber., Bd. 35 (1902), S. 4078) (27 mg, 0,134 mmol) wurde 5 Minuten in Acetonitril (2 ml) mit TBTU (52 mg, 0,160 mmol) und NMM (47 mg, 0,469 mmol) gerührt. Sodann wurde das Gemisch mit dem Hydrochloridsalz des entsprechenden Tetrapeptids (hergestellt gemäß den Angaben für Verbindung 16e, jedoch unter Verwendung von Isoleucin anstelle von Cyclohexylglycin und unter Verwendung von 4(R)-(Naphthalin-1- ylmethoxy)-prolin anstelle von 4(R)-(Naphthalin-2-ylmethoxy)-prolin) versetzt (97,0 mg, 0,134 mmol). Das Gemisch wurde 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von Ethylacetat wurde das Gemisch mit 10%iger wässriger Citronensäure (2×), gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (2×) und Kochsalzlösung (1×) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Man erhielt das geschützte Tetrapeptid in Form eines gelben Öls.
Die vorstehende Verbindung (etwa 0,134 mmol) wurde in Ethanol (3 ml) gelöst und mit Ammoniumacetat (10 mg) und 20% Palladiumhydroxid-auf-Aktivkohle (30 mg) versetzt. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei einem Wasserstoffdruck von 1 atm gerührt, sodann durch eine Millipore^®:Millex^®-HV-0,45 μm Filteranlage filtriert und auf eine äquilibrierte Whatman Partisil 10-ODS-3 (2,2 × 50 cm)-C18-Umkehrphasensäule injiziert. Reinigungsprogramm: Linearer Gradient mit 15 ml/min, λ 230 nm, 5% A für 10 min, 5–60% A in 60 min (A: 0,06% TFA/CH₃CN; B: 0,06% TFA/H₂O). Die Fraktionen wurden durch HPLC analysiert. Das gewonnene Produkt wurde lyophilisiert. Mann erhielt die Verbindung 221 in Form eines weißen Feststoffes (21 mg).
MS (FAB) 683 (MH⁺).
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,12 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,07–8,03 (m, 1H), 7,96–7,81 (m, 4H), 7,59–7,51 (m, 3H), 7,55 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,90 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,45 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,36–4,31 (m, 2H), 4,24–4,12 (m, 3H), 3,74–3,68 (m, 1H), 2,43–2,31 (m, 4H), 2,23–2,18 (m, 1H), 2,01–1,92 (m, 2H), 1,67–1,51 (m, 3H), 1,42–1,32 (m, 3H), 1,14–0,96 (m, 1H), 0,93–0,67 (m, 15H).
Beispiel 18
Die nachstehende Beschreibung stellt ein Beispiel für Verbindungen der Formel I dar, bei denen Q die Bedeutung CH₂C(O) hat.
Herstellung der Verbindung 413 (Tabelle 4)
Verbindung 18b

1) Cyclohexylessigsäure (18a) (8 g, 56,25 mmol) wurde in DCM (160 ml) bei Raumtemperatur mit Oxalylchlorid (6,4 ml, 73,14 mmol) und 2 Tropfen DMF versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt Cyclohexylacetylchlorid.
2) Das chirale Hilfsmittel (4S)-(–)-4-Isopropyl-2-oxazolidinon (7,63 g, 59,06 mmol) wurde in THF (200 ml) gelöst und auf –78°C abgekühlt. N-Butyllithium (1,6 M) in Hexan (36,9 ml, 59,06 mmol) wurde langsam (innerhalb von 10 Minuten) zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei –78°C gerührt (es entstand ein Gel). Sodann wurde das vorerwähnte Cyclohexylacetylchlorid in THF (50 ml) bei –78°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei –78°C und sodann 1 Stunde bei 0°C gerührt. Anschließend wurde die Umsetzung durch Zugabe einer wässrigen Lösung von NH₄Cl (16 ml) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Et₂O (300 ml) wurde zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit einer 10%igen wässrigen Citronensäurelösung (2 × 200 ml), einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung (2 × 200 ml) und Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel, 40–60 μ, 60 × 100 mm, 9/1 → 8/2, Hexan/EtOAc) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 18b in Form eines farblosen Öls (11,3 g, Ausbeute 79%). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 4,40–4,36 (m, 1H), 4,20 (dd, J = 8,3 Hz, J = 9,1 Hz, 1H), 4,13 (dd, J = 2,9 Hz, 9,1 Hz, 1H), 2,86 (dd, J = 6,4 Hz, 15,7 Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 7,1 Hz, 15,7 Hz, 1H), 2,35–2,27 (m, 1H), 1,83–1,76 (m, 1H), 1,70–1,57 (m, 5H), 1,26–0,90 (m, 5H), 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,81 (d, J = 6,7 Hz, 3H).

Verbindung 18c
Eine Lösung der Verbindung 18b (11,3 g, 44,68 mmol) in THF (125 ml) wurde bei –78°C mit einer NaHMDS-Lösung (1 M in THF, 49,2 ml, 49,15 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei –78°C gerührt. Sodann wurde eine Lösung von tert.-Butylbromacetat (8,67 ml, 53,62 mmol) in THF (25 ml) bei –78°C zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Sodann wurde eine gesättigte wässrige Lösung von NH₄Cl (33 ml) langsam zugegeben. Nach Entfernen des Kältebads wurde das Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des THF wurde EtOAc (200 ml) zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt, nacheinander mit einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung (200 ml), H₂O (200 ml), einer wässrigen 1 N HCl-Lösung (200 ml) und Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde durch Verreiben mit Et₂O gereinigt. Man erhielt die Verbindung 18c in Form eines weißen Feststoffes (12,65 g, Ausbeute 77%).
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 4,61–4,53 (m, 3H), 4,27–4,25 (m, 1H), 2,84–2,66 (m, 2H), 2,55–2,41 (m, 1H), 1,89–1,76 (m, 6H), 1,58 (s, 9H), 1,35–1,31 (m, 4H), 1,14–1,04 (m, 7H).
Verbindung 18d
Eine eiskalte Lösung der Verbindung 18c (12,2 g, 33,28 mmol) in einem Gemisch aus THF/H₂O (3/1-Gemisch, 495 ml/165 ml) wurde mit H₂O₂ (30%, 15,1 ml, 133,1 mmol) und anschließend langsam mit LiOH·H₂O (2,79 g, 66,56 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 0°C und sodann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Gemisch auf 0°C abgekühlt und langsam mit einer 1,5 N wässrigen Na₂SO₃-Lösung versetzt, um überschüssiges Peroxid zu zersetzen (Überwachung durch KI-Papier). Nach Einengen des Gemisches unter vermindertem Druck wurde die verbleibende wässrige Lösung mit DCM (2 × 150 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit einer 10%igen wässrigen Citronensäurelösung angesäuert. Das Gemisch wurde mit EtOAc (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt die Verbindung 18d in Form eines farblosen Öls (8,38 g, Ausbeute 98%).
¹H-NMR (CDCl₃) δ 2,71–2,66 (m, 1H), 2,59 (dd, J = 10,8 Hz, 16,0 Hz, 1H), 2,36 (dd, J = 3,8 Hz, 16,0 Hz, 1H), 1,78–1,57 (m, 6H), 1,41 (s, 9H), 1,30–0,98 (m, 5H).
Verbindung 18f

1) Das entsprechende Boc-Derivat der Verbindung 18e (1,63 g, 2,74 mmol) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 4 N HCl/Dioxan (14 ml, 54,91 mmol) behandelt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit einer 5%igen wässrigen Na₂CO₃-Lösung (25 ml) versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 5 Minuten heftig gerührt. Nach Zugabe von EtOAc (75 ml) wurden die beiden erhaltenen Phasen getrennt. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt die Verbindung 18e, die direkt in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
2) Das Aminotripeptid wurde bei Raumtemperatur in DMF (5 ml) mit der Verbindung 18d (739 mg, 288 mmol) in DMF (5 ml) und anschließend mit DIPEA (1,43 ml, 8,24 mmol) und TBTU (502 mg, 2,88 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von EtOAc (125 ml) wurde die organische Phase abgetrennt, mit einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung (100 ml), H₂O (100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel, 40–60 μ, 40 × 125 mm, 6/4 → 5/5 Hexan/EtOAc) gereinigt. Man erhielt die tert.-Butylesterverbindung 18f in Form eines weißen Schaums (1,18 g, Ausbeute 59%). ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,06 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,55–7,40 (m, 4H), 7,35 (s, 1H), 6,28 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,86–5,79 (m, 1H), 5,24 (dd, J = 1,6 Hz, 17,2 Hz, 1H), 5,17 (dd, J = 1,3 Hz, J = 10,5 Hz, 1H), 4,98 (ABq, Δv = 18,7 Hz, J = 12,1 Hz, 2H), 4,67–4,51 (m, 4H), 4,41–4,38 (m, 1H), 3,99 (dd, J = 3,8 Hz, 10,8 Hz, 1H), 2,64–2,59 (m, 2H), 2,42–2,38 (m, 2H), 2,10–1,95 (m, 2H), 1,68–1,53 (m, 9H), 1,43–1,41 (m, 1H), 1,42 (s, 9H), 1,15–1,04 (m, 4H), 0,97–0,91 (m, 8H).

Verbindung 18h
Handelsüblicher 3-[Benzyl-(2-methoxycarbonylethyl)-amino]-propionsäuremethylester (18g) (2 g, 7,16 mmol) in MeOH (24 ml) wurde mit Palladium-Katalysator (Pd/C 10%, 500 mg, 25% (Gew./Gew.)) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre (Ballon) gerührt. Sodann wurde das Gemisch durch Diatomeenerde filtriert. Die Filterschicht wurde mit MeOH (20 ml) gewaschen. MeOH (Filtrat + Waschflüssigkeit) wurde eingedampft. Man erhielt 1,2 g (Ausbeute 89%) der Verbindung 18h in Form eines blassgelben Öls. Dieses Produkt wurde direkt in der nächsten Stufe eingesetzt.
Verbindung 18i

1) Die tert.-Butylesterverbindung 18f (1,18 g, 1,62 mmol) wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur mit 4 N HCl in Dioxan (8,5 ml, 32,4 mol) behandelt. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt und sodann gemeinsam mit Benzol/Et₂O eingedampft. Man erhielt 1,04 g der entsprechenden Säure in Form eines beigefarbenen Schaums (Ausbeute 95%).
2) Die letztgenannte Säure (200 mg, 0,29 mmol) wurde in DMF (1 ml) bei Raumtemperatur mit dem Amin (Verbindung 18h, 59 mg, 0,31 mmol) in DMF (2 ml) und anschließend mit DIPEA (154 μl, 0,89 mmol) und TBTU (100 mg, 0,31 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von EtOAc (125 ml) wurde die organische Phase abgetrennt, mit einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO₃ (75 ml), H₂O (75 ml) und Kochsalzlösung (75 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel, 40–60 μ, 20 × 100 mm, 8/2 EtOAc/Hexan) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 18i in Form eines gelben Öls (82 mg, Ausbeute 33%). MS (ESI) 869,3 (M + Na)⁺, 845,4 (M – H)^–.

Verbindung 413
Eine wässrige 1 M NaOH-Lösung (774 μl, 0,774 mmol) wurde zu einer Lösung der Verbindung 18i (82 mg, 0,097 mmol) in einem Gemisch aus THF/MeOH (111, jeweils 1 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von H₂O (15 ml) wurde die wässrige Phase abgetrennt und mit DCM (3 × 15 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde durch Zugabe einer wässrigen 1 N HCl-Lösung angesäuert (pH-Wert 3). Sodann wurde das Gemisch mit EtOAc (3 × 15 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (5% → 53% MeCN innerhalb von 60 Minuten) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 413 in Form eines weißen lyophilisierten Feststoffes (31 mg, Ausbeute 41%).
MS (ESI) 779,3 (M + H)⁺, 801,3 (M + Na)⁺, 777,3 (M – H)^–
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,38 (s, 1H), 8,06 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,57–7,44 (m, 5H), 5,01 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,35–4,31 (m, 2H), 4,25 (dd, J = 7,9 Hz, 8,3 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 3,80–3,49 (m, 3H), 3,37–3,34 (m, 2H), 2,63–2,61 (m, 2H), 2,56–2,52 (m, 1H), 2,39–2,35 (m, 2H), 2,25–2,20 (m, 2H), 2,05–1,91 (m, 2H), 1,62–1,59 (m, 1H), 1,41–1,22 (m, 5H), 0,96–0,73 (m, 16H).
Beispiel 19
Radiometrische Bestimmung von rekombinanter HCV-NS3-Protease
a) Klonieren, Exprimieren und Reinigen der rekombinanten HCV-NS3-Protease Typ 1b
Serum eines HCV-infizierten Patienten wurde von externen Mitarbeitern (Bernard Willems MD, Hôpital St-Luc, Montreal, Canada und Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Santé Publique du Quebec, Ste-Anne de Bellevue, Canada) erhalten. Eine gentechnisch hergestellte cDNA-Matrize von voller Länge des HCV-Genoms wurde aus DNA-Fragmenten konstruiert, die durch reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) von Serum-RNA und unter Verwendung von speziellen Primern, die auf der Basis der Homologie mit anderen Genotyp 1b-Stämmen ausgewählt worden waren, erhalten worden waren. Aus der Bestimmung der gesamten Genomsequenz wurde ein Genotyp 1b dem HCV-Isolat gemäß der Klassifikation von Simmonds et al. (J. Clin. Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 1493–1503) zugeordnet. Die Aminosäuresequenz der nicht-strukturellen Region NS2-NS4B zeigte eine mehr als 93-prozentige Identität mit dem HCV-Genotyp 1b (BK-, JK- und 483-Isolate) und eine 88-prozentige Identität mit dem HCV-Genotyp 1a (HCV-1-Isolat). Ein DNA-Fragment, das für den Polyprotein-Vorläufer (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) kodierte, wurde durch PCR erzeugt und in eukaryontische Expressionvektoren eingeführt. Nach vorübergehender Transfektion wurde die durch die HCV-NS3-Protease vermittelte Polyprotein-Prozessierung durch die Anwesenheit des reifen NS3-Proteins unter Anwendung von Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Das reife NS3-Protein wurde bei Expression eines Polyprotein-Vorläufers, der die Mutation S1165A enthielt, die die NS3-Protease inaktiviert, nicht beobachtet, was die Funktionalität der HCV-NS3-Protease bestätigte.
Das für die rekombinante HCV-NS3-Protease (Aminosäuren 1027–1206) kodierende DNA-Fragment wurde in den bakteriellen Expressionsvektor pET11d kloniert. Die NS3-Protease-Expression in E. coli BL21(DE3)pLysS wurde durch 3-stündige Inkubation mit 1 mM IPTG induziert. Eine typische Fermentation (18 Liter) ergab etwa 100 g feuchte Zellpaste. Die Zellen wurden in Lysispuffer (3,0 ml/g), der aus 25 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin (Vol/Vol), 1 mM EDTA und 0,01% NP-40 bestand, resuspendiert und bei –80°C aufbewahrt. Sodann wurden die Zellen aufgetaut, homogenisiert und mit 5 mM DTT versetzt. Anschließend wurden Magnesiumchlorid und DNase zum Homogenisat in einer Endkonzentration von 20 mM bzw. 20 μg/ml gegeben. Nach 25-minütiger Inkubation bei 4°C wurde das Homogenisat einer Ultraschallbehandlung unterzogen und 30 Minuten bei 4°C mit 15000 × g zentrifugiert. Der pH-Wert des Überstands wurde sodann unter Verwendung von 1 M Natriumphosphatlösung auf 6,5 eingestellt.
Eine weitere Gelfiltrations-Chromatographiestufe wurde zur Ergänzung des zweistufigen Reinigungsverfahrens gemäß WO-95/22985 durchgeführt. Kurz zusammengefasst, der Überstand des bakteriellen Extrakts wurde auf eine SP-HiTrap-Säule (Pharmacia), die vorher mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min in Puffer A (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,5, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01% NP-40) äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde sodann mit Puffer A mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl gewaschen. Die Protease wurde durch Aufsetzen von 10 Säulenvolumina eines linearen Gradienten von 0,15–0,3 M NaCl eluiert. Die die NS3-Protease enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf eine endgültige NaCl-Konzentration von 0,1 M verdünnt. Das Enzym wurde weiter an einer HiTrap-Heparin-Säule (Pharmacia), die in Puffer B (25 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 5 mM DTT, 0,01% NP40) äquilibriert worden war, gereinigt. Die Probe wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min aufgesetzt. Die Säule wurde sodann mit Puffer B mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min gewaschen. Zwei Waschstufen wurden in Gegenwart von Puffer B mit einem Gehalt an 0,3 oder 1 M NaCl durchgeführt. Die Protease wurde in der 0,3 M NaCl-Waschflüssigkeit gewonnen, 3-fach mit Puffer B verdünnt, erneut auf die HiTrap-Heparin-Säule aufgesetzt und mit Puffer B mit einem Gehalt an 0,4 M NaCl eluiert. Schließlich wurden die die NS3-Protease enthaltenden Fraktionen auf eine Superdex 75-HiLoad-16/60-Säule (Pharmacia), die in Puffer B mit einem Gehalt an 0,3 M NaCl äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Reinheit der aus den gepoolten Fraktionen erhaltenen HCV-NS3-Protease wurde aufgrund von SDS-PAGE unter anschließender densitometrischer Analyse zu mehr als 95% bestimmt.
Das Enzym wurde bei –80°C aufbewahrt und sodann auf Eis aufgetaut und vor der Verwendung verdünnt.
b) Radiometrischer Test auf rekombinante HCV-NS3-Protease
Das für den radiometrischen Test auf HCV-NS3-Protease verwendete Substrat DDIVPC-SMSYTW wird durch das Enzym zwischen dem Cysteinrest und dem Serinrest gespalten. Die Sequenz DDIVPC-SMSYTW entspricht der natürlichen NS5A/NS5B-Spaltungsstelle, bei der der Cysteinrest in P2 durch einen Prolinrest substituiert ist. Das Peptidsubstrat DDIVPC-SMSYTW und der Tracer Biotin-DDIVPC-SMS[¹²⁵-IY]TW wurden mit der rekombinanten NS3-Protease in Abwesenheit oder Gegenwart von Inhibitoren inkubiert. Die Abtrennung des Substrats von den Produkten wird durch Zugabe von mit Avidin beschichteten Agarosekügelchen zum Testgemisch und anschließende Filtration durchgeführt. Die Menge an SMS[¹²⁵-IY]TW-Produkt, die im Filtrat gefunden wird, ermöglicht die Berechnung des prozentualen Anteils der Substratumwandlung und der prozentualen Hemmung.
A. Reagenzien
Tris- und Tris-HCl (ultrarein) wurden von der Firma Life Technologies bezogen. Glycerin (ultrarein), MES und BSA wurden von der Firma Sigma^® bezogen. TCEP wurde von der Firma Pierce, DMSO von der Firma Aldrich^® und NaOH von der Firma Anachemia^®, bezogen.
Testpuffer: 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 30% (Gew./Vol.) Glycerin, 2% (Gew./Vol.) CHAPS), 1 mg/ml BSA, 1 mM TCEP (Zugabe von TCEP unmittelbar vor der Verwendung aus einer 1 M Vorratslösung in Wasser).
Substrat: DDIVPC-SMSYTW, 25 μM Endkonzentration (aus einer 2 mM-Vorratslösung in DMSO bei Aufbewahrung bei –20°C zur Vermeidung von Oxidation).
Tracer: reduziertes monoiodiertes Substrat Biotin-DDIVPC-SMS[¹²⁵I-Y]TW (~1 nM Endkonzentration).
HCV-NS3-Protease Typ 1b, 25 nM Endkonzentration (aus einer Vorratslösung in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,01% NP40).
B. Verfahren
Der Test wurde in einer Polypropylenplatte der Firma Costar mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Vertiefung enthielt folgende Bestandteile:

• 20 μl Substrat/Tracer in Testpuffer;
• 10 μl ± Inhibitor in 20% DMSO/Testpuffer;
• 10 μl NS3-Protease 1b.

Ferner wurden auf der gleichen Testplatte ein Leerwert (ohne Inhibitor und ohne Enzym) und eine Kontrolle (ohne Inhibitor) vorbereitet.
Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe der Enzymlösung eingeleitet. Das Testgemisch wurde 60 Minuten bei 23°C unter mäßigem Bewegen inkubiert. Anschließend wurden 20 μl 0,025 N NaOH zum Stoppen der enzymatischen Reaktion zugesetzt.
20 μl mit Avidin beschichtete Agarosekügelchen (bezogen von der Firma Pierce^®) wurden auf eine Millipore^®-MADP-N65-Filtrationplatte gegeben. Das gestoppte Testgemisch wurde auf die Filtrationsplatte übertragen und 60 Minuten bei 23°C unter mäßigem Bewegen inkubiert.
Die Platten wurden unter Verwendung einer Millipore^®-MultiScreen-Vakuum-Manifold-Filtrationsvorrichtung filtriert. 40 μl Filtrat wurden auf eine undurchsichtige Platte mit 96 Vertiefungen mit einem Gehalt an 60 μl Szintillationsflüssigkeit pro Vertiefung übertragen.
Die Filtrate wurden auf einem Packard^®-TopCount-Instrument 1 Minute unter Anwendung des ¹²⁵I-Flüssigverfahrens ausgezählt. Die prozentuale Hemmung wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: 100 – [(ZählereignisseInh – ZählereignisseLw)/(ZählereignisseKtr – ZählereignisseLw) × 100]
Eine nicht-lineare Kurvenanpassung nach dem Hill-Modell wurde auf die Hemmungs-Konzentrationsdaten angewandt. Die 50% effektive Konzentration (IC₅₀) wurde unter Verwendung der SAS-Software (Statistical Software System, SAS Institute, Inc., Cary, N. C.) berechnet.
Beispiel 20
Radiometrischer Test auf das rekombinante HCV-NS3-Protease/NS4A-Kofaktor-Peptid
Das Enzym wurde gemäß dem in Beispiel 19 beschriebenen Verfahren kloniert, exprimiert und zubereitet. Das Enzym wurde bei –80°C aufbewahrt, auf Eis aufgetaut und unmittelbar vor der Verwendung im Testpuffer mit einem Gehalt an dem NS4A-Kofaktor-Peptid verdünnt.
Das für den radiometrischen Test auf NS3-Protease/N24A-Kofaktor-Peptid verwendete Substrat DDIVPC-SMSYTW (SEQ ID NO: 2) wird durch das Enzym zwischen dem Cysteinrest und dem Serinrest gespalten. Die Sequenz DDIVPC-SMSYTW entspricht der natürlichen NS5A/NS5B-Spaltungsstelle, bei dem der Cysteinrest in P2 durch einen Prolinrest substituiert ist. Das Peptidsubstrat DDIVPC-SMSYTW (SEQ ID NO: 2) und der Tracer Biotin-DDIVPC-SMS[¹²⁵-IY]TW (SEQ ID NO: 3) werden mit der rekombinanten NS3-Protease und dem NS4A-Kofaktor-Peptid KKGSVVIVGRIILSGRK (SEQ ID NO: 1) (Molverhältnis Enzym:Kofaktor 1:100) in Abwesenheit oder Gegenwart von Inhibitoren inkubiert. Die Abtrennung des Substrats von den Produkten wird durch Zugabe von mit Avidin beschichteten Agarosekügelchen zum Testgemisch und anschließende Filtration durchgeführt. Die Menge an SMS[¹²⁵-IY]TW-Produkt, die im Filtrat gefunden wird, ermöglicht die Berechnung des prozentualen Anteils der Substratumwandlung und der prozentualen Hemmung.
A. Reagenzien
Tris- und Tris-HCl (Ultrarein) wurden von der Firma Life Technologies bezogen. Glycerin (ultrarein), MES und BSA wurden von der Firma Sigma bezogen. TCEP wurde von der Firma Pierce, DMSO von der Firma Aldrich und NaOH von der Firma Anachemia^® bezogen.
Testpuffer: 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 30% (Gew./Vol) Glycerin, 1 mg/ml BSA, 1 mM TCEP (Zugabe von TCEP unmittelbar vor der Verwendung aus einer 1 M Vorratslösung in Wasser).
Substrat: DDIVPCSMSYTW (SEQ ID NO: 2), 25 μM Endkonzentration (aus einer 2 mM-Vorratslösung in DMSO bei Aufbewahrung bei –20°C zur Vermeidung von Oxidation).
Tracer: reduziertes monoiodiertes Substrat Biotin-DDIVPC-SMS[¹²⁵I-Y]TW (SEQ ID NO: 3) (~1 nM Endkonzentration).
HCV-NS3-Protease Typ 1b, 25 nM Endkonzentration (aus einer Vorratslösung in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,01% NP40).
NS4A-Kofaktor-Peptid: KKGSVVIVGRIILSGRK (SEQ ID NO: 1), 2,5 μM Endkonzentration (aus einer 2 mM Vorratslösung in DMSO, aufbewahrt –20°C).
B. Verfahren
Der Test wurde in einer Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Jede Vertiefung enthielt folgende Bestandteile:

• 20 μl Substrat/Tracer in Testpuffer;
• 10 μl ± Inhibitor in 20% DMSO/Testpuffer;
• 10 μl NS3-Protease 1b/NS4-Kofaktor-Peptid (Molverhältnis 1:100).

Ferner wurden auf der gleichen Testplatte ein Leerwert (ohne Inhibitor und ohne Enzym) und eine Kontrolle (ohne Inhibitor) vorbereitet.
Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe der Enzym/NS4A-Peptid-Lösung eingeleitet. Das Testgemisch wurde 40 Minuten bei 23°C unter mäßigem Bewegen inkubiert. Anschließend wurden 10 μl 0,5 N-NaOH und 10 μl 1 M MES, pH-Wert 5,8, zum Stoppen der enzymatischen Reaktion zugesetzt.
20 μl mit Avidin beschichtete Agarosekügelchen (bezogen von der Firma Pierce^®) wurden auf eine Millipore^®-MADP-N65-Filtrationplatte gegeben. Das gestoppte Testgemisch wurde auf die Filtrationsplatte übertragen und 60 Minuten bei 23°C unter mäßigem Bewegen inkubiert.
Die Platten wurden unter Verwendung einer Millipore^®-MultiScreen-Vakuum-Manifold-Filtrationsvorrichtung filtriert. 40 μl Filtrat wurden auf eine undurchsichtige Platte mit 96 Vertiefungen mit einem Gehalt an 60 μl Szintillationsflüssigkeit pro Vertiefung übertragen.
Die Filtrate wurden auf einem Packard^®-TopCount-Instrument 1 Minute unter Anwendung des ¹²⁵I-Flüssigverfahrens ausgezählt.
Der Wert für IC₅₀ wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 19 berechnet.
Beispiel 20
Spezifitätstests
Die Spezifität der Verbindungen wurde gegenüber verschiedenen Serin-proteasen getestet: Humane Leukozyten-Elastase, Schweinepankreas-Elastase und Rinderpankreas-α-Chymotrypsin; sowie gegen eine Cystein-protease: Humanes Leber-Cathepsin B. In sämtlichen Fällen wurde das Verfahren mit einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines kolorimetrischen p-Nitroanilid (pNA)-Substrats, das für jedes Enzym spezifisch ist, herangezogen. Jeder Test umfaßte eine 1-stündige Enzym-Inhibitor-Vorinkubation bei 30°C und eine anschließende Zugabe von Substrat und eine Hydrolyse bis zu einer ~30 prozentigen Umwandlung, gemessen mit einem UV-Thermomax^®-Mikroplattenlesegerät. Die Substratkonzentrationen wurden im Vergleich zum K_M-Wert möglichst nieder gehalten, um die Substratkonkurrenz zu verringern. Die Konzentrationen der Verbindungen variierten je nach ihrer Wirkungsstärke von 300 bis 0,06 μM. Folgende Endbedingungen wurden bei jedem Test eingehalten:
50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,5 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01% Tween-20 für
[100 μM Succ-AAPF-pNA (SEQ ID NO: 4) und 250 pM α-Chymotrypsin], [133 μM Succ-AAA-pNA und 8 nM Schweineelastase], [133 μM Succ-AAV-pNA und 8 nM Leukozytenelastase]; oder
[100 mM NaHPO₄ pH-Wert 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP, 0,01% Tween-20, 30 μM Z-FR-pNA und 5 nM Cathepsin B (das Vorratsenzym wurde vor der Verwendung in einem Puffer mit einem Gehalt an 20 mM TCEP aktiviert)].
Ein repräsentatives Beispiel wird nachstehend für Schweinepankreas-Elastase zusammengefasst:
In einer Polystyrol-Platte mit 96 flachbödigen Vertiefungen wurden unter Verwendung eines Biomek^®Flüssigkeitshandhabungsgeräts (Beckman) folgende Bestandteile vorgelegt:

• 40 μl Testpuffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA);
• 20 μl Enzymlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 40 nM Schweinepankreas-Elastase);
• und 20 μl Inhibitorlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 1,5 mM–0,3 μM Inhibitor, 15% (Vol./Vol.) DMSO).

Nach 60-minütiger Vorinkubation bei 30°C wurden 20 μl einer Substratlösung ((50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,5 M Na₂SO₄, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 665 μM Succ-AAA-pNA) in jede Vertiefung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 60 Minuten bei 30°C inkubiert, wonach die Absorption am UV-Thermomax^®-Plattenlesegerät abgelesen wurde. Reihen von Vertiefungen wurden für Kontrollen (ohne Inhibitor) und für Leerwerte (ohne Inhibitor und ohne Enzym) bereitgestellt.
2-fache Verdünnungsreihen der Inhibitorlösung wurden auf einer getrennten Platte mit dem Flüssigkeitshandhabungsgerät unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02% Tween-20 und 15% DMSO durchgeführt. Sämtliche übrigen Spezifitätstests wurden auf ähnliche Weise vorgenommen.
Die prozentuale Hemmung wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet: [1 – ((UVInh – UVLw)/(UVKtrl. – UVLw))] × 100
Ein nicht-lineare Kurvenanpassung mit dem Hill-Modell wurde auf die Hemmungs-Konzentrationsdaten angewandt. Die zu 50% effektive Konzentration (IC₅₀) wurde unter Verwendung der SAS-Software (Statistical Software System, SAS Institute, Inc., Cary, N. C.) berechnet.
Beispiel 22
Tabelle von Verbindungen
Die folgenden Tabellen führen die IC₅₀-Werte für repräsentative Verbindungen der Erfindung auf. Die mit einem Stern (*) gekennzeichneten Verbindungen sind Gegenstand der Erfindung.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
IC₅₀: Konzentration, die zur Erzielung einer 50%igen Hemmung beim radiometrischen NS3-Protease/NS4A-Cofaktor-Peptid-Test gemäß Beispiel 11 erforderlich ist. Die mit einem * gekennzeichneten Ergebnisse geben einen IC₅₀-Wert an, der beim radiometrischen HCV-NS3-Protease-Test gemäß Beispiel 10 erhalten worden ist.
HLE: Die Konzentration, die zu einer 50%igen Hemmung beim Test auf humane Leukozyten-Elastase erforderlich ist.
PPE: Die Konzentration, die zur Erzielung einer 50%igen Hemmung beim Test auf Schweinepankreas-Elastase erforderlich ist.
Andere: Nicht gekennzeichnete Zahlenwerte geben die Konzentration an, die zur Erzielung einer 50%igen Hemmung beim Test auf Schweinepankreas-α-Chymotrypsin erforderlich ist; mit ** markierte Zahlenwerte geben die Konzentration an, die zur Erzielung einer 50%igen Hemmung beim Test auf humanes Leber-Cathepsin B erforderlich ist.
MS: Massenspektrometrische Daten (MH⁺ aus FAB). AAA: Daten der Aminosäureanalyse, angegeben in% Peptidausbeute. Acca: 1-Aminocyclopropylcarbonsäure; Acpe: 1-Aminocyclopentylcarbonsäure; Abu: 2-Aminobuttersäure; Chg: Cyclohexylglycin (2-Amino-2-cyclohexylessigsäure); Hyp: 4(R)-Hydroxyprolin; Hyp(4-Bn): 4(R)-Benzyloxyprolin; Pip: Pipecolinsäure (d. h. Homoprolyl); Tbg: tert.-Butylglycin; Ac: Acetyl; Bn: Benzyl; O-Bn: Benzyloxy; DAD: 3-Carboxypropionyl; DAE: 4-Carboxybutyryl; AlGly: Allylglycin (2-Amino-4-pentensäure); Thioxolle: L-Thionoisoleucin; Ph: Phenyl; 3I-Ph: 3-Iodphenyl; 4I-Ph: 4-Iodphenyl; 2Br-Ph: 2-Bromphenyl; 3Br-Ph: 3-Bromphenyl; 4Br-Ph: 4-Bromphenyl; 1-NpCH₂O: Naphthalin-1-ylmethoxy; 2-NpCH₂O: Naphthalin-2-ylmethoxy; 3,5-Br₂Ph: 3,5-Dibromphenyl.

Claims

Verbindung der Formel (I):
worin Q CH₂ oder N-Y ist, worin Y H oder C_1-6-Alkyl ist; a) wenn Q CH₂ ist, a 0 ist, b 0 ist und B ein Amidderivat der Formel R_11a(R_11b)-C(O)- ist, worin R_11a H; C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder Di(C_1-6-alkyl)amino; C_3-7-Cycloalkyl; C₆-Aryl; C_7-10 Alkylaryl; (C_3-7-Cycloalkyl)-(C_1-6-alkyl); Heterocyclus-C_1-6-alkyl ist; und R_11b C_1-6-Alkyl, substituiert mit Carboxyl, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl oder Phenylmethoxycarbonyl; oder C_7-16-Aralkyl, substituiert am aromatischen Teil mit Carboxyl, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl, Phenylmethoxycarbonyl oder Heterocyclus-C_1-6-alkyl ist; oder R_11a und R_11b unter Bildung eines 3- bis 7-gliedrigen, Stickstoff enthaltenden Rings, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder (C_1-6-Alkoxy)carbonyl, verbunden sind; oder b) wenn Q N-Y ist; a 0 oder 1 ist, b 0 oder 1 ist und B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin R₁₁ (i) C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy (z.B. AcOCH₂) oder C_1-6-Alkoxy (z.B. Boc); ii) C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl oder Phenylmethoxycarbonyl; (iii) C_3-7-Cycloalkyl, substituiert mit Carboxyl und einem bis drei C_1-6-Alkylsubstituenten; (iv) C_4-10-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert am Cycloalkylteil mit Carboxy, (C_1-6-Alkoxy)carbonyl oder Phenylmethoxycarbonyl; (v)
(vi) C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, ist; R₆, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, substituiert mit Carboxyl ist; und R₅, wenn vorhanden, C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl ist; oder c) wenn Q entweder CH₂ oder N-Y ist; R₄ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; Z Oxo oder Thioxo ist; R₃ C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; W eine Gruppe der Formel III' ist:
Formel III' worin R₁₃ OH; SH; NH₂; Carboxyl; R₁₂; OR₁₂, SR₁₂, NHR₁₂ oder NR₁₂R₁₂' ist, worin R₁₂ und R₁₂' unabhängig sind: cyclisches C_3-16-Alkyl oder acyclisches C_1-16-Alkyl oder cyclisches C_3-16-Alkenyl oder acyclisches C_2-16-Alkenyl, wobei das Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls substituiert sind mit NH₂, OH, SH, Halogen oder Carboxyl; wobei Alkyl oder Alkenyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; oder R₁₂ und R₁₂' unabhängig C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy-C_1-6-alkyl sind; wobei das Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; wobei das cyclische Alkyl, cyclische Alkenyl, Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mit einem zweiten 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring kondensiert sind, um ein cyclisches System oder ein heterocyclisches System zu bilden, wobei der zweite Ring gegebenenfalls substituiert ist mit NH₂, OH, SH, Halogen, Carboxyl oder Carboxy-C_1-6-alkyl; wobei der zweite Ring gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthält, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N; R₁' Wasserstoff ist und R₁ Propyl ist; oder R₁' und R₁ zusammen einen 3-gliedrigen Ring gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl bilden; und A Hydroxy oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Ester davon ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel (Ia):
worin Y H oder C_1-6-Alkyl ist; a 0 oder 1 ist; b 0 oder 1 ist; B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin R₃, R₄, R₅, R₆, R₁₁, W, R₁, R₁' und A wie in Anspruch 1 definiert sind.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 2, worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁C(O)- ist, worin R₁₁: C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, C_1-6-Alkanoyloxy oder C_1-6-Alkoxy; C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl, MeOC(O), EtOC(O) oder BnOC(O); 3-Carboxypropionyl (DAD) oder 4-Carboxybutyryl (DAE); oder
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 3, worin B Acetyl, 3-Carboxypropionyl, 4-Carboxybutyryl, AcOCH₂C(O), Me₃COC(O),
ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 4, worin B Acetyl, 3-Carboxypropionyl (DAD), 4-Carboxybutyryl (DAE), AcOCH₂C(O)
ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 5, worin B Acetyl ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 2, worin R₆, falls vorhanden, die Seitenkette von Asp oder Glu ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 7, worin R₆, falls vorhanden, die Seitenkette von Asp ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 2, worin R₅, falls vorhanden, die Seitenkette einer Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D-Asp, Asp, D-Glu, Glu, D-Val, Val, D-Tbg und Tbg.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 9, worin R₅, falls vorhanden, die Seitenkette von D-Asp, D-Val oder D-Glu ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 10, worin R₅, falls vorhanden, die Seitenkette von D-Glu ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel (Ib):
worin B ein Amid der Formel R_11aN(R_11b)C(O)- ist, worin R_11a C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxy ist oder R_11a C₆-Aryl, C_7-10-Arylalkyl, 2-Tetrahydrofuranylmethyl oder 2-Thiazolidylmethyl ist; und R_11b C_1-6-Alkyl substituiert mit Carboxyl ist.
Verbindung der Formel (Ib) nach Anspruch 12, worin R_11a Isopropyl, Carboxyethyl, Benzylmethyl, Benzyl oder 2-Tetrahydrofuranylmethyl ist.
Verbindung der Formel (Ib) nach Anspruch 13, worin R_11b C_1-4-Alkyl substituiert mit Carboxyl ist.
Verbindung der Formel (Ib) nach Anspruch 14, worin R_11b Ethylcarboxyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Isopropyl, Cyclopropyl, tert.-Butyl, 1-Methylpropyl oder 2-Methylpropyl.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 16, worin R₄ Cyclopropyl oder 1-Methylpropyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 17, worin R₄ Cyclopropyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin Z Oxo ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₃ die Seitenkette von Ile, allo-Ile, Chg, Cha, Val, Tbg oder Glu ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 20, worin R₃ die Seitenkette von Val, Tbg oder Chg ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 21, worin R₃ die Seitenkette von Val ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin R₁₃ OR₁₂ oder SR₁₂ ist, worin R₁₂ ein C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl ist, wobei das genannte erste Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls substituiert ist mit C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, NH₂, OH, SH, Halogen, C_1-6-Alkoxy, Carboxyl, Carboxy-C_1-6-alkyl oder einem zweiten Aryl oder Aralkyl; wobei das genannte erste und zweite Aryl oder Aralkyl gegebenenfalls mindestens ein Heteroatom enthalten, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, S und N.
Verbindung nach Anspruch 23, worin R₁₃ Bn; PhCH₂CH₂; PhCH₂CH₂CH₂; o-Bn; o-Tolylmethoxy; m-Tolylmethoxy; p-Tolylmethoxy; 1-Naphthyloxy; 2-Naphtyloxy; 1-Naphthalinylmethoxy; 2-Naphthalinylmethoxy; (4-tert.-Butyl)-methoxy; (3I-Ph)CH₂O; (4Br-Ph)O; (2Br-Ph)O; (3Br-Ph)O; (4I-Ph)O; (3Br-Ph)CH₂O; (3,5-Br₂-Ph)CH₂O;

ist.
Verbindung nach Anspruch 24, worin R₁₃ O-Bn; PhCH₂CH₂CH₂; 1-Naphthyloxy; 2-Naphthyloxy; 1-Naphthalinylmethoxy; 2-Naphthalinylmethoxy;
ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin a) Q CH₂ ist, a 0 ist, b 0 ist und B ein Amid der Formel R_11aN(R_11b)-C(O)- ist, worin R_11a C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl ist oder R_11a Phenyl, C_7-10-Arylalkyl, 2-Tetrahydrofuranylmethyl oder 2-Thienylmethyl ist; und R_11b (C_0-2-Alkyl)phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder (C_1-4-Alkoxy)carbonyl; oder C_1-6-Alkyl substituiert mit Carboxyl oder (C_1-4-Alkoxy)carbonyl ist; oder R_11a und R_11b unter Bildung eines Piperidinrings, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder (C_1-6-Alkoxy)carbonyl, verbunden sind; oder b) Q N-Y ist, worin Y H oder C_1-6-Alkyl ist; a 0 oder 1 ist, b 0 oder 1 ist und B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin R₁₁ (i) C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkyl substituiert mit Carboxyl, MeC(O)O-, MeO-, EtO-, MeCH₂CH₂O- oder Me₃C-O-; (ii) Cyclopentyl oder Cyclohexyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; (iv) C_4-10-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert am Cycloalkylteil mit Carboxyl; (v)
(vi) Phenyl, Benzyl oder Phenylethyl ist; R₆, falls vorhanden, CH₂COOH oder CH₂CH₂COOH ist, R₅, falls vorhanden, C_1-6-Alkyl oder CH₂COOH oder CH₂CH₂COOH ist; oder c) wenn Q entweder CH₂ oder N-Y ist, R₄ C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; Z Oxo oder Thio ist; R₃ C_1-6-Alkyl; C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; R_1' Wasserstoff ist und R₁ Propyl ist; oder R_1' und R₁ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an dem sie gebunden sind, ein Cyclopropyl bilden, das gegebenenfalls mit Ethyl substituiert sein kann; und W wie in Anspruch 1 definiert ist; und A Hydroxy oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon; C_1-6-Alkoxy oder (Aryl-C_1-6-alkoxy) ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 2, worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin R₁₁ C_1-6-Alkoxy, C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder Benzylcarboxy; oder
ist; R₆ abwesend ist; R₅ abwesend ist; R₄ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; R₃ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; und W wie in Anspruch 1 definiert ist; und A Hydroxy oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon; Methoxy, Ethoxy, Phenoxy oder Benzyloxy ist.
Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 2, worin B Acetyl, 3-Carboxypropionyl, 4-Carboxylbutyryl, AcOCH₂C(O), Me₃COC(O),
ist; Y H oder Me ist, a 0 oder 1 ist, b 0 oder 1 ist, R₆, falls vorhanden, die Seitenkette von Asp oder Glu ist, R₅, falls vorhanden, die Seitenkette von Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Val, D-Val oder Tbg ist, R₄ die Seitenkette von Val, Chg, Tbg, Ile oder Leu ist, R₃ Wasserstoff oder die Seitenkette von Ile, Chg, Val, Glu ist; W eine Gruppe der Formel III' ist:
worin R₁₃ Bn, PhCH₂CH₂, PhCH₂CH₂CH₂, O-Bn, o-Tolylmethoxy, m-Tolylmethoxy, p-Tolylmethoxy, 1-Naphthalinylmethoxy, 2-Naphthalinylmethoxy, (4-tert.-Butyl)benzyloxy, (3I-Ph)CH₂O, (4Br-Ph)O, (2Br-Ph)O, (3Br-Ph)O, (4I-PH)O, (3Br-Ph)CH₂O, (3,5-Br₂-Ph)CH₂O,
ist; R_1' H ist und R₁ Propyl ist; oder R_1' und R₁ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an dem sie gebunden sind, ein Cyclopropyl bilden; und A Hydroxyl ist.
Verbindung der Formel Ib nach Anspruch 12, worin B ein Amid der Formel R_11aN(R_11b)-C(O)- ist, worin R_11a C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl ist oder R_11a 2-Tetrahydrofuranylmethyl ist; und R_11b (C_0-2-Alkyl)phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder (C_1-4-Alkoxy)carbonyl; oder C_1-6-Alkyl substituiert mit Carboxyl oder (C_1-4-Alkoxy)carbonyl ist; oder R_11a und R_11b unter Bildung eines Piperidinrings, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl oder (C_1-6-Alkoxy)carbonyl verbunden sind; R₄ Cyclohexyl ist, Z Oxo ist; R₃ Wasserstoff oder die Seitenkette von Ile, Chg, Val, Glu ist; W eine Gruppe der Formel III' ist:
worin R₁₃ Bn, PhCH₂CH₂, PhCH₂CH₂CH₂, O-Bn, o-Tolylmethoxy, m-Tolylmethoxy, p-Tolylmethoxy, 1-Naphthalinylmethoxy, 2-Naphthalinylmethoxy, (4-tert.-Butyl)methoxy, (3I-Ph)CH₂O, (4Br-Ph)O, (2Br-Ph)O, (3Br-Ph)O, (4I-Ph)O, (3Br-Ph)CH₂O, (3,5-Br₂-Ph)CH₂O,

ist; R_1' H ist und R₁ Propyl ist; oder R_1' und R₁ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an dem sie gebunden sind, ein Cyclopropyl bilden; und A Hydroxyl ist.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, worin B ein Acylderivat der Formel R₁₁-C(O)- ist, worin R₁₁ C_1-10-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; C_3-7-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl; oder ein C_4-10-(Alkylcycloalkyl), gegebenenfalls substituiert am Cycloalkylteil mit Carboxyl, ist; oder R₁₁ C₆- oder C₁₀-Aryl oder C_7-16-Aralkyl, gegebenenfalls substituiert mit einem C_1-6-Alkyl ist; a 0 oder 1 ist; R₆, falls vorhanden, C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl ist; b 0 oder 1 ist; R₅, falls vorhanden, C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Carboxyl ist; Q N-Y ist und Y H oder C_1-6-Alkyl ist; R₄ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; Z Oxo ist, R₃ C_1-10-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl oder C_4-10-(Alkylcycloalkyl) ist; und W, R₁' und R₁ wie in Anspruch 1 definiert sind; und A Hydroxyl oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder ein Ester davon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine bezüglich Hepatitis C antiviral wirksame Menge einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermedium oder Hilfsmittel.
In-vitro-Verfahren zur Inhibierung der Replikation des Hepatitis C-Virus, in dem der Virus einer Hepatitis C-Virus-NS3-Protease inhibierenden Menge der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon ausgesetzt wird.
Verwendung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Hepatitis C-Infektion in einem Säuger.
Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung der Formel
worin B, P6, P5, P4, P3, P2, W und P1 wie nachstehend definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung der Formel
worin B, P6, P5, P4, P3, R₁₃ und P1 wie nachstehend definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung der Formel
worin B, P6, P5, P4, P3, P2, W und P1 wie nachstehend definiert sind:
Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Verbindung der Formel
worin B, R₄, P3, R₁₃ und P1 wie nachstehend definiert sind:
Verwendung eines Zwischenprodukts der Formel:
worin R₁ und R_1' einen 3-gliedrigen Ring gegebenenfalls substituiert mit C_1-6-Alkyl bilden, zur Synthese einer Verbindung der Formel I nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche.
Verwendung nach Anspruch 38, worin die Carboxyl-Schutzgruppe (PG1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylestern, Aralkylestern und Estern, die durch milde Basenbehandlung oder milde reduktive Mittel gespalten werden können.