CN112533936B - 利用磺酸化合物纯化肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种纯化目标肽的方法，其包括以下工序：在磺酸化合物的存在下，将通过肽合成获得的肽与溶剂混合以获得固体，并进行固液分离以收集该固体以纯化目标肽。
Description
技术领域
本申请涉及从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，以及包含通过该纯化方法获得的目标肽的药剂。
背景技术
通常，氨基酸残基较少的肽(通常为30个残基以下)通常是通过有机化学合成方法来生产的(例如专利文献1)。作为有机化学合成方法，可列举固相法和液相法，重复包含N-保护氨基酸与C-保护肽链(二肽形成时为C-保护氨基酸)之间的偶联反应和其之后继续的N-末端脱保护反应的肽延伸反应。在有机化学合成方法中，由于肽延伸反应的一部分重复或一部分缺失，合成了各种相似肽，因此有必要将产生的目标肽与这些相似肽分离。然而，相似肽的物理化学性质通常与目标肽的物理化学性质非常相似，这使得它们的分离非常困难。为了获得纯化的目标肽，需要有效分目标肽和相似肽的方法。
具有较多氨基酸残基(通常超过30个残基)的肽通常通过发酵方法制造(例如专利文献2)。在这种情况下，有时混入部分氨基酸残基被部分取代的相似肽，如何将具有非常相似性质的目标肽和相似肽分离是一个重要的问题。
另外，现有的肽的纯化，即使在扩大规模的情况下，通常也通过成本上具有巨大的负担的高速分取液相色谱仪进行。因此需要一种能够替代或补充其的有效地从目标肽和相似肽的混合物中分离和去除相似肽的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2018-52933号公报
专利文献2：日本特开2016-190851号公报
在本申请说明中，引用的现有技术文献的公开内容全部通过参照而引入本申请说明书中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题
本申请的课题是提供一种纯化目标肽的方法，其包括从包含通过肽合成获得的目标肽和相似肽的混合物中除去相似肽。
此外，本申请的课题是提供一种用于替代或补充现有的肽纯化方法的肽纯化方法。
解决技术问题的技术手段
本发明的发明人，为了解决上述课题进行了深入的锐意研究，结果发现：包含相似肽的目标肽的肽合成产物中，在溶剂的存在下，混合具有指定结构的磺酸化合物，进行固液分离，由此能够提高目标肽的纯度(绝对纯度，其中不包括磺酸化合物)，且能够获得相似肽的含量减少的目标肽的磺酸盐的固态物质，完成了项发明。下面将详细描述本申请的发明。
[项目1]
一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下将所述合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集所述固体的工序。
[项目1-1]
一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下将所述合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)从所述混合开始经过1分钟以上后进行固液分离并收集所述固体的工序。
[项目1-2]
一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下将所述合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集所述固体的工序，
所述溶剂包括：水、醇化合物、乙腈、醚化合物、酮化合物、酯化合物、烃化合物、DMSO、酰胺化合物、卤代烃或它们的混合物。
[项目1-3]
一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下将合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集所述固体的工序，
(3)洗涤所述固体的工序。
[项目1-4]
一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物存在下，在0～50℃下，将所述合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)在0～50℃下进行固液分离并收集所述固体的工序。
[项目1～5]
一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下，将所述合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集所述固体的工序，
所述溶剂与所述目标肽的重量比(溶剂/目标肽)为1～100000。
[项目1-6]
一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下，将所述合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集所述固体的工序，
其中，所述磺酸化合物与所述目标肽的摩尔比为0.1～50。
[项目1-7]
一种从肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，所述目标肽应具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基。
该方法包含
(1)在磺酸化合物的存在下将合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序。
(2)固液分离和收集固体的工序。
[项目2]
项1-1～1-7中任一项所述的方法，其中，所述磺酸化合物是下述式(I)的化合物，
[化学式1]
[式中，
A为任选进行了取代的C6-14芳基，任选进行了取代的双环杂环基，C2-3烯基或C2-3炔基；
X是(i)单键，(ii)任选进行了取代的C1-6亚烷基，(iii)-CO-(CH2)n-(CO与A键合)或(iv)C2-4亚烯基；且
n是1到3的整数]。
[项目3]
项2所述的方法，其中，A是任选进行了取代的双环杂环基，
X是(i)单键，(ii)C1-6亚烷基，(iii)-CO-(CH2)n-(CO与A键合)或(iv)C2-3亚烯基；且
n是1到3的整数。
[项目4]
项2所述的方法，其中，A是任选进行了取代的双环杂环基，
X是(i)单键，(ii)C1-6亚烷基，(iii)-CO-(CH2)n-(CO与A键合)或(iv)C2-3亚烯基；且
n是1到3的整数。
[项目5]
项2中所述方法，其中，A是C2-3烯基；且X是C1-4亚烷基。
[项目6]
项2中所述方法，其中，A是C2-3炔基；且X是C1-4亚烷基。
[项目7]
项1～6和项1-1～1-7中任一项所述的方法，其中，所述目标肽具有5～31个氨基酸残基。
[项目8]
项1～6和项1-1～1-7中任一项所述的方法，其中，所述合成的肽含有相似肽。
[项目9]
项1～8和项1-1～1-7中任一项所述的方法，其中，在所述合成的肽中，相似肽与所述目标肽的摩尔比为0.7以下。
[项目10]
项1～9和项1-1～1-7中任一项所述的方法，其中，所述肽合成是通过固相方法进行的肽合成。
[项目11]
项1～10和项1-1～1-7中任一项所述的方法，其中，所述目标肽包含至少1个碱性氨基酸残基，且目标肽的N末端任选是游离的。
[项目12]
项2、3和7～11中任一项所述的方法，其中，A是任选由选自C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及C6-10芳基中的相同或不同的1～5个取代基进行了取代的C6-14芳基(例如，C6-13芳基、C6-10芳基)
[项目13]
项2、3和7～12项中任一项所述的方法，其中，A是选自苯基，萘基和茚满基的C6-10芳基，所述C6-10芳基任选由选自C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及C6-10芳基中的相同或不同的1～5个取代基进行了取代。
[项目13-1]
项2、3和7～12中任一项所述的方法，其中，A是选自苯基，萘基和茚满基的C6-10芳基，所述C6-10芳基任选由选自C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及C6-10芳基中的相同或不同的1～5个取代基进行了取代。
[项目14]
项2、4和7～11中任一项所述的方法，其中，A为选自2,3,4,5-四氢-1H-1-苯并氮杂
基、苯并
唑基、吲哚基、异吲哚基、酞嗪基、苯并二氢吡喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、嘧啶基、苯并噻唑基、喹啉基、异苯并二氢吡喃基及苯并三唑基中的双环杂环基，且所述双环杂环基任选进行了适当的取代。
[项目15]
项2、4、7～11和14中任一项所述的方法，A为任选由选自C6-10芳基、C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及氧代基(O＝)中的相同或不同的1～5个取代基进行了取代的双环杂环基。
[项目16]
第2、4、7～11、14和15项中的任何一项所述的方法，其中，A是选自下述化学式中的双环杂环基，所述双环杂环基任选由1个苯基进行了取代。
[化学式2]
及
[化学式3]
[第17项]
项2～4、7～16和项13-1中任一项所述的方法，其中，
X是(i)单键，(i)任选由选自甲基、苄基、氰基及苯基中的相同或不同的1～3个取代基进行了取代的C1-4亚烷基，或(iii)-CO-CH2-(CO与A键合)。
[项目17-1]
项2～4，项7～16和项13-1中任一项所述的方法，其中，X是(i)单键，(ii)任选由1个甲基、1个苄基、1个氰基和/或1个或2个苯基进行了取代的C1-4亚烷基，或(III)-CO-CH2-(CO与A键合)。
[项18]
项12所述的方法，其中，X是(i)单键，(ii)任选由选自甲基、苄基、氰基及苯基中的相同或不同的1～3个取代基进行了取代的C1-4亚烷基，或(iii)-CO-(CH2)-(CO与A键合)。
[项目18-1]
项12所述的方法，其中，，X是(i)单键，(ii)任选由1个甲基、1个苄基、1个氰基和/或1个或两个苯基进行了取代的C1-4亚烷基，或(iii)-CO-(CH2)-(CO与A键合)。
[项目19]
项2～4、7～18以及13-1、17-1和18-1中任一项所述的方法，其中X是单键。
[项目20]
第16项所述的方法，其中，X是单键。
[项目21]
项1～20和1-1～1-7、13-1、17-1和18-1中任一项所述的方法。
所述磺酸化合物从下列化合物中选择：
[项目22]
项1～21和项1-1～1-7、13-1、17-1和18-1中任一项所述的方法，其进一步包括除去磺酸化合物的工序。
[项目23]
项1～22，项1-1～1-7、13-1、17-1和18-1中任一项所述的方法，其用于提高目标肽与相似肽的摩尔比。
[项目24]
一种制备所述目标肽的方法，其包括项1～23和1-1～1-7、13-1、17-1和18-1中任一项所述的方法。
[项目25]
一种药剂，其含有通过包含项1～23和1-1～1-7、13-1、17-1和18-1中任一项所述方法的方法进行纯化而得到的目标肽。
[项目26]
一种含有所述磺酸化合物的试剂，其用于项1～23和1-1～1-7、13-1、17-1和18-1中任一项所述的方法中。
[第27项]
一种化合物，其是选自下述化学式的化合物。
[化学式4]
[化学式5]
[化学式6]
[化学式7]
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[项目28]
一种药剂，其是含有通过肽合成获得的肽经过纯化而得到的目标肽的药剂，所述目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，
所述纯化包括下述工序：
(1)在磺酸化合物的存在下将所述合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集固体。
[项目28-1]
一种药剂，其是含有通过肽合成获得的肽经过纯化而得到的目标肽的药剂，所述目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，
所述纯化包括下述工序：
(1)在溶剂的存在下将所述合成的肽与磺酸化合物混合，
(2)从液相中分取获得的固态物质。
[项目29]
一种制剂，其是含有用于在从通过肽合成获得的肽中进行目标肽的纯化时使用的磺酸化合物的制剂，所述目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，所述纯化包括下述工序：
(1)在磺酸化合物的存在下将合成的肽与溶剂混合以获得固体，
(2)进行固液分离并收集所述固体。
[项目29-1]
一种制剂，其是含有用于在从通过肽合成获得的肽中进行目标肽的纯化时使用的磺酸化合物的制剂，所述目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，所述纯化包括下述工序：
(1)在溶剂的存在下将所述合成的肽与磺酸化合物混合，
(2)从液相分取所述获得的固态物质。
发明的效果
通过本发明，可以从合成获得的，包含相似肽的肽中获取目标肽纯度更高的肽。
本发明的具体实施方式
在一个实施方案中，本申请是一种从通过合成获得的肽中纯化目标肽的方法，该目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，该方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下将该合成的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集该固体的工序。
在一个实施方案中，本申请是一种从通过合成获得的肽中纯化目标肽的方法，该目标肽具有游离的N端和/或具有至少1个碱性氨基酸残基，该方法包括：
(1)在溶剂的存在下将该合成的肽与磺酸化合物混合，
(2)从液相中分取获得的固态物质。
在本申请中，“进行纯化”是指提高某种物质的纯度。在此，纯度是指绝对纯度(该物质相对于含有作为对象的物质的混合物的总量的量)或相对纯度(作为对象物质相对于某种混合物中所含的其他物质(例如，杂质)的含量的量)。
例如，在本发明中，“纯化目标肽”包括，与相对于与磺酸化合物混合之前的合成肽的总量，其中所包含的目标肽的量(例如重量％)相比，相对于从与磺酸化合物混合后得到的固态物质中减去相当于磺酸化合物部分后的重量，其中所包含的目标肽的量(例如重量％)得到提高。在本发明中，“纯化目标肽”还包括，例如，与磺酸化合物混合之前相比，在该混合后得到的固态物质中的目标肽与相似肽的摩尔比得到提高。
在本申请中，对目标肽的纯度的测定方法没有特别限定，可以通过通常使用的方法(例如HPLC法)进行测定。
在本申请中，“肽合成”没有特别限定，只要是用于合成肽的方法即可，例如包括有机化学合成方法(例如，固相方法和液相方法)和发酵方法等常规的方法。肽合成中一般设置有抑制杂质(例如相似肽)产生的合成条件(例如有机化学合成方法中树脂、保护基团、反应温度、反应时间、溶剂；发酵方法中的培养条件、宿主、载体、碱基序列)。同样在本申请中，基于本领域技术人员通常已知的知识，优选设定抑制相似肽的产生的条件，优选在通过肽合成获得的肽中，目标肽的物质量大于相似肽的物质量。
例如，在通过肽合成获得的肽中，该相似肽与该目标肽的摩尔比(相似肽/目标肽)为0.7以下(优选0.6以下，更优选0.5以下，进一步优选0.45以下，更进一步优选0.4以下，更优选0.2以下)。优选该相似肽与该目标肽的摩尔比较低，对于下限没有特别限定，例如，可以将0.0001～0.7、0.001～0.6、0.01～0.5的范围列举为该摩尔比的范围的示例。该摩尔比，例如可以根据基于通过HPLC法得到的值(例如面积比)计算得到的值作为摩尔比的近似值使用。
在通过肽合成获得的肽中，“目标肽的物质量大于相似肽的物质量”是指目标肽的物质量大于某一种相似肽的物质量，包括多个相似肽时，是指目标肽的物质量大于每种相似肽的物质量。在通过肽合成获得的肽中，“目标肽的物质量大于相似肽的物质量”可以如下表示：在通过该肽合成而获得的肽的总量中的目标肽的量(绝对纯度)较大(例如，通过肽合成得到的肽中的目标肽的浓度为40重量％以上、50重量％以上、60重量％以上、70重量％以上、80重量％以上、90重量％以上)，因此通过该肽合成获得的肽中相似肽的物质量低于目标肽的物质量的概率极高。
在本申请中，“目标肽”是指通过肽合成来生成为目的而生成的肽，并且只要目标肽的结构如下即可，没有特别限定：其N末端为游离的或具有至少1个(例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个及1个)碱性氨基酸残基，或其N端是游离的且至少有1个(例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个及1个)碱性氨基酸残基。目标肽优选具有5～31个氨基酸残基，更优选为5～25个氨基酸，进一步优选为5～20个氨基酸，更进一步优选为5～15个氨基酸残基。目标肽中的氨基酸残基数量的范围可以通过选自5、6、7和8的下限值和选自31、25、20、15和10的上限的组合而表示。
目标肽中可包含的氨基酸残基除了下表中的20种通常构成蛋白质的氨基酸(除不具有不对称碳的甘氨酸以外均为L型)，还可以为来自L-硒代半胱氨酸、2-氨基异丁酸、D-异缬氨酸、L-异缬氨酸、L-正亮氨酸、L-鸟氨酸等天然存在的氨基酸的氨基酸残基，或者可以为来自非天然存在或或微量存在(因此通常通过化学合成等而制造)的非天然氨基酸的氨基酸残基。
作为非天然氨基酸的例子，可列举：下表所示的除甘氨酸的19种的D型氨基酸；下表所示的20种氨基酸的N-甲基体(例如N-甲基甘氨酸、L-N-甲基苯基丙氨酸)和除N-甲基甘氨酸以外的19种的L-N-甲基体的镜像体；下表中所示的除甘氨酸和丙氨酸以外的18种氨基酸的α-甲基体的镜像体(例如，α-甲基赖氨酸)；下表中所示的不包括丙氨酸的19种氨基酸的α-乙基体的两个镜像体；
D-硒代半胱氨酸；
D-正亮氨酸；
D-鸟氨酸；
(S)-或(R)-2,3-二氨基丙酸；
(S)-或(R)-2,4-二氨基丁酸；
(S)-或(R)-焦谷氨酸；
(S)-或(R)-α-甲基-邻氟苯基丙氨酸；
(S)-或(R)-α-(4-戊烯基)丙氨酸；
(S)-或(R)-α-(7-辛烯基)丙氨酸；
(S)-或(R)-α-丙炔基丙氨酸；
(S)-或(R)-α-烯丙基丙氨酸；
(S)-或(R)-茚满-2-基-甘氨酸；
(S)-或(R)-吡啶-3-基-甲基甘氨酸，以及吡啶环上可被烷基或苯基取代的衍生物；
(S)-或(R)-吡啶-2-基-甲基甘氨酸；
(S)-或(R)-六氢吡啶羧酸(ピペコリン酸，Pipecolinic acid)；
(S)-或(R)-和反式或顺式-4-羟基脯氨酸；
RC8((R)-α-(7-辛烯基)丙氨酸)；
SC5((S)-α-(4-戊烯基)丙氨酸)。
在本申请中，碱性氨基酸残基是指来自除氨基外的具有显示碱性的残基的氨基酸(例如，D-或L-赖氨酸、D-或L-精氨酸、D-或L-组氨酸、D-或L-鸟氨酸、(S)-或(R)-2,3-二氨基丙酸及(S)-或(R)-2,4-二氨基丁酸)的氨基酸残基。
在本申请中，目标肽的末端可以通过肽合成中通常使用的末端保护基(例如，N末端为Ac基(乙酰基)、Fmoc基(9-芴基甲氧羰基)或Boc基(叔丁氧羰基)；C末端为酰胺基或酯基)进行了修饰。
在本申请中，“相似肽”是指可以通过用于生成目标肽的肽合成来产生的非目标肽的肽。作为相似肽的例子，可列举以下的肽：
(1)目标肽中包含的氨基酸残基的一部分(例如，连续或不连续的1～3个氨基酸残基，连续或不连续的1～2个氨基酸残基和1个氨基酸残基)重复；
(2)目标肽中包含的氨基酸残基的一部分(例如，连续或不连续的1～3个氨基酸残基，连续或不连续的1～2个氨基酸残基和1个氨基酸残基)缺失；
(3)目标肽中包含的氨基酸残基的一部分(例如，连续或不连续的1～3个氨基酸残基，连续或不连续的1～2个氨基酸残基和1个氨基酸残基)被差向异构化(例如，通过N-保护氨基酸的α位异构化产生的差向异构化)；和/或
(4)目标肽中包含的氨基酸残基的一部分(例如，连续或不连续的1～3个氨基酸残基，连续或不连续的1～2个氨基酸残基和1个氨基酸残基)数目相同的氨基酸残基取代。
相似肽的氨基酸残基的数目，例如，与目标肽的氨基酸残基的数目相同，,或者多1～3个(优选为1～2个，更优选为1个)，或者少1～3个(优选为1～2个，更优选1个)。
“相似肽”可以为具有碱性部分(其N末端是游离的/具有至少1个(例如，1～5个、1～4个、1～3个、1～2个及1个)碱性氨基酸残基)，也可以没有这样碱性的部分。本发明的效果虽不限于特定的机制，但如上所述，在通过肽合成获得的肽中，目标肽的量(物质量)通常大于相似肽的量，并且目标肽和相似肽的结构相似时，两者在溶剂中的溶解特性通常相似，因此，当“相似肽”具有碱性部分时，有可能和目标肽一样地与磺酸化合物形成盐，从而成为固体，但是在与磺酸化合物混合后获得的固态物质中，与相似肽相比，原本含量就更高的目标肽的比例会提高。
在本申请中，用于与磺酸化合物混合时使用的溶剂没有特别限定，并且可以考虑目标肽的纯化效率而适当地选择。
例如，溶剂包括
水；
醇化合物(例如，C1-4醇(例如，异丙醇、甲醇、乙醇))；
乙腈；
醚化合物(例如，C2-6醚(例如，乙醚、MTBE、四氢呋喃、1,4-二
烷、1,2-二甲氧基乙烷、CPME(环戊基甲基醚)))；
酮化合物(例如，C3-6酮(例如丙酮)、MEK(甲基乙基酮)、甲基异丙基酮、MIBK(甲基异丁基酮))；
酯化合物(例如，C3-6酯(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯，乙酸叔丁酯))；
烃化合物(例如，C6-9烃类化合物(例如甲苯))；
DMSO；
酰胺化合物(例如，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、DMA(N,N-二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮))；
卤代烃(例如，氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷)；或
它们的混合(在此，该混合意指为组合)。溶剂可以进一步含有其他物质。
并且，作为溶剂的其他例子，可列举：异丙醇(IPA)、甲醇(MeOH)、1,4-二
烷、1,2-二甲氧基乙烷(DME)、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、MTBE、DMSO、二乙醚及它们的混合(在此，混合意指组合)等，该溶剂可以含有其他物质。
当在溶剂的存在下将通过肽合成获得的肽与磺酸化合物混合时，相对于该肽，溶剂的量和磺酸化合物的量没有特别限定，可以考虑目标肽的纯化效率而适当选择。例如，按重量计，相对于通过肽合成得到的目标肽1(可以是理论值)，溶剂可以在1～100000，优选为1～10000，更优选为1～2000，更进一步优选在10～1000的范围使用。
例如，磺酸化合物与目标肽的摩尔比(可以是理论值)可以在0.1～50，优选0.2～40，更优选0.3～30，进一步优选0.5～20。并且，例如，磺酸化合物与目标肽的摩尔比(可以是理论值)，在磺酸化合物具有1个磺基时，例如，可以在0.5～20的范围内使用，优选为0.8～10，更优选为1～8，进一步优选为1.5～7；在具有两个磺基时，例如，可以在0.2～10的范围内使用，优选0.4～5，更优选0.5～4，进一步优选为0.75～3.5；在具有三个磺基时，例如，可以在0.15～6的范围使用，优选为0.3～3.3，更优选0.4～2.6，进一步优选0.5～2.3。
在此，理论值可以意指，将肽合成产物中的目标肽的纯度设为100％而算出的值。
关于与磺酸化合物混合后将得到的固态物质从液相中分取出(固液分离)的方法可以根据生产规模等适当选择，没有特别限定，例如，可列举：过滤、离心、倾析等方法。
由于通过固液平衡可以提高固体中的目标肽的纯度，因此优选固液分离在合成的肽与磺酸化合物及溶剂混合后，经过指定的时间(例如，1分钟以上、2分钟以上、3分钟以上、4分钟以上、5分钟以上、10分钟以上、30分钟以上、1小时以上、2小时以上、3小时以上)后进行。考虑到工作效率，例如，优选在1天以内、2天以内、1周以内、2周以内进行固液分离，可以在不进行固液分离的情况下存储混合物，再适当地进行固液分离。
与磺酸化合物和/或溶剂混合时，以及将获得的固态物质从液相中分取出(固液分离)时的温度没有特别限定，可以考虑目标肽的纯化效率而适当选择。例如，可列举：0～50℃、0～40℃、0～30℃、10～25℃。
固液分离后的固态物质可以进行适当洗涤。洗涤中使用的液体(清洗液)没有特别限定，可以考虑的目标肽的纯化效率适当地选择。
例如，洗涤液可以包括
水；
醇化合物(例如，C1-4醇(例如，异丙醇、甲醇、乙醇))；
乙腈；
醚化合物(例如，C2-6醚(例如，乙醚、MTBE、四氢呋喃、1,4-二
烷、1,2-二甲氧基乙烷、CPME(环戊基甲基醚)))；
酮类化合物(例如，C3-6酮(例如丙酮)、MEK(甲基乙基酮)、甲基异丙基酮、MIBK(甲基异丁基酮))；
酯化合物(例如，C3-6酯(例如，乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯))；
烃化合物(例如，C6-9碳氢化合物(例如甲苯))；
DMSO；
酰胺化合物(例如，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、DMA(N,N-二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮))；
卤代烃(例如，氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷)；或
它们的混合(混合意指组合)
洗涤液可以进一步包含其他物质。
对于通过本申请的纯化方法得到的固态物质，可以重复进行本申请的纯化方法，可以以本申请的1个实施方式的形式而列举。通过重复本申请的纯化方法，可以提高目标肽的纯度。
本申请的纯化方法可以与其他纯化方法(例如，分取HPLC、重结晶、分散洗涤)组合进行。例如，可以将通过本申请的方法获得的固态物质进行另外的纯化方法，或者对预先通过另一种纯化方法纯化得到的肽进行本发明的纯化方法。
在通过本申请的纯化方法获得的固态物质中，优选在进一步的纯化工序中从固态物质中除去磺酸化合物。除去磺酸化合物的方法没有特别限定，并且可以通过除去磺酸化合物的常规方法进行，例如，酸或碱处理或使用离子交换树脂的除去法。
在本申请中，磺酸化合物是指具有磺基(-SO3H)的有机化合物。本申请中的磺酸化合物优选磺基通过单键或短的连接基(例如，C1-12、C1-6、C1-4等)键合至具有1个以上不饱和键的部位。
例如，作为磺酸化合物的优选例，可以举出式(I)的磺酸化合物。
[化学式式16]
[式中，A为可以进行了取代的C6-14芳基(例如，C6-13芳基、C6-10芳基)，可以进行了取代的双环杂环基、C2-3烯基或C2-3炔基；
X是(i)单键，(ii)可以进行了取代的C1-6亚烷基(例如，C1～5亚烷基、C1-4亚烷基)，(iii)-CO-(CH2)n-(CO与A键合)，或(iv)C2-4亚烯基；且
n是1到3的整数]。
在本申请中，“C6-14芳基(包括构成某些基团的一部分的情况)”是指6～14元的单环、双环或三环的芳香族烃环基，或者该芳香族烃环与1个环烷烃缩合而形成的环基。作为C6-14芳基的实例，可列举：苯基、萘基、茚满基、四氢萘基和芴基。
在本申请中，“C6-10芳基(包括构成某些基团的一部分的情况)”是指6～10元的单环或双环芳香族烃环基，或者芳香族烃环与1个环烷烃缩合而形成的环基。作为C6-10芳基的实例，可列举：苯基、萘基、茚满基、四氢萘基。
作为“可以被取代的C6-14芳基(或C6-13芳基、C6-10芳基)”的例子，可列举可以被选自C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及C6-10芳基中的相同或不同的1～5个(例如1～3个、1～2个及1个)取代基取代的C6-14芳基(或C6-13芳基、C6-10芳基)。
在本申请中，“双环杂环基”是指单环芳香族环(苯、吡啶等)与具有选自氮原子、氧原子及硫原子的1～4个杂原子的单环芳香族环(吡啶、呋喃、噻吩、咪唑、嘧啶、
唑、噻唑、噻嗪、三唑)或单环非芳香族环(四氢吡喃、环己亚(azepane)、胺、哌啶等)缩合而成的8～11元双环基。双环杂环基可以以任何提供稳定结构的杂原子或碳原子键合。双环杂环基可以包含1个以上(例如，1个、2个)氧代基。作为双环杂环基的例子，可列举：2,3,4,5-四氢-1H-1-苯并氮杂
基，苯并
唑基、吲哚基、异吲哚基、酞嗪基、苯并二氢吡喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、嘧啶基、苯并噻唑基、喹啉基、异苯并二氢吡喃基和苯并三唑基。
关于本申请中“可任意取代的双环杂环基”的例子，可列举可以被选自C6-10芳基，C1-4烷基，-CO-C6-10芳基，-OH，-O-C1-3烷基，-NO2，-CO2H，-CO2-C1-4烷基，卤素，-NH2，-CH2-SO3H，-SO3H，-CN，-CO-C1-4烷基，-CF3和羰基中相同或不同的1～5个取代基(例如1～3个、1～2个和1个)取代的双环杂环基。
在本申请中，“C2-3烯基”是指具有2～3个碳原子并且含有1个或2个双键的直链或支链的不饱和烃基。例如，乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、丙二烯基。
在本申请中，“C2-3炔基”是指具有2～3个碳原子并且含有1个三键的直链或支链的不饱和烃基，例如乙炔基、丙炔基(1-丙炔基、2-丙炔基)。
在本申请中，“C1-4亚烷基”是指来自直链C1-4烷基的二价基团。作为C1-4亚烷基的例子，可列举：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基。
在本申请中，“C1-6亚烷基”是指来自直链C1-6烷基的二价基团。作为C1-6亚烷基的例子，可列举：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基。
在本申请中，“C1-3亚烷基”是指来自直链C1-3烷基的二价基团。作为C1-3亚烷基的例子，可列举：亚甲基、亚乙基、三亚甲基。
作为本申请中的“可以被取代的C1-6亚烷基(或C1-5亚烷基、C1-4亚烷基、C1-3亚烷基)”的例子，可列举：被选自甲基、苄基、氰基及苯基的相同或不同的1～3个取代基(例如，可以被1个甲基、1个苄基或1个苯基取代)取代的C1-6亚烷基(或C1-5亚烷基、C1-4亚烷基、C1-3亚烷基)。
在本申请的“-CO-(CH2)n-”中，n为1～3的整数(优选为1～2)，优选的-CO-(CH2)n-的例子可列举-CO-CH2-。
在本申请中，“C2-4亚烯基”是指来自直链C2-4烯基的二价基团。在本申请中，“C2-3亚烯基”是指来自直链C2-3烯基的二价基团。作为C2-4亚烯基和C2-3亚烯基的例子，可列举：亚乙烯基(-CH＝CH-)、丙烯腈(-CH2CH＝CH-)。
在本申请中，“C1-4烷基(包括形成某些基团的一部分的情况)”是指具有C1-4个碳原子的直链或支链的饱和烃基。作为C1-4烷基的例子，可列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
在本申请中，“C1-3烷基(包括形成某些基团的一部分的情况)”是指具有1～3个碳原子的直链或支链的饱和烃基。作为C1-3烷基的例子，可列举：甲基、乙基、丙基和异丙基。
在本申请中，作为“-CO-C6-10芳基”的例子，可列举-CO-苯基。
在本申请中，作为卤素的例子，可列举氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
作为进一步优选的磺酸化合物的例子，可列举上述的[项目21]中列出的化合物。
本申请的一个方式，是提供包含本申请的纯化方法的制造目标肽的方法。
本申请的一个方式，是提供含有通过包含本申请的纯化方法的方法纯化而得到的目标肽的制剂。该试剂可以通过常规方法制造。
本申请的一个方式，是提供了用于在本申请的纯化方法中使用的包含磺酸化合物的制剂。该试剂可以通过常规方法制造。
[实施例]
在下文中，将通过试验例描述本发明，但是本发明不限于这些试验例。
目标肽的纯化
评价方法的概述：
当以固相法合成目标肽时，虽然可以预测到获得的粗肽中会混杂有作为杂质的相似肽，但是难以确定实际上掺杂了哪种相似肽。因此，通过固相法分别合成了具有与目标肽及相似肽相当的、已知序列的拟相似肽，并将得到的粗目标肽，粗拟相似肽及各种酸化合物溶解在溶剂中(这是为了获得用于测定处理前值(HPLC)的均匀的样品)，然后冻干以除去该溶剂。接下来，将溶剂添加到残留物中后，从获得的固液混合物中去除上清液，测定目标肽的物质量(mol)相对于获得的固体中的目标肽和拟相似肽的总物质量(mol)的比例。并评价该固体中的目标肽是否得到了纯化。
1-1：肽的合成
下表中所示的目标肽和拟相似肽通过下述固相法合成。
[表1-1]
[表1-2]
实施例中使用的设备如下。
-肽合成仪：国产化学社株式会社制造的“KMS-3”。
-质量分析仪：由安捷伦公司制造的“6224TOF LC/MS”和“1260Infinity系列”，“离子化条件为ESI(毛细管电压：3500V，分段器电压：100V)”
-HPLC分析仪：岛津制作所株式会社制造的“SPD-M20A”、“LC-20AD”、“SIL-20AC”、“DGU-20A”、“CTO-20AC”、“CBM-20A”或岛津制作所株式会社制造的“SPD-M20A”、“LC-2010C”或安捷伦公司制造的“1200系列”。
(1)保护肽树脂的合成
在保护肽树脂的合成中，使用各构成氨基酸的α-氨基均被9-芴基甲氧基羰基(Fmoc基)保护得到的物质，在活性侧链中，使用天冬氨酸的β-羧基和天冬氨酸的β-羧基和谷氨酸的γ-羧基被叔丁基(tBu基)保护得到的物质；精氨酸的胍基被2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基-磺酰基(Pbf基)保护得到的物质；丝氨酸和苏氨酸的羟基被叔丁基(tBu基)保护得到的物质；半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基被三苯甲基(Trt基)保护得到的物质；酪氨酸的酚羟基被叔丁基(tBu基)保护得到的物质；天冬酰胺和谷氨酰胺的碳酰胺基被三苯甲基(Trt基)保护得到的物质；赖氨酸的ε-氨基、Dap的β-氨基及色氨酸的吲哚基团被叔丁氧羰基(Boc基团)保护得到的物质。
作为树脂，在合成C末端的羧酸的肽链时，使用：(2-氯)三苯甲基氯树脂(渡边化学株式会社制造，约1.6mmol/g)。合成C末端为碳酰胺的肽链时，使用了Fmoc-NH-SAL树脂(渡边化学株式会社制造，约0.43mmol/g)。合成C端为羧酸的肽链时，向树脂中加入2.5当量的Fmoc氨基酸DMF溶液和2.5当量的N,N-二异丙基乙胺，振荡并搅拌2小时以上以导入C末端氨基酸。当合成C末端为碳酰胺肽链时，为了去除与树脂结合的Fmoc基，添加20％哌啶DMF溶液，振荡并搅拌10分钟以上，然后使用DMF清洗树脂3～5次后，将2.5当量的Fmoc氨基酸DMF溶液及2.5当量的1-羟基苯并三唑DMF溶液和2.5当量的DIC加入到树脂中，并且通过振荡并搅拌40分钟以上来导入C末端氨基酸。
将C末端氨基酸导入到树脂中后，通过用DMF洗涤树脂3～5次来除去过量的试剂，然后通过加入20％的哌啶在室温下振荡和搅拌10分钟以上以除去作为末端氨基保护基的Fmoc基团。通过用DMF洗涤树脂3～5次来除去哌啶，并且使其与位于目标肽的氨基酸序列相邻位置的氨基酸的Fmoc保护衍生物的羧基进行缩合。在该保护氨基酸的缩合中，通过将2.5当量的Fmoc-氨基酸的DMF溶液、2.5当量的1-羟基苯并三唑的DMF溶液和2.5当量的DIC添加至树脂中进行缩合。重复相同的Fmoc基团去除和与Fmoc氨基酸的缩合反应，合成具有目标肽的氨基酸序列的保护肽树脂。
合成N末端为游离氨基的肽时，使N末端的Fmoc氨基酸缩合，然后以20％的哌啶DMF溶液在室温下振摇和搅拌10分钟以上以除去Fmoc基，然后用DMF洗涤树脂3～5次来除去哌啶，以完成保护肽树脂的合成。当合成N末端被Ac基保护的肽序列时，在使N末端成为1个如上述相同的游离氨基之后，通过加入5当量的乙酸和4.95当量的N-羟基琥珀酸的DMF溶液和5当量的DIC来进行缩合，完成在N-末端导入Ac基并具有目标肽氨基酸序列的保护肽树脂。当N末端的氨基酸残基是(S)-或(R)-焦谷氨酸时，作为N末端的Fmoc氨基酸，使用5等量的(S)-或(R)-Fmoc-焦谷氨酸氯化物和10等量的吡啶，振荡并搅拌40分钟以上进行缩合，然后，通过在室温下以20％哌啶DMF溶液振荡并搅拌10分钟以上，除去Fmoc基团，然后用DMF洗涤树脂3～5次除去哌啶，完成保护肽树脂的合成。
(2)粗肽产物的合成
在合成粗肽产物中，通过用酸处理上述合成的具有目标肽的氨基酸序列的保护肽树脂，进行脱保护和从树脂上的切下。如果目标肽是如半胱氨酸及蛋氨酸这样的包含具有硫原子的氨基酸的肽链时，使用TFA/水/乙二硫醇/TIS(94/2.5/2.5/1)在冰浴～室温下，进行30分钟以上的振荡搅拌进行脱保护和从树脂上的切下。如果目标肽不包含半胱氨酸及蛋氨酸这样的具有硫原子的氨基酸，使用TFA/水/TIS(95/2.5/2.5)并在冰浴～室温下振荡并搅拌30分钟以上，进行脱保护和从树脂上的切下。反应完成后，过滤树脂，用脱保护溶液洗涤树脂3～5次，将洗涤液和滤液混合，并用蒸发器进行浓缩。将MTBE添加到残留物中，并且通过过滤或离心进行固液分离，并且进行多次MTBE洗涤以获得粗肽产物。
(8)H-YERAKSNM-OH的制造方法(方法A)
(1)将187.5mg(0.30mmol)的(2-氯)三苯甲基氯树脂(渡边化学株式会社制造，约1.6mmol/g)加入至连接到肽合成仪“KMS-3”所带有的PP制柱中，并添加5mL的DMF，然后对其振荡搅拌过夜。通过抽滤去除DMF后，加入2mL(0.75mmol；2.5当量)的Fmoc-Met-OH的DMF溶液(375mM)、128μL(0.75mmol；2.5当量)的N,N-二异丙基乙胺及1mL的DMF，振荡搅拌6小时，通过抽滤除去反应溶液后，将其用3mL的DMF洗涤5次。加入3mL的20％哌啶DMF溶液，振荡并搅拌35分钟。进行抽滤，并用3mL的DMF洗涤5次。
(2)加入2mL(0.75mmol；2.5当量)的Fmoc-Asn(Trt)-OH的DMF溶液(375mM)、1mL(0.75mmol；2.5当量)的1-羟基苯并三唑的DMF溶液(750mM)及116μL(0.75mmol)(2.5当量)的DIC，并搅拌过夜。通过抽滤除去反应溶液后，将其用3mL的DMF洗涤5次。加入3mL的20％哌啶DMF溶液，振荡并搅拌35分钟。进行抽滤，并用3mL的DMF洗涤5次。
(3)参考上面的工序(2)，并按依次结合下一个氨基酸。后续氨基酸的顺序和反应时间，Fmoc-Ser(tBu)-OH为20小时，Fmoc-Lys(Boc)-OH为45分钟，Fmoc-Ala-OH为3小时，Fmoc-Arg(Pbf)-OH为16小时，Fmoc-Glu(tBu)-OH为2.5小时，Fmoc-Tyr(tBu)-OH为15小时。
(4)在冰浴条件下，向合成的保护肽树脂中加入3mL脱保护溶液(TFA/水/乙二硫醇/TIS＝94/2.5/2.5/1)，移开冰浴，在室温下振荡搅动3小时。过滤树脂，将树脂用脱保护溶液洗涤3次，将洗涤液和滤液混合，并用蒸发器浓缩。将5mL的MTBE添加至浓缩的残留物中，并在冰浴却条件下搅拌过夜。全部转移到离心沉降管中，然后以3000rpm离心1分钟，除去上清液。加入2mL的MTBE，振荡搅拌3分钟后，以3000rpm离心1分钟，去除上清液，进行3次上述操作。对沉淀物进行减压干燥，得到179.5mg的目标序列(H-YERAKSNM-OH)的粗肽产物。通过HPLC和ESI-TOF/MS仪器的质量分析确认得到的粗肽产物。
ESI-MS：理论M:[M+H]+＝998.47，实验M:(m/z):[M+H]+＝998.4739
HPLC条件(条件A)
色谱柱：YMC-triartC18 3μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.7mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm(仅在分析[表14-2]中的目标肽(8)和相似肽(22)时)或274nm
梯度：2％B(0分钟)→2％B(0.2分钟)→6.4％B(0.5分钟)→6.4％B(11分钟)→95％B(15.5分钟)→95％B(20.5分钟)→2％B(20.6分钟)→2％B(29分钟)
保留时间＝约13.3分钟
(12)Ac-ALRAL-NH2的制造方法(方法B)
(1)将348.8mg(0.15mmol)的Fmoc-NH-SAL树脂(渡边化学株式会社制造，约0.43mmol/g)放入肽合成仪“KMS-3”所带有的PP制柱中，加入5mL的DMF后，振荡并搅拌1分钟，静置过夜。通过抽滤除去DMF后，加入3mL的20％哌啶DMF溶液，振荡并搅拌35分钟。进行抽滤，用3mL的DMF洗涤5次。
(2)加入2mL(0.375mmol；2.5当量)的Fmoc-Leu-OH的DMF溶液(187.5mM)、1mL(0.375mmol；2.5当量)的1-羟基苯并三唑DMF溶液(375mM)及58μL(0.375mmol；2.5当量)的DIC，振荡并搅拌3小时。通过抽滤除去反应溶液后，用3mL的DMF洗涤5次。加入3mL的20％哌啶DMF溶液，振荡并搅拌35分钟。进行抽滤，并用3mL的DMF洗涤5次。
(3)参考上面的工序(2)，并依次结合下个氨基酸。后续的氨基酸的顺序和反应时间是，Fmoc-Ala-OH为2.5小时，Fmoc-Arg(Pbf)-OH为15.5小时，Fmoc-Leu-OH为2.5小时和Fmoc-Ala-OH为2.5小时。合成N末端为游离的氨基的保护肽树脂，然后加入3mL(0.744mmol；4.96当量)的N-羟基琥珀酸的DMF溶液(248mM)、43μL(0.75mmol；5当量)乙酸和116μL(0.75mmol；5当量)DIC，振荡并搅拌16小时。通过抽滤除去反应溶液后，用3mL的DMF洗涤5次，然后用3mL的MTBE洗涤3次。
(4)在冰浴条件下将3mL的脱保护溶液(TFA/水/TIS＝95/2.5/2.5)加入到合成的保护肽树脂中，移除冰浴，在室温下振荡并搅拌4小时。过滤树脂，将树脂用脱保护溶液洗涤3次，将洗涤液和滤液混合，并用蒸发器进行浓缩。将5mL的MTBE添加至浓缩的残留物中，在冰浴条件下搅拌过夜。将混合物全部转移到离心沉降管中，然后以3000rpm离心1分钟，然后除去上清液。加入2mL的MTBE，振荡并搅拌3分钟后，以3000rpm离心1分钟，去除上清液，重复3次上述操作。对沉淀物进行减压干燥，获得90.6mg的目标序列(Ac-ALRAL-NH2)的粗肽产物。通过HPLC和ESI-TOF/MS仪器的质量分析确认得到的粗肽产物。
ESI-MS：理论M:[M+H]+＝584.39，实验M:(m/z):[M+H]+＝584.3879
HPLC条件(条件B)
色谱柱：YMC-PackProC18 3μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：5％B(0分钟)→5％B(5分钟)→95％B(17分钟)→5％B(17.1分钟)→5％B(20.1分钟)→5％B(24分钟)
保留时间＝约10.6分钟
(1)Ac-YFYPEL-NH2的制造方法
如方法B中所述，对233mg(0.1mmol)的Fmoc-NH-SAL树脂依次进行与Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合之后，通过对N末端为游离的氨基进行Ac保护来合成保护肽树脂。使用脱保护溶液(TFA/水/TIS＝95/2.5/2.5)进行从树脂上的切下，并通过相同操作获得90.6mg目标序列(Ac-YFYPEL-NH2)的粗肽产物。通过HPLC和ESI-TOF/MS仪器的质量分析确认得到的粗肽产物。
ESI-MS：理论M:[M+H]+＝872.42，实验M:(m/z):[M+H]+＝872.4203
HPLC条件(条件C)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：20％B(0分钟)→20％B(12分钟)→95％B(15分钟)→95％B(19分钟)→20％B(20分钟)→20％B(28分钟)
保留时间＝约10.2分钟
使用上述方法A或B，通过固相法合成下表中的目标肽。
HPLC的分析条件除了如上所述的HPLC条件(条件A～C)以外，还使用以下所示的分析条件进行分析。
HPLC条件(条件D)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：275nm
梯度：15％B(0分钟)→25％B(1分钟)→25％B(12分钟)→95％B(14.5分钟)→95％B(17分钟)→15％B(17.5分钟)→15％B(28分钟)
HPLC条件(条件E)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.7mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：20％B(0分钟)→35％B(17分钟)→95％B(18分钟)→95％B(20分钟)→20％B(20.5分钟)→20％B(28分钟)
HPLC条件(条件F)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：279nm
梯度：36％B(0分钟)→36％B(12.5分钟)→95％B(13分钟)→95％B(14.5分钟)→36％B(15分钟)→36％B(27分钟)
HPLC条件(条件G)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：281nm
梯度：22％B(0分钟)→25％B(2分钟)→25％B(14分钟)→95％B(17分钟)→95％B(18.5分钟)→22％B(19分钟)→22％B(30分钟)
HPLC条件(条件H)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.65mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：2％B(0分钟)→2％B(3分钟)→5％B(12分钟)→5％B(14分钟)→8％B(16分钟)→95％B(19分钟)→95％B(19.9分钟)→2％B(20分钟)→2％B(28分钟)
HPLC条件(条件I)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：23％B(0分钟)→25％B(2分钟)→25％B(10分钟)→35％B(15分钟)→95％B(17分钟)→95％B(19分钟)→23％B(20分钟)→23％B(28分钟)
HPLC条件(条件J)
色谱柱：Waters Atlantis T3 3μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：1.0mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：20％B(0分钟)→20％B(12分钟)→95％B(17分钟)→95％B(19分钟)→20％B(19.1分钟)→20％B(28分钟)
HPLC条件(条件K)
色谱柱：Waters Xbridge Phenyl 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：1.0mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：5％B(0分钟)→5％B(3分钟)→95％B(20分钟)→5％B(20.1分钟)→5％B(26分钟)
HPLC条件(条件L)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：28％B(0分钟)→38％B(12分钟)→95％B(15分钟)→95％B(19分钟)→28％B(20分钟)→28％B(28分钟)
HPLC条件(条件M)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.65mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：4％B(0分钟)→4％B(3分钟)→7％B(8分钟)→95％B(15分钟)→95％B(15.9分钟)→4％B(16分钟)→4％B(28分钟)
HPLC条件(条件N)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：1.0mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
渐变：0％B(0分钟)→3％B(8分钟)→95％B(25分钟)→95％B(28分钟)→0％B(28.5分钟)→0％B(35分钟)
HPLC条件(条件O)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：25％B(0分钟)→25％B(14分钟)→95％B(17分钟)→95％B(21分钟)→0％B(22分钟)→0％B(32分钟)
HPLC条件(条件P)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：20％B(0分钟)→25％B(12分钟)→25％B(14分钟)→95％B(17分钟)→95％B(18.5分钟)→20％B(19分钟)→20％B(28分钟)
HPLC条件(条件Q)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：3％B(0分钟)→5％B(5分钟)→5％B(16分钟)→95％B(17分钟)→95％B(19分钟)→3％B(19.1分钟)→3％B(28分钟)
HPLC条件(条件R)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.6mL/min，温度：30℃
检测波长：275nm
梯度：11％B(0分钟)→11％B(10分钟)→20％B(12分钟)→95％B(15分钟)→95％B(17.5分钟)→11％B(18分钟)→11％B(28分钟)
HPLC条件(条件S)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.6mL/min，温度：30℃
检测波长：281nm
梯度：29％B(0分钟)→29％B(10分钟)→40％B(12分钟)→95％B(15分钟)→95％B(17.5分钟)→29％B(18分钟)→29％B(28分钟)
HPLC条件(条件T)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.7mL/min，温度：30℃
检测波长：276nm
梯度：10.5％B(0分钟)→10.5％B(10分钟)→95％B(14分钟)→95％B(17分钟)→10.5％B(17.1分钟)→10.5％B(28分钟)
HPLC条件(条件U)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.65mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：15％B(0分钟)→15％B(10分钟)→30％B(12分钟)→95％B(15分钟)→95％B(17.5分钟)→15％B(17.6分钟)→15％B(29分钟)
HPLC条件(条件V)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：1mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：17％B(0分钟)→17％B(12分钟)→95％B(17分钟)→95％B(19分钟)→17％B(19.1分钟)→17％B(26分钟)
HPLC条件(条件W)
色谱柱：YMC Triart C18 3μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：5％B(0分钟)→95％B(17分钟)→5％B(17.1分钟)→5％B(23.5分钟)
HPLC条件(条件X)
色谱柱：YMC-PackproC18RS 3μm，50×3mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.5mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：5％B(0分钟)→95％B(12分钟)→95％B(18分钟)→5％B(18.5分钟)→5％B(25分钟)
HPLC条件(条件Y)
色谱柱：YMC Triart C18 3μm，50×3.0mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.65mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：2％B(0分钟)→2％B(6分钟)→5％B(8分钟)→8％B(16分钟)→95％B(19分钟)→95％B(22分钟)→2％B(22.1分钟)→2％B(28分钟)
HPLC条件(条件Z)
色谱柱：Waters Xbridge C18 3.5μm，150×4.6mm
洗脱液：A＝0.1％TFA水溶液；B＝0.1％TFA乙腈
流速：0.7mL/min，温度：30℃
检测波长：205nm
梯度：10％B(0分钟)→10％B(0.2分钟)→34％B(0.5分钟)→34％B(14分钟)→95％B(16分钟)→95％B(19分钟)→10％B(19.1分钟)→10％B(29分钟)
[表2-1]
[表2-2]
[表2-3]
同样地，使用上述方法，通过固相法合成下表中的相似肽。
[表3-1]
[表3-2]
[表3-3]
[表3-4]
1-2：酸性化合物
购买并使用了以下酸化合物。
硫酸：Nacalai tesque株式会社特级
盐酸：Nacalai tesque株式会社0.1N特级
[化学式19]
：东京化成工业株式会社
[化学式20]
：东京化成工业株式会社
[化学式21]
：东京化成工业株式会社
[化学式22]
：东京化成工业株式会社
[化学式23]
：东京化成工业株式会社
[化学式24]
：东京化成工业株式会社
[化学式25]
：东京化成工业株式会社
[化学式26]
：东京化成工业株式会社
[化学式27]
：东京化成工业株式会社
[化学式28]
：东京化成工业株式会社
[化学式29]
：Nacalai tesque株式会社特级
[化学式30]
：和光纯药株式会社特级
[化学式31]
：东京化成工业株式会社
[化学式32]
：Nacalai tesque株式会社一级
[化学式33]
：东京化成工业株式会社
[化学式34]
：东京化成工业株式会社
[化学式35]
：东京化成工业株式会社
以下所示的磺酸除另有说明外，各自均通过将相应的卤化物与亚硫酸钠反应，再用盐酸酸化获得的磺酸钠盐来合成而使用。
作为具体例，对甲基苄基磺酸的合成描述如下。
[化学式36]
将1.55g(7mmol)的对甲基苄基溴溶解在4mL的乙醇中，加入0.97g(7.7mmol；1.1当量)的亚硫酸钠和8mL的水，进行加热并回流过夜。反应结束后，用蒸发器件浓缩除去乙醇，然后对析出的固体进行过滤，从而获得1.09g对甲基苄基磺酸钠。向625mg的得到的固体中加入1mL浓盐酸和1.5mL水，搅拌过夜。过滤反应溶液，用0.5mL水洗涤两次，得到448mg的对甲基苄基磺酸。1H NMR(400MHz，D2O)7.25(d，J＝8.0Hz，2H)，7.19(d，J＝7.9Hz，2H)，4.07(s，2H)，2.28(s，3H)
将1.18g(6mmol)的9-芴基甲醇放入1.50mL的三颈烧瓶中，并使其溶解在9mL的乙酸乙酯中，然后在冰浴中冷却至0℃。加入488μL(6.3mmol；1.05eq)甲磺酰氯后，在0～10℃的内部温度下滴加920μL(6.6mmol；1.05eq)三乙胺。在0℃下搅拌26小时后，加入10mL水和10mL的MTBE以终止反应。进行分液，并将有机层依次用15mL的饱和碳酸氢钠水溶液、15mL的0.5M硫酸氢钠水溶液、15mL的水洗涤。对洗涤后的有机层进行浓缩，得到1.28g的9-芴基甲氧基甲烷磺酸酯的粗体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：7.78(d,J＝7.8Hz,2H)，7.62(d,J＝7.8Hz,2H)，7.43(m,4H)，4.50(d,J＝7.6Hz,2H)，4.31(t,J＝7.6Hz,1H)，2.91(s,3H)。
2.向1.28g上述合成的9-芴基甲氧基甲磺酸酯的粗体中加入3mL乙醇，使其溶解，然后加入7mL水和1.01g(8mmol)亚硫酸钠。加热并在80℃的内部温度下搅拌90小时。反应结束后，用蒸发器进行浓缩除去乙醇，并将析出的固体过滤。将1mL的浓盐酸加入到滤液中，并用蒸发器进行浓缩至成为干燥固体。向残留物中添加2mL水，悬浮1小时，过滤，用0.5mL水洗净2次，获得310mg的9-芴基甲基磺酸(1H NMR(400MHz)(CD3OD)7.91(d,J＝7.6Hz,2H)，7.78(d,J＝7.6Hz,2H)，7.34(m,4H)，4.44(t,J＝6.0Hz,1H)，3.28(m,2H))。
对于
与上述的
的合成同样，以805mg(6mmol)的2-茚满醇作为原料，合成1.26g的2-茚满基氧基甲烷磺酸盐(1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.22(m，4H)，5.53(m，1H)，3.37(m，1H)，3.21(m，2H)，3.02(s，3H))，使用1.26g获得的2-茚满基氧基甲磺酸盐得到2-茚满基磺酸131mg(1H NMR(400MHz)(CD3OD)7.19(m，2H)，7.12(m，2H)，3.80(m，1H)，3.34(m，3H))。
根据上述合成对甲基苄基磺酸的方法，使用相应的卤化物合成下表中所示的磺酸。
[表4-1]
[表4-2]
[表4-3]
[表4-4]
[表4-5]
[表4-6]
[表4-7]
[表4-8]
苄基磺酸的合成
[化学式37]
向1.71g(10mmol)的苄基溴中，加入10mL的乙醇和0.76g(10mmol)的硫脲，加热回流过夜。通过TLC确认原料消失后，将其浓缩并通过蒸发器进行浓缩干燥至固体。将10mL乙腈添加至残留物中使其溶解，并在冰浴中冷却。在冰浴下加入2mL(4mmol)的2N盐酸和5.34g(40mmol)的N-氯代丁二酰亚胺，并在室温下搅拌1小时。用蒸发器浓缩反应溶液，将5mL乙酸乙酯加入到残留物中并进行分液，然后用蒸发器浓缩有机层。将5mL的MTBE和庚烷5mL添加至残留物中，滤出析出的固体，然后用蒸发器浓缩滤液。将残留物通过硅胶柱色谱法(硅胶：Fuji Silicia株式会社，PSQ-100B，50g；洗脱液：己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到0.64g苄基磺酰氯。向0.59g获得的苄基磺酰氯中加入5.9mL水，加热并回流5天。对反应溶液进行浓缩干燥至固体，并用真空泵干燥，获得0.39g的苄基磺酸。1H NMR(400MHz，CD3OD)7.42(m，2H)，7.28(m，3H)，4.05(s，2H)
对羧基苄基磺酸的合成
[化学式38]
向上述合成的0.50g的对甲氧基羰基苄基磺酸中，添加0.6mL浓盐酸和0.6mL水，并加热至90℃。在90℃下加热并搅拌过夜后，冷却至室温，并对析出的固体进行减压过滤，获得0.37g的对羧基苄基磺酸。1H NMR(400MHz，CD3OD)7.97(d，J＝8.3Hz，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，2H)，4.12(s，2H)
缩写说明
TFA：三氟乙酸
IPA：异丙醇
DMSO：二甲基亚砜
DIC：二异丙基碳二亚胺
TIS：三异丙基硅烷
MTBE：甲基叔丁基醚
试验例1：目标肽的纯化-1(相似肽的去除)
将1-1中获得的粗目标肽和粗相似肽分别溶解在含1％TFA的水/乙腈＝100～70/0～30中，得到20mM(假定每种肽的纯度为100％)的粗目标肽溶液或粗相似肽溶液。将难以溶解的肽稀释至约5mM(假设每种肽的纯度为100％)使其溶解。
将各种酸化合物溶于水，或难溶于水时，将其溶于10％IPA水溶液或10％DMSO水溶液中以制备50mM酸化合物溶液。
将粗目标肽溶液(1μmol(假设目标肽的纯度为100％))和粗相似肽溶液(0.1μmol(假设相似肽的纯度为100％))混合。
将酸性化合物溶液(1.5μmol)与该混合物混合(HPLC分析(处理前))，并通过冻干进行干燥。
将100μLIPA添加到残留物中，并在室温下振荡过夜。
将得到的浆液离心分离(5000至15000rpm，1～5分钟)，并且将滤饼用150μL的IPA洗涤两次。将滤液和洗涤液合并。
分别用HPLC分析所获得的固体和清洗液(处理后的固体/处理后的清洗液)。
HPLC测定装置与上述相同。
测量条件：根据在肽合成时的各HPLC条件(HPLC条件A～Z)。
就含有芳香族氨基酸残基的肽而言，长波长侧的紫外线吸收可以专门归因于芳香族侧链。分析相应的肽时的HPLC检测波长为条件A(在274nm下进行检测)、条件D、条件F～G和条件R～T。在条件A(在274nm下进行检测时)，条件R和条件T下，目标肽和相似肽均具有1个芳香族氨基酸残基，在条件F下具有五个，在条件G和S下具有四个。在条件D下，目标肽具有3个芳香族氨基酸残基，而相似肽具有2个相似肽。即，对274～281nm下的长波紫外线吸收有贡献的芳香族侧链的数目，目标肽和相似肽相同或有相差1个，HPLC面积比值可以视为近似摩尔比。
另一方面，不含有芳香族氨基酸残基的肽在长波长侧不具有紫外线吸收，可以使用通过羰基产生的短波长紫外线吸收(205nm)进行检测。例如，在条件A(在205nm下进行检测)和条件J下，目标肽具有10个羰基，而相似肽具有9个羰基。同样，在条件B和条件K下，目标肽为6个，相似肽为5个，在条件C下是8个和7个，条件E下是16个和15个，条件H下是9个和6个或8个，条件I下是31个和30个，在条件L下是32个和31个，在条件M下是9个和8个。即，对205nm下的短波紫外线吸收有贡献的羰基数目，目标肽与相似肽之间有相差1个～3个，HPLC面积比值可被视为近似摩尔比。另外，虽然目标肽(9)和(10)具有芳香族侧链，但是它们具有充分长的链长且羰基较多，因此，虽然在条件I下，通过紫外吸收(205nm)检测了羰基，但是在长波长侧也可以进行检测(目标肽和相似肽均具有6个芳香族氨基酸残基)。同样，目标肽(16)和相似肽(25)各具有两个芳香族侧链，但是在205nm下检测出。
同样的，对于条件N、条件O、条件P、条件Q、条件U、条件V、条件W、条件X、条件Y和条件Z，使用了通过羰基产生的短波长紫外线吸收(205nm)进行了检测。
如下式1)所示，使用HPLC测定值(面积)计算目标肽的面积与目标肽和相似肽的总面积的比例(％)，并计算目标肽的物质量(mol)相对于目标肽和相似肽的物质量(mol)的总量的近似比率(％)(目标肽比率)。
等式1)
目标肽比率(％)(％)＝目标肽面积/(目标肽面积+相似肽面积)x 100
≈目标肽(mol)/(目标肽(mol)+相似肽(mol))×100
评价1：形成盐的验证
当肽和酸化合物混合时，有时酸化合物与N端氨基或碱性氨基酸(赖氨酸K、精氨酸R、组氨酸H等)的侧链部分形成盐。
使用不含碱性氨基酸的目标肽：H-YFYPEL-NH2及作为1个残基缺失体的相似肽：H-YYPEL-NH2，以及其N端受乙酰基(Ac)保护的目标肽Ac-YFYPEL-NH2及作为其1个残基缺失体的相似肽Ac-YYPEL-NH2，并通过检测固体中目标肽比例(％)的变化来对肽与酸化合物之间是否形成盐进行了验证。
此外，也使用不包含碱性氨基酸的、没有能够形成盐的基团的目标肽：Pyr-GPWLEEEEEAYGWMDF-NH2及作为其1个残疾缺失体的相似肽：Pyr-GPWLEEEEEYGWMDF-NH2，对固体中目标肽比率(％)的变化进行了调查。
目标肽比率(％)的变化使用以下等式2)以作为“目标肽比率(％)(％)的增加百分点”计算得出。
等式2)：
目标肽比率(％)的增加百分点＝处理后固体的目标肽比率(％)-处理前固体的目标肽比率(％)
结果如下表所示。
[表5-1]
[表5-2]
关于表5-1
在N末端被Ac基保护的目标肽Ac-YFYPEL-NH2及其相似肽Ac-YYPEL-NH2中，目标肽比率(％)的增加百分点在不使用酸化合物的情况下为1.4百分点。使用硫酸时为2.0百分点，使用磺酸化合物时2.1百分点，是否使用酸性化合物对目标肽比率(％)的增加百分点没有显著差异。
对此，使用作为N端游离的目标肽：H-YFYPEL-NH2及其相似肽：H-YYPEL-NH2时，不使用酸化合物时为-0.3百分点，而使用硫酸时为0.2百分点，使用该磺酸化合物为3.1百分点，与不使用酸化合物和使用硫酸时相比，使用该磺酸化合物时的增加百分点更高。
当目标肽和相似肽的结构相似时，在溶剂中的溶解特性通常相似。然后，当肽与磺酸化合物形成盐而成为固体时，所得到的固体在溶剂中的溶解特性与原本的肽相比有显著变化，因此，通过固液分离，比相似肽含量更高的目标肽比例增加的可能性会显著提升。因此，这些结果教导了该磺酸化合物与肽的N末端的氨基形成盐。
另外，无论有无酸化合物，在N末端被Ac基保护的目标肽Ac-YFYPEL-NH2及其相似肽Ac-YYPEL-NH2中，认为目标肽比率(％)的增加，是由于肽在IPA中的溶解行为的差异。
关于表5-2
对于无法形成盐的目标肽：Pyr-GPWLEEEEEAYGWMDF-NH2及其相似肽：Pyr-GPWLEEEEEYGWMDF-NH2，无论有无酸性化合物的存在，目标肽比率的增加百分点(％)没有差异。
评价2：磺酸化合物的效果
使用下表中的酸化合物，使用目标肽和相似肽，通过与上述相同的方法计算得到了固体中目标肽比率(％)的增加百分点。
结果如下表所示。
[表6]
与不使用酸化合物的情况相比，通过使用磺酸化合物，增加目标肽比率(％)的增加百分点，且磺酸化合物在目标肽与相思肽的分离方面显示优异的效果。认为这是因为，如评价1教导的那样由于与磺酸化合物形成盐，溶解行为发生变化。
评价3：与无机酸的比较
使用下表的酸化合物、目标肽及相似肽，通过与上述相同的方法，计算得到的固体中的目标肽比率(％)的增加百分点
使用下表中的酸化合物，使用目标肽和相似肽，通过与上述相同的方法计算得到了固体中目标肽比率(％)的增加百分点。
结果如下表所示。
[表7]
使用磺酸化合物时的目标肽比率(％)的增加百分点大于使用盐酸和硫酸时的目标肽比率的增加百分点，磺酸化合物在纯化目标肽方面显示优异的效果。
评价4：与羧酸化合物的比较
使用下表中的磺酸化合物或羧酸化合物以及目标肽和相似肽，通过与上述相同的方法计算得到了固体中目标肽比率(％)的增加百分点。
结果如下表所示。
[表8]
[表9]
使用磺酸化合物时的目标肽比率(％)的增加百分点高于使用羧酸化合物时的目标肽比率(％)的增加百分点，磺酸化合物在纯化目标肽中显示优异的效果。
评价5：各种磺酸化合物的效果(1)
使用下表中的磺酸化合物、目标肽和相似肽，由于分析上的问题，存在无法计算出固体中目标肽比率的试料，因此使用下述等式3)将滤洗液中目标肽比率的变化(％)作为“目标肽比率(％)的降低百分点(％)”算出。由于处理前后目标肽和相似肽的各自的浓度未知，并且目标肽和相似肽的HPLC敏感性不同，无法从滤洗液中的目标肽比率(％)降低百分点换算成固体中目标肽比率(％)的增加百分点，但是滤洗液中目标肽比率的降低意味着固体中目标肽比率的增加。
等式3)：
目标肽比率(％)的降低白分率＝处理后滤洗液中的目标肽比率(％)-处理前的目标肽比率(％)
结果如下表所示。
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
[表14-1]
[表14-2]
[表15-1]
[表15-2]
[表16-1]
[表16-2]
[表16-3]
[表16-4]
[表17]
评价6：各种磺酸化合物的效果(2)
使用下表中的酸化合物、目标肽及相似肽，通过与上述相同的方法计算得到了固体中目标肽比率(％)的增加百分点。
结果如下表所示。
[表18]
[表19]
[表20]
[表21]
[表22]
h＝D-His
[表23]
c＝D-Cys
[表24]
[表25]
[表26]
[表27]
MeK＝α-甲基赖氨酸(α-Methyllysine)
[表28]
MeK＝α-甲基赖氨酸(α-Methyllysine)
[表29]
(Me)F＝N-甲基苯丙氨酸(N-Methylphenylalanine),
MeK＝α-甲基赖氨酸(α-Methyllysine)
[表30]
[表31]
MeK＝α-甲基赖氨酸(α-Methyllysine)
[表32]
MeK＝α-甲基赖氨酸(α-Methyllysine)
[表33]
[表34]
(Me)G＝N-甲基甘氨酸(N-Methylglycine)
如表5～表34所示，所获得的固体中的目标肽比率增加(或所获得的滤洗液中的目标肽比率降低)，磺酸化合物在各种目标肽的纯化中显示了优异的效果。
试验例2：溶剂的探讨1
将在1-1中获得的粗目标肽((8)H-YERAKSNM-OH)和粗相似肽((13)H-YERKSNM-OH)分别溶于水/乙腈＝1/2，制成10mM(假定各肽的纯度为100％)，以制备粗目标肽溶液和粗相似肽溶液。
将酸化合物溶解在水中以制备30mM酸化合物溶液。
将粗目标肽溶液(1μmol(假设目标肽的纯度为100％))和粗相似肽溶液(0.1μmol(假设相似肽的纯度为100％))混合。
将酸化合物溶液(0.9μmol)与混合液混合(HPLC分析(处理前))，并通过冻干进行干燥。酸性化合物使用了
[化学式39]
将100μL下表的溶剂添加到残留物中，并将混合物在室温下振摇过夜。
将得到的浆液离心分离(14000rpm，1分钟)，并将滤饼用100μL的溶剂洗涤两次。将滤液和洗涤液合并。
分别对获得的固体和清洗液(处理后的固体/处理后的滤洗液)进行HPLC分析。
通过与上述相同的方法，计算出了得到的滤洗液中的目标肽比率(％)的降低百分点。
另外，从处理前液和处理后固体的HPLC分析结果计算出了目标肽的HPLC面积百分比(其中，要从总面积中减去磺酸化合物的峰)。
[表35]
[表36]
如表35和表36所示，结果显示目标肽的绝对纯度和相对纯度得到提升，并且磺酸化合物使用任何一种溶剂时在纯化目标肽方面均显示出效果。溶剂的组成可以在通常进行的范围内进行讨论而选择适合于去除相似肽的溶剂。
测试示例3：规模扩大
使用与试验例2相同的目标肽，相似肽、磺酸化合物进行以下试验。
将粗目标肽，粗相似肽和磺酸化合物分别溶解在水/乙腈(1/2)中，粗目标肽和粗相似肽为50mM(假定纯度为100％)，对于磺酸化合物，制备了75mM的溶液。将1mL(50μmol)的粗目标肽溶液和0.1mL(5μmol)的粗相似肽混合。
加入1mL(75μmol)的磺酸化合物溶液(HPLC分析(条件A，处理前))，并将混合物冻干。向残留物中加入1mL的IPA将其分散后，将其再次冻干，获得残留物(67.35mg)。
将2mL的IPA添加到上述残留物中，并且在以700rpm振荡3小时之后对固体进行离心分离(14000rpm，1分钟)。分离固体和上清液并冻干，分别获得60.74mg的来自固体的残渣和5.84mg的来自上清液的残渣。分别进行HPLC分析(条件A，处理后)。结果如下表所示。
[表37]
即使扩大规模，也获得与试验例2相同的结果。
试验例4：去除磺酸
使用与试验例3相同的目标肽、相似肽和磺酸化合物进行以下试验。
将粗目标肽，粗相似肽和磺酸化合物分别溶解在水/乙腈(1/2)中，粗目标肽和粗相似肽为50mM(假定纯度为100％)，对于磺酸化合物，制备了75mM的溶液。将1mL(50μmol)的粗目标肽溶液和0.1mL(5μmol)的粗相似肽混合。
加入1mL(75μmol)的磺酸化合物溶液(HPLC分析(条件A，处理前))，并将混合物冻干。在向残留物中加入1mL IPA并将其分散后，将其再次冻干以获得残留物(70.93mg)。
将5mL的IPA添加至上述残留物中，以700rpm振荡3.5小时，然后对固体进行离心分离(14000rpm，1分钟)。分离固体和上清液，并用1mL的IPA洗涤固体。分别对上清液和洗涤液的混合液、以及固体进行冻干，获得59.58mg的来自固体的残留物和5.40mg的来自上清液和洗涤液的残留物。
使用Oasis WAX Cartridge(6cc/150mg)(由Waters公司制造)，依次通过1mL的1N氢氧化钠溶液，7mL的水(纯净水)和2mL的水/MeOH(10/1)，进行了预处理。
将15.74mg上述来自固体的残留物溶于1mL水/MeOH(10/1)中，并进行HPLC分析(条件A，处理后，磺酸在5.1分钟附近洗脱出)。
将上述溶液上样到预处理过的Oasis WAX Cartridge(6cc/150mg)中，用9mL的水/MeOH(10/1)过柱。对过柱的溶液进行HPLC分析，以确认磺酸的去除(条件A，去除磺酸后)。将其冻干，得到9.47mg的残留物。
下表显示了用磺酸化合物处理前的溶液，处理后的固体以及除去磺酸化合物后的该HPLC分析中的目标肽的HPLC面积百分比。
[表38]
试验例5：溶剂2的探讨
将1-1中获得的粗目标肽((8)H-YERAKSNM-OH)和粗相似肽((23)H-YERAKSN-OH)分别溶于水/乙腈＝1/2，制备10mM(每种假定肽的纯度为100％)的粗目标肽溶液或粗相似肽溶液。
将磺酸化合物溶解在水中以制备50mM磺酸化合物溶液。
将粗目标肽溶液(1μmol(假设目标肽的纯度为100％))和粗相似肽溶液(0.1μmol(假设相似肽的纯度为100％))混合。
将磺酸化合物溶液(1.5μmol)与该混合物混合(HPLC分析(处理前))，并通过冻干进行干燥。磺酸化合物使用了
[化学式40]
将100μL下表的溶剂添加到残留物中，在室温下振荡过夜。
将得到的浆液离心分离(14000rpm，1分钟)，并将滤饼用100μL的溶剂洗涤2次。将滤液和滤洗液合并。
对得到的固体和滤洗液分别使用HPLC分析(处理后的固体/处理后的滤洗液)。
通过与上述相同的方法，算出所得到的滤液中的目标肽比率(％)的降低百分点。
另外，从处理前溶液和处理后固体的HPLC分析结果计算出目标肽的HPLC面积百分比(但是对于处理后的固体，磺酸化合物的峰要从总面积中减去)。
结果如下表所示。
如下表所示，目标肽的绝对纯度和相对纯度得到了提升，并且在使用任何一种溶剂的条件下，磺酸化合物均显示了对目标肽的纯化效果。
[表39]
[表40]
试验例6：目标肽的纯化-2
关于下表的目标肽，相似肽和磺酸化合物，通过试验例1中进行的HPLC分析结果，算出处理前溶液和处理后固体的目标肽的HPLC面积百分率(其中，从总面积中减去磺酸化合物的峰)。
[表41]
试验例7：目标肽3的纯化
(1)以上述“1-1：肽的合成(段落编号[0082]～[0128])”中得到的H-AQKLRASD-OH(表1中记载为目标肽(7))为粗相似肽，以H-QKLRASD-OH(在表1中记载为相似肽(19))作为粗目标肽，使用与[表14-1](段落编号[0167])相同的磺酸化合物，通过与试验例1(第[0141]段)相同的方法进行试验。
结果如下表所示。
[表42]
(2)同样，以H-AQKLRASD-OH(在表1中记载为目标肽(7))为粗相似肽，H-AQKLRSD-OH(在表1中记载为相似肽(20))为粗目标肽，使用与[表16-2](段落编号[0172])相同的磺酸化合物，通过与试验例1(段落编号[0141])相同的方式进行了试验。
结果如下表所示。
[表43]
(3)同样地，以H-YERAKSNM-OH(在表1中记载为目标肽(8))为粗相似肽，H-YERAKNM-OH(在表1中记载为相似肽(9))为粗目标肽。使用与[表7](段落编号[0155])的磺酸化合物，通过与试验例1(段落编号[0141])相同的方法进行了试验。
结果如下表所示。
[表44]
(4)同样地，以H-YERAKSNM-OH(在表1中称为目标肽(8))为粗相似肽，H-YERAKSN-OH(在表1中称为相似肽(23))为粗目标肽。使用段落编号[0168]([表14-2])的磺酸化合物，并且以与试验例1(段落[0141])相同的方式进行测试。
结果如下表所示。
[表45]
(5)同样地，H-AQKLRASD-OH(在表1中记载为目标肽(7))为粗相似肽，H-AQKRASD-OH(在表1中记载为相似肽(24))为粗目标肽。使用与[表16-2](段落编号[0172])相同的磺酸化合物，通过与试验例1(段落编号[0141])相同的方法进行了测试。
结果如下表所示。
[表46]
在试验例7中，为了进一步证明本发明的方法是一种通用型非常高的肽纯化方法，交换了试验例1中目标肽和相似肽的摩尔比，即以试验例1中的目标肽作为相似肽，上述试验例的相似肽作为目标肽进行了试验。
具体而言，在试验例1，[表14-1](段落编号[0167])中，示出了以目标肽(7)H-AQKLRASD-OH和相似肽(19)H-QKLRASD-OH的摩尔比为约10:1混合的模型的结果。与之相对，试验例7中，使用了相同的磺酸化合物并交换了两者的摩尔比(理论值)，即以(7)H-AQKLRASD-OH:(19)H-QKLRASD-OH＝以约1:10的比例混合的模型进行了试验。
另外，对于试验例1，[表16-2](段落编号[0172])中记载的目标肽(7)H-AQKLRASD-OH及相似肽(20)H-AQKLRSD-OH；[表7](段落编号[0155])中记载的目标肽(8)H-YERAKSNM-OH和相似肽(9)H-YERAKNM-OH；[表14-2](段落编号[0168])中记载的目标肽(8)H-YERAKSNM-OH和相似肽(23)H-YERAKSN-OH；[表16-2](段落[0172])中的目标肽(7)H-AQKLRASD-OH和相似肽(24)H-AQKLRSD-OH，也同样地使摩尔比(理论值)交换，使用与上述试验例相同的磺酸化合物进行了试验。
从试验例7的结果可知，通过交换混合比例表明，即即使将试验例1的相似肽用作目标肽并且将试验例1的目标肽用作相似肽时，固体中的目标肽相对于相似肽的相对纯度也得到提高(或是在液体中降低)。
试验例8：各种磺酸化合物的效果(去除多种相似肽)
使用多种粗相似肽溶液(分别为0.1μmol(假定相似肽的纯度为100％))，通过与试验例1(段落编号[0141])相同的方法，计算获得的固体中目标肽相对于相似肽的各目标肽比率(％)的增加百分点。
结果如下表所示。
[表47]
[表48]
[表49]
如表47～表49所示，得到的固体中的目标肽比率增加，并且磺酸化合物在各种目标肽的纯化中表现出优异的效果。
[工业实用性]
本申请的方法可用于纯化肽。
SEQUENCE LISTING
<110> 长濑产业株式会社
<120> 利用磺酸化合物纯化肽的方法
<130> 675013
<150> JP 2018-173042
<151> 2018-09-14
<150> JP 2019-008701
<151> 2019-01-22
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
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<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 酰胺化
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Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 2
Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Val Ile Arg Ala Leu Arg Arg Ala Leu Val Ala Leu Arg Ala Leu Arg
1 5 10 15
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 酰胺化
<400> 4
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Ala
1 5 10 15
Leu Ser Arg
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Ala Gln Lys Leu Arg Ala Ser Asp
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Tyr Glu Arg Ala Lys Ser Asn Met
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> 酰胺化
<400> 9
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn
20 25
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化
<400> 10
Gly Gly Gly Arg Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化
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Ala Leu Arg Ala Leu
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 12
Ala Leu Arg Ala Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Ala Leu Arg Ala Leu Arg Ala Leu Arg
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化
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Gly Gly Arg Gly Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 酰胺化
<400> 15
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg Glu Gly
1 5 10 15
Ala Arg Leu Gln Arg Leu Leu Gln Gly Leu Val
20 25
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化
<400> 16
Tyr Tyr Pro Glu Leu
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化
<400> 17
Tyr Tyr Pro Glu Leu
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Val Ile Arg Ala Leu Arg Ala Leu Val Ala Leu Arg Ala Leu Arg
1 5 10 15
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 酰胺化
<400> 19
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Asn Lys Ala Leu
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Ala Gln Lys Leu Arg Ala Asp
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Ala Lys Leu Arg Ala Asp
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Gln Lys Leu Arg Ala Ser Asp
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Ala Gln Lys Leu Arg Ser Asp
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Ala Gln Lys Leu Arg Ala Ser
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Ala Gln Lys Arg Ala Ser Asp
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Ala Gln Lys Leu Ala Ser Asp
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Tyr Glu Arg Ala Lys Asn Met
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Tyr Glu Arg Lys Ser Asn Met
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Tyr Glu Arg Ala Ser Asn Met
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<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Tyr Glu Arg Ala Lys Ser Met
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Glu Arg Ala Lys Ser Asn Met
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Tyr Glu Arg Ala Lys Ser Asn
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Tyr Arg Ala Lys Ser Asn Met
1 5
<210> 36
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 酰胺化
<400> 36
Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Arg Asn
20
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 酰胺化
<400> 37
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 酰胺化
<400> 38
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 39
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Ala Leu Ala Leu Arg Ala Leu Arg
1 5
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 酰胺化
<400> 41
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 42
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 酰胺化
<400> 42
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Arg Leu Glu Gly Ala
1 5 10 15
Arg Leu Gln Arg Leu Leu Gln Gly Leu Val
20 25
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa =Pyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化
<400> 43
Xaa His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化
<400> 44
His Val Thr Thr Val
1 5
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 酰胺化
<400> 45
Val Thr Thr Val
1
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 46
Tyr Glu Arg Ala Lys Ser Asn Met
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 47
Tyr Glu Arg Ala Lys Ser Asn Leu
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 48
Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr
1 5 10
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Arg Ala Val Leu Pro
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=RC8
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=(Me)F
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=SC5
<400> 50
Xaa Arg Arg Arg Xaa Arg Xaa
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 51
His Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 酰胺化
<400> 52
Trp Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp
1 5 10
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=(Me)G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Dap
<400> 53
Thr Xaa Arg Lys Xaa His
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Pyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 酰胺化
<400> 54
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp
1 5 10 15
Phe
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化
<400> 55
Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val
1 5
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
Arg Ala Leu Pro
1
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=RC8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa=SC5
<400> 57
Xaa Arg Arg Arg Arg Xaa
1 5
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 58
His Tyr Tyr Pro Glu Leu
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 59
Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp
1 5 10
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=(Me)G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Dap
<400> 60
Xaa Arg Lys Xaa His
1 5
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Pyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 61
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Gly Trp Met Asp Phe
1 5 10 15
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 62
Tyr His Tyr Pro Glu Leu
1 5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=MeK
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 63
Tyr Xaa Tyr Pro Glu Leu
1 5
Claims (24)
1.一种方法，其是从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽的方法，其中，所述目标肽具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基，
所述方法包括：
(1)在磺酸化合物的存在下将通过所述肽合成而得到的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集所述固体的工序，
所述磺酸化合物是下述式(I)的化合物，
[化学式1]
式中，
A为任选进行了取代的C6-10芳基、任选进行了取代的双环杂环基、C2-3烯基或C2-3炔基；
X是(i)单键，(ii)任选进行了取代的C1-4亚烷基，(iii)-CO-(CH2)n-，其中CO与A键合或(iv)C2-4亚烯基；且
n是1到3的整数。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
A为任选进行了取代的C6-10芳基；
X是(i)单键，(ii)任选进行了取代的C1-4亚烷基，(iii)-CO-(CH2)n-，其中CO与A键合或(iv)C2-3亚烯基；且
n是1到3的整数。
3.如权利要求1所述的方法，其中，
A是任选进行了取代的双环杂环基，
X是(i)单键，(ii)C1-4亚烷基，(iii)-CO-(CH2)n-，其中CO与A键合或(iv)C2-3亚烯基；且
n是1到3的整数。
4.如权利要求1的方法，其中，
A是C2-3烯基；且X是C1-4亚烷基。
5.如权利要求1的方法，其中，
A是C2-3炔基；且X是C1-4亚烷基。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
所述目标肽具有5～31个氨基酸残基。
7.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
通过所述肽合成而得到的肽中含有相似肽。
8.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
在通过所述肽合成而得到的肽中，相似肽与所述目标肽的摩尔比为0.7以下。
9.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
所述肽合成是通过固相法进行的肽合成。
10.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
所述目标肽包含至少1个碱性氨基酸残基，且所述目标肽的N末端任选是游离的。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中，
A是任选由选自C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及C6-10芳基中的相同或不同的1～5个取代基进行了取代的C6-14芳基。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中，
A是选自苯基、萘基、芴基及茚满基中的C6-10芳基，所述C6-10芳基任选由选自C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及C6-10芳基中的相同或不同的1～5个取代基进行了取代。
13.如权利要求1或3所述的方法，其中，
A为选自2,3,4,5-四氢-1H-1-苯并氮杂
基、苯并
唑基、吲哚基、异吲哚基、酞嗪基、苯并二氢吡喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、嘧啶基、苯并噻唑基、喹啉基、异苯并二氢吡喃基及苯并三唑基中的双环杂环基，且所述双环杂环基任选进行了取代。
14.如权利要求1或3所述的方法，其中，
A为任选由选自C6-10芳基、C1-4烷基、-CO-C6-10芳基、-OH、-O-C1-3烷基、-NO2、-CO2H、-CO2-C1-4烷基、卤素、-NH2、-CH2-SO3H、-SO3H、-CN、-CO-C1-4烷基、-CF3及氧代基中的相同或不同的1～5个取代基进行了取代的双环杂环基。
15.如权利要求1或3所述的方法，其中，
A是选自下述化学式中的双环杂环基，所述双环杂环基任选由1个苯基进行了取代，
[化学式2]
及
[化学式3]
16.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
X是(i)单键，(ii)任选由1个甲基、1个苄基或1个苯基进行了取代的C1-4亚烷基，或(iii)-CO-CH2-，其中CO与A键合。
17.如权利要求11所述的方法，其中，
X是(i)单键，(ii)任选由1个甲基、1个苄基或1个苯基进行了取代的C1-4亚烷基，或(iii)-CO-(CH2)-，其中CO与A键合。
18.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
X是单键。
19.如权利要求15所述的方法，其中，
X是单键。
20.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
所述磺酸化合物从下列中选择：
21.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其进一步包括去除所述磺酸化合物的工序。
22.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其用于提高所述目标肽与相似肽的摩尔比。
23.一种制备目标肽的方法，其包括权利要求1～22中任一项所述的方法。
24.一种磺酸化合物在从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽中的用途，其中，
所述目标肽具有游离的N端和/或至少1个碱性氨基酸残基，
所述从通过肽合成获得的肽中纯化目标肽包括：
(1)在磺酸化合物的存在下将通过所述肽合成而得到的肽与溶剂混合以获得固体的工序，
(2)进行固液分离并收集所述固体的工序，
所述磺酸化合物是下述式(I)的化合物，
[化学式1]
式中，
A为任选进行了取代的C6-10芳基、任选进行了取代的双环杂环基、C2-3烯基或C2-3炔基；
X是(i)单键，(ii)任选进行了取代的C1-4亚烷基，(iii)-CO-(CH2)n-，其中CO与A键合或(iv)C2-4亚烯基；且
n是1到3的整数。
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