CN101759776A

CN101759776A - 一种埃替菲巴肽的合成方法

Info

Publication number: CN101759776A
Application number: CN200910247949A
Authority: CN
Inventors: 白俊才; 刘亚东; 张国庆; 贾军
Original assignee: Shanghai Angbo Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Angbo Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2010-06-30

Abstract

本发明提供一种埃替菲巴肽的合成方法，其包括如下步骤：(1)将Fmoc Rinklinker与取代度为0.8-1.2mmol/g的AM树脂缩合；得到Fmoc-多肽树脂；将moc-多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基，得到去保护的多肽树脂；(3)在缩合剂的存在下，使Fmoc保护的氨基酸和去保护的多肽树脂进行缩合；(4)重复步骤(2)-(3)，得到六肽树脂；(5)六肽树脂与Mpa(Trt)-OH缩合，得到七肽树脂；(6)在切割剂的存在下，使七肽树脂上的七肽和树脂分离，得到埃替菲巴肽粗品；(7)埃替菲巴肽粗品进行氧化环化，得到埃替菲巴肽。本发明的方法可以提高埃替菲巴肽收率，降低其成本，提高纯度。

Description

一种埃替菲巴肽的合成方法

技术领域

本发明涉及一种埃替菲巴肽(Eptifibatide)合成方法。

背景技术

埃替菲巴肽(Eptifibatide)是人工合成的环状七肽，含有血小板膜GP II b/III。受体特异识别的Lys-Glu-Asn序列(类似于纤维蛋白原)，抑制血小板膜GP II b/IIIa受体与纤维蛋白原的结合。可用于治疗患有无Q波心肌梗死的患者，也可用于预防PT-CA(血管成形术)术后缺血性并发症的发生。该药有口服和注射两种制剂。静脉用药5min后，血浆浓度达峰值。用药4～6h后，血浆浓度达稳定值。当其静脉推注在90～250ug.kg-1时，血浆浓度峰值与剂量成正相关。埃替巴肽的血浆浓度与其抗血小板聚集作用成正相关，它进入血液循环后，25％药物与血浆蛋白相结合。埃替巴肽主要经肾脏排泄，其tl/2(半衰期)为1～1.5h。严重肾功能不全患者药物清除速度减慢，老年人药物清除速度略有减慢，血液透析可增加药物清除。常见不良反应为出血，较稍微，大多数局限在血管穿刺处或静脉补液处。其他不良反应有低血压，但不严重。

埃替非巴肽具有以下的化学结构：

埃替非巴肽也可以用氨基酸名称表示如下：

埃替菲巴肽的合成方法目前既有固相法，液相法，也有固液相集合的方法。如在1999IBC多肽技术会议上，曾报道将MPa-Har-Gly和Asp-Trp-Pro两个片断耦合反应形成6肽片断，再和三苯甲基保护的Cys残基耦合，去除Cys和Har残基上的S保护基团，变形成了双硫健。

美国专利No.101983报道了液相合成方法，通过耦合Har-Gly和Asp-Trp-Pro，再分别与Cys和MPa反应，经环化后得到eptifibatide。

这些合成方法尽管生产量大，但消耗时间长，步骤复杂，GMP生产的控制项目多，不易稳定，且生产的副产物多，杂质的去除要多次洗涤或其他手段纯化，使得现有工艺的收率为25-30％，导致成本高；而且杂质也仅能控制在0.3-0.5％范围。

综上所述，本领域迫切需要一种可以提高埃替菲巴肽收率，提高纯度，使得成本降低的埃替菲巴肽的合成路线。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以提高埃替菲巴肽收率，提高纯度，使得成本降低的埃替菲巴肽的合成路线。

本发明提供一种埃替菲巴肽的合成方法，其包括如下步骤：

(1)将Fmoc Rink linker与取代度为0.8-1.2mmol/g的AM树脂缩合；得到Fmoc-多肽树脂；

(2)将步骤(1)的Fmoc-多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基，得到去保护的多肽树脂；

(3)在缩合剂的存在下，使Fmoc保护的氨基酸和步骤(2)的去保护的多肽树脂进行缩合；

(4)重复步骤(2)-(3)，得到如式(I)所示的六肽树脂；

Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂 (I)

(5)所述式(I)的六肽树脂与Mpa(Trt)-OH缩合，得到式(II)所示的七肽树脂；

Fmoc-Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂 (II)

(6)在切割剂的存在下，使式(II)七肽树脂上的七肽和树脂分离，得到如式III所示的埃替菲巴肽粗品；

Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂ (III)

(7)所述式(III)的埃替菲巴肽粗品进行氧化环化，得到如式(IV)所示的埃替菲巴肽

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)采用取代度为0.8-1.0mmol/g的AM树脂。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(2)中，所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；

所述的去保护剂中还含有任选的选自下述的一种或多种物质：0-10％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-10％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(2)的去保护剂以其总体积计，含有10±1％哌啶，1±0.2％二环脒；3±1％1-羟基苯并三唑；余量的DMF。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(3)中，所述缩合剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其组合；

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(3)中，所述缩合剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的组合，二者体积比例为(1～3)∶(3～10)。

在本发明的一个具体实施方式中，Fmoc保护的氨基酸与缩合剂的摩尔比例为1∶1～3；或者

所述去保护的多肽树脂和Fmoc保护的氨基酸的摩尔比例为1∶1～6，优选1∶1～4.5。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(5)中，所述缩合步骤包括如下具体步骤：

(i)采用质子活化剂洗涤式(I)所示的六肽树脂；使得所述六肽树脂的高精氨酸(Har)侧链的胍基质子化；

所述质子活化剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)、HOBt/DBU组合或苯磺酸；

(ii)使得所述式(I)的六肽树脂与Mpa(Trt)-OH缩合，得到式(II)所示的七肽树脂；

Fmoc-Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂(II)。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(5)中，所述质子活化剂为0.1-10％的1-羟基苯并三唑(HOBt)、0.1-5％DBU的DMF溶液，以所述质子活化剂总体积计。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(6)中，所述七肽和树脂分离后，采用沉降剂进行沉降，得到如式III所示的埃替菲巴肽粗品；

Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂ (III)；

在一优选例中，所述沉降剂为甲基叔丁醚(MTBE)或乙醚。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过长期摸索对制备工艺进行改进，采用固相合成法埃替菲巴肽的合成工艺路线，并使其杂质大幅降低，收率显著。在此基础上完成了本发明。

本发明中所使用的缩写的含义列于下表：

本文中，“去保护剂”是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂可以是本领域熟知的，例如但不限于，Fmoc，Boc。

本文中，“缩合剂”是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂，可以是本领域熟知的，例如但不限于，碳二亚胺、PyBOP、HATU、TBTU。

本文中，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以是本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。

本发明的构思如下：

本发明的原理是遵循本领域Fmoc法合成多肽的方法。本发明的特点是采用各种技术手段，使得埃替非巴肽合成反应的杂质降低和收率提高。这些技术手段主要包括对AM树脂的选择。同时，还提供了优选的技术手段以获得更好的技术效果(杂质进一步降低和收率提高)，这些优选的技术手段包括采用特定的缩合剂、特定的保护剂。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。

以下对本发明的各个方面进行详述

Fmoc-多肽树脂

本发明的步骤(1)中，将Fmoc Rink linker与取代度为0.8-1.2mmol/g的AM树脂缩合，得到Fmoc-多肽树脂。

所述的“Fmoc Rink linker”原料可以通过市售获得，例如天津南开合成有限公司。

所述的“AM树脂”为取代度0.8-1.2mmol/g。该树脂可以采用本领域市售的Amide树脂或Amide MBHA树脂。

缩合过程中可以加入本领域常见的试剂。

氨基酸的缩合

本发明的氨基酸为七肽结构。所述氨基酸的缩合按如下步骤进行：

步骤(2)中，将Fmoc-多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基，得到去保护的氨基酸树脂；

步骤(3)中，在缩合剂的存在下，使带有Fmoc的氨基酸或多肽和去保护的氨基酸树脂上的氨基酸进行缩合。

步骤(4)中，重复步骤(2)-(3)，得到如式(I)所示的六肽树脂；

Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂 (I)

步骤(5)中，所述式(I)的六肽树脂与Mpa(Trt)-OH缩合，得到式(II)的七肽树脂；

Fmoc-Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂(II)。

具体地，各个氨基酸根据式II所示的七肽树脂自C端向N端逐一缩合，直至在树脂上键合而得到该七肽树脂，如下多步反应式所示：

Fmoc Rink linker+AM树脂

→Fmoc-Cys(氨基保护)-树脂

→Fmoc-Pro-Cys(氨基保护)-树脂

→Fmoc-Asp(氨基保护)-Trp(氨基保护)-Pro-Cys(氨基保护)-树脂

→Fmoc-Gly-Asp(氨基保护)-Trp(氨基保护)-Pro-Cys(氨基保护)-树脂

→Fmoc-Har-Gly-Asp(氨基保护)-Trp(氨基保护)-Pro-Cys(氨基保护)-树脂也即式I化合物)→Fmoc-Mpa(氨基保护)-Har-Gly-Asp(氨基保护)-Trp(氨基保护)-Pro-Cys(氨基保护)-树脂(也即式II化合物)。

所述Cys的支链保护为Trt基团的保护。

所述Trp的支链保护为Boc基团的保护。

所述Asp的羧基保护为OtBu基团的保护。

在一个优选的实施方式中，氨基酸的各个缩合步骤中，所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；优选地，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-10％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-10％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。在一优选例中，步骤(2)的去保护剂采用10±1％哌啶，1±0.2％二环脒；3±1％1-羟基苯并三唑；余量的DMF。

在一个优选的实施方式中，氨基酸的各个缩合步骤中，所述缩合剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其组合。优选地，所述带有Fmoc的氨基酸与缩合剂的摩尔比例为1∶1～3。优选地，所述去保护的氨基酸树脂和Fmoc保护氨基酸与的摩尔比例为1∶1～6，优选1∶1～4.5。

在一优选例中，所述缩合剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的组合物，二者比例为(1～3)∶(3～10)。当缩合剂为组合物时，缩合剂的加入顺序不受限制。

步骤(5)中，还包括如下的优选步骤：(i)采用质子活化剂洗涤式(I)所示的六肽树脂；使得所述六肽树脂的高精氨酸(Har)侧链的胍基质子化；所述质子活化剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯磺酸或其HOBt/DBU组合。所述胍基质子化以后再进行氨基酸缩合步骤。在一优选例中，所述质子活化剂为0.1-10％的1-羟基苯并三唑(HOBt)、0.1-5％DBU的DMF溶液。

切割

本发明的切割剂可以采用本领域常规的切割剂，可以是但不限于，含有TFA的酸性溶液。

具体地，采用如下三氟乙酸∶乙二硫醇∶水∶苯酚∶茴香硫醚(82.5v∶2.5v∶5v∶5v∶5v)进行切割，从而获得更好的切割效果。

更具体地，本发明的切割步骤中还可以采用沉降方法分离粗品。例如，步骤(6)中，所述七肽和树脂分离后，采用沉降剂进行沉降，得到如式III所示的埃替菲巴肽粗品；Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂(III)。

在一优选例中，所述沉降剂为甲基叔丁醚(MTBE)或乙醚。

氧化环化

本发明的氧化环化步骤可以采用本领域的常规技术。二硫键的形成本质是一种氧化反应，氧化剂的选择很重要。常用有先脱保护基再环化的氧化剂：DMSO，K3Fe(CN)6，H₂O₂及空气等；有直接氧化再脱保护的氧化剂：I2，T1(tfa)3，氯硅烷-砜类氧化剂等。

在本发明中，可以采用较为简便的空气或空气/活性炭氧化反应，这种氧化反应操作简便，环化率高。

具体地，可以采用多肽粗品溶解在0.2M醋酸氨水溶液里，敞口室温搅拌或空气鼓泡反应，HPLC每24小时监控检测一次。在72小时内完成氧化环化。

本发明的优点在于：

采用经典固相合成方法获得Eptifibatide的合成工艺，步骤简单，操作方便，成本可得到控制，且纯化后的产品杂质均＜0.1％，符合药物申报未知杂质控制标准，而现有工艺杂质控制在0.3-0.5％范围内。现有工艺的收率为25-30％，而该工艺可控制在50％。

A.固相合成方法：操作简单，成本低，

B.所用原料投料比例：低于一般投料比，成本降低

C.所用脱保护液的成分：对于杂质的控制好

D.所用Mpa(Trt)-OH缩合前洗涤方法：所用Har基为未保护氨基酸，价格低，反应时，用HOBt/DMF溶液洗涤使高精氨酸(Har)侧链的胍基质子化，避免副反应发生。

E.切割步骤中MTBE的使用：生产安全性高，成本低。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

本发明实施例中所用HPLC方法为：

实施例1：

Fmoe Rink amide AM树脂(Fmoc-多肽树脂)的合成

将以下几种物质Fmoc Rink linker/TBTU/HOBt/NMM(摩尔比为2.0∶1.9∶4)与AM树脂(取代度范围0.8-1.0mmol/g)缩合，室温搅拌3小时。

树脂洗涤干燥后使用。

Fmoc脱保护

使用10％哌啶/3％HOBT/1％DBU/DMF溶液脱除Fmoc，连续两次脱保护，时间分别为10min和20min。抽干脱保护溶液，分别用DMF和甲醇洗涤。彻底抽干后Kaiser test检测评估Fmoc脱除。

Fmoc氨基酸缩合步骤：

向反应器里加Fmoc-AA-OH/HOBt(3当量/3当量)，相对于Fmoc-Rink amideAM树脂)/DMF溶液，随后加DIC(3当量相对于Fmoc-Rink amide AM树脂)。在反应三个小时过程中用Kaiser test监控。

Mpa(Trt)-OH缩合

用5％HOBt/0.5％DBU/DMF溶液洗涤Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-Rink amide AM树脂三次，使高精氨酸(Har)侧链的胍基质子化，随后用上述同样的方法缩合Mpa(Trt)-OH。

切割

(a)切割液配置：

试剂K配置，在合适大小的容器中按体积比混合三氟乙酸∶乙二硫醇∶水∶苯酚∶茴香硫醚(82.5v∶2.5v∶5v∶5v∶5v)，用制冷剂或冰水冷却切割液。

(b)切割：

向冷却的切割液中缓慢的加入多肽树脂并维温度在0℃±5。搅拌回温2-3小时。收集滤液包装树脂。

(c)沉降：

浓缩好的滤液(约每1ml滤液10ml MTBE)倒入冷却好的甲基叔丁醚(MTBE)，(-5-15℃)里沉降。冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或离心得虑饼，用MTBE彻底洗涤虑饼三次。

粗品干燥：将粗品多肽转移至干燥器，真空下干燥至少12小时。

液相(S-S)氧化环化

多肽粗品溶解在0.2M醋酸氨水溶液里(PH＝7-8)(浓度1mg/ml)。敞口室温搅拌或空气鼓泡反应，HPLC每24小时监控检测一次。在72小时内完成氧化环化。

合成粗品纯度为80％，合成得率为95％。

纯化

采用制备色谱方法进行纯化，得到纯度为99.0％产品，纯化得率60％。

实施例2：

Fmoc-Rink amide AM树脂的合成

和Ac20/Pyridine/DMF(60v∶50v∶500v)封端得到。彻底抽干反应液，洗涤6次。树脂洗涤干燥后使用。

Fmoc脱保护

使用20％哌啶/1％HOBT/0％DBU/DMF溶液溶液脱除Fmoc，连续两次脱保护，时间分别为10min和20min。抽干脱保护溶液，分别用DMF和甲醇洗涤。彻底抽干后Kaiser test检测评估Fmoc脱除。

Fmoc氨基酸缩合步骤：

向反应器里加Fmoc-AA-OH/HOBt(1当量/1当量)，相对于Fmoc-Rink amideAM树脂)/DMF溶液，随后加DIC(1.5当量相对于Fmoc-Rink amide AM树脂)。在反应三个小时过程中用Kaiser test监控。增长的肽链树脂用甲醇/DMF洗涤树脂后彻底抽干。

Mpa(Trt)-OH缩合

用10％HOBt/1％DBU/DMF溶液洗涤Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-Rink amide AM树脂三次，使高精氨酸(Har)侧链的胍基质子化，随后用上述同样的方法缩合Mpa(Trt)-OH。

切割

切割液配置：

切割：

沉降：

浓缩好的滤液(约每1ml滤液10ml乙醚)倒入冷却好的乙醚，(-5-15℃)里沉降。冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或离心得虑饼，用冷冻的乙醚彻底洗涤虑饼。

液相(S-S)氧化环化

多肽粗品溶解在0.2M醋酸氨水溶液里，加入活性炭和空气鼓泡反应，HPLC监控，在48小时内完成氧化环化。

合成粗品纯度为75％，合成得率为96％。

纯化

采用制备色谱方法进行纯化，得到纯度为99.0％产品，纯化得率55％。得到纯度为99.5％产品，控制最大单一杂质＜0.1％。纯化得率28％。

实施例3：

Fmoc-Rink amide AM树脂的合成

Fmoc脱保护

使用8％哌啶/1％HOOBT/5％DBU/DMF溶液溶液脱除Fmoc，连续两次脱保护，时间分别为10min和20min。抽干脱保护溶液，分别用DMF和甲醇洗涤。彻底抽干后Kaiser test检测评估Fmoc脱除。

Fmoc氨基酸缩合步骤：

向反应器里加Fmoc-AA-OH/HOBt(2当量/2当量)，2当量相对于Fmoc-Rinkamide AM树脂)/DMF溶液，随后加DIC(2当量相对于Fmoc-Rink amide AM树脂)。在反应三个小时过程中用Kaiser test监控。增长的肽链树脂用甲醇/DMF洗涤树脂后彻底抽干。

Mpa(Trt)-OH缩合

用5％苯磺酸/DMF溶液洗涤Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-Rink amide AM树脂三次，使高精氨酸(Har)侧链的胍基质子化，随后用上述同样的方法缩合Mpa(Trt)-OH。

切割

切割液配置：

切割：

向冷却的切割液中缓慢的加入多肽树脂并维温度在0℃±5。搅拌回温2-3小时。过滤或离心去除树脂并用三氟乙酸洗涤树脂两次。收集滤液包装树脂。

沉降：

液相(S-S)氧化环化

多肽粗品溶解在0.2M醋酸氨水溶液里，敞口室温搅拌或空气鼓泡反应，HPLC监控检测，在72小时内完成氧化环化。

合成粗品纯度为82％，合成得率为90％。

纯化

采用制备色谱方法进行纯化，得到纯度为99.0％产品，纯化得率63％。得到纯度为99.5％产品，控制最大单一杂质＜0.1％.纯化得率29％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种埃替菲巴肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)重复步骤(2)-(3)，得到如式(I)所示的六肽树脂；

Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂 (I)

Fmoc-Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂 (II)

Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂ (III)

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)采用取代度为0.8-1.0mmol/g的AM树脂。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的去保护剂以其总体积计，含有10±1％哌啶，1±0.2％二环脒；3±1％1-羟基苯并三唑；余量的DMF。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缩合剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其组合；

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缩合剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的组合，二者体积比例为(1～3)∶(3～10)。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，

Fmoc保护的氨基酸与缩合剂的摩尔比例为1∶1～3；或者

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述缩合步骤包括如下具体步骤：

Fmoc-Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-树脂(II)。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述质子活化剂为0.1-10％的1-羟基苯并三唑(HOBt)、0.1-5％DBU的DMF溶液，以所述质子活化剂总体积计。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述七肽和树脂分离后，采用沉降剂进行沉降，得到如式III所示的埃替菲巴肽粗品；

Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂ (III)；

在一优选例中，所述沉降剂为甲基叔丁醚(MTBE)或乙醚。