CN103172704A

CN103172704A - 一种抗肿瘤小肽FpAT的制备方法

Info

Publication number: CN103172704A
Application number: CN2011104290669A
Authority: CN
Inventors: 王良友; 陆冬冬; 陈逸民
Original assignee: CHINA TECH PEPTIDE Co Ltd
Current assignee: CHINA TECH PEPTIDE Co Ltd
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤小肽FpAT的制备方法，技术方案包括如下步骤：采取Fmoc/tBu固相多肽合成策略，以2-氯三苯甲基氯树脂(CTC Resin)作载体，制备替代度为0.4～0.7mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin；通过固相多肽合成方法，从FpAT的C端到N端的序列依次缩合Fmoc保护氨基酸，直至N末端的天冬氨酸缩合完成后，得到FpAT的全保护肽树脂；用TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚做裂解试剂，无水乙醚沉降，获得FpAT粗肽；将FpAT粗肽加水溶解，调节pH至3～4，使用制备型反相HPLC纯化，收集纯度合格的目的产物，冻干得到成品。此工艺操作简便，生产效率较高，对设备要求低，总收率可达到35％以上，可以规模化生产，有较好的经济社会价值和应用前景。

Description

一种抗肿瘤小肽FpAT的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽药物化学合成领域，具体涉及本发明涉及一种抗肿瘤小肽FpAT的制备方法。

背景技术

抗肿瘤小肽FpAT的氨基酸序列为：L-天冬氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-缬氨酰-L-精氨酸。

其结构如下：

肿瘤是危害人类生命健康最严重的疾病之一，目前治疗肿瘤的方法很多，如利用外科学、放射治疗学、化学治疗等，肿瘤血管阻断疗法等。其中基于血管生成与肿瘤生长、转移的关系而发展起来的抗血管生成疗法是一种较为看好的方法，为治疗癌症提供了希望。相关研究显示，近年来内源性的抗肿瘤小肽研究发展迅速，其与传统抗肿瘤药物相比具有明显的优势，其作为信使分子针对肿瘤细胞生长发育的不同环节特异性杀伤或抑制肿瘤细胞，此外，小肽分子小，活性高，易于合成，而且无免疫源性，结构简单，功能明确而特异，毒副作用小，作为药物较为安全。

FpAT是北京肿瘤防治研究所寿成超等发现的具抗血管生成的内源性小肽物质，在小鼠体内有较好的抑瘤生长活性，初步实验提示其还能延长荷瘤小鼠的生存期，具良好的开发应用前景。FpAT小肽在抗肿瘤中的应用已申请专利(申请号200610113568.X，WO2008040190A1)。

专利200610113568.X和WO2008040190A1虽然公布了一种FpAT小肽的制备方法，但是该方法没有公开生产方法中参与反应的关键物料(如催化剂、反应介质等)或关键的反应条件，属于肽类药物合成的通用方法，本领域技术人员很难根据该方法公开的内容大量制备高纯度的该化合物。本申请发明人经过反复试验，提供了一条反应条件温和、副反应少、产率高、操作简便、适合规模化大生产、可随时监控反应进程的Fmoc/tBu固相多肽合成策略。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高收率、低成本、反应条件温和并易于操作、环境污染小、有利于实现产业化的固相合成FpAT肽工艺。

2、为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：小肽FpAT的制备方法，所述FpAT为H-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-OH，包括以下步骤：

(1)由Fmoc-Arg(Pbf)-OH和替代度为1.0～1.3mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂反应得到0.4～0.7mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂。

(2)按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法，根据FpAT序列，从C端到N端逐步偶联Fmoc保护的氨基酸，直至完成FpAT肽树脂的合成。

(3)使用裂解试剂将FpAT从树脂载体上切割下来，得到粗肽。

(4)将粗肽溶解、纯化及冻干得到FpAT成品。

上述合成步骤中，制备Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂时，Fmoc-Arg(Pbf)-OH与2-氯三苯甲基氯树脂投料摩尔比为1.5～2.5∶1，优先选择摩尔比为1.5∶1，N，N-二异丙基乙胺与Fmoc-Arg(Pbf)-OH的投料摩尔比为3-4∶1，优先选择摩尔比为3∶1。Fmoc保护氨基酸、N，N-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯丙三氮唑的投料摩尔比为1∶1～1.3∶1～1.3，优先选择1∶1.2∶1.2。Fmoc保护的氨基酸的投料量为与其进行的偶联的树脂的摩尔数的2～4倍，优先选择3倍。从C端到N端，偶联完第10位双保护氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH后，脱保护采用含0.1MHOBt的20％哌啶/DMF溶液，能抑制天冬酰亚胺副产物的产生。Fmoc保护的氨基酸分别为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。采用的偶联试剂包括DIC/HOBt、HBTU/HOBt、TBTU/HOBt、HCTU/HOBt、PyAOP/HOBt、PyBOP/HOBt等，采用的有机碱有NMM或DIPEA，确优先选择DIC/HOBt缩合体系。偶联过程中，采用的是Kaiser检测法检测，判断偶联是否完全，若反应3小时后，取样检测仍呈阳性，则需重复偶联。裂解试剂采用的是用TFA/苯甲硫醚/苯甲醚/EDT＝90/5/3/2或TFA∶EDT∶TIS＝95/2.5/2.5的混合液，优先选择TFA/苯甲硫醚/苯甲醚/EDT＝90/5/3/2作为裂解液。纯化流动相的选择方案为：第一步纯化A相可选择TFA、CH₃COOH或H₃PO4的水溶液，B相为乙腈；第二步纯化A相可选择TEAP或PBS水溶液，B相为乙腈；第三步纯化A相可选择庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠或高氯酸的水溶液，B相为乙腈，优先选择的流动相组合如下：第一步纯化A相为TFA水溶液，B相为乙腈；第二步纯化A相为TEAP水溶液，B相为乙腈；第三步纯化A相为庚烷磺酸钠水溶液，B相为乙腈。

根据上述步骤(4)中，本发明制得的小肽FpAT可以制备成各种盐形式，如FpAT的醋酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐等，但不限于此几种盐形式。

本发明具有操作工艺简单、对设备要求低、污染小、特别是能抑制天冬酰亚胺副产物的形成，有利于提高下游纯化收率和效率，从而提高总收率，降低总成本，具有大规模生产的应用价值。

具体实施方式

本发明中所提到的氨基酸均为L-构型，相关缩写具有如下含义：

tBu：叔丁基；2-CTC Resin：2-氯三苯甲基氯树脂；DCM：二氯甲烷；DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺；DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；DMF：N，N-二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；EDT：1，2-乙二硫醇；Fmoc：9-芴甲氧羰基；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBt：1-羟基苯并三氮唑；；NMP：N-甲基吡咯烷酮；Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PyAOP：(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基；TBTU：O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸；TEAP：磷酸三乙胺；TFA：三氟乙酸；

Fmoc-Ala-OH：芴甲氧羰基-L-丙氨酸；

Fmoc-Arg(Pbf)-OH：N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸；

Fmoc-Asp(OtBu)-OH：芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-天冬氨酸；

Fmoc-Glu(OtBu)-OH：芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-谷氨酸；

Fmoc-Gly-OH：芴甲氧羰基甘氨酸；

Fmoc-Leu-OH：芴甲氧羰基-L-亮氨酸；

Fmoc-Phe-OH：芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸；

Fmoc-Ser(tBu)-OH：芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-丝氨酸；

Fmoc-Val-OH：芴甲氧羰基-L-缬氨酸；

A/B：指A与B的混合物；

本发明中，Kaiser检测法主要采用的试剂为茚三酮，反应呈紫色或蓝色表明树脂上有游离的氨基存在，表面偶联未完全。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例：

实施例1

(1)Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂的制备：称取2-CTC Resin(1.3mol)置于反应釜中，加入适量DMF洗涤后，抽掉溶液，加入适量的DCM溶涨约30min。称取1062.7g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，加入1/3体积量的DIPEA(288mL)到上述氨基酸溶液中，搅拌均匀，冰水浴10min。待树脂溶涨结束后，抽掉DCM，将溶解好的保护氨基酸料液倒入反应釜中，反应10min后，加入剩余的2/3体积的DIPEA(570mL)，20℃反应3h。反应1h和2h后分别各补加60mL DIPEA。反应结束后，抽掉反应液，加入适量DMF洗涤3次，加入体积之比为17∶2∶1的DCM、甲醇、DIPEA的混合溶液封闭未反应的基团，封闭两次，每次约20min。封闭结束后，加入适量体积的DMF洗涤3次，再用无水甲醇洗涤收缩2次，每次约10分钟。真空干燥，得到约1230.0g氢基酸树脂，测得替代度为0.55mmol/g。

(2)FpAT肽树脂的制备：称取1090.9g Fmoc-Arg(pbf)-CTC Resin置于夹套式玻璃反应釜中，加入适量DCM溶涨约30min，抽掉。加入适量的20％哌啶/DMF溶液脱保护2次，第一次为10min，第二次为20min，两次脱保护之间需加入适量的DMF洗涤。脱完保护后再用适量DMF洗涤5次，每次洗涤1min。Kaiser法检测，树脂呈深蓝色，表明Fmoc已脱除。称取407.3g Fmoc-Val-OH，162.0g HOBt置烧杯中，加入适量DMF溶解，将烧杯放入冰浴中冰浴约5min，然后再量取186mL DIC于溶液中冰浴活化10min，然后将其投入反应釜中。20℃反应2～3h。待反应2h后，Kaiser法检测，若观察到树脂和溶液都显浅黄色，则表明反应已经完全，若反应3h后，Kaiser法检测树脂仍呈蓝色，则需重复偶联。

上述步骤结束后加入适量DMF洗涤两次，根据FpAT从C端到N端的序列，重复以上脱Fmoc保护和偶联操作步骤，依次偶联完所有的氨基酸，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Leu-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Gly-Val-Arg(Pbf)-CTC树脂，加入适量的含0.1M HOBt的20％哌啶/DMF溶液脱保护2次，第一次为10min，第二次为20min，两次脱保护之间需加入适量的DMF洗涤。脱完保护后，加入适量DMF洗涤3次，DCM洗涤1次，最后再用无水甲醇洗涤收缩两次，每次约10分钟。将肽树脂从反应釜中转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到干燥的FpAT肽树脂2120.6g。

(3)取FpAT粗肽的制备：上述步骤(2)中所得的FpAT肽树脂2120.6g，缓缓加入到预先冰冻的16L裂解液中(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚＝90/5/3/2)，室温裂解约2.5小时，然后过滤并在冷冻的无水乙醚中沉降。半个小时后，离心，洗涤，真空干燥约14h，得到干燥的粗肽，重约920.0g。

(4)FpAT粗肽的纯化、转盐及冻干：将上述所得的粗肽，加水溶解至浓度为15mmol/L充分搅拌至完全溶解，搅拌下滴加10％的稀氨水450mL左右，调节pH值至3～4，溶液经0.45μm的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得滤液。滤液经直径15厘米的反相高效液相制备柱(粒径10微米，孔径100埃)纯化。纯化需分三步，第一步制备流动相为，A相：0.1％TFA水溶液(取1mL的TFA加入999mL水中)，B相：乙腈。制备流动相的检测波长为225nm，流速为400～500mL/min，洗脱梯度B相由16％～20％，40分钟，上样量约为22g，收集并合并纯度大于85％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行二步纯化。第二步制备流动相为，A相：TEAP水溶液(1.1％磷酸，用三乙胺调pH值2.3，加水定容至1升)，B相：乙腈，检测波长和流速同第一步纯化，洗脱梯度B相由15％-19％，20分钟，上样量约为22g，收集并合并纯度大于98％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行三步纯化。第三步制备流动相，A相为庚烷磺酸钠水溶液(50mmol/L，用磷酸调pH值2.5，加水定容至1升)，B相：乙腈。检测波长和流速同第一步纯化，洗脱梯度B相由26％～30％，20分钟，上样量约为17g。收集并合并总纯大于98％，单杂小于1％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行转盐。对于峰前、峰后后样品，按上述步骤多次纯化得到合格品。最后再用醋酸铵和醋酸转盐、减压浓缩、冻干得到成品。

在上述纯化过程中，上样量是指所含目的肽的数量，920.0g粗肽经纯化、转盐及冻干后得到最终成品约370g(HPLC纯度为98.8％，水分为3.2％，醋酸含量为5.3％)，总收率为38.5％。

实施列2

(1)Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂的制备：称取2-CTC Resin(1.3mol)置于反应釜中，加入适量DMF洗涤后，抽掉溶液，加入适量的DCM溶涨约30min。称取1417.0g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，加入1/3体积量的DIPEA(435mL)到上述氨基酸溶液中，搅拌均匀，冰水浴约12min。待树脂溶涨结束后，抽掉DCM，将溶解好的保护氨基酸料液倒入反应釜中，反应约12min后，加入剩余的2/3体积的DIPEA(869mL)，25℃反应4h。反应1h和2h后分别各补加60mLDIPEA。反应结束后，抽掉反应液，加入适量DMF洗涤3次，加入体积之比为17∶2∶1的DCM、甲醇、DIPEA的混合溶液封闭未反应的基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入适量体积的DMF洗涤3次，再用无水甲醇洗涤收缩2次，每次约10分钟。真空干燥，得到约1227.4g氨基酸树脂，测得替代度为0.54mmol/g。

(2)FpAT肽树脂的制备：称取1111.1g Fmoc-Arg(pbf)-CTC Resin置于夹套式玻璃反应釜中，加入适量DCM溶涨约30min，抽掉。加入适量的20％哌啶/DMF溶液脱保护2次，第一次为10min，第二次为20min，两次脱保护之间需加入适量的DMF洗涤。脱完保护后再用适量DMF洗涤5次，每次洗涤1min。Kaiser法检测，树脂呈深蓝色，表明Fmoc已脱除。称取611.0g Fmoc-Val-OH，291.6g HOBt置烧杯中，加入适量DMF溶解，将烧杯放入冰浴中冰浴约5min，然后再量取334mL DIC于溶液中冰浴活化13min，然后将其投入反应釜中。25℃反应2～3h。待反应2h后，Kaiser法检测，若观察到树脂和溶液都显浅黄色，则表明反应已经完全，若反应3h后，Kaiser法检测树脂仍呈蓝色，则需重复偶联。

上述步骤结束后加入适量DMF洗涤两次，根据FpAT从C端到N端的序列，重复以上脱Fmoc保护和偶联操作步骤，依次偶联完所有的15个氨基酸，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Leu-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Gly-Val-Arg(Pbf)-CTC树脂。再加入适量的含0.1M HOBt的20％哌啶/DMF溶液脱保护2次，第一次为10min，第二次为20min，两次脱保护之间需加入适量的DMF洗涤。脱完保护后，加入适量DMF洗涤3次，DCM洗涤1次，最后再用无水甲醇洗涤收缩两次，每次约10分钟。将肽树脂从反应釜中转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到干燥的FpAT肽树脂2117.7g。

(3)取FpAT粗肽的制备：上述步骤(2)中所得的FpAT肽树脂2117.7g缓缓加入到预先冰冻的16L裂解液中(TFA∶EDT∶TIS＝95/2.5/2.5)，室温裂解约2.5小时，然后过滤并在冷冻的无水乙醚中沉降。半个小时后，离心，洗涤，真空干燥约14h，得到干燥的粗肽，重约914.5g。

(4)FpAT粗肽的纯化、转盐及冻干：将上述所得的粗肽，加水溶解至浓度为15mmol/L充分搅拌至完全溶解，搅拌下滴加12％的稀氨水432mL左右，调节pH值至3～4，溶液经0.45μm的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得滤液。滤液经直径15厘米的反相高效液相制备柱(粒径10微米，孔径100埃)纯化。纯化需分三步，第一步制备流动相为，A相：1％CH₃COOH水溶液，B相：乙腈。制备流动相的检测波长为225nm，流速为400～500mL/min，洗脱梯度B相由10％～30％，40分钟，上样量约为22g，收集并合并纯度大于85％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行二步纯化。第二步制备流动相为，A相：PBS(35mmol KH₂PO4溶于1L水中，调pH至7)，B相：乙腈，检测波长和流速同第一步纯化，洗脱梯度B相由10％-25％，20分钟，上样量约为18g，收集并合并纯度大于98％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行三步纯化。第三步制备流动相，A相为辛烷磺酸钠，B相：乙腈。检测波长和流速同第一步纯化，洗脱梯度B相由22％～28％，20分钟，上样量约为16g。收集并合并总纯大于98％，单杂小于1％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行转盐。最后再用醋酸铵和醋酸转盐、减压浓缩、冻干得到成品。

在上述纯化过程中，上样量是指所含目的肽的数量，914.5g粗肽经纯化、转盐及冻干后得到最终成品约365g(HPLC纯度为98.6％，水分为3.5％，醋酸含量为6.1％)，总收率为37.5％。

实施列3

(1)Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂的制备：称取2-CTC Resin(1.3mol)置于反应釜中，加入适量DMF洗涤后，抽掉溶液，加入适量的DCM溶涨约30min。称取1771.2g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH于烧杯中，加入适量DMF溶解，加入1/3体积量的DIPEA(477mL)到上述氨基酸溶液中，搅拌均匀，冰水浴15min。待树脂溶涨结束后，抽掉DCM，将溶解好的保护氨基酸料液倒入反应釜中，反应15min后，加入剩余的2/3体积的DIPEA(953mL)，30℃反应4h。反应1h和2h后分别各补加60mL DIPEA。反应结束后，抽掉反应液，加入适量DMF洗涤3次，加入体积之比为17∶2∶1的DCM、甲醇、DIPEA的混合溶液封闭未反应的基团，封闭两次，每次约15min。封闭结束后，加入适量体积的DMF洗涤3次，再用无水甲醇洗涤收缩2次，每次约10分钟。真空干燥，得到约1240.5g氨基酸树脂，测得替代度为0.56mmol/g。

(2)FpAT肽树脂的制备：称取1111.1g Fmoc-Arg(pbf)-CTC Resin置于夹套式玻璃反应釜中，加入适量DCM溶涨约30min，抽掉。加入适量的20％哌啶/DMF溶液脱保护2次，第一次为10min，第二次为20min，两次脱保护之间需加入适量的DMF洗涤。脱完保护后再用适量DMF洗涤5次，每次洗涤1min。Kaiser法检测，树脂呈深蓝色，表明Fmoc已脱除。称取814.7g Fmoc-Val-OH，324.0g HOBt置烧杯中，加入适量DMF溶解，将烧杯放入冰浴中冰浴约5min，然后再量取446mL DIC于溶液中冰浴活化13min，然后将其投入反应釜中。30℃反应2～3h。待反应2h后，Kaiser法检测，若观察到树脂和溶液都显浅黄色，则表明反应已经完全，若反应3h后，Kaiser法检测树脂仍呈蓝色，则需重复偶联。

上述步骤结束后加入适量DMF洗涤两次，根据FpAT从C端到N端的序列，重复以上脱Fmoc保护和偶联操作步骤，依次偶联完所有的氨基酸，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Leu-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Gly-Val-Arg(Pbf)-CTC树脂。再加入适量的含0.1M HOBt的20％哌啶/DMF溶液脱保护2次，第一次为10min，第二次为20min，两次脱保护之间需加入适量的DMF洗涤。脱完保护后，加入适量DMF洗涤3次，DCM洗涤1次，最后再用无水甲醇洗涤收缩两次，每次约10分钟。将肽树脂从反应釜中转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到干燥的FpAT肽树脂2094.7g。

(3)取FpAT粗肽的制备：上述步骤(2)中所得的FpAT十五肽肽树脂2117.7g，缓缓加入到预先冰冻的16L裂解液中(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚＝90/5/3/2)，室温裂解约2.5小时，然后过滤并在冷冻的无水乙醚中沉降。半个小时后，离心，洗涤，真空干燥约14h，得到干燥的粗肽，重约925.0g。

(4)FpAT粗肽的纯化、转盐及冻干：将上述所得的粗肽，加水溶解至浓度为15mmol/L充分搅拌至完全溶解，滴加15％的稀氨水420mL左右，调节pH值至3～4，溶液经0.45μm的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得滤液。滤液经直径15厘米的反相高效液相制备柱(粒径10微米，孔径100埃)纯化。纯化需分三步：第一步制备流动相为，A相：1％H₃PO₄水溶液，B相：乙腈。制备流动相的检测波长为225nm，流速为400～500mL/min，洗脱梯度B相由15％～25％，40分钟，上样量约为20g，收集并合并纯度大于85％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行二步纯化。第二步制备流动相为，A相：TEAP水溶液，B相：乙腈，检测波长和流速同第一步纯化，洗脱梯度B相由15％-19％，20分钟，上样量约为20g，收集并合并纯度大于98％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行三步纯化。第三步制备流动相，A相为高氯酸水溶液，B相：乙腈。检测波长和流速同第一步纯化，洗脱梯度B相由18％～25％，20分钟，上样量约为15g。收集并合并总纯大于98％，单杂小于1％的样品，然后根据HPLC分析检测并定量，旋转蒸发仪减压(33℃)除去大部分乙腈，准备进行转盐。最后再用醋酸铵和醋酸转盐、减压浓缩、冻干得到成品。

在上述纯化过程中，上样量是指所含目的肽的数量，925.0g粗肽经纯化、转盐及冻干后得到最终成品约358g(HPLC纯度为98.8％，水分为3.7％，醋酸含量为5.8％)，总收率为36.8％。

综上所述，本实施例的FpAT肽的合成工艺路线具有的特点：以2-CTC树脂作为载体，使用Fmoc/tBu固相合成策略，工艺步骤少，操作简便，生产周期短，可实现单批次几百克至千克级的生产规模。每步的氨基酸缩合率能达到99.5％以上，粗肽的纯度可达到90％左右，成品纯度可达达到98％以上，最终产品的总收率可达到35％以上，且整个生产的过程采用的是常规试剂原料，无剧毒物质，安全环保。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人员能够了解本发明的内容并实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.FpAT小肽的制备方法，所述FpAT的氨基酸序列为H-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-OH，其特征在于包括如下步骤：

(1)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH连接到载体2-氯三苯甲基氯树脂上获得Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂；

(2)按照Fmoc/tBu固相多肽合成方法，根据FpAT的序列，从C端到N端逐步偶联Fmoc保护氨基酸，直至完成FpAT肽树脂的合成；

(3)使用裂解试剂将FpAT从树脂载体上切下，离心、干燥得到粗肽；

(4)将步骤3所得的粗肽加纯水溶解，调pH，利用制备型反相HPLC纯化，收集目的产物，旋蒸，冻干得到FpAT成品。

2.根据权利要求1所述的方法，在步骤(4)中利用制备型反相HPLC纯化所使用的流动相，其特征在于：第一步纯化流动相A相可以为TFA、CH₃COOH或H₃PO4的水溶液，B相为乙腈；第二步纯化流动相：A相可以为TEAP或PBS的水溶液，B相为乙腈；第三步纯化流动相A相可选择庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠或高氯酸的水溶液，B相为乙腈。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：流动相优选组合为：第一步纯化A相为TFA水溶液，B相为乙腈；第二步纯化A相为TEAP水溶液，B相为乙腈；第三部纯化A相为庚烷磺酸钠水溶液，B相为乙腈。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中将粗肽加粗肽加纯水溶解后，用10％～15％的稀氨水调pH至3～4。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，在反应釜中，通过加入N，N-二异丙基乙胺和N，N-二甲基甲酰胺试剂，使Fmoc-Arg(Pbf)-OH和2-氯三苯甲基氯树脂反应得到生产所需的Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂，其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH与2-氯三苯甲基氯树脂投料摩尔比为1.5～2.5∶1。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：N，N-二异丙基乙胺与Fmoc-Arg(Pbf)-OH的投料摩尔比为3～4∶1，室温反应3～5小时。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的反应结束后，将反应液抽掉，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤后，加入二氯甲烷、甲醇及N，N-二异丙基乙胺到反应釜中，封闭两次，每次15～20分钟，以封闭2-氯三苯甲基氯树脂上未反应的功能基，最后经过洗涤、干燥得到所需的Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的偶联在N，N-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯丙三氮唑以及N，N-二甲基甲酰胺的缩合体系中进行，其中Fmoc保护氨基酸、N，N-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑的投料摩尔比为1∶1～1.3∶1～1.3，且Fmoc保护的氨基酸的投料量为与其进行的偶联的树脂的摩尔数的2～4倍；从C端到N端偶联完第10位氨基酸Asp后，脱Fmoc时要采用0.1M HOBt的20％哌啶/DMF溶液或环己亚胺/HOBt/NMP/DMSO＝4/4/71/71来抑制天冬酰亚胺杂质的形成。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中，通过Kaiser法来判断偶联是否完全。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(3)中，用TFA/苯甲硫醚/苯甲醚/EDT＝90/5/3/2或TFA∶EDT∶TIS＝95/2.5/2.5的混合液作为裂解试剂。