JP2020045327A - スルホン酸化合物によるペプチド精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはN末端が遊離であるかおよび/または少なくとも1つの塩基性アミノ酸残基を有し、
(1)該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
(2)得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法。
該スルホン酸化合物が式(I):
[式中、
Aは、置換されていてもよいC6−10アリール、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、C2−3アルケニル、またはC2−3アルキニルであり;
Xは、
(i)単結合、
(ii)置換されていてもよいC1−4アルキレン、
(iii)−CO−(CH2)n−(COがAと結合する)、または
(iv)C2−4アルケニレン
であり;および
nは1〜3の整数である]
の化合物である、項1に記載の方法。
Aが置換されていてもよいC6−10アリールであり;
Xが、
(i)単結合、
(ii)置換されていてもよいC1−4アルキレン(例えばC1−3アルキレン)、
(iii)−CO−(CH2)n−(COがAと結合する)、または
(iv)C2−3アルケニレン
であり;および
nが1〜3の整数である
項2に記載の方法。
Aが置換されていてもよい二環式ヘテロ環基であり;
Xが、
(i)単結合、
(ii)C1−4アルキレン(例えばC1−3アルキレン)、
(iii)−CO−(CH2)n−(COがAと結合する)、または
(iv)C2−3アルケニレン
であり;および
nが1〜3の整数である
項2に記載の方法。
AがC2−3アルケニルであり;および
XがC1−4アルキレンである
項2に記載の方法。
AがC2−3アルキニルであり;および
XがC1−4アルキレンである
項2に記載の方法。
該目的ペプチドが5〜31個のアミノ酸残基を有する、項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
該合成されたペプチドに類縁ペプチドが含まれる、項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
該合成されたペプチドにおいて、該目的ペプチドに対して、類縁ペプチドのモル比が0.7以下である、項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
該ペプチド合成が固相法によるペプチド合成である、項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
該目的ペプチドが少なくとも1つの塩基性アミノ酸残基を含み、かつ、該目的ペプチドのN末端が遊離であってもよい、項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
Aが、C1−4アルキル、−CO−C6−10アリール、−OH、−O−C1−3アルキル、−NO2、−CO2H、−CO2−C1−4アルキル、ハロゲン、−NH2、−CH2−SO3H、−SO3H、CN、−CO−C1−4アルキル、−CF3、およびC6−10アリールからなる群から選択される同一または異なった1〜5個の置換基で置換されていてもよいC6−10アリールである、項2、3、および7〜11のいずれか1項に記載の方法。
Aがフェニル、ナフチル、およびインダニルから選択されるC6−10アリールであって、該C6−10アリールは、C1−4アルキル、−CO−C6−10アリール、−OH、−O−C1−3アルキル、−NO2、−CO2H、−CO2−C1−4アルキル、ハロゲン、−NH2、−CH2−SO3H、−SO3H、CN、−CO−C1−4アルキル、−CF3、およびC6−10アリールからなる群から選択される同一または異なった1〜5個の置換基で置換されていてもよい、項2、3、および7〜12のいずれか1項に記載の方法。
Aが、2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、およびベンゾトリアゾリルからなる群から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は適宜置換されていてもよい、項2、4、および7〜11のいずれか1項に記載の方法。
Aが、C6−10アリール、C1−4アルキル、−CO−C6−10アリール、−OH、−O−C1−3アルキル、−NO2、−CO2H、−CO2−C1−4アルキル、ハロゲン、−NH2、−CH2−SO3H、−SO3H、CN、−CO−C1−4アルキル、−CF3、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった1〜5個の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基である、項2、4、7〜11、および14のいずれか1項に記載の方法。
Aが
Xが、
(i)単結合、
(ii)1つのメチル、1つのベンジル、または1つのフェニルで置換されていてもよいC1−4アルキレン(例えばC1−3アルキレン)、または
(iii)−CO−(CH2)−(COがAと結合する)、
である、項2〜4、および7〜16のいずれか1項に記載の方法。
Xが、
(i)単結合、
(ii)1つのメチル、1つのベンジル、または1つのフェニルで置換されていてもよいC1−4アルキレン(例えばC1−3アルキレン)、または
(iii)−CO−(CH2)−(COがAと結合する)、
である、項12に記載の方法。
Xが単結合である、項2〜4、および7〜18のいずれか1項に記載の方法。
Xが単結合である、項16に記載の方法。
該スルホン酸化合物が下記:
から選択される、項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
該スルホン酸化合物を除去する工程をさらに含む、項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比を向上させるための、項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
項1〜23のいずれか1項に記載の方法を含む、該目的ペプチドを製造する方法。
項1〜23のいずれか1項に記載の方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する薬剤。
項1〜23のいずれか1項に記載の方法において使用されるための、該スルホン酸化合物を含有する剤。
ペプチド合成によって得られたペプチドから精製された目的ペプチドを含有する薬剤であって、該目的ペプチドはN末端が遊離であるかおよび/または少なくとも1つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
(1)該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
(2)得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、薬剤。
ペプチド合成によって得られたペプチドからの目的ペプチドの精製において使用するためのスルホン酸化合物を含有する剤であって、該目的ペプチドはN末端が遊離であるかおよび/または少なくとも1つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
(1)該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物を含有する剤と混合し、
(2)得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、剤。
(1)該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
(2)得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法を提供する。
非天然アミノ酸の例として、下表に示すグリシンを除く19種類のアミノ酸のN−メチル体とその鏡像体;N−メチルグリシン;下表に示すグリシンとアラニンを除く18種類のアミノ酸のα−メチル体の両鏡像体;下表に示すアラニンを除く19種類のアミノ酸のα−エチル体の両鏡像体;
D−セレノシステイン;
D−ノルロイシン;
D−オルニチン;
(S)−又は(R)−2,3−ジアミノプロピオン酸;
(S)−又は(R)−2,4−ジアミノ酪酸;
(S)−又は(R)−ピログルタミン酸;
(S)−又は(R)−α−メチルーオルトフルオロフェニルアラニン;
(S)−又は(R)−α−(4−ペンテニル)アラニン;
(S)−又は(R)−α−(7−オクテニル)アラニン;
(S)−又は(R)−α−プロパルギルアラニン;
(S)−又は(R)−α−アリルアラニン;
(S)−又は(R)−インダン−2−イルグリシン;
(S)−又は(R)−ピリジン−3−イルメチルグリシン、及びそのピリジン環上がアルキル基で置換されていても良いフェニル基で置換されていても良い誘導体;
(S)−又は(R)−ピリジン−2−イルメチルグリシン;
(S)−又は(R)−ピペコリン酸;および
(S)−又は(R)−及びtrans−又はcisー4−ヒドロキシプロリンが挙げられる。
(1)目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部(例えば、連続または不連続の1〜3アミノ酸残基、連続または不連続の1〜2アミノ酸残基、および1アミノ酸残基)が重複した;
(2)目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部(例えば、連続または不連続の1〜3アミノ酸残基、連続または不連続の1〜2アミノ酸残基、および1アミノ酸残基)が欠損した;
(3)目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部(例えば、連続または不連続の1〜3アミノ酸残基、連続または不連続の1〜2アミノ酸残基、および1アミノ酸残基)がエピマー化(例えば、N−保護アミノ酸のα−位異性化によるエピマー化)した;および/または
(4)目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部(例えば、連続または不連続の1〜3アミノ酸残基、連続または不連続の1〜2アミノ酸残基、および1アミノ酸残基)が同数のアミノ酸残基により置換された、
ペプチドが挙げられる。
[式中、
Aは、置換されていてもよいC6−10アリール、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、C2−3アルケニル、またはC2−3アルキニルであり;
Xは、
(i)単結合、
(ii)置換されていてもよいC1−4アルキレン、
(iii)−CO−(CH2)n−(COがAと結合する)、または
(iv)C2−4アルケニレン
であり;および
nは1〜3の整数である]
本願において「C1−3アルキレン」とは、直鎖C1−3アルキル由来の2価の基を意味する。C1−3アルキレンの例としてメチレン、エチレン、トリメチレンが挙げられる。
本願において「C1−3アルキル(ある基の一部を構成する場合を含む)」とは、炭素数1〜3個を有する、直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。C1−3アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルが挙げられる。
目的ペプチドを固相法により合成した場合、得られた粗ペプチドには不純物として類縁ペプチドが混入していることが予想されるが、実際にどのような類縁ペプチドが混入しているかを同定することは困難である。よって、目的ペプチドと類縁ペプチドに相当する配列既知の擬似類縁ペプチドを固相法によりそれぞれ合成し、得られた粗目的ペプチド、粗擬似類縁ペプチド、および各種酸化合物を溶媒下で混合し、凍結乾燥した。残渣に溶媒を加えて上清を除去し、得られた固体における、目的ペプチドと擬似類縁ペプチドの物質量(mol)の合計に対する目的ペプチドの物質量(mol)の割合を測定し、その変化により、当該固体において目的ペプチドが精製されたかを評価する。
下表に示す目的ペプチドおよび類縁ペプチド(擬似)をそれぞれ、以下に説明する固相法により合成した。
・ペプチド合成装置:国産化学社製「KMS−3」。
・質量分析装置:Agilent社製「6224 TOF LC/MS」および「1260 Infinity series」。「イオン化条件はESI(キャピラリー電圧:3500V、フラグメンター電圧:100V)」
・HPLC分析装置:島津製作所社製「SPD−M20A」、「LC−20AD」、「SIL−20AC」、「DGU−20A」、「CTO−20AC」、「CBM-20A」、または島津製作所社製「SPD−M20A」、「LC−2010C」、またはAgilent社製「1200 series」。
保護ペプチド樹脂の合成においては、各構成アミノ酸のα-アミノ基はすべて9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)で保護され、活性な側鎖のうち、アスパラギン酸のβ-カルボキシル基およびグルタミン酸のγ-カルボキシル基はtert-ブチル基(tBu基)で、アルギニンのグアニジノ基は2,2,4,6,7-ペンタメチル‐2,3‐ジヒドロベンゾフラン‐5‐イルスルホニル基(Pbf基)で、セリンおよびスレオニンの水酸基はtert-ブチル基(tBu基)で、システインのチオール基およびヒスチジンのイミダゾール基はトリチル基(Trt基)で、チロシンのフェノール性水酸基はtert-ブチル基(tBu基)で、アスパラギンおよびグルタミンのカルボアミド基はトリチル基(Trt基)で、リジンのε-アミノ基およびトリプトファンのインドール基はtert-ブチルオキシカルボニル基(Boc基)で保護されたものを使用した。
ペプチド粗生成物の合成においては、上記で合成した目的のペプチドのアミノ酸配列を持つ保護ペプチド樹脂を酸で処理することにより脱保護および樹脂からの切り出しを行った。目的のペプチドがシステインやメチオニンといった硫黄原子を持つアミノ酸を含むペプチド配列の場合は、TFA/水/エタンジチオール/TIS(94/2.5/2.5/1)を用い、氷冷から室温下で30分以上振盪撹拌することで脱保護および樹脂からの切り出しを行った。目的のペプチドがシステインやメチオニンといった硫黄原子を持つアミノ酸を含まない場合は、TFA/水/TIS(95/2.5/2.5)を用い、氷冷から室温下で30分以上振盪撹拌することで脱保護および樹脂からの切り出しを行った。反応終了後、樹脂を濾過して、脱保護溶液で樹脂を3回から5回洗浄した後、洗浄液と濾液を混合して、エバポレーターで濃縮した。残渣にMTBEを添加し、析出した沈殿をろ過または遠心分離することで固液分離し、MTBE洗浄を複数回行うことで、目的のペプチド粗生成物を合成した。
カラム:YMC-triartC18 3μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.7mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm([表14−2]の目的ペプチド(8)と類縁ペプチド(22)の分析の際のみ)または274 nm
勾配:2%B(0分)→2%B(0.2分)→6.4%B(0.5分)→6.4%B(11分)→95%B(15.5分)→95%B(20.5分)→2%B(20.6分)→2%B(29分)
保持時間=13.3分付近
カラム:YMC-PackProC18 3μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:5%B(0分)→5%B(5分)→95%B(17分)→5%B(17.1分)→5%B(20.1分)→5%B(24分)
保持時間=10.6分付近
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:20%B(0分)→20%B(12分)→95%B(15分)→95%B(19分)→20%B(20分)→20%B(28分)
保持時間=10.2分付近
HPLCの分析条件は上記に示したHPLC条件(条件A〜C)のほか、以下に示す条件を用いて分析した。
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:275 nm
勾配:15%B(0分)→25%B(1分)→25%B(12分)→95%B(14.5分)→95%B(17分)→15%B(17.5分)→15%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.7mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:20%B(0分)→35%B(17分)→95%B(18分)→95%B(20分)→20%B(20.5分)→20%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:279 nm
勾配:36%B(0分)→36%B(12.5分)→95%B(13分)→95%B(14.5分)→36%B(15分)→36%B(27分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:281 nm
勾配:22%B(0分)→25%B(2分)→25%B(14分)→95%B(17分)→95%B(18.5分)→22%B(19分)→22%B(30分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.65mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:2%B(0分)→2%B(3分)→5%B(12分)→5%B(14分)→8%B(16分)→95%B(19分)→95%B(19.9分)→2%B(20分)→2%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:23%B(0分)→25%B(2分)→25%B(10分)→35%B(15分)→95%B(17分)→95%B(19分)→23%B(20分)→23%B(28分)
カラム:Waters Atlantis T3 3μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:1.0mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:20%B(0分)→20%B(12分)→95%B(17分)→95%B(19分)→20%B(19.1分)→20%B(28分)
カラム: Waters Xbridge Phenyl 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:1.0mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:5%B(0分)→5%B(3分)→95%B(20分)→5%B(20.1分)→5%B(26分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:28%B(0分)→38%B(12分)→95%B(15分)→95%B(19分)→28%B(20分)→28%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.65mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:4%B(0分)→4%B(3分)→7%B(8分)→95%B(15分)→95%B(15.9分)→4%B(16分)→4%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:1.0mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:0%B(0分)→3%B(8分)→95%B(25分)→95%B(28分)→0%B(28.5分)→0%B(35分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:25%B(0分)→25%B(14分)→95%B(17分)→95%B(21分)→0%B(22分)→0%B(32分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:20%B(0分)→25%B(12分)→25%B(14分)→95%B(17分)→95%B(18.5分)→20%B(19分)→20%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.5mL/分、温度:30℃
検出波長:205 nm
勾配:3%B(0分)→5%B(5分)→5%B(16分)→95%B(17分)→95%B(19分)→3%B(19.1分)→3%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.6mL/分、温度:30℃
検出波長:275 nm
勾配:11%B(0分)→11%B(10分)→20%B(12分)→95%B(15分)→95%B(17.5分)→11%B(18分)→11%B(28分)
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液:A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAアセトニトリル
流速:0.6mL/分、温度:30℃
検出波長:281 nm
勾配:29%B(0分)→29%B(10分)→40%B(12分)→95%B(15分)→95%B(17.5分)→29%B(18分)→29%B(28分)
硫酸:ナカライテスク社 特級
塩酸:ナカライテスク社 0.1N 特級
p−メチルベンジルブロミド1.55g(7mmol)をエタノール4mLに溶かし、亜硫酸ナトリウム0.97g(7.7mmol;1.1当量)、水8mLを加え、終夜加熱還流した。反応終了後、エバポレーターで濃縮しエタノールを除去した後、析出した固体をろ過し、1.09gのp−メチルベンジルスルホン酸ナトリウム塩を得た。得られた固体625mgに濃塩酸1mLと水1.5mLを加え終夜撹拌した。反応液を濾過し、水0.5mLで2回洗浄し、p−メチルベンジルスルホン酸448mgを得た。1H NMR (400 MHz, D2O) 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.28 (s, 3H)
TFA:トリフルオロ酢酸
IPA:イソプロピルアルコール
DMSO:ジメチルスルホキシド
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
TIS:トリイソプロピルシラン
MTBE:メチルターシャリーブチルエーテル
1−1で得られた粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドをそれぞれ1%TFA含有水/アセトニトリル=100〜70/0〜30に溶解し、20mM(各ペプチドの純度を100%と仮定)の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。溶けにくいペプチドは約5mM(各ペプチドの純度を100%と仮定)まで希釈して溶解させた。
各酸化合物を水、または、水に溶けにくい場合は10%IPA水溶液または10%DMSO水溶液に溶かし、50mMの酸化合物溶液とした。
粗目的ペプチド溶液(1μmol(目的ペプチドの純度を100%と仮定))、粗類縁ペプチド溶液(0.1μmol(類縁ペプチドの純度を100%と仮定))を混合した。
当該混合物に酸化合物溶液(1.5μmol)を混合し(HPLC分析(処理前))、凍結乾燥により乾固した。
残渣にIPA 100μLを加え、室温にて終夜振盪した。
得られたスラリーを遠心ろ過(5000〜15000rpm、1〜5分)し、ケーキをIPA 150μLで2回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
得られた固体と濾洗液をそれぞれHPLC分析した(処理後固体/処理後濾洗液)。
測定条件:ペプチド合成時の各HPLC条件(HPLC条件A〜M)に従う。
式1)
目的ペプチド率(%)=目的ペプチドの面積/(目的ペプチドの面積+類縁ペプチドの面積)×100
≒目的ペプチド(mol)/(目的ペプチド(mol)+類縁ペプチド(mol))×100
ペプチドと酸化合物を混合した場合、N末端のアミノ基、あるいは、塩基性アミノ酸(リジンK、アルギニンR、ヒスチジンH等)の側鎖部分と酸化合物が塩を形成する可能性がある。
塩基性アミノ酸不含の目的ペプチド:H-YFYPEL-NH2および1残基欠損体であるその類縁ペプチド:H-YYPEL-NH2、ならびにこれらのN末端をアセチル基(Ac)で保護した目的ペプチドAc-YFYPEL-NH2および1残基欠損体であるその類縁ペプチドAc-YYPEL-NH2を用いて、固体における目的ペプチド率(%)の変化により、ペプチドと酸化合物との塩形成の有無を検証した。
式2):
目的ペプチド率(%)の上昇ポイント=処理後固体の目的ペプチド率(%)−処理前の目的ペプチド率(%)
結果を下表に示す。
対して、N末端がフリーである目的ペプチド:H-YFYPEL-NH2とその類縁ペプチド:H-YYPEL-NH2では、酸化合物を使用しない場合では−0.3ポイント、硫酸では0.2ポイントであるのに対して、当該スルホン酸化合物では3.1ポイントであり、当該スルホン酸化合物での上昇ポイントは酸化合物不使用および硫酸に比べて大きかった。
目的ペプチドと類縁ペプチドの構造が類似している場合、溶媒に対する溶解特性は通常近似する。そうすると、ペプチドが酸化合物と塩を形成して固体となった場合には、得られた固体の溶媒に対する溶解特性が元のペプチドに比べ大きく変化するので、固液分離する事によって、類縁ペプチドより多く含まれる目的ペプチドの割合が上昇する可能性は顕著に高まる。従って、これらの結果は、当該スルホン酸化合物がペプチドのN末端のアミノ基と塩を形成したことを示唆する。
下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率(%)の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率(%)の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
下表のスルホン酸化合物またはカルボン酸化合物、ならびに目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率(%)の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
下表のスルホン酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用い、分析上の問題で固体における目的ペプチド率が算出できなかった試料があったため濾洗液における目的ペプチド率(%)の変化を、下式3)を用いて「目的ペプチド率(%)の低下ポイント」として算出した。目的ペプチドと類縁ペプチドの処理前後のそれぞれの濃度は不明であること、および目的ペプチドと類縁ペプチドのHPLC感度は同一ではないことから、「目的ペプチド率(%)の低下ポイント」から「目的ペプチド率(%)の上昇ポイント」への換算はできないものの、濾洗液において目的ペプチド率が減少したことは固体において目的ペプチド率が増加したことを意味する。
目的ペプチド率(%)の低下ポイント=処理後濾洗液の目的ペプチド率(%)−処理前の目的ペプチド率(%)
結果を下表に示す。
下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率(%)の上昇ポイントを算出した。
結果を下表に示す。
1−1で得られた粗目的ペプチド((8)H-YERAKSNM-OH)と粗類縁ペプチド((13)H-YERKSNM-OH)をそれぞれ水/アセトニトリル=1/2に溶解し、10mM(各ペプチドの純度を100%と仮定)の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。
酸化合物を水に溶かし、30mMの酸化合物溶液とした。
粗目的ペプチド溶液(1μmol(目的ペプチドの純度を100%と仮定))、粗類縁ペプチド溶液(0.1μmol(類縁ペプチドの純度を100%と仮定))を混合した。
当該混合物に酸化合物溶液(0.9μmol)を混合し(HPLC分析(処理前))、凍結乾燥により乾固した。酸化合物は、
残渣に下表の溶媒 100μLを加え、室温にて終夜振盪した。
得られたスラリーを遠心ろ過(14000rpm、1分)し、ケーキを当該溶媒 100μLで2回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
得られた固体と濾洗液をそれぞれHPLC分析した(処理後固体/処理後濾洗液)。
上記と同様の方法で、得られた濾洗液における目的ペプチド率(%)の低下ポイントを算出した。
加えて、処理前溶液と処理後固体についてのHPLC分析結果から、目的ペプチドのHPLC面積百分率(但し、総面積からスルホン酸化合物のピークを除く)を算出した。
粗目的ペプチド、粗類縁ペプチド、スルホン酸化合物をそれぞれ水/アセトニトリル(1/2)に溶解し、粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドについては50 mM(それぞれ純度を100%と仮定)、スルホン酸化合物については75 mMの溶液を調製した。粗目的ペプチド溶液1 mL(50 μmol)、粗類縁ペプチド0.1 mL(5 μmol)を混合した。
スルホン酸化合物溶液1 mL(75 μmol)を添加し(HPLC分析(条件A、処理前))、凍結乾燥した。残渣にIPA 1 mLを加え分散した後、再度凍結乾燥し残渣(67.35 mg)を得た。
上記残渣にIPA 2 mLを加え、700rpmで3時間振盪後固体を遠心沈降した(14000rpm、1分)。固体と上清を分離し、それぞれ凍結乾燥して固体由来残渣60.74 mg、上清由来残渣5.84 mgを得た。それぞれHPLC分析した(条件A、処理後)。結果を下表に示す。
粗目的ペプチド、粗類縁ペプチド、スルホン酸化合物をそれぞれ水/アセトニトリル(1/2)に溶解し、粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドについては50 mM(それぞれ純度を100%と仮定)、スルホン酸化合物については75 mMの溶液を調製した。粗目的ペプチド溶液1 mL(50 μmol)、粗類縁ペプチド0.1 mL(5 μmol)を混合した。
スルホン酸化合物溶液1 mL(75 μmol)を添加し(HPLC分析した(条件A、処理前))、凍結乾燥した。残渣にIPA 1 mLを加え分散した後、再度凍結乾燥し残渣(70.93 mg)を得た。
上記残渣にIPA 5 mLを加え、700rpmで3.5時間振盪後固体を遠心沈降した(14000rpm、1分)。固体と上清を分離し、IPA 1 mLで固体を洗浄した。固体と上清および洗浄溶液を合わせたもの、それぞれを凍結乾燥して固体由来残渣59.58 mg、上清および洗浄由来残渣5.40 mgを得た。
Oasis WAX Cartridge(6cc/150mg)(Waters社製)を用い、1N水酸化ナトリウム水溶液1 mL、水(精製水)7 mL、水/MeOH(10/1)2 mLの順で通液し、前処理を行った。
上記固体由来残渣15.74 mg を 水/MeOH(10/1)1 mLに溶解し、HPLC分析した(条件A、処理後。スルホン酸は5.1分付近に溶出した)。
前処理を行ったOasis WAX Cartridge(6cc/150mg)に上記溶液をロードし、水/MeOH(10/1)9 mLを通液した。このカートリッジを通した溶液をHPLC分析し、スルホン酸の除去を確認した(条件A、スルホン酸除去後)。凍結乾燥して残渣9.47 mgを得た。
1−1で得られた粗目的ペプチド((8)H-YERAKSNM-OH)と粗類縁ペプチド((23)H-YERAKSN-OH)をそれぞれ水/アセトニトリル=1/2に溶解し、10mM(各ペプチドの純度を100%と仮定)の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。
スルホン酸化合物を水に溶かし、50mMのスルホン酸化合物溶液とした。
粗目的ペプチド溶液(1μmol(目的ペプチドの純度を100%と仮定))、粗類縁ペプチド溶液(0.1μmol(類縁ペプチドの純度を100%と仮定))を混合した。
当該混合物にスルホン酸化合物溶液(1.5μmol)を混合し(HPLC分析(処理前))、凍結乾燥により乾固した。スルホン酸化合物は、
残渣に下表の溶媒 100μLを加え、室温にて終夜振盪した。
得られたスラリーを遠心ろ過(14000rpm、1分)し、ケーキを当該溶媒 100μLで2回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
得られた固体と濾洗液をそれぞれHPLC分析した(処理後固体/処理後濾洗液)。
上記と同様の方法で、得られた濾洗液における目的ペプチド率(%)の低下ポイントを算出した。
加えて、処理前溶液と処理後固体についてのHPLC分析結果から、目的ペプチドのHPLC面積百分率(但し、処理後固体については総面積からスルホン酸化合物のピークを除く)を算出した。
下表の目的ペプチド、類縁ペプチド、およびスルホン酸化合物に関し、試験例1で行ったHPLC分析結果から、処理前溶液と処理後固体の目的ペプチドのHPLC面積百分率(但し総面積からスルホン酸化合物のピークを除く)を算出した。
Claims (28)
- ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはN末端が遊離であるかおよび/または少なくとも1つの塩基性アミノ酸残基を有し、
(1)該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
(2)得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法。 - 該スルホン酸化合物が式(I):
[式中、
Aは、置換されていてもよいC6−10アリール、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、C2−3アルケニル、またはC2−3アルキニルであり;
Xは、
(i)単結合、
(ii)置換されていてもよいC1−4アルキレン、
(iii)−CO−(CH2)n−(COがAと結合する)、または
(iv)C2−4アルケニレン
であり;および
nは1〜3の整数である]
の化合物である、請求項1に記載の方法。 - Aが置換されていてもよいC6−10アリールであり;
Xが、
(i)単結合、
(ii)置換されていてもよいC1−4アルキレン、
(iii)−CO−(CH2)n−(COがAと結合する)、または
(iv)C2−3アルケニレン
であり;および
nが1〜3の整数である
請求項2に記載の方法。 - Aが置換されていてもよい二環式ヘテロ環基であり;
Xが、
(i)単結合、
(ii)C1−4アルキレン、
(iii)−CO−(CH2)n−(COがAと結合する)、または
(iv)C2−3アルケニレン
であり;および
nが1〜3の整数である
請求項2に記載の方法。 - AがC2−3アルケニルであり;および
XがC1−4アルキレンである
請求項2に記載の方法。 - AがC2−3アルキニルであり;および
XがC1−4アルキレンである
請求項2に記載の方法。 - 該目的ペプチドが5〜31個のアミノ酸残基を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 該合成されたペプチドに類縁ペプチドが含まれる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 該合成されたペプチドにおいて、該目的ペプチドに対して、類縁ペプチドのモル比が0.7以下である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 該ペプチド合成が固相法によるペプチド合成である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 該目的ペプチドが少なくとも1つの塩基性アミノ酸残基を含み、かつ、該目的ペプチドのN末端が遊離であってもよい、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- Aが、C1−4アルキル、−CO−C6−10アリール、−OH、−O−C1−3アルキル、−NO2、−CO2H、−CO2−C1−4アルキル、ハロゲン、−NH2、−CH2−SO3H、−SO3H、CN、−CO−C1−4アルキル、−CF3、およびC6−10アリールからなる群から選択される同一または異なった1〜5個の置換基で置換されていてもよいC6−10アリールである、請求項2、3、および7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- Aがフェニル、ナフチル、およびインダニルから選択されるC6−10アリールであって、該C6−10アリールは、C1−4アルキル、−CO−C6−10アリール、−OH、−O−C1−3アルキル、−NO2、−CO2H、−CO2−C1−4アルキル、ハロゲン、−NH2、−CH2−SO3H、−SO3H、CN、−CO−C1−4アルキル、−CF3、およびC6−10アリールからなる群から選択される同一または異なった1〜5個の置換基で置換されていてもよい、請求項2、3、および7〜12のいずれか1項に記載の方法。
- Aが、2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、およびベンゾトリアゾリルからなる群から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は適宜置換されていてもよい、請求項2、4、および7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- Aが、C6−10アリール、C1−4アルキル、−CO−C6−10アリール、−OH、−O−C1−3アルキル、−NO2、−CO2H、−CO2−C1−4アルキル、ハロゲン、−NH2、−CH2−SO3H、−SO3H、CN、−CO−C1−4アルキル、−CF3、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった1〜5個の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基である、請求項2、4、7〜11、および14のいずれか1項に記載の方法。
- Aが
- Xが、
(i)単結合、
(ii)1つのメチル、1つのベンジル、または1つのフェニルで置換されていてもよいC1−4アルキレン、または
(iii)−CO−(CH2)−(COがAと結合する)、
である、請求項2〜4、および7〜16のいずれか1項に記載の方法。 - Xが、
(i)単結合、
(ii)1つのメチル、1つのベンジル、または1つのフェニルで置換されていてもよいC1−4アルキレン、または
(iii)−CO−(CH2)−(COがAと結合する)、
である、請求項12に記載の方法。 - Xが単結合である、請求項2〜4、および7〜18のいずれか1項に記載の方法。
- Xが単結合である、請求項16に記載の方法。
- 該スルホン酸化合物が下記:
から選択される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。 - 該スルホン酸化合物を除去する工程をさらに含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比を向上させるための、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法を含む、該目的ペプチドを製造する方法。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する薬剤。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法において使用されるための、該スルホン酸化合物を含有する剤。
-
- 請求項25に記載の薬剤の有効量をその必要がある患者に投与することを含む、ヒトにおける疾患を治療する方法。
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