TW202016126A - 藉由磺酸化合物來進行的胜肽精製方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種精製目標胜肽的方法，其包含：在磺酸化合物的存在下，將藉由胜肽合成所獲得的胜肽與溶劑混合而獲得固體的步驟；及，進行固液分離來採取該固體的步驟。

Description

藉由磺酸化合物來進行的胜肽精製方法
本發明關於下述技術：一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽；及，一種藥劑，其包含藉由該精製方法所獲得的目標胜肽。
胺基酸殘基數量較少的胜肽(通常為30個殘基以下)，一般而言是藉由有機化學性的合成法來製造(例如專利文獻1)。作為有機化學性的合成法，可列舉固相合成法與液相合成法，該等方法重覆胜肽伸長反應，該胜肽伸長反應是由耦合反應與接續耦合反應的N-末端去保護反應所構成，該耦合反應是以N-保護胺基酸與C-保護胜肽(形成二胜肽時，為C-保護胺基酸)來進行。有機化學性合成法中，會由於該胜肽伸長反應的部分重覆、部分缺失等，而合成出各式各樣的類似胜肽，從而需要自該等類似胜肽將已生成的目標胜肽分離。然而，由於類似胜肽的物化性質與目標胜肽有很多酷似之處，所以其分離非常困難。為了獲得經精製的目標胜肽，謀求一種方法，其可有效地分離目標胜肽與類似胜肽。
一般而言，胺基酸殘基較多的胜肽(通常超過30個殘基)可藉由發酵法來製造(例如，專利文獻2)。此時，亦會有混入類似胜肽的情況，該類似胜肽是胺基酸殘基經部分取代等而成，所以分離性質酷似的類似胜肽與目標胜肽也是重大的問題。
又，現今的胜肽精製，即便在擴大規模的情形下，一般而言仍是利用藉由分層高效液相層析的方法來實行，該方法在成本方面會造成龐大的負擔。為了取代或彌補分層高效液相層析，謀求一種方法，其可自目標胜肽與類似胜肽之混合物將類似胜肽有效地分離並去除。 [先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：日本特開2018-52933號。 專利文獻2：日本特開2016-190851號。
在本說明書中，藉由參照其中所引用的全部先前技術文獻的技術內容，來併入本說明書中。
[發明所欲解決的問題] 本發明所欲解決的問題在於，提供一種精製目標胜肽的方法，其包含從混合物去除類似胜肽的步驟，該混合物包含藉由胜肽合成所獲得的目標胜肽與類似胜肽。 進一步，本發明所解決的問題在於，提供一種胜肽精製方法，其用以取代或彌補先前的胜肽精製方法。
[解決問題的技術手段] 本發明人為了解決上述問題致力於研究的結果，發現在包含類似胜肽之目標胜肽的胜肽合成產物中，在溶劑的存在下，使其與具有特定結構之磺酸化合物混合來進行固液分離，藉此，可提升目標胜肽的純度(絕對純度，其中不包含磺酸化合物)，並且可獲得目標胜肽的磺酸鹽的固形物，其已減少了類似胜肽的比例，並基於該等事實從而完成本發明。在以下詳細地說明本發明。
[1] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體。 [1-1] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其從該混合開始經過1分鐘以上後，進行固液分離來採取該固體。 [1-2] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體； 並且，該溶劑含有水、醇類化合物、乙腈、醚化合物、酮化合物、酯化合物、烴化合物、二甲亞碸(DMSO)、醯胺化合物、鹵化烴、或該等的混合物。 [1-3] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體； 步驟(2)，其是進行固液分離來採取該固體；及， 步驟(3)，其將該固體進行洗淨。 [1-4] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在0～50℃且在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其是在0～50℃進行固液分離來採取該固體。 [1-5] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體； 並且，該溶劑與該目標胜肽的重量比也就是溶劑/目標胜肽是1～100000。 [1-6] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體； 並且，該磺酸化合物相對於該目標胜肽的莫耳比是0.1～50。 [1-7] 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合；及， 步驟(2)，其從液相將所獲得的固形物進行分離。
[2] 如[1]及[1-1]～[1-7]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該磺酸化合物是式(I)的化合物：
Figure 02_image001
(I) 式(I)中，A是可經取代的C6 － 14 芳基(例如是C6 － 13 芳基、C6 － 10 芳基)、可經取代的二環式雜環基、C2 － 3 烯基或C2 － 3 炔基； X是(i)單鍵、(ii)可經取代的C1 － 6 伸烷基(例如C1 － 5 伸烷基、C1 － 4 伸烷基)、(iii)－CO－(CH2 )n －(CO與A進行鍵結)、或(iv)C2 － 4 伸烯基，並且，n是1～3的整數。
[3] 如[2]所述之胜肽精製方法，其中，A是可經取代的C6 － 14 芳基(例如是C6 － 13 芳基、C6 － 10 芳基)； X是(i)單鍵、(ii)可經取代的C1 － 6 伸烷基(例如C1 － 5 伸烷基、C1 － 4 伸烷基、C1 － 3 伸烷基)、(iii)－CO－(CH2 )n －(CO與A進行鍵結)、或(iv)C2 － 3 伸烯基，並且，n是1～3的整數。
[4] 如[2]所述之胜肽精製方法，其中，A是可經取代的二環式雜環基； X是(i)單鍵、(ii) C1 － 6 伸烷基(例如C1 － 5 伸烷基、C1 － 4 伸烷基、C1 － 3 伸烷基)、(iii)－CO－(CH2 )n －(CO與A進行鍵結)、或(iv)C2 － 3 伸烯基，並且，n是1～3的整數。
[5] 如[2]所述之胜肽精製方法，其中，A是C2 － 3 烯基，並且X是C1 － 4 伸烷基。
[6] 如[2]所述之胜肽精製方法，其中，A是C2 － 3 炔基，並且X是C1 － 4 伸烷基。
[7] 如[1]～[6]及[1-1]～[1-7]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該目標胜肽具有5～31個胺基酸殘基。
[8] 如[1]～[7]及[1-1]～[1-7]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該經合成胜肽中包含有類似胜肽。
[9] 如[1]～[8]及[1-1]～[1-7]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，在該所合成出的胜肽中，相對於該目標胜肽，類似胜肽的莫耳比是0.7以下。
[10] 如[1]～[9]及[1-1]～[1-7]中任一項所述之方法，其中，該胜肽合成是藉由固相合成法所進行的胜肽合成。
[11] 如[1]～[10]及[1-1]～[1-7]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該目標胜肽包含至少1個鹼性胺基酸殘基，且該目標胜肽的N末端可以是游離基。
[12] 如[2]、[3]及[7]～[11]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是可經1～5個相同或不同的下述取代基取代的C6 － 14 芳基(例如C6 － 13 芳基、C6 － 10 芳基)，該取代基是選自由C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及C6 － 10 芳基所組成之群組。
[13] 如[2]、[3]及[7]～[12]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是選自苯基、萘基、茀基及二氫茚基的C6 － 13 芳基，該C6 － 13 芳基可經1～5個相同或不同的下述取代基所取代，該等取代基是選自由C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及C6 － 10 芳基所組成之群組。 [13-1] 如[2]、[3]及[7]～[12]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是選自苯基、萘基及二氫茚基的C6 － 10 芳基，該C6 － 10 芳基可經1～5個相同或不同的下述取代基所取代，該等取代基是選自由C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及C6 － 10 芳基所組成之群組。
[14] 如[2]、[4]及[7]～[11]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是二環式雜環基，其選自由2,3,4,5-四氫-1H-1-苯并氮雜環庚三烯基(2,3,4,5-tetrahydro-1H-1-benzoazepinyl)、苯并氧雜環己烷基(苯并噁烷基，benzoxanyl)、吲哚啉基、異吲哚啉基、呔[口井]基(phthalazinyl)、苯并二氫哌喃基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、嘧啶基、苯并噻唑基、喹啉基、異苯并二氫哌喃基及苯并三唑基所組成之群組，並且該二環式雜環基可經適當地取代。
[15] 如[2]、[4]、[7]～[11]及[14]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是可經1～5個相同或不同的下述取代基取代的二環式雜環基，該等取代基是選自由C6 － 10 芳基、C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及氧基所組成之群組。
[16] 如[2]、[4]、[7]～[11]、[14]及[15]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是選自下述式的二環式雜環基：
Figure 02_image003
，及，
Figure 02_image005
；該二環式雜環基可經1個苯基取代。
[17] 如[2]～[4]、[7]～[16]及[13-1]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii)可經1～3個選自由甲基、苯甲基、氰基及苯基所組成之群組中的相同或不同的取代基取代的C1 － 4 伸烷基(例如C1 － 3 伸烷基)；或 (iii)－CO－CH2 －(CO與A進行鍵結)。 [17-1] 如[2]～[4]、[7]～[16]及[13-1]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii)可經1個甲基、1個苯甲基、1個氰基及/或1或2個苯基取代的C1 － 4 伸烷基(例如C1 － 3 伸烷基)；或 (iii)－CO－CH2 －(其CO與A進行鍵結)。
[18] 如[12]所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii)可經1～3個選自由甲基、苯甲基、氰基及苯基所組成之群組中的相同或不同的取代基取代的C1 － 4 伸烷基(例如C1 － 3 伸烷基)；或 (iii)－CO－(CH2) －(CO與A進行鍵結)。 [18-1] 如[12]所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii) 可經1個甲基、1個苯甲基、1個氰基及/或1或2個苯基取代的C1 － 4 伸烷基(例如C1 － 3 伸烷基)；或 (iii)－CO－(CH2) －(CO與A進行鍵結)。
[19] 如[2]～[4]、[7]～[18]、[13-1]、[17-1]及[18-1]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，X是單鍵。
[20] 如[16]所述之胜肽精製方法，其中，X是單鍵。
[21] 如[1]～[20]、[1-1]～[1-7]、[13-1]、[17-1]及[18-1]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該磺酸化合物選自由下述式：
Figure 108128238-A0304-0001
Figure 02_image039
Figure 108128238-A0304-0002
[22] 如[1]～[21]、[1-1]～[1-7]、[13-1]、[17-1]及[18-1]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，進一步包含將該磺酸化合物去除的步驟。
[23] 如[1]～[22]、[1-1]～[1-7]、[13-1]、[17-1]及[18-1]中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該方法用以使目標胜肽的相對於類似胜肽的莫耳比提升。
[24] 一種製造目標胜肽的方法，該方法包含了[1]～[23]、[1-1]～[1-7]、[13-1]、[17-1]及[18-1]中任一項所述之胜肽精製方法。
[25] 一種藥劑，其含有目標胜肽，該目標胜肽是藉由包含了[1]～[23]、[1-1]～[1-7]、[13-1]、[17-1]及[18-1]中任一項所述之胜肽精製方法之方法所精製而成。
[26] 一種試劑，其含有磺酸化合物，該試劑是用以使用於[1]～[23]、[1-1]～[1-7]、[13-1]、[17-1]及[18-1]中任一項所述之胜肽精製方法中。
[27] 一種化合物，其選自下述式：
Figure 02_image060
、
Figure 02_image062
、
Figure 02_image064
、
Figure 02_image066
、
Figure 02_image068
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
及
Figure 02_image059
。
[28] 一種藥劑，其含有從藉由胜肽合成所獲得的胜肽所精製而得的目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該精製包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體。 [28-1] 一種藥劑，其含有從藉由胜肽合成所獲得的胜肽所精製而得的目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該精製包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合；及， 步驟(2)，其從液相將所獲得的固形物進行分離。
[29] 一種試劑，其含有磺酸化合物，該磺酸化合物是用以使用於從藉由胜肽合成所獲得的胜肽精製目標胜肽的方法，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體。 [29-1] 一種試劑，其含有磺酸化合物，該磺酸化合物是用以使用於從藉由胜肽合成所獲得的胜肽精製目標胜肽的方法，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合；及， 步驟(2)，其從液相將所獲得的固形物進行分離。 [發明的效果]
根據本發明，可提供一種胜肽，其提升了目標胜肽的純度，並且該胜肽來自可包含藉由合成所獲得的類似胜肽之胜肽。
在一態樣中，本發明提供一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體。 在一態樣中，本發明提供一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合；及， 步驟(2)，其從液相將所獲得的固形物進行分離。
在本說明書中，所謂「進行精製」，意指提升某一物質的純度。此處，所謂純度，有時意指絕對純度(相對於包含被設為對象的物質之混合物的總量，該物質的量)，有時也意指相對純度(相對於被包含在某一混合物中的其他物質(例如雜質)的量，被設為對象的物質的量)。
例如，在本說明書中針對「精製目標胜肽」包含下述情況：被包含在與磺酸化合物混合前的合成胜肽中的目標胜肽相對於該合成胜肽的總量的量(例如重量%)，相比於被包含在與磺酸化合物混合後的重量中的目標胜肽相對於該重量的量(例如重量%)有所提升，該重量是從與磺酸化合物混合後所獲得的固形物去除相當於磺酸化合物而得者。在本說明書中，針對「精製目標胜肽」，例如包含下述情況：相比於與磺酸化合物混合前，該混合後所獲得的固形物中的目標胜肽相對於類似胜肽的莫耳比有所提升。
在本說明書中，目標胜肽的純度測定方法並無特別限定，可藉由通常使用的方法(例如HPLC(High performance liquid chromatography，高效液相層析)法)來測定。
在本說明書中，所謂「胜肽合成」，只要是可合成胜肽的方法即可，並無特別限定，例如可列舉有機化學性合成法(例如固相合成法和液相合成法)及發酵法，並且能夠藉由通常的方法來實行。針對胜肽合成，通常會設定為可抑制雜質(例如類似胜肽)的產生的合成條件(例如，在有機化學性合成法中是設定樹脂、保護基、反應溫度、反應時間、溶劑；在發酵法中則是設定培養條件、寄主、載體、鹼基序列等)。在本說明書中，胜肽合成較佳亦為：基於本發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知的知識，來設定可抑制類似胜肽的產生的合成條件；並且在藉由胜肽合成所獲得的胜肽中，較佳是目標胜肽的物質量多於類似胜肽的物質量。
例如，在藉由胜肽合成所獲得的胜肽中，該類似胜肽相對於該目標胜肽的莫耳比也就是類似胜肽/目標胜肽是0.7以下(較佳是0.6以下，更佳是0.5以下，進一步較佳是0.45以下，進一步更佳是0.4以下，最佳是0.2以下)。較佳是該類似胜肽相對於該目標胜肽的莫耳比低，其下限並沒有特別限定，但是例如可列舉0.0001～0.7、0.001～0.6、0.01～05的範圍作為該莫耳比的範圍的例子。該莫耳比，例如可使用作為莫耳比的近似值被算出的數值，該數值是依據HPLC法所獲得的數值(例如面積比)所算出。
在利用胜肽合成所獲得的胜肽中，所謂「目標胜肽的物質量多於類似胜肽的物質量」，意指目標胜肽的物質量多於某一種類似胜肽的物質量，當包含有複數種的類似胜肽時，意指分別與各類似胜肽的物質量相比，目標胜肽的物質量仍較多。在藉由胜肽合成所獲得的胜肽中，所謂「目標胜肽的物質量多於類似胜肽的物質量」，可藉由下述方式來表示：在藉由該胜肽合成所獲得的胜肽總量中的目標胜肽的量(絕對純度)較多(例如，藉由胜肽合成所獲得的胜肽中的目標胜肽的濃度是40重量%以上、50重量%以上、60重量%以上、70重量%以上、80重量%以上及90重量%以上)；或，在該藉由胜肽合成所獲得的胜肽中，類似胜肽的物質量低於目標胜肽的物質量的或然性極高。
在本說明書中，所謂「目標胜肽」，意指目的在於藉由胜肽合成來生成並從而被生成的胜肽，並且該目標胜肽的結構，並無特別限定，只要是下述情況即可：其N末端為游離基、或具有至少1個(例如1～5個、1～4個、1～3個、1～2個及1個)鹼性胺基酸殘基、或其N末端為游離基且具有至少1個(例如1～5個、1～4個、1～3個、1～2個及1個)鹼性胺基酸殘基。目標胜肽較佳是具有5～31個胺基酸殘基，更佳是5～25個，進一步較佳是5～20個，進一步更佳是5～15個。目標胜肽的胺基酸殘基數的範圍，可藉由下述下限值與上限值的組合來表示，該下限值是選自5、6、7及8，該上限值是選自31、25、20、15及10。
可包含在目標胜肽中的胺基酸殘基，除了構成常見蛋白質的下表的20種胺基酸(除了不具不對稱碳原子之甘胺酸以外皆是左式)之外，可以是源自存在於天然環境下的胺基酸的胺基酸殘基，也可以是源自非天然胺基酸的胺基酸殘基，該存在於天然環境下的胺基酸是L-硒半胱胺酸、2-胺異丁酸、D-異纈胺酸、L-異纈胺酸、L-正白胺酸、L-鳥胺酸等，該非天然胺基酸不存在於天然環境且或即便存在也呈微量(因此通常是藉由化學合成等來製造)。 作為非天然胺基酸的例子，可列舉：除了甘胺酸以外的下表所示的19種胺基酸的左式；下表所示的20種胺基酸的N-甲基體(例如N-甲基甘胺酸、L-N-甲基苯丙胺酸)與除了N-甲基甘胺酸以外的19種胺基酸L-N-甲基體的鏡像異構物；除了甘胺酸與丙胺酸以外的下表所示的18種胺基酸的α-甲基體的兩鏡像異構物(例如α-甲基離胺酸)；除了丙胺酸以外的下表所示的19種的胺基酸的α-乙基體的兩鏡像異構物； D-硒半胱胺酸； D-正白胺酸； D-鳥胺酸； (S)( Sinister，左旋)-或(R)(Rectus，右旋)-2,3-二胺基丙酸； (S)-或(R)-2,4-二胺基丁酸； (S)-或(R)-焦麩胺酸； (S)-或(R)-α-甲基鄰氟苯丙胺酸； (S)-或(R)-α-(4-戊烯基)丙胺酸； (S)-或(R)-α-(7-辛烯基)丙胺酸； (S)-或(R)-α-炔丙基丙胺酸； (S)-或(R)-α-烯丙基丙胺酸； (S)-或(R)-氫化茚-2-基甘胺酸； (S)-或(R)-吡啶-3-基甲基甘胺酸、及在其吡啶環上可經烷基取代且可經苯基取代的衍生物； (S)-或(R)-吡啶-2-基甲基甘胺酸； (S)-或(R)-2-哌啶甲酸； (S)-或(R)-和順式或反式-4-羥脯胺酸； RC8((R)-α-(7-辛烯基)丙胺酸); SC5((S)-α-(4-戊烯基)丙胺酸)。
Figure 108128238-A0304-0003
在本說明書中，所謂鹼性胺基酸殘基，意指源自下述胺基酸的胺基酸殘基，該胺基酸不但具有胺基且具有表現鹼性的殘基(例如：D-或L-離胺酸、D-或L-精胺酸、D-或L-組胺酸、D-或L-鳥胺酸、(S)-或(R)-2,3-二胺基丙酸及(S)-或(R)-2,4-二胺基丁酸)。
在本說明書中，目標胜肽在胜肽合成時，其末端可以被通常使用的保護基等所修飾(例如，N末端以Ac基(乙醯基)、Fmoc基(9-茀甲氧基羰基，9-fluorenylmethyloxycarbonyl)或Boc基(三級丁氧基羰基)修飾；C末端以醯胺基或酯基修飾)。
在本說明書中，所謂「類似胜肽」，意指下述胜肽：其可藉由用以生成目標胜肽的胜肽合成所生成，並且不是目標胜肽。作為類似胜肽的例子，可列舉下述胜肽： (1)被包含在目標胜肽的部分胺基酸殘基(例如，連續或不連續的1～3個胺基酸殘基、連續或不連續的1～2個胺基酸殘基及1個胺基酸殘基)重複者； (2)被包含在目標胜肽的部分胺基酸殘基(例如，連續或不連續的1～3個胺基酸殘基、連續或不連續的1～2個胺基酸殘基及1個胺基酸殘基)缺失者； (3)被包含在目標胜肽的部分胺基酸殘基(例如，連續或不連續的1～3個胺基酸殘基、連續或不連續的1～2個胺基酸殘基及1個胺基酸殘基)經表異構化(例如，藉由N-保護胺基酸的α-位異構化進行的表異構化)而成者；及/或， (4)被包含在目標胜肽的部分胺基酸殘基(例如，連續或不連續的1～3個胺基酸殘基、連續或不連續的1～2個胺基酸殘基及1個胺基酸殘基)被相同數量的胺基酸殘基取代者。
類似胜肽的胺基酸殘基數，例如可以是與目標胜肽的胺基酸殘基數為相同數量、或多於1～3個(較佳是1～2個，更佳是1個)、或少於1～3個(較佳是1～2個，更佳是1個)。
「類似胜肽」，可以具有鹼性部分(其N末端為游離基/具有至少1個(例如1～5個、1～4個、1～3個、1～2個及1個)鹼性胺基酸殘基)，亦可以不具有這樣的鹼性部分。本發明的效果並未限定於特定的機制，只要如同上述，在藉由胜肽合成所獲得的胜肽中，相比於類似胜肽的量目標胜肽的量(物質量)通常較多，並且目標胜肽與類似胜肽的結構相似的情況，因為兩者相對於溶劑的溶解特性通常是相似的，所以當「類似胜肽」具有鹼性部分時，雖然會與目標胜肽同樣地和磺酸化合物形成鹽而成為固體，但是在與磺酸化合物混合後所獲得的固形物中，仍可提升原本就比類似胜肽含量多的目標胜肽的比例。
在本說明書中，與磺酸化合物混合時所使用的溶劑並無特別限定，可考慮目標胜肽的精製效率來適當選擇。例如，該溶劑是含有下述成分： 水； 醇類化合物(例如，C1-4 醇(例如，異丙醇、甲醇、乙醇))； 乙腈； 醚類化合物(例如，C2-6 醚(例如，二乙醚、MTBE(methyl tert-butyl ether，甲基第三丁基醚)、四氫呋喃、1,4-二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷、CPME(環戊基甲基醚)))； 酮類化合物(例如，C3-6 酮(例如丙酮)、MEK(甲基乙基酮)、甲基異丙基酮、MIBK(甲基異丁基酮))； 酯類化合物(例如，C3-6 酯(例如，乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸三級丁酯))； 烴化合物(例如C6-9 烴(例如甲苯))； DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲亞碸)； 醯胺化合物(例如，DMF(N,N-二甲基甲醯胺)、DMA(N,N-二甲基乙醯胺)、NMP(N-甲基吡咯啶酮))； 鹵化烴(例如，三氯甲烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷)；或， 該等的混合(此處，該混合意指組合)。該溶劑亦可進一步包含其他物質。 進一步，作為溶劑的例子，可列舉：水、異丙醇(IPA)、甲醇(MeOH)、1,4-二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷(DME)、四氫呋喃(THF)、丙酮、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、MTBE、DMSO、二乙醚及該等的混合(此處，該混合意指組合)，並且該溶劑亦可進一步含有其他物質。
在溶劑的存在下，將藉由胜肽合成所獲得的胜肽與磺酸化合物混合時，此時的溶劑相對於該胜肽的量、磺酸化合物相對於該胜肽的量並無特別限定，可考慮目標胜肽的精製效率來適當選擇。例如，以重量比為基準計，相對於藉由胜肽合成所獲得的胜肽1(可以是理論值)，溶劑可在1～100000的範圍內使用，較佳是1～10000，更佳是1～2000，進一步較佳是10～1000。 例如，相對於目標胜肽的莫耳比(可以是理論值)，磺酸化合物是0.1～50，較佳是0.2～40，進一步較佳是0.3～30，進一步更佳是0.5～20。進一步，相對於目標胜肽的莫耳比(可以是理論值)，當是下述情況時，磺酸化合物可在下述範圍內使用：磺酸化合物具有1個磺基時，例如是0.5～20，較佳是0.8～10，進一步較佳是1～8，進一步更佳是1.5～7；具有2個磺基時，例如是0.2～10，較佳是0.4～5，進一步較佳是0.5～4，進一步更佳是0.75～3.5；具有3個磺基時，例如是0.15～6，較佳是0.3～3.3，進一步較佳是0.4～2.6，進一步更佳是0.5～2.3。 此處，所謂理論值，可意指將胜肽合成產物中的目標胜肽的純度設為100%時所算出的數值。
在與磺酸化合物混合後，自液相將固形物進行分離(固液分離)的方法，並無特別限定，可依據製造規模來適當選擇，例如可列舉：過濾、離心分離、傾析等方法。 為了經由固液平衡來提高固體中的目標胜肽的純度，固液分離較佳是：在將所合成出的胜肽與磺酸化合物和溶劑混合後，經過特定時間(例如，1分鐘以上、2分鐘以上、3分鐘以上、4分鐘以上、5分鐘以上、10分鐘以上、30分鐘以上、1小時以上、2小時以上、3小時以上)後再實行固液分離。考慮作業效率，例如較佳是在1天以內、2天以內、1星期以內、2星期以內來實行固液分離，但是亦可以將混合物保存起來而不進行固液分離，再適當地實行固液分離。
混合磺酸化合物及/或溶劑時、及自液相將所獲得的固形物進行分離(固液分離)時，其溫度並無特別限定，例如可考慮目標胜肽的精製效率來適當選擇。例如可列舉：0～50℃、0～40℃、0～30℃、10～25℃。 固液分離後的固形物可以適當地洗淨。用於洗淨的液體(洗淨液)並無特別限定，可考慮目標胜肽的精製效率來適當選擇。 例如，該洗淨液可含有： 水； 醇類化合物(例如，C1-4 醇(例如，異丙醇、甲醇、乙醇))； 乙腈； 醚類化合物(例如，C2-6 醚(例如，二乙醚、MTBE、四氫呋喃、1,4-二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷、CPME(環戊基甲基醚))； 酮類化合物(例如，C3-6 酮(例如丙酮)、MEK(甲基乙基酮)、甲基異丙基酮、MIBK(甲基異丁基酮))； 酯類化合物(例如，C3-6 酯類(例如，乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸三級丁酯))； 烴化合物(例如C6-9 烴(例如甲苯))； DMSO； 醯胺化合物(例如，DMF(N,N-二甲基甲醯胺)、DMA(N,N-二甲基乙醯胺)、NMP(N-甲基吡咯啶酮))； 鹵化烴(例如，三氯甲烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷)；或， 該等的混合(此處，該混合意指組合)。該洗淨液亦可進一步含有其他物質。
對於利用本發明的精製方法所獲得的固形物重覆進行本發明的精製方法，可列舉本發明的精製方法的一實施態樣。藉由重覆本發明的精製方法，能夠提升目標胜肽的純度。
本發明的精製方法亦可以組合其他精製方法(例如分離HPLC、再結晶、分散洗淨)來實行。例如，可以將利用本發明的方法所獲得的固形物供以其他精製方法使用，或者可將預先利用其他精製方法所精製而成的胜肽供以本發明的精製方法使用。
利用本發明的精製方法所獲得的固形物，較佳是在進一步的精製步驟中從該固形物中去除磺酸化合物。去除磺酸化合物的方法並無特別限定，可藉由通常用以去除磺酸化合物的方法，例如使用酸處理、鹼處理或離子交換樹脂的去除法來實行。
在本說明書中，所謂的磺酸化合物，意指具有磺基(－SO3 H)之有機化合物。在本說明書中的磺酸化合物，較佳是：磺基是隔著單鍵或較短的(例如C1 － 12 、C1 － 6 、C1 － 4 等)連結鍵，鍵結在具有1個以上的不飽和鍵之部位。
例如，作為磺酸化合物的較佳例，可列舉：式(I)的磺酸化合物。
Figure 02_image074
(I) 式(I)中， A是可經取代的C6 － 14 芳基(例如C6 － 13 芳基、C6 － 10 芳基)、可經取代的二環式雜環基、C2 － 3 烯基或C2 － 3 炔基； X是(i)單鍵、(ii)可經取代的C1 － 6 伸烷基(例如C1 － 5 伸烷基、C1 － 4 伸烷基)、(iii)－CO－(CH2 )n －(CO與A進行鍵結)、或(iv)C2 － 4 伸烯基，並且，n是1～3的整數。
在本說明書中，所謂「C6 － 14 芳基(包含構成某一基團的部分的情況)」，意指：六員～十四員的單環、二環或三環芳香族烴環基、或者在該芳香族烴環基中縮合有一個環烷烴(cycloalkane)之環基。作為C6 － 14 芳基的例子，可列舉：苯基、萘基、二氫茚基、四氫萘基、茀基。 在本說明書中，所謂「C6 － 10 芳基(包含構成某一基團的部分的情況)」，意指：六員～十員的單環或二環芳香族烴環基、或者在該芳香族烴環基中縮合有一個環烷烴之環基。作為C6 － 10 芳基的例子，可列舉：苯基、萘基、二氫茚基、四氫萘基。
作為「可經取代的C6 － 14 芳基(或C6 － 13 芳基、C6 － 10 芳基)」的例子，可列舉下述C6 － 14 芳基(或C6 － 13 芳基、C6 － 10 芳基)，其可經1～5個(例如1～3個、1～2個及1個)相同或相異的取代基取代，該取代基選自由C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及C6 － 10 芳基所組成之群組。
在本說明書中，所謂「二環式雜環基」，意指下述八員～十一員的二環基，其是在單環芳香族環(苯、吡啶等)上縮合有單環芳香環(吡啶、呋喃、噻吩、咪唑、嘧啶、噁唑、噻唑、噻嗪、三唑)或單環非芳香族環(四氫哌喃、氮[口+半](azepane)、哌啶等)而成，該等單環芳香族環和單環非芳香族環具有1～4個選自氮原子、氧原子及硫原子的雜原子。二環式雜環基能夠以任意且可產生穩定的結構之雜原子或碳原子鍵結。二環式雜環基可包含1個以上(例如1個、2個)的氧基，作為二環式雜環基的例子，可列舉：
Figure 02_image075
Figure 02_image076
2,3,4,5-四氫-1H-1-苯并氮雜環庚三烯基、苯并氧雜環己烷基、吲哚啉基、異吲哚啉基、呔[口井]基、苯并二氫哌喃基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、嘧啶基、苯并噻唑基、喹啉基、異苯并二氫哌喃基及苯并三唑基。
在本說明書中，作為「可經取代的二環式雜環基」，可列舉可經1～5個(例如1～3個、1～2個及1個)相同或不同的下述取代基取代的二環式雜環基，該取代基是選自由C6 － 10 芳基、C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及氧基所組成之群組。
在本說明書中，所謂「C2 － 3 烯基」，意指具有碳數2～3個並包含1或2個雙鍵之鏈狀或支鏈狀的不飽和烴基，例如可列舉：乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、丙二烯基。
在本說明書中，所謂「C2 － 3 炔基」，意指具有碳數2～3個並包含1個三鍵之鏈狀或支鏈狀的不飽和烴基，例如可列舉：乙炔、丙炔(1-丙炔、2-丙炔)。
在本說明書中，所謂「C1 － 4 伸烷基」，意指源自直鏈C1 － 4 烷基的二價基團。作為C1 － 4 伸烷基的例子，可列舉：亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基。 在本說明書中，所謂「C1 － 6 伸烷基」，意指源自直鏈C1 － 6 烷基的二價基團。作為C1 － 6 伸烷基的例子，可列舉：亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基。 在本說明書中，所謂「C1 － 3 伸烷基」，意指源自直鏈C1 － 3 烷基的二價基團。作為C1 － 3 伸烷基的例子，可列舉：亞甲基、伸乙基、伸丙基。
在本說明書中，作為「可經取代的C1 － 6 伸烷基(或C1 － 5 伸烷基、C1 － 4 伸烷基、C1 － 3 伸烷基)」的例子，可列舉下述C1 － 6 伸烷基(或C1 － 5 伸烷基、C1 － 4 伸烷基、C1 － 3 伸烷基)，其可經1～3個選自由甲基、苯甲基、氰基及苯基所組成之群組中的相同或不同的取代基取代(例如可經1個甲基、1個苯甲基或1個苯基取代)。
在本說明書的「－CO－(CH2 )n －」中，n是1～3(較佳是1～2)的整數，作為－CO－(CH2 )n －的較佳例可列舉－CO－CH2 －。
在本說明書中，所謂「C2 － 4 伸烯基」，意指源自C2 － 4 烯基的二價基團。在本說明書中，所謂「C2 － 3 伸烯基」，意指源自C2 － 3 烯基的二價基團。作為C2 － 4 伸烯基和C2 － 3 伸烯基的例子，可列舉伸乙烯基(－ CH ＝ CH － )、伸丙烯基(－ CH 2 CH ＝ CH － )。
在本說明書中，所謂「C1 － 4 烷基(包含構成某一基團的部分的情況)」，意指具有碳數1～4個且為直鏈狀或支鏈狀的飽和烴基。作為C1 － 4 烷基的例子，可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基。 在本說明書中，所謂「C1 － 3 烷基(包含構成某一基團的部分的情況)」，意指具有碳數1～3個且為直鏈狀或支鏈狀的飽和烴基。作為C1 － 3 烷基的例子，可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基。
在本說明書中，作為「－CO－C6 － 10 芳基」的例子，可列舉：－CO－苯基。
在本說明書中，作為鹵素的例子，可列舉：氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
作為磺酸化合物進一步較佳的例子，可列舉上述[21]所列出的化合物。
在本說明書的一態樣中，可提供一種製造目標胜肽的方法，其包含本發明的精製方法。
在本說明書的一態樣中，可提供一種製劑，其含有藉由包含本發明的精製方法之方法所精製而成的目標胜肽。該製劑可藉由通常的方法來製造。
在本說明書的一態樣中，可提供一種製劑，其含有磺酸化合物，該製劑用以使用於本發明的精製方法中。該製劑可藉由通常的方法來製造。 [實施例]
以下，列舉試驗例來說明本發明，但是本發明並未限定於該等試驗例。
[目標胜肽的精製]
評價方法的概要： 當利用固相合成法合成目標胜肽時，可預期所獲得的原態的胜肽會混有作為雜質的類似胜肽，但是難以鑑定出實際上含有哪種類似胜肽。因此，藉由固相合成法各自合成出目標胜肽與相當於類似胜肽且具有已知序列的擬態類似胜肽，使所獲得的原態的目標胜肽、原態的擬態類似胜肽及各種酸化合物溶解於溶劑中(這是為了獲得均勻且可用以測定處理前的值(HPLC)的樣品)，之後為了去除該溶劑進行冷凍乾燥。繼而，自在殘渣中添加溶劑所獲得的固液混合物去除上清液，針對所獲得的固體，測定其目標胜肽的物質量(mol，莫耳)相對於目標胜肽與擬態類似胜肽的物質量(mol)的合計的比例，並基於其變化，來評價在該固體中是否已精製出目標胜肽。
(1-1：胜肽的合成) 利用說明於以下的固相合成法來分別合成下表所示的目標胜肽和類似胜肽(擬態)。 [表1-1]
Figure 108128238-A0304-0004
 [表1-2]
Figure 108128238-A0304-0005
使用於實施例的裝置如同下述。 ‧胜肽合成裝置：國產化學公司製造的「KMS-3」。 ‧質量分析裝置：安捷倫科技股份有限公司製造的「6224 TOF LC/MS」及「1260 Infinity series」。其離子化條件是ESI(毛細管電壓：3500V，分段電壓：100V)。 ‧HPLC分析裝置：島津製作所公司製造的「SPD-M20A」、「LC-20AD」、「SIL-20AC」、「DGU-20A」、「CTO-20AC」、「CBM-20A」、或島津製作所公司製造的「SPD-M20A」、「LC-2010C」，或安捷倫科技股份有限公司製造的「1200 series」。
(1)保護胜肽樹脂的合成 在保護胜肽樹脂的合成中，使用了下述胺基酸：各構成胺基酸的全部的α-胺基以9-茀甲氧基羰基(Fmoc基)保護，並且在活性的側鏈中，天門冬胺酸的β-羧基及麩胺酸的γ-羧基以三級丁基(tBu基)保護，精胺酸的胍基以2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氫苯并呋喃-5-磺醯基(Pbf基)保護，絲胺酸和蘇胺酸的羥基以三級丁基(tBu基)保護，半胱胺酸的巰基和組胺酸的咪唑基以三苯甲基(Trt基)保護，酪胺酸的酚性羥基以三級丁基(tBu)保護，天門冬醯胺和麩醯胺的羰醯胺基以三苯甲基(Trt基)保護，離胺酸的ε-胺基、Dap(二氨基庚二酸)的β-胺基及色胺酸的吲哚基以三級丁氧羰基(Boc基)保護。
作為樹脂，當C末端要合成羧酸的胜肽序列時，使用2-氯三苯甲基氯樹脂(渡邊化學公司製造，約1.6mmol/g)，當C末端要合成羰醯胺的胜肽序列時，使用Fmoc－NH－SAL樹脂(渡邊化學公司製造，約0.43mmol/g)。當C末端要合成羧酸的胜肽序列時，對樹脂加入2.5當量的Fmoc胺基酸的DMF溶液及2.5當量的N,N-二異丙基乙胺，並藉由震盪攪拌2小時以上來導入C末端的胺基酸。當C末端要合成羰醯胺的胜肽序列時，為了去除與樹脂鍵結的Fmoc基，加入20%哌啶DMF溶液，震盪攪拌10分鐘以上後，以DMF洗淨樹脂3次～5次，並對於樹脂添加2.5當量的Fmoc胺基酸的DMF溶液、2.5當量的1-羥基苯并三唑的DMF溶液及2.5當量的DIC，藉由震盪攪拌40分鐘以上來導入C末端的胺基酸。
C末端的胺基酸被導入樹脂之後，以DMF洗淨樹脂3次～5次來去除過剩量的試藥後，以20%哌啶DMF溶液在室溫下震盪攪拌10分鐘以上，藉此來去除末端胺基酸的保護基也就是Fmoc基。以DMF洗淨樹脂3次～5次來去除哌啶，繼而與位於目標胜肽的胺基酸序列中的下一位置的胺基酸之Fmoc保護衍生物中的羧基進行縮合。在該保護胺基酸的縮合中，藉由對樹脂添加2.5當量的Fmoc胺基酸的DMF溶液、2.5當量的1-羥基苯并三唑的DMF溶液及2.5當量的DIC來進行縮合。重覆同樣的Fmoc基的去除和Fmoc胺基酸的縮合反應直到完成目標胜肽的胺基酸序列為止，而合成出具有目標胜肽的胺基酸序列之保護胜肽樹脂。
當N末端要合成游離的胺基的胜肽時，將N末端的Fmoc胺基酸縮合後，以20%哌啶DMF溶液在室溫下震盪攪拌10分鐘以上，藉此來去除Fmoc基後，以DMF洗淨樹脂3次～5次去除哌啶，來完成保護胜肽樹脂的合成。當合成N末端以Ac基保護的胜肽序列時，與上述方法同樣地將N末端作成游離的胺基後，藉由添加5當量的乙酸、4.95當量的N-羥基丁二酸的DMF溶液及5當量的DIC來進行縮合，而合成出N-末端導入有Ac基且具有目標胜肽的胺基酸序列之保護胜肽樹脂。N末端的胺基酸殘基是(S)-或(R)-焦麩胺酸時，使用5當量的氯化(S)-或(R)-Fmoc-焦麩胺酸與10當量的吡啶來作為N末端的Fmoc胺基酸，震盪攪拌40分鐘以上使其縮合後，以20%哌啶DMF溶液在室溫下震盪攪拌10分鐘以上，藉此來去除Fmoc基，之後，以DMF洗淨樹脂3次～5次來去除哌啶，而完成保護胜肽樹脂的合成。
(2)原態的胜肽生成物的合成 在原態的胜肽生成物的合成中，以酸處理上述合成出的具有目標胜肽的胺基酸序列之保護胜肽樹脂，藉此來實行去保護並自樹脂切割出目標胜肽。當目標胜肽的胜肽序列包含半胱胺酸和甲硫胺酸這樣具有硫原子之胺基酸時，使用TFA/水/乙二硫醇/TIS(94/2.5/2.5/1)，在冰浴～室溫下震盪攪拌30分鐘以上，藉此來實行去保護並自樹脂切割出目標胜肽。當目標胜肽的胜肽序列不包含半胱胺酸和甲硫胺酸這樣具有硫原子之胺基酸時，使用TFA/水/TIS(95/2.5/2.5)，在冰浴～室溫下震盪攪拌30分鐘以上，藉此來實行去保護並自樹脂切割出目標胜肽。反應完成後，過濾樹脂並以去保護溶液洗淨樹脂3次～5次之後，混合洗淨液與濾液，利用蒸餾器進行濃縮。藉由在殘渣中添加MTBE並將所析出的沉澱過濾或離心分離來進行固液分離，並實行複數次MTBE洗淨，藉此來合成原態的目標胜肽生成物。
(8)H－YERAKSNM－OH的製造方法(方法A)
(1)在胜肽合成裝置「KMS-3」附屬的PP製的管柱中添加187.5mg(0.30mmol)的2-氯三苯甲基氯樹脂(渡邊化學公司製造，約1.6mmol/g)並添加5mL的DMF後，震盪攪拌一晚。以真空過濾去除DMF後，添加2mL(0.75mmol，2.5當量)的Fmoc－Met－OH的DMF溶液(375mM)及128μL(0.75mmol，2.5當量)的N,N-二異丙基乙胺及1mL的DMF，震盪攪拌6小時。以真空過濾去除反應液後，以3mL的DMF進行5次洗淨。添加3mL的20%哌啶DMF溶液，震盪攪拌35分鐘。進行真空過濾，以3mL的DMF進行洗淨5次。
(2)添加2mL(0.75mmol，2.5當量)的Fmoc－Asn(Trt)－OH的DMF溶液(375mM)、1mL(0.75mmol，2.5當量)的1-羥基苯并三唑的DMF溶液(750mM)及116μL(0.75mmol，2.5當量)的DIC，震盪攪拌一晚。以真空過濾去除反應液後，以3mL的DMF進行5次洗淨。添加3mL的20%哌啶DMF溶液，震盪攪拌35分鐘。進行真空過濾，以3mL的DMF進行洗淨5次。
(3)參照上述步驟(2)，依序鍵結以下的胺基酸。後續胺基酸的順序和反應時間依序為：Fmoc－Ser(tBu)－OH，20小時；Fmoc－Lys(Boc)－OH，45分鐘；Fmoc－Ala－OH，3小時；Fmoc－Arg(Pbf)－OH，16小時；Fmoc－Glu(tBu)－OH，2.5小時；及，Fmoc－Tyr(tBu)－OH，15小時。
(4)在冰浴中對合成出的保護胜肽樹脂添加3mL的去保護液(TFA/水/乙二硫醇/TIS＝94/2.5/2.5/1)，自冰浴取出，以其自然變化的溫度震盪攪拌3小時。過濾樹脂並以去保護溶液將樹脂洗淨3次後，混合洗淨液與濾液，利用蒸餾器濃縮。在殘渣中添加5mL的MTBE，在冰浴中攪拌一晚。將總量移入離心管後，以3000rpm使其進行離心沉澱1分鐘後，將上清液去除。實行3次下述操作：添加2mL的MTBE並震盪攪拌3分鐘後，以3000rpm使其進行離心沉澱1分鐘後，將上清液去除。將沉澱物進行減壓乾燥，來獲得179.5mg的原態的目標序列(H－YERAKSNM－OH)的胜肽生成物。藉由HPLC和ESI-TOF/MS機器的質量分析，來確認所獲得的原態的胜肽生成物。
ESI-MS:理論質量:[M+H]+ =998.47、實驗質量:(m／z):[M+H]+ =998.4739。
HPLC條件(條件A) 管柱：YMC-TriartC18 3μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.7mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm(僅在分析[表14-2]的目標胜肽(8)與類似胜肽(22)的分析時)或274nm。 梯度：2%B(0分鐘)→2%B(0.2分鐘)→6.4%B(0.5分鐘)→6.4%B(11分鐘)→95%B(15.5分鐘)→95%B(20.5分鐘)→2%B(20.6分鐘)→2%B(29分鐘)。 保持時間： 13.3分鐘左右。
(12)Ac－ALRAL－NH2 的製造方法(方法B)
(1)在胜肽合成裝置「KMS-3」附屬的PP製的管柱中添加348.8mg(0.15mmol)的Fmoc－NH－SAL樹脂(渡邊化學公司製造，約0.43mmol/g)並添加5mL的DMF後，震盪攪拌1分鐘，之後，靜置一晚。以真空過濾去除DMF後，添加3mL的20%哌啶DMF溶液，震盪攪拌35分鐘。進行真空過濾，以3mL的DMF進行洗淨5次。
(2)添加2mL(0.375mmol，2.5當量)的Fmoc－Leu－OH的DMF溶液(187.5mM)、1mL(0.375mmol，2.5當量)的1-羥基苯并三唑的DMF溶液(375mM)及58μμL(0.375mmol，2.5當量)的DIC，震盪攪拌3小時。以真空過濾去除反應液後，以3mL的DMF進行5次洗淨。添加3mL的20%哌啶DMF溶液，震盪攪拌35分鐘。進行真空過濾，以3mL的DMF進行洗淨5次。
(3)參照上述步驟(2)，依序鍵結以下的胺基酸。後續胺基酸的順序和反應時間依序為：Fmoc－Ala－OH，2.5小時；Fmoc－Arg(Pbf)－OH，15.5小時；Fmoc－Leu－OH，2.5小時；及，Fmoc－Ala－OH，2.5小時。在N末端合成游離胺基的保護胜肽樹脂後，添加3mL(0.744mmol，4.96當量)的N-羥基丁二酸的DMF溶液(248mM)、43μL(0.75mmol，5當量)乙酸及116μL(0.75mmol，5當量)的DIC進行震盪攪拌16小時。以真空過濾去除反應液後，以3mL的DMF進行5次洗淨，之後以3mL的MTBE進行3次洗淨。
(4)在冰浴中對合成出的保護胜肽樹脂添加3mL的去保護液(TFA/水/TIS＝95/2.5/2.5)，自冰浴取出，以其自然變化的溫度震盪攪拌4小時。過濾樹脂並以去保護溶液洗淨樹脂3次後，混合洗淨液與濾液，利用蒸餾器濃縮。在殘渣中添加5mL的MTBE，在冰浴中攪拌一晚。將總量移入離心管後，以3000rpm使其進行離心沉澱1分鐘後，將上清液去除。實行3次下述操作：添加2mL的MTBE並震盪攪拌3分鐘後，以3000rpm使其進行離心沉澱1分鐘後，將上清液去除。將沉澱物進行減壓乾燥，來獲得90.6mg的原態的目標序列(Ac－ALRAL－NH2 )的胜肽生成物。藉由HPLC和ESI-TOF/MS機器的質量分析來確認所獲得的原態的胜肽生成物。
ESI-MS:理論質量:[M+H]+ =584.39、實驗質量:(m／z):[M+H]+ =584.3879。
HPLC條件(條件B) 管柱：YMC-PackProC18 3μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：5%B(0分鐘)→5%B(5分鐘)→95%B(17分鐘)→5%B(17.1分鐘)→5%B(20.1分鐘)→5%B(24分鐘)。 滯留時間：10.6分鐘左右。
(1)Ac－YFYPEL－NH2 的製造方法
與方法B同樣地操作，依序使Fmoc－Leu－OH、Fmoc－Glu(tBu)－OH、Fmoc－Pro－OH、Fmoc－Tyr(tBu)－OH、Fmoc－Phe－OH、Fmoc－Tyr(tBu)－OH縮合在233mg(0.1mmol)的Fmoc－NH－SAL樹脂後，藉由N末端的游離的胺基進行Ac保護，而合成出保護胜肽樹脂。使用去保護液(TFA/水/TIS＝95/2.5/2.5)，自保護胜肽樹脂切割出保護胜肽，並藉由同一操作，獲得90.6mg原態的目標序列(Ac－YFYPEL－NH2 )的胜肽生成物。藉由HPLC和ESI-TOF/MS機器的質量分析來確認所獲得的原態的胜肽生成物。藉由HPLC和ESI-TOF/MS機器的質量分析來確認所獲得的原態的胜肽生成物。
ESI-MS:理論質量:[M+H]+ =872.42、實驗質量:(m／z):[M+H]+ =872.4203。
HPLC條件(條件C) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：20%B(0分鐘)→20%B(12分鐘)→95%B(15分鐘)→95%B(19分鐘)→20%B(20分鐘)→20%B(28分鐘)。 滯留時間：10.2分鐘左右。
使用上述方法A或B，藉由固相合成法各自合成出下表的目標胜肽。 HPLC的分析條件除了上述所示的HPLC條件(條件A～C)以外，使用以下所示的條件來進行分析。
HPLC條件(條件D) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：275nm。 梯度：15%B(0分鐘)→25%B(1分鐘)→25%B(12分鐘)→95%B(14.5分鐘)→95%B(17分鐘)→15%B(17.5分鐘)→15%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件E) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.7mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：20%B(0分鐘)→35%B(17分鐘)→95%B(18分鐘)→95%B(20分鐘)→20%B(20.5分鐘)→20%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件F) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：279nm。 梯度：36%B(0分鐘)→36%B(12.5分鐘)→95%B(13分鐘)→95%B(14.5分鐘)→36%B(15分鐘)→36%B(27分鐘)。
HPLC條件(條件G) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：281nm。 梯度：22%B(0分鐘)→25%B(2分鐘)→25%B(14分鐘)→95%B(17分鐘)→95%B(18.5分鐘)→22%B(19分鐘)→22%B(30分鐘)。
HPLC條件(條件H) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.65mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：2%B(0分鐘)→2%B(3分鐘)→5%B(12分鐘)→5%B(14分鐘)→8%B(16分鐘)→95%B(19分鐘)→95%B(19.9分鐘)→2%B(20分鐘)→2%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件I) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：23%B(0分鐘)→25%B(2分鐘)→25%B(10分鐘)→35%B(15分鐘)→95%B(17分鐘)→95%B(19分鐘)→23%B(20分鐘)→23%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件J) 管柱：Waters Atlantis T3 3μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：1.0mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：20%B(0分鐘)→20%B(12分鐘)→95%B(17分鐘)→95%B(19分鐘)→20%B(19.1分鐘)→20%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件K) 管柱：Waters Xbridge Phenyl 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：1.0mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：5%B(0分鐘)→5%B(3分鐘)→95%B(20分鐘)→5%B(20.1分鐘)→5%B(26分鐘)。
HPLC條件(條件L) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：28%B(0分鐘)→38%B(12分鐘)→95%B(15分鐘)→95%B(19分鐘)→28%B(20分鐘)→28%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件M) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.65mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度：4%B(0分鐘)→4%B(3分鐘)→7%B(8分鐘)→95%B(15分鐘)→95%B(15.9分鐘)→4%B(16分鐘)→4%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件N) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：1.0mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:0%B(0分鐘)→3%B(8分鐘)→95%B(25分鐘)→95%B(28分鐘)→0%B(28.5分鐘)→0%B(35分鐘)。
HPLC條件(條件O) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:25%B(0分鐘)→25%B(14分鐘)→95%B(17分鐘)→95%B(21分鐘)→0%B(22分鐘)→0%B(32分鐘)。
HPLC條件(條件P) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:20%B(0分鐘)→25%B(12分鐘)→25%B(14分鐘)→95%B(17分鐘)→95%B(18.5分鐘)→20%B(19分鐘)→20%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件Q) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:3%B(0分鐘)→5%B(5分鐘)→5%B(16分鐘)→95%B(17分鐘)→95%B(19分鐘)→3%B(19.1分鐘)→3%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件R) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.6mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：275nm。 梯度:11%B(0分鐘)→11%B(10分鐘)→20%B(12分鐘)→95%B(15分鐘)→95%B(17.5分鐘)→11%B(18分鐘)→11%B(28分鐘)。
HPLC條件(條件S) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.6mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：281nm。 梯度:29%B(0分鐘)→29%B(10分鐘)→40%B(12分鐘)→95%B(15分鐘)→95%B(17.5分鐘)→29%B(18分鐘)→29%B(28分鐘)。 HPLC條件(條件T) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.7mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：276nm。 梯度:10.5%B(0分鐘)→10.5%B(10分鐘)→95%B(14分鐘)→95%B(17分鐘)→10.5%B(17.1分鐘)→10.5%B(28分鐘)。 HPLC條件(條件U) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.65mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:15%B(0分鐘)→15%B(10分鐘)→30%B(12分鐘)→95%B(15分鐘)→95%B(17.5分鐘)→15%B(17.6分鐘)→15%B(29分鐘)。 HPLC條件(條件V) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：1mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:17%B(0分鐘)→17%B(12分鐘)→95%B(17分鐘)→ 95%B(19分鐘)→17%B(19.1分鐘)→ 17%B(26分鐘)。 HPLC條件(條件W) 管柱：YMC Triart C18 3μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:5%B(0分鐘)→95%B(17分鐘)→5%B(17.1分鐘)→5%B(23.5分鐘)。 HPLC條件(條件X) 管柱：YMC-Packpro C18RS 3μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.5mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度: 5%B(0分鐘)→95%B(12分鐘)→95%B(18分鐘)→ 5%B(18.5分鐘)→5%B(25分鐘)。 HPLC條件(條件Y) 管柱：YMC Triart C18 3μm、50×3.0mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.65mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:2%B(0分鐘)→2%B(6分鐘)→5%B(8分鐘)→8%B(16分鐘)→95%B(19分鐘)→95%B(22分鐘)→2%B(22.1分鐘)→2%B(28分鐘)。 HPLC條件(條件Z) 管柱：Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm。 溶析液：A＝0.1%TFA水溶液；B＝0.1%TFA乙腈。 流速：0.7mL/分鐘；溫度：30℃。 偵檢波長：205nm。 梯度:10%B(0分鐘)→10%B(0.2分鐘)→34%B(0.5分鐘)→34%B(14分鐘)→95%B(16分鐘)→95%B(19分鐘)→ 10%B(19.1分鐘)→10%B(29分鐘)。
[表2-1]
Figure 108128238-A0304-0006
[表2-2]
Figure 02_image077
[表2-3]
Figure 108128238-A0304-0007
同樣地使用上述方法，藉由固相合成法各自合成出下表的類似胜肽。
[表3-1]
Figure 108128238-A0304-0008
[表3-2]
Figure 02_image079
[表3-3]
Figure 02_image081
[表3-4]
Figure 108128238-A0304-0009
[1-2：酸化合物]
購入並使用以下的酸化合物。 硫酸：Nacalai Tesque Inc.公司製造，特級。 鹽酸：Nacalai Tesque Inc.公司製造，0.1N，特級。
Figure 02_image083
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image085
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image087
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image089
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image091
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image093
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image095
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image097
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image099
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image101
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image103
：Nacalai Tesque Inc.公司製造，特級。
Figure 02_image105
：和光純藥公司製造，特級。
Figure 02_image107
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image109
：Nacalai Tesque Inc.公司製造，一級。
Figure 02_image111
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image113
：東京化成工業股份有限公司製造。
Figure 02_image115
：東京化成工業股份有限公司製造。
以下所示的磺酸只要沒有特別記載，分別是藉由下述方式合成來使用：使對應的鹵化物與亞硫酸鈉進行方法，並利用鹽酸來將所獲得的磺酸鈉鹽作成酸性。 作為具體例，於以下說明對甲基苯甲磺酸也就是
Figure 02_image007
的合成。 將1.55g(7mmol)的對甲基苯甲基溴化物溶解於4mL的乙醇，並加入0.97g(7.7mmol，1.1當量)的亞硫酸鈉、8mL的水，進行加熱回流一晚。反應完成後，利用蒸餾器進行濃縮並去除乙醇後，過濾已析出的固體，而獲得1.09g的對甲基苯甲磺酸鈉鹽。對625mg的所獲得的固體添加1mL的濃鹽酸與1.5mL的水，攪拌一晚。過濾反應液，並以0.5mL的水洗淨2次，而獲得448mg的對甲基苯甲磺酸。1 H NMR (400 MHz, D2O)　7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.28 (s, 3H)。
Figure 02_image117
由對應於如下所述的醇化合物來合成。 1. 在50mL的三口燒瓶中倒入1.18g(6mmol)的9-茀甲醇，並使其溶解在9mL的乙酸乙酯後，利用冰浴冷卻至0℃。添加488μL(6.3mmol，1.05eq)氯化甲磺酸後，在內部溫度為0～10℃中滴下920μL(6.6mmol，1.05eq)三乙胺。在0℃中攪拌26小時後，添加10mL的水、10mL的MTBE來使反應中止。分液後，依序以15mL的飽和碳酸氫鈉水溶液、15mL的0.5M硫酸氫鈉水溶液、15mL的水將有機層洗淨。將洗淨後的有機層濃縮，獲得1.28g的9-茀甲氧基甲磺酸酯的原態體。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )　δ：7.78 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.43 (m, 4H), 4.50 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 2.91 (s, 3H)。 2. 在由上述所合成的原態體也就是1.28g的9-茀甲氧基甲磺酸酯中添加3mL的乙醇使其溶解後，添加7mL的水、1.01g(8mmol)的亞硫酸鈉。加熱並在內部溫度80℃的條件下攪拌90小時。反應完成後，利用蒸餾器進行濃縮並去除乙醇後，將已析出的固體過濾。在濾液中添加1mL的濃鹽酸，然後利用蒸餾器進行濃縮乾燥。在殘渣中添加2mL的水，使其懸浮1小時後，過濾再以0.5mL的水洗淨2次，獲得310mg的9-茀甲磺酸(（1 H NMR (400 MHz) (CD3 OD) 7.91 (d,J = 7.6 Hz, 2H), 7.78 (d,J = 7.6 Hz, 2H), 7.34 (m, 4H), 4.44 (t,J = 6.0 Hz, 1H), 3.28 (m, 2H)）)。 有關
Figure 02_image119
，亦與上述
Figure 02_image117
的合成同樣地操作，將805mg(6mmol)的2-茚醇作為原料，而合成出1.26g的2-二氫化茚基氧磺酸酯(1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )δ：7.22 (m, 4H), 5.53 (m, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.21 (m, 2H), 3.02 (s, 3H))，使用所獲得的1.26g的2-二氫化茚基氧磺酸酯，來獲得131mg的2-二氫化茚基磺酸(1 H NMR (400 MHz) (CD3 OD) 7.19 (m, 2H), 7.12 (m, 2H), 3.80 (m, 1H), 3.34 (m, 3H))。
依據上述的對甲基苯甲磺酸的合成方法，使用對應的鹵化物來合成下表的磺酸。
[表4-1]
Figure 02_image122
[表4-2]
Figure 02_image124
[表4-3]
Figure 02_image126
[表4-4]
Figure 02_image128
[表4-5]
Figure 02_image130
[表4-6]
Figure 02_image132
[表4-7]
Figure 02_image134
[表4-8]
Figure 02_image136
苯甲磺酸的合成
Figure 02_image138
在1.17g(10mmol)的苯甲基溴化物中添加10mL的乙醇、0.76g(10mmol)的硫脲，進行加熱回流一晚。利用TLC確認到原料消失後，利用蒸餾器進行濃縮乾燥。在殘渣中添加10mL乙腈使其溶解，利用冰浴進行冷卻。在冰浴的溫度中添加2mL(4mmol)的2N鹽酸、5.34g(40mmol)的N-氯琥珀醯亞胺，在室溫中攪拌1小時。利用蒸餾器將反應液濃縮，在殘渣中添加5mL的乙酸乙酯並進行分液後，利用蒸餾器將有機層進行濃縮。在殘渣中添加5mL的MTBE、5mL的庚烷，然後過濾出已析出的固體後，利用蒸餾器將濾液進行濃縮。利用矽凝膠管柱層析(矽凝膠：Fuji Silysia股份有限公司，PSQ-100B，50g；溶析液：己烷/乙酸乙酯＝20/1)將殘渣進行精製，而獲得0.64g氯化苯甲基磺酸。在0.59g的所獲得的氯化苯甲基磺酸中添加5.9mL的水，進行加熱回流5天。將反應液濃縮乾燥，並利用真空泵進行乾燥，獲得0.39g的苯甲基磺酸(1 H NMR (400 MHz, CD3OD)　7.42 (m, 2H), 7.28 (m, 3H), 4.05 (s, 2H))。
對羧基苯甲基磺酸的合成
Figure 02_image140
在0.50g的上述合成的對甲氧基羰基苯甲基磺酸中添加0.6mL的濃鹽酸、0.6mL的水，在90℃中加熱。在90℃中加熱攪拌一晚後，冷卻至室溫並將已析出的固體進行減壓過濾，藉此獲得0.37g的對羧基苯甲基磺酸(1 H NMR (400 MHz, CD3OD) 7.97 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.12 (s, 2H))。
簡稱的說明 TFA：三氟乙酸 IPA：異丙醇 DMSO：二甲亞碸 DIC：二異丙基碳二亞胺 TIS：三異丙基矽烷 MTBE：甲基三級丁基醚
試驗例1：目標胜肽的精製-1(有關去除類似胜肽) 將利用1-1所獲得的原態的目標胜肽與原態的類似胜肽分別溶解在含有1%TFA之水/乙腈＝100～70/0～30中，作成20mM(假設各胜肽的純度是100%)的原態的目標胜肽溶液或原態的類似胜肽溶液。不易溶解的胜肽則稀釋至約5mM(假設各胜肽的純度是100%)來使其溶解。 將各酸化合物溶解於水，或者當不易溶於水時溶解於10%IPA水溶液或10%DMSO水溶液中來作成50mM的酸化合物溶液。 將原態的目標胜肽溶液(1μmol(假設目標胜肽的純度是100%))與原態的類似胜肽溶液(1μmol(假設類似胜肽的純度是100%))混合。 將酸化合物溶液(1.5μmol)混合在該混合物中(HPLC分析(處理前))，並藉由冷凍乾燥來進行乾燥。 在殘渣中添加100μL的IPA，以室溫震盪一晚。 將所獲得的漿液進行離心過濾(5000～15000rpm，1～5分鐘)，以150μL的IPA將濾餅進行2次洗淨。並將濾液與洗淨液合併。 將所獲得的固體與濾洗液(濾液與洗淨液)各自進行HPLC分析(處理後固體/處理後濾洗液)。
HPLC的測定機器與上述相同。 測定條件：依照合成胜肽時的各HPLC條件(HPLC條件A～Z)。
包含芳香族胺基酸殘基之胜肽中，長波長側紫外線的吸收主要能夠歸因於其芳香族側鏈。當分析屬於包含芳香族胺基酸殘基之胜肽時，其HPLC的檢測波長，是條件A(能夠以274nm檢測時)、條件D、條件F～G、條件R～T。條件A(能夠以274nm檢測時)、條件R及條件T中，目標胜肽和類似胜肽各具有1個芳香族胺基酸殘基；條件F中，各具有5個；條件G和條件S中，目標胜肽和類似胜肽各具有4個；條件D中，目標胜肽具有3個而類似胜肽具有2個。亦即，在對吸收274～281nm的長波長紫外線有所貢獻的芳香族側鏈的數目上，目標胜肽與類似胜肽中是相同數目或相差1個，所以能夠將HPLC的面積值的比與其大致的莫耳比進行比較來判斷。
另一方面，不包含芳香族胺基酸殘基之胜肽在長波長側中不會吸收紫外線，而能夠將藉由羰基會吸收短波長紫外線(205nm)這點用來檢測。例如，條件A(能夠以205nm檢測時)與條件J中，目標胜肽的羰基是10個，類似胜肽具有9個羰基。同樣地，條件B與條件K中，目標胜肽具有6個，類似胜肽具有5個；條件C中分別是8個與7個羰基；條件E中分別是16個與15個；條件H中分別是9個與6個或8個；條件I中分別是31個與30個；條件L中分別是32個與31個；條件M中分別是9個與8個。亦即，在對吸收205nm的短波長紫外線有所貢獻的羰基數目上，目標胜肽與類似胜肽會相差1～3個，所以能夠將HPLC的面積值的比與其大致的莫耳比進行比較來判斷。再者，目標胜肽(9)與(10)，雖然具有芳香族側鏈，但是因為其鏈長充分地長且羰基又多，所以條件I中可檢測到羰基的紫外線吸收(205nm)，也能夠在長波長側偵測到紫外線吸收(目標胜肽和類似胜肽皆各自具有6個芳香族胺基酸殘基)。同樣地，雖然目標胜肽(16)與類似胜肽(25)分別具有2個芳香族側鏈，但是在205nm也檢測到紫外線吸收。 針對條件N、條件O、條件P、條件Q、條件U、條件V、條件W、條件X、條件Y及條件Z，亦同樣地將藉由羰基會吸收短波長紫外線(205nm)這點用於檢測。
如同下述式1)，使用HPLC測定值(面積)來算出目標胜肽的面積相對於目標胜肽與類似胜肽的合計面積的比例(%)，當作是目標胜肽的物質量(mol)相對於目標胜肽與類似胜肽的物質量(mol)的合計之大致的比例(%，目標胜肽率)。 式1) 目標胜肽率(%)＝目標胜肽的面積/(目標胜肽的面積＋類似胜肽的面積) ×100 ≒目標胜肽(mol)/(目標胜肽(mol)+類似胜肽(mol)) ×100
評價1：形成鹽類的檢驗 當混合了胜肽與酸化合物時，N末端的胺基或鹼性胺基酸(離胺酸K、精胺酸R、組胺酸H等)的側鏈部分可能會與酸化合物形成鹽類。 使用下述胜肽，藉由其固體中的目標胜肽率(%)的變化，來檢驗是否形成胜肽與酸化合物之鹽類，該等胜肽是：不含鹼性胺基酸之目標胜肽H－YFYPEL－NH2 和其缺少1個殘基的型態也就是其類似胜肽H－YYPEL－NH2 、及該等N末端以乙醯基(Ac)保護之目標胜肽Ac－YFYPEL－NH2 和其缺少1個殘基的型態也就是其類似胜肽Ac－YYPEL－NH2 。 除此之外，使用下述胜肽，來調查其固體中的胜肽目標胜肽率(%)的變化，該等胜肽是：不具能夠形成鹽類的基團之鹼性胺基酸之目標胜肽Pyr－GPWLEEEEEAYGWMDF－NH2 和其缺少1個殘基的型態也就是其類似胜肽Pyr－GPWLEEEEEYGWMDF－NH2 。
目標胜肽率(%)的變化，使用下述式2)而作為「目標胜肽率(%)的上升百分點」來算出。 式2) 目標胜肽率(%)的上升百分點＝處理後的固體的目標胜肽率(%)－處理前的目標胜肽率(%)。 將結果表示於下表。
[表5-1]
Figure 02_image142
[表5-2]
Figure 02_image144
(有關表5-1) N末端以Ac保護的目標胜肽Ac－YFYPEL－NH2 和其類似胜肽Ac－YYPEL－NH2 中，目標胜肽率(%)的上升百分點，在不使用酸化合物時是1.4個百分點，在使用硫酸時是2.0個百分點，在使用該磺酸化合物時是2.1個百分點，所以是否使用酸化合物對於目標胜肽率(%)的上升百分點沒有造成大的差異。 相對於此，N末端為游離基的目標胜肽H－YFYPEL－NH2 和其類似胜肽中H－YYPEL－NH2 中，相對於在不使用酸化合物時是-0.3個百分點且在使用硫酸時是0.2個百分點，使用該磺酸化合物時是3.1個百分點，所以相較於不使用酸化合物和使用硫酸，利用該磺酸化合物的上升百分點較大。 當目標胜肽與類似胜肽的結構相似時，其對於溶劑的溶解特性通常會相似。這樣一來，在胜肽與磺酸化合物形成鹽類而成為固體時，所獲得的固體對於溶劑的溶解特性相比於原來的胜肽會大幅改變，故藉由進行固液分離，可顯著地提高使所包含的比類似胜肽更多的目標胜肽的比例上升的可能性。因此，該等結果暗示了該磺酸化合物與胜肽的N末端的胺基形成了鹽類。 再者，不論是否有酸化合物，N末端以Ac基保護的目標胜肽Ac－YFYPEL－NH2 和其類似胜肽Ac－YYPEL－NH2 中，目標胜肽率(%)之所以會上升，認為是起因於該等胜肽在IPA中的溶解特性的差異所導致。
(有關表5-2) 不具能夠形成鹽類的基團之目標胜肽Pyr－GPWLEEEEEAYGWMDF－NH2 和其類似胜肽Pyr－GPWLEEEEEYGWMDF－NH2 中，針對是否使用酸化合物在目標胜肽率(%)的上升百分點上沒有差異。
評價2：磺酸化合物的效果 使用下表的酸化合物、目標胜肽及類似胜肽，基於與上述相同的方法，算出所獲得的固體中的目標胜肽率(%)的上升百分點。 將結果表示於下表。
[表6]
Figure 02_image146
相比於不使用酸化合物的情況，藉由使用磺酸化合物，目標胜肽率(%)的上升百分點增加，所以顯示了磺酸化合物對於目標胜肽與類似胜肽的分離具有優異的效果。這被認為是如同評價1所暗示，由於藉由與磺酸化合物形成鹽類而改變了溶解特性所導致。
評價3：與無機酸的比較 使用下表的酸化合物、目標胜肽及類似胜肽，基於與上述相同的方法，算出所獲得的固體中的目標胜肽率(%)的上升百分點。 將結果表示於下表。
[表7]
Figure 02_image148
目標胜肽率(%)的上升百分點，相比於鹽酸和硫酸，磺酸化合物較大，而顯示了磺酸化合物對於目標胜肽的精製具有優異的效果。
評價4：與羧酸化合物的比較 使用下表的磺酸化合物或羧酸化合物、及目標胜肽和類似胜肽，基於與上述相同的方法，算出所獲得的固體中的目標胜肽率(%)的上升百分點。 將結果表示於下表。
[表8]
Figure 02_image150
[表9]
Figure 02_image152
目標胜肽率(%)的上升百分點，相比於羧酸化合物，磺酸化合物較大，而顯示了磺酸化合物對於目標胜肽的精製具有優異的效果。
評價5：各種磺酸化合物的效果(1) 使用下表的磺酸化合物、目標胜肽及類似胜肽，因為其中有基於分析上的因素無法算出固體中的目標胜肽率的樣品，所以使用下述式3)，算出濾洗液中的目標胜肽率(%)的變化來作為「目標胜肽率(%)的降低百分點」。由於目標胜肽與類似胜肽在處理前後時各自的濃度不明，並且目標胜肽與類似胜肽的HPLC靈敏度並不相同，所以雖然不能從濾洗液中的目標胜肽率(%)的降低百分點來換算為固體中的目標胜肽率(%)的上升百分點，但是濾洗液中的目標胜肽率(%)減少仍意指在固體中的目標胜肽率增加。
式3) 目標胜肽率(%)的降低百分點＝處理後的濾洗液的目標胜肽率(%)－處理前的目標胜肽率(%) 將結果表示於下表。
[表10]
Figure 02_image154
[表11]
Figure 02_image156
[表12]
Figure 02_image158
[表13]
Figure 02_image160
[表14-1]
Figure 02_image162
[表14-2]
Figure 02_image164
[表15-1]
Figure 02_image166
[表15-2]
Figure 02_image168
[表16-1]
Figure 02_image170
[表16-2]
Figure 02_image172
[表16-3]
Figure 02_image174
[表16-4]
Figure 02_image176
[表17]
Figure 02_image178
評價6：各種磺酸化合物的效果(2) 使用下表的酸化合物、目標胜肽及類似胜肽，基於與上述相同的方法，算出所獲得的固體中的目標胜肽率(%)的上升百分點。 將結果表示於下表。
[表18]
Figure 02_image180
[表19]
Figure 02_image182
[表20]
Figure 02_image184
[表21]
Figure 02_image186
[表22]
Figure 02_image188
[表23]
Figure 02_image190
[表24]
Figure 02_image192
[表25]
Figure 02_image194
[表26]
Figure 02_image196
[表27]
Figure 02_image198
[表28]
Figure 02_image200
[表29]
Figure 02_image202
[表30]
Figure 02_image204
[表31]
Figure 02_image206
[表32]
Figure 02_image208
[表33]
Figure 02_image210
[表34]
Figure 02_image212
如同表5～34所示，所獲得的固體中的目標胜肽率上升(或所獲得的濾洗液中的目標胜肽率降低)，顯示了磺酸化合物對於各種目標胜肽的精製具有優異的效果。
試驗例2：溶劑的探討-1 將以1-1所獲得的原態的目標胜肽((8)H－YERAKSNM－OH)與原態的類似胜肽((13)H－YERKSNM－OH)各自溶解在水/乙腈＝1/2中，作成10mM(假設各胜肽的純度為100%)的原態的目標胜肽溶液或原態的類似胜肽溶液。 將酸化合物溶於水中，作成30mM的酸化合物溶液。 混合原態的目標胜肽溶液(1μmol(假設目標胜肽的純度為100%))、原態的類似胜肽溶液(0.1μmol(假設類似胜肽的純度為100%))。 將酸化合物溶液(0.9μmol)混合於該混合物中(HPLC分析(處理前))，藉由冷凍乾燥進行乾燥。酸化合物使用下述化合物：
Figure 02_image214
在殘渣中添加100μL的下表的溶劑，在室溫中震盪一晚。 將所獲得的漿液進行離心過濾(14000rpm，1分鐘)，利用100μL的該溶劑將濾餅洗淨2次。並將濾液與洗淨液合併。 將所獲得的固體與濾洗液(濾液與洗淨液)各自進行HPLC分析(處理後固體/處理後濾洗液)。 基於與上述相同的方法，算出所獲得的濾洗液中的目標胜肽率(%)的降低百分點。 除此之外，從針對處理前溶液與處理後固體的HPLC分析結果，算出目標胜肽的HPLC的面積百分率(其中，自總面積減去磺酸化合物的峰)。
[表35]
Figure 02_image216
[表36]
Figure 02_image218
如同表35和36，顯示了目標胜肽的絕對純度和相對純度的提升，並且磺酸化合物在使用任一溶劑時，對於目標胜肽的精製皆表現出效果。在通常的實施範圍內探討溶劑的組成，藉此便能夠選擇適於去除類似胜肽的溶劑。
試驗例3：放大規模
使用與試驗例2相同的目標胜肽、類似胜肽、磺酸化合物來實行以下的試驗。 將原態的目標胜肽、原態的類似胜肽及磺酸化合物各自溶解在水/乙腈(1/2)中，針對原態的目標胜肽溶液或與原態的類似胜肽溶液調製成50mM(假設純度分別為100%)的溶液，針對磺酸化合物調製成75mM的溶液。混合1mL(50μmol)的原態的目標胜肽溶液與0.1mL(5μmol)的原態的類似胜肽溶液。 添加1mL(75μmol)的磺酸化合物(HPLC分析(條件A，處理前))，並進行冷凍乾燥。在殘渣中添加1mL的IPA使其分散後，再度進行冷凍乾燥來獲得殘渣(64.35mg)。 在上述殘渣中加入2mL的IPA，以700rpm震盪3小時後進行離心沉澱(14000rpm，1分鐘)。將固體與上清液分離，將其分別進行冷凍乾燥，分別獲得源自固體的殘渣60.74mg、源自上清液的殘渣5.84mg。分別進行HPLC分析(條件A，處理後)。將結果表示於下表中。 [表37]
Figure 02_image220
即便在放大規模的情況下，亦獲得與試驗例2相同的結果。
試驗例4：去除磺酸
使用與試驗例3相同的目標胜肽、類似胜肽、磺酸化合物來實行以下的試驗。 將原態的目標胜肽、原態的類似胜肽及磺酸化合物各自溶解在水/乙腈(1/2)中，針對原態的目標胜肽溶液與原態的類似胜肽溶液調製成50mM(假設純度分別為100%)的溶液，針對磺酸化合物調製成75mM的溶液。混合1mL(50μmol)的原態的目標胜肽溶液與0.1mL(5μmol)的原態的類似胜肽溶液。 添加1mL(75μmol)的磺酸化合物(HPLC分析(條件A，處理前))，並進行冷凍乾燥。在殘渣中添加1mL的IPA使其分散後，再度進行冷凍乾燥來獲得殘渣(70.93mg)。 在上述殘渣中加入5mL的IPA，以700rpm震盪3.5小時後進行離心沉澱(14000rpm，1分鐘)。將固體與上清液分離，並利用1mL的IPA來洗淨固體。將固體、與混合上清液和洗淨溶液而成者進行冷凍乾燥，分別獲得源自固體的殘渣59.58mg、源自上清液和洗淨溶液的殘渣5.40mg。 使用Oasis WAX Cartidge(6cc/150mg，沃特斯公司製造)，依序以1mL的1N氫氧化鈉水溶液、7mL的水(蒸餾水)、2mL的水/MeOH(10/2)進行浸漬來實行前處理。 將15.74mg的上述源自固體的殘渣溶解在1mL的水/MeOH(10/1)中，進行HPLC分析(條件A，處理後。磺酸在5.1分鐘左右溶出)。 在經實行前處理的Oasis WAX Cartridge (6cc/150mg)中饋入上述溶液，並以9mL的水/MeOH(10/1)進行浸漬。將通過該濾罈(cartridge)的溶液進行HPLC分析，確認已去除磺酸(條件A，去除磺酸後)。進行冷凍乾燥而獲得殘渣9.47mg。
在下表中表示藉由磺酸化合物處理前的溶液與處理後的固體、及針對去除磺酸化合物後的該HPLC分析中的目標胜肽的HPLC面積百分率。
[表38]
Figure 02_image222
試驗例5：溶劑的探討-2 將以1-1所獲得的原態的目標胜肽((8)H－YERAKSNM－OH)與原態的類似胜肽((23)H－YERAKSN－OH)各自溶解在水/乙腈＝1/2中，作成10mM(假設各胜肽的純度為100%)的原態的目標胜肽溶液或原態的類似胜肽溶液。 將磺酸化合物溶於水中，作成50mM的磺酸化合物溶液。 混合原態的目標胜肽溶液(1μmol(假設目標胜肽的純度為100%))、原態的類似胜肽溶液(0.1μmol(假設類似胜肽的純度為100%))。 將磺酸化合物溶液(1.5μmol)混合於該混合物中(HPLC分析(處理前))，藉由冷凍乾燥進行乾燥。磺酸化合物使用下述化合物：
Figure 02_image224
在殘渣中添加100μL的下表的溶劑，在室溫中震盪一晚。 將所獲得的漿液進行離心過濾(14000rpm，1分鐘)，利用100μL的該溶劑將濾餅洗淨2次。並將濾液與洗淨液合併。 將所獲得的固體與濾洗液各自進行HPLC分析(處理後固體/處理後濾洗液)。 基於與上述相同的方法，算出所獲得的濾洗液中的目標胜肽率(%)的降低百分點。 除此之外，從針對處理前溶液與處理後固體的HPLC分析結果，算出目標胜肽的HPLC的面積百分率(其中，自總面積減去磺酸化合物的峰)。 將結果表示於下表中。 如同下表，顯示了目標胜肽的絕對純度和相對純度的提升，並且磺酸化合物在使用任一溶劑時，對於目標胜肽的精製皆表現出效果。
[表39]
Figure 02_image226
[表40]
Figure 02_image228
試驗例6：目標胜肽的精製-2 關於下表的目標胜肽、類似胜肽及磺酸化合物，自在試驗例1中所實行的HPLC分析結果，算出處理前的溶液與處理後的固體的目標胜肽的HPLC面積百分率(其中，自總面積減去磺酸化合物的峰)。
[表41]
Figure 02_image230
試驗7：目標胜肽的精製-3 (1)將藉由上述的「1-1：胜肽的合成(段落編號[0082]～[0128])」所獲得的H－AQKLRASD－OH(在表1中記載為目標胜肽(7))作為原態的類似胜肽，並將H－QKLRASD－OH(在表1中記載為類似胜肽(19))作為原態的目標胜肽，並使用與段落編號[0167]([表14-1])相同的磺酸化合物，以試驗例1(段落編號[0141])相同的方法來實行試驗。 將結果表示於下表中。 [表42]
Figure 02_image232
(2)同樣地，使用H－AQKLRASD－OH(在表1中記載為目標胜肽(7))作為原態的類似胜肽，並將H－AQKLRSD－OH(在表1中記載為類似胜肽(20))作為原態的目標胜肽，並使用與段落編號[0172]([表16-2])相同的磺酸化合物，以試驗例1(段落編號[0141])相同的方法來實行試驗。 將結果表示於下表中。 [表43]
Figure 02_image234
(3)同樣地，使用H－YERAKSNM－OH(在表1中記載為目標胜肽(8))作為原態的類似胜肽，並將H－YERAKNM－OH(在表1中記載為類似胜肽(9))作為原態的目標胜肽，並使用與段落編號[0155]([表7])相同的磺酸化合物，以試驗例1(段落編號[0141])相同的方法來實行試驗。 將結果表示於下表中。 [表44]
Figure 02_image236
(4)同樣地，使用H－YERAKSNM－OH(在表1中記載為目標胜肽(8))作為原態的類似胜肽，並將H－YERAKSN－OH(在表1中記載為類似胜肽(23))作為原態的目標胜肽，並使用與段落編號[0168]([表14-2])相同的磺酸化合物，以試驗例1(段落編號[0141])相同的方法來實行試驗。 將結果表示於下表中。 [表45]
Figure 02_image238
(5)同樣地，使用H－AQKLRASD－OH(在表1中記載為目標胜肽(7))作為原態的類似胜肽，並將H－AQKRASD－OH(在表1中記載為類似胜肽(24))作為原態的目標胜肽，並使用與段落編號[0172]([表16-2])相同的磺酸化合物，以試驗例1(段落編號[0141])相同的方法來實行試驗。 將結果表示於下表中。 [表46]
Figure 02_image240
試驗例7中，為了進一步證明本發明的方法為通用性非常高的胜肽精製方法，將試驗例1中的目標胜肽與類似胜肽的莫耳比互換，也就是以將類似胜肽設為目標胜肽並將試驗例的目標胜肽設為類似胜肽的方式來實行試驗。 具體而言，試驗例1在段落編號[0167]也就是[表14-1]中，顯示了將目標胜肽(7)H－AQKLRASD－OH與類似胜肽(19)H－QKLRASD－OH以約為10:1的莫耳比混合而成的範例的結果，相對於此，在試驗例7中，雖然使用相同的磺酸化合物，但是使該莫耳比(理論值)互換，也就是以(7)H－AQKLRASD－OH：(19)H－QKLRASD－OH＝約1：10進行混合的範例來實行試驗。 除此之外，有關實施例1中的下述組合亦同樣地使莫耳比(理論值)互換，並分別使用與上述試驗例相同的磺酸化合物來實行試驗，該組合是：段落編號[0172]也就是[表16-2]中所述之目標胜肽(7)H－AQKLRASD－OH與類似胜肽(20)H－AQKLRSD－OH；段落編號[0155]也就是[表7]中所述之目標胜肽(8)H－YERAKSNM－OH與類似胜肽(9)H－YERAKNM－OH；段落編號[0168]也就是[表14-2]中所述之目標胜肽(8)H－YERAKSNM－OH與類似胜肽(23)H－YERAKSN－OH；段落編號[0172]也就是[表16-2]中所述之目標胜肽(7)H－AQKLRASD－OH與類似胜肽(24)H－AQKLRSD－OH。 如同試驗例7的結果可知，藉由使混合比互換，亦即，即便在將試驗例的類似胜肽設為目標胜肽並將試驗例的目標胜肽設為類似胜肽時，對於固體仍顯示了目標胜肽相對於類似胜肽的相對純度提升(或在液體中降低)的結果。
試驗例8：各種磺酸化合物的效果(去除複數種的類似胜肽) 使用複數種的原態的類似胜肽溶液(分別為0.1μmol(假設類似胜肽的純度為100%))，以與試驗例1(段落編號[0141])相同的方法，針對所獲得的固體中的各類似胜肽，算出目標胜肽率(%)的上升百分點。 將結果表示於下表中。 [表47]
Figure 02_image242
[表48]
Figure 02_image244
[表49]
Figure 02_image246
如同表47～表49所示，所獲得的固體中的目標胜肽有所提升，而顯示了磺酸化合物對於各種目標胜肽的精製有優異的效果。
本發明的方法能夠使用於胜肽的精製。
無
無
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國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
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Claims (36)

  1. 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體。
  2. 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其從該混合開始經過1分鐘以上後，進行固液分離來採取該固體。
  3. 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體； 並且，該溶劑含有水、醇類化合物、乙腈、醚化合物、酮化合物、酯化合物、烴化合物、二甲亞碸、醯胺化合物、鹵化烴、或該等的混合物。
  4. 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體； 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體；及， 步驟(3)，其將該固體進行洗淨。
  5. 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在0～50℃且在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其是在0～50℃進行固液分離來採取該固體。
  6. 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體； 並且，該溶劑與該目標胜肽的重量比也就是溶劑/目標胜肽是1～100000。
  7. 一種胜肽精製方法，其從藉由胜肽合成所獲得的胜肽來精製目標胜肽，該目標胜肽的N末端為游離基、及/或該目標胜肽具有至少1個鹼性胺基酸殘基； 其中，該胜肽精製方法包含下述步驟： 步驟(1)，其是在磺酸化合物的存在下，將該所合成出的胜肽與溶劑混合而獲得固體；及， 步驟(2)，其進行固液分離來採取該固體； 並且，該磺酸化合物相對於該目標胜肽的莫耳比是0.1～50。
  8. 如請求項1～7中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該磺酸化合物是式(I)的化合物：
    Figure 03_image001
    (I) 式(I)中，A是可經取代的C6 － 14 芳基、可經取代的二環式雜環基、C2 － 3 烯基或C2 － 3 炔基； X是(i)單鍵、(ii)可經取代的C1 － 6 伸烷基、(iii)－CO－(CH2 )n －(CO與A進行鍵結)、或(iv)C2 － 4 伸烯基，並且，n是1～3的整數。
  9. 如請求項8所述之胜肽精製方法，其中，A是可經取代的C6 － 14 芳基； X是(i)單鍵、(ii)可經取代的C1 － 6 伸烷基、(iii)－CO－(CH2 )n －(CO與A進行鍵結)、或(iv)C2 － 3 伸烯基，並且，n是1～3的整數。
  10. 如請求項8所述之胜肽精製方法，其中，A是可經取代的二環式雜環基； X是(i)單鍵、(ii)C1 － 6 伸烷基、(iii)－CO－(CH2 )n －(CO與A進行鍵結)、或(iv)C2 － 3 伸烯基，並且，n是1～3的整數。
  11. 如請求項8所述之胜肽精製方法，其中，A是C2 － 3 烯基，並且X是C1 － 4 伸烷基。
  12. 如請求項8所述之胜肽精製方法，其中，A是C2 － 3 炔基，並且X是C1 － 4 伸烷基。
  13. 如請求項1～12中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該目標胜肽具有5～31個胺基酸殘基。
  14. 如請求項1～13中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該所合成出的胜肽中包含有類似胜肽。
  15. 如請求項1～14中任一項所述之胜肽精製方法，其中，在該所合成出的胜肽中，相對於該目標胜肽，類似胜肽的莫耳比是0.7以下。
  16. 如請求項1～15中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該胜肽合成是藉由固相合成法進行的胜肽合成。
  17. 如請求項1～16中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該目標胜肽包含至少1個鹼性胺基酸殘基，且該目標胜肽的N末端可以是游離基。
  18. 9及13～17中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是可經1～5個相同或不同的下述取代基取代的C6 － 14 芳基，該取代基是選自由C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及C6 － 10 芳基所組成之群組。
  19. 9及13～18中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是選自苯基、萘基、茀基及二氫茚基的C6 － 13 芳基，該C6 － 13 芳基可經1～5個相同或不同的下述取代基所取代，該等取代基是選自由C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及C6 － 10 芳基所組成之群組。
  20. 9及13～18中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是選自苯基、萘基及二氫茚基的C6 － 10 芳基，該C6 － 10 芳基可經1～5個相同或不同的下述取代基所取代，該等取代基是選自由C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及C6 － 10 芳基所組成之群組。
  21. 10及13～17中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是二環式雜環基，其選自由2,3,4,5-四氫-1H-1-苯并氮雜環庚三烯基、苯并氧雜環己烷基、吲哚啉基、異吲哚啉基、呔[口井]基、苯并二氫哌喃基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、嘧啶基、苯并噻唑基、喹啉基、異苯并二氫哌喃基及苯并三唑基所組成之群組，並且該二環式雜環基可經適當地取代。
  22. 10、13～17及21中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是可經1～5個相同或不同的下述取代基取代的二環式雜環基，該等取代基是選自由C6 － 10 芳基、C1 － 4 烷基、－CO－C6 － 10 芳基、－OH、－O－C1 － 3 烷基、－NO2 、－CO2 H、－CO2 －C1 － 4 烷基、鹵素、－NH2 、－CH2 －SO3 H、－SO3 H、－CN、－CO－C1 － 4 烷基、－CF3 及氧基所組成之群組。
  23. 10、13～17、21及22中任一項所述之胜肽精製方法，其中，A是選自下述式的二環式雜環基：
    Figure 03_image003
    ，及，
    Figure 03_image005
    ；該二環式雜環基可經1個苯基取代。
  24. 如請求項8～10及13～23中任一項所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii)可經1～3個選自由甲基、苯甲基、氰基及苯基所組成之群組中的相同或不同的取代基取代的C1 － 4 伸烷基；或 (iii)－CO－CH2 －(CO與A進行鍵結)。
  25. 如請求項8～10及13～23中任一項所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii)可經1個甲基、1個苯甲基、1個氰基及/或1或2個苯基取代的C1 － 4 伸烷基；或 (iii)－CO－CH2 －(其CO與A進行鍵結)。
  26. 如請求項18所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii)可經1～3個選自由甲基、苯甲基、氰基及苯基所組成之群組中的相同或不同的取代基取代的C1 － 4 伸烷基；或 (iii)－CO－(CH2) －(CO與A進行鍵結)。
  27. 如請求項18所述之胜肽精製方法，其中，X是： (i)單鍵； (ii) 可經1個甲基、1個苯甲基、1個氰基及/或1或2個苯基取代的C1 － 4 伸烷基；或 (iii)－CO－(CH2) －(CO與A進行鍵結)。
  28. 如請求項8～10及13～27中任一項所述之胜肽精製方法，其中，X是單鍵。
  29. 如請求項23所述之胜肽精製方法，其中，X是單鍵。
  30. 如請求項1～29中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該磺酸化合物選自下述磺酸化合物：
    Figure 03_image248
    Figure 03_image250
    Figure 03_image252
    Figure 03_image254
    。
  31. 如請求項1～30中任一項所述之胜肽精製方法，其中，進一步包含將該磺酸化合物去除的步驟。
  32. 如請求項1～31中任一項所述之胜肽精製方法，其中，該方法用以使目標胜肽的相對於類似胜肽的莫耳比提升。
  33. 一種製造目標胜肽的方法，該方法包含請求項1～32中任一項所述之胜肽精製方法。
  34. 一種藥劑，其含有目標胜肽，該目標胜肽是藉由包含了請求項1～32中任一項所述之胜肽精製方法之方法所精製而成。
  35. 一種試劑，其含有磺酸化合物，該試劑是用以使用於請求項1～32中任一項所述之胜肽精製方法中。
  36. 一種化合物，其選自下述式：
    Figure 03_image060
    、
    Figure 03_image062
    、
    Figure 03_image064
    、
    Figure 03_image066
    、
    Figure 03_image068
    、
    Figure 03_image041
    、
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    、
    Figure 03_image051
    及
    Figure 03_image059
    。
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