WO2020054287A1 - スルホン酸化合物によるペプチド精製方法 - Google Patents

スルホン酸化合物によるペプチド精製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020054287A1
WO2020054287A1 PCT/JP2019/031405 JP2019031405W WO2020054287A1 WO 2020054287 A1 WO2020054287 A1 WO 2020054287A1 JP 2019031405 W JP2019031405 W JP 2019031405W WO 2020054287 A1 WO2020054287 A1 WO 2020054287A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
solid
target peptide
minutes
target
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/031405
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
恵介 松山
憲一郎 山本
沙代子 村上
Original Assignee
長瀬産業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 長瀬産業株式会社 filed Critical 長瀬産業株式会社
Priority to EP19860341.7A priority Critical patent/EP3851446A4/en
Priority to US17/275,938 priority patent/US11535647B2/en
Priority to CN201980043284.3A priority patent/CN112533936B/zh
Publication of WO2020054287A1 publication Critical patent/WO2020054287A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D223/00—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D223/14—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D223/16—Benzazepines; Hydrogenated benzazepines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/02—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C309/20—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/02—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C309/24—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/28—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only
    • C07D311/30—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only not hydrogenated in the hetero ring, e.g. flavones

Definitions

  • the present application relates to a method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, and a drug containing the target peptide obtained by the purification method.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Peptides having relatively few amino acid residues are generally produced by an organic chemical synthesis method (for example, Patent Document 1).
  • Examples of the organic chemical synthesis method include a solid phase method and a liquid phase method. A coupling reaction between an N-protected amino acid and a C-protected peptide (C-protected amino acid at the time of dipeptide formation) and a subsequent N-terminal deprotection reaction are carried out. Is repeated.
  • various related peptides are also synthesized due to partial overlap, partial omission, and the like of the peptide elongation reaction. Therefore, it is necessary to separate the generated target peptide from these related peptides.
  • An object of the present application is to provide a method for purifying a target peptide, which comprises removing the related peptide from a mixture containing the target peptide and the related peptide obtained by peptide synthesis.
  • a further object of the present invention is to provide a peptide purification method that can replace or supplement a conventional peptide purification method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, in a peptide synthesis product of a target peptide including a related peptide, mixing a sulfonic acid compound having a predetermined structure in the presence of a solvent to perform solid-liquid separation. It was found that the purity of the target peptide (absolute purity, excluding the sulfonic acid compound) was improved, and that a solid of the sulfonate of the target peptide with a reduced ratio of the related peptide was obtained. Reached.
  • the present invention will be described in detail.
  • [Item 1] A method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue, (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) A method comprising a step of collecting the solid by solid-liquid separation.
  • [Item 1-1] A method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue, (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) A method including a step of collecting the solid by solid-liquid separation at least one minute after the mixing.
  • a method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue comprises the steps of (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid, (2) a step of collecting the solid by solid-liquid separation,
  • the solvent contains water, an alcohol compound, acetonitrile, an ether compound, a ketone compound, an ester compound, a hydrocarbon compound, DMSO, an amide compound, a halogenated hydrocarbon, or a mixture thereof.
  • a method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) a step of collecting the solid by solid-liquid separation, and (3) a step of washing the solid.
  • [Item 1-4] A method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue, (1) mixing the synthesized peptide with a solvent at 0 to 50 ° C. in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) A method comprising a step of solid-liquid separation at 0 to 50 ° C. to collect the solid.
  • a method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) a step of collecting the solid by solid-liquid separation, A weight ratio of the solvent and the target peptide (solvent / target peptide) is 1 to 100,000; Method.
  • a method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue comprises: (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) a step of collecting the solid by solid-liquid separation, The molar ratio of the sulfonic acid compound to the target peptide is 0.1 to 50, Method.
  • [Item 1-7] A method for purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide has a free N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue, (1) mixing the synthesized peptide with a sulfonic acid compound in the presence of a solvent, (2) A method including a step of separating the obtained solid from the liquid phase.
  • the sulfonic acid compound has the formula (I): (I) [Where, A is an optionally substituted C 6-14 aryl (eg, C 6-13 aryl, C 6-10 aryl), an optionally substituted bicyclic heterocyclic group, C 2-3 alkenyl, or 2-3 alkynyl; X is (I) a single bond, (Ii) optionally substituted C 1-6 alkylene (eg, C 1-5 alkylene, C 1-4 alkylene), (Iii) —CO— (CH 2 ) n — (CO bonds to A), or (iv) C 2-4 alkenylene; and n is an integer of 1-3.
  • Item 10 The method according to Item 1, and any one of Items 1-1 to 1-7.
  • A is an optionally substituted C 6-14 aryl (eg, C 6-13 aryl, C 6-10 aryl);
  • X is (I) a single bond, (Ii) optionally substituted C 1-6 alkylene (eg, C 1-5 alkylene, C 1-4 alkylene, C 1-3 alkylene); (Iii) —CO— (CH 2 ) n — (CO bonds to A), or (iv) C 2-3 alkenylene; and n is an integer of 1 to 3.
  • A is an optionally substituted bicyclic heterocyclic group
  • X is (I) a single bond, (Ii) C 1-6 alkylene (eg, C 1-5 alkylene, C 1-4 alkylene, C 1-3 alkylene), (Iii) —CO— (CH 2 ) n — (CO bonds to A), or (iv) C 2-3 alkenylene; and n is an integer of 1 to 3.
  • Item 8 The method according to any one of Items 1 to 6 and 1-1 to 1-7, wherein the target peptide has 5 to 31 amino acid residues.
  • Item 8 The method according to any one of Items 1 to 7 and 1-1 to 1-7, wherein the synthesized peptide includes an analogous peptide.
  • Item 8 The method according to any one of items 1 to 8 and 1-1 to 1-7, wherein the molar ratio of the related peptide to the target peptide in the synthesized peptide is 0.7 or less.
  • Item 10 The method according to any one of Items 1 to 9 and 1-1 to 1-7, wherein the peptide synthesis is a solid phase peptide synthesis.
  • A is C 1-4 alkyl, —CO—C 6-10 aryl, —OH, —O—C 1-3 alkyl, —NO 2 , —CO 2 H, —CO 2 —C 1-4 alkyl, halogen The same or different selected from the group consisting of: —NH 2 , —CH 2 —SO 3 H, —SO 3 H, —CN, —CO—C 1-4 alkyl, —CF 3 , and C 6-10 aryl Any one of clauses 2, 3, and 7-11, which is a C 6-14 aryl optionally substituted with one to five substituents (eg, a C 6-13 aryl, a C 6-10 aryl) The method described in the section.
  • A is a C 6-13 aryl selected from phenyl, naphthyl, fluorenyl, and indanyl, wherein the C 6-13 aryl is C 1-4 alkyl, —CO—C 6-10 aryl, —OH, — O-C 1-3 alkyl, -NO 2 , -CO 2 H, -CO 2 -C 1-4 alkyl, halogen, -NH 2 , -CH 2 -SO 3 H, -SO 3 H, -CN,- Terms 2, 3, and 5, optionally substituted with the same or different 1 to 5 substituents selected from the group consisting of CO—C 1-4 alkyl, —CF 3 , and C 6-10 aryl 13.
  • A is a C 6-10 aryl selected from phenyl, naphthyl, and indanyl, wherein the C 6-10 aryl is C 1-4 alkyl, —CO—C 6-10 aryl, —OH, —O— C 1-3 alkyl, —NO 2 , —CO 2 H, —CO 2 —C 1-4 alkyl, halogen, —NH 2 , —CH 2 —SO 3 H, —SO 3 H, —CN, —CO— Items 2, 3, and 7-, optionally substituted with the same or different 1 to 5 substituents selected from the group consisting of C 1-4 alkyl, —CF 3 , and C 6-10 aryl 13.
  • A is composed of 2,3,4,5-tetrahydro-1H-1-benzoazepinyl, benzoxanyl, indolinyl, isoindolinyl, phthalazinyl, chromanyl, benzofuranyl, benzothiophenyl, pyrimidyl, benzothiazonyl, quinolyl, isochromanyl, and benzotriazolyl 12.
  • A is C 6-10 aryl, C 1-4 alkyl, —CO—C 6-10 aryl, —OH, —O—C 1-3 alkyl, —NO 2 , —CO 2 H, —CO 2 —C
  • the same is selected from the group consisting of 1-4 alkyl, halogen, -NH 2 , -CH 2 -SO 3 H, -SO 3 H, -CN, -CO-C 1-4 alkyl, -CF 3 , and oxo.
  • Item 15 The method according to any one of Items 2, 4, 7 to 11, and 14, which is a bicyclic heterocyclic group optionally substituted with 1 to 5 different substituents.
  • A is and Any one of items 2, 4, 7 to 11, 14, and 15, wherein the bicyclic heterocyclic group is optionally substituted with one phenyl. The method described in the section.
  • X is (I) a single bond, (Ii) C 1-4 alkylene (eg, C 1-3 alkylene) which may be substituted with the same or different 1 to 3 substituents selected from the group consisting of methyl, benzyl, cyano, and phenyl; Or (iii) —CO—CH 2 — (CO bonds to A), Item 13.
  • X is (I) a single bond, (Ii) C 1-4 alkylene optionally substituted with one methyl, one benzyl, one cyano, and / or one or two phenyl (eg C 1-3 alkylene), or (iii)- CO—CH 2 — (CO bonds to A), Item 13.
  • the method according to any one of items 2 to 4, and 7 to 16, and 13-1.
  • X is (I) a single bond, (Ii) C 1-4 alkylene (eg, C 1-3 alkylene) which may be substituted with the same or different 1 to 3 substituents selected from the group consisting of methyl, benzyl, cyano, and phenyl; Or (iii) -CO- (CH 2 )-(CO bonds to A), Item 13.
  • C 1-4 alkylene eg, C 1-3 alkylene
  • Item 17 The method according to Item 16, wherein X is a single bond.
  • the sulfonic acid compound is as follows: The method according to any one of Items 1 to 20, and Items 1-1 to 1-7, 13-1, 17-1, and 18-1 selected from the group consisting of:
  • Item 13 The method according to any one of Items 1 to 22, and Items 1-1 to 1-7, 13-1, 17-1, and 18-1 for improving the molar ratio of the target peptide to the analogous peptide. .
  • a method for producing the target peptide including the method according to any one of Items 1 to 23 and Items 1-1 to 1-7, 13-1, 17-1, and 18-1.
  • Item 1 A drug containing the target peptide purified by a method including the method described in any one of Items 1 to 23 and any one of Items 1-1 to 1-7, 13-1, 17-1, and 18-1.
  • Item 1 contains the sulfonic acid compound for use in the method according to any one of items 1 to 23, and items 1-1 to 1-7, 13-1, 17-1, and 18-1. Agent.
  • [Section 28-1] An agent containing a target peptide purified from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide is free at the N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue.
  • the purification comprises: (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) An agent comprising a step of collecting a solid by solid-liquid separation.
  • the purification comprises (1) mixing the synthesized peptide with an agent containing a sulfonic acid compound in the presence of a solvent, (2) An agent comprising a step of separating the obtained solid from a liquid phase.
  • a peptide having an improved purity of a target peptide is provided from a peptide that may include a related peptide obtained by synthesis.
  • the present application is a method of purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide is free at the N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue. And (1) mixing the synthesized peptide with a solvent in the presence of a sulfonic acid compound to obtain a solid; (2) A method including a step of collecting the solid by solid-liquid separation. In one aspect, the present application is a method of purifying a target peptide from a peptide obtained by peptide synthesis, wherein the target peptide is free at the N-terminus and / or has at least one basic amino acid residue. And (1) mixing the synthesized peptide with a sulfonic acid compound in the presence of a solvent, (2) A method including a step of separating the obtained solid from a liquid phase.
  • to purify means that the purity of a certain substance is improved.
  • the purity means the absolute purity (the amount of the substance relative to the total amount of the mixture containing the substance of interest) and the relative purity (the amount of the substance of interest relative to the amount of other substances (eg, impurities) contained in a certain mixture). May also mean.
  • purifying the target peptide means that the sulfonic acid compound and the sulfonic acid compound are compared with the total amount of the synthetic peptide before mixing with the sulfonic acid compound (for example,% by weight).
  • the amount (for example,% by weight) of the target peptide contained therein with respect to the weight of the solid matter obtained after mixing of the solid matter excluding the amount corresponding to the sulfonic acid compound is improved.
  • purifying the target peptide means, for example, that the molar ratio of the target peptide to the analogous peptide in the solid obtained after the mixing is improved as compared to before the mixing with the sulfonic acid compound. included.
  • the method for measuring the purity of the target peptide is not particularly limited, and can be measured by a commonly used method (for example, HPLC method).
  • peptide synthesis is not particularly limited as long as it is a method for synthesizing a peptide, and includes, for example, an organic chemical synthesis method (for example, a solid phase method and a liquid phase method) and a fermentation method. Can be performed.
  • synthesis conditions for example, resin, protecting group, reaction temperature, reaction time, solvent in organic chemical synthesis method
  • impurities eg, analogous peptide
  • the peptide synthesis is set to synthesis conditions under which the production of analogous peptides is suppressed, based on the knowledge generally known to those skilled in the art. Is preferably larger than the substance amount of the related peptide.
  • the molar ratio of the related peptide to the target peptide is 0.7 or less (preferably 0.6 or less, more preferably 0.5 or less, and It is preferably 0.45 or less, even more preferably 0.4 or less, more preferably 0.2 or less.
  • the molar ratio of the analogous peptide to the target peptide is preferably low, and the lower limit is not particularly limited, but is, for example, 0.0001 to 0.7, 0.001 to 0.6, 0.01 to 0.
  • the range of 0.5 is mentioned as an example of the range of the molar ratio.
  • the molar ratio for example, a value calculated as an approximate value of the molar ratio from a value (for example, an area ratio) obtained by an HPLC method may be used.
  • the substance amount of the target peptide is larger than the substance amount of the related peptide means that the substance amount of the target peptide is larger than the substance amount of one kind of the related peptide. In the case where a plurality of related peptides are contained, it means that the amount of the target peptide is larger than the amount of each of the related peptides.
  • the substance amount of the target peptide is larger than the substance amount of the related peptide means that the amount (absolute purity) of the target peptide in the total amount of the peptide obtained by the peptide synthesis is large (
  • the concentration of the target peptide in the peptide obtained by peptide synthesis is 40% by weight or more, 50% by weight or more, 60% by weight or more, 70% by weight or more, 80% by weight or more, and 90% by weight or more. This can be indicated by the extremely high probability that the amount of the related peptide in the peptide obtained by peptide synthesis is lower than the amount of the target peptide.
  • the “target peptide” means a peptide produced for the purpose of being produced by peptide synthesis, and the structure of the target peptide is such that its N-terminus is free or at least one (for example, 1 to 5) , 1-4, 1-3, 1-2, and 1) basic amino acid residues or their N-terminus is free and at least one (eg, 1-5, It is not particularly limited as long as it has 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, and 1) basic amino acid residues.
  • the target peptide preferably has 5 to 31 amino acid residues, more preferably 5 to 25 amino acids, still more preferably 5 to 20 amino acids, and still more preferably 5 to 15 amino acids.
  • the range of the number of amino acid residues of the target peptide can be indicated by a combination of a lower limit selected from 5, 6, 7, and 8, and an upper limit selected from 31, 25, 20, 15, and 10. .
  • the amino acid residues that can be contained in the target peptide are usually the following 20 kinds of amino acids (L-form except glycine having no asymmetric carbon) constituting the protein, L-selenocysteine, 2-aminoisobutyric acid, An amino acid residue derived from a naturally occurring amino acid such as isovaline, L-isovaline, L-norleucine, L-ornithine, or a non-naturally occurring amino acid residue; Amino acid residues derived from unnatural amino acids).
  • Examples of unnatural amino acids include D-forms of 19 amino acids excluding glycine shown in the table below; N-methyl forms (eg, N-methylglycine, LN-methylphenylalanine) of 20 kinds of amino acids shown in the table below Enantiomers of 19 LN-methyl forms excluding N-methylglycine; both enantiomers of ⁇ -methyl forms of 18 amino acids excluding glycine and alanine shown in the following table (eg, ⁇ -methyllysine); Both enantiomers of ⁇ -ethyl form of 19 kinds of amino acids except alanine shown in; D-selenocysteine; D-norleucine; D-ornithine; (S)-or (R) -2,3-diaminopropionic acid; (S)-or (R) -2,4-diaminobutyric acid; (S)-or (R) -pyroglutamic acid; (S)-or (R) -
  • a basic amino acid residue refers to an amino acid having a residue showing basicity in addition to an amino group (eg, D- or L-lysine, D- or L-arginine, D- or L-histidine, D- Or L-ornithine, (S)-or (R) -2,3-diaminopropionic acid, and (S)-or (R) -2,4-diaminobutyric acid).
  • an amino group eg, D- or L-lysine, D- or L-arginine, D- or L-histidine, D- Or L-ornithine, (S)-or (R) -2,3-diaminopropionic acid, and (S)-or (R) -2,4-diaminobutyric acid.
  • the target peptide has a terminal such as a protecting group or the like usually used in peptide synthesis (for example, an N-terminal is an Ac group (acetyl group), an Fmoc group (9-fluorenylmethyloxycarbonyl group), or a Boc group (tert- Butoxycarbonyl group); the C-terminal may be modified with an amide group or an ester group).
  • a protecting group or the like usually used in peptide synthesis
  • an N-terminal is an Ac group (acetyl group), an Fmoc group (9-fluorenylmethyloxycarbonyl group), or a Boc group (tert- Butoxycarbonyl group)
  • the C-terminal may be modified with an amide group or an ester group.
  • related peptide means a peptide that is not a target peptide and can be produced by peptide synthesis for producing the target peptide.
  • related peptides (1) Some amino acid residues (eg, continuous or discontinuous 1 to 3 amino acid residues, continuous or discontinuous 1 to 2 amino acid residues, and 1 amino acid residue) contained in the target peptide are duplicated ; (2) Part of amino acid residues (eg, continuous or discontinuous 1 to 3 amino acid residues, continuous or discontinuous 1 to 2 amino acid residues, and 1 amino acid residue) contained in the target peptide are deleted ; (3) Some amino acid residues (eg, continuous or discontinuous 1 to 3 amino acid residues, continuous or discontinuous 1 to 2 amino acid residues, and 1 amino acid residue) contained in the target peptide are epimerized (Eg, epimerization of N-protected amino acids by ⁇ -isomerization); and / or (4) some amino acid residues contained in the target peptide (eg,
  • the number of amino acid residues in the analogous peptide is, for example, the same as the number of amino acid residues in the target peptide, 1 to 3 (preferably 1 to 2, more preferably 1), or 1 to 3 (Preferably 1 or 2, more preferably 1).
  • an “analogous peptide” is a residue of a basic amino acid (the N-terminus of which is free / at least one (eg, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, and 1)) (Having a group) and may not have such a basic moiety.
  • the effect of the present invention is not limited to a specific mechanism, as described above, in a peptide obtained by peptide synthesis, the amount (substance amount) of the target peptide is usually larger than the amount of the related peptide, and When the structures of the peptide and the analogous peptide are similar, the solubility characteristics of the two in the solvent can be usually approximated.
  • the ⁇ analogous peptide '' has a basic moiety, the sulfonic acid compound and the salt are used similarly to the target peptide. Although it can be formed into a solid, in a solid obtained after mixing with a sulfonic acid compound, the ratio of the target peptide originally contained more than the related peptide may increase.
  • the solvent used for mixing with the sulfonic acid compound is not particularly limited, and may be appropriately selected in consideration of the purification efficiency of the target peptide.
  • the solvent is water; Alcohol compounds (eg, C 1-4 alcohols (eg, isopropyl alcohol, methanol, ethanol)); Acetonitrile; Ether compounds (eg, C 2-6 ether (eg, diethyl ether, MTBE, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,2-dimethoxyethane, CPME (cyclopentyl methyl ether))); Ketone compounds (eg, C 3-6 ketone (eg, acetone), MEK (methyl ethyl ketone), methyl isopropyl ketone, MIBK (methyl isobutyl ketone)); Ester compounds (eg, C 3-6 esters (eg, ethyl acetate, isopropyl acetate, t
  • the solvent may further contain other substances.
  • examples of the solvent include water, isopropyl alcohol (IPA), methanol (MeOH), 1,4-dioxane, 1,2-dimethoxyethane (DME), tetrahydrofuran (THF), acetone, acetonitrile, ethanol, ethyl acetate, Toluene, MTBE, DMSO, diethyl ether, and mixtures thereof (where the mixture means a combination), and the solvent may further contain other substances.
  • IPA isopropyl alcohol
  • MeOH methanol
  • DME 1,2-dimethoxyethane
  • THF tetrahydrofuran
  • acetone acetone
  • acetonitrile acetonitrile
  • ethanol ethyl acetate
  • Toluene MTBE
  • DMSO diethyl ether
  • diethyl ether diethyl ether
  • the amount of the solvent relative to the peptide and the amount of the sulfonic acid compound are not particularly limited, and may be appropriately determined in consideration of the purification efficiency of the target peptide.
  • the solvent is used in a weight ratio of 1 to 100,000, preferably 1 to 10,000, preferably 1 to 2,000, and even more preferably 10 to 100,000 target peptides 1 (which may be theoretical values) obtained by peptide synthesis. It can be used in the range of 10001000.
  • the molar ratio of the sulfonic acid compound to the target peptide (which may be a theoretical value) is 0.1 to 50, preferably 0.2 to 40, more preferably 0.3 to 30, and still more preferably 0.1 to 0.3. 5 to 20.
  • the molar ratio of the sulfonic acid compound to the target peptide (may be a theoretical value) is, for example, 0.5 to 20, preferably 0.8 to 10 when the sulfonic acid compound has one sulfo group.
  • the theoretical value may mean a value calculated assuming that the purity of the target peptide in the peptide synthesis product is 100%.
  • the method of separating the obtained solid from the liquid phase is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the production scale and the like. , Decanting and the like. Since the purity of the target peptide in the solid can be improved through the solid-liquid equilibrium, the solid-liquid separation is performed by mixing the synthesized peptide with the sulfonic acid compound and the solvent for a predetermined time (for example, 1 minute or more, 2 minutes or more). , 3 minutes or more, 4 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 30 minutes or more, 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more). In consideration of work efficiency, for example, solid-liquid separation is preferably performed within 1 day, within 2 days, within 1 week, within 2 weeks. However, the mixture is stored without performing solid-liquid separation, and solid-liquid separation is performed as appropriate. May be performed.
  • the temperature at the time of mixing with the sulfonic acid compound and / or the solvent and at the time of separating the obtained solid from the liquid phase is not particularly limited. Can be selected. For example, 0 to 50 ° C, 0 to 40 ° C, 0 to 30 ° C, and 10 to 25 ° C.
  • the solid after the solid-liquid separation may be appropriately washed.
  • the liquid used for washing (washing liquid) is not particularly limited, and may be appropriately selected in consideration of the purification efficiency of the target peptide.
  • the cleaning solution is water; Alcohol compounds (eg, C 1-4 alcohols (eg, isopropyl alcohol, methanol, ethanol)); Acetonitrile; Ether compounds (eg, C 2-6 ether (eg, diethyl ether, MTBE, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,2-dimethoxyethane, CPME (cyclopentyl methyl ether))); Ketone compounds (eg, C 3-6 ketone (eg, acetone), MEK (methyl ethyl ketone), methyl isopropyl ketone, MIBK (methyl isobutyl ketone)); Ester compounds (eg, C 3-6 esters (eg, ethyl acetate, isopropyl acetate, t-butyl acetate)); Hydrocarbon compounds (eg, C 6-9 hydrocarbons (eg, toluene)); DMSO; Amide compounds (eg,
  • the repetition of the purification method of the present application on the solid obtained by the purification method of the present application is an embodiment of the purification method of the present application.
  • the purity of the target peptide can be improved by repeating the purification method of the present application.
  • the purification method of the present application may be performed in combination with another purification method (for example, preparative HPLC, recrystallization, dispersion washing).
  • another purification method for example, preparative HPLC, recrystallization, dispersion washing.
  • the solid obtained by the method of the present application may be subjected to another purification method, or a peptide previously purified by another purification method may be subjected to the purification method of the present application.
  • the sulfonic acid compound is removed from the solid obtained by the purification method of the present application in the further purification step.
  • the method for removing the sulfonic acid compound is not particularly limited, and can be performed by a usual method for removing a sulfonic acid compound, for example, an acid or alkali treatment or a removal method using an ion exchange resin.
  • the sulfonic acid compound means an organic compound having a sulfo group (—SO 3 H).
  • the sulfonic acid compound has a sulfo group bonded to a site having one or more unsaturated bonds via a single bond or a short (eg, C 1-12, C 1-6, C 1-4 ) linker. Is preferred.
  • sulfonic acid compound examples include a sulfonic acid compound of the formula (I).
  • A is an optionally substituted C 6-14 aryl (eg, C 6-13 aryl, C 6-10 aryl), an optionally substituted bicyclic heterocyclic group, C 2-3 alkenyl, or 2-3 alkynyl;
  • X is (I) a single bond, (Ii) optionally substituted C 1-6 alkylene (eg, C 1-5 alkylene, C 1-4 alkylene), (Iii) —CO— (CH 2 ) n — (CO bonds to A), or (iv) C 2-4 alkenylene; and n is an integer of 1-3.
  • C 6-14 aryl refers to a 6 to 14 membered monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic hydrocarbon ring group, or the aromatic group.
  • Examples of C 6-14 aryl include phenyl, naphthyl, indanyl, tetrahydronaphthyl, fluorenyl.
  • C 6-10 aryl refers to a 6 to 10-membered monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon ring group, or A ring group in which one cycloalkane is fused.
  • Examples of C 6-10 aryl include phenyl, naphthyl, indanyl, tetrahydronaphthyl.
  • optionally substituted C 6-14 aryl include C 1-4 alkyl, —CO—C 6-10 aryl, —OH, — O-C 1-3 alkyl, -NO 2 , -CO 2 H, -CO 2 -C 1-4 alkyl, halogen, -NH 2 , -CH 2 -SO 3 H, -SO 3 H, -CN,- 1 to 5 (eg, 1-3, 1-2, and 1) identical or different members selected from the group consisting of CO—C 1-4 alkyl, —CF 3 , and C 6-10 aryl And C 6-14 aryl (or C 6-13 aryl, C 6-10 aryl) which may be substituted with a substituent.
  • the “bicyclic heterocyclic group” refers to a monocyclic aromatic ring having 1 to 4 heteroatoms selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom in a monocyclic aromatic ring (benzene, pyridine, etc.).
  • An 8- to 11-membered bicyclic group condensed with an aromatic ring pyridine, furan, thiophene, imidazole, pyrimidine, oxazole, thiazole, thiazine, triazole
  • a monocyclic non-aromatic ring tetrahydropyran, azepane, piperidine, etc.
  • Bicyclic heterocyclic groups can be attached at any heteroatom or carbon atom that results in a stable structure.
  • the bicyclic heterocyclic group may include one or more (eg, one or two) oxo groups.
  • a bicyclic heterocyclic group 2,3,4,5-tetrahydro-1H-1-benzoazepinyl, benzoxanyl, indolinyl, isoindolinyl, phthalazinyl, chromanyl, benzofuranyl, benzothiophenyl, pyrimidyl, benzothiazonyl, quinolyl, isochromanyl, benzotriazolyl.
  • examples of the “ optionally substituted bicyclic heterocyclic group” include C 6-10 aryl, C 1-4 alkyl, —CO—C 6-10 aryl, —OH, —O—C 1-. 3 alkyl, —NO 2 , —CO 2 H, —CO 2 —C 1-4 alkyl, halogen, —NH 2 , —CH 2 —SO 3 H, —SO 3 H, —CN, —CO—C 1- It may be substituted with the same or different 1 to 5 (eg, 1 to 3, 1 to 2, and 1) substituents selected from the group consisting of 4 alkyl, —CF 3 , and oxo. And bicyclic heterocyclic groups.
  • C 2-3 alkenyl means a linear or branched unsaturated hydrocarbon group having 2 to 3 carbon atoms and containing one or two double bonds.
  • vinyl, allyl, 1-propenyl, isopropenyl, allenyl for example, vinyl, allyl, 1-propenyl, isopropenyl, allenyl.
  • C 2-3 alkynyl means a linear or branched unsaturated hydrocarbon group having 2 to 3 carbon atoms and containing one triple bond, for example, ethynyl , Propynyl (1-propynyl, 2-propynyl).
  • C 1-4 alkylene means a divalent group derived from straight-chain C 1-4 alkyl.
  • Examples of C 1-4 alkylene include methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene.
  • C 1-6 alkylene means a divalent group derived from straight-chain C 1-6 alkyl.
  • Examples of C 1-6 alkylene include methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, pentamethylene.
  • C 1-3 alkylene means a divalent group derived from straight-chain C 1-3 alkyl. Examples of C 1-3 alkylene include methylene, ethylene, trimethylene.
  • examples of “optionally substituted C 1-6 alkylene (or C 1-5 alkylene, C 1-4 alkylene, C 1-3 alkylene)” include a group consisting of methyl, benzyl, cyano, and phenyl.
  • C 1-6 alkylene which may be substituted with the same or different 1 to 3 substituents selected from (for example, may be substituted with 1 methyl, 1 benzyl, or 1 phenyl) Or C 1-5 alkylene, C 1-4 alkylene, C 1-3 alkylene).
  • n is an integer of 1 to 3 (preferably 1 to 2), and preferred examples of —CO— (CH 2 ) n — include —CO—CH 2 -.
  • C 2-4 alkenylene means a divalent group derived from straight-chain C 2-4 alkenyl.
  • C 1-4 alkyl (including a case where it constitutes a part of a certain group)” means a linear or branched saturated hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms. .
  • Examples of C 1-4 alkyl include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl.
  • C 1-3 alkyl (including a part of a certain group)” means a linear or branched saturated hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Examples of C 1-3 alkyl include methyl, ethyl, propyl, isopropyl.
  • examples of “ —CO —C 6-10 aryl” include —CO-phenyl.
  • examples of the halogen include fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), and iodine (I).
  • Examples of more preferred sulfonic acid compounds include the compounds listed in the above [Item 21].
  • a method for producing a target peptide including the purification method of the present application.
  • an agent containing a target peptide purified by a method including the purification method of the present application is provided.
  • the agent can be produced by a usual method.
  • an agent containing a sulfonic acid compound for use in the purification method of the present application is provided.
  • the agent can be produced by a usual method.
  • the supernatant is removed from the solid-liquid mixture obtained after adding the solvent to the residue, and the amount (mol) of the target peptide relative to the total amount (mol) of the target peptide and the pseudo-analogous peptide in the obtained solid And the change is used to evaluate whether the target peptide has been purified in the solid.
  • -Peptide synthesizer "KMS-3” manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.
  • -Mass spectrometer "6224 TOF LC / MS” and "1260 Infinity series” manufactured by Agilent.
  • "Ionization conditions are ESI (capillary voltage: 3500V, fragmentor voltage: 100V)”
  • -HPLC analyzer "SPD-M20A”, “LC-20AD”, “SIL-20AC”, “DGU-20A”, “CTO-20AC”, “CBM-20A” or “CBM-20A” manufactured by Shimadzu Corporation “SPD-M20A”, “LC-2010C”, or “1200 series” manufactured by Agilent.
  • -Ylsulfonyl group (Pbf group), serine and threonine hydroxyl groups are tert-butyl groups (tBu groups), cysteine thiol groups and histidine imidazole groups are trityl groups (Trt groups), and tyrosine phenolic hydroxyl groups are the tert-butyl group (tBu group), the carboxamide group of asparagine and glutamine is the trityl group (Trt group), Amino group, beta-amino group and tryptophan indole group of Dap were used those protected with tert- butyloxycarbonyl group (Boc group).
  • a (2-chloro) trityl chloride resin manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd., about 1.6 mmol / g
  • a peptide sequence of a carboxamide at the C-terminal is synthesized.
  • Fmoc-NH-SAL resin manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd., about 0.43 mmol / g
  • the resin After washing, the resin is added with 2.5 equivalents of a DMF solution of Fmoc amino acid, 2.5 equivalents of a DMF solution of 1-hydroxybenztriazole and 2.5 equivalents of DIC, and shake-stirred for 40 minutes or more to give a C-terminal. Amino acids were introduced.
  • the excess reagent is removed by washing the resin three to five times with DMF, and then the Fmoc group, which is a protecting group for the terminal amino group, is removed with 20% piperidine. It was removed by shaking and stirring at room temperature for 10 minutes or more. The piperidine was removed by washing the resin with DMF three to five times and then condensed with the carboxyl group of the Fmoc protected derivative of the next amino acid in the amino acid sequence of the peptide of interest.
  • the resin was added by adding 2.5 equivalents of a Dmo solution of Fmoc-amino acid, 2.5 equivalents of a DMF solution of 1-hydroxybenztriazole, and 2.5 equivalents of DIC. The same removal of the Fmoc group and the condensation reaction with the Fmoc amino acid were repeated until the amino acid sequence of the target peptide was formed, whereby a protected peptide resin having the amino acid sequence of the target peptide was synthesized.
  • the Fmoc amino acid at the N-terminus is condensed, and the Fmoc group is removed by shaking and stirring at room temperature for at least 10 minutes in a 20% piperidine DMF solution.
  • the resin was removed by washing the resin three to five times to complete the synthesis of the protected peptide resin.
  • synthesizing a peptide sequence in which the N-terminus is protected by an Ac group the N-terminus is converted into a free amino group in the same manner as described above, and then a DMF solution containing 5 equivalents of acetic acid and 4.95 equivalents of N-hydroxysuccinic acid.
  • the target peptide does not contain an amino acid having a sulfur atom such as cysteine and methionine
  • TFA / water / TIS 95 / 2.5 / 2.5
  • MTBE was added to the residue, and the precipitated precipitate was subjected to solid-liquid separation by filtration or centrifugation, and MTBE washing was performed a plurality of times to synthesize a target peptide crude product.
  • step (3) Referring to the above step (2), the next amino acid is sequentially linked.
  • the order of the subsequent amino acids and the reaction time were as follows: Fmoc-Ser (tBu) -OH 20 hours, Fmoc-Lys (Boc) -OH 45 minutes, Fmoc-Ala-OH 3 hours, Fmoc-Arg (Pbf) -OH 16 hours, Fmoc-Glu (tBu) -OH 2.5 hours and Fmoc-Tyr (tBu) -OH 15 hours.
  • step (3) Referring to the above step (2), the next amino acid is sequentially linked.
  • the order of the subsequent amino acids and the reaction time were as follows: Fmoc-Ala-OH 2.5 hours, Fmoc-Arg (Pbf) -OH 15.5 hours, Fmoc-Leu-OH 2.5 hours and Fmoc-Ala-OH 2.5 hours It was time.
  • the target peptides shown in the following table were respectively synthesized by the solid phase method.
  • the HPLC analysis conditions were analyzed using the following HPLC conditions (conditions A to C) and the following conditions.
  • sulfonic acids were used by synthesizing the corresponding halides with sodium sulfite and acidifying the resulting sulfonic acid sodium salt with hydrochloric acid.
  • p-methylbenzylsulfonic acid Is described below. 1.55 g (7 mmol) of p-methylbenzyl bromide was dissolved in 4 mL of ethanol, 0.97 g (7.7 mmol; 1.1 equivalents) of sodium sulfite and 8 mL of water were added, and the mixture was heated under reflux overnight.
  • the reaction solution was concentrated with an evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added to the residue, and the mixture was separated.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator.
  • MTBE 5 mL
  • heptane 5 mL
  • the precipitated solid was separated by filtration, and the filtrate was concentrated with an evaporator.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • IPA isopropyl alcohol
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DIC diisopropyl carbodiimide
  • TIS triisopropyl silane MTBE: methyl tertiary butyl ether
  • Test Example 1 Purification of Target Peptide-1 (Removal of Related Peptide)
  • a peptide solution or a crude peptide solution was used.
  • the poorly soluble peptide was diluted and dissolved to about 5 mM (assuming that the purity of each peptide was 100%).
  • Each acid compound was dissolved in water or, when it was hardly soluble in water, in a 10% aqueous IPA solution or a 10% DMSO aqueous solution to obtain a 50 mM acid compound solution.
  • a crude target peptide solution (1 ⁇ mol (assuming the purity of the target peptide was 100%)) and a crude analog peptide solution (0.1 ⁇ mol (assuming the purity of the analog peptide was 100%)) were mixed.
  • the mixture was mixed with an acid compound solution (1.5 ⁇ mol) (HPLC analysis (before treatment)) and lyophilized to dryness. 100 ⁇ L of IPA was added to the residue, and the mixture was shaken at room temperature overnight.
  • the obtained slurry was subjected to centrifugal filtration (5000 to 15000 rpm, 1 to 5 minutes), and the cake was washed twice with 150 ⁇ L of IPA. The filtrate and the washing were combined. The obtained solid and the filtrate were analyzed by HPLC (solid after treatment / filtered solution after treatment).
  • HPLC measuring instrument is the same as above. Measurement conditions: follow each HPLC condition (HPLC conditions AZ) during peptide synthesis.
  • long-wavelength ultraviolet absorption can be exclusively attributed to the aromatic side chain.
  • the HPLC detection wavelength for analyzing the peptide corresponding to this is condition A (when detecting at 274 nm), condition D, conditions FG, and conditions RT.
  • condition A when detecting at 274 nm
  • condition R, and condition T the target peptide and the related peptide each have one aromatic amino acid residue, five in condition F, and four in condition G and condition S.
  • condition D the target peptide has three aromatic amino acid residues and the related peptide has two.
  • the number of aromatic side chains contributing to long-wavelength ultraviolet absorption at 274 to 281 nm is the same or one difference between the target peptide and the related peptide, and the ratio of the HPLC area values can be regarded as an approximate molar ratio.
  • a peptide containing no aromatic amino acid residue has no ultraviolet absorption on the long wavelength side, and short wavelength ultraviolet absorption (205 nm) due to a carbonyl group can be used for detection.
  • the target peptide has 10 carbonyl groups and the related peptide has 9 carbonyl groups.
  • the number is 31 and 30, in the condition L, the number is 32 and 31, and in the condition M, the number is 9 and 8.
  • the number of carbonyl groups contributing to short-wavelength ultraviolet absorption at 205 nm is a difference of 1 to 3 between the target peptide and the analogous peptide, and the ratio of the HPLC area values can be regarded as an approximate molar ratio.
  • the target peptides (9) and (10) have aromatic side chains but have a sufficiently long chain length and many carbonyl groups, they were detected by UV absorption (205 nm) of carbonyl groups under condition I, but on the long wavelength side It can also be detected (both the target peptide and the analogous peptide have six aromatic amino acid residues).
  • the target peptide (16) and the related peptide (25) have two aromatic side chains, respectively, and were detected at 205 nm.
  • the short-wavelength UV absorption (205 nm) due to the carbonyl group is used for detection.
  • Target peptide ratio (%) target peptide area / (target peptide area + related peptide area) ⁇ 100 ⁇ Target peptide (mol) / (target peptide (mol) + related peptide (mol)) ⁇ 100
  • Evaluation 1 Verification of salt formation When a peptide and an acid compound are mixed, an acid compound forms a salt with the amino group at the N-terminus or the side chain portion of a basic amino acid (lysine K, arginine R, histidine H, etc.). there is a possibility.
  • a basic amino acid lysine K, arginine R, histidine H, etc.
  • the point of increase in the target peptide ratio (%) is that no acid compound is used.
  • the point was 1.4 points
  • the point of sulfuric acid was 2.0 points
  • the point of the sulfonic acid compound was 2.1 points.
  • the target peptide having free N-terminal: H-YFYPEL-NH 2 and its related peptide: H-YYPEL-NH 2 -0.3 point when no acid compound is used, and 0.2 point for sulfuric acid
  • the value of the sulfonic acid compound was 3.1 points, and the increase point of the sulfonic acid compound was larger than that of the non-acid compound and sulfuric acid.
  • the peptide forms a salt with the sulfonic acid compound and becomes a solid
  • the solubility of the obtained solid in the solvent changes significantly as compared with the original peptide.
  • the target peptide ratio (%) of the target peptide Ac-YFYPEL-NH 2 and the related peptide Ac-YYPEL-NH 2 in which the N-terminus was protected with an Ac group was increased. This is thought to be due to the difference in the dissolution behavior of these peptides in IPA.
  • Table 5-2 object no groups capable of salt formation for the peptide: Pyr-GPWLEEEEEAYGWMDF-NH 2 and its analogs Peptides: In Pyr-GPWLEEEEEYGWMDF-NH 2, the rise point of the desired peptide rate whether acid compound used (%) difference There was no.
  • Evaluation 2 Effect of sulfonic acid compound Using the acid compound, the target peptide and the analogous peptide shown in the following table, the rising point of the target peptide ratio (%) in the obtained solid was calculated in the same manner as described above. The results are shown in the table below.
  • Evaluation 4 Comparison with a carboxylic acid compound Using the sulfonic acid compound or the carboxylic acid compound shown in the following table, and a target peptide and an analogous peptide, an increase in the target peptide ratio (%) in the obtained solid in the same manner as described above. Points were calculated. The results are shown in the table below.
  • Evaluation 5 Effect of various sulfonic acid compounds (1) Using the sulfonic acid compound, target peptide and related peptide shown in the table below, there was a sample for which the target peptide ratio in the solid could not be calculated due to analytical problems. It was calculated as “point of decrease in target peptide ratio (%)” using 3). Since the respective concentrations of the target peptide and the analogous peptide before and after the treatment are unknown, and the HPLC sensitivity of the target peptide and the analogous peptide is not the same, the concentration of the target peptide (%) in the filtrate was reduced from the point of decrease in the solid content. Although the target peptide ratio (%) cannot be converted to an increasing point, a decrease in the target peptide ratio in the filtrate means an increase in the target peptide ratio in the solid.
  • Evaluation 6 Effect of various sulfonic acid compounds (2) Using the acid compounds, target peptides and analogous peptides shown in the following table, the increase point of the target peptide ratio (%) in the obtained solid was calculated in the same manner as described above. The results are shown in the table below.
  • the target peptide ratio in the obtained solid was increased (or the target peptide ratio in the obtained filtrate was lowered), and the sulfonic acid compound had an excellent effect in purifying various target peptides. Indicated.
  • Test Example 2 Study of solvent-1
  • the acid compound was dissolved in water to obtain a 30 mM acid compound solution.
  • a crude target peptide solution (1 ⁇ mol (assuming the purity of the target peptide was 100%)) and a crude analog peptide solution (0.1 ⁇ mol (assuming the purity of the analog peptide was 100%)) were mixed.
  • the mixture was mixed with an acid compound solution (0.9 ⁇ mol) (HPLC analysis (before treatment)) and lyophilized to dryness.
  • the acid compound is It was used.
  • 100 ⁇ L of the solvent shown in the table below was added to the residue, and the mixture was shaken at room temperature overnight.
  • the obtained slurry was subjected to centrifugal filtration (14000 rpm, 1 minute), and the cake was washed twice with 100 ⁇ L of the solvent.
  • the filtrate and the washing were combined.
  • the obtained solid and the filtrate were analyzed by HPLC (solid after treatment / filtered solution after treatment). In the same manner as above, the point of decrease in the target peptide ratio (%) in the obtained filtrate was calculated.
  • the HPLC area percentage of the target peptide (however, the peak of the sulfonic acid compound was excluded from the total area) was calculated from the HPLC analysis results of the solution before treatment and the solid after treatment.
  • the absolute and relative purities of the target peptide were improved, and the sulfonic acid compound was effective in purifying the target peptide regardless of the solvent used.
  • a solvent suitable for removing the related peptide can be selected.
  • the following test was performed using the same target peptide, analogous peptide, and sulfonic acid compound as in Test Example 2.
  • the crude target peptide, the crude analog peptide, and the sulfonic acid compound are dissolved in water / acetonitrile (1/2), respectively, and the crude target peptide and the crude analog peptide are dissolved at 50 mM (each purity is assumed to be 100%), and the sulfonic acid compound is dissolved.
  • Test example 4 Sulfonic acid removal
  • the following test was performed using the same target peptide, analogous peptide, and sulfonic acid compound as in Test Example 3.
  • the crude target peptide, the crude analog peptide, and the sulfonic acid compound are dissolved in water / acetonitrile (1/2), respectively, and the crude target peptide and the crude analog peptide are dissolved at 50 mM (each purity is assumed to be 100%), and the sulfonic acid compound is dissolved.
  • the combined solid, supernatant and washing solution were lyophilized to give 59.58 mg of solid-derived residue and 5.40 mg of supernatant and washing-derived residue.
  • Oasis WAX Cartridge (6 cc / 150 mg) (manufactured by Waters)
  • the solution was passed in the order of 1 mL of 1N aqueous sodium hydroxide, 7 mL of water (purified water), and 2 mL of water / MeOH (10/1). Processing was performed. 15.74 mg of the above solid-derived residue was dissolved in 1 mL of water / MeOH (10/1) and analyzed by HPLC (condition A, after treatment. Sulfonic acid eluted around 5.1 minutes).
  • the above solution was loaded on a pretreated Oasis WAX Cartridge (6 cc / 150 mg), and 9 mL of water / MeOH (10/1) was passed.
  • the solution passed through the cartridge was analyzed by HPLC to confirm the removal of the sulfonic acid (condition A, after the removal of the sulfonic acid). Lyophilization gave 9.47 mg of a residue.
  • the following table shows the solution before the treatment with the sulfonic acid compound, the solid after the treatment, and the HPLC area percentage of the target peptide in the HPLC analysis after the removal of the sulfonic acid compound.
  • Test Example 5 Study of solvent-2
  • the sulfonic acid compound was dissolved in water to obtain a 50 mM sulfonic acid compound solution.
  • a crude target peptide solution (1 ⁇ mol (assuming the purity of the target peptide was 100%)) and a crude analog peptide solution (0.1 ⁇ mol (assuming the purity of the analog peptide was 100%)) were mixed.
  • the mixture was mixed with a sulfonic acid compound solution (1.5 ⁇ mol) (HPLC analysis (before treatment)) and lyophilized to dryness.
  • the sulfonic acid compound is It was used.
  • 100 ⁇ L of the solvent shown in the table below was added to the residue, and the mixture was shaken at room temperature overnight.
  • the obtained slurry was subjected to centrifugal filtration (14000 rpm, 1 minute), and the cake was washed twice with 100 ⁇ L of the solvent.
  • the filtrate and the washing were combined.
  • the obtained solid and the filtrate were analyzed by HPLC (solid after treatment / filtered solution after treatment). In the same manner as above, the point of decrease in the target peptide ratio (%) in the obtained filtrate was calculated.
  • the HPLC area percentage of the target peptide (excluding the peak of the sulfonic acid compound from the total area of the solid after the treatment) was calculated from the HPLC analysis results of the solution before the treatment and the solid after the treatment. The results are shown in the table below. As shown in the table below, the improvement of the absolute purity and the relative purity of the target peptide was shown, and the sulfonic acid compound was effective in purifying the target peptide regardless of the solvent used.
  • Test Example 6 Purification of target peptide-2
  • the HPLC area percentage of the target peptide in the solution before treatment and the solid peptide after treatment was calculated.
  • Test Example 7 Purification of target peptide-3
  • H-AQKLRASD-OH (described as target peptide (7) in Table 1) obtained in the above “1-1: Synthesis of peptide (paragraph numbers [0082] to [0128])” is a crude analog H-QKLRASD-OH (referred to as analogous peptide (19) in Table 1) was used as a peptide, and the crude target peptide was tested using the same sulfonic acid compound as in paragraph [0167] ([Table 14-1]). The test was performed in the same manner as in Example 1 (paragraph number [0141]). The results are shown in the table below.
  • H-AQKLRASD-OH (described as the target peptide (7) in Table 1) is used as a crude analog peptide
  • H-AQKLRSD-OH (described as an analog peptide (20) in Table 1) is used as a crude target peptide.
  • a test was conducted in the same manner as in Test Example 1 (paragraph number [0141]) using the same sulfonic acid compound as paragraph number [0172] ([Table 16-2]). The results are shown in the table below.
  • H-YERAKSNM-OH (described in Table 1 as target peptide (8)) is used as a crude analog peptide
  • H-YERAKNM-OH (described in Table 1 as analog peptide (9)) is used as a crude target peptide.
  • a test was performed in the same manner as in Test Example 1 (paragraph number [0141]) using the same sulfonic acid compound as paragraph number [0155] ([Table 7]). The results are shown in the table below.
  • H-YERAKSNM-OH (described as target peptide (8) in Table 1) is a crude analog peptide
  • H-YERAKSN-OH (described as analog peptide (23) in Table 1) is a crude target peptide.
  • Test Example 7 in order to further prove that the method of the present invention is a very versatile peptide purification method, the molar ratio of the target peptide and the related peptide in Test Example 1 was changed, that is, Test Example 1
  • the test was carried out using the target peptide of the above test example as the target peptide, and the target peptide of the above Test Example as the target peptide.
  • Test Example 1 paragraph [0167] [Table 14-1] shows that the target peptide (7) H-AQKLRASD-OH and the related peptide (19) H-QKLRASD-OH had a molar ratio of about 10: 1.
  • Test Example 7 the molar ratio (theoretical value) was reversed while using the same sulfonic acid compound, that is, (7) H-AQKLRASD -OH: (19) The test was performed using a model in which H-QKLRASD-OH was mixed at about 1:10.
  • the molar ratio was reversed, and a test was performed using the same sulfonic acid compound as in each of the above Test Examples.
  • Test Example 8 Effect of various sulfonic acid compounds (removal of multiple related peptides) Using a plurality of crude analog peptide solutions (0.1 ⁇ mol each (assuming the purity of the analog peptide is 100%)), each of the solids obtained in the same manner as in Test Example 1 (paragraph number [0141]) was used. The rising point of the target peptide ratio (%) relative to the related peptide was calculated. The results are shown in the table below.
  • the target peptide ratio in the obtained solid was increased, and the sulfonic acid compound showed an excellent effect in purifying various target peptides.
  • the method of the present application can be used for peptide purification.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)

Abstract

本願は、ペプチド合成によって得られたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得、固液分離して該固体を採取する工程を含む、目的ペプチドを精製する方法を提供する。

Description

スルホン酸化合物によるペプチド精製方法
　本願は、ペプチド合成によって得られるペプチドから目的ペプチドを精製する方法、および該精製方法によって得られた目的ペプチドを含む薬剤に関する。
　比較的アミノ酸残基が少ないペプチド（通常３０残基以下）は有機化学的合成法により製造されるのが一般的である（例えば特許文献１）。有機化学的合成法としては固相法と液相法が挙げられ、Ｎ－保護アミノ酸とＣ－保護ペプチド（ジペプチド形成時にはＣ－保護アミノ酸）とのカップリング反応とそれに続くＮ末端脱保護反応とからなるペプチド伸長反応が繰り返される。有機化学的合成法では、当該ペプチド伸長反応の一部重複、一部欠落等により様々な類縁ペプチドも合成されてしまうため、生成した目的ペプチドをこれらの類縁ペプチドから分離する必要がある。しかしながら、類縁ペプチドの物理化学的性質は目的ペプチドのそれと酷似することが多いため、その分離は非常に困難である。精製された目的ペプチドを得るために、目的ペプチドと類縁ペプチドを効果的に分離する方法が求められている。
　アミノ酸残基が多いペプチド（通常３０残基を超える）は発酵法により製造されるのが一般的である（例えば特許文献２）。この場合にもアミノ酸残基が一部置換等した類縁ペプチドが混入してしまうことがあり、性質が酷似するこれらの分離は重大な課題である。
　また、現在のところペプチドの精製は、スケールアップした場合でも、コスト的に多大な負担がかかる分取高速液体クロマトグラフィーによる方法で行うのが一般的である。分取高速液体クロマトグラフィーに代わる、あるいはこれを補うための、目的ペプチドと類縁ペプチドの混合物から類縁ペプチドを効果的に分離除去する方法が求められている。
特開２０１８－５２９３３ 特開２０１６－１９０８５１
　本明細書において引用する先行技術文献の開示は全て参照することにより、本明細書に組み込まれる。
　本願の課題は、ペプチド合成によって得られる目的ペプチドと類縁ペプチドを含む混合物から類縁ペプチドを除去することを含む、目的ペプチドを精製する方法の提供である。
　さらに本願の課題は、従来のペプチド精製方法に代わる、あるいはこれを補うためのペプチド精製方法の提供である。
　本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、類縁ペプチドを含む目的ペプチドのペプチド合成産物において、溶媒の存在下で所定の構造を有するスルホン酸化合物を混合させ固液分離することで、目的ペプチドの純度（絶対純度、ただしスルホン酸化合物を除く）が向上すること、および、類縁ペプチドの割合が減少した目的ペプチドのスルホン酸塩の固形物が得られることを見出し、本願発明に至った。以下に本願の発明を詳説する。
［項１］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
を含む、方法。
［項１－１］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）該混合から１分以上経過後に固液分離して該固体を採取する工程
を含む、方法。
［項１－２］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
　該方法は
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
を含み、
　該溶媒は、水；アルコール化合物；アセトニトリル；エーテル化合物；ケトン化合物；エステル化合物；炭化水素化合物；ＤＭＳＯ；アミド化合物；ハロゲン化炭化水素；または、これらの混合を含有する、
方法。
［項１－３］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
（３）該固体を洗浄する工程
を含む、方法。
［項１－４］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）０～５０℃で、該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）０～５０℃で、固液分離して該固体を採取する工程
を含む、方法。
［項１－５］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
を含み、
　該溶媒と該目的ペプチドの重量比（溶媒／目的ペプチド）が１～１０００００である、
方法。
［項１－６］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
　該方法は、
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
を含み、
　該目的ペプチドに対する該スルホン酸化合物のモル比が０．１～５０である、
方法。
［項１-７］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法。
［項２］
　該スルホン酸化合物が式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （Ｉ）
［式中、
　Ａは、置換されていてもよいＣ６－１４アリール（例えばＣ６－１３アリール、Ｃ６－１０アリール）、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、Ｃ２－３アルケニル、またはＣ２－３アルキニルであり；
　Ｘは、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１－6アルキレン（例えばＣ１－５アルキレン、Ｃ１－4アルキレン）、
（ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２－４アルケニレン
であり；および
　ｎは１～３の整数である］
の化合物である、項１、および項１-１～１-７のいずれか１項に記載の方法。
［項３］
　Ａが置換されていてもよいＣ６－１４アリール（例えばＣ６－１３アリール、Ｃ６－１０アリール）であり；
　Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１－６アルキレン（例えばＣ１－５アルキレン、Ｃ１－4アルキレン、Ｃ１－３アルキレン）、
（ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２－３アルケニレン
であり；および
　ｎが１～３の整数である
項２に記載の方法。
［項４］
　Ａが置換されていてもよい二環式ヘテロ環基であり；
　Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）Ｃ１－６アルキレン（例えばＣ１－５アルキレン、Ｃ１－4アルキレン、Ｃ１－３アルキレン）、
（ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２－３アルケニレン
であり；および
　ｎが１～３の整数である
項２に記載の方法。
［項５］
　ＡがＣ２－３アルケニルであり；および
　ＸがＣ１－４アルキレンである
項２に記載の方法。
［項６］
　ＡがＣ２－３アルキニルであり；および
　ＸがＣ１－４アルキレンである
項２に記載の方法。
［項７］
　該目的ペプチドが５～３１個のアミノ酸残基を有する、項１～６および項１-１～１-７のいずれか１項に記載の方法。
［項８］
　該合成されたペプチドに類縁ペプチドが含まれる、項１～７および項１-１～１-７のいずれか１項に記載の方法。
［項９］
　該合成されたペプチドにおいて、該目的ペプチドに対して、類縁ペプチドのモル比が０．７以下である、項１～８および項１-１～１-７のいずれか１項に記載の方法。
［項１０］
　該ペプチド合成が固相法によるペプチド合成である、項１～９および項１-１～１-７のいずれか１項に記載の方法。
［項１１］
　該目的ペプチドが少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を含み、かつ、該目的ペプチドのＮ末端が遊離であってもよい、項１～１０および項１-１～１-７のいずれか１項に記載の方法。
［項１２］
　Ａが、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびＣ６－１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよいＣ６－１４アリール（例えばＣ６－１３アリール、Ｃ６－１０アリール）である、項２、３、および７～１１のいずれか１項に記載の方法。
［項１３］
　Ａがフェニル、ナフチル、フルオレニル、およびインダニルから選択されるＣ６－１３アリールであって、該Ｃ６－１３アリールは、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびＣ６－１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよい、項２、３、および７～１２のいずれか１項に記載の方法。
［項１３－１］
　Ａがフェニル、ナフチル、およびインダニルから選択されるＣ６－１０アリールであって、該Ｃ６－１０アリールは、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびＣ６－１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよい、項２、３、および７～１２のいずれか１項に記載の方法。
［項１４］
　Ａが、2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、およびベンゾトリアゾリルからなる群から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は適宜置換されていてもよい、項２、４、および７～１１のいずれか１項に記載の方法。
［項１５］
　Ａが、Ｃ６－１０アリール、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基である、項２、４、７～１１、および１４のいずれか１項に記載の方法。
［項１６］
　Ａが
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 および
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は１つのフェニルで置換されていてもよい、項２、４、７～１１、１４、および１５のいずれか１項に記載の方法。
［項１７］
　Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）メチル、ベンジル、シアノ、およびフェニルからなる群から選択される同一または異なった１～３個の置換基で置換されていてもよいＣ１－４アルキレン（例えばＣ１－３アルキレン）、または
（ｉｉｉ）－ＣＯ－ＣＨ２－（ＣＯがＡと結合する）、
である、項２～４、および７～１６および項１３－１のいずれか１項に記載の方法。
［項１７-１］
　Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、１つのシアノ、および／または１つもしくは２つのフェニルで置換されていてもよいＣ１－４アルキレン（例えばＣ１－３アルキレン）、または
（ｉｉｉ）－ＣＯ－ＣＨ２－（ＣＯがＡと結合する）、
である、項２～４、および７～１６、および項１３－１のいずれか１項に記載の方法。
［項１８］
　Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）メチル、ベンジル、シアノ、およびフェニルからなる群から選択される同一または異なった１～３個の置換基で置換されていてもよいＣ１－４アルキレン（例えばＣ１－３アルキレン）、または
（ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）－（ＣＯがＡと結合する）、
である、項１２に記載の方法。
［項１８-１］
　Ｘが、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、１つのシアノ、および／または１つもしくは２つのフェニルで置換されていてもよいＣ１－４アルキレン（例えばＣ１－３アルキレン）、または
（ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）－（ＣＯがＡと結合する）、
である、項１２に記載の方法。
［項１９］
　Ｘが単結合である、項２～４、および７～１８、および項１３－１、１７－１、および１８－１のいずれか１項に記載の方法。
［項２０］
　Ｘが単結合である、項１６に記載の方法。
［項２１］
　該スルホン酸化合物が下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022


Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024

から選択される、項１～２０、および項１-１～１-７、１３－１、１７－１、および１８－１のいずれか１項に記載の方法。
［項２２］
　該スルホン酸化合物を除去する工程をさらに含む、項１～２１、および項１-１～１-７、１３－１、１７－１、および１８－１のいずれか１項に記載の方法。
［項２３］
　目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比を向上させるための、項１～２２、および項１-１～１-７、１３－１、１７－１、および１８－１のいずれか１項に記載の方法。
［項２４］
　項１～２３、および項１-１～１-７、１３－１、１７－１、および１８－１のいずれか１項に記載の方法を含む、該目的ペプチドを製造する方法。
［項２５］
　項１～２３、および項１-１～１-７、１３－１、１７－１、および１８－１のいずれか１項に記載の方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する薬剤。
［項２６］
　項１～２３、および項１-１～１-７、１３－１、１７－１、および１８－１のいずれか１項に記載の方法において使用されるための、該スルホン酸化合物を含有する剤。
［項２７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 および
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 から選択される、化合物。
［項２８］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから精製された目的ペプチドを含有する薬剤であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
を含む、薬剤。
［項２８-１］
　ペプチド合成によって得られたペプチドから精製された目的ペプチドを含有する薬剤であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、薬剤。
　［項２９］
　ペプチド合成によって得られたペプチドからの目的ペプチドの精製において使用するためのスルホン酸化合物を含有する剤であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
を含む、剤。
　［項２９-１］
　ペプチド合成によって得られたペプチドからの目的ペプチドの精製において使用するためのスルホン酸化合物を含有する剤であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、該精製は
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物を含有する剤と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、剤。
　本発明によれば、合成によって得られた類縁ペプチドを含みうるペプチドから、目的ペプチドの純度が向上したペプチドが提供される。
　１つの態様において、本願は、ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
（２）固液分離して該固体を採取する工程
を含む、方法を提供する。
　１つの態様において、本願は、ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
（１）該合成されたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合し、
（２）得られた固形物を液相から分取する
工程を含む、方法を提供する。
　本願において「精製する」とは、ある物質の純度が向上することを意味する。ここで純度とは、絶対純度（対象とする物質を含む混合物の総量に対する該物質の量）も相対純度（ある混合物に含まれる他の物質（例えば不純物）の量に対する対象とする物質の量）も意味することがある。
　例えば、本願発明において「目的ペプチドを精製する」には、スルホン酸化合物との混合前の合成ペプチドの総量に対するそこに含まれる目的ペプチドの量（例えば重量％）と比較して、スルホン酸化合物との混合後に得られた固形物からスルホン酸化合物に相当する分を除いた重量に対するそこに含まれる目的ペプチドの量（例えば重量％）が向上することが含まれる。本願発明において「目的ペプチドを精製する」には、例えば、スルホン酸化合物との混合前と比較して、当該混合後に得られた固形物中の目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比が向上することが含まれる。
　本願において目的ペプチドの純度の測定方法は特に限定されず、通常用いられる方法（例えばＨＰＬＣ法）により測定されうる。
　本願において、「ペプチド合成」とは、ペプチドを合成する方法であれば特に限定されず、例えば、有機化学的合成法（例えば固相法および液相法）および発酵法が挙げられ、通常の方法により行われ得る。ペプチド合成においては不純物（例えば類縁ペプチド）の生成が抑制される合成条件（例えば、有機化学的合成法においては、樹脂、保護基、反応温度、反応時間、溶媒；発酵法においては、培養条件、宿主、ベクター、塩基配列等）に設定されるのが通常である。本願においても、ペプチド合成は当業者に通常知られる知識に基づいて、類縁ペプチドの生成が抑制される合成条件に設定されることが好ましく、ペプチド合成によって得られたペプチドにおいては目的ペプチドの物質量が類縁ペプチドの物質量よりも多いことが好ましい。
　例えば、ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて、該類縁ペプチドの該目的ペプチドに対するモル比（類縁ペプチド／目的ペプチド）が０．７以下（好ましくは０．６以下、より好ましくは０．５以下、さらに好ましくは０．４５以下、さらにより好ましくは０．４以下、より好ましくは０．２以下）である。該類縁ペプチドの該目的ペプチドに対するモル比は低い方が好ましく、下限は特に限定されるものではないが、例えば、０．０００１～０．７、０．００１～０．６、０．０１～０．５の範囲が該モル比の範囲の例として挙げられる。該モル比は、例えばＨＰＬＣ法により得られた値（例えば面積比）により、モル比の近似値として算出された値を用いてもよい。
　ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて、「目的ペプチドの物質量が類縁ペプチドの物質量よりも多い」とは、目的ペプチドの物質量がある１種の類縁ペプチドの物質量よりも多いことを意味し、複数の類縁ペプチドが含まれる場合には、各類縁ペプチドの物質量とそれぞれ比較して目的ペプチドの物質量が多いことを意味する。ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて、「目的ペプチドの物質量が類縁ペプチドの物質量よりも多い」ことは、当該ペプチド合成によって得られたペプチドの総量における目的ペプチドの量（絶対純度）が多い（例えば、ペプチド合成によって得られたペプチドにおける目的ペプチドの濃度が４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、および９０重量％以上）ことにより、当該ペプチド合成によって得られたペプチドにおいて類縁ペプチドの物質量が目的ペプチドの物質量よりも低い蓋然性が極めて高いことにより示されうる。
　本願において「目的ペプチド」とは、ペプチド合成により生成することを目的として生成されるペプチドを意味し、該目的ペプチドの構造は、そのＮ末端が遊離であるか、少なくとも１つ（例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、および１個）の塩基性アミノ酸残基を有するか、またはそのＮ末端が遊離でありかつ少なくとも１つ（例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、および１個）の塩基性アミノ酸残基を有する限り、特に限定されない。目的ペプチドは好ましくは５～３１個のアミノ酸残基、より好ましくは５～２５個、さらに好ましくは５～２０個、よりさらに好ましくは５～１５個のアミノ酸残基を有する。目的ペプチドのアミノ酸残基数の範囲は、５、６、７、および８から選択される下限値と、３１、２５、２０、１５、および１０から選択される上限値との組合せにより示されうる。
　目的ペプチドに含まれうるアミノ酸残基は、通常タンパク質を構成する下表の２０種のアミノ酸（不斉炭素を有しないグリシン以外はＬ体）に加え、Ｌ－セレノシステイン、２－アミノイソ酪酸、Ｄ－イソバリン、Ｌ－イソバリン、Ｌ－ノルロイシン、Ｌ－オルニチン等の天然に存在するアミノ酸に由来するアミノ酸残基であっても、天然には存在しないか存在しても微量である（そのため通常化学合成等により製造される）非天然アミノ酸由来のアミノ酸残基でも良い。
　非天然アミノ酸の例として、下表に示すグリシンを除く１９種類のアミノ酸のＤ体；下表に示す２０種類のアミノ酸のＮ－メチル体（例えばＮ－メチルグリシン、Ｌ－Ｎ－メチルフェニルアラニン）とＮ－メチルグリシンを除く１９種類のＬ－Ｎ－メチル体の鏡像体；下表に示すグリシンとアラニンを除く１８種類のアミノ酸のα－メチル体の両鏡像体（例えばα－メチルリジン）；下表に示すアラニンを除く１９種類のアミノ酸のα－エチル体の両鏡像体；
Ｄ－セレノシステイン；
Ｄ－ノルロイシン；
Ｄ－オルニチン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－２，３－ジアミノプロピオン酸；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－２，４－ジアミノ酪酸；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－ピログルタミン酸；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－α－メチルーオルトフルオロフェニルアラニン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－α－（４－ペンテニル）アラニン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－α－（７－オクテニル）アラニン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－α－プロパルギルアラニン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－α－アリルアラニン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－インダン－２－イルグリシン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－ピリジン－３－イルメチルグリシン、及びそのピリジン環上がアルキル基で置換されていても良いフェニル基で置換されていても良い誘導体；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－ピリジン－２－イルメチルグリシン；
（Ｓ）－又は（Ｒ）－ピペコリン酸；および
（Ｓ）－又は（Ｒ）－及びｔｒａｎｓ－又はｃｉｓー４－ヒドロキシプロリン；
ＲＣ８（（Ｒ）－α－（７－オクテニル）アラニン）；
ＳＣ５（（Ｓ）－α－（４－ペンテニル）アラニン）；
が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　本願において塩基性アミノ酸残基とは、アミノ基のほかに塩基性を示す残基をもつアミノ酸（例えば、Ｄ－又はＬ－リジン、Ｄ－又はＬ－アルギニン、Ｄ－又はＬ－ヒスチジン、Ｄ－又はＬ－オルニチン、（Ｓ）－又は（Ｒ）－２，３－ジアミノプロピオン酸、および（Ｓ）－又は（Ｒ）－２，４－ジアミノ酪酸）に由来するアミノ酸残基を意味する。
　本願において目的ペプチドは末端がペプチド合成において通常使用される保護基等（例えば、Ｎ末端がＡｃ基（アセチル基）、Ｆｍｏｃ基（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基）、またはＢｏｃ基（tert-ブトキシカルボニル基）で；Ｃ末端がアミド基、またはエステル基で）修飾されていてもよい。
　本願において「類縁ペプチド」とは、目的ペプチドを生成するためのペプチド合成により生成されうる、目的ペプチドではないペプチドを意味する。類縁ペプチドの例として、
（１）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１～３アミノ酸残基、連続または不連続の１～２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）が重複した；
（２）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１～３アミノ酸残基、連続または不連続の１～２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）が欠損した；
（３）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１～３アミノ酸残基、連続または不連続の１～２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）がエピマー化（例えば、Ｎ－保護アミノ酸のα－位異性化によるエピマー化）した；および／または
（４）目的ペプチドに含まれるアミノ酸残基の一部（例えば、連続または不連続の１～３アミノ酸残基、連続または不連続の１～２アミノ酸残基、および１アミノ酸残基）が同数のアミノ酸残基により置換された、
ペプチドが挙げられる。
　類縁ペプチドのアミノ酸残基数は、例えば、目的ペプチドのアミノ酸残基数と同数であるか、１～３個（好ましくは１～２個、より好ましくは１個）多いか、または１～３個（好ましくは１～２個、より好ましくは１個）少ない。
　「類縁ペプチド」は、塩基性部分（そのＮ末端が遊離／少なくとも１つ（例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、および１個）の塩基性アミノ酸残基を有している）を有していてもよく、そのような塩基性部分を有していなくてもよい。本願発明の効果は特定のメカニズムに限定されるものではないが、上述のとおり、ペプチド合成によって得られるペプチドにおいて、目的ペプチドの量（物質量）は類縁ペプチドの量と比較して通常多く、目的ペプチドと類縁ペプチドの構造が類似している場合、溶媒に対する両者の溶解特性は通常近似しうるため、「類縁ペプチド」が塩基性部分を有する場合には目的ペプチドと同様にスルホン酸化合物と塩を形成して固体となりうるものの、スルホン酸化合物との混合後に得られた固形物では、類縁ペプチドより元々多く含まれていた目的ペプチドの割合が上昇しうる。
　本願においてスルホン酸化合物との混合の際に使用される溶媒は特に限定されず、目的ペプチドの精製効率を考慮して適宜選択されうる。
例えば、該溶媒は、
　水；
　アルコール化合物（例えば、Ｃ１－４のアルコール（例えば、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール））；
　アセトニトリル；
　エーテル化合物（例えば、Ｃ２－６エーテル（例えばジエチルエーテル、ＭＴＢＥ、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、ＣＰＭＥ（シクロペンチルメチルエーテル）））；
　ケトン化合物（例えば、Ｃ３－６ケトン（例えばアセトン）、ＭＥＫ（メチルエチルケトン）、メチルイソプロピルケトン、ＭＩＢＫ（メチルイソブチルケトン））；
　エステル化合物（例えば、Ｃ３－６エステル（例えば酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ－ブチル））；
　炭化水素化合物（例えばＣ６－９炭化水素（例えばトルエン））；
　ＤＭＳＯ；
　アミド化合物（例：ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、ＤＭＡ（Ｎ，Ｎージメチルアセトアミド）、ＮＭＰ（Ｎ－メチルピロリドン））；
　ハロゲン化炭化水素（例：クロロホルム、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン）；または
　これらの混合（ここで該混合は組み合わせを意味する）
を含有する。該溶媒は他の物質をさらに含有してもよい。
　さらに溶媒の例としては、水、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、アセトニトリル、エタノール、酢酸エチル、トルエン、ＭＴＢＥ、ＤＭＳＯ、ジエチルエーテル、およびそれらの混合（ここで該混合は組み合わせを意味する）が挙げられ、該溶媒は他の物質をさらに含有してもよい。
　ペプチド合成によって得られたペプチドを溶媒の存在下でスルホン酸化合物と混合する際の、該ペプチドに対する溶媒の量、スルホン酸化合物の量は特に限定されず、目的ペプチドの精製効率を考慮して適宜選択されうる。例えば、溶媒は重量比でペプチド合成によって得られた目的ペプチド１（理論値であってもよい）に対して、１～１０００００、好ましくは１～１００００、好ましくは１～２０００、さらにより好ましくは１０～１０００の範囲で使用されうる。
　例えばスルホン酸化合物は目的ペプチドに対するモル比（理論値であってもよい）が、０．１～５０、好ましくは０．２～４０、さらに好ましくは０．３～３０、よりさらに好ましくは０．５～２０である。さらに、例えばスルホン酸化合物は目的ペプチドに対するモル比（理論値であってもよい）が、スルホン酸化合物がスルホ基を１つ有する場合は、例えば０．５～２０、好ましくは０．８～１０、より好ましくは１～８、更により好ましくは１．５～７；スルホ基を２個有する場合は、例えば０．２～１０、好ましくは０．４～５、より好ましくは０．５～４、更により好ましくは０．７５～３．５；スルホ基を３個有する場合は、例えば０．１５～６、好ましくは０．３～３．３、より好ましくは０．４～２．６、更により好ましくは０．５～２．３の範囲で使用されうる。
　ここで、理論値とは、ペプチド合成産物中の目的ペプチドの純度が１００％として算出された値を意味しうる。
　スルホン酸化合物と混合の後、得られた固形物を液相から分取（固液分離）する方法は特に限定されず、製造スケール等に応じて適宜選択されうるが、例えば、ろ過、遠心分離、デカント等の方法が挙げられる。
　固液平衡を介して固体中の目的ペプチドの純度が向上しうるため、固液分離は、合成されたペプチドをスルホン酸化合物および溶媒と混合した後、所定時間（例えば１分以上、２分以上、３分以上、４分以上、５分以上、１０分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上）経過後に行われることが好ましい。作業効率を考慮して、例えば１日以内、２日以内、１週間以内、２週間以内に固液分離されることが好ましいが、固液分離せずに混合物を保存して、適宜固液分離を行ってもよい。
　スルホン酸化合物および／または溶媒と混合する際、および得られた固形物を液相から分取（固液分離）する際の温度は特に限定されず、例えば目的ペプチドの精製効率を考慮して適宜選択されうる。例えば０～５０℃、０～４０℃、０～３０℃、１０～２５℃が挙げられる。
　固液分離後の固形物は適宜洗浄されてよい。洗浄に用いられる液（洗浄液）は特に限定されず、目的ペプチドの精製効率を考慮して適宜選択されうる。
例えば、該洗浄液は、
　水；
　アルコール化合物（例えば、Ｃ１－４のアルコール（例えば、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール））；
　アセトニトリル；
　エーテル化合物（例えば、Ｃ２－６エーテル（例えばジエチルエーテル、ＭＴＢＥ、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、ＣＰＭＥ（シクロペンチルメチルエーテル）））；
　ケトン化合物（例えば、Ｃ３－６ケトン（例えばアセトン）、ＭＥＫ（メチルエチルケトン）、メチルイソプロピルケトン、ＭＩＢＫ（メチルイソブチルケトン））；
　エステル化合物（例えば、Ｃ３－６エステル（例えば酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ－ブチル））；
　炭化水素化合物（例えばＣ６－９炭化水素（例えばトルエン））；
　ＤＭＳＯ；
　アミド化合物（例：ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、ＤＭＡ（Ｎ，Ｎージメチルアセトアミド）、ＮＭＰ（Ｎ－メチルピロリドン））；
　ハロゲン化炭化水素（例：クロロホルム、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン）；または
　これらの混合（ここで該混合は組み合わせを意味する）
を含有する。該洗浄液は他の物質をさらに含有してもよい。
　本願の精製方法により得られた固形物に対して本願の精製方法を繰り返し行うことは、本願の精製方法の１つの実施形態として挙げられる。本願の精製方法を繰り返すことで、目的ペプチドの純度を向上できうる。
　本願の精製方法は他の精製方法（例えば分取ＨＰＬＣ、再結晶、分散洗浄）と組み合わせて行われてもよい。例えば本願の方法により得られた固形物を別の精製方法に供してもよく、あるいは、予め別の精製方法により精製されたペプチドを本願の精製方法に供してもよい。
　本願の精製方法により得られた固形物は、さらなる精製工程において当該固形物中からスルホン酸化合物が除去されることが好ましい。スルホン酸化合物を除去する方法は特に限定されず、スルホン酸化合物を除去するための通常の方法、例えば、酸、アルカリ処理やイオン交換樹脂を用いる除去法により行われうる。
　本願においてスルホン酸化合物とは、スルホ基（－ＳＯ３Ｈ）を有する有機化合物を意味する。本願においてスルホン酸化合物は、スルホ基が単結合または短い（例えばＣ１－12、Ｃ１－6、Ｃ１－４など）のリンカーを介して、１つ以上の不飽和結合を有する部位に結合していることが好ましい。
　例えばスルホン酸化合物の好ましい例として、式（Ｉ）のスルホン酸化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 （Ｉ）
［式中、
　Ａは、置換されていてもよいＣ６－１４アリール（例えばＣ６－１３アリール、Ｃ６－１０アリール）、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、Ｃ２－３アルケニル、またはＣ２－３アルキニルであり；
　Ｘは、
（ｉ）単結合、
（ｉｉ）置換されていてもよいＣ１－６アルキレン（例えばＣ１－５アルキレン、Ｃ１－4アルキレン）、
（ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＯがＡと結合する）、または
（ｉｖ）Ｃ２－４アルケニレン
であり；および
　ｎは１～３の整数である］
　本願において「Ｃ６－１４アリール（ある基の一部を構成する場合を含む）」とは６～１４員の単環、二環、または三環の芳香族炭化水素環基、または該芳香族炭化水素環に１個のシクロアルカンが縮合した環基を意味する。Ｃ６－１４アリールの例として、フェニル、ナフチル、インダニル、テトラヒドロナフチル、フルオレニルが挙げられる。
　本願において「Ｃ６－１０アリール（ある基の一部を構成する場合を含む）」とは６～１０員の単環または二環の芳香族炭化水素環基、または該芳香族炭化水素環に１個のシクロアルカンが縮合した環基を意味する。Ｃ６－１０アリールの例として、フェニル、ナフチル、インダニル、テトラヒドロナフチルが挙げられる。
　「置換されていてもよいＣ６－１４アリール（あるいはＣ６－１３アリール、Ｃ６－１０アリール）」の例として、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびＣ６－１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１～５個（例えば１～３個、１～２個、および１個）の置換基で置換されていてもよいＣ６－１４アリール（あるいはＣ６－１３アリール、Ｃ６－１０アリール）が挙げられる。
　本願において「二環式ヘテロ環基」とは、単環芳香族環（ベンゼン、ピリジン等）に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子より選択される１～４個のヘテロ原子を有する単環芳香族環（ピリジン、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピリミジン、オキサゾール、チアゾール、チアジン、トリアゾール）または単環非芳香族環（テトラヒドロピラン、アゼパン、ピペリジン等）が縮合した、８～１１員の二環基を意味する。二環式ヘテロ環式基は、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子で結合し得る。二環式ヘテロ環基は１以上（例えば１個、２個）のオキソ基を含んでいてもよい。二環式ヘテロ環基の例として、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、ベンゾトリアゾリルが挙げられる。
　本願において「置換されていてもよい二環式ヘテロ環基」の例として、Ｃ６－１０アリール、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった１～５個（例えば１～３個、１～２個、および１個）の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基が挙げられる。
　本願において「Ｃ２－３アルケニル」とは、炭素数２～３個を有し、１個または２個の二重結合を含む直鎖状または分枝鎖状の不飽和炭化水素基を意味し、例えば、ビニル、アリル、１－プロペニル、イソプロペニル、アレニルが挙げられる。
　本願において「Ｃ２－３アルキニル」とは、炭素数２～３個を有し、１個の三重結合を含む直鎖状または分枝鎖状の不飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチニル、プロピニル（１－プロピニル、２－プロピニル）が挙げられる。
　本願において「Ｃ１－４アルキレン」とは、直鎖Ｃ１－４アルキル由来の２価の基を意味する。Ｃ１－４アルキレンの例としてメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレンが挙げられる。
　本願において「Ｃ１－６アルキレン」とは、直鎖Ｃ１－６アルキル由来の２価の基を意味する。Ｃ１－６アルキレンの例としてメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレンが挙げられる。
　本願において「Ｃ１－３アルキレン」とは、直鎖Ｃ１－３アルキル由来の２価の基を意味する。Ｃ１－３アルキレンの例としてメチレン、エチレン、トリメチレンが挙げられる。
　本願において「置換されていてもよいＣ１－６アルキレン（またはＣ１－５アルキレン、Ｃ１－４アルキレン、Ｃ１－３アルキレン）」の例として、メチル、ベンジル、シアノ、およびフェニルからなる群から選択される同一または異なった１～３個の置換基で置換されていてもよい（例えば１つのメチル、１つのベンジル、または１つのフェニルで置換されていてもよい）Ｃ１－６アルキレン（またはＣ１－５アルキレン、Ｃ１－４アルキレン、Ｃ１－３アルキレン）が挙げられる。
　本願の「－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－」において、ｎは１～３（好ましくは１～２）の整数であり、好ましい－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－の例として－ＣＯ－ＣＨ２－が挙げられる。
　本願において「Ｃ２－４アルケニレン」とは、直鎖Ｃ２－４アルケニル由来の２価の基を意味する。本願において「Ｃ２－３アルケニレン」とは、直鎖Ｃ２－３アルケニル由来の２価の基を意味する。Ｃ２－４アルケニレンおよびＣ２－３アルケニレンの例として、ビニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）、プロペニレン（－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－）が挙げられる。
　本願において「Ｃ１－４アルキル（ある基の一部を構成する場合を含む）」とは、炭素数１～４個を有する、直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。Ｃ１－４アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。
　本願において「Ｃ１－３アルキル（ある基の一部を構成する場合を含む）」とは、炭素数１～３個を有する、直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。Ｃ１－３アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルが挙げられる。
　本願において、「－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール」の例として、－ＣＯ－フェニルが挙げられる。
　本願において、ハロゲンの例として、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）が挙げられる。
　さらに好ましいスルホン酸化合物の例として、上記［項２１］に列記する化合物が挙げられる。
　本願の１つの態様において、本願の精製方法を含む、目的ペプチドを製造する方法が提供される。
　本願の１つの態様において、本願の精製方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する剤が提供される。当該剤は通常の方法により製造されうる。
　本願の１つの態様において、本願の精製方法において使用されるための、スルホン酸化合物を含有する剤が提供される。当該剤は通常の方法により製造されうる。
　以下、試験例を挙げて、本願発明を説明するが、本願発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
　目的ペプチドの精製
　評価方法の概略：
　目的ペプチドを固相法により合成した場合、得られた粗ペプチドには不純物として類縁ペプチドが混入していることが予想されるが、実際にどのような類縁ペプチドが混入しているかを同定することは困難である。よって、目的ペプチドと類縁ペプチドに相当する配列既知の擬似類縁ペプチドを固相法によりそれぞれ合成し、得られた粗目的ペプチド、粗擬似類縁ペプチド、および各種酸化合物を溶媒に溶解させて（これは処理前の値（ＨＰＬＣ）を測定するための均一なサンプルを得るため）、その後該溶媒を除去するために凍結乾燥した。ついで残渣に溶媒を加えた後に得られた固液混合物から上清を除去し、得られた固体における、目的ペプチドと擬似類縁ペプチドの物質量（ｍｏｌ）の合計に対する目的ペプチドの物質量（ｍｏｌ）の割合を測定し、その変化により、当該固体において目的ペプチドが精製されたかを評価する。
　１－１：ペプチドの合成
　下表に示す目的ペプチドおよび類縁ペプチド（擬似）をそれぞれ、以下に説明する固相法により合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　実施例で使用した装置は以下の通りである。
・ペプチド合成装置：国産化学社製「ＫＭＳ－３」。
・質量分析装置：Ａｇｉｌｅｎｔ社製「６２２４ ＴＯＦ ＬＣ/ＭＳ」および「１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｅｒｉｅｓ」。「イオン化条件はＥＳＩ（キャピラリー電圧：３５００V、フラグメンター電圧：１００V）」
・ＨＰＬＣ分析装置：島津製作所社製「ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ」、「ＬＣ－２０ＡＤ」、「ＳIＬ－２０ＡＣ」、「ＤＧＵ－２０Ａ」、「ＣＴＯ－２０ＡＣ」、「ＣＢＭ-２０Ａ」、または島津製作所社製「ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ」、「ＬＣ－２０１０Ｃ」、またはＡｇｉｌｅｎｔ社製「１２００ ｓｅｒｉｅｓ」。
（１）保護ペプチド樹脂の合成
　保護ペプチド樹脂の合成においては、各構成アミノ酸のα-アミノ基はすべて9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護され、活性な側鎖のうち、アスパラギン酸のβ-カルボキシル基およびグルタミン酸のγ-カルボキシル基はtert-ブチル基（ｔＢｕ基）で、アルギニンのグアニジノ基は2,2,4,6,7-ペンタメチル‐2,3‐ジヒドロベンゾフラン‐5‐イルスルホニル基（Ｐｂｆ基）で、セリンおよびスレオニンの水酸基はtert-ブチル基（ｔＢｕ基）で、システインのチオール基およびヒスチジンのイミダゾール基はトリチル基（Ｔｒｔ基）で、チロシンのフェノール性水酸基はtert-ブチル基（ｔＢｕ基）で、アスパラギンおよびグルタミンのカルボアミド基はトリチル基（Ｔｒｔ基）で、リジンのε-アミノ基、Dapのβ-アミノ基およびトリプトファンのインドール基はtert-ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたものを使用した。
　樹脂としては、Ｃ末端がカルボン酸のペプチド配列を合成する場合は（2-クロロ）トリチルクロリド樹脂（渡辺化学社製、約1.6 mmol/g）を用い、Ｃ末端がカルボアミドのペプチド配列を合成する場合はFmoc-NH-SAL樹脂（渡辺化学社製、約0.43 mmol/g）を用いた。Ｃ末端がカルボン酸のペプチド配列を合成する場合は、樹脂に対し２．５当量のFmocアミノ酸のDMF溶液および２．５当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを加え、２時間以上振盪撹拌することでＣ末端のアミノ酸を導入した。Ｃ末端がカルボアミドのペプチド配列を合成する場合は、樹脂と結合したＦｍｏｃ基を除去するために、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を加え、10分間以上振盪撹拌した後、ＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄し、樹脂に対し２．５当量のFmocアミノ酸のDMF溶液、２．５当量の1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液および２．５当量のＤＩＣを加え、４０分以上振盪撹拌することでＣ末端のアミノ酸を導入した。
　Ｃ末端のアミノ酸が樹脂に導入されたのちは、過剰量の試薬をＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去した後、末端アミノ基の保護基であるＦｍｏｃ基を２０％ピペリジンで室温下１０分間以上振盪撹拌することで除去した。ピペリジンをＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去し、ついで目的のペプチドのアミノ酸配列における次に位置するアミノ酸のFmoc保護誘導体のカルボキシル基と縮合した。この保護アミノ酸の縮合においては、樹脂に対し2.5当量のFmoc-アミノ酸のＤＭＦ溶液と２．５当量の1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液および２．５当量のＤＩＣを加えることにより縮合した。同様のＦｍｏｃ基の除去およびＦｍｏｃアミノ酸との縮合反応を目的のペプチドのアミノ酸配列ができるまで繰り返し、目的のペプチドのアミノ酸配列を持つ保護ペプチド樹脂を合成した。
　Ｎ末端が遊離のアミノ基のペプチドを合成する場合はＮ末端のＦｍｏｃアミノ酸を縮合した後、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で室温下１０分間以上振盪撹拌することでＦｍｏｃ基を除去した後、ピペリジンをＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去し、保護ペプチド樹脂の合成を完了した。Ｎ末端がＡｃ基で保護されたペプチド配列を合成する場合は、Ｎ末端を上記と同様に遊離のアミノ基とした後、５当量の酢酸と４．９５当量のＮ-ヒドロキシコハク酸のＤＭＦ溶液および５当量のＤＩＣを加えることにより縮合し、Ｎ末端にＡｃ基を導入し目的のペプチドのアミノ酸配列を持つ保護ペプチド樹脂を合成した。Ｎ末端のアミノ酸残基が（Ｓ）－又は（Ｒ）－ピログルタミン酸の場合は、Ｎ末端のＦｍｏｃアミノ酸として5等量の（Ｓ）－又は（Ｒ）－Fmoc－ピログルタミン酸クロリドと10等量のピリジンを用いて４０分以上振盪撹拌することで縮合させたのち、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で室温下１０分間以上振盪撹拌することでＦｍｏｃ基を除去した後、ピペリジンをＤＭＦで３回から５回樹脂を洗浄することで除去し、保護ペプチド樹脂の合成を完了した。
　（２）ペプチド粗生成物の合成
　ペプチド粗生成物の合成においては、上記で合成した目的のペプチドのアミノ酸配列を持つ保護ペプチド樹脂を酸で処理することにより脱保護および樹脂からの切り出しを行った。目的のペプチドがシステインやメチオニンといった硫黄原子を持つアミノ酸を含むペプチド配列の場合は、ＴＦＡ／水／エタンジチオール／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１）を用い、氷冷から室温下で３０分以上振盪撹拌することで脱保護および樹脂からの切り出しを行った。目的のペプチドがシステインやメチオニンといった硫黄原子を持つアミノ酸を含まない場合は、ＴＦＡ／水／ＴＩＳ（９５／２．５／２．５）を用い、氷冷から室温下で３０分以上振盪撹拌することで脱保護および樹脂からの切り出しを行った。反応終了後、樹脂を濾過して、脱保護溶液で樹脂を３回から５回洗浄した後、洗浄液と濾液を混合して、エバポレーターで濃縮した。残渣にＭＴＢＥを添加し、析出した沈殿をろ過または遠心分離することで固液分離し、ＭＴＢＥ洗浄を複数回行うことで、目的のペプチド粗生成物を合成した。
(8)H-YERAKSNM-OHの製造方法（方法Ａ）
（１）ペプチド合成装置「ＫＭＳ－３」付属のＰＰ製カラムに（2-クロロ）トリチルクロリド樹脂（渡辺化学社製、約1.6 mmol/g）１８７．５ｍｇ（0.30 mmol）を入れ、ＤＭＦ５ｍＬを加えた後、終夜振盪撹拌した。吸引濾過でＤＭＦを除去した後、Ｆｍｏｃ-Ｍｅｔ-ＯＨのＤＭＦ溶液（３７５ｍＭ）２ｍＬ（0.75mmol；2.5当量）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１２８μＬ（0.75mmol；2.5当量）、ＤＭＦ１ｍＬを加え、６時間振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
（２）Ｆｍｏｃ-Ａｓｎ（Ｔｒｔ）-ＯＨのＤＭＦ溶液（３７５ｍＭ）２ｍＬ（0.75mmol；2.5当量）、1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液（７５０ｍＭ）１ｍＬ（0.75mmol；2.5当量）およびＤＩＣ１１６μＬ（0.75mmol；2.5当量）を加え終夜振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
（３）上記ステップ（２）を参照して、次のアミノ酸を順次結合する。後続アミノ酸の順番及び反応時間は、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ　２０時間、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ　４５分間、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ　３時間、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ　１６時間、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ　２．５時間およびＦｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ　１５時間であった。
（４）合成した保護ペプチド樹脂に氷冷下、３ｍＬの脱保護液（ＴＦＡ／水／エタンジチオール／ＴＩＳ＝９４／２．５／２．５／１）を加え、氷浴を取り外し、成り行き温度で３時間振盪撹拌した。樹脂を濾過し、脱保護溶液で樹脂を３回洗浄した後、洗浄液と濾液を混合して、エバポレーターで濃縮した。濃縮残渣にＭＴＢＥ５ｍＬを加え、氷冷下終夜撹拌した。全量を遠心沈降管に移したのち、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させた後、上澄み液を除去した。ＭＴＢＥ２ｍＬを加え、３分間振盪撹拌した後、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させ、上澄み液を除去する操作を３回行った。沈殿物を減圧乾燥し、目的の配列（H-YERAKSNM-OH）のペプチド粗生成物１７９．５ｍｇを得た。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。
ESI-MS:理論M:[M+H]+=998.47、実験M:(m／z):[M+H]+=998.4739
ＨＰＬＣ条件（条件Ａ）
カラム:YMC-triartC18 3μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.7mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm（［表１４－２］の目的ペプチド(8)と類縁ペプチド(22)の分析の際のみ）または274 nm
勾配：2％B(0分)→2％B(0.2分)→6.4％B(0.5分)→6.4％B(11分)→95％B(15.5分)→95％B(20.5分)→2％B(20.6分)→2％B(29分)
保持時間＝13.3分付近
(12)Ac-ALRAL-NH2の製造方法（方法Ｂ）
（１）ペプチド合成装置「ＫＭＳ－３」付属のＰＰ製カラムにFmoc-NH-SAL樹脂（渡辺化学社製、約0.43 mmol/g）348.8ｍｇ（0.15mmol）を入れ、ＤＭＦ５ｍＬを加えた後、１分間振盪撹拌したのち、終夜静置した。吸引濾過でＤＭＦを除去した後、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
（２）Ｆｍｏｃ-Ｌｅｕ-ＯＨのＤＭＦ溶液（１８７．５ｍＭ）２ｍＬ（0.３７５mmol；2.5当量）、1-ヒドロキシベンズトリアゾールのＤＭＦ溶液（３７５ｍＭ）１ｍＬ（0.３７５mmol；2.5当量）およびＤＩＣ５８μＬ（0.375mmol；2.5当量）を加え３時間振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を３ｍＬ加え、３５分振盪撹拌した。吸引濾過し、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した。
（３）上記ステップ（２）を参照して、次のアミノ酸を順次結合する。後続アミノ酸の順番及び反応時間は、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ　２．５時間、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ　１５．５時間、Ｆｍｏｃ-Ｌｅｕ-ＯＨ　２．５時間およびＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ　２．５時間であった。Ｎ末端が遊離のアミノ基の保護ペプチド樹脂を合成した後、Ｎ－ヒドロキシコハク酸のＤＭＦ溶液（２４８ｍＭ）３ｍＬ（0.744mmol；4.96当量）、酢酸４３μＬ（0.75mmol；5当量）およびＤＩＣ１１６μＬ（0.75mmol；5当量）を加え16時間振盪撹拌した。吸引濾過で反応液を除去した後、ＤＭＦ３ｍＬで５回洗浄した後、ＭＴＢＥ３ｍＬで3回洗浄した。
（４）合成した保護ペプチド樹脂に氷冷下、３ｍＬの脱保護液（ＴＦＡ／水／ＴＩＳ＝９５／２．５／２．５）を加え、氷浴を取り外し、成り行き温度で４時間振盪撹拌した。樹脂を濾過し、脱保護溶液で樹脂を３回洗浄した後、洗浄液と濾液を混合して、エバポレーターで濃縮した。濃縮残渣にＭＴＢＥ５ｍＬを加え、氷冷下終夜撹拌した。全量を遠心沈降管に移したのち、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させた後、上澄み液を除去した。ＭＴＢＥ２ｍＬを加え、３分間振盪撹拌した後、３０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させ、上澄み液を除去する操作を３回行った。沈殿物を減圧乾燥し、目的の配列（Ac-ALRAL-NH2）のペプチド粗生成物９０．６ｍｇを得た。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。
ESI-MS:理論M:[M+H]+=584.39、実験M:(m／z):[M+H]+=584.3879
ＨＰＬＣ条件（条件Ｂ）
カラム:YMC-PackProC18 3μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：5％B(0分)→5％B(5分)→95％B(17分)→5％B(17.1分)→5％B(20.1分)→5％B(24分)
保持時間＝10.6分付近
(1)Ac-YFYPEL-NH2の製造方法
　方法Ｂと同様にFmoc-NH-SAL樹脂233ｍｇ（0.1mmol）に対し、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OHと順次縮合させた後、Ｎ末端が遊離のアミノ基をAc保護することで、保護ペプチド樹脂を合成した。脱保護液（ＴＦＡ／水／ＴＩＳ＝９５／２．５／２．５）を用いて樹脂からの切り出しを行い、同様の操作で、目的の配列（Ac-YFYPEL-NH2）のペプチド粗生成物９０．６ｍｇを得た。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。得られたペプチド粗生成物はＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＴＯＦ／ＭＳ機器での質量分析により確認した。
ESI-MS:理論M:[M+H]+=872.42、実験M:(m／z):[M+H]+=872.4203
ＨＰＬＣ条件（条件Ｃ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→20％B(12分)→95％B(15分)→95％B(19分)→20％B(20分)→20％B(28分)
保持時間＝10.2分付近
　上記の方法ＡまたはＢを用い、下表の目的ペプチドをそれぞれ固相法により合成した。
　ＨＰＬＣの分析条件は上記に示したＨＰＬＣ条件（条件Ａ～Ｃ）のほか、以下に示す条件を用いて分析した。
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｄ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：275 nm
勾配：15％B(0分)→25％B(1分)→25％B(12分)→95％B(14.5分)→95％B(17分)→15％B(17.5分)→15％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｅ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.7mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→35％B(17分)→95％B(18分)→95％B(20分)→20％B(20.5分)→20％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｆ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：279 nm
勾配：36％B(0分)→36％B(12.5分)→95％B(13分)→95％B(14.5分)→36％B(15分)→36％B(27分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｇ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：281 nm
勾配：22％B(0分)→25％B(2分)→25％B(14分)→95％B(17分)→95％B(18.5分)→22％B(19分)→22％B(30分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｈ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.65mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：2％B(0分)→2％B(3分)→5％B(12分)→5％B(14分)→8％B(16分)→95％B(19分)→95％B(19.9分)→2％B(20分)→2％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｉ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：23％B(0分)→25％B(2分)→25％B(10分)→35％B(15分)→95％B(17分)→95％B(19分)→23％B(20分)→23％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｊ）
カラム:Waters Atlantis T3 3μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：1.0mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→20％B(12分)→95％B(17分)→95％B(19分)→20％B(19.1分)→20％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｋ）
カラム: Waters Xbridge Phenyl 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：1.0mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：5％B(0分)→5％B(3分)→95％B(20分)→5％B(20.1分)→5％B(26分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｌ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：28％B(0分)→38％B(12分)→95％B(15分)→95％B(19分)→28％B(20分)→28％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｍ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.65mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：4％B(0分)→4％B(3分)→7％B(8分)→95％B(15分)→95％B(15.9分)→4％B(16分)→4％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｎ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液;B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：1.0mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：0％B(0分)→3％B(8分)→95％B(25分)→95％B(28分)→0％B(28.5分)→0％B(35分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｏ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液;B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：25％B(0分)→25％B(14分)→95％B(17分)→95％B(21分)→0％B(22分)→0％B(32分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｐ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：20％B(0分)→25％B(12分)→25％B(14分)→95％B(17分)→95％B(18.5分)→20%B(19分）→20％B(28分)
　ＨＰＬＣ条件（条件Ｑ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：3％B(0分)→5％B(5分)→5％B(16分)→95％B(17分)→95％B(19分)→3％B(19.1分）→3％B(28分)
ＨＰＬＣ条件（条件Ｒ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.6mL/分、温度：30℃
検出波長：275 nm
勾配：11％B(0分)→11％B(10分)→20％B(12分)→95％B(15分)→95％B(17.5分)→11％B(18分）→11％B(28分)
ＨＰＬＣ条件（条件Ｓ）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.6mL/分、温度：30℃
検出波長：281 nm
勾配：29％B(0分)→29％B(10分)→40％B(12分)→95％B(15分)→95％B(17.5分)→29％B(18分）→29％B(28分)

HPLC条件（条件T）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.7mL/分、温度：30℃
検出波長：276 nm
勾配：10.5％B(0分)→10.5％B(10分)→95％B(14分)→95％B(17分)→10.5%B(17.1分）→10.5％B(28分)

HPLC条件（条件U）
カラム:Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.65mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：15％B(0分)→15％B(10分)→30％B(12分)→95％B(15分)→95％B(17.5分)→15%B(17.6分）→15％B(29分)

HPLC条件（条件V）
カラム: Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：1mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：17％B(0分)→17％B(12分)→95％B(17分)→ 95％B(19分)→17％B(19.1分)→ 17%B(26分）

HPLC条件（条件W）
カラム:YMC Triart C18 3μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：5％B(0分)→95％B(17分)→5％B(17.1分)→5%B(23.5分）

HPLC条件（条件X）
カラム: YMC-PackproC18RS 3μm、50×3mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.5mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：5％B(0分)→95％B(12分)→95％B(18分)→ 5％B(18.5分)→5%B(25分）

HPLC条件（条件Y）
カラム: YMC Triart C18 3μm、50×3.0mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.65mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：2％B(0分)→2％B(6分)→5％B(8分)→8％B(16分)→95％B(19分)→95％B(22分)→2％B(22.1分)→2%B(28分）
HPLC条件（条件Z）
カラム: Waters XbridgeC18 3.5μm、150×4.6mm
溶離液：A=0.1％TFA水溶液；B=0.1％TFAアセトニトリル
流速：0.7mL/分、温度：30℃
検出波長：205 nm
勾配：10％B(0分)→10%B(0.2分)→34%B(0.5分)→34%B(14分)→95％B(16分)→95％B(19分)→ 10％B(19.1分)→10%B(29分）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　同様に、上記の方法を用い、下表の類縁ペプチドをそれぞれ固相法により合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
　１－２：酸化合物
　以下の酸化合物を購入して使用した。
　硫酸：ナカライテスク社　特級
　塩酸：ナカライテスク社　0.1N　特級
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 ：ナカライテスク社　特級
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 ：和光純薬社　特級
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 ：ナカライテスク社　一級
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 ：東京化成工業（株）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 ：東京化成工業（株）
　以下に示すスルホン酸は特に記載がない限りそれぞれ、相応するハロゲン化物を亜硫酸ナトリウムと反応させ、得られたスルホン酸ナトリウム塩を塩酸で酸性とすることにより合成して使用した。
　具体例として、p－メチルベンジルスルホン酸：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 の合成を以下に説明する。
　p－メチルベンジルブロミド1.55g（7mmol）をエタノール４ｍLに溶かし、亜硫酸ナトリウム0.97g（7.7mmol；1.1当量）、水８ｍLを加え、終夜加熱還流した。反応終了後、エバポレーターで濃縮しエタノールを除去した後、析出した固体をろ過し、1.09gのp－メチルベンジルスルホン酸ナトリウム塩を得た。得られた固体625mgに濃塩酸1mLと水1.5mLを加え終夜撹拌した。反応液を濾過し、水0.5mLで2回洗浄し、p－メチルベンジルスルホン酸448mgを得た。1H NMR (400 MHz, D2O)　7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.28 (s, 3H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
は下記のように相応するアルコール化合物から合成した。
１．50 mL3つ口フラスコに9－フルオレニルメタノール1.18 g(6 mmol)を入れ、酢酸エチル9 mLに溶解させた後、氷浴にて0℃に冷却した。メタンスルホニルクロリド488 μL(6.3 mmol; 1.05 eq)を加えた後、トリエチルアミン920 μL(6.6 mmol; 1.05 eq)を内温0～10℃で滴下した。0℃で26時間撹拌した後、水10 mL、MTBE10 mLを加え反応を停止した。分液し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液15 mL、0.5 M硫酸水素ナトリウム水溶液15 mL、水15 mLで順次洗浄した。洗浄後の有機層を濃縮し、9－フルオレニルメトキシメタンスルホネート の粗体1.28 gを得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3)　δ：7.78 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.43 (m, 4H), 4.50 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 2.91 (s, 3H)。
２．上記で合成した粗体の9－フルオレニルメトキシメタンスルホネート1.28 gにエタノール3 mLを加え溶解させた後、水7 mL、亜硫酸ナトリウム1.01 g(8 mmol)を加えた。加熱し内温80℃で90時間撹拌した。反応終了後、エバポレーターで濃縮しエタノールを除去した後、析出した固体をろ過した。ろ液に濃塩酸1 mLを加え、エバポレーターで濃縮乾固した。残渣に水2 mLを加え、1時間懸濁させた後、濾過し、水0.5mLで2回洗浄し、9－フルオレニルメチルスルホン酸310 mg（1H NMR (400 MHz) (CD3OD) 7.91 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.34 (m, 4H), 4.44 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.28 (m, 2H)）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
についても、上記の
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
の合成と同様して、2‐インダノール805 mg(6 mmol)を原料に2‐インダニルオキシメタンスルホネート1.26 gを合成し（1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：7.22 (m, 4H), 5.53 (m, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.21 (m, 2H), 3.02 (s, 3H)）、得られた2‐インダニルオキシメタンスルホネート1.26 gを用いて、2‐インダニルスルホン酸 131 mg（1H NMR (400 MHz) (CD3OD) 7.19 (m, 2H), 7.12 (m, 2H), 3.80 (m, 1H), 3.34 (m, 3H)）を得た。
　上記のp－メチルベンジルスルホン酸の合成方法に従って、下表のスルホン酸を、相応するハロゲン化物を用いて合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000072
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000073
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000075
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
ベンジルスルホン酸の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 　ベンジルブロミド1.71g(10mmol)にエタノール10mL、チオウレア0.76g（10mmol）を加え、終夜加熱還流した。TLCで原料の消失を確認した後、エバポレーターで濃縮乾固した。残渣にアセトニトリル10mLを加え溶解させ、氷浴にて冷却した。氷冷下2N塩酸2mL（4mmol）、Ｎ－クロロスクシンイミド5.34g（40mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。反応液をエバポレーターで濃縮し、残渣に酢酸エチル5mLを加え分液した後、有機層をエバポレーターで濃縮した。残渣にMTBE5mL、ヘプタン5mLを加え、析出した固体をろ別した後、ろ液をエバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：富士シリシア社、PSQ-100B、50g；溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１）にて精製し、ベンジルスルホニルクロリド0.64gを得た。得られたベンジルスルホニルクロリド0.59gに水5.9mLを加え、5日間加熱還流した。反応液を濃縮乾固、真空ポンプで乾燥することで、ベンジルスルホン酸0.39gを得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD)　7.42 (m, 2H), 7.28 (m, 3H), 4.05 (s, 2H)
p-カルボキシベンジルスルホン酸の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 　上記で合成したp-メトキシカルボニルベンジルスルホン酸0.50gに濃塩酸0.6mL、水0.6mLを加え、９０℃に加熱した。終夜９０度で加熱撹拌した後、室温まで冷却し、析出した固体を減圧濾過することで、p-カルボキシベンジルスルホン酸0.37gを得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) 7.97 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.12 (s, 2H)
　略語の説明
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＭＴＢＥ：メチルターシャリーブチルエーテル
試験例１：目的ペプチドの精製－１（類縁ペプチドの除去に関して）
　１－１で得られた粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドをそれぞれ１％ＴＦＡ含有水／アセトニトリル＝１００～７０／０～３０に溶解し、２０ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。溶けにくいペプチドは約５ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）まで希釈して溶解させた。
　各酸化合物を水、または、水に溶けにくい場合は１０％ＩＰＡ水溶液または１０％ＤＭＳＯ水溶液に溶かし、５０ｍＭの酸化合物溶液とした。
　粗目的ペプチド溶液（１μｍｏｌ（目的ペプチドの純度を１００％と仮定））、粗類縁ペプチド溶液（０．１μｍｏｌ（類縁ペプチドの純度を１００％と仮定））を混合した。
　当該混合物に酸化合物溶液（１．５μｍｏｌ）を混合し（ＨＰＬＣ分析（処理前））、凍結乾燥により乾固した。
　残渣にＩＰＡ　１００μＬを加え、室温にて終夜振盪した。
　得られたスラリーを遠心ろ過（5000～15000ｒｐｍ、１～５分）し、ケーキをＩＰＡ　１５０μＬで２回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
　得られた固体と濾洗液をそれぞれＨＰＬＣ分析した（処理後固体／処理後濾洗液）。
　ＨＰＬＣの測定機器は上記と同様である。
測定条件：ペプチド合成時の各ＨＰＬＣ条件（ＨＰＬＣ条件Ａ～Ｚ）に従う。
　芳香族アミノ酸残基を含むペプチドでは、長波長側紫外吸収は専ら該芳香族側鎖に帰する事ができる。これに該当するペプチドを分析する際のHPLC検出波長は、条件A（274 nmで検出する場合）、条件D、条件F～G、条件R～Tである。条件A（274 nmで検出する場合）、条件R、および条件Tでは目的ペプチドも類縁ペプチドも芳香族アミノ酸残基を１個ずつ、条件Fでは５個ずつ、条件Gおよび条件Sでは４個ずつ持ち、条件Dでは目的ペプチドが芳香族アミノ酸残基を３個、類縁ペプチドは２個持つ。即ち274～281 nmの長波長紫外吸収に寄与する芳香族側鎖の数は目的ペプチドと類縁ペプチドで同じか１つの差であり、HPLC面積値の比を凡そのモル比とみなす事ができる。
　一方芳香族アミノ酸残基を含まないペプチドでは長波長側に紫外吸収はなく、カルボニル基による短波長紫外吸収（205 nm）を検出に用いる事ができる。例えば条件A（205 nmで検出する場合）と条件Jでは目的ペプチドのカルボニル基は１０個、類縁ペプチドは９個のカルボニル基を持つ。同様に条件Bと条件Kでは目的ペプチド６個、類縁ペプチド５個、条件Cでは８個と７個、条件Eでは１６個と１５個、条件Hでは９個と６個又は８個、条件Iでは３１個と３０個、条件Lでは３２個と３１個、条件Mでは９個と８個である。即ち205 nmの短波長紫外吸収に寄与するカルボニル基の数は目的ペプチドと類縁ペプチドで１～３個の差であり、HPLC面積値の比を凡そのモル比とみなす事ができる。尚目的ペプチド(9)と(10)は芳香族側鎖を持つものの十分に鎖長が長くカルボニル基が多いので条件Iではカルボニル基の紫外吸収（205 nm）で検出したが、長波長側で検出する事もできる（目的ペプチドも類縁ペプチドも芳香族アミノ酸残基を６個ずつ持つ）。同様に目的ペプチド(16)と類縁ペプチド(25)は芳香族側鎖を２個ずつ持つが、205 nmで検出した。
　条件N、条件O、条件P、条件Q、条件U、条件V、条件W、条件X、条件Y、および条件Zについても同様に、カルボニル基による短波長紫外吸収（205 nm）を検出に用いた。
　下式１）のとおり、ＨＰＬＣ測定値（面積）を用いて、目的ペプチドと類縁ペプチドの合計面積に対する目的ペプチドの面積の割合（％）を算出し、目的ペプチドと類縁ペプチドの物質量（ｍｏｌ）の合計に対する目的ペプチドの物質量（ｍｏｌ）のおおよその割合（％）（目的ペプチド率）とした。
　式１）
目的ペプチド率（％）＝目的ペプチドの面積／（目的ペプチドの面積＋類縁ペプチドの面積）×１００
　　　　　　　　　　≒目的ペプチド（ｍｏｌ）／（目的ペプチド（ｍｏｌ）＋類縁ペプチド（ｍｏｌ））×１００
評価１：塩形成の検証
　ペプチドと酸化合物を混合した場合、Ｎ末端のアミノ基、あるいは、塩基性アミノ酸（リジンＫ、アルギニンＲ、ヒスチジンＨ等）の側鎖部分と酸化合物が塩を形成する可能性がある。
　塩基性アミノ酸不含の目的ペプチド：H-YFYPEL-NH2および１残基欠損体であるその類縁ペプチド：H-YYPEL-NH2、ならびにこれらのＮ末端をアセチル基(Ａｃ)で保護した目的ペプチドAc-YFYPEL-NH2および１残基欠損体であるその類縁ペプチドAc-YYPEL-NH2を用いて、固体における目的ペプチド率（％）の変化により、ペプチドと酸化合物との塩形成の有無を検証した。
　加えて、塩形成できる基がない塩基性アミノ酸不含の目的ペプチド：Pyr-GPWLEEEEEAYGWMDF-NH2および１残基欠損体であるその類縁ペプチド：Pyr-GPWLEEEEEYGWMDF-NH2を用いて、固体における目的ペプチド率（％）の変化を調べた。
　目的ペプチド率（％）の変化は、下式２）を用いて「目的ペプチド率（％）の上昇ポイント」として算出した。
　式２）：
　目的ペプチド率（％）の上昇ポイント＝処理後固体の目的ペプチド率（％）－処理前の目的ペプチド率（％）
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
　表５-１について
　Ｎ末端がＡｃ基で保護された目的ペプチドAc-YFYPEL-NH2およびその類縁ペプチドAc-YYPEL-NH2では、目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは、酸化合物を使用しない場合では１．４ポイント、硫酸では２．０ポイント、当該スルホン酸化合物では２．１ポイントであり、酸化合物使用の有無で目的ペプチド率（％）の上昇ポイントに大きな差はなかった。
　対して、Ｎ末端がフリーである目的ペプチド：H-YFYPEL-NH2とその類縁ペプチド：H-YYPEL-NH2では、酸化合物を使用しない場合では－０．３ポイント、硫酸では０．２ポイントであるのに対して、当該スルホン酸化合物では３．１ポイントであり、当該スルホン酸化合物での上昇ポイントは酸化合物不使用および硫酸に比べて大きかった。
　目的ペプチドと類縁ペプチドの構造が類似している場合、溶媒に対する溶解特性は通常近似する。そうすると、ペプチドがスルホン酸化合物と塩を形成して固体となった場合には、得られた固体の溶媒に対する溶解特性が元のペプチドに比べ大きく変化するので、固液分離する事によって、類縁ペプチドより多く含まれる目的ペプチドの割合が上昇する可能性は顕著に高まる。従って、これらの結果は、当該スルホン酸化合物がペプチドのＮ末端のアミノ基と塩を形成したことを示唆する。
　なお、酸化合物の有無に関わらず、Ｎ末端がＡｃ基で保護された目的ペプチドAc-YFYPEL-NH2およびその類縁ペプチドAc-YYPEL-NH2では、目的ペプチド率（％）が上昇したのは、これらのペプチドのＩＰＡ中での溶解挙動の差に起因すると考えられる。
　表５-２について
　塩形成できる基がない目的ペプチド：Pyr-GPWLEEEEEAYGWMDF-NH2およびその類縁ペプチド：Pyr-GPWLEEEEEYGWMDF-NH2では、酸化合物使用の有無で目的ペプチド率（％）の上昇ポイントに差はなかった。
評価２：スルホン酸化合物の効果
　下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
　酸化合物不使用の場合と比較して、スルホン酸化合物を使用することにより、目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは増加し、スルホン酸化合物は目的ペプチドと類縁ペプチドの分離において優れた効果を示した。これは評価１から示唆される様にスルホン酸化合物との塩形成により溶解挙動が変化した為と考えられる。
評価３：無機酸との比較
　下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
　目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは、塩酸および硫酸と比較してスルホン酸化合物の方が大きく、スルホン酸化合物は目的ペプチドの精製において優れた効果を示した。
評価４：カルボン酸化合物との比較
　下表のスルホン酸化合物またはカルボン酸化合物、ならびに目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000085
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
　目的ペプチド率（％）の上昇ポイントは、カルボン酸化合物と比較してスルホン酸化合物の方が大きく、スルホン酸化合物は目的ペプチドの精製において優れた効果を示した。
評価５：各種スルホン酸化合物の効果（１）
　下表のスルホン酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用い、分析上の問題で固体における目的ペプチド率が算出できなかった試料があったため濾洗液における目的ペプチド率（％）の変化を、下式３）を用いて「目的ペプチド率（％）の低下ポイント」として算出した。目的ペプチドと類縁ペプチドの処理前後のそれぞれの濃度は不明であること、および目的ペプチドと類縁ペプチドのＨＰＬＣ感度は同一ではないことから、濾洗液における目的ペプチド率（％）の低下ポイントから固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントへの換算はできないものの、濾洗液において目的ペプチド率が減少したことは固体において目的ペプチド率が増加したことを意味する。
　式３）：
　目的ペプチド率（％）の低下ポイント＝処理後濾洗液の目的ペプチド率（％）－処理前の目的ペプチド率（％）
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000089
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
評価６：各種スルホン酸化合物の効果（２）
　下表の酸化合物、目的ペプチドおよび類縁ペプチドを用いて、上記と同様の方法で、得られた固体における目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000103
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000106
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000108
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000110
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000111
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000112
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000113
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000114
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000115
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000116
　表５～３４に示すとおり、得られた固体における目的ペプチド率は上昇（又は得られた濾洗液における目的ペプチド率が低下）し、スルホン酸化合物は種々の目的ペプチドの精製において優れた効果を示した。
　試験例２：溶媒の検討－１
　１－１で得られた粗目的ペプチド（(8)H-YERAKSNM-OH）と粗類縁ペプチド（(13)H-YERKSNM-OH）をそれぞれ水／アセトニトリル＝１／２に溶解し、１０ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。
　酸化合物を水に溶かし、３０ｍＭの酸化合物溶液とした。
　粗目的ペプチド溶液（１μｍｏｌ（目的ペプチドの純度を１００％と仮定））、粗類縁ペプチド溶液（０．１μｍｏｌ（類縁ペプチドの純度を１００％と仮定））を混合した。
　当該混合物に酸化合物溶液（０．９μｍｏｌ）を混合し（ＨＰＬＣ分析（処理前））、凍結乾燥により乾固した。酸化合物は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
 を使用した。
　残渣に下表の溶媒　１００μＬを加え、室温にて終夜振盪した。
　得られたスラリーを遠心ろ過（１４０００ｒｐｍ、１分）し、ケーキを当該溶媒　１００μＬで２回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
　得られた固体と濾洗液をそれぞれＨＰＬＣ分析した（処理後固体／処理後濾洗液）。
　上記と同様の方法で、得られた濾洗液における目的ペプチド率（％）の低下ポイントを算出した。
　加えて、処理前溶液と処理後固体についてのＨＰＬＣ分析結果から、目的ペプチドのHPLC面積百分率（但し、総面積からスルホン酸化合物のピークを除く）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000118
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000119
　表３５および３６のとおり、目的ペプチドの絶対純度および相対純度の向上が示され、スルホン酸化合物は、いずれの溶媒を使用した場合においても、目的ペプチドの精製において効果を示した。溶媒の組成を通常行われる範囲で検討することで類縁ペプチドの除去に適する溶媒を選択できる。
　試験例３：スケールアップ
　試験例２と同じ目的ペプチド、類縁ペプチド、スルホン酸化合物を用いて以下の試験を行った。
　粗目的ペプチド、粗類縁ペプチド、スルホン酸化合物をそれぞれ水／アセトニトリル（１／２）に溶解し、粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドについては50 mM（それぞれ純度を100％と仮定）、スルホン酸化合物については75 mMの溶液を調製した。粗目的ペプチド溶液1 mL（50 μmol）、粗類縁ペプチド0.1 mL（5 μmol）を混合した。
　スルホン酸化合物溶液1 mL（75 μmol）を添加し（HPLC分析（条件A、処理前））、凍結乾燥した。残渣にIPA 1 mLを加え分散した後、再度凍結乾燥し残渣（67.35 mg）を得た。
上記残渣にIPA 2 mLを加え、７００ｒｐｍで３時間振盪後固体を遠心沈降した（１４０００ｒｐｍ、１分）。固体と上清を分離し、それぞれ凍結乾燥して固体由来残渣60.74 mg、上清由来残渣5.84 mgを得た。それぞれHPLC分析した（条件A、処理後）。結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000120
　スケールアップした場合でも、試験例２と同様の結果が得られた。
　試験例４：スルホン酸除去
　試験例３と同じ目的ペプチド、類縁ペプチド、スルホン酸化合物を用いて以下の試験を行った。
　粗目的ペプチド、粗類縁ペプチド、スルホン酸化合物をそれぞれ水／アセトニトリル（１／２）に溶解し、粗目的ペプチドと粗類縁ペプチドについては50 mM（それぞれ純度を100％と仮定）、スルホン酸化合物については75 mMの溶液を調製した。粗目的ペプチド溶液1 mL（50 μmol）、粗類縁ペプチド0.1 mL（5 μmol）を混合した。
　スルホン酸化合物溶液1 mL（75 μmol）を添加し（HPLC分析した（条件Ａ、処理前））、凍結乾燥した。残渣にIPA 1 mLを加え分散した後、再度凍結乾燥し残渣（70.93 mg）を得た。
　上記残渣にIPA 5 mLを加え、７００ｒｐｍで３.5時間振盪後固体を遠心沈降した（１４０００ｒｐｍ、１分）。固体と上清を分離し、IPA 1 mLで固体を洗浄した。固体と上清および洗浄溶液を合わせたもの、それぞれを凍結乾燥して固体由来残渣59.58 mg、上清および洗浄由来残渣5.40 mgを得た。
　Oasis WAX Cartridge（6cc/150mg）（Waters社製）を用い、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液1 mL、水（精製水）7 mL、水／MeOH（10／1）2 mLの順で通液し、前処理を行った。
　上記固体由来残渣15.74 mg を 水／MeOH（10／1）1 mLに溶解し、HPLC分析した（条件Ａ、処理後。スルホン酸は5.1分付近に溶出した）。
　前処理を行ったOasis WAX Cartridge（6cc/150mg）に上記溶液をロードし、水／MeOH（10／1）9 mLを通液した。このカートリッジを通した溶液をHPLC分析し、スルホン酸の除去を確認した（条件Ａ、スルホン酸除去後）。凍結乾燥して残渣9.47 mgを得た。
　スルホン酸化合物による処理前の溶液と処理後の固体、並びにスルホン酸化合物除去後の当該HPLC分析における目的ペプチドのHPLC面積百分率を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000121
　試験例５：溶媒の検討－２
　１－１で得られた粗目的ペプチド（(8)H-YERAKSNM-OH）と粗類縁ペプチド（(23)H-YERAKSN-OH）をそれぞれ水／アセトニトリル＝１／２に溶解し、１０ｍＭ（各ペプチドの純度を１００％と仮定）の粗目的ペプチド溶液または粗類縁ペプチド溶液とした。
　スルホン酸化合物を水に溶かし、５０ｍＭのスルホン酸化合物溶液とした。
　粗目的ペプチド溶液（１μｍｏｌ（目的ペプチドの純度を１００％と仮定））、粗類縁ペプチド溶液（０．１μｍｏｌ（類縁ペプチドの純度を１００％と仮定））を混合した。
　当該混合物にスルホン酸化合物溶液（１．５μｍｏｌ）を混合し（ＨＰＬＣ分析（処理前））、凍結乾燥により乾固した。スルホン酸化合物は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
 を使用した。
　残渣に下表の溶媒　１００μＬを加え、室温にて終夜振盪した。
　得られたスラリーを遠心ろ過（１４０００ｒｐｍ、１分）し、ケーキを当該溶媒　１００μＬで２回洗浄した。濾液と洗浄液は合一した。
　得られた固体と濾洗液をそれぞれＨＰＬＣ分析した（処理後固体／処理後濾洗液）。
　上記と同様の方法で、得られた濾洗液における目的ペプチド率（％）の低下ポイントを算出した。
　加えて、処理前溶液と処理後固体についてのＨＰＬＣ分析結果から、目的ペプチドのHPLC面積百分率（但し、処理後固体については総面積からスルホン酸化合物のピークを除く）を算出した。
　結果を下表に示す。
　下表のとおり、目的ペプチドの絶対純度および相対純度の向上が示され、スルホン酸化合物は、いずれの溶媒を使用した場合においても、目的ペプチドの精製において効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000123
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
試験例６：目的ペプチドの精製－２
　下表の目的ペプチド、類縁ペプチド、およびスルホン酸化合物に関し、試験例１で行ったＨＰＬＣ分析結果から、処理前溶液と処理後固体の目的ペプチドのHPLC面積百分率（但し総面積からスルホン酸化合物のピークを除く）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000125
試験例７：目的ペプチドの精製－３
（１）上記の「１－１：ペプチドの合成（段落番号［００８２］～［０１２８］)」で得られた、H-AQKLRASD-OH（表１では目的ペプチド(7)と記載）を粗類縁ペプチドとし、H-QKLRASD-OH（表１では類縁ペプチド(19)と記載）を粗目的ペプチドとして、段落番号［０１６７］（［表１４－１］）と同一のスルホン酸化合物を用いて、試験例１（段落番号［０１４１］）と同様の方法で試験を行った。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000126
（２）同様に、H-AQKLRASD-OH（表１では目的ペプチド(7)と記載）を粗類縁ペプチドとし、H-AQKLRSD-OH（表１では類縁ペプチド(20)と記載）を粗目的ペプチドとして、段落番号［０１７２］（［表１６－２］）と同一のスルホン酸化合物を用いて、試験例１（段落番号［０１４１］）と同様の方法で試験を行った。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000127
（３）同様に、H-YERAKSNM-OH（表１では目的ペプチド(8)と記載）を粗類縁ペプチドとし、H-YERAKNM-OH（表１では類縁ペプチド(9)と記載）を粗目的ペプチドとして、段落番号［０１５５］（［表７］）と同一のスルホン酸化合物を用いて、試験例１（段落番号［０１４１］）と同様の方法で試験を行った。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000128
 （４）同様に、H-YERAKSNM-OH（表１では目的ペプチド(8)と記載）を粗類縁ペプチドとし、H-YERAKSN-OH（表１では類縁ペプチド(23)と記載）を粗目的ペプチドとして、段落番号［０１６８］（［表１４－２］）と同一のスルホン酸化合物を用いて、試験例１（段落番号［０１４１］）と同様の方法で試験を行った。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000129
 （５）同様に、H-AQKLRASD-OH（表１では目的ペプチド(7)と記載）を粗類縁ペプチドとし、H-AQKRASD-OH（表１では類縁ペプチド(24)と記載）を粗目的ペプチドとして、段落番号［０１７２］（［表１６－２］）と同一のスルホン酸化合物を用いて、試験例１（段落番号［０１４１］）と同様の方法で試験を行った。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000130
　試験例７では、本願発明の方法が非常に汎用性の高いペプチド精製方法であることをさらに証明するために、試験例１での目的ペプチドと類縁ペプチドのモル比を入れ替えた、すなわち試験例１の類縁ペプチドを目的ペプチドとし、上記の試験例の目的ペプチドを類縁ペプチドとして試験を行った。
　具体的には試験例１、段落番号［０１６７］［表１４－１］には目的ペプチド(7)H-AQKLRASD-OHと類縁ペプチド(19)H-QKLRASD-OHを約１０：１のモル比で混合したモデルでの結果が示されているが、対して、試験例７では、同じスルホン酸化合物を用いつつ、これらのモル比（理論値）を逆転させて、すなわち(7)H-AQKLRASD-OH：(19)H-QKLRASD-OH＝約１：１０で混合するモデルで試験を行った。
　加えて、試験例１、段落番号［０１７２］［表１６－２］に記載の目的ペプチド(7)H-AQKLRASD-OHと類縁ペプチド(20)H-AQKLRSD-OH；段落番号［０１５５］［表７］に記載の目的ペプチド(8)H-YERAKSNM-OHと類縁ペプチド(9)H-YERAKNM-OH；段落番号［０１６８］［表１４－２］に記載の目的ペプチド(8)H-YERAKSNM-OHと類縁ペプチド(23)H-YERAKSN-OH；段落番号［０１７２］［表１６－２］に記載の目的ペプチド(7)H-AQKLRASD-OHと類縁ペプチド(24)H-AQKLRSD-OHについても同様にモル比（理論値）を逆転させ、それぞれ上記の試験例と同じスルホン酸化合物を用いて試験を行った。
　試験例７の結果から明かなとおり、混合比を逆転させることで、すなわち、試験例１の類縁ペプチドを目的ペプチドとし、試験例１の目的ペプチドを類縁ペプチドとした場合であっても、固体中において目的ペプチドの類縁ペプチドに対する相対純度が向上（あるいは液体中では低下）したことが示された。
試験例８：各種スルホン酸化合物の効果（複数の類縁ペプチドの除去）
　複数の粗類縁ペプチド溶液（各々、０．１μｍｏｌ（類縁ペプチドの純度を１００％と仮定））を用いて、試験例１（段落番号［０１４１］）と同様の方法で、得られた固体における各類縁ペプチドに対する目的ペプチド率（％）の上昇ポイントを算出した。
　結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000131
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000132
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000133
　表４７～４９に示すとおり、得られた固体における目的ペプチド率は上昇し、スルホン酸化合物は種々の目的ペプチドの精製において優れた効果を示した。
　本願の方法はペプチドの精製に使用できる。

Claims (36)

  1. 　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
    （１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
    （２）固液分離して該固体を採取する工程
    を含む、方法。
  2. 　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
    （１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
    （２）該混合から１分以上経過後に固液分離して該固体を採取する工程
    を含む、方法。
  3. 　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
    　該方法は
    （１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
    （２）固液分離して該固体を採取する工程
    を含み、
    　該溶媒は、水；アルコール化合物；アセトニトリル；エーテル化合物；ケトン化合物；エステル化合物；炭化水素化合物；ＤＭＳＯ；アミド化合物；ハロゲン化炭化水素；または、これらの混合を含有する、
    方法。
  4. 　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
    （１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
    （２）固液分離して該固体を採取する工程
    （３）該固体を洗浄する工程
    を含む、方法。
  5. 　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
    （１）０～５０℃で、該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
    （２）０～５０℃で、固液分離して該固体を採取する工程
    を含む、方法。
  6. 　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
    （１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
    （２）固液分離して該固体を採取する工程
    を含み、
    　該溶媒と該目的ペプチドの重量比（溶媒／目的ペプチド）が１～１０００００である、
    方法。
  7. 　ペプチド合成によって得られたペプチドから目的ペプチドを精製する方法であって、該目的ペプチドはＮ末端が遊離であるかおよび／または少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を有し、
    　該方法は、
    （１）該合成されたペプチドをスルホン酸化合物の存在下で溶媒と混合して固体を得る工程、
    （２）固液分離して該固体を採取する工程
    を含み、
    　該目的ペプチドに対する該スルホン酸化合物のモル比が０．１～５０である、
    方法。
  8. 　該スルホン酸化合物が式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （Ｉ）
    ［式中、
    　Ａは、置換されていてもよいＣ６－１４アリール、置換されていてもよい二環式ヘテロ環基、Ｃ２－３アルケニル、またはＣ２－３アルキニルであり；
    　Ｘは、
    （ｉ）単結合、
    （ｉｉ）置換されていてもよいＣ１－6アルキレン、
    （ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＯがＡと結合する）、または
    （ｉｖ）Ｃ２－４アルケニレン
    であり；および
    　ｎは１～３の整数である］
    の化合物である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　Ａが置換されていてもよいＣ６－１４アリールであり；
    　Ｘが、
    （ｉ）単結合、
    （ｉｉ）置換されていてもよいＣ１－６アルキレン、
    （ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＯがＡと結合する）、または
    （ｉｖ）Ｃ２－３アルケニレン
    であり；および
    　ｎが１～３の整数である
    請求項８に記載の方法。
  10. 　Ａが置換されていてもよい二環式ヘテロ環基であり；
    　Ｘが、
    （ｉ）単結合、
    （ｉｉ）Ｃ１－６アルキレン、
    （ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＯがＡと結合する）、または
    （ｉｖ）Ｃ２－３アルケニレン
    であり；および
    　ｎが１～３の整数である
    請求項８に記載の方法。
  11. 　ＡがＣ２－３アルケニルであり；および
    　ＸがＣ１－４アルキレンである
    請求項８に記載の方法。
  12. 　ＡがＣ２－３アルキニルであり；および
    　ＸがＣ１－４アルキレンである
    請求項８に記載の方法。
  13. 　該目的ペプチドが５～３１個のアミノ酸残基を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　該合成されたペプチドに類縁ペプチドが含まれる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　該合成されたペプチドにおいて、該目的ペプチドに対して、類縁ペプチドのモル比が０．７以下である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　該ペプチド合成が固相法によるペプチド合成である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　該目的ペプチドが少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を含み、かつ、該目的ペプチドのＮ末端が遊離であってもよい、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　Ａが、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびＣ６－１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよいＣ６－１４アリールである、請求項８、９、および１３～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　Ａがフェニル、ナフチル、フルオレニル、およびインダニルから選択されるＣ６－１３アリールであって、該Ｃ６－１３アリールは、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびＣ６－１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよい、請求項８、９、および１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　Ａがフェニル、ナフチル、およびインダニルから選択されるＣ６－１０アリールであって、該Ｃ６－１０アリールは、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびＣ６－１０アリールからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよい、請求項８、９、および１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　Ａが、2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-1-ベンゾアゼピニル、ベンゾオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、フタラジニル、クロマニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジル、ベンゾチアゾニル、キノリル、イソクロマニル、およびベンゾトリアゾリルからなる群から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は適宜置換されていてもよい、請求項８、１０、および１３～１７のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　Ａが、Ｃ６－１０アリール、Ｃ１－４アルキル、－ＣＯ－Ｃ６－１０アリール、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２－Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、－ＮＨ２、－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＮ、－ＣＯ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＦ３、およびオキソからなる群から選択される同一または異なった１～５個の置換基で置換されていてもよい二環式ヘテロ環基である、請求項８、１０、１３～１７、および２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　Ａが
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     および
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     から選択される二環式ヘテロ環基であって、該二環式ヘテロ環基は１つのフェニルで置換されていてもよい、請求項８、１０、１３～１７、２１、および２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　Ｘが、
    （ｉ）単結合、
    （ｉｉ）メチル、ベンジル、シアノ、およびフェニルからなる群から選択される同一または異なった１～３個の置換基で置換されていてもよいＣ１－４アルキレン、または
    （ｉｉｉ）－ＣＯ－ＣＨ２－（ＣＯがＡと結合する）、
    である、請求項８～１０、および１３～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　Ｘが、
    （ｉ）単結合、
    （ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、１つのシアノ、および／または１つもしくは２つのフェニルで置換されていてもよいＣ１－４アルキレン、または
    （ｉｉｉ）－ＣＯ－ＣＨ２－（ＣＯがＡと結合する）、
    である、請求項８～１０、および１３～２３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 　Ｘが、
    （ｉ）単結合、
    （ｉｉ）メチル、ベンジル、シアノ、およびフェニルからなる群から選択される同一または異なった１～３個の置換基で置換されていてもよいＣ１－４アルキレン、または
    （ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）－（ＣＯがＡと結合する）、
    である、請求項１８に記載の方法。
  27. 　Ｘが、
    （ｉ）単結合、
    （ｉｉ）１つのメチル、１つのベンジル、１つのシアノ、および／または１つもしくは２つのフェニルで置換されていてもよいＣ１－４アルキレン、または
    （ｉｉｉ）－ＣＯ－（ＣＨ２）－（ＣＯがＡと結合する）、
    である、請求項１８に記載の方法。
  28. 　Ｘが単結合である、請求項８～１０、および１３～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 　Ｘが単結合である、請求項２３に記載の方法。
  30. 　該スルホン酸化合物が下記：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004


    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006


    から選択される、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 　該スルホン酸化合物を除去する工程をさらに含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 　目的ペプチドの類縁ペプチドに対するモル比を向上させるための、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 　請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法を含む、該目的ペプチドを製造する方法。
  34. 　請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法を含む方法により精製された目的ペプチドを含有する薬剤。
  35. 　請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法において使用されるための、該スルホン酸化合物を含有する剤。
  36. Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     および
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     から選択される、化合物。
PCT/JP2019/031405 2018-09-14 2019-08-08 スルホン酸化合物によるペプチド精製方法 WO2020054287A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19860341.7A EP3851446A4 (en) 2018-09-14 2019-08-08 PEPTIDE PURIFICATION PROCESS USING A SULFONATE COMPOUND
US17/275,938 US11535647B2 (en) 2018-09-14 2019-08-08 Peptide purification method using sulfonate compound
CN201980043284.3A CN112533936B (zh) 2018-09-14 2019-08-08 利用磺酸化合物纯化肽的方法

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-173042 2018-09-14
JP2018173042 2018-09-14
JP2019-008701 2019-01-22
JP2019008701A JP6564539B1 (ja) 2018-09-14 2019-01-22 スルホン酸化合物によるペプチド精製方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020054287A1 true WO2020054287A1 (ja) 2020-03-19

Family

ID=67692195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/031405 WO2020054287A1 (ja) 2018-09-14 2019-08-08 スルホン酸化合物によるペプチド精製方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11535647B2 (ja)
EP (1) EP3851446A4 (ja)
JP (2) JP6564539B1 (ja)
CN (1) CN112533936B (ja)
TW (1) TWI744674B (ja)
WO (1) WO2020054287A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022358487A1 (en) * 2021-09-30 2024-03-28 Protinhi B.V. Protease inhibitors

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013501773A (ja) * 2009-08-11 2013-01-17 バイオコン・リミテッド クロマトグラフィーの方法およびその精製化合物
JP2016190851A (ja) 2010-05-25 2016-11-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド ポリペプチドの精製方法
JP2018052933A (ja) 2015-01-09 2018-04-05 イーライ リリー アンド カンパニー Ｇｉｐおよびｇｌｐ−１コアゴニスト化合物

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4581168A (en) * 1983-02-21 1986-04-08 Sanofi Synthesis of hpGRF (Somatocrinin) in liquid phase and intermediate peptides
JP2662287B2 (ja) 1988-03-14 1997-10-08 三井東圧化学株式会社 α―Ｌ―アスパルチル―Ｌ―フェニルアラニンメチルエステルの分離方法
US5116726A (en) * 1988-07-25 1992-05-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Methods for removal of detergents from analytes
ES2146649T3 (es) 1993-05-05 2000-08-16 Keith Rose Compuestos de polioximas y su preparacion.
JPH11508452A (ja) 1995-07-11 1999-07-27 デグッサ アクチエンゲゼルシャフト ペプチドおよびｎ−カルバモイル保護されたペプチドの新規製造法
IT1277914B1 (it) * 1995-08-22 1997-11-12 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per produrre - in forma pura e in quantita' elevate - polipeptidi con l'attivita' proteolitica della proteasi ns3 di hcv, e
AU3189997A (en) * 1996-06-21 1998-01-07 Takeda Chemical Industries Ltd. Method for producing peptides
JPH1087695A (ja) 1996-07-24 1998-04-07 Takeda Chem Ind Ltd 環状ペプチド化合物またはその塩の精製法
US7799561B2 (en) 2002-06-12 2010-09-21 Sigma-Aldrich, Co. Affinity peptides and method for purification of recombinant proteins
SG144809A1 (en) 2007-01-11 2008-08-28 Millipore U K Ltd Benzimidazole compounds and their use as chromatographic ligands
EP2120915B1 (en) * 2007-01-22 2011-09-28 Genentech, Inc. Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies
WO2008109079A2 (en) 2007-03-01 2008-09-12 Novetide, Ltd. High purity peptides
WO2009017154A1 (ja) * 2007-07-31 2009-02-05 Otsuka Chemical Co., Ltd. ペプチドの製造方法
CN101899092B (zh) * 2009-06-01 2013-07-24 北京大学 一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法
CN101759776A (zh) * 2009-12-31 2010-06-30 上海昂博生物技术有限公司 一种埃替菲巴肽的合成方法
US9200034B2 (en) * 2011-03-16 2015-12-01 Council Of Scientific & Industrial Research Oligopeptides and process for preparation thereof
JP2014524916A (ja) * 2011-07-13 2014-09-25 インストラクション・ゲーエムベーハー 高耐塩性のイオン交換材料
US9309282B2 (en) * 2011-10-19 2016-04-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Solid phase for mixed-mode chromatographic purification of proteins
EP2935309B1 (en) 2012-12-20 2019-01-23 Merck Patent GmbH Copolymers for protein precipitation
EP3102637B1 (en) * 2014-02-04 2018-04-11 Basf Se Method for purification of antibodies, antibody fragments or engineered variants thereof using specific anthraquinone dye-ligand structures
CN107072550A (zh) 2014-11-07 2017-08-18 皇家飞利浦有限公司 体动记录方法和装置
CN106905381A (zh) * 2017-03-11 2017-06-30 顺德职业技术学院 天然产物药物的高效集群式化学修饰合成方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013501773A (ja) * 2009-08-11 2013-01-17 バイオコン・リミテッド クロマトグラフィーの方法およびその精製化合物
JP2016190851A (ja) 2010-05-25 2016-11-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド ポリペプチドの精製方法
JP2018052933A (ja) 2015-01-09 2018-04-05 イーライ リリー アンド カンパニー Ｇｉｐおよびｇｌｐ−１コアゴニスト化合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARTHA, A. ET AL.: "Effect of the type of ion- pairing reagent in reversed-phase ion-pair chromatography", CHROMATOGRAPHIA, vol. 20, no. 10, October 1985 (1985-10-01), pages 587 - 590, XP055694758 *
BIGGER, S. W. ET AL.: "Flashphotol: Using a flash photolysis apparatus simulator to introduce students to the kinetics of transient species and fast reactions", J. CHEM. EDUC., vol. 93, 2016, pages 1475 - 1477, XP055694767 *
LOUGNOT, D. J. ET AL.: "A water-soluble benzophenone in reverse micelles: kinetics and spectroscopy", JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY, vol. 26, 1984, pages 119 - 130, XP055694763 *
NAHOR, G. S. ET AL.: "Reduction of dinitrogen to ammonia in aqueous solution mediated by colloidal metals", J. CHEM. SOC. FARADAY TRANS., vol. 86, no. 23, 1990, pages 3927 - 3933, XP000176937, DOI: 10.1039/ft9908603927 *
See also references of EP3851446A4

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020045336A (ja) 2020-03-26
US11535647B2 (en) 2022-12-27
JP2020045327A (ja) 2020-03-26
EP3851446A1 (en) 2021-07-21
EP3851446A4 (en) 2022-07-27
CN112533936A (zh) 2021-03-19
CN112533936B (zh) 2022-03-01
US20220144888A1 (en) 2022-05-12
TW202016126A (zh) 2020-05-01
JP6564539B1 (ja) 2019-08-21
TWI744674B (zh) 2021-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6942147B2 (ja) Ｍｔ１−ｍｍｐに対して特異的な二環式ペプチド−毒素コンジュゲート
Schneider et al. Synthesis and efficacy of square planar copper complexes designed to nucleate. beta.-sheet structure
TWI666026B (zh) Ｗｔ１抗原胜肽結合疫苗
JP6450192B2 (ja) トリアゾール架橋した、およびチオエーテル架橋したペプチドミメティック大環状化合物
Capone et al. Electrophilic S‐Trifluoromethylation of Cysteine Side Chains in α‐and β‐Peptides: Isolation of Trifluoro‐methylated Sandostatin®(Octreotide) Derivatives
US8569452B2 (en) Preparation of phalloidin and its derivatives
JP5985534B2 (ja) グアニジル基およびアミノ基の保護のためのインドールスルホニル保護基
WO2020054287A1 (ja) スルホン酸化合物によるペプチド精製方法
JP2018535946A (ja) バルシバン及びその中間体を作製する新規の方法
Jacobsen et al. Synthesis of cyclic peptide analogues of the 3 10 helical Pro138-Gly144 segment of human aquaporin-4 by olefin metathesis
FR2756827A1 (fr) Composes synthetiques biepitopiques utilisables comme etalons dans les dosages biologiques de la troponine i
Olma et al. The biological consequences of replacing hydrophobic amino acids in deltorphin I with amphiphilic α‐hydroxymethylamino acids
JP4929452B2 (ja) 新規クマリン誘導体
WO2024043251A1 (ja) 環状ペプチドの細胞膜透過性の予測方法
WO2022149584A1 (ja) ペプチド
WO2023054712A1 (ja) ペプチド
JP7162853B1 (ja) 液相ペプチド合成用担体結合ペプチドの分析方法
WO2024043249A1 (ja) 環状ペプチドまたはその塩、およびｍｄｍｘ阻害剤
Joshi et al. Application of microwave method to the solid phase synthesis of pseudopeptides containing ester bond
JP7302847B2 (ja) 新規フルオロジニトロフェニル化合物及びその用途
EP3042911A1 (en) Method for producing dipeptide derivative containing disubstituted amino acid residue
Chen et al. Aladan scanning: The structure-activity relationship of dynorphin A

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19860341

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019860341

Country of ref document: EP

Effective date: 20210414

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP