KR102097954B1 - 단백질 침전을 위한 공중합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공중합체를 사용해 세포 배양 유체로부터 포획 또는 청징을 위한 재조합 및/또는 바이오치료 단백질의 단리에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 공중합체는 소수성 및 음이온성 잔기를 포함한다.

Description

단백질 침전을 위한 공중합체 {COPOLYMERS FOR PROTEIN PRECIPITATION}

본 발명은 공중합체를 사용해 세포 배양 유체로부터 포획 또는 청징을 위한 재조합 및/또는 바이오치료 단백질과 같은 표적 분자의 정제에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 공중합체는 소수성 및 음이온성 잔기를 포함한다.

단일클론 항체 (mAb) 는 임상 적용, 진단 시스템 및 상이한 연구 분야에 널리 사용된다. 포유류 세포 발현 시스템을 사용하는 이들 단백질의 제조가 1986 넌도에 처음 허가 받은 mAb 의 제조 이래로 엄청나게 성장해왔다. 지금까지, 하기 주요 3 개의 상이한 세포주: 중국 햄스터 난소 (CHO), 쥣과 골수종 (NS0) 및 Sp2/0 세포가 mAb 제조에 사용되지만, 제조는 5000 내지 25000 리터 범위의 바이오리액터(bioreactor) 에서 일어난다. 항체 및 바이오치료 단백질의 다운스트림 가공은 일반적으로 예를 들어 디스크 스택(disk stack) 원심분리기를 사용해, 발효조의 하베스팅(harvesting) 으로 개시한 후, 뎁스(depth)- 및 막 필터 시스템을 통해 청징시키는, 일련의 정제 단계를 사용한다. 후에, 수개의 크로마토그래피 단계를 사용하는데, 단백질 A 와의 친화도 크로마토그래피를 사용한 초기 포획으로 개시한 후, 음이온- 및 양이온 교환 크로마토그래피를 실시한다. 추가의 크로마토그래피 단계는 소수성 또는 친수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 바이러스 불활성화는 낮은 pH 용리를 통해 달성되고, 추가의 여과는 잔류 바이러스 입자를 제거한다. 그러나, 25 년 전의 1 g l^-1 과 비교시 10-13 g l^-1 의 세포 배양물 발현 수준의 증가, 뿐만 아니라 경제적 압력 상승은 현 크로마토그래피-기재 시스템의 수행성과 비교시 보다 높은 수율 및 처리량(throughput) 을 갖는 향상된 정제 방법에 대한 필요성을 요구한다. 이들 요구는 크로마토그래피 컬럼 물질 용량, 컬럼의 차원 증가, 또는 비슷한 수율 및 순도를 수득하지만 비용을 감소시키고 보다 양호하게 스케일러블(scalable) 해야 하는, 크로마토그래피에 대한 대안 정제 방식의 개발로 맞춰질 수 있다. 대규모 면적의 경우, 배치(batch) 정제 방법이 개발되었는데, 이때 목적하는 단백질이 하베스트 세포 용액으로부터 침전된다. 단백질 침전을 위한 통상적 방법은 여기서 암모늄 술페이트 침전 (AS) (Venkiteshwaran, Heider, et al., 2008), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전, 또는 침전제로서 카프릴산을 사용하는 것이다 (Wang, Diehl, et. al., 2009; Temponi, Kageshita, et al., 1989). 그러나, 대규모 정제를 위해 PEG 또는 AS 를 사용하는 것은 대량의 이들 침전제 및 보다 높은 단백질 농도를 요구함으로, 단지 적당한 순도 등급만을 산출하고, 높은 폐기 적재량을 생성한다. 기존의 정제 방법은 고가이고, 대량 부피의 완충액 및 낮은 처리량으로 매우 수고스럽거나 (크로마토그래피), 또는 충분한 순도 및 수율에 있어서 부족하다 (침전). 낮은 pH 에서 단백질 A 로부터 결합된 mAb 의 용리는 면역원군을 형성할 수 있으며, 이들의 제거 및 단백질 A 의 침출은 비용을 추가로 증가시킨다. 따라서, 단백질 A 크로마토그래피에 대한 대안 방식 및 단백질 및 항체 정제의 개선이 간절히 요구된다. 추가로, 항체의 단편 항원 결합 영역은 진단 및 치료에의 적용에서 그 중요성이 증가하고 있다. 상기 단편을 수득하기 위해, 엔도펩티다아제가 사용될 수 있다. 파파인으로의 단일클론 항체의 처리는 항원 결합 단편 또는 단편 항원 결합을 생성하는 통상적인 방식이며, 또한 항체의 불변부를 나타내는 Fc 단편의 생성을 유도한다. Fab 및 Fc 는 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용해 분리될 수 있지만, 상기 분리 기법은 상기 유형의 Fab 에 대한 단백질 A 의 결합 친화도로 인해 V_H3 서브패밀리에 속하는 mAb 유래의 Fab 에서는 불충분하다. 인간 mAb 는 V_H3 이 풍부한 유전자 서열에 주로 의존한다. 추가로, 인간 파지(phage) 디스플레이 라이브러리는 V_H3 의 대규모의 존재를 나타낸다. 따라서, Fab 및 Fc 단편의 분리를 위한 대안적 전략이 요구된다. 개질된 단백질 A 는 하나의 옵션이지만, 다소 코스트-인텐시브(cost-intensive) 하다.

매우 최근의 추구되는 접근법은 커스터마이징(customizing) 에 대한 요구 없이 대다수의 항체에 적용될 수 있는 침전제로서의 중합체의 사용이다.

US 6,927,282 는 중합체 응집을 위한 상이한 전하 밀도를 갖는 음이온성 중합체의 사용을 개시한다. US 5,922,531 은 단백질 흡착을 위한 고분자전해질층으로 처리된 조절된 기공 유리의 사용을 다룬다. WO 2008/079280 은 특정 조건 하에 용해되고, 그 조건에서 변화되면 용액으로부터 침전되는 고분자전해질의 사용을 개시한다.

WO 2008/091740 은 단백질 침전을 위한 다음이온성 또는 다양이온성 중합체의 사용을 개시한다.

상기는 침전제로서 중합체를 사용하는 접근법이 더더욱 중요해지고 있음을 나타낸다. 아직까지는, 생물약제의 생성에 적합한 것으로 충분히 효율적인 방법을 발견하는데 여전히 문제가 있다. 추가로, 상이한 표적 분자를 위한 절차를 조정하고 최적화시키는 문제가 여전히 존재한다.

음이온성 및 소수성 특성을 갖는 중합체 (소위 음이온성 혼합 모드 중합체) 가 단백질 침전을 위한 이상적인 중합체인 것으로 밝혀졌다. 소수성 및 음이온성기를 포함하는 중합체를 사용함으로써, 항체는 90% 이하의 수율로 정화된 세포 배양 배지로부터 침전될 수 있고, 더 많은 항체가 양호한 순도로 회수될 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기를 포함하는, 샘플로부터 표적 분자의 분리 또는 단리 방법에 관한 것이다:

a) 샘플을 제공하고,

b) 소수성 및 음이온성기를 포함하는 하나 이상의 공중합체를 샘플에 첨가함으로써, 표적 분자-공중합체 침전물을 형성시키고,

c) 단계 b) 의 혼합물로부터 침전물을 분리시킴.

바람직한 구현예에서, 공중합체는 35 내지 65% 음이온성기를 포함한다.

하나의 바람직한 구현예에서, 음이온성기는 술폰산, 황산, 카르복실산 및/또는 포스폰산 또는 인산을 포함한다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 소수성기는 선형, 분지형 또는 시클릭 알킬기, 할로겐 치환된 알킬기, 방향족기, 헤테로방향족기 및/또는 할로겐 치환된 방향족 또는 헤테로방향족기를 포함한다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 공중합체의 중량 평균 분자량은 10,000 내지 120,000 g/mol 이고/이거나 다분산도는 1.05-2.50 이다.

바람직한 구현예에서, 표적 분자는 항체이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 항체의 Fc (단편 불변부) 부분 또는 Fab (단편 항원 결합) 영역이다.

바람직한 구현예에서, 단계 a) 에서 샘플의 pH 는 표적 분자의 등전점 미만의 pH 및 적용가능하다면 분리되어야 하는 샘플의 기타 성분의 등전점 초과의 pH 로 조정된다.

바람직한 구현예에서, 단계 a) 에서 샘플의 pH 는 4 내지 5.5 의 pH 로 조정된다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 샘플의 이온 강도는 20 ℃ 에서 측정시 17 mS/cm 이하의 전도도와 유사하게 조정된다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 추가의 단계 d) 에서 단계 c) 로부터의 침전물은 재용해된다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 d) 의 재용해된 혼합물은 실리카 또는 유리 플레이크로 처리된다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 실리카 또는 유리 플레이크는 DMAE 및/또는 TMAE 기로 관능기화된다.

도 1 은 본 발명의 방법에 사용되는 공중합체를 위한 상이한 유형의 적합한 빌딩 블록의 화학 구조를 나타낸다.
도 2 는 하기를 비교하기 위해 스펙트럼 오버레이(overlay) 로서 중간 적외선 스펙트럼을 나타내고:
a) 본 발명에 따른 정제 기법으로 처리된 단일클론 항체 세툭시마브(Cetuximab)
b) 침전에 속하지 않은 2 차 구조의 단일클론 항체 세툭시마브
2 차 구조의 항체가 침전시 유의하게 바뀌지 않는 것을 나타낸다.
도 3 은 하기의 바이오레이어(Biolayer) 간섭측정 (BLI) 후의 센서그램을 나타낸다:
a) 비침전된 단일클론 항체
b) 밀폐된(enclosed) 정제 기법으로 처리된, 침전 및 재용해된 단일클론 항체
이때, 침전 및 비침전 항체의 결합 친화도의 차이는 없는 것으로 나타났다. 레드 라인은 1:1 상호작용 모델에 대한 데이터의 글로벌 피트(global fit) 를 나타낸다. Octet Red 를 사용해 데이터가 수합됐다. 동일한 항원 포함 웰 (6, 4, 3, 2 및 1 nM) 에서 비침전 및 침전 항체의 역학을 측정했다.

정의

본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명이 특정한 조성 및 방법 단계에 제한되지 않고, 그 자체가 가변적일 수 있는 것으로 여겨져야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된바, 단수형은 달리 명백히 지시되지 않는한 복수형을 포함하는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어 "리간드" 로 언급하는 것은 복수의 리간드를 포함하고, "항체" 로 언급하는 것은 복수의 항체 등을 포함한다.

달리 정의되지 않는한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련되어 있는 당업자에 의해 통상 여겨지는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해 정의된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 분자" 는 샘플의 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물로부터 단리, 분리 또는 정제되어야 하는 임의의 분자, 물질 또는 화합물로 칭한다. 표적 분자의 예는 항체, 단편 항원 결합부 (Fab), 단편 불변부 (Fc), 단백질, 펩티드, 재조합 단백질, 기타 천연 화합물, 기타 생물약제학 화합물, 백신 또는 생물약제학 화합물의 군이다. 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 생분자, 바람직하게는 단백질이다. 매우 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 항체이다. 전형적으로, 표적 분자는 본 발명의 방법을 적용함으로써 단리되어야 하는 생성물이지만, 또한 단리되어야 하는 생성물이 아닌 표적 분자를 침전시키는데 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 상기 경우에, 최종 생성물이 상청액에 남아 있고 표적 분자를 제거함으로써 정제된다면, 표적 분자는 제거되어야 하는 성분이다. Fab 및 Fc 단편의 분리 및 정제를 위해 본 발명을 사용하는 경우, 예를 들어 침전되는 표적 분자가 원하는 생성물일 수 있지만, 원하는 생성물이 상청액에 있는 단편이라면, 한 유형의 단편을 또한 침전시킬 수 있다. 임의의 경우에, 침전되는 성분이 표적 분자로 불린다.

용어 "항체" 는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질로 칭한다. 전형적으로, 항체는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어진 기본 4-폴리펩티드 사슬 구조를 가지며, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 디술파이드 결합에 의해 안정화된다. 항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있고, 단량체성 또는 중합체성 형태로 존재할 수 있는데, 예를 들어 IgM 항체는 오량체 형태로 존재하고/하거나 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재한다. 항체는 유지된다면 항체 단편들 및 다특이적 항체 (예, 이중특이적 항체) 를 또한 포함할 수 있거나, 또는 개질되어 리간드-특이적 결합 도메인을 포함한다. 용어 "단편" 은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 부분 또는 일부로 칭한다. 단편은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 방식에 의해 수득될 수 있다. 재조합으로 생성되는 경우, 단편은 단독으로 또는 융합 단백질로 불리는 거대 단백질의 부분으로서 발현될 수 있다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따라, 융합 단백질은 또한 용어 "항체" 를 포함한다.

상기 논의되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역 포함 단백질, 예를 들어 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, Fc 영역 포함 단백질은 또 다른 폴리펩티드 또는 그 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예시적 폴리펩티드는, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; α-1-항트립신; 인슐린 α-사슬; 인슐린 β-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나아제 또는 인간뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화시 조절 정상적 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안(Muellerian)-저해 물질; 렐락신 α-사슬; 렐락신 β-사슬; 프로렐락신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 β-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA) (예, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘성 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β.; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 αFGF 및 βFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리스로포이에틴; 골전도성 인자; 항체독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-I 내지 IL-IO; 초산화물 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부식 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔빌로프(envelope) 의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 항체는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 그 단편 또는 변이체이며, 이는 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나에 특이적으로 결합된다.

본원에 사용된 바와 같고 달리 언급되지 않는한, 용어 "샘플" 은 표적 분자를 포함하는 임의의 조성물 또는 혼합물로 칭한다. 샘플은 생물학적 또는 기타 공급원 유래일 수 있다. 생물학적 공급원은 진핵 및 원핵 공급원, 예컨대 식물 및 동물 세포, 조직 및 기관을 포함한다. 바람직한 샘플은 세포 배양 유체, 예컨대 포유류 세포 배양물, 예를 들어 CHO, NS-0, SP2/0, BioWa, 세균 세포 배양물, 예를 들어 E. 콜라이(coli), B. 서브틸리스(subtilis), 효모 세포 배양물, 또는 사상균류이다. 샘플은 또한 표적 분자와 함께 혼합되어 발견되는 희석제, 완충액, 세제, 및 오염 종, 파편 등을 포함할 수 있다. 샘플은 "부분 정제" 될 수 있거나 (즉, 하나 이상의 정제 단계, 예컨대 여과 단계에 속함), 표적 분자를 생성하는 호스트 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다 (예를 들어, 샘플은 하베스트된 세포 배양 유체를 포함할 수 있음).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물" 은 생물학적 매크로분자, 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 호스트 세포 단백질, 핵산, 내독소, 지질, 합성 기원의 불순물, 및 본 발명의 방법을 사용해 외래 또는 부적당한 분자 중 하나 이상으로부터 분리된 표적 분자를 포함하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 첨가제를 포함해 임의의 외래 또는 부적당한 분자로 칭한다. 추가로, 상기 불순물은 본 발명의 방법 이전에 일어날 수 있는 단계에 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다.

본원에서 상호교환되어 사용되는 바와 같은 용어 "정제" "분리" 또는 "단리" 는 표적 분자 및 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 분리에 의해 표적 분자의 순도를 증가시키는 것으로 칭한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도는 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분) 제거함으로써 증가된다.

용어 "크로마토그래피" 는 혼합물에 존재하는 기타 분자로부터 관심있는 분석물 (예, 표적 분자) 을 분리시키는 임의 종류의 기법으로 칭한다. 통상적으로, 표적 분자는 상기 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 고정 배지를 통해 이동하는 속도, 또는 결합 및 용리 프로세스의 차이의 결과로서 기타 분자로부터 분리된다.

용어 "친화도 크로마토그래피" 는 표적 분자 (예, 관심있는 Fc 영역 포함 단백질 또는 항체) 가 표적 분자에 특이적인 리간드에 특이적으로 결합되는, 단백질 분리 기법으로 칭한다. 상기와 같은 리간드는 일반적으로 생물특이적 리간드로 칭한다. 일부 구현예에서, 생물특이적 리간드 (예, 단백질 A 또는 그 기능 변이체) 는 크로마토그래피 매트릭스 물질에 공유결합되고, 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉하는 경우에 용액 중의 표적 분자에 접근가능하다. 표적 분자는 일반적으로 크로마토그래피 단계 동안 생물특이적 리간드에 대한 그 특이적 결합 친화도를 보유하지만, 상기 혼합물 중 기타 용질 및/또는 단백질은 리간드에 눈에 띄게 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정화 리간드에의 표적 분자의 결합은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 매트릭스를 통과하도록 하면서, 표적 분자는 고상 물질 상의 고정화 리간드에 특이적으로 결합되어 있다. 이후에, 특이적 결합된 표적 분자는 적합한 조건 하에 (예, 낮은 pH, 높은 pH, 고염, 경쟁 리간드 등) 고정화 리간드로부터 활성 형태로 제거되고, 초기에 컬럼을 통과시켰던 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 없는 용리 완충액을 포함하는 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 임의 성분은 그 각각의 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 각종 방법에서, 단백질 A 는 Fc 영역 포함 표적 분자를 위한 리간드로서 사용된다. 표적 분자 (예, Fc 영역 포함 단백질) 의 생물특이적 리간드 (예, 단백질 A) 로부터의 용리를 위한 조건이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 그 기능 변이체는 생물특이적 리간드로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생물특이적 리간드, 예컨대 단백질 A 는 Fc 영역 포함 단백질에의 결합, 생물특이적 리간드 / 표적 분자 콘주게이트(conjugate) 의 세정 또는 재평형화를 위해 5-9 의 pH 범위에서 사용된 후, 하나 이상의 염을 포함하는, 약 4 이하의 pH 를 갖는 완충액으로 용리시킨다.

표적 분자 (예, Fc 영역 포함 단백질) 및 공중합체 분자 사이의 상호작용을 기재하는데 있어서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "결합" 은 결합 부위에서의 정전력, 수소 결합, 소수성 상호작용, 및/또는 반 데르 발스 힘과 결합 부위에서의 예를 들어 단백질 및 공중합체 구조의 공간 상보성과의 조합 영향을 통한 공중합체 분자에의 표적 분자의 일반적인 가역 결합으로 칭한다. 일반적으로, 결합 부위에서 공간 상보성이 크고 기타 힘들이 커질수록, 그 각각의 리간드에 대해서 단백질의 결합 특이성이 커질 것이다. 특이적 결합의 비제한적 예는 항체-항원 결합, 효소-기질 결합, 효소-공인자 결합, 금속 이온 킬레이트화, DNA 결합 단백질-DNA 결합, 조절 단백질-단백질 상호작용 등을 포함한다. 이상적으로, 친화도 크로마토그래피에서 특이적 결합은 유리 용액 중에 약 10"⁴ 내지 10"⁸ M 의 친화도로 일어난다.

"완충액" 은 그 산-염기 콘주게이트 성분의 작용에 의한 pH 의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충액의 목적하는 pH 에 따라 활용될 수 있는 각종 완충액이 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)] 에 기재되어 있다. 완충액의 비제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충액, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.

본 발명에 따라, 용어 "완충액" 은 하기를 위해 사용되는 임의의 액체 조성물에 대해서 사용된다.

a) 본 발명의 범주 내에 사용되는 표적 분자 또는 임의의 기타 분자를 포함하는 용액의 pH 및/또는 이온 강도 또는 기타 화학 또는 물리적 속성을 조정,

b) 본 발명의 범주 내에 사용되는 침전 표적 분자 또는 임의의 기타 분자의 세정,

c) 본 발명의 범주 내에 사용되는 침전 표적 분자 또는 임의의 기타 분자의 재용해.

본 발명에 따라, 용어 "중합" 또는 "공중합체의 합성" 은 상호교환되어 사용될 수 있고, 제한되지 않지만 하기 기법들 중 하나를 사용한 공중합체 또는 중합체 합성으로 칭할 수 있다: 자유 라디칼 중합, 활발한 라디칼 중합 (ATRP, RAFT, NMP 등), 음이온성 또는 양이온성 중합, 축합 중합 또는 임의 종류의 고리-열림 중합. 자유 라디칼 중합은 예를 들어 열적, 광화학적, 레독스 반응을 통해 또는 전기화학적으로 개시될 수 있다.

본 발명에 따라, 단량체 비는 공중합체에 존재하는 모든 기타 유형의 단량체에 대한 공중합체에 존재하는 하나의 단량체 유형의 몰비이다.

본 발명에 따라, 공중합체의 분자량은 공중합체의 분자량을 측정하기 위한 표준 방법으로서 당업자에 공지되어 있는 겔 침투 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같은 중량 평균 분자량 (본 발명에서 공중합체에 관해서 언급할때 Mw 로 축약됨) 의 관점에서 제시된다. 본 발명에 따라, 용어 다분산도는 제시된 공중합체의 중량 평균 분자량 및 수 평균 분자량의 비이다.

"지방족" 또는 "지방족기" 는 임의 치환된, 비방향족 탄화수소 부분을 의미한다. 부분은, 예를 들어 선형, 분지형, 또는 시클릭 {예, 모노- 또는 폴리시클릭, 예컨대 융합, 브릿지, 또는 스피로-융합 폴리시클릭), 또는 그 조합일 수 있다. 달리 명시되지 않는한, 지방족기는 1-30 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 20 개의 탄소 원자를 포함한다. 바람직한 지방족기는 알킬기이다.

본원에 기재된 "알킬기" 는 바람직하게는 주사슬에서 1 내지 20 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자, 및 모두 합쳐 30 개 이하의 탄소 원자를 포함하는 저급 알킬이다. 이들은 선형, 분지형 또는 시클릭일 수 있고, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함한다.

용어 "방향족기" 는 총 5 내지 14 개의 고리 구성원을 갖는 임의 치환된 모노시클릭, 바이시클릭, 및 트리시클릭 고리 시스템으로 칭하며, 이때 시스템에서 하나 이상의 고리는 방향족이고, 시스템에서 각 고리는 3 내지 7 개의 고리 구성원을 포함한다. 고리 부분에 6 내지 12 개의 탄소를 포함하는 모노시클릭 또는 바이시클릭기, 예컨대 페닐, 바이페닐, 나프틸, 치환된 페닐, 치환된 바이페닐 또는 치환된 나프틸이 바람직하다.

"소수성기" 는 수소 원자 대신에 단량체 또는 중합체와 같은 분자에 공유결합시 분자의 소수성을 증가시키는 치환기 또는 잔기와 같은 부분이다.

발명의 상세한 설명

공중합체의 합성/특성

본 발명에 따라, 공중합체는 2 개 이상의 상이한 유형의 단량체로 이루어진 중합체이다. 바람직하게는, 공중합체는 선형이고, 바람직하게는 20 ℃ 에서 측정시 예를 들어 전도도가 10-20 mS/cm 인 것을 포함하는 생리학적 염 조건에서 물 및 수성 완충액 중에 가용성이다. 본 발명의 방법에 사용되는 공중합체는 하나 이상의 유형의 음이온성기 및 하나 이상의 유형의 소수성기를 포함한다. 하나의 구현예에서, 음이온성기 및 소수성기만을 포함한다. 본 발명에 따라, 용어 "음이온성기" 는 공중합체에 존재하는 음전하기로 칭한다. 음이온성기의 전하가 단지 특정한 pH 조건에서 존재할 수 있지만, 미하전 상태에서 음이온성기가 예를 들어 친전자체 (예, 양성자 (H(+)) 의 제거로, 예를 들어 pH 의존 방식으로 음이온성으로 하전되게 할 수 있는 것으로 당업자에 자명하다. 음이온성기는 정전기 상호작용이 가능할 수 있고, 강한 이온 교환기, 약한 이온 교환기일 수 있고/있거나 금속 이온을 착물화할 수 있다. 음이온성기는 제한되지 않지만 하기 관능기 중 하나일 수 있다: 술폰산 및 그 염 -SO₃ ^-, 황산 에스테르 / 아미드 및 그 염 -SO₄ ^-, -NHSO₃ ^-, 포스폰산 -PO₃ ^2-, 인산 에스테르 및 그 염 -PO₄ ^2-, 카르복실산 및 그 염 -COO^-. 공중합체에서 음이온성기의 도입에 적합한 단량체 단위의 예는 2-아실아미도-2-메틸프로판 술폰산 (AMPS), 비닐 술폰산 VS, 스티렌 술폰산 또는 (메트)아크릴산이다.

소수성기는 선형, 분지형 또는 시클릭 지방족기, 할로겐 치환된 지방족기, 방향족, 헤테로방향족 또는 할로겐 치환된 방향족기일 수 있다. 공중합체에서 소수성기의 도입에 적합한 단량체 단위의 예는 벤질아실아미드 (BzAAm) 또는 벤질메타크릴레이트 (BzMA), N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAM), 메틸메타크릴레이트 (MMA), 부틸아크릴레이트 또는 tert-부틸아크릴레이트이다. 바람직한 구현예에서, 소수성기는 술폰산, 카르복실산 또는 포스폰산과 같은 음이온성기로 추가로 관능기화된다. 상기와 같은 관능기화 소수성기의 예는 벤조산이다. 공중합체에서 관능기화 소수성기의 도입에 적합한 단량체 단위의 예는 4-(아크릴로일아미도)벤조산 (4-ABZ) 이다.

본 발명에 따른 공중합체는 전형적으로 음이온성 및 소수성기가 부착되는 공중합체 백본을 포함한다. 전형적으로, 공중합체는 단량체 단위의 중합으로 합성된다. 공중합체 백본은 라디칼 중합 (예, 자유 라디칼 중합, 활발한 라디칼 중합 (ATRP, RAFT, NMP 등), 음이온성 또는 양이온성 중합, 축합 중합 또는 임의 종류의 고리-열림 중합과 같은 임의 유형의 중합을 통해 실시될 수 있는 임의의 중합체일 수 있다. 자유 라디칼 중합은, 예를 들어 열적, 광화학적, 레독스 반응을 통해 또는 전기화학적으로 개시될 수 있다. 전형적인 중합체 백본은 제한되지 않지만 하기일 수 있다: 비닐 중합체 (예, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐피리딘, 폴리비닐피롤리돈), 폴리에테르 (예, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌옥시드), 폴리에스테르, 폴리아미드.

식 I 내지 IV 에서, 가능한 공중합체의 도식 표현이 제시된다. 공중합체는 랜덤 또는 블록 공중합체, 바람직하게는 랜덤일 수 있다. 하기 정의가 적용된다:

R = 중합체 백본

R' = 중합체에 존재할 수 있거나 존재할 수 없는 스페이서

F = 관능기 (F1 = 음이온성기, F2 = 소수성기, F3 및 F4 = 서로 독립적으로 임의의 관능기 또는 -H, n > 0, m > 0, l ≥ 0, k ≥ 0)

표 1 에서, 중합체 백본 (R) 및 중합체의 측기의 적합한 예가 정의되어 있으며, 이때 소위 측기는 관능기 (F) 및 스페이서 (R'), 또는 스페이서 (R') 가 존재하지 않는다면 관능기 (F) 단독으로 이루어진다.

바람직한 구현예에서, 공중합체의 합성에 사용되는 각 단량체 단위는 하나 이상의 소수성 또는 하나의 음이온성기를 갖는다.

매우 양호한 결과가 적어도 AMPS 및 4-ABZ 뿐만 아니라 AMPS 및 BzAAm 에서 만들어진 공중합체로 수득될 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 공중합체는 전형적으로 약 1000 g/mol 내지 약 1,100,000 g/mol 범위의 중량 평균 분자량 및/또는 1.05-2.5 의 다분산도를 갖는다. 본 발명의 공중합체는 광범위한 사슬 길이, 즉 약 1000 g/mol 내지 약 1,000,000 g/mol 의 다양한 중량 평균 분자량, 바람직하게는 1.05-2.5 의 다분산도를 갖지만 동일한 유형의 단량체성 단위를 포함하는 공중합체의 혼합물로서 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 또한 좁은 범위의 중량 평균 분자량, 예를 들어 약 35,000 내지 약 45,000 g/mol, 또는 약 50,000 g/mol 내지 약 55,000 g/mol 을 가질 수 있다 (바람직하게는 모두가 다분산도 1.05-2.5). 중량 평균 분자량 및 분자량 분포의 프로파일이 농도, 중합 개시제 또는 촉매, 온도, 또는 시간과 같이 단량체성 단위의 특정한 중합 조건 하에서 조절될 수 있다. 공중합체의 중량 평균 분자량은 바람직하게는 10,000 내지 120,000 g/mol, 가장 바람직하게는 35,000 내지 60,000 g/mol 이다 (바람직하게는, 다분산도는 1.05-2.5).

음이온성 및 소수성기의 전체 수 중에서, 전형적으로 기의 10 내지 90% 가 음이온성기이다. 음이온성 및 소수성기의 전체 수의 바람직하게는 35 내지 65%, 가장 바람직하게는 45 내지 60% 가 음이온성기이다.

공중합체는 예를 들어 한정된 분자량, 사슬 길이 또는 한정된 소수화도 및 조성의 공중합체를 활용함으로써 각종 표적 분자를 선택적 침전시키기 위한 요건에 특별히 맞추어 합성될 수 있다.

침전 방법

본 발명의 방법은 음이온성 및 소수성기를 포함하는 공중합체를 사용해 생물약제학 샘플에 전형적으로 존재하는 표적 분자의 정제에 관한 것이다. 공중합체를 샘플 용액에 첨가하는 경우, 공중합체가 표적 분자에 결합되고, 침전된다. 최적의 침전 결과를 얻기 위해, 샘플이 제시되고, 표적 분자 농도, pH 및 이온 강도와 같은 특정한 조건으로 조정된다. 이는 공중합체의 첨가 이전에 또는 동시에 실시될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 공중합체를 사용해 샘플이 20 ℃ 에서 측정시 22.5 mS/cm 의 전도도까지의 높은 이온 강도를 갖는 경우라도 양호한 침전 결과를 달성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, 샘플의 이온 강도는 적절한 희석 방법을 사용해 0 mS/cm 내지 22.5 mS/cm 의 전도도, 바람직하게는 0 mS/cm 내지 17 mS/cm 의 전도도로 조정되어야 한다 (전도도는 20 ℃ 에서 측정). 많이 공지된 절차와 달리, 본 발명의 방법은 20 ℃ 에서 측정된 전도도가 10 mS/cm 내지 22.5 mS/cm 인 이온 강도에서도 표적 분자의 효율적인 침전을 가능하게 한다. 이온 강도는 적절한 희석 기법 또는 완충액 교환 기법을 사용해 개질 또는 감소될 수 있다.

특별한 경우에, 특히 단일클론 항체의 효소 처리 후에 Fc 영역으로부터 Fab 의 분리를 위해, 8 mS/cm 내지 22.5 mS/cm 의 전도도로 이온 강도의 조정은 선택적 침전을 가능하게 하는데 요구될 수 있다. 바람직하게는, Fc 영역으로부터 Fab 의 분리를 위해, 이온 강도는 9 mS/cm 내지 18 mS/cm, 가장 바람직하게는 10 내지 16 mS/cm 의 전도도로 조정된다.

pH 는 적절한 방법을 사용해 표적 분자의 등전점 (pI) 보다 낮은 pH 를 달성하도록 조정되고, 적용가능하다면 불순물 단백질 또는 불순물 단백질의 대부분의 등전점 초과의 pH 를 달성하도록 조정된다. 전형적으로 pH 가 4 내지 7, 바람직하게는 4 내지 5.5 로 조정되어야 하는 것으로 밝혀졌다. 특히, NS0, CHO-S 또는 SP2/0 세포 배양 유체와 같은 세포 배양 유체로부터 7 내지 9 의 등전점을 갖는 단일클론 항체의 침전시에, 4 내지 5.5 의 pH, 특히 5.0 내지 5.2 의 pH 가 매우 적합하다.

특별한 경우에, 특히 단일클론 항체의 효소 처리 후에 Fc 영역으로부터 Fab 의 분리를 위해, pH 의 4 내지 5.5 의 pH, 특히 5.0 내지 5.2 의 pH 로의 조정이 매우 적합하다.

본 발명의 방법에 사용되는 공중합체의 양은 샘플에 존재하는 표적 분자의 양에 따라 다르다. 전형적으로, 양호한 결과는 표적 분자 mg 당 0.2 내지 1.2 mg 공중합체를 사용하는 경우에 수득될 수 있다. 바람직하게는, 0.35 내지 0.9 mg 공중합체가 표적 분자 mg 당 첨가된다.

최적의 침전 달성을 위해, 공중합체를 샘플 용액에 첨가한 후에, 상기 혼합물을 바람직하게는 인큐베이션한다. 전형적인 인큐베이션 시간은 10 분 내지 2 시간이다. 바람직하게는, 상기 혼합물은 인큐베이션 동안, 예를 들어 쉐이커 상에서 또는 교반기로 교반된다.

후에, 표적 분자 및 공중합체를 포함하는 공침전물은 예를 들어 여과, 침강, 원심분리 또는 임의의 기타 방식에 의해 상청액으로부터 분리될 수 있다. 전형적으로, 표적 분자를 포함하는 공침전물은 이후에 표적 분자의 단리 또는 추가 정제를 위한 추가의 방법 단계에 속하게 된다. 그러나, 예를 들어 표적 분자가 샘플로부터 제거되어야 하는 공지된 물질 (예, 항체의 Fc 영역) 이지만, 샘플로부터 최종적으로 단리 및 정제되어야 하는 생성물이 본 발명의 방법을 수행한 후에 현재 상청액에 존재하는 또 다른 분자 (예, 항체의 Fab 영역) 인 경우 상청액을 추가의 방법 단계에 또한 소속시킬 수 있다.

그러나, 대부분의 경우, 공중합체를 첨가해 침전된 표적 분자는 추가로 정제되어야 하는 화합물이다. 상기 경우에, 표적 분자를 포함하는 공침전물은 1 회 또는 수 회, 예를 들어 산성 완충액으로 세정될 수 있다. 바람직하게는, 세정 완충액은 공중합체를 샘플에 첨가한 후에 수득한 혼합물과 동일한 pH 및 동일하거나 그 보다 낮은 이온 강도를 갖는다.

공침전물은 이후에 재용해될 수 있다. 이는 표적 분자의 등전점보다 1 pH 단위 초과로 낮은 pH 를 갖는 수성 완충액 중에서 실시될 수 있다. 전형적으로, 7 내지 9 의 pH 를 갖는 완충액, 예를 들어 Tris-완충액 pH 8.0 또는 K-Na-포스페이트 완충액 pH 7.4 (PBS) 가 공침전물의 재용해에 사용된다. 재용해는, 예를 들어 쉐이킹 또는 교반에 의해, 예를 들어 300 내지 600 rpm 에서 5 내지 20 분 동안 쉐이킹에 의해 지지될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 고정제된 표적 분자의 수득을 위해, 본 발명에 따른 방법의 추가 단계에서, 공중합체가 재용해된 공침전물을 포함하는 용액으로부터 제거될 수 있다. 이는 크로마토그래피 방법, 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 수 개의 방법에 의해 실시될 수 있다. 또한, 침전제를 첨가함으로써 공중합체의 재침전이 가능하다. 적합한 침전제는, 예를 들어 고분자전해질이 공유결합되는 비드(bead) 이다. 고분자전해질은 반복 단위가 전해질기를 갖는 중합체이다. 다양이온 및 다음이온은 고분자전해질이다. 적합한 비드의 예는, 예를 들어 유리 비드, 실리카 비드 또는 중합체 비드이다. 적합한 고분자전해질은, 예를 들어 양이온성 고분자전해질, 혼합 모드 고분자전해질, 소수성 고분자전해질 또는 친수성 고분자전해질 (H-결합 가능) 이다.

적합한 비드가, 예를 들어 US 5,922,531 에 개시되어 있다.

바람직한 구현예에서, 비드는 유리 또는 실리카 비드, 더 바람직하게는 유리 또는 운모 또는 실리카 플레이크이다. 침강 속도가 0.8 내지 1.2 cm/분인 유리 또는 실리카 플레이크가 재침전에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, 직경이 10-200 μM 범위이고 두께가 100 내지 1000 nm 인 실리카 또는 유리 플레이크는 상기 적합한 침강 속도를 나타내고, 공중합체의 재침전에 특히 적합하다. 바람직한 구현예에서, 유리 또는 실리카 비드 및 또한 기타 유형의 비드는 양이온성기 또는 양이온성 및 소수성 또는 친수성기로 관능기화된다. 바람직하게는, 관능기화는 양이온성 및 소수성 또는 친수성 관능기와 고분자전해질 또는 양이온성 고분자전해질과의 공유결합에 의해 실시된다.

특히 바람직한 것은 TMAE 또는 DMAE 를 포함하는 고분자전해질이다.

비드가 전형적으로 재현탁된 표적-분자-공중합체 용액에 첨가되어 최종 혼합물 중의 비드 또는 플레이크의 최종 농도가 0.0001 내지 0.5 mg/ml 에 도달된다.

비드는 전형적으로 용액의 pH 를 pH 7.0-8.5 로 조정한 후에 재현탁된 표적-분자-공중합체 용액에 첨가된다.

예를 들어 원심분리, 침강 또는 여과에 의해 부착된 공중합체를 갖는 비드를 제거한 후에, 고순도의 표적 분자를 포함하고 공중합체 오염물이 없거나 거의 없는 상청액을 수득한다. 전형적으로, 공중합체는 이들 실리카 플레이크를 사용해 샘플 내의 초기 공중합체 농도와 비교시 > 90% (중량/중량) 로 제거될 수 있다. 이들 실리카 플레이크의 농도를 조정하면서, 공중합체는 샘플 내의 초기 공중합체 농도와 비교시 전형적으로 > 95% (중량/중량) 에서 99% (중량/중량) 로 제거될 수 있다.

본 발명의 방법은 불순물을 줄이고 크로마토그래피, 여과 또는 원심분리와 같은 이후의 정제 단계의 클로깅(clogging) 을 막는다. 본 발명의 방법은 한정된 부피로 선택적 침전 및 이후의 재용해에 의해 표적 분자를 상향 농축시킬 수 있는데, 농도 인자를 100 까지 달성함으로써 이후의 정제 단계를 위한 가공 시간을 증가시키고, 크로마토그래피에서의 작업량 (크로마토그래피에서 정제되는 표적 분자 kg 당 시간) 을 감소시킨다.

선행기술에 개시된 침전을 위한 중합체의 사용이 종종 높은 정제 수율을 제공하지만, 이들 공보에 나타낸 바와 같이 전도도가 5 mS/cm 이하 만큼 낮은 이온 강도에서만 충분히 작용된다.

그러나, 상기 제한은 침전을 위한 중합체의 적용 이전에 세포 배양 유체의 희석이, 예를 들어 25000 리터의 초기 세포 배양 유체와 비교시 75000 리터의 희석된 세포 배양 유체 및 그 이상에 이르는 것을 요구한다.

이들 거대 부피는 템퍼링되고, 저장될 필요가 있고, 정제 후 높은 폐기 적재량을 갖는데, 이 모두는 고비용을 야기한다.

이들 제한 및 단점과 달리, 본 발명의 방법은 소비자가 특이적으로 최적화된 공중합체를 사용하여 생리학적 염 조건과 유사한 이온 강도에서도 표적 분자의 높은 수율 및 순도를 수득하게 해준다. 이로써, 과잉의 사전 희석 단계가 요구되지 않는다.

본 발명은 생물약제학 또는 재조합 단백질의 정제에서 지금까지 사용된 정제 단계를 부분 또는 완전히 대체하여 동일하거나 또는 더 양호한 수율, 정제 시간, 효율, 순도를 유도할 수 있다.

상기 및 하기에 인용되는 모든 출원, 특허 및 공보, 및 2012 년 12 월 20 일에 출원한 EP 대응 출원 EP 12008475.1 의 전체 개시내용이 여기서 참조로 포함되어 있다.

실시예

하기 실시예는 가능한 합성 단계를 제시하여 본 발명의 방법에 사용되는 공중합체를 수득한다.

실시예 1a:

4.92 g 의 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 술폰산 및 6.82 g 의 4-아크릴아미도 벤조산을 300 ml 물/DMF (1/1) 및 3.4 ml NaOH 용액 (32%) 의 혼합물 중에 용해시킨다. 용액을 질소를 사용해 탈기시킨다. 탈기된 물 중에 용해시킨 0.436 g 의 나트륨퍼옥소디술페이트를 용액에 첨가한다. 온도를 80 ℃ 로 상승시킨다. 반응 시간은 5 시간이다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 공기에 노출시킨다. 용매를 회전 증발기로 제거한다. 고체 중합체를 다시 수중에 용해시키고, 2-프로판올 중에서 침전시킨다. 중합체를 여과하고, 건조시킨다. 중량 평균 분자량은 대략 Mw = 100 000 g/mol 이며, 다분산도는 1.3 이다.

실시예 1b:

Sephadex® 컬럼 (가교된 덱스트란 겔) 을 사용해 중합체를 정제하는 것을 제외하고는, 실시예 1a 와 동일하다. 컬럼을 5 x 5 ml 물로 세정하고, 2.5 ml 의 반응 혼합물을 "주입" 하고, 컬럼을 3.5 ml 물로 세정한다. 용리액을 수합하고, 재평형화를 7 x 5 ml 물로 실시한다. 절차를 3 회 반복한다. 용매를 회전 증발기를 사용해 용리액으로부터 제거하고, 중합체를 건조시킨다.

실시예 1c:

투석 또는 접선 유동 여과를 통한 정제를 제외하고는, 실시예 1a 와 동일하다. 반응 후에, 상기 혼합물을 실온으로 냉각하고, 용매를 회전 증발기로 제거한다. 고체 중합체를 수중에 다시 용해시키고, 중합체를 예를 들어 12 000 - 14 000 Da 의 적절한 MWCO 를 사용하는 투석 또는 접선 유동 여과로 정제한다.

실시예 2a:

4.92 g 의 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 술폰산 및 6.82 g 의 4-아크릴아미도 벤조산을 300 ml 물/DMF (1/1) 및 3.4 ml NaOH 용액 (32%) 의 혼합물 중에 용해시킨다. 95 μL 1-부탄티올 (사슬 전이제로서) 을 첨가한다. 용액을 질소를 사용해 탈기시킨다. 탈기된 물 중에 용해시킨 0.436 g 의 나트륨퍼옥소디술페이트를 용액에 첨가한다. 온도를 80 ℃ 로 상승시킨다. 반응 시간은 5 시간이다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 공기에 노출시킨다. 용매를 회전 증발기로 제거한다. 고체 중합체를 수중에 다시 용해시키고, 2-프로판올 중에서 침전시킨다. 중합체를 여과하고, 건조시킨다. 중량 평균 분자량은 대략 Mw = 55 000 g/mol 이며, 다분산도는 1.16 이다.

실시예 2b:

380 μL 의 1-부탄티올을 첨가하는 것을 제외하고는, 실시예 2a 와 동일하다. 수득한 중합체의 중량 평균 분자량은 대략 Mw = 35 000 g/mol 이며, 다분산도는 1.6 이다.

실시예 3:

상이한 몰 단량체비를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1 과 동일하다:

실시예 4:

4-아크릴아미도 벤조산 대신에, 벤질아크릴아미드를 공단량체로서 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 3 과 동일하다.

하기 실시예는 본 발명의 적용을 나타낸다.

실시예 5:

HCP (호스트 세포 단백질) 양이 9000 ng/mg 항체인 (면역효소적-어세이 SP2/0 에 따름), 단일클론 항체 (mAb03) 역가가 2.0 mg/ml (단백질 A 친화도 크로마토그래피에 따름) 인 단일클론 항체 세포 배양 용액 (SP2/0 세포 배양 유체) 을 세포 배양 용액을 pH 5.0 으로 사전 조정한 후에 음이온성-소수성 공중합체로 처리한다. mol 로 전체 단량체 농도 (AMPS+ABZ) 의 비 1:0.03 으로 3.17% (w/w) 나트륨퍼옥소디술페이트 및 사슬 전이제 1-부탄티올을 사용해 61.7% (w/w) AMPS 및 38.3% (w/w) (ABZ) 로 공중합체를 합성한다.

공중합체의 특성화가 산출된다 (36% 4-(아크릴로일아미노)벤조산 (ABZ 도 1) (w/w); 64% 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 술폰산 (AMPS 도 1) (w/w); 감쇠 전반사 적외 분광법에 의해 측정; SEC 에서 차등 굴절률로 측정한 분자량 분포: Mw 28000 Da, Mn 13000 Da, 다분산율 2.1). 공중합체를 10 mg/ml 의 농도, pH 5.0 으로 조정하고, 소부피로 항체 세포 배양 용액에 첨가하여 최종 농도는 0.4 mg/ml 중합체 내지 1.2 mg/ml 중합체 범위이고 최종 항체 농도는 1.4 mg/ml 가 된다 (이온 강도: 20 ℃ 에서 측정시 12 mS/cm 의 전도도 또는 120 mM NaCl 등가).

1 시간 저속 교반 후에, 첨가된 공중합체를 포함하는 항체 세포 배양물을 15 분 동안 2500 rcf 에서 원심분리시킨다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 80 mM K-Na-포스페이트 완충액 pH 7.4 중에 12 분 동안 500 rpm 에서 쉐이킹함으로써 재용해시킨다. 실리카 플레이크에 부착된 4 차 암모니아 잔기 (트리메틸아미노에틸) 를 10% (v/v) 의 비로 재용해시킨 펠릿에 첨가한 후, 2500 rcf 에서 10 분 원심분리시킨다. 상청액을 제거하고, 초기 항체 역가와 비교시, 공중합체 제거율 98.8%, HCP 제거율 70%, 항체 회수율 80% 인 것을 수득한다. IR 스펙트럼 (부착된 도 2 참조) 은 침전 전후의 (이후에 재용해시킴) 항체의 2 차 구조의 유의한 변화가 없음을 나타낸다. 바이오레이어 간섭측정 (BLI) 은 본 발명에 따른 침전 및 재용해를 사용해 정제한 항체 (부착된 도 3 B 참조) 와 비침전 항체 (부착된 도 3 A 참조) 의 비교시 항체의 그 표적에 대한 결합 친화도의 차이가 없음을 나타낸다.

실시예 6:

2 mg/ml 단일클론 항체 (각각 mAb03, mAb04, mAb05, mAb07, 추가 정보에 대해서는 표 2) 및 2 mg/ml 소 혈청 알부민을 포함하는 용액을 세포 배양 용액을 pH 5.0 으로의 사전 조정 후에 각종 음이온성-소수성 공중합체로 처리한다. 공중합체 (10-77.5% ABZ (w/w); 22.5-90% AMPS (w/w); 감쇠 전반사 분광법에 의해 측정; SEC 에서 굴절률로 측정한 분자량 분포: Mw 5000-300000 Da, Mn 5000-131000 Da, 다분산율 1-2.3; SEC 에서 UV 측정으로 측정한 분자량 분포: Mw 5000-300000 Da, Mn 5000-131000 Da, 다분산율 1-2.5) 를 용액에 첨가하여 (각 농도, 각 pH 및 이온 강도에서의 각 공중합체를 별개의 용액 컨테이너에 첨가함) 최종 항체 농도 1 mg/ml, 최종 BSA 농도 1 mg/ml, pH 5.0, 이온 강도 20 ℃ 에서 측정시 대략 15 mS/cm 의 전도도, 공중합체 농도 0.1-1.5 mg/ml 인 공중합체-단백질 용액이 되게 한다. 300 rpm 에서 1 시간 쉐이킹 후에, 공중합체-단백질 용액을 15 분 동안 2500 rcf 에서 원심분리시킨다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 80 mM K-Na-포스페이트 완충액 pH 7.4 중에 12 분 동안 500 rpm 에서 쉐이킹함으로써 재용해시킨다. 10% (v/v) TMAE 플레이크를 재용해시킨 펠릿에 첨가한 후, 2500 rcf 에서 10 분 원심분리시킨다. 상청액을 제거하고, 초기 항체 역가와 비교시 공중합체 제거율 95%, BSA 제거율 20-80% 및 항체 회수율 85% 인 것을 수득한다. 가장 가망성이 있는 공중합체 (10-70% ABZ, 30-90% AMPS, 중량 평균 사슬 길이 < 80000 Da) 는 85% mAb 회수율 및 80% BSA 제거율로서 산출된다.

실시예 7:

0.7 mg/ml 단일클론 항체 (mAb05) 및 공지된 양의 HCP 단백질/mg 항체를 포함하는 CHO-S 세포주 중의 단일클론 항체 세포 배양 용액을 pH 5.0 및 20 ℃ 에서 측정시의 전도도 11 mS/cm 로 조정한다. 용액을 항체에 대한 최종 공중합체 중량비 0.57:1 내지 1.14:1 로 음이온성-소수성 공중합체 (65% ABZ, 35% AMPS; Mw 80000 Da, Mn 55000 Da, SEC 에서 차등 굴절률로 측정) 로 처리한다. 1 시간 동안 300 rpm 에서 쉐이킹 및 2500 rcf 에서 15 분 동안 원심분리 후에, 상청액을 이동 및 분석하고, 재용해시킨 펠릿 (80 mM K-Na-포스페이트 완충액 pH 7.4, 12 분 동안 500 rpm 에서 쉐이킹) 도 이동 및 분석한다. 둘 모두의 측정은 호스트 세포 단백질 제거율이 50% 이고 항체 침전율이 80-90% 인 것을 나타낸다. 중적외선 스펙트럼은 문헌 써치와 일치하는, 침전 전후의 항체의 구조 변화가 없음을 나타낸다. 바이오레이어 간섭측정은 침전 전후에 항체의 결합 친화도의 변화가 없음을 나타낸다.

실시예 8:

농도 2 mg/ml 의 단일클론 항체 (mAb03) 의 FAb 부분 (단편 항원-결합) 을 포함하는 용액을 전도도 2 mS/cm (20 ℃ 에서 측정) 인 이온 강도로서 pH 5.0 으로 조정한 후, 100% (v/v) 의 음이온성-소수성 공중합체 (50% BzAAm, 50% AMPS; Mw 63000, Mn 46000, SEC 에서 굴정률 측정으로 측정) 를 첨가해 최종 농도가 FAb-공중합체 용액 중에서 0.1-0.8 mg/ml 가 된다 (전도도 1 mS/cm 인 이온 강도, pH 5.0). 용액을 쉐이커에서 1 시간 동안 300 rpm 에서 인큐베이션하고, 15 분 동안 2500 rcf 에서 원심분리시킨다. 80% FAb 를 용액으로부터 침전시킨다.

실시예 9:

2 mg/ml 단일클론 항체 (mAb07) 및 공지된 양의 HCP 단백질/mg 항체를 포함하는 쥣과 골수종 세포주 (NS0) 중의 단일클론 항체 세포 배양 용액을 전도도 12 mS/cm 로서 pH 5.0 으로 조정하고, 음이온성-소수성 공중합체 (65% ABZ, 35% AMPS; Mw 80000 Da, Mn 55000 Da, SEC 에서 굴절률로 측정) 로 항체에 대한 최종 공중합체의 각종 중량비로 처리한다. 1 시간 동안 300 rpm 에서 쉐이킹 및 2500 rcf 에서 15 분 동안 원심분리 후에, 상청액을 이동 및 분석하고, 재용해시킨 펠릿 (80 mM K-Na-포스페이트 완충액 pH 7.4, 12 분 동안 500 rpm 에서 쉐이킹) 도 이동 및 분석한다. 둘 모두의 측정은 호스트 세포 단백질 제거율 50-70% 및 항체 침전율 80-95% 인 것을 나타낸다.

실시예 10:

침전물의 초기 부피가 20 mL 이고 표적-분자-공중합체 펠릿을 500 uL 로 재용해시켜 표적-분자 농도를 인자 40 까지 증가시키는 것을 제외하고는, 실시예 9 와 동일하다.

실시예 11:

파파인 소화 후에 단일클론 항체의 Fab 및 Fc 단편을 포함하는 용액을 pH 5.0 및 전도도 14 mS/cm 로 조정하였다. 용액을 음이온성-소수성 공중합체 (64% ABZ, 36% AMPS; Mw 160,000 Da, Mn 55000 Da, SEC 에서 굴절률로 측정) 로 전체 단백질에 대한 최종 공중합체의 각종 중량비로 처리하였다. 1 시간 동안 300 rpm 에서 쉐이킹 및 2500 rcf 에서 15 분 동안 원심분리 후에, 상청액을 이동및 분석하고, 재용해시킨 펠릿 (80 mM K-Na-포스페이트 완충액 pH 7.4, 12 분 동안 500 rpm 에서 쉐이킹) 도 이동 및 분석하였다. 펠릿은 Fc 단편만으로 이루져있지만, 상청액은 10% 비침전 Fc 및 100% 의 초기에 활용된 Fab 단편으로 구성되어 있었다.

실시예 12:

실리카 또는 디올 유리 플레이크-TMAE 합성:

직경 10-100 μm 인 글리시딜옥시프로필트리에톡시실란으로 코팅된 디올 유리 플레이크 또는 실리카 플레이크를 사용하고, 단량체 N,N-디메틸에틸렌디아민 (0.225 M), 아크릴산 클로라이드 (0.216 M) 및 디메틸술페이트 (0.228 M) 를 첨가하고, 개시제로서 4.5 mM 암모늄세르-IV-니트레이트를 사용해 실리카 또는 디올 유리 플레이크를 합성한다.

기타 문제

공중합체 조성물은 NMR 분광법 뿐만 아니라 적외선 분광법을 포함하는 감쇠 전반사 분광법 (ATR) 을 사용해 특성화된다. 그 결과는 NMR 및 ATR 에서 비슷하고 (표 3), 공중합체 특성화에 있어서 ATR 의 가능성을 나타낸다.

표 4 는 실시예 1-4 에 기재된 절차에 따라 제조된 본 발명의 방법에 따라 사용되는 공중합체의 예를 나타낸다.

표 5 는 침전 실험에 사용되는 단백질 발현 시스템의 이온 강도를 나타낸다.

Claims (15)

1. 하기를 포함하는 샘플로부터의 표적 분자의 단리 방법으로서:
   a) 샘플을 제공하고,
   b) 단량체 단위들로부터 합성된 하나 이상의 공중합체를 샘플과 혼합함으로써, 표적 분자-공중합체 침전물을 형성시키고,
   여기서, 공중합체의 합성에 사용되는 각 단량체 단위는 하나 이상의 소수성 또는 음이온성 기를 가지고,
   하나 이상의 소수성 기를 갖는 단량체 단위는 벤질아크릴아미드 (BzAAm), 벤질메타크릴레이트 (BzMA), N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAM), 메틸메타크릴레이트 (MMA), 부틸아크릴레이트, tert-부틸아크릴레이트 또는 4-(아크릴로일아미도)벤조산 (4-ABZ) 으로부터 선택되고, 하나 이상의 음이온성 기를 갖는 단량체 단위는 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 술폰산 (AMPS), 비닐 술폰산 (VS), 스티렌 술폰산 또는 (메트)아크릴산으로부터 선택되고,
   c) 단계 b) 의 혼합물로부터 침전물을 분리시킴,
   단계 a) 에서 샘플의 pH 는 표적 분자의 등전점 미만의 pH 로 조정되는 단리 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 공중합체의 소수성 및 음이온성기의 35 내지 65% 가 음이온성기인 것을 특징으로 하는 단리 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 음이온성 기를 갖는 단량체 단위가 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 술폰산 (AMPS) 이고, 하나 이상의 소수성 기를 갖는 단량체 단위가 벤질아크릴아미드 (BzAAm) 또는 4-(아크릴로일아미도)벤조산 (4-ABZ) 으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단리 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 공중합체의 중량 평균 분자량이 10,000 내지 120,000 g/mol 이고/이거나 다분산도가 1.05-2.5 인 것을 특징으로 하는 단리 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 단리 방법.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 에서 샘플의 pH 를 4 내지 5.5 의 pH 로 조정하는 것을 특징으로 하는 단리 방법.
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 이온 강도를 20 ℃ 에서 측정된, 17 mS/cm 이하의 전도도와 동일하게 조정하는 것을 특징으로 하는 단리 방법.
8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 단편 항원 결합 영역인 것을 특징으로 하는 단리 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 샘플의 이온 강도를 20 ℃ 에서 측정된, 9 내지 18 mS/cm 의 전도도와 동일하게 조정하는 것을 특징으로 하는 단리 방법.
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 단계 d) 에서 단계 c) 로부터의 침전물을 재용해시키는 것을 특징으로 하는 단리 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 단계 d) 의 재용해 혼합물을 고분자전해질을 보유한 비드로 처리하는 것을 특징으로 하는 단리 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 고분자전해질을 보유한 비드가 유리 또는 실리카 플레이크인 것을 특징으로 하는 단리 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 고분자전해질이 DMAE 및/또는 TMAE 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리 방법.
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