MXPA05004276A - Ns3 de proteasa de hcv resistente a inhibidor. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una NS3 proteasa de HCV resistente a inhibidor la cual es util para cribado en busqueda de compuestos que tengan valor terapeutico contra cepas de HCV resistentes a medicamentos. En particular, la NS3 proteasa de HCV resistente inhibidor comprende una secuencia de aminoacidos la cual esta mutada en la cavidad de un sustrato de la misma lo que vuelve a la proteasa resistente al inhibidor. En un aspecto especifico de la presente invencion, se mutan por lo menos uno de los aminoacidos en la posicion 155, 156, y 168 de la NS3 proteasa de HCV para proporcionar una proteasa resistente a inhibidor.

Description

NS3 DE PROTEASA DE HCV RESISTENTE A INHIBIDOR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una NS3 proteasa de HCV novedosa, y en particular con una NS3 proteasa de HCV resistente a inhibidor que comprende una secuencia de aminoácidos mutada . También se relaciona con métodos para utilizar dicha proteasa resistente inhibidor para identificar inhibidores que tengan actividad contra las cepas de HSV las cuales hayan desarrollado resistencia a tratamientos conocidos .

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA El virus de hepatitis C (HCV) es el mayor agente etiológico de la hepatitis no A no B posterior a transfusión y adquirida por la comunidad en todo el mundo. Se calcula que más de 200 millones de personas en todo el mundo están infectadas con el virus. Un alto porcentaje de portadores se vuelven infectados crónicamente y muchos desarrollan enfermedad hepática crónica o lo que se denomina hepatitis C crónica. A su vez, este grupo se encuentra en alto riesgo de adquirir una enfermedad hepática grave tal como cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular y hepatopatía terminal que desemboca en muerte.

Aún no se ha dilucidado completamente el mecanismo por medio del cual HCV establece persistencia viral y provoca una tasa elevada de hepatopatía crónica. No se sabe de que manera interactúa HCV y evade el sistema inmunológico del anfitrión. Además, aún están por establecerse los papeles de las respuestas inmunológicas celular y humoral las cuales protegen contra infección y enfermedad provocada por HCV. El HVC es un ARN virus de cadena positiva, envuelta de la familia Flaviviridae . El genoma de ARN de HCV de cadena única es de polaridad positiva y comprende un marco de lectura abierto (ORF) de aproximadamente 9600 nucleótidos de longitud, el cual codifica para una poliproteína lineal de aproximadamente 3010 aminoácidos. En células infectadas, esta poliproteína se separa en sitios múltiples por proteasas celulares y virales para producir proteínas estructurales y no estructurales (NS) . Las proteínas estructurales (C, El, E2 y E2-p7) comprenden polipéptidos que constituyen la partícula del virus. Las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) codifican para enzimas de factores accesorios que catalizan y regulan la replicación del genoma de ARN de HCV. El procesamiento de las proteínas estructurales es catalizado por proteasas de la célula anfitriona, La generación de proteínas no estructurales maduras es catalizada por dos proteasas codificadas viralmente . La primera es la NS2/3 proteasa, dependiente de zinc, la cual autocataliza la liberación de la proteína NS3 a partir de la poliproteína . La proteína NS3 liberada contiene un dominio serina proteasa N terminal y cataliza las separaciones remanentes de la poliproteína. La proteína NS4A liberada tiene por lo menos dos funciones. La primera función es formar un complejo estable con la proteína NS3 y ayudar en la ubicación en la membrana del complejo NS3/NS4A. La segunda función de la proteína NS4A es actuar como un cofactor para la actividad de la NS3 proteasa. A su vez, este complejo asociado a membrana cataliza la separación de los sitios restantes en la poliproteína y de esta manera lleva a cabo la liberación de NS4B, NS5A y NS5B. El segmento C terminal de la proteína NS3 también alberga actividad de nucleósido trifosfatasa y de AKN helicasa. Se desconoce la función de la proteína NS4B. NS5A es una proteína altamente fosforilada que parece ser responsable de la resistencia a interferón de los diversos genotipos de HCV. NS5B es un ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) que está involucrada en la replicación de HCV. El marco de lectura abierto del genoma de ARN de HCV está flanqueado en su extremo 5 ' por una región no traducida (NTR) de aproximadamente 340 nucleótidos que funciona como el sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) y en su extremo 3' por una NTR de aproximadamente 230 nucleótidos. Ambas NTR 5' y 3' son importantes para la replicación del genoma de ARN. La variación en la secuencia genómica no está distribuida uniformemente sobre el genoma y la parte 5' TR y las partes de 3 'NTR son las porciones más altamente conservadas. Se han analizado las secuencias parcial y completa clonadas y caracterizadas del genoma de HCV con respecto a los objetivos apropiados para prospectos de tratamientos antivirales. Las siguientes cuatro actividades de enzimas virales proporcionan objetivos posibles: (1) la proteasa NS2/3; (2) el complejo de proteasa NS3/4A, (3) la helicasa NS3 y (4) la ARN polimerasa dependiente de ARN NS5B (NS5B RdRp) . La proteasa NS3 también ha sido cristalizada para mostrar una estructura reminiscente de otras serinas proteasas (Love et al., 1996; Kim et al. 1996) . La actividad de la NS3 proteasa es un objetivo atractivo para el descubrimiento de medicamentos. Los estudios enzimáticos han demostrado que los péptidos basados en el producto N terminal del sitio de separación NS5A/5B son inhibidores competitivos de la enzima. Estos péptidos han servido como un punto de inicio útil en los esfuerzos de química médica para diseñar de manera razonada inhibidores de NS3 proteasa como compuestos contra HCV clínicamente eficaces. La hepatitis C crónica ha surgido como una indicación clínica importante, para la cual aún no se ha desarrollado un tratamiento eficaz debido a las bajas tasas de respuesta a los tratamientos existentes actualmente. Por ejemplo, el tratamiento estándar recién aprobado, interferón pegilado combinado con ribavirina, muestra una tasa de respuesta sostenida de 40 a 50%. No obstante, la mayor parte de los pacientes aún no generan una respuesta antiviral sostenida, particularmente contra los genotipos de HCV resistentes a interferón la y Ib. Los documentos WO 00/09543, WO 00/09558 y WO 00/59929 (los tres incorporados a la presente como referencia) describen ciertos tipos de inhibidores de la NS3 proteasa de HCV que son altamente activos y selectivos. Estos compuestos tienen potencial para volverse la siguiente generación de tratamiento contra HCV. Se puede esperar que estos inhibidores, así como muchos otros tratamientos antivirales finalmente de lugar a virus que sean por lo menos parcialmente resistentes a dichos inhibidores. El conocimiento de las mutaciones las cuales vuelven a HCV resistente a inhibidores proporciona la base para identificar inhibidores que sean eficaces contra dichas cepas resistentes. Trozzi et al., 2003 ha descrito un replicón mutante resistente que tiene tres sustituciones aminoácidos individuales (D168A/Y/V) que vuelven a la proteasa resistente a un inhibidor de la NS3 proteasa . En consecuencia, en un esfuerzo por desarrollar un tratamiento con eficacia a largo plazo que suprima o que supere la resistencia contra HCV, describimos un medio para identificar compuestos contra HCV que muestren actividad contra cepas de HCV resistentes a inhibidor.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En una primera modalidad, la presente invención proporciona un método para seleccionar una NS3 proteasa de HCV resistente a inhibidor, mutante, que comprende las etapas de: • preparar un constructo (plásmido recombinante o combinación) de ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable y NS3 proteasa de HCV nativa, y transfectar células anfitrionas con el constructo; e • incubar las células anfitrionas transíectadas en presencia de un inhibidor de NS3 de HCV bajo condiciones adecuadas para selección de las células transfectadas , en donde las colonias que resultan de la incubación bajo estas condiciones se vuelven NS3 proteasas de HCV resistente a inhibidor mutante. De acuerdo con otro aspecto de esta primera modalidad, la presente invención proporciona un método para aislar una NS3 proteasa de HCV resistente a inhibidor mutante, en donde el método descrito en lo anterior comprende además las etapas de; • lisar las células para liberar el ARN y utilizar dicho ARN para producir la proteasa mutante resistente; o lisar las células para liberar la NS3 proteasa resistente a inhibidor; y aislar la NS3 proteasa resistente a inhibidor. En este sentido, la presente invención proporciona, en un segunda modalidad, NS3 proteasas de HCV resistentes a inhibidor novedosas. En este sentido, la presente invención proporciona, en un segunda modalidad, NS3 proteasas de HCV resistentes a inhibidor aisladas novedosas. En una tercera modalidad, la presente invención proporciona ácidos nucleicos recombinantes que codifican para NS3 proteasas de HCV resistentes a inhibidor. Además, en una tercera modalidad, la presente invención proporciona ácidos nucleicos recombinantes aislados que codifican para NS3 proteasas de HCV resistentes a inhibidor. De acuerdo con otro aspecto de esta tercera modalidad, se proporciona una sonda nucleotídica capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas con una secuencia nucleotídica mutada, como se define en la presente, para propósitos de diagnóstico. En una cuarta modalidad se proporcionan vectores que incorporan ácidos nucleicos que codifican para NS3 proteasas de HCV resistentes a inhibidor. Las células anfitrionas transíectadas con estos vectores y las líneas de células derivadas de las mismas se proporcionan en una quinta modalidad de la invención. En una sexta modalidad la invención comprende un método para evaluar la actividad de NS3 proteasa de HCV de las NS3 proteasas resistentes a inhibidor, de acuerdo con la invención, que comprende las etapas de: · incubar células anfitrionas transíectadas con ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa de HCV resistente a inhibidor bajo condiciones las cuales causan que la proteasa se exprese; y • medir la replicación del ácido nucleico en las células anfitrionas, en donde el nivel de replicación es proporcional a la actividad de la proteasa expresada. En una séptima modalidad, la invención comprende un método para identificar inhibidores potenciales de segunda generación de la actividad de NS3 proteasa de HCV que comprende: • incubar células anfitrionas transfectadas con ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa resistente a inhibidor bajo condiciones las cuales provocan expresión de la misma, en ausencia de un compuesto candidato inhibidor de segunda generación; • incubar células anfitrionas transfectadas con ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa resistente a inhibidor bajo condiciones las cuales provocan la expresión del mismo, en presencia de un compuesto candidato inhibidor de segunda generación; y • medir la replicación de ácido nucleico en presencia y en ausencia del compuesto candidato inhibidor de la segunda generación, en donde el nivel de replicación del ácido nucleico es proporcional a la actividad de la proteasa expresada, y en donde una disminución en la actividad de la proteasa en presencia de un compuesto candidato inhibidor de la segunda generación indica que el compuesto inhibe a la proteasa. En una octava modalidad la invención comprende un método para identificar inhibidores potenciales de segunda generación de la actividad de NS3 proteasa de HCV que comprende : • incubar un mutante de NS3 proteasa resistente a inhibidor como se define en lo anterior en presencia o ausencia de un compuesto candidato inhibidor de segunda generación; y • medir la actividad de proteasa de la NS3 proteasa resistente inhibidor en presencia y ausencia del compuesto candidato inhibidor de segunda generación; en donde una disminución en la actividad en presencia de un compuesto candidato inhibidor de segunda generación indica que el compuesto inhibe a la NS3 proteasa resistente a inhibidor. Otros objetivos, ventajas y características de la presente invención se volverán evidentes ante la lectura de la siguiente descripción no limitante de las modalidades preferidas con referencia a los dibujos anexos, en los cuales: DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra el método mediante el cual se ha establecido la replicación del ARN para HCV en cultivos de células Huh-7; la figura 2 ilustra el crecimiento de células Huh-7 resistentes a neomicina en presencia de inhibidor de NS3 proteasa a concentraciones que varían de 2 nM a 2000 nM; y la figura 3 ilustra el agrupamiento de varias sustituciones de aminoácidos que se seleccionan con inhibidores de NS3 proteasa a inhibidores que están proximales al sitio activo (gris claro) del dominio del NS3 proteasa. Los residuos en blanco indican aquellos identificados en estudios de resistencia y que se localizan cerca del inhibidor unido en la estructura cristalina (estructura reportada en ?.?. Tsantrizos, et al, Angew Chemie v42, 1356) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se defina de otra manera, los términos y la nomenclatura científica y tecnológica que se utiliza en la presente tiene el mismo significado al comprendido comúnmente por una persona habitualmente experta a la que pertenezca la invención. De manera general, los procedimientos para el cultivo celular, la infección, los métodos de biología molecular y similares son métodos comunes utilizados en la técnica. Tales técnicas estándar se pueden encontrar en manuales de referencia tales como, por ejemplo, Sambrook eü al., (2000) y Ausubel et al. (1994) . En la presente las secuencias nucleotídicas están presentadas por una cadena única, en la dirección 5' a 31 , de izquierda a derecha, utilizando los símbolos nucleotídicos de una letra como se utilizan habitualmente en la técnica y de acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (1972). La presente descripción se relaciona con diversos términos de tecnología de ADN recombinante (ADNr) utilizados habitualmente . No obstante, se proporcionan por claridad y consistencia definiciones de los ejemplos seleccionados de tales términos de ADNr. El término "ADN recombinante", "molécula recombinante de ácido nucleico" o "plásmido recombinante" como se conoce en la técnica, se refiere a una molécula de ADN que resulta de la unión de segmentos de ADN. Esto con frecuencia se denomina como ingeniería genética. El término "ácido nucleico" como se utiliza con respecto a los segmentos, moléculas o secuencias se refiere a una unidad constituida de nucleótidos y, por lo tanto, abarca moléculas tanto de ADN como de AN. Estos segmentos, moléculas o secuencias se pueden aislar de fuentes naturales utilizando técnicas establecidas en el arte, o se pueden derivar sintéticamente también, utilizando técnicas bien establecidas. Cuando se lea con respecto al código genético, estas secuencias pueden codificar para un tramo lineal o una secuencia de aminoácidos la cual define un polipéptido, una proteína o un fragmento de proteína. El término "ADN" como se utiliza con respecto a los segmentos, moléculas o secuencias, se utiliza en la presente para referirse a una cadena de nucleótidos, dada una con el azúcar desoxirribosa y una de las cuatro bases adenina (A) , guanina (G) , timina (T) o citosina (C) . El término "ARN" se refiere a una cadena de nucleótidos, cada una con un azúcar ribosa y una de las cuatro bases adenina (A) , guanina (G) , uracilo (U) o citosina (C) . Como lo apreciará un experto en la técnica, las referencias a ADN las que siguen también son aplicables generalmente a ARN. El término "derivado" indica una modificación la cual comprende la adición de una porción química que imparte sobre la proteasa mutante NS3, o el ADN que la codifica, una o más propiedades deseables. Tales propiedades químicas, por ejemplo, pueden impartir estabilidad mejorada (por ejemplo vida media biológica) . Estas porciones también se pueden utilizar con el propósito de marcado. Las porciones capaces de proporcionar estas y otras propiedades deseables se pueden encontrar en Remington' s The Science and Practice of Pharmacy (1995) . Las metodologías para acoplamiento de tales porciones a una molécula son bien conocidos en el arte . El término "fragmentos" se refiere a un segmento de un ADN que codifica para NS3 proteasa mutante resistente a inhibidor, ARN o secuencia de aminoácidos identificada, o con un segmento de cualquier variante o derivado de la misma que retenga sustancialmente la capacidad de codificar para una NS3 proteasa resistente a inhibidor. Tales fragmentos pueden incluir, pero no se limitan a secuencias nucleotídicas con cortes en las partes 5 ' ó 31 o secuencias de aminoácidos con cortes en una parte terminal . El término "vector de expresión" define un vector similar a los descritos en lo anterior el cual incorpora adicionalmente los elementos necesarios para permitir la expresión de una secuencia insertada después de transformación o transfección en un anfitrión. El gen clonado (la secuencia insertada) habitualmente se coloca bajo el control de secuencias de elementos de control de expresión tales como secuencias promotoras. Tales secuencias de control de expresión variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar la secuencia insertada en un anfitrión procariótico o eucariótico o en ambos (vectores lanzadera) y adicionalmente puede contener elementos de transcripción tales como elementos mejoradores, secuencias de terminación, elementos de especificidad de tejido o sitios de inicio y de terminación traduccionales . ADN/AR se refiere en la presente a que es incorporado "de manera expresable" dentro de dicho vector y se incorpora "de manera expresable" en una célula, una vez que se ha llevado a cabo la expresión exitosa desde una célula. Mediante "sistema de expresión eucariótico" se quiere significar la combinación de un vector de expresión apropiado y una línea de células eucarioticas que se puede utilizar para expresar un gen de interés. En todos los casos, el vector contendrá elementos de control apropiados (promotores) para expresar el gen en el tipo de célula de interés. Los tipos de células eucarioticas que se utilizan habitualmente incluyen células de levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris) , transfectadas con ún vector plasmídico; y células de mamífero transfectadas con vectores de ADN para expresión transitoria o constitutiva. Una línea celular preferida útil para el propósito de esta invención se deriva de tejido hepático. Como se utiliza en la presente la designación "derivado funcional" indica, en el contexto de un derivado funcional de una secuencia ya sea una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos, una molécula que retiene una actividad biológica (ya sea de función o estructural) que es sustancialmente similar a la de la secuencia original. En el presente caso, el derivado funcional significa que la secuencia resultante de aminoácidos retiene por lo menos una porción de la actividad biológica de la NS3 proteasa suficiente para permitir que la NS3 proteasa separe por lo menos una porción, preferiblemente la totalidad de sus sustratos naturales, es decir, los sitios de separación NS3/4A, 4A/4B, 4B./5A y 5A/5B. In vivo, la actividad de NS3 proteasa se retiene cuando el ARN de HCV o el virus son capaces de replicarse. Este derivado funcional o equivalente puede ser un derivado natural o se puede preparar sintéticamente. Tales derivados incluyen secuencias de aminoácidos que tienen sustituciones, supresiones o adiciones de uno o más aminoácidos con la condición de que se conserve la actividad biológica de la proteína. Lo mismo se aplica a derivados de secuencias de ácido nucleico los cuales pueden tener sustituciones, supresiones o adiciones de uno o más nucleótidos con la condición de que se mantenga de manera general la actividad biológica de la secuencia. Cuando se relaciona con una secuencia proteínica, los aminoácidos de sustitución tienen propiedades quimicofísicas las cuales habitualmente , pero no de manera necesaria son similares a las del aminoácido sustituido. Estas propiedades quimicofísicas similares incluyen similitudes en carga, volumen, hidrofobicidad, hidrofilicidad y similares. Algunas de las sustituciones de aminoácidos conservadoras conocidas más comúnmente incluyen, pero no se limitan a-. Leu o Val o lie; Gly o Ala; Asp o Glu; Aso o Asn o His; Glu o Gln; Lys o Arg; Phe o Trp o Tyr Val o Ala; Cys o Ser; Thr o Ser y Met o Leu. La expresión "hibridizar bajo condiciones rigurosas", como se utiliza en la presente significan condiciones que distinguen por lo menos uno o más cambios nucleotídicos en la secuencia objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "resistente a inhibidor" quiere indicar que se refiere a un mutante de NS3 proteasa de HCV que mantiene sustancialmente la actividad de proteasa en presencia de un compuesto conocido generalmente que inhibe la actividad de NS3 proteasa de HVC nativa. Por claridad, "un inhibidor" es un compuesto que inhibe la separación de uno o más sitios de separación de NS3 proteasa que se selecciona de: NS3/4A, NS4A/4B, NS4B/5A y NS5A/5B. El término "aislado", como se utiliza en la presente significa un estado aislado de la célula, es decir, cualquier extracto libre de células. Por claridad, una "NS3 proteasa de HCV mutante" se refiere a una NS3 proteasa de HCV que incluye una o más mutaciones de aminoácidos, tales como modificaciones, sustituciones, supresiones e inserciones de aminoácidos que no resultan en la eliminación de la actividad de proteasa. Como se comprenderá por una persona experta en la técnica, la actividad de una NS3 proteasa de HCV mutante puede variar en cierto grado un aspecto a la NS3 proteasa de HCV nativa. Se comprenderá por aquellos expertos en la técnica que la presente invención significa que abarca a la NS3 proteasa mutante resistente a inhibidor y por lo tanto no se limita a las secuencias específicas de aminoácidos que se ejemplifican en la presente. La invención también abarca derivados o variantes de las presentes NS3 proteasas mutantes, o fragmentos de las mismas los cuales presentan resistencia a inhibidores de NS3 proteasa de HCV. Como se ejemplifica en este documento posteriormente, las secuencias nucleotídicas y polipéptidos utilizados en la presente invención se pueden modificar, por ejemplo mediante mutagénesis in vitro, para analizar las relaciones de función catalítica y estructurada en la misma y permitir un mejor diseño e identificación de las proteínas resultantes . El término "constructo de ácido nucleico" se refiere a una cadena de ácido nucleico constituida de secuencias de ácido nucleico las cuales normalmente no coexisten. Un constructo de ácido nucleico generalmente se prepara para un propósito específico y por lo tanto incorpora todos los componentes necesarios para obtener dicho propósito. Por ejemplo se puede preparar un constructo de ácido nucleico que codifica para una proteína específica el cual incluye a los componentes necesarios para la expresión de dicha proteína bajo ciertas condiciones. El ADN vector que incorpora ADN exógeno, como se discute posteriormente, es un ejemplo de un constructo de ácido nucleico. Una célula anfitriona o célula indicadora ha sido "transfectada" por ADN o A N exógeno o heterólogo (por ejemplo un constructo de ADN) cuando dicho ARN o ADN ha sido introducido en la célula. El ARN o ADN transfectante puede o no estar integrado (unido covalentemente) en el ADN cromosómico constituyendo el genoma de la célula. En procariotas, el ADN transfectante/transformante se puede mantener en un elemento episómico tal como un plásmido. Por otra parte, en eucariotas, la célula transfectada de manera estable es aquella la cual el ADN transfectante se integra con el ADN genómico en cromosomas y es heredado por las células hijas o descendientes a través de replicación cromosómica. Además, en eucariotas, una célula transfectada de manera estable puede ser aquella en la cual el ARN transfectante se mantiene como un elemento episómico tal como un replicón. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula para establecer líneas celulares o clones comprendidos de una población de células hijas que contienen el ADN transfectante . Los métodos de transfección son bien conocidos en la técnica como se describen en Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1994. El término "replicón" como se utiliza en la presente significa una molécula de ARN que codifica para una o más moléculas de proteína y que se replica a través de una cadena intermedia de ARN complementaria. Con el fin de evaluar fácilmente la expresión de un gen de interés, una célula se puede transfectar con un gen que codifica para una proteína marcadora detectable o "indicadora" junto con el gen de interés de manera que la expresión de la proteína indicadora será indicativa de la expresión del gen de interés. El término "gen indicador" se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para dicha "proteína indicadora". Los ejemplos de genes indicadores utilizados habitualmente incluyen fosfatasa alcalina secretada (SEAP) , neomicina, luciferasa, cloramfenicol aminotransferasa (CAT) , P-galactosidasa y proteína fluorescente verde (GFP) . El término "marcador seleccionable" como se utiliza en la presente significa un gen que, cuando se expresa, se vuelve resistente a la célula a un agente de selección tal como un antibiótico (también denominado como presión selectiva) . El término "presión selectiva" o "agente de selección", como se utiliza en la presente, significa de manera intercambiable una molécula o compuesto que, cuando - - se presenta a las células que no expresan el marcador seleccionable, les producirá muerte celular. Por ejemplo, tales agentes de selección pueden incluir antibióticos tales como: G418, higromicina, zeomicina o puromicina. La designación "variante" indica, en el contexto de esta invención, una NS3 proteasa que presenta resistencia a inhibidor como se establece en lo anterior. Una variante puede ser de la misma especie o de una especie diferente y puede ser una variante natural o una variante derivada sintéticamente. Una NS3 proteasa variante de acuerdo con la presente invención puede incorporar una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos con la condición de que se conserve la resistencia a inhibidor. Las variaciones en la secuencia nucleotídica que codifican para las presentes NS3 proteasas mutantes también están abarcadas, y estas también incluyen sustituciones, supresiones o adiciones de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia con la condición de que se conserve la resistencia a inhibidor de la proteasa codificada por la secuencia nucleotídica. Las variantes, los derivados y los fragmentos de moléculas de acuerdo con la presente invención, que incluyen tanto moléculas de proteína como de ácido nucleico se pueden obtener utilizando métodos bien conocidos en el arte que incluyen técnicas de aislamiento/purificación, síntesis química y tecnología de ADN recombinante. El término "vector" se refiere a un compuesto de ácido nucleico utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en células anfitrionas. Un vector comprende una secuencia nucleotídica la cual puede codificar para una o más moléculas proteínicas. Los plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos en el estado natural o los cuales han experimentado ingeniería recombinante son ejemplos de vectores utilizados habitualmente dentro de los cuales se puede insertar una secuencia genética exógena o un elemento (ADN o ARN) de manera que lleve a cabo la replicación de la secuencia o elemento exógeno.

Modalidades Preferidas Método de selección y aislamiento de NS3 proteasa mutante resistente a inhibidor En una primera modalidad de la presente invención se proporciona un método para preparar una NS3 proteasa mutante de HCV resistente a inhibidor. El método comprende las etapas de preparar un constructo (plásmido recombinante o combinación) de ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable y NS3 proteasa de HCV nativa en donde la replicación y la expresión del marcador seleccionable dependen de la actividad de NS3 proteasa de HCV. Un ejemplo es el replicón de HCV. Las células anfitricnas se transfectan con este constructo y se incuban en presencia de inhibidor de NS3 bajo presión selectiva, bajo condiciones adecuadas para selección de las células transfectadas exitosamente. Los ejemplos de marcadores seleccionables se identifican en lo anterior. El marcador seleccionable apropiado conferirá a células transfectadas sucesivamente una ventaja de crecimiento bajo las condiciones de crecimiento que se les proporcionan a las células. Las colonias que resultan de la incubación bajo estas condiciones incorporan NS3 proteasa mutante de HCV resistente a inhibidor . Los métodos para lisar las células y aislar el ácido nucleico mutante o finalmente aislar la proteasa mutante son bien conocidos dentro de la habilidad de la técnica, o como se describe en los siguientes ejemplos. La naturaleza de las mutaciones las cuales vuelven a la NS3 proteasas mutantes resistentes al inhibidor seleccionado se pueden identificar fácilmente utilizando técnicas de secuenciado estándar las cuales son bien conocidas por los expertos en la técnica. Después de la primera identificación de los mutantes pertinentes se puede obtener validación por producción adicional de ácidos nucleicos o proteasas mutantes similares mediante mutagénesis dirigida al sitio por técnicas bien conocidas por las personas expertas en el arte, o como se describe en los siguientes ejemplos.

Proteasas mutantes En una segunda modalidad, la presente invención proporciona una NS3 proteasa mutante de HCV resistente a inhibidor, novedosa. Aunque no se desea unirse a teoría particular alguna, en un aspecto de esta modalidad las mutaciones a la NS3 proteasa nativa resultan en un cambio, tal vez conformacional o estérico, que evita o por lo menos reduce la unión de inhibidor de proteasa de manera tal que se retiene sustancialmente la actividad de proteasa. De manera particular, las mutaciones dentro o aproximadamente de los aminoácidos 1-180 de la proteasa se pueden mutar de modo que disminuye la unión de inhibidor. Más particularmente, las mutaciones dentro o alrededor del sitio activo o cercanas al sitio de unión de inhibidor se pueden mutar de modo que disminuya la unión de inhibidor. En un aspecto de esta modalidad, la proteasa resistente a inhibidor se muta en por lo menos una posición de aminoácido que corresponde a los aminoácidos 155, 156 o 168 de la secuencia de NS3 proteasa de HCV nativa. El aminoácido nativo en la posición 155 es arginina (Argl55 o R155) , en la posición 156 es alanina (Alai 56 o A156) y en la posición 168 con mayor frecuencia en el genotipo 1, un ácido aspártico (Aspl68 o D168) , aunque también se ha encontrado un ácido glutámico (Glu o E) en algunos virus del genotipo 1 o glutamina (Gln o Q) se ha encontrado en los virus del genotipo 3. Un ejemplo de la secuencia nativa de aminoácidos del dominio de NS3 proteasa HCV-lb se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, la NS3 proteasa resistente a inhibidor tiene por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 155, 156 y 168 que está sustituido con un aminoácido que habitualmente no se presenta en la NS3 proteasa de HCV en esas posiciones. El aminoácido nativo en la posición 155 es arginina (Arg~" o R'~~~) . De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, la NS3 proteasa resistente a inhibidor en la cual la arginina en la posición 155 se sustituye con un aminoácido no básico. La sustitución de Arg" generalmente con un aminoácido no básico tal como glutamina (Q) o triptofano (Vi) resulta en una NS3 proteasa resistente a inhibidor. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, la NS3 proteasa resistente a inhibidor tiene la alanina en la posición 156 que está sustituida con cualquier otro aminoácido. En otro aspecto de esta modalidad, la proteasa resistente a inhibidor se muta en Alal56 generalmente con los aminoácidos no cargados tales como glicina (G) , treonina (T) o valina (V) , lo que resulta en una NS3 proteasa resistente a inhibidor. De manera alternativa, la proteasa resistente a inhibidor se muta en Alal56 generalmente con aminoácidos no cargados que tienen una cadena lateral ligeramente más grande tal como treonina (T) o valina (V) lo que resulta en una NS3 proteasa resistente a inhibidor. En otro aspecto de esta modalidad, la proteasa resistente a inhibidor se muta en la posición de aminoácido 168. El aminoácido nativo en la posición 168 es ácido aspártico (Asp;63 o D1") , ácido glutámico (Glu o E) o glutamina (Gln o Q) . De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, la NS3 proteasa resistente a inhibidor tiene el ácido aspártico/ácido glutámico/glutamina en la posición 168 que es sustituido con cualquier otro aminoácido. La sustitución de Asp:" generalmente con aminoácidos tales como glicina (G) , alanina (A) , asparagina (N) , histidina (H) o valina (V) resulta en una NS3 proteasa resistente a inhibidor. Preferiblemente, la NS3 proteasa resistente a inhibidor tiene el ácido aspártico/ácido glutámico/glutamina en la posición 168 que se sustituye con un aminoácido no cargado con cadenas laterales pequeñas tales como glicina (G) , alanina (A) , asparagina (N) o valina (V) que resultan en una NS3 proteasa resistente a inhibidor. De manera más preferible, el Asp/Glu/Gln 168 se muta a alanina (A) o valina (V) . De manera alternativa, en una modalidad preferida adicional, la Asp/Glu/Gln'^ nativa de la NS3 proteasa se sustituye con glicina (G) , asparagina (N) o histidina (H) . En un aspecto preferido adicional de esta modalidad, la Arg:55 nativa de la NS3 proteasa se sustituye con ácido glutámico. En un aspecto preferido de esta modalidad, la Ala1"5 nativa de la NS3 proteasa se sustituye con valina. En un aspecto preferido adicional de esta modalidad, la Asp:a8 nativa de la NS3 proteasa se sustituye con valina. En un aspecto preferido de esta modalidad, por lo menos un de Ala15í y Aspies nativas de la NS3 proteasas se sustituyen con valina. En un aspecto preferido adicional de esta modalidad, tanto la Ala"" y la Asp1" nativas de la NS3 proteasa se sustituyen con valina. Otro aspecto de la presente invención cubre un dominio de NS3 proteasa que comprende una secuencia que tiene 90% de identidad con la secuencia que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, en donde la secuencia de aminoácidos se muta como se define en lo anterior . De manera alternativa, en un aspecto preferido adicional de esta modalidad, cualquiera de las mutaciones que se presentan en las tablas 1, 2, 3 6 4 puede generar una NS3 proteasa mutante de HCV resistente a inhibidor.

Moléculas recombinantes de ácido nucleico En una tercera modalidad, la invención abarca moléculas recombinantes de ácido nucleico que incluyen moléculas tanto de ADN como de ARN que codifican para las NS3 proteasas mutantes de HCV resistentes a inhibidor definidas en lo anterior. Un ejemplo de la secuencia nucleotídica que codifica para un dominio de la NS3 proteasa de HCV nativa se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. Se abarcan modificaciones en esta secuencia las cuales codifican para NS3 proteasas mutantes resistentes a inhibidor, como se determinan utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, tales como aquellos basados en células descritos en los ejemplos específicos en la presente, que incluyen variantes, derivados y fragmentos de los mismos. Estas modificaciones de secuencia también pueden incorporar, por supuesto, modificaciones que resulten de la generación del código de ácido nucleico. En un aspecto de la presente invención, la molécula del ácido nucleico codifica para una NS3 proteasa mutante de HCV resistente a inhibidor la cual se modifica en por lo menos uno de los aminoácidos como se define en lo anterior.

Constructos de ácido nucleico, vectores, replicón y virus En una cuarta modalidad, la invención abarca constructos de ácido nucleico, vectores, replicones y virus que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa mutante de HVC resistente a inhibidor, como se describe en lo anterior. En un aspecto de esta modalidad se preparan constructos de ácido nucleico que codifican para NS3 proteasa resistente a inhibidor en la cual el ácido nucleico que codifica para la proteasa mutante se une al ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable . En un aspecto particular de esta modalidad, el ácido nucleico que codifica para la NS3 proteasa mutante de HCV resistente a inhibidor se incorpora "de manera expresable" en ,un constructo o vector. Con el fin de obtener expresión, el ácido nucleico que codifica para la proteasa se une a elementos dentro del constructo o vector los cuales son apropiados para permitir la expresión del ácido nucleico que codifica para la proteasa mediante transfección, estable o transitoria, en una célula anfitriona. Los constructos de expresión y los vectores son bien conocidos por los expertos en la técnica como se describe en lo anterior.

Células anfitrionas transfectadas En una quinta modalidad, se proporcionan células anfitrionas transfectadas con un vector de expresión o un replicón que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa imitante de HCV resistente a inhibidor, así como líneas celulares derivadas de dichas células anfitrionas. En un aspecto de la modalidad preferida se proporcionan sistemas de expresión apropiados y células procarióticas y eucarióticas para expresión de la NS3 proteasa mutante de HCV. Los aspectos preferidos de esta modalidad proporcionan sistemas de expresión en E. coli, baculovirus, levadura así como en células de mamífero tales como en células Huh-7. En un aspecto preferido de esta modalidad, se proporciona una célula anfitriona de mamífero transfectada con un vector o un replicón, o infectada con un virus, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa mutante resistente a inhibidor, ya sea estable o transitoria. Los ejemplos no limitantes de células anfitrionas de mamífero apropiadas y líneas de células incluyen hepatocitos primarios, líneas de células hepáticas, fibroblastos, linfocitos y líneas de células renales . En un aspecto preferido adicional, se proporciona una línea de célula anfitriona humana que está transfectada con un ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa mutante resistente a inhibidor. En un aspecto más preferido, la línea de célula anfitriona humana transfectada se selecciona de una línea de célula hepática o renal. Los ejemplos de células anfitrionas preferidas incluyen células renales embriónicas humanas de la línea 293 (ATCC · CRL 1573), células de carcinoma humano que incluyen las de la línea HeLa (ATCC CCL2) y células de neuroblastoma de las líneas IMR-32 (ATCC CCL 127), SK-N-MC (ATCC HBT 10) y SK-N-SH (ATCC HBT 11), células Huh-7, células WRL68, células HepG2 y células Chang .

Método para evaluar la actividad de proteasa En una sexta modalidad de la presente invención, se proporciona un método para evaluar la actividad de NS3 proteasa de una NS3 proteasa mutante de HCV, de acuerdo con la presente invención. El método comprende las etapas de incubar células anfitrionas y transfectadas con ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa resistente a inhibidor bajo condiciones las cuales provocan que se exprese la proteasa; y medir la replicación del ácido nucleico, en donde el nivel de replicación es proporcional a la actividad de la proteasa expresada. Como lo apreciará un experto en la técnica, el nivel de replicación así como la actividad de proteasa se pueden medir (directa o indirectamente) utilizando ensayos estándar establecidos para este propósito, tales como los ensayos descritos con detalle en los ejemplos específicos que siguen. Los métodos para evaluar la actividad de protesasa incluyen, pero no se limitan a ensayos con replicón, ensayos basados en células sustitutas o ensayos enzimáticos in vitro de NS3 proteasa purificada.

Método para identificación de inhibidores En una séptima modalidad de la presente invención se proporciona un método para cribado (determinación sistemática) de compuestos inhibidores candidatos de segunda generación para determinar la capacidad para inhibir la actividad de NS3 proteasa mutante de HCV, de acuerdo con la presente invención. En una octava modalidad de la presente invención, se proporciona un método para el cribado de compuestos inhibidores candidatos de la segunda generación para determinar la capacidad para inhibir la actividad de la NS3 proteasa de HCV mutante en un ensayo libre de células, de acuerdo con la presente invención. En un aspecto, el método de identificación del compuesto inhibidor potencial de segunda generación de la NS3 proteasa de HCV comprende incubar un mutante de NS3 proteasa resistente a inhibidor, aislado, como se define en lo anterior, en presencia o ausencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación; y medir la actividad de proteasa de la NS3 proteasa resistente a inhibidor en presencia y ausencia del compuesto inhibidor candidato de segunda generación. Una disminución en la actividad en presencia de un compuesto inhibidor candidato de la segunda generación indica que el compuesto inhibe a la NS3 proteasa resistente a inhibidor. En otro aspecto, el método de identificación de compuestos potenciales inhibidores de la segunda generación de una NS3 proteasa de HCV comprende incubar células anfitrionas transíectadas con ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa resistente a inhibidor en presencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación bajo condiciones las cuales provocan la expresión del mismo; incubar células anfitrionas transfectadas con ácido nucleico que codifica para una NS3 proteasa resistente a inhibidor en ausencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación bajo condiciones las cuales provoquen la expresión del mismo; y después medir la replicación del ácido nucleico, en donde el nivel de replicación del ácido nucleico es proporcional en cada caso a la actividad de proteasa. Una disminución de la actividad de proteasa en presencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación indica que el compuesto candidato inhibe a la proteasa. Los ensayos y métodos basados en células de la presente invención se llevan a cabo bajo condiciones para el crecimiento de células de mamífero que son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, es decir, pH fisiológico, concentraciones de sal utilizando amortiguadores tales como PBS , temperaturas entre 30° y 42°, medios de cultivo celular apropiados y suministrando tiempo suficiente para crecimiento celular. De manera más específica, las células anfitrionas transfectadas se incuban por un tiempo suficiente para permitir la expresión de la NS3 proteasa mutante resistente a inhibidor, por ejemplo, un período de incubación de por lo menos 1 hora, pero de manera más preferible un período de incubación de 10 horas a aproximadamente 24 horas. Los ensayos y métodos de la presente invención se llevan a cabo bajo condiciones para medir la actividad de NS3 proteasa los cuales son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, es decir, pH fisiológico, concentraciones de sal utilizando amortiguadores tales como Tris, HEPES, temperaturas entre 15° y 37° (preferiblemente a temperatura ambiente) y técnicas apropiadas de incubación y detección. Los aspectos preferidos de las modalidades de la presente invención se describen en los siguientes ejemplos específicos los cuales no deben considerarse como limitantes .

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Identi icación de los imitantes de NS3 de HCV resistentes a un inhibidor de HCV peptídico macrocíclico Se utiliza el método descrito por Lohmann et al. (1999, Science 285:110) para imitar la replicación de APJSÍ subgenómico de HCV en un sistema que depende de la función de proteínas y enzimas no estructurales de HCV. Este sistema de replicón de ARN para HCV incorpora dos cistrones: uno que codifica para la región no estructural de HCV y el segundo que codifica para un marcador resistente a neomicina seleccionable (es decir, un gen que codifica para neomicina fosfotransferasa) . Como lo apreciará una persona experta en la técnica, el segundo cistrón puede codificar para cualquier marcador adecuado con propósitos de selección. Las líneas celulares que albergan dicho ARN para HCV subgenómico bicistrónico, tal como la línea celular S22.3, se describen por Kukolj y Pause (véase el documento WO 02/052015, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia) . Estas líneas celulares son útiles para evaluar la eficacia y la potencia de las sustancias terapéuticas potenciales contra HCV que inhiben una o más de las proteínas no estructurales de HCV. En la figura 1 se resume el presente método por medio del cual se establece en el cultivo celular la replicación de ARN para HCV. Como se muestra, se transfectan células Huh-7 (8 x 10b células) con ARN para HCV subgenómico bicistrónico utilizando métodos de transfección bien establecidos en la técnica. Las células Huh-7 transíectadas se seleccionan por crecimiento en medio que contiene neomicina (0.5 mg/ml de neomicina) . De manera específica, las células transíectadas replican el ARN que produce neomicina fosfotransferasa y de esta manera vuelven a las células resistentes al efecto citotóxico de la neomicina. Los replicones de HCV mutados se describen en el documento WO 02/052015 y también se pueden utilizar de acuerdo con el presente método para incrementar la replicación de AKN y la eficiencia del establecimiento del replicón. Brevemente, la selección de las líneas de células S22.3 resistentes a inhibidores de NS3 proteasa es como sigue. Se tripsinizan células S22.3 y se resuspenden en medio fresco (DMEM, suero bovino fetal 10%) con 1 mg/ml de antibiótico G418, se siembran en placa 150,000 células en una placa con 6 pozos. El día siguiente (t = día 0) , se agrega a cada pozo medio fresco que contiene el inhibidor de NS3 proteasa en una concentración predeterminada y se agregan 1 mg/ml de G418. Después de que las células llegan a confluencia en el día 3, las células S22.3 se tripsinizan y se hacen pasar a una caja de 10 cm. Se cambia el medio (que contiene inhibidor y 1 mg/ml de G418) en el día 6 y en el día 10. En el día 11 es evidente la muerte celular, dado que la mayor parte de las células han perdido resistencia a G418. En el día 14 se cambia medio fresco el cual ahora contiene una concentración predeterminada del inhibidor de NS3 proteasa con 0.5 mg/ml de G418. El medio con inhibidor y 0.5 mg/ml de G418 se reabastece en el día 17 y en el día 20. Las células que forman colonias en el día 21 se toman para expandirlas en placas de 48 pozos y se cuentan las colonias por fijación y tinción de las células con cristal violeta. Las líneas de células resistentes se propagan de las placas de 48 pozos a placas de 24 pozos y a placas de 6 pozos y más allá. El ARN celular total que también contiene el ARN para el replicón subgenómico de HCV se aisla de 1,000,000 de células (o más) siguiendo el protocolo que viene en el cartucho de Qiagen RNeasyy . Se amplifica la secuencia de HCV por RT-PCR y se secuencia la región NS3 con cebadores específicos para NS3. De manera específica, las colonias de células resistentes a neomicina después se exponen a un inhibidor de NS3 proteasa conocido, específicamente un inhibidor peptídico macrociclico : Inhibidor A = ácido ciclopropa [e] irrólo [1 , 2 -a] [1, 4] diazaciclopentadecin-14a (5) -carboxí lico, 6- [ [ (ciclopentiloxi) carbonil] amino] - 1,2, 3, 6, 7, 8,9, 10, 11, 13 a, -14, 15, 16, 16a-tetradecahidro-2- [ [7-metoxi-2- [2- [ (1-metiletil) amino] -4-tiazolil] -4-quinolinil] oxi] -5, 16-dioxo- , (2R, 6S, 12Z, 13aS, 14aR, 16aS) , el cual se describe como el compuesto #822 en el documento WO 00/59929, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia. Las colonias se hacen crecer en presencia de concentraciones cada vez mayores de este inhibidor (CE-0 de 2 nM) que varían desde 2 nM hasta 2000 nM . Las colonias que surgen en presencia de concentraciones bajas (6 x CE;: o 12 nM) y altas (1000 x CE= o 2000 nM) del inhibidor A se expanden y se determina la secuencia del ARN del replicón sobre la región NS3/4A utilizando técnicas estándar de secuenciado. Las mutaciones detectadas en el dominio de la proteasa NS3 a concentraciones tanto alta como baja de inhibidor se resumen a continuación en la tabla 1. Se hace referencia a los aminoácidos con el código de una letra, el aminoácido nativo de la NS3 proteasa de HCV precede al número de su posición en la proteasa y el aminoácido mutante está después del número de la posición, por ejemplo, D168G indica que el ácido aspártico nativo en la posición 168 ha sido sustituido por glicina en la proteasa mutante.

TABLA 1 ; Concentración baja de inhibidor[] (12 nM) Concentración alta de inh¡bidor[] (2000 nM) ! cambio en nucleótido cambio de ' cambio de nucleótido cambio ¦ aminoácido aminoácido A503G D168G | G466A - A503G A156T D168A A211G-G466A 17IV A156T C467T A156V A257G - A503G Q86R D168G C467T A156V i A503G D168G C467T i A156V C467T A156V C467T A156V A503G D168G C265T - C467T P89S A156V G464A R155Q C265T - C467T P89S A156V A503T D168V A503T D168V A122G Q41R C467T A156V C467T A156V C266T - C467T P89L A156V A503G D168G C467T A156V G502R D168N/D C467T A156V G502A - A532T D168N T178S A503T D168V A239G - G331T Q80R A111S A503T D168V G502C D168H A503T D168V C467T A156V C467T A156V C467T A155V G466A A156T A257G - A503G Q86R D168G C467T — A156V C315T D168E C467T A156V C467T A156V C467T A156V G526A E176K Los resultados muestran que se producen una diversidad de mutaciones de aminoácidos en la proximidad del sitio activo (véanse aminoácidos con negrillas en la figura 3) , particularmente en colonias aisladas con una concentración baja de inhibidor. Las mutaciones alanina a valina o treonina en la posición 156 (A156V/Y) y ácido aspártico a valina/alanina y la posición 168 (D168V/A) se observan de manera consistente en colonias aisladas con una concentración alta de inhibidor. En particular, la mutación A156V se detecta en 70% de las colonias secuenciadas que crecen con una concentración alta de inhibidor, mientras que la mutación D168V se detecta en 20% de las colonias secuenciadas que crecen con una concentración alta de inhibidor.

Ejemplo 2 - Identificación de los mutantes de NS3 de HCV resistentes al inhibidor B de NS3 Se utiliza el método descrito en lo anterior, en el ejemplo 1, para identificar los mutantes de NS3 proteasa que se presentan por crecimiento en presencia de un inhibidor de NS3 proteasa. Inhibidor B = ácido ciclopropano carboxílico, - [ (ciclopentiloxi) carbonil] -3 -metil -L-valil - (4R) - [ [2- [2-(acetilamino) -4-tiazolil] - 7 -metoxi -4 -quinolinil] oxi] -L-prolil-l-amino-2-etenil- , (1R,2S)-, el cual tiene una CE; = de 40 ??. Las colonias que surgen en presencia de concentración es baja (3 x CE5.. o 120 nM) y alta (50 x CE5.. o 2000 nM) de inhibidor se expanden y se determina la secuencia del ARN de replicón sobre la región NS3/4A utilizando técnicas de secuenciado estándar. Las mutaciones detectadas en el dominio de NS3 proteasa en concentraciones tanto alta como baja de inhibidor se resumen a continuación en la tabla 2.

TABLA 2 i C366A I S122R C265T - C366A I P89S S122R A211G - G502A 171V D168N G502A D168N A503C D168A C266T - G464A P89L R155Q Nuevamente, los resultados muestran que se producen una diversidad de mutaciones de aminoácidos en proximidad de la cavidad de unión de inhibidor, particularmente en colonias aisladas a una baja concentración de inhibidor, y las mutaciones individuales A156V/G y D168V/N/A/G se observan de manera consistente en colonias aisladas a una concentración a baja y alta de inhibidor. La mutación A156V se detecta en 80% de las colonias secuenciadas que crecen con una concentración alta de inhibidor, mientras que la mutación D168V se detecta en 20% de las colonias secuencias que crecen con una concentración alta de inhibidor.

Ejemplo 3 - Identificación de mutantes de NS3 de HCV resistentes a otro inhibidor de NS3 Se utiliza el método descrito en el ejemplo 1 anterior junto con el inhibidor de proteasa NS3 : Inhibidor C = ácido ciclopropa [e] irrólo [1 , 2 -a] [1 , 4] diazaciclopentadecin- 14a ( 5H) -carboxílico, 2- [[2- [2- (acetilamino) -4-tiazolil] -7-metoxi-4 -quinolinil] oxi] -6- [ [ (1 , 1-dimetiletoxi) carbonil] amino] -l,2,3,6,7,8,9(10,ll;13a,14,15,16, 16a- tetradecahidro- 5 , 16-dioxo-, (2R, 6S, 12Z, 13aS, 14aR, 16aS) - , el cual también se describe como el compuesto #702 en el documento WO 00/59929 (incorporado en la presente como referencia), el cual tiene una CE;c de 5 nM. Las colonias que surgen en presencia de concentraciones baja (6 x CE30 o 30 nM) intermedia (20 x CE5,, 100 nM) y alta (100 x CES0, 500 nM y 200 x CE-., 1000 nM) de inhibidor se expanden y se determina la secuencia del ARN de replicón sobre la región N33/4A utilizando técnicas de secuenciado estándar. Las mutaciones detectadas en el dominio de NS3 proteasa en diferentes concentraciones se resumen a continuación en la tabla 3. TABLA 3 Concentración baja de Concentración Concentración alta de Concentración alta de j inhibidor (30 nM) intermedia (100 nM) inhibidor (500 nM) inhibidor (1000 nM) cambio ! Cambio de cambio Cambio de i cambio Cambio de cambio I Cambio de de I aminoácidos de aminoácidos de : aminoácidos de ; aminoácidos nucleótido nucleótido nucleótido j nucleótido ! G466A A156T G466A A156T A84G ¡ Q28R A503T/C i D168V A504T i D168V C449 T A150V A504C D168A A84G Q28R A503T D168V C467T A 156 V A504T D168V G59A S20N A504T D168V C467T A 156 V G466A A156T C343T P115S C430T L144F A503G D168G G466A A156T G466A A156T A504T D168V C467T A156V A239G Q80R G466A A156T A504T D168V A503T D168V G472C V158L T536C M179Y G466A A156T C467T A156V C463T R155W G302A S101N A503C D168A A239G Q80R A503T D168 C467T A156V Los resultados muestran que se producen una diversidad de mutaciones de aminoácidos en la proximidad del sitio activo y que se observan de manera consistente las mutaciones A156V/T y D168V/A/G.

Ejemplo 4- Identificación de los imitantes NS3 de HCV resistentes a inhibidor de HCV peptídico macrocíclico en otra línea de células que alberga ARN para HCV subgenomico bicis ronico La línea celular R3 se deriva de S22.3 y contiene un replicón de HCV bicistrónico con mutaciones que confieren adaptación para replicarse en células Huh7 ( O 02/052015, incorporado en la presente como referencia) . Se utiliza el Inhibidor A descrito en lo anterior en el ejemplo 1 para identificar mutantes de NS3 proteasa en líneas de células R3. Las colonias que surgen en presencia de 7.5 nM y 700 nM de Inhibidor A se expanden y se determina la secuencia del AR de replicón sobre la región NS3/4A utilizando técnicas de secuenciado estándar. Las mutaciones detectadas en el dominio de ??3 proteasa a ambas concentraciones se resumen en la tabla 4.

TABLA 4 Los resultados muestran que se producen un número seleccionado de mutaciones de aminoácidos en proximidad al sitio activo. Se observan con mayor frecuencia mutaciones individuales, ácido aspártico a valina (D168V) o alanina (D168A) o glicina (D168G) a una concentración baja de inhibidor mientras que se observa con mayor frecuencia D168V a concentración alta de inhibidor .

EJEMPLO 5 - DETERMINACIÓN DEL INHIBIDOR CE50 UTILIZANDO LINEAS DE CÉLULA DE REPLICÓN MUTANTE DE NS3 Los ADNc de replicón subgenómico de HCV isogénicos específicos que contienen únicamente una de las mutaciones resistentes a inhibidor, es decir (en este ejemplo: A156T o A156V; o D168V; o D168G) se clonan y se generan los ARN transcritos in vitro correspondientes de estos replicones bicistrónicos modificados. Los ARN codificantes mutantes se utilizan para construir líneas de células de replicón que contienen mutante en células Huh-7 previamente no expuestas, como se describe previamente para otros replicones de HCV. Cada una de estas líneas de células de replicón individuales después se utilizan para confirmar la disminución en la inhibición mostrada por la NS3 proteasa del inhibidor A sobre los mutantes de NS3. También se utilizaron para determinar el nivel de inhibición de las líneas de células resistentes a inhibidor mutantes en presencia de un inhibidor de NS5B de polimerasa de HCV o interferón a. Utilizando el ensayo descrito en el documento WO 03/010141 (Ejemplo 48) se determina la CE;; de cada inhibidor utilizando las líneas de células mutantes . Los resultados de estos experimentos se resumen a continuación en la tabla 5.

TABLA 5 Inhibidor WT A156T A156V D168V D168G I A 0.0009 0.547 0.324 0.735 0.023 Inhibidor 1.39 1.34 1.19 1.38 1.13 de polimerasa IFN-a ¡0.23 0.210.23 0.20 0.1S Nótese que cada uno de estos cuatro mutantes únicamente desplazan la potencia de los inhibidores relacionados de NS3 proteasa y no tienen efectos sobre la CE=: de un inhibidor de NS5B polimerasa no relacionada de HCV o de interferón a. Los mutantes D168V y A156T son los más perjudiciales para esta clase de inhibidores de NS3 proteasa, desplazando la potencia de la CE;c del cultivo celular hasta 700 veces.

EJEMPLO 6 - ENSAYOS ENZIMÁTICOS IN VITRO Y DETERMINACIÓN DE Ki El ADN que codifica para la región codificante de NS3-NS4A del HCV genotipo Ib, que incluye una secuencia N terminal de 28 residuos que contiene una etiqueta hexahistidina y una separación de TEV de proteasa (Pause, A. et al. (2003) J. Biol . Chem. 278:20374-20380) se amplifica por PCR y después se subclona en el vector de expresión bacteriano pETlla. Se introducen las sustituciones de aminoácidos A156T y D168V dentro de la región que codifica para NS3-NS4A utilizando procedimientos estándar de mutagénesis dirigida al sitio. De manera alternativa, la región codificante de la NS3 proteasa (1-180) para el tipo silvestre con la secuencia ASKKKK en la parte C terminal se clona dentro del vector de expresión bacteriano y se introducen las sustituciones de aminoácidos A156T, D168V y R155Q como se describe en lo anterior. El dominio de NS3 proteasa (que alberga las mutaciones A156T o D168V o R155Q) se expresan en E. coli y se purifican como se describe previamente (LaPlante, S.R. et al (1999) J. Biol. Chem. 274: 18618-18624) . Las proteínas NS3-NS4A con cualquiera de las mutaciones A156T o D168V también se expresan en E. coli y la pasta celular se resuspende en 5 mi de amortiguador de lisis (fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5, glicerol 20%, EDTA 1 mM, Tritón X-100 0.5%, NaCl 0.5M) por gramo de células, tratadas con desoxirribonucleasa I, y después se clarifican mediante centrifugación durante 30 min a 150,000 x g; el sobrenadante se diluye dos veces en fosfato de sodio 50 m , pH 7.5, NaCl 0.5 M y se agrega iraidazol a una concentración final de 25 mM. La solución de complejo NS3-NS4A se purifica por etapas sucesivas en una columna de Ni'2-quelante Hi-Trap y una columna de afinidad poli (U) -Sepharose previamente equilibrada con fosfato de sodio y 50 mM, pH 7.0, glicerol 10%, NaCl 0.2 M, N-dodecil-S-D-maltósido 0.05%, ß-mercaptoetanol 10 m . La enzima se eluye en el mismo amortiguador que contiene NaCl 2M. Las enzimas aisladas se almacenan a -80°C.

Determinación de K¡^ - Se determina la constante de inhibición (K¿) utilizando el sustrato fluorogénico depsipéptido antranilil -DDIVPAb [C (O) -0] AMY (3 -NO.) TW-OH. La reacción de separación se monitorea continuamente a 23 °C en un fluorómetro BMG POLARstarMS Galaxy, equipado con filtros de excitación y de emisión de 320 y 405 nm, respectivamente. La NS3 proteasa de tipo silvestre y el mutante (5-20 nM) se ensayan en Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, glicerol 30%, BSA 1 mg/ml, TCEP 1 M en presencia de un exceso molar de 1000 veces de NS4Acéo.í.to. Se lleva a cabo una preincubación durante 15 min para permitir la formación de un complejo NS3 proteasa-NS4A_,-;i3. Las proteínas NS3-NS4A (5-20 nM) se ensayan en Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, citrato de sodio 0.25 M, n-dodecil-S-D-maltósido 0.01%, y TCEP 1 mM. La velocidad inicial de la reacción inhibida se determina a diversas concentraciones de inhibidor (que corresponden a un intervalo de inhibición de 25-75%) mientras se varía la concentración de sustrato (típicamente de 0.1 a 5.0 KJ , suponiendo una cinética de Michaelis-Menten . La reacción se inicia por adición de enzima. Se realizan los cálculos de Ki mediante análisis de regresión no lineal de los datos de velocidad inicial utilizando el software GraFit (versión 3.0, Erithacus:R Software Ltd. , Staines, Reino Unido) . Algunos valores de K, se calculan a partir de la CI50 concentración eficaz 50%) en base en la siguiente ecuación para inhibición competitiva: CI50 = 0.5Er + KL (1 + S/KJ . Se obtienen los CI5C a partir de un ajuste de curva no lineal utilizando el modelo de Hill aplicado a los datos de % de inhibición-concentración y se calculan mediante el uso de SAS (Statistical Software System, SAS Institute Inc., Cary, N.C. ) . Los resultados que se muestran en las tablas 6 y 7 resumen la sensibilidad in vitro de algunos inhibidores de NS3 proteasa (como valores K._ observados) para NS3 proteasa WT versus el imitante resistente a inhibidor en forma ya sea de proteína de longitud completa de NS3/NS4A (tabla 6) o el complejo de péptido NS3-NS4A (tabla 7) . Nótese que el desplazamiento en los valores K. para el inhibidor A (es decir, la K, obtenida con las enzimas mutantes en relación a la enzima de tipo silvestre) recuerda el desplazamiento observado en CE53 con este inhibidor en el ensayo de cultivo celular (tabla 5) .

TABLA 6 Inhibidor Ki (nM) WT A156T ¡ D168V 1600 n.d. 8100 0.047 29 12 870* 520* * K1 calculada a partir de CI;,. El compuesto E tiene la siguiente estructura El compuesto F tiene la siguiente estructura (F) TABLA 7 Inhibidor K. (nM) WT A156T D168V 5.6 800* |970* 220* *K calculada de CI- Conclusión Se describe en los ejemplos precedentes un método para la selección de ARN subgenómico de HCV que se replica en presencia de diversos inhibidores de NS3 proteasa de HCV. Este método para aislar replicones de HCV que son resistentes a inhibidores de NS3 proteasa permite la identificación y predicción de las sustituciones nucleot dicas y de aminoácidos que pueden conferir una ventaja de crecimiento al virus HCV en presencia de estos inhibidores, inhibidores relacionados y, en realidad, cualquier otro inhibidor de HCV conocido o futuro particularmente. Los inhibidores de NS3 proteasa que inhiben la enzima por el mismo mecanismo o la unión de la misma región/cavidad. El conocimiento a priori de las mutaciones las cuales vuelven a HCV resistentes a inhibidores de NS3 proteasa proporciona la base para identificar inhibidores que serán eficaces contra tales cepas resistentes, por ejemplo, utilizando los ensayos in vitro de alto rendimiento que reconstituyen actividades de la enzima HCV resistente o la proteína. Las NS3 proteasas de mutantes de HCV (que albergan cualquiera de las mutaciones que se describen en la presente) que retienen actividad pero que no se inhiben por inhibidores de la "primera generación" son herramientas útiles para identificar inhibidores de la segunda generación que se pueden necesitar en un tratamiento de combinación de medicamentos múltiples para el tratamiento de infección por HCV.

Referencias Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York Gale Jr. et al., 1997, Virology 230, 217 Kim JL, et al. 1996, Cell; 87 : 345-355 Kukolj and Pause, O 02/052015 Lohmann et al . , 1999, Science 285:110 Love, R.A. et al., 1996, Cell, 87, 331-342 Reed et al . , 1997, J. Virol. 71, 7187 Remington, 1995, The Science and Practice of Pharmacy Sambrook et al., 2000, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Trozzi et al., 2003, J. Virol, 77, 3669-3679 (corresponds to Migliaccio et al., 2002 Selection and Characterization of HCV Replicón Mutants; Resistant to Antiviral Agents., Abst. 9Ln International Meeting of HCV and Related Viruses, Jul 7-11, La Jolla, California) .

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una proteasa de HCV constituida de una secuencia de aminoácidos en la cual se muta un aminoácido en por lo menos una de las posiciones 155 ó 156 de la NS3 proteasa nativa de HCV.

2. La proteasa de HCV, como se describe en la reivindicación 2, en donde la secuencia comprende una mutación en por lo menos una de las posiciones 155 ó 156 de la NS3 proteasa de HCV nativa.

3. La NS3 proteasa de HCV, como se describe en la reivindicación 2, en donde el aminoácido en la posición 155 se sustituye con un aminoácido diferente de arginina.

4. La NS3 proteasa de HCV, como se describe en la reivindicación 2, en donde el aminoácido en la posición 156 se sustituye con un aminoácido diferente de alanina.

5. La NS3 proteasa de HCV constituida de una secuencia de aminoácidos definida por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 que comprende una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste de: R155Q; R155W; A156G; A156T; A156V.

6. La NS3 proteasa de HCV, como se describe en la reivindicación 5, que comprende además una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste de: Q80R; y S122R.

7. La NS3 proteasa de HCV, cerno se describe en la reivindicación 5 o 6, que comprende además una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste de: S20N; R26K; Q28R; A39T; Q41R; I71V; Q86R; P89L; P89S; S101N; A111S; P115S; L144F; A150V; B158L; E176K; y T178S; M179I; M179V y M179T.

8. Una NS3 proteasa de HCV que está constituida de 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, que comprende además una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste de R155Q R155W; A156G; A156T y A156V.

9. La NS3 proteasa de HCV, como se describe en la reivindicación 8, que comprende además una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste de: Q80R y S122R.

10. La NS3 proteasa de HCV, como se describe en la reivindicación 8 o 9, que comprende además una o más mutaciones que se seleccionan del grupo que consiste de: S20N; R26K; Q28R; A39T; Q41R; I71V; Q86R; P89L; P89S; S101N; A111S; P115S L144F; A150V; V158L; E176K; y T178S; M1791; M179V y M179T.

11. Un ácido nucleico recombinante que codifica para una NS3 proteasa de HCV resistente a inhibidor, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Una sonda nucleotídica capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas con una secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 11.

13. Un vector que incorpora un ácido nucleico como se define en la reivindicación 11.

14. Una célula anfitriona transfectada con un vector como se define en la reivindicación 13.

15. Un método para evaluar la actividad de NS3 proteasa de HCV de NS3 proteasa resistente a inhibidor, el método comprende las etapas de: · incubar células anfitrionas como se define en la reivindicación 14 bajo condiciones las cuales provocan que la proteasa se exprese; y · medir la replicación del ácido nucleico; en donde el nivel de replicación del ácido nucleico es proporcionar a la actividad de la proteasa expresada.

16. Un método para identificar un inhibidor potencial de segunda generación de la actividad de NS3 proteasa de HCV, que comprende: · incubar células anfitrionas como se define en la reivindicación 14 bajo condiciones las cuales provocan la expresión de la proteasa resistente a inhibidor, en ausencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación; · incubar las células anfitrionas como se define en la reivindicación 14 bajo condiciones las cuales provocan la expresión de la proteasa resistente a inhibidor, en presencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación; y · medir la replicaciaón del ácido nucleico en presencia y ausencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación, en donde el nivel de replicación del ácido nucleico es proporcional a la actividad de la proteasa expresada, y en donde una disminución en la actividad de la proteasa en presencia de un compuesto inhibidor candidato indica que el compuesto inhibe a la proteasa.

17. Un método para identificar un inhibidor potencial de segunda generación de la actividad de NS3 proteasa de HCV, que comprende: · incubar una NS3 proteasa mutante resistente a inhibidor como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en presencia o ausencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación; y · medir la actividad de proteasa de la NS3 proteasa resistente a inhibidor en presencia y ausencia del compuesto inhibidor candidato de segunda generación; en donde una disminución en la actividad de proteasa en presencia de un inhibidor candidato de segunda generación indica que el compuesto inhibe a la NS3 proteasa resistente a inhibidor.