ES2298585T3 - Ns3 proteasa de hcv resistente a inhibidores. - Google Patents
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Abstract
Una NS3 proteasa de HCV que comprende una secuencia de aminoácidos como está numerada de acuerdo con SEQ ID No. 2, en la cual la secuencia de aminoácidos está mutada por lo menos en las posiciones 155 ó 156 de la NS3 proteasa de HCV nativa, en donde la posición 155 de los aminoácidos está substituida con glutamina o triptófano, o en donde el aminoácido en la posición 156 está substituido con glicina, treonina o valina.
Description
NS3 proteasa de HCV resistente a
inhibidores.
La presente invención se refiere a una nueva NS3
proteasa de HCV, y en particular, a una NS3 proteasa de HCV
resistente a los inhibidores, la cual comprende una secuencia de
aminoácidos mutada. Se refiere también a los métodos de empleo de
dicha proteasa resistente a los inhibidores para identificar
inhibidores que tienen actividad contra las cepas de HCV que han
desarrollado resistencia a los tratamientos conocidos.
\vskip1.000000\baselineskip
El virus de la hepatitis C (HCV) es el agente
etiológico principal de la post-transfusión
adquirido por la comunidad mundial de la hepatitis no A y no B. Se
estima que por encima de 200 millones de la población mundial están
infectados por el virus. Un alto porcentaje de portadores se
convierten en crónicamente infectados y muchos progresan hacia una
enfermedad crónica del hígado o la llamada hepatitis C crónica.
Este grupo tiene a su vez un alto riesgo de una seria enfermedad
del hígado tal como la cirrosis hepática, el carcinoma
hepatocelular y la enfermedad hepática terminal que conduce a la
muerte.
El mecanismo por el cual el HCV establece una
persistencia vírica y ocasiona una alta proporción de enfermedades
hepáticas crónicas no ha sido dilucidado completamente. No se
conoce como el HCV interactúa con, y evade, el sistema inmunológico
del anfitrión. Además, los papeles de las respuestas inmunológicas
celulares y humorales que protegen contra la infección y la
enfermedad por HCV, no han sido todavía establecidos.
El HCV es un virus de cadena ARN positiva
recubierta, de la familia de los Flaviviridae. El genoma del
ARN del HCV de cadena única es de polaridad positiva y comprende un
marco de lectura abierto (ORF) de aproximadamente 9600 nucleótidos
de longitud, el cual codifica una poliproteína lineal de
aproximadamente 3010 aminoácidos. En las células infectadas, esta
poliproteína se escinde en múltiples sitios mediante proteasas
celulares y víricas para producir proteínas estructurales y no
estructurales (NS). Las proteínas estructurales (C, E1, E2 y
E2-p7) comprenden polipéptidos que constituyen la
partícula del virus. Las proteínas no estructurales (NS2, NS3,
NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) codifican enzimas o factores accesorios que
catalizan y regulan la replicación del genoma de ARN del HCV. El
procesado de las proteínas estructurales es catalizado por las
proteasas de la célula anfitriona. La generación de las proteínas
no estructurales maduras es catalizada mediante dos proteasas
codificadas víricamente. La primera es la proteasa NS2/3
dependiente del zinc, la cual autocataliza la liberación de la
proteína NS3 de la poliproteína. La proteína NS3 liberada contiene
un dominio N-terminal de serina proteasa y cataliza
las restantes escisiones de la poliproteína. La proteína NS4A
liberada juega por lo menos dos papeles. El primer papel es el de
formar un complejo estable con la proteína NS3 y ayudar a la
localización de la membrana del complejo NS3/NS4A. El segundo papel
de la proteína NS4A es el de actuar como un cofactor para la
actividad de la proteasa NSE. Este complejo asociado a la membrana
cataliza a su vez la escisión de los restantes sitios de la
poliproteína, ocasionando de esta forma la liberación de las NS4B,
NS5A y NS5B. El segmento C-terminal de la proteína
NS3 alberga la nucleósido trifosfatasa y la actividad de la ARN
helicasa. La función de la proteína NS4B es desconocida. La NS5A es
una proteína altamente fosforilada que parece ser la responsable de
la resistencia al interferón de varios genotipos de HCV. La NS5B
es una ARN polimerasa dependiente del ARN (RdRp) que está implicada
en la replicación del HCV.
El marco de lectura abierto del genoma del ARN
del HCV está flanqueado en su extremo 5' por una región no
traducida (NTR) de aproximadamente 340 nucleótidos que funciona
como el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), y su extremo
3' por una NTR de aproximadamente 230 nucleótidos. Tanto la NTR 5'
como la 3' son importantes para la replicación del genoma de ARN.
La variación de la secuencia genómica no está uniformemente
distribuida sobre el genoma y la 5'NTR y partes de la 3'NTR son las
porciones más altamente conservadas.
Las secuencias clonadas y caracterizadas parcial
y completamente del genoma del HCV han sido analizadas respecto a
los objetivos apropiados para las terapias antivíricas futuras. Las
cuatro actividades enzimáticas víricas siguientes proporcionan
posibles objetivos: (1) la NS2/3 proteasa; (2) el complejo NS3/4A
proteasa, (3) la NS3 helicasa y (4) la ARN polimerasa dependiente
de NS5B ARN (NS5B RdRp). La NS3 proteasa ha sido también
cristalizada para descubrir una estructura que recuerda la de otras
serina proteasas (Love et al., 1996; Kim et al.
1996).
La actividad de la NS3 proteasa es un objetivo
atractivo para el descubrimiento de fármacos. Los estudios
enzimáticos han demostrado que los péptidos basados sobre el
producto N-terminal del sitio de escisión NS5A/5B
son inhibidores competitivos de la enzima. Estos péptidos han
servido como punto de partida útil en los esfuerzos de la química
médica para clasificar racionalmente los inhibidores de la NS3
proteasa como compuestos anti-HCV clínicamente
efectivos.
La hepatitis C crónica ha surgido como una
indicación clínicamente importante, un tratamiento efectivo para la
cual tiene todavía que desarrollarse debido a las pobres
velocidades de respuesta de los tratamientos actualmente
existentes. Por ejemplo, el tratamiento estándar de reciente
aprobación, el interferón pegilado en combinación con el Ribavirin,
presenta una velocidad de respuesta sostenida, del 40 al 50%. Sin
embargo, una mayoría de pacientes, todavía no manifiestan una
respuesta antivírica sostenida, en particular contra los genotipos
de HCV resistentes al interferón, 1a y 1b.
Las patentes WO 00/09543, WO 00/09558 y WO
00/59929 (incorporadas a la presente como referencias), describen
ciertos tipos de inhibidores de la NS3 proteasa del HCV que son
altamente activos y selectivos. Estos compuestos tienen el
potencial de convertirse en la próxima generación del tratamiento
anti-HCV. Puede esperarse que estos inhibidores,
así como también muchos otros tratamientos antivíricos den paso a
virus que sean por lo menos parcialmente resistentes a dichos
inhibidores.
El conocimiento de las mutaciones que convierten
el HCV en resistente a los inhibidores proporciona la base para la
identificación de los inhibidores que son efectivos contra dichas
cepas resistentes. Trozzi et al., 2003 ha descrito un
replicón mutante resistente que tiene tres substituciones de
aminoácidos individuales (D168A/Y/V) que convierte la proteasa en
resistente a un inhibidor de la NS3 proteasa.
En consecuencia, en un esfuerzo por desarrollar
un tratamiento con una eficacia a largo plazo, que suprime o
supera la resistencia anti HCV, nosotros describimos unos medios
para identificar los compuestos anti HCV que presentan una
actividad contra las cepas de HCV resistentes a los
inhibidores.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa en un método para
seleccionar una NS3 proteasa de HCV mutante, resistente a los
inhibidores, que comprende los pasos de:
- \bullet
- preparación de una construcción de un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable y una NS3 proteasa de HCV nativa, y transfección de las células anfitrionas con dicha construcción; e
- \bullet
- incubación de las células anfitrionas transfectadas en presencia de un inhibidor de NS3 de HCV en condiciones adecuadas para la selección de las células transfectadas, en donde las colonias que resultan de la incubación en estas condiciones, dan una NS3 proteasa de HCV mutante, resistente a los inhibidores.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro método permite el aislamiento de una NS3
proteasa de HCV mutante, resistente a los inhibidores, en donde el
método descrito más arriba comprende además los pasos de:
- \bullet
- lisis de las células para liberar el ARN y empleo de dicho ARN para producir la proteasa mutante resistente; o lisado de las células para liberar la NS3 proteasa resistente a los inhibidores; y aislamiento de dicha NS3 proteasa resistente a los inhibidores.
\vskip1.000000\baselineskip
A este respecto, la presente invención
proporciona una segunda versión nueva, de preferencia NS3 proteasas
de HCV resistentes a los inhibidores, aisladas.
En otra versión, la presente invención
proporciona ácidos nucleicos recombinantes aislados que codifican
las NS3 proteasas de HCV resistentes a los inhibidores.
De acuerdo con otro aspecto de esta tercera
versión, se proporciona una sonda de nucleótidos capaz de hibridar
en condiciones restrictivas a una secuencia de nucleótidos mutada
como se ha definido en la presente para fines diagnósticos.
En otra versión, se proporcionan los vectores
que se incorporan a los ácidos nucleicos que codifican las NS3
proteasas de HCV resistentes a los inhibidores.
Las células anfitrionas transfectadas con estos
vectores, y las líneas celulares derivadas de las mismas, se
proporcionan en otra versión de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención comprende también un método para la
evaluación de la actividad de la NS3 proteasa de HCV de las NS3
proteasas resistentes a los inhibidores, de acuerdo con la
invención, el cual método comprende los pasos de:
- \bullet
- incubación de las células anfitrionas transfectadas con ácido nucleico que codifica una NS3 proteasa de HCV resistente a los inhibidores, en condiciones que ocasionan que la proteasa se exprese; y
- \bullet
- medición de la replicación del ácido nucleico en las células anfitrionas, en donde el nivel de replicación es proporcional a la actividad de la proteasa expresada.
\newpage
Además, la invención comprende un método para la
identificación de inhibidores potenciales de segunda generación de
la NS3 proteasa de HCV, el cual método comprende:
- \bullet
- incubación de las células anfitrionas transfectadas con ácido nucleico que codifica una NS3 proteasa resistente a los inhibidores en condiciones que ocasionan la expresión de la misma, en ausencia de un candidato de un compuesto inhibidor de segunda generación;
- \bullet
- incubación de células anfitrionas transfectadas con ácido nucleico que codifica una NS3 proteasa resistente a los inhibidores en condiciones que ocasionan la expresión de la misma, en presencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación; y
- \bullet
- medición de la replicación del ácido nucleico en presencia y ausencia del compuesto inhibidor candidato de segunda generación, en donde el nivel de replicación del ácido nucleico es proporcional a la actividad de la proteasa expresada, y en donde una disminución de la actividad de la proteasa en presencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación indica que el compuesto inhibe la proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención comprende también un método para la
identificación de inhibidores potenciales de segunda generación de
la actividad de la NS3 proteasa de HCV, el cual método
comprende:
- \bullet
- incubación de la NS3 proteasa mutante, resistente a los inhibidores, como se ha definido más arriba, en presencia o ausencia de un compuesto inhibidor candidato de segunda generación; y
- \bullet
- medición de la actividad de la proteasa de la NS3 proteasa resistente a los inhibidores, en presencia y ausencia del compuesto inhibidor candidato de segunda generación;
en donde una disminución de la
actividad en presencia de un compuesto inhibidor candidato de
segunda generación indica que el compuesto inhibe la NS3 proteasa
resistente a los
inhibidores.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros objetivos, ventajas y características de
la presente invención serán más evidentes después de la lectura de
la descripción no restrictiva siguiente, de las versiones
preferidas con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:
La figura 1 ilustra el método por el cual se
establece la replicación del ARN de HCV en el cultivo de células
Huh-7;
La figura 2 ilustra el crecimiento de las
células Huh-7 resistentes a la neomicina, en
presencia de un inhibidor de NS3 proteasa a concentraciones que
oscilan entre 2 nM y 2000 nM; y
La figura 3 ilustra el agrupamiento de varias
substituciones de aminoácidos seleccionados con los inhibidores de
la NS3 proteasa, por aminoácidos que están próximos al sitio activo
(gris claro) del dominio de la NS3 proteasa. Los radicales en
blanco indican los identificados en estudios de resistencia y
localizados cerca del inhibidor unido en la estructura cristalina
(estructura descrita en Y.S. Tsantrizos et al., Angew Chemie
v42, 1356).
A no ser que se defina de otra manera, los
términos científicos y tecnológicos y la nomenclatura empleados en
la presente tienen el mismo significado normalmente utilizado por
una persona experta en la técnica ordinaria, a la cual está
invención pertenece. Generalmente, los procedimientos para el
cultivo de células, infección, métodos de biología molecular y
similares son métodos habitualmente empleados en la técnica. Tales
técnicas estándar pueden encontrarse en los manuales de referencia
tales como por ejemplo, Sambrook et al. (2000) y Ausubel
et al., (1994).
Las secuencias de nucleótidos están
representadas en la presente mediante una cadena sencilla, en la
dirección de 5' a 3' de izquierda a derecha, empleando los símbolos
de nucleótidos de una sola letra como se emplean corrientemente en
la técnica y de acuerdo con las recomendaciones de la
IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissión
(1972).
La presente descripción se refiere a un número
de términos de la tecnología recombinante del ADN, empleados
rutinariamente (ADNr). Sin embargo, se proporcionan definiciones de
ejemplos seleccionados de dichos términos de ADNr, en aras de la
claridad y de la lógica.
El término "ADN recombinante", "molécula
de ácido nucleico recombinante" o "plásmido recombinante"
como es conocido en la técnica, se refiere a una molécula de ADN
resultante de la unión de segmentos de ADN. A esto se le llama a
menudo ingeniería genética.
El término "ácido nucleico" como se emplea
con respecto a los segmentos, moléculas o secuencias, se refiere a
una unidad compuesta de nucleótidos, de manera que comprende tanto
moléculas de ADN como moléculas de ARN. Estos segmentos, moléculas
o secuencias pueden ser aislados de fuentes naturales empleando
técnicas ya establecidas en la especialidad, o pueden ser derivados
sintéticamente empleando también técnicas bien establecidas. Cuando
se leen de acuerdo con el código genético, estas secuencias pueden
codificar un tramo lineal o una secuencia de aminoácidos que define
un polipéptido, una proteína o un fragmento de proteína.
El término "ADN" como se emplea con
respecto a segmentos, moléculas o secuencias, se emplea en la
presente para indicar una cadena de nucleótidos, conteniendo cada
uno el azúcar desoxirribosa y una de las cuatro bases, adenina
(A), guanina (G), timina (T) ó citosina (C). El término "ARN"
se refiere a una cadena de nucleótidos conteniendo cada uno el
azúcar ribosa y una de las cuatro bases adenina (A), guanina (G),
uracilo (U) ó citosina (C). Como apreciará un experto en la
técnica, las referencias al ADN que siguen, son aplicables en
general al ARN.
El término "derivado" significa una
modificación que comprende la adición de un grupo químico que
imparte a la NS3 proteasa mutante, ó al ADN que la codifica, una o
más propiedades deseables. Estos grupos químicos, por ejemplo,
pueden impartir una mejor estabilidad (es decir, una semivida
biológica). Estos grupos pueden también emplearse con la finalidad
de una señalización. Grupos capaces de proporcionar estas y otras
propiedades deseables, pueden encontrarse en Remington's The
Science and Practice of Pharmacy ("Ciencia y Práctica de la
Farmacia, de Remington") (1995). Las metodologías para el
acoplamiento de estos grupos a una molécula son ya bien conocidas
en la técnica.
El término "fragmento" se refiere a un
segmento identificado de ADN que codifica la NS3 proteasa mutante
resistente a los inhibidores, ARN ó secuencia de aminoácidos, y/o
un segmento de cualquier variante o derivado del mismo, que
conserva substancialmente la capacidad de codificar una NS3
proteasa resistente a los inhibidores. Estos fragmentos pueden
incluir, pero no están limitados a secuencias 5' ó 3' de nucleótidos
truncados o secuencias terminales de aminoácidos truncados.
El término "vector de expresión" define un
vector similar al descrito más arriba, el cual incorpora
adicionalmente los elementos necesarios para permitir la expresión
de una secuencia insertada después de la transformación o
transfección en un anfitrión. El gen clonado (secuencia insertada)
está normalmente colocada bajo el control de las secuencias del
elemento de control de expresión tales como las secuencias del
promotor. Estas secuencias del control de expresión variarán en
función de si el vector es designado para expresar la secuencia
insertada en un anfitrión procariótico, o eucariótico, o ambos
(vectores lanzadera), y pueden contener adicionalmente, elementos
transcripcionales tales como elementos potenciadores, secuencias de
terminación, elementos de especificidad a tejidos, y/o sitios de
iniciación y terminación de la traducción. Se dice en la presente,
que el ADN/ARN está incorporado "expresivamente" en dicho
vector, e incorporado "expresivamente" dentro de una célula,
cuando se ha logrado con éxito la expresión de una célula.
Por "sistema eucariótico de expresión" se
entiende la combinación de un vector de expresión adecuado y una
línea de células eucarióticas que pueden emplearse para expresar un
gen que interesa. En todos los casos, el vector contendrá los
elementos apropiados de control (promotor) para expresar el gen en
el tipo de célula que interesa. Los tipos de células eucarióticas
empleadas típicamente incluyen las células de levaduras (p. ej.,
Saccharomyces cerevisae, Pischia pastoris) transfectadas con
un vector plásmido; y células de mamíferos transfectadas con
vectores de ADN para una expresión temporal o constitutiva. Una
línea celular preferida útil para la finalidad de esta invención se
deriva del tejido hepático.
Como se emplea en la presente, la expresión
"derivado funcional", en el contexto de derivado funcional de
una secuencia, significa o bien un ácido nucleico, o bien una
secuencia de aminoácidos, una molécula que mantiene una actividad
biológica (bien sea funcional o bien sea estructural) que es
substancialmente similar a la de la secuencia original. En el caso
presente, el derivado funcional significa que la secuencia de
aminoácidos resultante mantiene por lo menos una parte de la
actividad biológica de la NS3 proteasa suficiente para permitir a
la NS3 proteasa que escinda por lo menos una parte, de
preferencia, todos sus substratos naturales es decir, los sitios de
escisión NS3/4A, 4A/4B, 4B/5A y 5A/5B. In vivo, la actividad
NS3 proteasa se mantiene cuando el ARN del HCV ó el virus es capaz
de replicar. Este derivado funcional o equivalente puede ser un
derivado natural o puede ser preparado sintéticamente. Estos
derivados incluyen las secuencias de aminoácidos que tienen
substituciones, supresiones o adiciones de uno o más aminoácidos,
con la condición de que se conserve la actividad biológica de la
proteína. Lo mismo se aplica a los derivados de las secuencias de
ácidos nucleicos que pueden tener substituciones, supresiones o
adiciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que la
actividad biológica de la secuencia sea en general mantenida.
Cuando se refiere a una secuencia de proteína, el aminoácido
substituyente tiene propiedades químico-físicas que
habitualmente, pero no necesariamente, son similares a las del
aminoácido substituido. Las propiedades
químico-físicas similares incluyen similiaridades en
la carga, la masa, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y
similares. Algunas de las substituciones de aminoácidos
conservadoras más comúnmente conocidas incluyen, pero no están
limitadas a:
Leu ó Val ó o Ile; Gly ó Ala; Asp ó Glu; Asp ó
Asn ó His; Glu ó Gln; Lys ó Arg; Phe ó Trp ó Tyr; Val ó Ala; Cys ó
Ser; Thr ó Ser; y Met ó Leu.
La expresión "hibridación en condiciones
restrictivas" como se emplea en la presente, significa en
condiciones que distinguen por lo menos uno o más cambios de
nucleótidos en la secuencia diana.
Como se emplea en la presente, el término
"resistente a los inhibidores" se refiere a una NS3 proteasa
de HCV mutante que mantiene substancialmente la actividad proteasa
en presencia de un compuesto en general conocido por inhibir la
actividad de la NS3 proteasa de HCV nativa. Para una mayor
claridad, "un inhibidor" es un compuesto que inhibe la
escisión de uno o más de los sitios de escisión de la NS3 proteasa,
seleccionados entre: NS3/4A, NS4A/4B, NS4B/5A y NS5A/5B. El término
"aislado", como se emplea en la presente, significa un estado
aislado de la célula, es decir, cualquier extracto exento de
células.
Para una mayor claridad, la NS3 proteasa de HCV
mutante'' se refiere a una NS3 proteasa de HCV que incluye una o
más mutaciones de aminoácidos, tales como modificaciones,
substituciones, supresiones e inserciones de aminoácidos, que no dan
por resultado la eliminación de la actividad de la proteasa. Como
puede ser comprendido por un experto en la técnica, la actividad de
una NS3 proteasa de HCV mutante, puede variar algo respecto a la de
la NS3 proteasa de HCV nativa. Debe comprenderse por los expertos en
la técnica, que la presente invención comprende la NS3 proteasa
mutante resistente a los inhibidores, y de esta manera, no está
limitada a las secuencias específicas de aminoácidos ejemplificados
en la presente. La invención comprende también derivados o
variantes de las presentes NS3 proteasas mutantes, o fragmentos de
las mismas, los cuales presentan resistencia a los inhibidores de
la NS3 proteasa de HCV. Como se ejemplifica en la presente más
adelante, las secuencias de nucleótidos y polipéptidos empleados en
la presente invención pueden ser modificadas, por ejemplo por
mutagénesis in vitro para analizar minuciosamente la relación
catalítica y estructural de las mismas y permitir un mejor diseño e
identificación de las proteínas resultantes.
El término "construcción de ácidos
nucleicos", se refiere a una cadena de ácidos nucleicos
compuesta de secuencias de ácidos nucleicos que normalmente no
coexisten. Una construcción de ácidos nucleicos se prepara
generalmente para una finalidad especifica, y de esta forma, se
incorporan todos los componentes necesarios para lograr dicha
finalidad. Por ejemplo, puede prepararse una construcción de ácidos
nucleicos que codifica una proteína específica la cual incluye los
componentes necesarios para la expresión de dicha proteína bajo
ciertas condiciones. El vector de ADN
que incorpora ADN exógeno, como se describe más adelante, es un ejemplo de una construcción de ácidos nucleicos.
que incorpora ADN exógeno, como se describe más adelante, es un ejemplo de una construcción de ácidos nucleicos.
Se dice que una célula anfitriona o célula
indicadora ha sido "transfectada" mediante un ADN ó ARN
exógeno o heterólogo (p. ej., una construcción de ADN), cuando
dicho ARN ó ADN ha sido introducido en el interior de la célula. El
ARN ó ADN transfectado puede o puede no estar integrado (unido
covalentemente) al ADN cromosómico, completando así el genoma de la
célula. En los procariotas el ADN transfectante/transformante puede
mantenerse sobre un elemento episómico como p. ej., un plásmido.
Por otro lado, en los eucariotas, una célula establemente
transfectada es aquella en la que el ADN transfectante es integrado
en el ADN genómico en los cromosomas y es heredado por las células
hijas a través de la replicación cromosómica. Además, en los
eucariotas, una célula establemente transfectada puede ser una en
la que el ARN transfectado se mantiene como un elemento episómico
tal como p. ej., un replicón. Esta estabilidad se demuestra por la
capacidad de la célula de establecer líneas celulares o clones
comprendidos por una población de células hijas que contienen el
ADN transfectado. Los métodos de transfección son ya bien conocidos
en la técnica como se describe en Sambrook et al., 1989 y
Ausubel et al., 1994.
El término "replicón" como se emplea en la
presente significa una molécula de ARN que puede codificar una o
más moléculas de proteína y se replica a través de una cadena
complementaria intermedia de ARN.
Con el fin de evaluar fácilmente la expresión de
un gen de interés, una célula puede ser transfectada con un gen que
codifica un marcador detectable o proteína "informadora"
junto con el gen de interés de forma que la expresión de la
proteína informadora será indicativa de la expresión del gen que
interesa. El término "gen informador" se refiere a una
secuencia de nucleótidos que codifica dicha "proteína
informadora". Ejemplos de genes informadores habitualmente
empleados incluyen la fosfatasa alcalina segregada (SEAP),
neomicina, luciferasa, cloranfenicol amino transferasa (CAT),
P-galactosidasa y la proteína verde fluorescente
(GFP).
El término "marcador seleccionable" como se
emplea en la presente significa un gen que, cuando se expresa,
convierte a la célula en resistente a un agente de selección como
p. ej., un antibiótico (llamado también presión selectiva).
Los términos "presión selectiva" o
"agente de selección", como se emplean indistintamente en la
presente, significan una molécula o compuesto que, cuando se
presenta a las células que no expresan el marcador seleccionable,
induce la muerte de la célula. Por ejemplo, estos agentes de
selección pueden incluir antibióticos como: G418, higromicina,
zeomicina o puromicina.
El término "variante" significa en el
contexto de esta invención, una NS3 proteasa que presenta
resistencia a los inhibidores como se ha indicado más arriba. Una
variante puede ser de la misma o diferente especie, y puede ser una
variante natural o una variante sintéticamente derivada. Una NS3
proteasa variante, de acuerdo con la presente invención, puede
incorporar una o más substituciones, supresiones o adiciones de
aminoácidos con la condición de que se mantenga la resistencia a
los inhibidores. Las variaciones en la secuencia de nucleótidos que
codifican la presente NS3 proteasa mutante están también
comprendidas, y pueden también incluir substituciones, supresiones
o adiciones de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia con la
condición de que se mantenga la resistencia a los inhibidores de la
proteasa codificada por la secuencia de nucleótidos. La variante,
el derivado y las moléculas fragmento de acuerdo con la presente
invención, incluyendo tanto las moléculas de proteína como de ácido
nucleico, pueden ser obtenidos empleando métodos ya bien conocidos
en la técnica, incluyendo las técnicas de aislamiento/purificación,
síntesis química y tecnología del ADN recombinante.
El término "vector" se refiere a un
compuesto de ácido nucleico empleado para introducir ácidos
nucleicos exógenos al interior de células anfitrionas. Un vector
comprende una secuencia de nucleótidos que pueden codificar una o
más moléculas de proteína. Los plásmidos, cósmidos, virus y
bacteriófagos, en estado natural o que han sido sometidos a
ingeniería genética, son ejemplos de vectores habitualmente
empleados, dentro de los cuales puede insertarse una secuencia o
elemento genético exógenos (bien de ADN, ó bien de ARN), para
ocasionar la replicación de la secuencia o elemento exógeno.
En una primera versión de la presente invención,
se proporciona un método de preparación de una NS3 proteasa de HCV
mutante resistente a los inhibidores.
El método comprende los pasos de preparación de
una construcción de ácidos nucleicos que codifica un marcador
seleccionable y una NS3 proteasa de HCV nativa en donde la
replicación y expresión del marcador seleccionable depende de la
actividad de la NS3 proteasa de HCV. Un ejemplo es el replicón de
HCV. Las células anfitrionas son transfectadas con esta
construcción y se incuban en presencia de un inhibidor de la NS3 a
una presión selectiva y bajo condiciones adecuadas para la
selección de las células transfectadas con éxito. Ejemplos de
marcadores seleccionables están identificados más arriba. El
marcador seleccionable apropiado comunicará a las células
transfectadas con éxito, un crecimiento ventajoso bajo las
condiciones de crecimiento proporcionadas a las células. Las
colonias resultantes de la incubación bajo estas condiciones tienen
incorporada la NS3 proteasa de HCV mutante resistente a los
inhibidores.
Los métodos para el lisado de las células y
aislamiento del ácido nucleico mutante, o la proteasa mutante
finalmente aislada, son bien conocidos por los expertos en la
técnica, o como se describe en los siguientes ejemplos.
La naturaleza de las mutaciones que convierten
las NS3 proteasas mutantes resistentes al inhibidor seleccionado
puede ser identificada fácilmente empleando técnicas estándar de
secuenciación que ya son bien conocidas por los expertos en la
técnica.
Después de la primera identificación de los
mutantes importantes, puede obtenerse una validación mediante una
posterior producción de ácidos nucleicos o proteasas mutantes
similares, mediante mutagénesis inducidas a los sitios mediante
técnicas bien conocidas por una persona experta en la técnica, o
como se describe en los ejemplos siguientes.
La presente invención proporciona, en una
segunda versión, una nueva NS3 proteasa mutante de HCV resistente a
los inhibidores.
Aún sin estar ligadas a ninguna teoría en
particular, en un aspecto de esta versión, las mutaciones a la NS3
proteasa nativa dan como resultado un cambio quizás conformacional
o estérico, que impide o al menos reduce la unión
proteasa-inhibidor de manera que la actividad de la
proteasa se mantiene substancialmente. Particularmente, las
mutaciones en y alrededor de 1-180 aminoácidos de
la proteasa pueden ser mutados de forma que la unión al inhibidor
disminuye. Más particularmente, las mutaciones en y alrededor del
sitio activo o próximas al sitio de unión del inhibidor, pueden ser
mutadas de forma que la unión al inhibidor disminuye.
La proteasa resistente al inhibidor puede ser
mutada por lo menos en una posición de aminoácidos correspondiente
a los aminoácidos 155, 156 ó 168 de la secuencia nativa de la NS3
proteasa de HCV. El aminoácido nativo en la posición 155 es la
arginina (Arg155 ó R155), en la posición 156 es la alanina (A1a156
ó A156), y en la posición 168 está más a menudo en el genotipo 1 un
ácido aspártico (Asp 168 ó D168) aunque el ácido glutámico (Glu ó
E) se ha encontrado también en algunos virus del genotipo 1, ó la
glutamina (Gln ó Q) se encuentra en los virus del genotipo 3. Un
ejemplo de la secuencia nativa de aminoácidos del dominio de la NS3
proteasa de HCV-1b, se muestra en la SEQ ID
No:2.
De acuerdo con un aspecto preferido de la
presente invención, la NS3 proteasa resistente a los inhibidores
tiene por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 155,
156 y 168, que está substituido por un aminoácido que al estado
natural no se encuentra en la NS3 proteasa de HCV en estas
posiciones.
El aminoácido nativo de la posición 155 es la
arginina (Arg^{155} ó R^{155}). De acuerdo con un aspecto
preferido de la presente invención, la NS3 proteasa resistente a
los inhibidores tiene la arginina en la posición 155 substituida
por un aminoácido no básico. La substitución de la Arg^{155}
generalmente con aminoácidos no básicos tal como la glutamina (Q) ó
el triptófano (W) da como resultado una NS3 proteasa resistente a
los inhibidores.
De acuerdo con un aspecto preferido de la
presente invención, la NS3 proteasa resistente a los inhibidores
tiene la alanina de la posición 156 substituida con cualquier otro
aminoácido. En otro aspecto de esta versión, la proteasa resistente
a los inhibidores está mutada en Ala 156 generalmente con
aminoácidos sin carga tales como la glicina (G), treonina (T) o
valina (V), dando como resultado una NS3 proteasa resistente a los
inhibidores. Alternativamente, la proteasa resistente a los
inhibidores está mutada en Ala 156 generalmente con aminoácidos sin
carga que tienen una cadena lateral ligeramente más larga tal como
la treonina (T) ó la valina (V), dando como resultado una NS3
proteasa resistente a los inhibidores.
En otro aspecto de esta versión, la proteasa
resistente a los inhibidores está mutada en el aminoácido de la
posición 168. El aminoácido nativo de la posición 168 es el ácido
aspártico (Asp^{168} ó D^{168}), ácido glutámico (Glu ó E) ó
glutamina (Gin ó Q). De acuerdo con un aspecto preferido de la
presente invención, la NS3 proteasa resistente a los inhibidores
tiene el ácido aspártico/ácido glutámico/glutamina en la posición
168 que está substituido por cualquier otro aminoácido. La
substitución del Asp^{168} generalmente con aminoácidos tales
como la glicina (G), alanina (A), asparagina (N), histidina (H) ó
valina (V) da como resultado una NS3 proteasa resistente a los
inhibidores. De preferencia, la NS3 proteasa resistente a los
inhibidores tiene el ácido aspártico/ácido glutámico/glutamina en
la posición 168 que está substituida con aminoácidos que no tienen
carga, con pequeñas cadenas laterales tales como la glicina (G),
alanina (A), asparagina (N) o valina (V), da como resultado una NS3
proteasa resistente a los inhibidores. Con más preferencia, el
Asp/Glu/Gin 168 está mutado a alanina (A) ó valina (V).
Alternativamente, en otra versión preferida, el Asp/Glu/Gin^{168}
de la NS3 proteasa está substituido con glicina (G), asparagina (N)
ó histidina (H).
En otro aspecto preferido de esta versión, el
Arg^{155} nativo de la NS3 proteasa está substituido con ácido
glutámico.
En un aspecto preferido de esta versión, el
Ala^{156} nativo de la NS3 proteasa está substituido con
valina.
En otra mutación, el Asp^{168} nativo de la
NS3 proteasa está substituido con valina.
En un aspecto preferido de esta versión, por lo
menos el Ala^{156} nativo de la NS3 proteasa está substituido con
valina.
En otro aspecto preferido de esta versión, tanto
el Ala^{156} nativo como el Asp^{168} de la NS3 proteasa están
substituidos con valina.
Otro aspecto de la presente invención abarca un
dominio de la NS3 proteasa que comprende una secuencia que tiene el
90% de identidad con la secuencia mostrada en SEQ ID No.2, en la
cual la secuencia de aminoácidos está mutada como se ha definido
más arriba.
Alternativamente, una cualquiera de las
mutaciones presentadas en las tablas 1,2,3 ó 4 puede conducir a una
NS3 proteasa de HCV mutante resistente a los inhibidores.
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La invención comprende moléculas de ácido
nucleico recombinante que incluyen tanto las moléculas de ADN como
de ARN que codifican las NS3 proteasas resistentes a los
inhibidores de HCV mutantes como se han definido más arriba. Un
ejemplo de la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de la
NS3 proteasa de HCV nativa está descrito en SEQ ID No: 1. Se
abarcan modificaciones en esta secuencia que codifican las NS3
proteasas mutantes resistentes a los inhibidores, como se ha
determinado empleando métodos ya conocidos por los expertos en la
técnica, tales como los ensayos basados en las células descritos en
los ejemplos específicos de la presente, incluyendo variantes,
derivados y fragmentos de los mismos. Estas modificaciones de
secuencias pueden también, por supuesto, incorporar modificaciones
que resultan de la degeneración del código de ácidos nucleicos.
En un aspecto de la presente invención, la
molécula de ácido nucleico codifica una NS3 proteasa de HCV mutante
resistente a los inhibidores, que está modificada por lo menos en
uno de los aminoácidos como se ha definido más arriba.
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La invención abarca construcciones de ácido
nucleico, vectores, replicones y virus que comprenden una molécula
de ácido nucleico que codifica una NS3 proteasa de HCV mutante
resistente a los inhibidores como se ha descrito más arriba.
En un aspecto de esta versión, se preparan
construcciones de ácido nucleico que codifican la NS3 proteasa
resistente a los inhibidores, en las cuales el ácido nucleico que
codifica la proteasa mutante está unido al ácido nucleico que
codifica un marcador seleccionable.
En un aspecto particular de esta versión, el
ácido nucleico que codifica la NS3 proteasa de HCV mutante
resistente a los inhibidores, se incorpora "expresivamente" en
una construcción o vector. Con el fin de lograr la expresión, el
ácido nucleico que codifica la proteasa se une a elementos dentro
de la construcción o vector, que son apropiados para permitir la
expresión del ácido nucleico que codifica la proteasa en la
transfección, establemente o temporalmente, en una célula
anfitriona. Las construcciones y vectores de expresión son ya bien
conocidos por los expertos en la técnica como se ha descrito más
arriba.
Se proporcionan células anfitrionas
transfectadas con un vector de expresión o un replicón que
comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una NS3
proteasa mutante de HCV resistente a los inhibidores, así como
líneas celulares derivadas de dichas células anfitrionas.
En un aspecto de la versión preferida, se
proporcionan sistemas de expresión adecuados y células
procarióticas o eucarióticas para la expresión de la NS3 proteasa
de HCV mutante.
Los aspectos preferidos de esta versión
proporcionan sistemas de expresión en E. coli, baculovirus,
levaduras, así como también en células mamíferas tales como las
células Huh-7.
En un aspecto preferido de esta versión, se
proporciona una célula anfitriona mamífera transfectada con un
vector o un replicón, o infectada con un virus, que contiene una
molécula de ácido nucleico que codifica una NS3 proteasa mutante
resistente a los inhibidores, bien sea establemente o temporalmente.
Ejemplos no limitantes de células anfitrionas mamíferas apropiadas,
y líneas celulares incluyen hepatocitos primarios, líneas celulares
hepáticas, fibroblastos, linfocitos y líneas celulares renales.
En otro aspecto preferido, se proporciona una
línea celular anfitriona humana, que está transfectada con ácido
nucleico que codifica la NS3 proteasa mutante resistente a los
inhibidores. En un aspecto más preferido, la línea celular
anfitriona humana se selecciona entre una línea celular hepática o
renal. Ejemplos de células anfitrionas preferidas incluyen las
células renales embrionarias humanas del linaje 293 (ATCC CRL
1573), células de carcinoma humano incluyendo las del linaje HeLa
(ATCC CCL 2), y células de neuroblastoma de las líneas
IMR-32 (ATCC CCL 127),
SK-N-MC (ATCC HTB 10) y
SK-N-SH (ATCC HTB 11), células
Huh-7, células WRL68, HepG2 y células Chang.
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Se proporciona un método para la evaluación de
la actividad de la NS3 proteasa de una NS3 proteasa de HCV
mutante, de acuerdo con la presente invención.
El método comprende los pasos de incubación de
las células anfitrionas transfectadas con un ácido nucleico que
codifica una NS3 proteasa resistente a los inhibidores en
condiciones que ocasionan que la proteasa se exprese; y la medición
de la replicación del ácido nucleico, en donde el nivel de
replicación es proporcional a la actividad de la proteasa
expresada. Como apreciará un experto en la técnica, el nivel de
replicación así como la actividad de la proteasa puede medirse
(directa o indirectamente) empleando ensayos estándar establecidos
con esta finalidad tales como los ensayos descritos con detalle en
los ejemplos específicos que siguen.
Los métodos para la evaluación de la actividad
de la proteasa incluyen pero no están limitados a, ensayos de
replicón, ensayos basados en la célula suplente, o ensayos
enzimáticos in vitro con NS3 proteasa purificada.
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Se proporciona también un método de selección de
compuestos candidatos inhibidores de segunda generación por la
capacidad de inhibir la actividad de la NS3 proteasa de HCV
mutante, de acuerdo con la presente invención.
En una octava versión de la presente invención,
se proporciona un método para seleccionar compuestos candidatos
inhibidores de segunda generación por la capacidad de inhibir la
actividad de la NS3 proteasa de HCV mutante en un ensayo exento de
células, de acuerdo con la presente invención.
En un aspecto, el método de identificación de
compuestos inhibidores potenciales de segunda generación de NS3
proteasa de HCV comprende la incubación de un mutante aislado de
NS3 proteasa resistente a los inhibidores como se ha definido más
arriba en presencia o ausencia de un compuesto inhibidor candidato
de segunda generación; y la medición de la actividad proteasa de la
NS3 proteasa resistente a los inhibidores en presencia y ausencia
del compuesto inhibidor candidato de segunda generación. Una
disminución de la actividad en presencia de un compuesto inhibidor
candidato de segunda generación, indica que el compuesto inhibe la
NS3 proteasa resistente a los inhibidores.
En otro aspecto, el método de identificación de
compuestos inhibidores potenciales de segunda generación de una NS3
de HCV, comprende la incubación de las células anfitrionas
transfectadas con ácido nucleico que codifica una NS3 proteasa
resistente a los inhibidores en presencia de un compuesto inhibidor
candidato de segunda generación en condiciones que ocasionan la
expresión del mismo; la incubación de las células anfitrionas
transfectadas con ácido nucleico que codifica una NS3 proteasa
resistente a los inhibidores en ausencia de un compuesto candidato
inhibidor de segunda generación en condiciones que ocasionan la
expresión del mismo; y a continuación midiendo la replicación del
ácido nucleico, en donde el nivel de replicación del ácido nucleico
es proporcional a la actividad proteasa en cada caso. Una
disminución en la actividad de la proteasa en presencia de un
compuesto candidato inhibidor de segunda generación indica que el
compuesto candidato inhibe la proteasa.
Los ensayos y métodos basados en células de la
presente invención se efectúan bajo ciertas condiciones para el
crecimiento de células mamíferas que son bien conocidas para una
persona experta en la técnica, es decir, pH fisiológico,
concentraciones de sales empleando tampones como el PBS,
temperaturas entre 30º y 42º, medios apropiados para el cultivo de
las células y proporcionando tiempo suficiente para el crecimiento
de las células. Más específicamente, las células anfitrionas
transfectadas se incuban durante un tiempo suficiente para permitir
la expresión de la NS3 proteasa mutante resistente a los
inhibidores, por ejemplo, un período de incubación de por lo menos
1 hora, pero con más preferencia, un período de incubación de 10
horas hasta aproximadamente 24 horas.
Los ensayos y métodos de la presente invención
se efectúan bajo ciertas condiciones para la medición de la
actividad de la NS3 proteasa, que son bien conocidas por una
persona experta en la técnica, es decir, pH fisiológico,
concentraciones de sales empleando tampones como el Tris, HEPES,
temperaturas entre 15º y 37º, (de preferencia a temperatura
ambiente), una incubación apropiada y técnicas de detección.
Aspectos preferidos de versiones de la presente
invención se describen en los siguientes ejemplos específicos, que
no se exponen como limitantes.
Se empleó el método descrito por Lohmann et
al., (1999, Science 285:110) para simular la replicación del
ARN del HCV subgenómico en un sistema que es dependiente de la
función de las proteínas y enzimas no estructurales del HCV. Este
sistema replicón del ARN de HCV incorpora dos cistrones; uno que
codifica la región no estructural del HCV y el segundo que codifica
un marcador seleccionable resistente a la neomicina (es decir, un
gen que codifica la neomicina fosfotransferasa). Como un experto en
la técnica apreciará, el segundo cistrón puede codificar cualquier
marcador adecuado con la finalidad de una selección. Las líneas
celulares que alojan dichos ARN de HCV bicistrónico, subgenómico,
tales como la línea celular S22.3, están descritos por Kukolj y
Pause (ver la patente WO 02/052015, el contenido de la cual se
incorpora a la presente como referencia). Estas líneas celulares
son útiles para evaluar la eficacia y la potencia de potenciales
productos terapéuticos anti HCV que inhiben una o más de las
proteínas no estructurales del HCV.
El presente método por el cual la replicación
del ARN del HCV se estableció en el cultivo celular, se resume en
la figura 1. Como puede apreciarse, las células
Huh-7 (8x10^{8} células) fueron transfectadas con
el ARN del HCV bicistrónico subgenómico empleando métodos de
transfección bien establecidos en la técnica. Las células
Huh-7 transfectadas se seleccionaron mediante
crecimiento en medios conteniendo neomicina (0,5 mg/ml de
neomicina). Específicamente, las células transfectadas replican el
ARN que produce la neomicina fosfotransferasa con lo cual las
células se convierten en resistentes al efecto citotóxico de la
neomicina. Los replicones de HCV mutados como se describe en la
patente WO 02/052015 pueden también emplearse de acuerdo con el
presente método para aumentar la replicación del ARN y la
eficiencia del establecimiento del replicón.
Brevemente, la selección de las líneas celulares
S22.3 resistentes a los inhibidores de la NS3 proteasa fue como
sigue: las células S22.3 fueron tripsinizadas y resuspendidas en
medio recién preparado (DMEM, 10% en suero bovino fetal) con 1
mg/ml de antibiótio G418. Se plaquearon 150.000 células en una
placa de 6 pocillos. Al día siguiente (t=día O), se añadió al
pocillo, medio recién preparado conteniendo el inhibidor de la NS3
proteasa a una concentración predeterminada y 1 mg/ml de G418.
Después que las células alcanzaran la confluencia el día 3, las
células S22.3 fueron tripsinizadas y se pasaron a una placa de 10
cm. El medio (que contenía el inhibidor y 1 mg/ml de G418) se
cambió el día 6 y el día 10. El día 11 la muerte de las células era
evidente puesto que la mayoría de células habían perdido su
resistencia al G418. El día 14 se cambió el medio recién preparado,
el cual ahora contenía una concentración predeterminada de
inhibidor de NS3 proteasa con 0,5 mg/ml de G418. El medio con el
inhibidor y 0,5 mg/ml de G418 se repusieron el día 17 y el día 20.
Las células que formaron colonias, se picaron el día 21 para su
expansión en placas de 48 pocillos, y las colonias se contaron
fijando y coloreando las células con violeta cristal. Las líneas de
células resistentes se propagaron de 48 pocillos a 24 pocillos a 6
pocillos y superior. El ARN celular total que también contenía el
ARN del replicón del HCV subgenómico se aisló de 1.000.000 de
células (o más) mediante un cartucho y protocolo Qiagen RNeasy®. La
secuencia de HCV se amplificó mediante RT-PCR y la
región NS3 se secuenció con cebadores NS3 específicos.
Específicamente, las colonias de células
neomicina-resistentes, se expusieron a continuación
a un inhibidor conocido de la NS proteasa, específicamente un
inhibidor péptido macrocíclico:
Inhibidor A = ácido
ciclopropa[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazaciclopentadecino-14a(5H)-carboxílico,
6-[[(ciclopentilo-
xi)carbonil]amino]-1,2,3,6,7,8,9,10,11,13a,14,15,16,16a-tetradecahidro-2-[[7-metoxi-2-[2-[(1-metiletil)amino]-4-
tiazolil]-4-quinolinil]oxi]-5,16-dioxo-(2R,6S,12Z,13aS,14aR,16aS),
xi)carbonil]amino]-1,2,3,6,7,8,9,10,11,13a,14,15,16,16a-tetradecahidro-2-[[7-metoxi-2-[2-[(1-metiletil)amino]-4-
tiazolil]-4-quinolinil]oxi]-5,16-dioxo-(2R,6S,12Z,13aS,14aR,16aS),
el cual se describe como el compuesto #822 en la
patente WO 00/59929, el contenido de la cual se incorpora a la
presente como referencia. Las colonias se hicieron crecer en
presencia de concentraciones crecientes de este inhibidor
(EC_{50} de 2 nM) variando de 2 nM hasta 2000 nM.
Las colonias emergentes en presencia de una baja
concentración (6xEC_{50} ó 12 nM) y una alta concentración
(1000xEC_{50} ó 2000 nM) del inhibidor A fueron expandidas
y se secuenció el ARN del replicón por encima de la región NS3/4A
empleando técnicas estándar de secuenciado. Las mutaciones
detectadas en el dominio de la NS3 proteasa tanto en
concentraciones altas como en concentraciones bajas de inhibidor,
están resumidas más adelante en la tabla 1.
Los aminoácidos se nombran con el código de una
letra, el aminoácido nativo de la NS3 de HCV precede al número que
indica su posición en la proteasa, y el aminoácido mutante va a
continuación del número de posición, por ejemplo D168G indica que
el ácido aspártico nativo en la posición 168 está substituido por
glicina en la proteasa mutante.
Los resultados muestran que tuvo lugar una
variedad de mutaciones de aminoácidos en la proximidad del sitio
activo (ver los aminoácidos en negro de la figura 3),
particularmente en colonias aisladas a una baja concentración de
inhibidor. Las mutaciones, alanina por valina o treonina en la
posición 156 (A156V/Y) y ácido aspártico por valina/alanina en la
posición 168 (D168V/A), fueron reiteradamente observadas en colonias
aisladas a alta concentración del inhibidor. En particular, la
mutación A156V fue detectada en un 70% de las colonias secuenciadas
que crecieron en una alta concentración de inhibidor, mientras que
la mutación D168V se detectó en un 20% de las colonias secuenciadas
que crecieron en una alta concentración de inhibidor.
El método descrito más arriba en el ejemplo 1 se
empleó para identificar los mutantes de la NS3 proteasa que tenían
lugar mediante crecimiento en presencia del inhibidor de la NS3
proteasa:
Inhibidor B: ácido ciclopropano
carboxílico,
N[(ciclo-pentiloxi)carbonil]-3-metil-L-valil-(4R)-4-[[2-[2-(acetilami-
no)-4-tiazolil]-7-metoxi-4-quinolinil]oxi]-L-prolil-1-amino-2-etenil-, (1R,2S)-, el cual tiene un EC_{50} de 40 nM.
no)-4-tiazolil]-7-metoxi-4-quinolinil]oxi]-L-prolil-1-amino-2-etenil-, (1R,2S)-, el cual tiene un EC_{50} de 40 nM.
Las colonias emergentes en presencia de bajas
concentraciones (3xEC_{50} ó 120 nM) y altas concentraciones
(50x
EC_{50} ó 2000 nM) de inhibidor fueron expandidas y el ARN del replicón se secuenció por encima de la región NS3/4A empleando técnicas estándar de secuenciación. Las mutaciones detectadas en el dominio de la NS3 proteasa tanto en concentraciones bajas como en concentraciones altas de inhibidor están resumidas más adelante en la tabla 2.
EC_{50} ó 2000 nM) de inhibidor fueron expandidas y el ARN del replicón se secuenció por encima de la región NS3/4A empleando técnicas estándar de secuenciación. Las mutaciones detectadas en el dominio de la NS3 proteasa tanto en concentraciones bajas como en concentraciones altas de inhibidor están resumidas más adelante en la tabla 2.
De nuevo, los resultados muestran que tuvo lugar
una variedad de mutaciones de aminoácidos en la proximidad del
hueco de unión con el inhibidor, particularmente en las colonias
aisladas a una baja concentración del inhibidor, y las mutaciones
individuales, A156V/G, y D168V/N/A/G fueron reiteradamente
observadas en colonias aisladas a baja y alta concentración del
inhibidor. La mutación, A156V, se detectó en un 80% de las colonias
secuenciadas que crecieron a alta concentración del inhibidor
mientras que la mutación D168V fue detectada en un 20% de las
colonias secuenciadas que crecieron en una alta concentración del
inhibidor.
El método descrito más arriba en el ejemplo 1 se
empleó conjuntamente con el inhibidor de la NS3 proteasa:
Inhibidor C: = ácido
ciclopropa[e]pirrollo[1,2-a][1,4]-diazaciclopentadecino-14a(5H)-carboxílico,
2-[[2-[2-(ace-
til-amino)-4-tiazolil]-7-metoxi-4-quinolinil]oxi]-6-[[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]amino]-1,2,3,6,7,8,9,10,11,13a,14,15,
16,16a-tetradecahidro-5,16-dioxo-, (2R,6S,12Z,13aS,14aR,16aS)-,
til-amino)-4-tiazolil]-7-metoxi-4-quinolinil]oxi]-6-[[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]amino]-1,2,3,6,7,8,9,10,11,13a,14,15,
16,16a-tetradecahidro-5,16-dioxo-, (2R,6S,12Z,13aS,14aR,16aS)-,
el cual se describe también como compuesto #702
en la patente WO 00/59929 (incorporada a la presente como
referencia) el cual tiene un EC_{50} de 5 nM.
Las colonias emergentes en presencia de bajas
concentraciones (6xEC_{50} ó 30 nM) concentraciones intermedias
(20xEC_{50}, 100 nM), y altas concentraciones (100xEC_{50} 500
nM y 200xEC_{50}, 1000 nM) de inhibidor, fueron expandidas y el
ARN del replicón se secuenció por encima de la región NS3/4A
empleando técnicas estándar de secuenciación. Las mutaciones
detectadas en el dominio de la NS3 proteasa a diferentes
concentraciones están resumidas más adelante en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que tienen lugar una
variedad de mutaciones de aminoácidos en las proximidades del sitio
activo, y las mutaciones A156V/T y D168V/A/G se observan
reiteradamente.
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La línea celular R3 se derivó de S22.3 y
contiene un replicón de HCV bicistrónico con mutaciones que
confieren adaptabilidad a replicar en células Huh7 (patente WO
02/052015 incorporada a la presente como referencia). El
inhibidor A descrito más arriba en el ejemplo 1 se empleó para
identificar los mutantes de la NS3 proteasa en las líneas celulares
R3.
Las colonias emergentes en presencia de 7,5 nM y
700 nM del inhibidor A fueron expandidas, y el ARN del
replicón se secuenció más arriba de la región NS3/4A empleando
técnicas estándar de secuenciación. Las mutaciones detectadas en el
dominio de la NS3 proteasa en ambas concentraciones están
resumidas en la tabla 4.
Los resultados muestran que tienen lugar un
número seleccionado de mutaciones de aminoácidos en las
proximidades del sitio activo. Las mutaciones individuales del
ácido aspártico con, o bien valina (D168V), ó bien alanina (D168A),
ó bien glicina (D168G), fueron observadas con mayor frecuencia a
una concentración baja de inhibidor, mientras que la D168V se
observó con mayor frecuencia a una concentración alta de
inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc del replicón subgenómico de HCV
isogénico específico, que individualmente contienen solamente una
de las mutaciones resistente a los inhibidores, es decir, (en este
ejemplo: A156T; ó A156V; ó D168V; ó D168G) fueron clonados y se
generaron en correspondencia, los ARN transcritos in vitro
de estos replicones bis-cistrónicos modificados.
Los ARN que codifican mutantes se emplearon para construir líneas
celulares de replicones conteniendo mutantes en células
Huh-7 no cebadas como se ha descrito previamente
para otros replicones de HCV. Cada una de estas líneas celulares de
replicones individuales, se emplearon a continuación para confirmar
la disminución de la inhibición que presenta el inhibidor A
de la NS3 proteasa sobre los mutantes NS3. Se emplearon también
para determinar el nivel de inhibición de las líneas celulares
resistentes a los inhibidores mutantes, en presencia de un
inhibidor no afín de la NS5B polimerasa de HCV o de
alfa-interferón. Empleando el ensayo descrito en la
patente WO 03/010141 (Ejemplo 48), se determinó el EC_{50} de
cada inhibidor empleando líneas celulares mutantes. Los resultados
de estos experimentos están resumidos a continuación en la Tabla
5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se hace notar que cada uno de estos cuatro
mutantes cambia solamente la potencia de los inhibidores afines de
la NS3 proteasa, y no tienen ningún efecto sobre el EC_{50} de un
inhibidor no afín de la NS5B polimerasa de HCV ó de
interferón-alfa. Los mutantes D168V y A156T son más
perjudiciales la mayoría de las veces, para esta clase de
inhibidores de la NS3 proteasa, cambiando la potencia EC_{50} del
cultivo celular hasta 700 veces más.
El ADN que codifica la región de codificación
NS3-NS4A del genotipo 1b de HCV, que incluye una
secuencia N-terminal de 28 residuos que contienen
una hexahistidina tag y una escisión TEV proteasa (Pause, A.
et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:
20374-20380), se amplificó mediante una PCR y a
continuación se subclonó en el vector de expresión bacteriano
pET11a. Las substituciones de aminoácidos A156T y D168V se
introdujeron en la región que codifica las NS3-NS4A,
empleando procedimientos estándar de mutagénesis inducidas en el
sitio.
Alternativamente, la región codificadora de la
NS3 proteasa (1-180) para el tipo salvaje con la
secuencia ASKKKK del terminal C, se clonó en un vector de expresión
bacteriano y las substituciones de aminoácidos A156T, D168V y R155Q
se introdujeron como se ha descrito más arriba.
El dominio de la NS3 proteasa (que aloja las
mutaciones A156T, D168V ó RI55Q) fueron expresadas en E.
coli y purificadas como se ha descrito anteriormente (La
Plante, S.R. et al (1999) J. Biol. Chem. 274:
18618-18624). Las proteínas
NS3-NS4A con la mutación A156T ó bien con la
mutación D168V fueron también expresadas en E. coli, y la
pasta de células se resuspendió en 5 ml de tampón de lisis (50 mM
de fosfato de sodio, pH 7,5, 20% de glicerina, 1 mM de EDTA, 0,5%
de Triton X-100, 0,5 M de NaCl) por gramo de
células, se trató con DNasaI, a continuación se clarificó durante
30 minutos de centrifugación a 150.000xg; el sobrenadante se diluyó
2 veces en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,5, 0,5 M de NaCl y se
añadió imidazol a una concentración final de 25 mM. La solución del
complejo NS3-NS4A se purificó por sucesivos pasos en
una columna quelante de Hi-Trap Ni^{+2}, y una
columna de afinidad poli(U)-sefarosa
previamente equilibrada en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,0, 10%
de glicerina, 0,2 M de NaCl, 0,05% de
n-dodecil-\beta-D-maltosido,
10 mM de \beta-mercaptoetanol. La enzima se eluyó
en el mismo tampón conteniendo 2M de NaCl. Las enzimas aisladas se
almacenaron a -80ºC.
Determinación de K_{i} - La constante
de inhibición (K_{i}) se determinó empleando el substrato
depsipéptido fluorogénico
antranilil-DDIVAbu[C(O)-O]AMY(3-NO_{2})TW-OH.
La reacción de escisión se monitorizó continuamente a 23ºC mediante
un fluorómetro BMG POLARstar® Galaxy, equipado con filtros de
excitación y emisión de 320 y 405 nm respectivamente. Se ensayaron
la NS3 proteasa tipo salvaje y el mutante (5-20 nM)
en 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 30% de glicerina, 1
mg/ml de BSA, 1 mM de TCEP en presencia de un exceso molar de 1000
veces el NS4A_{péptido}. Se efectuó una preincubación de 15
minutos para permitir la formación del complejo NS3
proteasa-NS4A_{péptido}. Se ensayaron las
proteínas NS3-NS4A (5-20 nM) en 50
MM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,25 M de citrato de sodio,
0,01% de
n-dodecil-\beta-D-maltosido,
1 mM de TCEP. La velocidad inicial de la reacción inhibida se
determinó a diferentes concentraciones de inhibidor
(correspondientes a un margen de inhibición del
25-75%), variando la concentración del substrato
(típicamente, de 0,1 a 5,0 K_{m}), asumiendo la cinética
Michaelis-Menten. La reacción se inició mediante la
adición de enzima. Los cálculos de K_{i} se efectuaron mediante
el análisis de regresión no lineal de los datos de la velocidad
inicial empleando el programa GraFit (versión 3.0,
Erithacus®Software Ltd., Staines, Reino Unido). Algunos valores de
K_{i} se calcularon a partir del IC_{50} (50% de concentración
efectiva) basados en la siguiente ecuación para la inhibición
competitiva: IC_{50} = 0,5E_{i} + K_{i}(1 + S/K_{m}).
Los IC_{50} se obtuvieron a partir del ajuste de una curva no
lineal empleando el modelo de Hill aplicado a los datos del % de
concentración de la inhibición y se calcularon empleando el
programa SAS (Statistical Software System, SAS Institute Inc.,
Cary, N.C.).
Los resultados mostrados en las tablas 6 y 7
resumen la sensibilidad in vitro de algunos inhibidores de
la NS3 proteasa (según se observó en los valores K_{i}) para la
NS3 proteasa WT frente al inhibidor-mutante
resistente en forma de, o bien la proteína NS3/NS4A de longitud
completa (tabla 6) ó bien el complejo péptido
NS3-NS4A (tabla 7). Hay que hacer notar que el
cambio de valores K_{i} para el inhibidor A, (es decir el
K_{i} obtenido con las enzimas mutantes relativas a la enzima
tipo salvaje) es similar al cambio observado en EC_{50} con este
inhibidor en el ensayo de cultivo celular (tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto E tiene la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto F tiene la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos anteriores se ha descrito un
método para la selección de los ARN subgenómicos de HCV que
replican en presencia de varios inhibidores de la NS3 proteasa de
HCV. Este método para el aislamiento de los replicones de HCV que
son resistentes a los inhibidores de la NS3 proteasa, permite la
identificación y predicción de las substituciones de nucleótidos y
aminoácidos que pueden conferir un mayor crecimiento del virus HCV
en presencia de estos inhibidores, inhibidores afines y
efectivamente, cualquier otro conocido o futuro inhibidor de HCV,
particularmente los inhibidores de NS3 proteasa que inhiben la
enzima mediante el mismo mecanismo o unión a la misma
región/hueco.
El conocimiento a priori de las
mutaciones que convierten al HCV en resistente a los inhibidores de
la NS3 proteasa, proporciona la base para la identificación de los
inhibidores que serán efectivos contra dichas cepas resistentes, por
ejemplo, empleando ensayos in vitro de alto rendimiento que
reconstituyen las actividades de las enzimas o proteínas de HCV
resistentes. Las NS3 proteasas de HCV mutantes (alojando cada una
de las mutaciones descritas en la presente) que mantienen la
actividad pero que no son inhibidas por los inhibidores de
"primera generación" son valiosas herramientas para la
identificación de los inhibidores de segunda generación que pueden
ser necesarios en una terapia de combinación de múltiples fármacos
para el tratamiento de la infección por HCV.
Ausubel et al., 1994,
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York
Gale Jr. et al., 1997,
Virology 230, 217
Kim JL. et al. 1996,
Cell. 87:343-355
Kukolj y Pause, WO 021052015
Lehmann et al., 1999,
Science 285:110
Love, RA. et al., 1996,
Cell, 87, 331-342
Reed et al., 1997, J.
Virol. 71, 7187
Remington, 1995, The Science and
Practice of Pharmacy
Sambrook et al., 2000,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Trozzi et al., 2003 J.
Virol, 77, 3669-3679 (corresponds to Migliacco
et al., 2002, Selection and Characterization of HCV Replican
Mutants; Resistant to Antiviral Agents., Abst. 9th International
Meeting of HCV and Related Viruses, Jul 7-11, La
Jolla, California).
<110> Boehringer Ingelheim International
GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NS3 proteasa de HCV resistente a los
inhibidores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 13/109WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 60/421,943
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-10-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 540
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HCV péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HCV péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Una NS3 proteasa de HCV que comprende una
secuencia de aminoácidos como está numerada de acuerdo con SEQ ID
No. 2, en la cual la secuencia de aminoácidos está mutada por lo
menos en las posiciones 155 ó 156 de la NS3 proteasa de HCV nativa,
en donde la posición 155 de los aminoácidos está substituida con
glutamina o triptófano, o en donde el aminoácido en la posición 156
está substituido con glicina, treonina o valina.
2. La proteasa de HCV de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el aminoácido de la posición 156 es la
valina.
3. Una NS3 proteasa de HCV, de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende
la SEQ ID No.2, y comprende además una o más mutaciones
seleccionadas del grupo formado por: R155Q; R155W; A156G; A156T; y
A156V.
4. Una NS3 proteasa de HCV resistente a los
inhibidores, de acuerdo con las reivindicaciones
1-3, que comprende además una o más mutaciones
seleccionadas del grupo formado por: Q80R; y S122R.
5. Una NS3 proteasa de HCV resistente a los
inhibidores, de acuerdo con las reivindicaciones
1-4, que comprende además una o más mutaciones
seleccionadas del grupo formado por: S20N; R26K; Q28R; A39T; Q41R;
I71V; Q86R; P89L; P89S; S101N; A111S; P115S; L144F; A150V; V158L;
E176K; y T178S; M179I; M179V y M179T.
6. Una NS3 proteasa de HCV resistente a los
inhibidores, la cual es por lo menos un 90% idéntica a la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID No.2, comprendiendo dicha NS3 proteasa de
HCV resistente a los inhibidores, una o más mutaciones
seleccionadas del grupo formado por R155Q; R155W; A156G; A156T y
A156V.
7. Una NS3 proteasa de HCV resistente a los
inhibidores, de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende
además una o más mutaciones seleccionadas del grupo formado por:
Q80R; y S122R.
8. Una NS3 proteasa de HCV resistente a los
inhibidores, de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, que comprende
además una o más mutaciones seleccionadas del grupo formado por
S20N; R26K; Q28R; A39T; Q41R; I71V; Q86R; P89L; P89S; S101N; A111S;
P115S; L144F; A150V; V158L; E176K; y T178S; M179I; M179V y
M179T.
9. Un ácido nucleico recombinante que codifica
una NS3 proteasa de HCV resistente a los inhibidores, de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un vector que codifica una NS3 proteasa de
HCV resistente a los inhibidores, de acuerdo con las
reivindicaciones 1-8, unido a un ácido nucleico que
codifica un marcador seleccionable.
11. Una célula anfitriona transfectada con el
vector, como se define en la reivindicación 10.
12. Un método para la evaluación de la actividad
de la NS3 proteasa de HCV de la NS3 proteasa resistente a los
inhibidores, el cual método comprende los pasos de:
\bullet incubación de las células anfitrionas
como se ha definido en la reivindicación 11, en condiciones que
ocasionan que dicha proteasa se exprese; y
\bullet medición del nivel de expresión de
dicho marcador seleccionable;
en donde el nivel del marcador
seleccionable es proporcional a la actividad de dicha proteasa
expresada.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Un método para la identificación de un
potencial inhibidor de segunda generación de la actividad de la NS3
proteasa de HCV, el cual comprende:
\bullet incubación de las células anfitrionas
como se ha definido en la reivindicación 11, en condiciones que
ocasionan la expresión de dicha proteasa resistente a los
inhibidores, en ausencia de un compuesto inhibidor candidato de
segunda generación;
\bullet incubación de dichas células
anfitrionas en condiciones que ocasionan la expresión de dicha
proteasa resistente a los inhibidores, en presencia de un compuesto
inhibidor candidato de segunda generación; y
\bullet medición del nivel de expresión de
dicho marcador seleccionable en presencia y ausencia de dicho
compuesto inhibidor candidato de segunda generación, en donde el
nivel del marcador seleccionable es proporcional a la actividad de
dicha proteasa expresada, y en donde una disminución de la
actividad de dicha proteasa en presencia de un compuesto inhibidor
candidato indica que dicho compuesto inhibe la proteasa.
\newpage
14. Un método para la identificación de un
potencial inhibidor de segunda generación de la actividad de la NS3
proteasa de HCV, el cual comprende:
\bullet incubación de una NS3 proteasa mutante
resistente a los inhibidores como se ha definido en una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, en presencia o ausencia de un
compuesto inhibidor candidato de segunda generación; y
\bullet medición de la actividad de la
proteasa de dicha NS3 proteasa resistente a los inhibidores en
presencia y ausencia de dicho compuesto inhibidor candidato de
segunda generación;
en donde una disminución de la
actividad de dicha proteasa en presencia de un inhibidor candidato
de segunda generación, indica que dicho compuesto inhibe dicha NS3
proteasa resistente a los
inhibidores.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005000308A2 (en) * | 2003-05-15 | 2005-01-06 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying hcv ns5b polymerase inhibitors and use against hepatitis c |
| WO2005042570A1 (en) * | 2003-10-27 | 2005-05-12 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hcv ns3-ns4a protease resistance mutants |
| ATE461209T1 (de) | 2004-01-30 | 2010-04-15 | Medivir Ab | Hcv ns-3 serine protease inhibitoren |
| AU2006235438A1 (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Achillion Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions for and methods of inhibiting HCV replication |
| US7465537B2 (en) * | 2005-05-01 | 2008-12-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compounds and methods for inhibiting hepatitis C virus replication |
| US20070128625A1 (en) * | 2005-07-25 | 2007-06-07 | Gilead Sciences, Llc | Drug-resistant mutants of hepatitis C virus |
| PE20070211A1 (es) | 2005-07-29 | 2007-05-12 | Medivir Ab | Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c |
| US7705138B2 (en) | 2005-11-11 | 2010-04-27 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hepatitis C virus variants |
| EP2392589A3 (en) | 2005-11-11 | 2012-06-20 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hepatitis C virus variants |
| EP2121991A2 (en) | 2006-10-20 | 2009-11-25 | Innogenetics N.V. | Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns3/4a genomic region |
| WO2008112108A1 (en) * | 2007-03-09 | 2008-09-18 | Merck & Co., Inc. | In vivo hcv resistance to anti-viral inhibitors |
| US8298541B2 (en) | 2007-03-29 | 2012-10-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Live attenuated virus vaccines for La Crosse virus and other Bunyaviridae |
| CA3059768A1 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | President And Fellows Of Harvard College | Continuous directed evolution of proteins and nucleic acids |
| AU2011348204B2 (en) | 2010-12-22 | 2017-03-02 | President And Fellows Of Harvard College | Continuous directed evolution |
| WO2013006722A1 (en) * | 2011-07-06 | 2013-01-10 | Gilead Sciences, Inc. | Hcv genotype 3 replicons |
| MX2014000123A (es) | 2011-07-06 | 2014-02-17 | Gilead Sciences Inc | Replicones de genotipo 4 de hcv. |
| US10179911B2 (en) | 2014-01-20 | 2019-01-15 | President And Fellows Of Harvard College | Negative selection and stringency modulation in continuous evolution systems |
| US10920208B2 (en) | 2014-10-22 | 2021-02-16 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of proteases |
| WO2016168631A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Vector-based mutagenesis system |
| US10392674B2 (en) | 2015-07-22 | 2019-08-27 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of site-specific recombinases |
| US11524983B2 (en) | 2015-07-23 | 2022-12-13 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of Bt toxins |
| WO2017019895A1 (en) | 2015-07-30 | 2017-02-02 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of talens |
| US11447809B2 (en) | 2017-07-06 | 2022-09-20 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of tRNA synthetases |
| WO2019056002A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | President And Fellows Of Harvard College | CONTINUOUS EVOLUTION FOR STABILIZED PROTEINS |
| US11913044B2 (en) | 2018-06-14 | 2024-02-27 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of cytidine deaminases |
| AU2020252001A1 (en) | 2019-03-29 | 2021-10-21 | Trustees Of Boston University | Chimeric antigen receptor (CAR) modulation |
| WO2022020431A2 (en) | 2020-07-21 | 2022-01-27 | Trustees Of Boston University | Inducible control of gene expression |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5843752A (en) * | 1995-05-12 | 1998-12-01 | Schering Corporation | Soluble active hepatitis C virus protease |
| IT1277914B1 (it) * | 1995-08-22 | 1997-11-12 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Procedimento per produrre - in forma pura e in quantita' elevate - polipeptidi con l'attivita' proteolitica della proteasi ns3 di hcv, e |
| US5990276A (en) * | 1996-05-10 | 1999-11-23 | Schering Corporation | Synthetic inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease |
| US6608027B1 (en) * | 1999-04-06 | 2003-08-19 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd | Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus |
| UA74546C2 (en) * | 1999-04-06 | 2006-01-16 | Boehringer Ingelheim Ca Ltd | Macrocyclic peptides having activity relative to hepatitis c virus, a pharmaceutical composition and use of the pharmaceutical composition |
| US6326137B1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-12-04 | Schering Corporation | Hepatitis C virus protease-dependent chimeric pestivirus |
| US20050074465A1 (en) * | 1999-11-24 | 2005-04-07 | Michael Houghton | HCV fusion proteins with modified NS3 domains |
| US6986892B1 (en) * | 1999-11-24 | 2006-01-17 | Chiron Corporation | Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides |
| WO2002052015A2 (en) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Self-replicating rna molecule from hepatitis c virus |
| WO2002068933A2 (en) * | 2001-02-28 | 2002-09-06 | The Scripps Research Institute | Small molecule design against drug resistant mutants using directed evolution |
| WO2005042570A1 (en) | 2003-10-27 | 2005-05-12 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hcv ns3-ns4a protease resistance mutants |
-
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