ES2300262T3 - Sistema basado en celulas sustitutivas y metodo ara analizar la actividad de la proteasa ns3 del virus de la hepatitis c. - Google Patents
Sistema basado en celulas sustitutivas y metodo ara analizar la actividad de la proteasa ns3 del virus de la hepatitis c. Download PDFInfo
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Abstract
Un sistema basado en células experimentales para evaluar la actividad proteasa de la proteasa NS3 del virus de la Hepatitis C que comprende: a) una primera molécula de DNA quimérica que comprende: i) un sistema promotor no citopático capaz de inducir la expresión de dicha primera quimera después de la transfección a una célula de mamífero; ii) una molécula de DNA del VHC funcionalmente unida a dicho sistema de expresión, que dicha molécula de DNA del VHC se define por los nucleótidos 1 a 4206 del NeM. ID. SEC.:1; y iii) y un dominio transactivador fusionado a 3'' de dicha molécula de DNA del VHC. Este dominio transactivador codifica una molécula transactivadora capaz de iniciar la expresión de un gen indicador donde dicho transactivador es el transactivador de la tetraciclina (tTA) definido por los nucleótidos 4207 a 5211 del NeM. ID. SEC.:1; y b) una segunda molécula de DNA quimérica que codifica dicho gen indicador co-unido a un operón que responde a dicha molécula transactivadora; donde la expresión de dicha primera molécula de DNA quimérica lleva a la producción de una poliproteína de fusión anclada al retículo endoplasmático de dicha célula de mamífero. Esta proteína anclada se puede cortar por dicha proteasa permitiendo de ese modo la translocación de dicho dominio transactivador para inducir la expresión de dicho gen indicador como un modo de evaluar dicha actividad proteasa.
Description
Sistema basado en células sustitutivas y método
para analizar la actividad de la proteasa NS3 del virus de la
hepatitis C.
La presente invención está relacionada con un
sistema de cultivo de células de mamífero y un método para analizar
la actividad de la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) y
la inhibición de la misma. Más particularmente, esta invención está
relacionada con una molécula recombinante, un sistema de análisis de
células huésped de mamífero transfectadas y un método para medir la
actividad de la proteasa NS3 y la inhibición de la misma mediante
compuestos anti-VHC candidatos.
El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal
microorganismo en el mundo causante de la hepatitis
no-A no-B adquirida por contagio o
postransfusional. Se estima que más de 100 millones de personas en
todo el mundo están infectadas por el virus. Un alto porcentaje de
portadores desarrollan una infección crónica y muchos progresan
hacia una enfermedad hepática crónica, la llamada hepatitis C
crónica. Este grupo tiene a su vez un alto riesgo de sufrir
enfermedades hepáticas serias como la cirrosis hepática, el
carcinoma hepatocelular y enfermedades hepáticas terminales que
acarrean la muerte. El mecanismo mediante el cual el VHC establece
la persistencia viral y causa un elevado índice de enfermedades
hepáticas crónicas no se ha aclarado del todo. No sé sabe cómo el
VHC interacciona con y evade el sistema inmunitario de los
huéspedes. Además, los papeles de las respuestas inmunes celular y
humoral en la protección contra la infección por el VHC y la
enfermedad todavía no se han determinado.
Se han llevado a cabo varias investigaciones
clínicas con el objetivo de identificar los compuestos farmacéuticos
capaces de tratar eficazmente la infección por el VIH en pacientes
afectados por la hepatitis C crónica. Estos estudios han implicado
el uso del interferón-alfa, solo y en combinación
con otros fármacos antivirales como la ribavirina. Tales estudios
han demostrado que un número substancial de los participantes no
respondían a estas terapias, y una gran proporción de los que
respondían de forma favorable presentaron recaída después de
terminar del tratamiento. Hasta la fecha, no hay compuestos
antivirales ampliamente eficaces para el tratamiento de la
infección por el VHC.
El VHC es un virus de RNA de cadena positiva
envuelto de la familia Flaviviridae.
El genoma de RNA del VHC de cadena simple tiene
aproximadamente 9500 nucleótidos de longitud y tiene un marco de
lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés), que codifica una
poliproteína grande única de alrededor de 3000 aminoácidos. En las
células infectadas, las proteasas celulares y virales cortan esta
poliproteína en múltiples sitios para producir proteínas
estructurales y no estructurales (NS, por sus siglas en inglés).
Las proteínas estructurales (C, E1, E2 y
E2-p7) comprenden los polipéptidos que constituyen
la partícula vírica. Las proteínas no estructurales (NS2, NS3,
NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) codifican las enzimas o factores accesorios
que catalizan y regulan la replicación del genoma de RNA del VHC.
Las proteasas de la célula huésped catalizan el proceso de las
proteínas estructurales. Dos proteasas codificadas por el virus
catalizan la generación de las proteínas no estructurales maduras.
La primera es la metaloproteasa NS2-3 dependiente de
zinc, que auto-cataliza la liberación de la
proteína NS3 a partir de la poliproteína. La NS3 liberada contiene
un dominio serin-proteasa en el extremo
N-terminal y cataliza las escisiones restantes de la
poliproteína. La proteína NS4A liberada tiene al menos dos papeles.
Primero, formar un complejo estable con la proteína NS3 y ayudar en
la localización del complejo NS3/NS4A en la membrana (Kim et
al., 1999) y segundo, actuar como cofactor en la actividad de
la proteasa NS3. Este complejo asociado a membrana, a su vez
cataliza el corte de los sitios restantes en la poliproteína,
efectuando así la liberación de NS4B, NS5A y NS5B. El segmento
C-terminal de la proteína NS3 también tiene una
actividad nucleósido trifosfatasa y RNA helicasa. La NS5B es una
polimerasa de RNA dependiente de RNA que está implicada en la
replicación del VHC.
Los 180 aminoácidos del extremo
N-terminal de la proteína NS3 codifican una
serin-proteasa de tipo tripsina que media el primer
paso del auto-escisión de NS3/4A. El complejo
NS3/NS4A asociado a la membrana después corta las uniones NS4A/4B,
NS4B/5A, y NS5A/NS5B para liberar las enzimas que se consideran
esenciales para la replicación viral. La formación del complejo
NS3/NS4A es un paso importante en el tratamiento secuencial en
dirección 3' de la poliproteína. La proteína NS3 es la proteína del
VHC más ampliamente caracterizada. Se han descrito parámetros
cinéticos para la escisión de todos los sitios de procesamiento. Se
han cristalizado independientemente ambos dominios, la proteasa
N-terminal y la helicasa C-terminal,
y existen modelos tridimensionales de alta resolución de estas
estructuras.
La actividad proteasa NS3 es un objetivo
atractivo para el descubrimiento de fármacos. Los estudios
enzimáticos han demostrado que los péptidos basados en el producto
N-terminal del sitio de escisión NS5A/5B son
inhibidores competitivos de la enzima. Estos péptidos han servido
como un punto de partida útil en los intentos de la química médica
para diseñar de un modo racional inhibidores de la proteasa NS3 como
compuestos anti-VHC clínicamente eficaces.
Debido a la alta incidencia del VHC y a las
consecuencias de la infección por VHC, encontrar compuestos
terapéuticos contra el VHC se ha convertido en una tarea
importante. Con este fin, los esfuerzos para descubrir compuestos
contra el VHC han requerido el desarrollo de sistemas de análisis
para el cribado y la selección de compuestos
anti-VHC.
Hasta la fecha, no se dispone de un sistema de
replicación de cultivo celular oportuno. Esta deficiencia ha
restringido la mayoría de cribados de inhibidores del VHC a ensayos
enzimáticos in vitro y ensayos indirectos basados en células
sustitutivas (Lohmann et al. (1999). Esto ha limitado
severamente la evaluación del potencial de los compuestos
anti-VHC potenciales en un cultivo celular.
Hirowatari et al. (1995) describe la
co-transfección de un primer plásmido que contiene
el dominio NS2/NS3 fusionado al sitio de escisión de NS5A/NS5B
(sustrato de NS3) y el transactivador Tax1, y un segundo plásmido
que contiene un gen indicador, la expresión del cual es dependiente
de la transactivación de Tax 1. El sitio NS5A/5B se escinde mediante
la actividad proteasa de NS2 o NS3 expresados liberando así Tax 1
para transactivar el gen indicador del segundo plásmido. De este
modo, la cantidad de gen indicador expresado es una medida de la
actividad proteolítica de NS2 o NS3. Uno de los inconvenientes es
que este sistema no diferencia las actividades de la metaloproteasa
NS2 y de la proteasa NS3. Además, este sistema no permite medir de
la actividad proteasa de la proteína NS3 cuando forma un complejo
con el dominio NS4A, un complejo que aumenta la especificidad de la
proteasa. Esta prueba tampoco permite medir la actividad proteasa
en un sistema que es más cercano al contexto natural del
tratamiento de las proteínas. Finalmente, otro inconveniente reside
en el hecho de que este sistema es
semi-cuantitativo, siendo así no adecuado para el
cribado de alto rendimiento cuantitativo.
Overton, H. Et al. (1995), enseñan una
actividad NS3 de VHC expresada en baculovirus en células de
insectos. Se describe una serie de construcciones de baculovirus
diseñadas para expresar la actividad proteasa NS3 y distintos
sustratos. Las construcciones que codifican NS2/NS3 parcial y
NS3/NS4S/NS4B se transfectan a una línea celular de insecto.
Construcciones virales adicionales que codifican de NS3 a NS5A y
NS5A/5B se transfectan solas o junto con una de las construcciones
de arriba. Los productos expresados y cortados se visualizan
inmunológicamente mediante análisis Western. Algunas de las
deficiencias de este sistema se relacionan con el uso de una línea
celular de insecto en lugar de una línea celular de mamífero, así
como el requerimiento de una infección viral, un evento que puede
además alterar las funciones normales de la célula. Este sistema
también utiliza el sistema de expresión de la polimerasa T7, un
sistema que no es necesario para el sistema de la presente
invención. Además, el método para la detección de los productos de
la escisión es largo, difícil de cuantificar con precisión y no
susceptible de una escala de rendimiento alta.
Song et al., (1996) describieron un
sistema de análisis de proteasa utilizando una proteína de fusión
lexA-GAL4 en levadura. Los autores describen la
inserción de la proteasa NS3 y el sitio de escisión entre el
dominio de unión a DNA de lexA y el dominio de activación de la
transcripción de la GAL4. La escisión de este sitio por la proteasa
NS3 vuelve GAL4 inactiva transcripcionalmente inhabilitando la
levadura transformada a sintetizar la
\beta-galactosidasa. Este sistema no tiene NS4A y
no reproduce el tratamiento en el contexto de la poliproteína del
VHC.
Cho, Y.G. et al., (1997), enseñan un
ensayo utilizando el sistema de replicación viral de sindbis. Esta
construcción vírica híbrida codifica la región proteasa NS3/NS4A del
VHC unida a las proteínas esenciales de SIN por una secuencia de
escisión NS4A/NS4B. El ensamblaje de las partículas virales en una
línea celular de mamífero depende del tratamiento del sitio de
corte NS4A/4B. Un inconveniente considerable de este sistema reside
en que la actividad proteasa del VHC produce virus quiméricos que
inducen cambios morfológicos citopáticos en las células. La
medida del cambio del pH del medio constituye una forma
semi-cuantitativa de medir estos cambios en el
mejor de los casos. Otro inconveniente de este sistema es que las
proteínas esenciales del sindbis contienen un sitio de escisión de
serin proteasa natural parecido al sitio NS3 haciendo así este
sistema de uso limitado para el de cribado de inhibidores de la
proteasa potenciales.
Cho, Y.G. et al., (1998), enseñan un
vector de expresión que codifica la región NS3/NS4A y el sitio de
corte NS4A/4B fusionados al gen SEAP (fosfatasa alcalina secretada),
transfectado a una línea celular de mamífero. La escisión del sitio
NS4A/4B por la proteasa NS3, libera la proteína SEAP al medio. La
cantidad de proteína SEAP al medio es una medida de la actividad
proteasa NS3. Un inconveniente de este sistema reside en el hecho
de que la molécula indicadora se fusiona directamente a la proteína
sustrato y puede entonces afectar la conformación natural de las
proteínas del complejo viral (NS3/NS4A). Otro inconveniente
considerable reside en el hecho de que la cantidad de proteína
indicadora secretada está en proporción directa a la cantidad de
proteína expresada y escindida en el sistema (1 molécula de
sustrato escindida = 1 molécula indicadora secretada). Debido que
la poliproteína del VHC es un sistema que se expresa a niveles muy
bajos (aun también en su contexto natural), la señal observada es
demasiado baja para llevarla a una gran escala de cribado. WO
98/00548 describe virus híbridos que comprenden un picornavirus,
preferiblemente poliovirus, dominio proteasa NS3 del VHC y un solo
sitio diana de la proteasa NS3 único. Estos virus quiméricos se
diseñan de modo que la actividad proteolítica de la NS3 del VHC es
esencial para la viabilidad y la proliferación viral. Se enseñan
varios híbridos, cada uno con un sitio de corte de NS3 distinto
(NS5A/NS5B, NS4A/NS4B o NS4B/NS5A). La viabilidad se mide mediante
el título viral utilizando el análisis de placa en monocapa de
células HeLa. Una vez más, este sistema no proporciona medias
cuantificables para el cribado de un gran número de inhibidores
potenciales con un rendimiento alto y no permite un cribado de la
actividad proteasa NS3 en el contexto natural del segmento de la
poliproteína.
La patente estadounidense 5,861,267 de Vertex
revela un método para analizar la proteasa NS3 del VHC que utiliza
la expresión de la región NS3/NS4A y del sitio de escisión NS4A/4B
fusionado al indicador IL-1\beta
(interleucina-1 \beta) secretado. La escisión del
sitio NS4A/4B por la proteasa NS3 libera la
IL-1\beta al medio, cosa que permite una medida
directa de la actividad proteasa NS3. Este sistema examina la
inhibición de la escisión de NS3 a un sitio de escisión adyacente
al complejo NS3/NS4A, una situación que no representa o reproduce
las condiciones auténticas de múltiples sitios de tratamiento de la
poliproteína presentes en las células infectadas. Además, este
sistema proporciona un sistema indicador donde el señal medido es
directamente proporcional a la cantidad de proteína expresada en el
sistema y la cantidad de proteína escindida, otra vez dando un señal
demasiado bajo para llevarlo a cabo a un cribado de gran
escala.
El documento WO 00/08469 de Agouron revela otro
sistema que comprende una construcción indicadora de proteasa que
consiste en la metaloproteasa NS2, la proteasa NS3, el
co-factor NS4A y diferentes variaciones de NS4B y
5A truncadas, antes del sitio de escisión de NS5A/5B. Sin embargo,
este sistema no revela la importancia de tener una poliproteína
entera para optimizar la actividad/especificidad de la proteasa NS3.
Además, este sistema requiere la infección de un vector del virus
de la vaccinia, un factor que atenúa la integridad de la célula
huésped y que puede afectar el mecanismo de escisión de la proteasa
cis o trans durante los eventos de tratamiento de la
poliproteína en el análisis. Otro inconveniente de utilizar la
expresión de vaccinia reside en el hecho de que las células en el
análisis se vuelven necróticas después de aproximadamente 24 horas,
limitando así el uso de este análisis para ensayos cinéticos a largo
plazo.
El documento WO 00/12727 de Vertex revela un
sistema con una proteína de fusión que comprende un dominio de
unión a ligando, un dominio de unión a DNA que puede unirse a un
elemento de respuesta a ligando de modo que el dominio de
activación VP16 regule la expresión de un gen indicador. El sitio de
escisión NS5A/5B se inserta dentro de esta proteína de fusión y
modula la expresión del gen indicador después del corte por la
proteasa NS3/4A que se expresa a partir de una construcción
separada. Otra vez, este sistema no revela la importancia de tener
una poliproteína entera para optimizar la actividad/especificidad de
la proteasa NS3.
Por tanto, es importante desarrollar un ensayo
para el cribado de un gran número de compuestos
anti-VHC, con la capacidad de llegar a un sistema
de alto rendimiento. La presente invención, por tanto, proporciona
un ensayo que es fácil de realizar, fiable, sensible y reproducible
a gran escala.
Por tanto, el propósito de esta invención es
proporcionar un sistema y un análisis basados en células con una
mejor sensibilidad para medir la inhibición de la actividad de la
proteasa NS3 del VHC. Este análisis se diseña para probar al mismo
tiempo la actividad proteasa en una construcción que reproduce tanto
como sea posible los de tratamientos de NS3 de la poliproteína que
se dan en las células infectadas en el curso de la enfermedad del
VHC.
Así, la presente invención concierne el
desarrollo de un sistema de análisis basado en células con una mayor
sensibilidad a la actividad de la proteasa NS3 del VHC en
comparación con ensayos conocidos y que es útil para el cribado de
compuestos de prueba capaces de modular (particularmente inhibir) la
actividad de la proteasa NS3 del VHC.
Esta invención proporciona una primera
construcción que comprende un dominio transactivador unido al
extremo 3' de los dominios NS3-5 del VHC bajo el
control de un sistema promotor viral no-citopático.
También se proporciona una segunda construcción que comprende un
gen indicador bajo el control de un operador sensible a la unión
del transactivador.
Los dominios NS3-5 codifican la
poliproteína NS3 que comprende: la proteasa NS3, seguida por el
co-factor NS4A, las proteínas NS4B y NS5A
(incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de estas),
terminadas por la proteína NS5B (incluyendo cualquier derivado,
variante o fragmento de ésta) suficiente para constituir el sitio
de escisión NS5A/5B. El transactivador, cuando se expresa y se
libera de la poliproteína inicia la transcripción y la expresión
del gen indicador que se puede medir.
Las ventajas de este sistema incluyen entre
muchas otras el hecho de que el dominio del cofactor NS4A, cuando
se expresa, permanece incrustado en la membrana del retículo
endoplasmático anclando de este modo la proteasa NS3 cuando forma
complejo con NS4A y reduciendo el señal de fondo (mediante la
prevención de la translocación inespecífica) cuando no se procesa
ninguno de los sitios de escisión en 3' de la poliproteína.
Las ventajas de este sistema también residen en
varios niveles de amplificación del señal que se mide. El
solicitante cree que un primer nivel de amplificación radica en el
hecho de que la poliproteína reproduce de forma perceptible la
conformación salvaje de la poliproteína y los eventos naturales de
tratamiento que se dan durante la infección en un ser humano. Esto
incrementa la actividad de escisión de la proteasa NS3 así como su
especificidad. La translocación de la señal hacia el núcleo y la
expresión indicadora es por tanto más específica y se reduce el
ruido de fondo a un mínimo aceptable para los ensayos de cribado de
alto rendimiento.
El uso de un sistema transactivador también
proporciona un segundo nivel de amplificación que incrementa más la
señal de salida.
\newpage
Finalmente, este sistema transactivador, que es
sensible a la presencia de antibiótico, proporciona un control
negativo incorporado interno que permite la medida del ruido de
fondo inherente del ensayo, asegurando así la especificidad del
ensayo y de los compuestos de análisis.
Así, la presente invención proporciona un ensayo
basado en células que tiene la habilidad de medir la inhibición de
la proteasa NS3 en un sistema que imita estrechamente el tratamiento
de las proteínas no estructurales del VHC en un contexto que
reproduce substancialmente el proceso de infección natural. El
sistema basado en células de mamífero de la presente invención es
altamente sensible, y demuestra una proporción señal/ruido elevada
en comparación con otros ensayos conocidos. Por tanto, un ensayo que
utiliza este sistema se puede incrementar fácilmente a un sistema
de cribado de alto rendimiento.
Por tanto, la presente invención proporciona un
sistema basado en células sustitutivas para evaluar la actividad
proteasa de la proteasa NS3 del virus de la Hepatitis C que
comprende:
a) una primera molécula de DNA quimérica que
comprende:
- i)
- un sistema de expresión no citopático capaz de inducir la expresión de dicha primera quimera después de la transfección de una célula de mamífero; y
- ii)
- una molécula de DNA recombinante del VHC unida funcionalmente a dicho sistema de expresión; dicha molécula de DNA del VHC codifica la poliproteína NS3-5 que comprende:
- -
- un dominio proteasa NS3 activo,
- -
- un dominio NS4A suficiente para permitir la incrustación a la membrana del RE después de la translación y que actúa como co-factor para la actividad proteasa NS3,
- -
- los dominios NS4B y NS5A, y
- -
- la proteína NS5B suficiente para proporcionar un sitio de escisión NS5A/5B para dicha proteasa NS3; dicha molécula de DNA del VHC se define por los nucleótidos 1 a 4206 de la SEQ. ID. NÚM.: 1.
- iii)
- Un dominio transactivador fusionado a 3' de dicha molécula de DNA del VHC, dicho dominio transactivador codifica una molécula transactivadora capaz de iniciar la expresión del gen indicador; donde dicho transactivador es un transactivador de la tetraciclina (tTA) definido por los nucleótidos 4207 a 5211 de la SEQ. ID. NÚM.: 1;
b) y una segunda molécula de DNA quimérica que
codifica dicho gen indicador co-unido a un operón
que responde a dicha molécula transactivadora;
a través del cual la expresión de
dicha primera molécula recombinante lleva a la producción de una
poliproteína de fusión anclada al retículo endoplasmático de dicha
célula de mamífero, dicha proteína anclada es capaz de ser cortada
por dicha proteasa permitiendo así la translocación de dicho dominio
transactivador para inducir la expresión de dicho gen indicador
como un modo de evaluar dicha actividad
proteasa.
La presente invención revela proteínas
recombinantes producidas a partir de las moléculas de DNA
recombinantes de la invención,
vectores que comprenden cualquiera de estas
moléculas de DNA recombinantes,
células huésped eucariotas transfectadas con
estos vectores, y
un método para analizar la actividad proteasa
NS3 mediante la utilización de moléculas recombinantes y células
huésped transfectadas de la invención. Este método también útil para
identificar inhibidores potenciales de estas.
Otros objetivos, ventajas y características de
la presente invención serán más aparentes después de leer la
siguiente descripción no restrictiva en referencia a las figuras que
acompañan que son ejemplares y no deberían interpretarse como una
limitación del alcance de la invención.
La Figura 1 muestra una visión general
esquemática de dos análisis basados en plásmidos en los que la
actividad proteasa NS3 media la activación de la luciferasa. El
esquema muestra la poliproteína precursora no estructural del VHC
recombinante co-unida a un dominio transactivador de
la tetraciclina (tTA) vía el sitio de escisión diana 5A/5B. En un
paso inicial del tratamiento, NS3 corta NS4A "en cis",
formando un complejo como se muestra mediante círculos solapados de
NS3/NS4A. Este complejo, que se asocia con la membrana del retículo
endoplasmático (RE), cataliza la escisión de los sitios diana en 3'
(4A/4B, 4B/5A, y 5A/5B) liberando así el dominio tTA de la molécula
recombinante. Una vez liberado, el dominio tTA migra hacia el núcleo
y transactiva la expresión del gen indicador, en este caso, la
luciferasa. De este modo, la actividad proteasa NS3 y el corte a 3'
del sitio de corte NS3/4A es esencial para la expresión de la
luciferasa.
El panel del medio muestra que la
transactivación de la luciferasa no tiene lugar en ausencia del
dominio tTA liberado. Lo posibles mecanismos para la no liberación
de tTA podrían ser: falta de actividad proteasa NS3 (por mutación
como en este caso), o bloqueo en los sitios de escisión diana a
3'.
El panel inferior muestra que no la
transactivación de la luciferasa no tiene lugar en presencia de
tetraciclina. Aunque la poliproteína NS3 se escinde y el dominio
tTA se transloque al núcleo, la tetraciclina se une al tTA y impide
la unión al DNA y la expresión del gen indicador, proporcionando así
un control interno fiable para medir la actividad de fondo de la
luciferasa.
La Figura 2 muestra el esquema de tres familias
de quimeras distintas que comprenden diferentes regiones de la
poliproteína del VHC fusionadas al transactivador de la tetraciclina
(tTA) con sus controles respectivos. El DNA que codifica el
segmento del VHC de estas quimeras se clonó como un fragmento Xba
I en los sitios Nhe I y Xba I de
pUHD15-1 para generar las quimeras de tTA.
La Figura 2A muestra la primera quimera en la
primera familia (construcción A), en la que la molécula recombinante
comprende la proteína NS3 del VHC en toda su longitud (incluyendo
ambos dominios proteasa y helicasa), NS4A en toda su longitud
(incluyendo los últimos seis aminoácidos designados como P6 a P1),
los primeros seis aminoácidos de NS4B designados como P1' a P6'
fusionados a la proteína tTA. Los aminoácidos P6 a P1 y P1' a P6' se
extienden a ambos lados del sitio de escisión 4A/4B como se muestra
con la flecha oscura.
La Figura 2B muestra la segunda quimera en la
primera familia (construcción B), que es la misma molécula
recombinante que en 2A con la excepción de que la proteína NS3 está
mutada en el aminoácido 1165 de serina a alanina (S1165A). Esta
construcción sirve como control, ya que la mutación obvia
completamente la actividad de la proteasa NS3.
La Figura 2C muestra la tercera quimera en la
primera familia (construcción C), que es la misma quimera que en 2A
con la excepción de que los dos aminoácidos designados P1 y P1' que
flanquean el sitio de escisión NS4A/4B están alterados de cisteína
y alanina a arginina y prolina, respectivamente. Estos cambios
obvian la escisión en este sitio. Esta construcción sirve como
control para el sitio de escisión.
La Figura 2D muestra la primera quimera en la
segunda familia (construcción D), en la que la construcción es la
misma que en la quimera 2A pero donde la secuencia aminoacídica
(P6-P6') que se extiende a ambos lados del sitio de
corte de NS4A/NS4B está reemplazada con la secuencia aminoacídica
(P6-P6') que define el sitio de corte
NS5A/NS5B.
La Figura 2E muestra la segunda quimera en la
segunda familia (construcción E), que es la misma construcción que
en 2D con la excepción que la proteasa NS3 está inactivada mediante
una mutación del aminoácido serina a alanina (S1165A). Esta
construcción sirve como control para la segunda quimera.
La Figura 2F muestra la tercera quimera en la
segunda familia (construcción F), que es la misma construcción que
en 2D con la excepción de que los dos aminoácidos designados P1 y
P1' que flanquean el sitio de corte NS5A/5B están alterados de
cisteína y serina a arginina y prolina, respectivamente. Estos
cambios obvian el corte en este sitio. Esta construcción sirve como
control para el sitio de corte 5A/5B.
La Figura 2G muestra la primera quimera en la
tercera familia (construcción G), en la que la molécula recombinante
comprende: la región entre la proteína NS3 entera, las proteínas
NS4A, NS4B y NS5A enteras, y la proteína NS5B parcial (que consiste
en los primeros seis aminoácidos designados P1' a P6'), fusionados a
la proteína tTA. La proteína NS5A entera y la región P1' a P6' de
5B se extienden a ambos lados del sitio de corte 5A/5B como se
muestra con la flecha oscura.
La Figura 2H muestra la segunda quimera en la
tercera familia (construcción H), que es la misma molécula
recombinante que en 2G con la excepción de que la proteasa NS3 está
inactivada por una mutación del aminoácido serina a alanina
(S1165A). Esta construcción sirve como control negativo para la
actividad proteasa NS3.
La Figura 2I muestra la tercera quimera en la
tercera familia (construcción I), que es la misma molécula
recombinante que en 2G con la excepción de que los dos aminoácidos
designados P1 y P1' que flanquean el sitio de corte NS5A/5B tienen
una alteración de cisteína y serina a arginina y prolina,
respectivamente. Estos cambios obvian la escisión en este sitio.
Esta construcción sirve como control para el sitio de escisión diana
de 5A/5B.
La Figura 3 muestra los resultados de los
análisis de las transferencia Western. Las quimeras descritas en
las Figuras 2A, 2B y 2C, insertadas en el plásmido de expresión
pCR3.1 mediante amplificación por PCR y clonaje TA (Invitrogen, CA,
EUA), se transfectan transitoriamente a la línea celular de riñón de
embriones humanos 293 junto con el virus de la vaccinia T7
recombinante (vvT7-3) que lleva la polimerasa de RNA
T7. Se cultivaron las células transfectadas y se extrajeron las
proteínas celulares, se realizó una electroforesis, se transfirió a
membrana y se marcó.
La Figura 3A muestra los resultados cuando se
marca la transferencia con un anticuerpo policlonal para la
proteína NS3. Los carriles A, B y C, corresponden a las
construcciones descritas en 2A, 2B y 2C, respectivamente, el carril
"-" indica un control de simulación de células 293
transfectadas. Los carriles A y C muestran la presencia de la
proteína NS3 madura (NS3), mientras que el carril B que representa
la construcción con la mutación S1165A, muestra la presencia de la
NS3 pre procesada (pre) pero no tiene ninguna proteína NS3
madura.
La Figura 3B muestra los resultados cuando la
transferencia se marca con un anticuerpo policlonal para NS4A. El
carril A demuestra la presencia de proteína NS4A madura (NS4A), el
carril B que representa la construcción 2B con la mutación S1165A
no tiene ninguna proteína NS4A madura, de forma similar, el carril C
que representa la construcción C con el sitio de corte mutado no
tiene proteína NS4A madura. Con tal de visualizar la proteína NS4A
madura que consiste en 54 aminoácidos, los extractos celulares se
determinan en una PAGE con SDS al 16,5% en gel de Tricina, se
transfieren a una membrana, y se marcan con anticuerpo policlonal
anti-NS4A. La banda resultante se muestra en el
panel inferior.
La Figura 4 muestra los resultados de los
análisis de las transferencias Western. Las quimeras se describen
en las Figuras 2D, 2E y 2F insertadas en el plásmido de expresión
pCR3.1 mediante clonaje TA directo de los productos de PCR, se
transfectan transitoriamente a la línea celular huésped de mamífero
293 junto con el virus de la vaccinia T7 recombinante
(wT7-3) que tiene la polimerasa de RNA T7. Se
cultivan las células transfectadas y se extrae la proteína celular,
se someten a electroforesis, se transfieren y se marcan. Los
resultados muestran la transferencia marcada con un anticuerpo
policlonal anti-NS3. Los carriles D, E y F,
corresponden a las construcciones descritas en 2D, 2E y 2F,
respectivamente, el carril "-" indica un control de simulación
de células transfectadas 293. Los carriles D y F muestran la
presencia de proteína NS3 madura (NS3), mientras que el carril E
que representa la construcción con la mutación S1165A demuestra la
presencia de NS3 pre-procesada (pre) pero no tiene
ninguna proteína NS3 madura.
La Figura 5 muestra los resultados de los
análisis de la transferencia Western. Las quimeras descritas en las
Figuras 2G, 2H y 2I insertadas en el plásmido de expresión pCR3.1
mediante clonaje TA directo de los productos de la PCR, se
transfectan de forma transitoria en la línea celular huésped de
mamífero 293 junto con el virus de la vaccinia T7 recombinante
(wT7-3) que tiene la polimerasa de RNA de T7. Se
cultivan las células transfectadas y se extraen las proteínas
celulares, se someten a electroforesis, se transfieren a membrana y
se marcan.
La Figura 5A muestra los resultados de la
transferencia marcada con un anticuerpo policlonal para la proteína
NS3. Los carriles G, H e I, corresponden a las construcciones
descritas en 2G, 2H y 2I, respectivamente, carril "-" indica
un control de células transfectadas 293 de prueba. Los carriles G e
I muestran la presencia de proteína NS3 madura (NS3), mientras que
el carril H que representa la construcción con la mutación S1165A
no tiene ninguna proteína NS3 madura.
La Figura 5B muestra los resultados de la
transferencia Western marcada con un anticuerpo policlonal para la
proteína NS4A. Los carriles G, H e I, corresponden a las
construcciones descritas en 2G, 2H y 2I, respectivamente, el carril
"-" indica un control de células transfectadas 293 de prueba.
Los carriles G e I muestran la presencia de proteína NS4A madura
(NS4A), mientras que el carril H que representa la construcción con
la mutación S1165A no tiene ninguna proteína NS4A madura.
La Figura 5C muestra los resultados de la
transferencia Western marcada con un anticuerpo policlonal para la
proteína NS5A. Los carriles G, H e I, corresponden a las
construcciones G, H y I, respectivamente, carril "-" indica un
control de células transfectadas 293 de prueba. El carril G muestra
la presencia de proteína NS5A madura (NS5A), mientras que el carril
H que representa la construcción con la mutación S1165A no tiene
ninguna proteína NS5A madura. De un modo similar, el carril I que
representa la construcción I con el sitio de corte NS5A/5B mutado
no tiene proteína NS5A madura y la proteína de fusión
NS5A-tTA se detecta como un producto de \approx
90 kDa.
La Figura 6 muestra los resultados del análisis
de la luciferasa llevados a cabo en extractos de células 293
co-transfectadas con una de las construcciones A a I
y el plásmido indicador pUHC13-3. La actividad
luciferasa es una medida de contaje de fotones por segundo. Las
denominaciones A a I corresponden a las construcciones descritas en
la Figura 2A a 2I, respectivamente. Los controles B, E y H son
defectuosos en el sitio activo de la proteasa mientras que los
controles C, F e I tienen un sitio de escisión defectuoso. Los
resultados en este análisis indican que la actividad luciferasa
depende de los dos, una proteasa NS3 activa y un sitio de escisión
funcional. Los resultados además indican que la construcción G
demuestra una actividad luciferasa superior a la de las
construcciones A o D. Estos valores son un promedio de dos
experimentos.
La Figura 7 muestra el índice de la actividad
luciferasa producida por las construcciones A, D y G respeto sus
mutantes de sitio activo respectivos B, E y H utilizando los valores
que se muestran en la Figura 6. Estos resultados muestran que la
proporción de G/H es de aproximadamente de 9 y 2 veces superior a
los índices A/B y D/E, respectivamente. La construcción G, con el
tramo más largo de la región no-estructural del VHC
que comprende NS3, NS4A, NS4B y NS5A en toda su longitud, y NS5B
parcial, produce la mayor respuesta luciferasa dependiente de NS3.
Los resultados son un promedio de n experimentos.
La Figura 8 muestra el efecto de la tetraciclina
en el transactivador transcripcional sensible a tetraciclina. La
expresión del gen indicador luciferasa se controla mediante el
tratamiento de NS3 de un transactivador transcripcional sensible a
la tetraciclina. El análisis de la luciferasa se realizó en
extractos de células 293 co-transfectadas con la
construcción G o H, o el plásmido productor de tTA
(pUHD15-1) como control positivo, y el plásmido
pUHC13-3 que contenía el indicador luciferasa. Las
barras cerradas y abiertas indican la ausencia y presencia de
tetraciclina, respectivamente. Hay que destacar que la construcción
G produce un señal controlado de tetraciclina; la inactivación de
la actividad proteasa NS3 (en la construcción H) elimina esta
señal.
La Figura 9 muestra los resultados del análisis
de la luciferasa realizado en extractos de la línea celular de
hígado WRL68 co-transfectada con una de las
construcciones A a I y el plásmido indicador
pUHC13-3. La actividad luciferasa es una medida del
contaje de fotones por segundo. Los controles B, E y H son
defectuosos en el sitio activo de la proteasa. Los controles C, F e
I tienen un sitio de escisión defectuoso y de esta manera no tienen
un sitio de escisión de la proteasa NS3 funcional. El resultado de
este análisis indica que la actividad luciferasa depende tanto de
una proteasa NS3 activa, como de un sitio de corte funcional. Los
resultados, además, indican que la construcción G demuestra una
actividad luciferasa superior a la de las construcciones A o D.
La Figura 10 muestra la proporción de la
actividad luciferasa producida por las construcciones A, D y G con
sus respectivos mutantes de sitio activo B, E y H. El análisis de la
luciferasa realizado en extractos de línea celular del hígado WRL
68 co-transfectada con una de las construcciones A,
B, D, E, G o H, y el plásmido indicador pUHC13-3.
La actividad luciferasa es una medida de contaje de fotones por
segundo. Los resultados muestran que la proporción G/H es de
aproximadamente 5 y 3,5 veces superior que la proporción de A/B y
D/E, respectivamente. La construcción G, con el tramo más largo de
la región no estructural del VHC que comprende NS3, NS4A, NS4B,
NS5A y NS5B parciales o enteras, también produce la mayor respuesta
de luciferasa dependiente de NS3 en la línea celular WRL68.
La Figura 11 muestra los resultados de optimizar
la cantidad de DNA plasmídico para transformar la línea celular
293. Se co-transfectaron diferentes cantidades de
DNA de la construcción G o del correspondiente control NS3
defectuoso de la construcción H, con una cantidad constante de pUHC
13-3 (0,2 \mug). Se utilizaron células al 50% de
confluencia en placas de 6 pocillos. Los resultados indican que una
cantidad de DNA plasmídico que codifica NS3 aproximadamente 3 veces
superior (0,6 \mug) que el pUHC 13-3 (0,2 \mug)
produce una señal luciferasa dependiente de NS3 óptima en las
células 293.
La Figura 12 muestra los resultados de optimizar
la cantidad de DNA plasmídico para transformar la línea celular
hepática WRL 68. Se co-transfectaron diferentes
cantidades de la construcción G o del control NS3 defectuoso de la
construcción H, con una cantidad constante de pUHC
13-3 (0,2 \mug). Los resultados indican que una
cantidad aproximadamente 2,5 veces superior (0,5 \mug) que el pUHC
13-3 (0,2 \mug) produce una señal luciferasa
dependiente de NS3 óptima en la línea celular hepática WRL 68.
La Figura 13 muestra que la proteína NS3
expresada a partir de la construcción I puede escindir la
poliproteína no-estructural del VHC en "trans"
en las células 293. El experimento implicó
co-transfectar el indicador pUHC13-3
con una de las construcciones G, H o I. Las construcciones H e I
también se co-transfectaron simultáneamente junto
con el plásmido indicador pUHC13-3. La transfección
de sólo la construcción G con el indicador resulta en una señal de
actividad luciferasa potente, mientras que la transfección de la
construcción H con el indicador (mutante del sitio activo de la
proteasa NS3) o de la construcción I con el indicador (mutante del
sitio de escisión) resulta en una actividad luciferasa débil. La
co-transfección triple con las construcciones H e I
junto con el plásmido indicador, restablece el señal de actividad
luciferasa. La proteína funcional NS3 expresada a partir de la
construcción I puede procesar el sitio de corte no modificado de la
construcción H, de ese modo liberando el transactivador de
tetraciclina para iniciar la expresión de la luciferasa del operón
de tetraciclina. Las diferentes cantidades del DNA plasmídico
utilizado en las transfecciones son las que se indican.
La Figura 14 muestra los resultados de un
experimento similar a la Figura 13 utilizando la línea celular
hepática WRL68. De forma similar, los resultados indican que la
proteína NS3 producida a partir de la construcción I puede cortar
la poliproteína no estructural del VHC en "trans" en las
células WRL68. Como se indica, en la transfección se utilizan
diferentes cantidades de DNA plasmídico.
La Figura 15-cuadrados cerrados:
muestra el % de inhibición de la actividad proteasa NS3 del VHC en
la transactivación por el tTA de la expresión de SEAP en células
huésped co-transfectadas con la construcción G y el
plásmido indicador pUHC13-3 que expresa la
fosfatasa alcalina secretada (SEAP, por sus siglas en inglés).
Cuadrados abiertos: muestran el % de inhibición de la actividad del
tTA control (independiente de la NS3 del VHC) en la transactivación
de la SEAP en las células huésped co-transfectadas
con los plásmidos control pUHD15-1 y
pUHC13-3. Después de la transfección, las células se
cultivaron en presencia de varias concentraciones del Inhibidor A.
Se midió la actividad SEAP y se determinaron los valores EC_{50} y
TC_{50}.
A menos que se defina de otro modo, los términos
científicos y tecnológicos y la nomenclatura utilizados aquí tienen
el mismo significado que una persona con experiencia en el ámbito
que utilice esta invención entendería habitualmente. Generalmente,
los procedimientos para el cultivo celular, la infección, los
métodos de biología molecular y similares son métodos utilizados
habitualmente en el ámbito. Tales técnicas habituales se pueden
encontrar en manuales de referencia tales como por ejemplo Sambrook
et al. (1989) y Ausubel et al. (1994).
Las secuencias nucleotídicas se presentan aquí
con una cadena simple, en dirección de 5' a 3', de izquierda a
derecha, utilizando los símbolos nucleotídicos de una letra como se
utilizan habitualmente en el ámbito y de acuerdo con las
recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica
IUPAC-IUB (1972).
La presente descripción se refiere a un número
de términos tecnológicos del DNA recombinante (rDNA) utilizadas
rutinariamente. No obstante, se proporcionan las definiciones de los
ejemplos seleccionados de tales términos de rDNA para conseguir
claridad y consistencia.
El término "DNA recombinante", "molécula
de ácido nucleico recombinante" o "plásmido recombinante"
como se conoce en el ámbito se refiere a una molécula de DNA que
resulta de la unión de segmentos de DNA. A menudo nos referimos a
esto como ingeniería genética.
El término "segmento o molécula o secuencia de
DNA", se utiliza aquí para hacer referencia a moléculas que
constan de los desoxirribonucleótidos de adenina (A), guanina (G),
timina (T) y/o citosina (C). Estos segmentos, moléculas o
secuencias se pueden encontrar en la naturaleza o se pueden derivar
sintéticamente. Cuando se lee de acuerdo con el código genético,
estas secuencias pueden codificar un tramo o una secuencia lineal de
aminoácidos a los que se puede referir como polipéptido, proteína,
fragmento proteico y similares.
Como se utiliza aquí, el término "gen" es
bien conocido en el ámbito y hace referencia a una secuencia de
ácidos nucleicos que define una proteína o un polipéptido únicos. El
polipéptido puede estar codificado por una secuencia entera o por
cualquier porción de la secuencia codificadora, mientras que
conserve la actividad funcional de la proteína.
Un "gen estructural" define una secuencia
de DNA que se transcribe a RNA y se traduce a una proteína que tiene
una secuencia aminoacídica específica generando un polipéptido o
poliproteína específicos. El término "Proteínas estructurales"
define las proteínas del VHC incorporadas a las partículas víricas
denominadas "C", E1, E2, y E2-p7. El término
"Proteínas no-estructurales", define las
proteínas del VHC que no se comprenden en las partículas virales,
denominadas NS2, NS3, NS4A, NS5A y NS5B.
Una "endonucleasa de restricción o enzima de
restricción" es una enzima que tiene la capacidad de reconocer
una secuencia de bases específica (normalmente 4, 5 o 6 pares de
bases de longitud) en una molécula de DNA, y de escindir la
molécula de DNA en cada sitio donde aparece esta secuencia. Un
ejemplo de tal enzima es EcoRI, que reconoce la secuencia de
bases G\downarrowAATTC y escinde una molécula de DNA en este sitio
de reconocimiento.
Los "fragmentos de restricción" son
moléculas de DNA producidas por la digestión de DNA con una
endonucleasa de restricción. Cualquier genoma o segmento de DNA
dados pueden digerirse por una endonucleasa de restricción
particular en al menos dos moléculas discretas de fragmentos de
restricción.
Una "electroforesis en gel de agarosa" es
un método analítico para fraccionar moléculas de DNA de cadena doble
basado en el tamaño del DNA. El método se basa en el hecho de que
las moléculas de DNA migran a través del gel como a través de un
tamiz, a través del cual la molécula de DNA más pequeña tiene mayor
movilidad y se desplaza lo más lejos posible a través del gel. Las
características de cribado del gel retardan las moléculas de DNA
más grandes de modo que estas tengan la menor movilidad posible. El
DNA fraccionado se puede visualizar tiñendo el gel utilizando
métodos bien conocidos en el ámbito, la hibridación de ácidos
nucleicos o marcando las moléculas de DNA fraccionado con un
marcador detectable. Todos estos métodos son bien conocidos en el
ámbito, se pueden encontrar métodos específicos en Ausubel et
al. (supra).
Un "oligonucleótido u oligómero" es una
molécula que consta de dos o más desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, preferentemente más de tres. El tamaño exacto de
la molécula dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de
la última función o uso del oligonucleótido. Un oligonucleótido se
puede derivar sintéticamente, mediante clonaje o por
amplificación.
La "amplificación de una secuencia" es un
método para generar grandes cantidades de una secuencia diana. En
general, uno o más cebadores de amplificación hibridan a una
secuencia de ácido nucleico. Utilizando las enzimas adecuadas, se
amplifican las secuencias que se encuentran adyacentes o entre los
cebadores. Un método de amplificación que se utiliza aquí es la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en
inglés).
Un "cebador de amplificación" se refiere a
un oligonucleótido capaz de hibridar a una región de DNA adyacente
a una secuencia diana y que sirve como cebador de iniciación para la
síntesis de DNA bajo condiciones adecuadas bien conocidas en el
ámbito. El producto de la extensión del cebador sintetizado es
complementario a la secuencia
diana.
diana.
El término "dominio" o "región" se
refiere a una secuencia aminoacídica específica que define o bien
una función específica o una estructura específica en una proteína.
Un ejemplo es el dominio de la proteasa NS3 comprendido en la
poliproteína no estructural del VHC.
El término "gen indicador" se refiere a una
secuencia nucleotídica que codifica una "proteína indicadora".
La proteína indicadora proporciona medios detectables para evaluar
la expresión génica. El gen indicador está comprendido en un
"plásmido indicador". Algunos ejemplos útiles de gen indicador
para el propósito de esta invención son; fosfatasa alcalina
secretada (SEAP), luciferasa, cloramfenicol aminotransferasa (CAT),
\beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde
(GFP), etc.
El término "sistema indicador" se refiere a
la combinación de dos o más indicadores. Un ejemplo no limitador de
un sistema indicador útil para el propósito de la presente
aplicación es un primer indicador que es un activador genético como
el tTA que dirige la expresión de un segundo indicador, como la
luciferasa o la fosfatasa alcalina secretada (SEAP).
Los términos "activador" y "operón" se
refieren a un sistema en el que una molécula "activadora" se
une a un operador que está comprendido en un operón para estimular
la expresión del "operón". Ejemplos de tales sistemas son;
transactivador de la tetraciclina (tTA), transactivador tat del
VIH-1, transactivador de GAL 4, NF\kappa\beta,
etc.
El término "molécula quimérica" o
"quimera" como se utiliza aquí se refiere a al menos dos
dominios de ácido nucleico que no se pueden encontrar unidos de
forma natural. Ejemplos no limitantes de tales quimeras según la
presente invención incluyen la construcción de los dominios
NS3-4A-4B-5A-5B-tTA
del VHC. Cuando se expresan tales quimeras dan lugar a "proteínas
de fusión".
El término "proteína de fusión" como se
define aquí se refiere a al menos a dos segmentos polipeptídicos que
no se pueden encontrar unidos de forma natural. Ejemplos no
limitantes de tales "proteínas de fusión" según la presente
invención incluyen las partes de la poliproteína del VHC
co-unidas con una proteína que tiene capacidades
indicadores directas o indirectas tal como el tTA o la SEAP.
Los términos "plásmido", "vector" o
"construcción de DNA" se conocen habitualmente en el ámbito y
se refieren a cualquier elemento genético, que incluye, pero no se
limita a, DNA plasmídico, DNA de fago, DNA viral y similares, que
pueden incorporar las secuencias oligonucleotídicas, o secuencias de
la presente invención, y que sirven como vehículo de DNA en el cual
se puede clonar el DNA de la presente invención. Existen numerosos
tipos de vectores y son bien conocidos en el ámbito. La terminología
"vector de expresión" define un vector como se describe arriba
pero diseñado para permitir la expresión de una secuencia insertada
tras la transformación o transfección en un huésped. El gen clonado
(secuencia insertada) normalmente se coloca bajo el control de
secuencias de elementos de control tales como secuencias promotoras.
Tales secuencias de control de la expresión variarán en función de
si el vector se diseña para expresar el gen unido funcionalmente a
una célula huésped procariota o eucariota o a ambas (vectores
lanzadera) y adicionalmente puede contener elementos
transcripcionales, tales como elemento potenciador, secuencias de
terminación, elementos específicos de tejido, y/o sitios de
iniciación y terminación de la traducción.
El término "no-citopático"
define un sistema que no induce cambios citopáticos en el sistema
celular en el cual se expresa. Este sistema de expresión no
requiere una co-infección con un virus y no causa
una expresión de componentes que no virales del VHC que
eventualmente podrían llevar a una patología celular y muerte
celular. Ejemplos de promotores no-citopáticos son:
el sistema promotor de CMV, el sistema del promotor temprano de
SV40 o el sistema promotor LTR del RSV (virus del Sarcoma de
Rous).
Por "sistema de expresión eucariota" se
entiende la combinación de un vector de expresión apropiado y una
línea celular eucariota que se puede utilizar para expresar un gen
de interés. Los vectores plasmídicos que contienen el gen deseado
también se pueden utilizar. En todos los casos, el vector contendrá
los elementos de control adecuados (promotor) para expresar el gen
en el tipo celular de interés. Los tipos celulares eucariotas que
se utilizan normalmente son levaduras (p. ej. Saccharomyces
cerevisiae, Pischia pastoris) transfectados con un vector
plasmídico; y células de mamífero transfectadas con vectores de DNA
para la expresión transitoria o constitutiva. Una línea celular
preferida útil para el propósito de esta invención deriva de tejido
hepático.
Una célula huésped o célula indicadora se ha
"transfectado" mediante un DNA exógeno o heterólogo (p. ej.
construcción de DNA) cuando tal DNA se ha introducido dentro de la
célula. El DNA que se transfecta puede integrarse o no (unido
covalentemente) a un DNA cromosómico enmascarando el genoma de la
célula. En las células procariotas, levaduras y las células de
mamífero, por ejemplo, el DNA que se transfecta/transforma se puede
mantener en un elemento episomal como un plásmido. Respeto a las
células eucariotas, un ejemplo de célula transfectador de forma
estable es una en la cual el DNA transfectante se ha integrado en un
cromosoma y es heredado por las células hijas a través de la
replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la
habilidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o
clones comprendidos en una población de células hijas que contienen
el DNA transfectante. Los métodos de transfección se conocen bien en
el ámbito (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al.,
1994).
Las secuencias nucleotídicas y los polipéptidos
útiles para practicar la invención incluyen, pero no se limitan a,
mutantes, homólogos, subtipos, cuasi-especies,
alelos, y similares. Se entiende que generalmente las secuencias de
la presente invención codifican una poliproteína. Para una persona
con experiencia en el ámbito, estará claro que la poliproteína de
la presente invención y cualquier variante, derivado o fragmento de
esta, se auto-procesa para dar una proteasa
activa.
Como se utiliza aquí, la denominación
"variante" indica en el contexto de esta invención una
secuencia, un ácido nucleico o bien un aminoácido, una molécula que
retiene la actividad biológica (funcional o bien estructural) que
es sustancialmente similar a la de la secuencia original. Esta
variante puede de la misma o de distinta especie y puede ser una
variante natural o prepararse sintéticamente. Tales variantes
incluyen secuencias aminoacídicas con sustituciones, deleciones, o
adiciones de uno o más aminoácidos, siempre que se conserve la
actividad biológica de la proteína. Lo mismo se puede aplicar a las
variantes de secuencias de ácidos nucleicos que pueden tener
sustituciones, deleciones, o adiciones de uno o más nucleótidos,
siempre que se mantenga generalmente la actividad biológica de
la
secuencia.
secuencia.
El término "derivado" incluye cualquiera de
las variantes descritas arriba cuando comprenden una fracción
química adicional que normalmente no forma parte de estas moléculas.
Estas regiones químicas pueden tener utilidades variables que
incluyen, la mejora de la solubilidad de una molécula, absorción,
vida media biológica, disminución de la toxicidad y eliminación o
disminución de los efectos secundarios no deseados. Además, estas
fracciones se pueden utilizar con el fin de marcar, unir, o pueden
encontrarse en producto(s) de fusión. Las diferentes
fracciones capaces de mediar los efectos descritos arriba se pueden
encontrar en Remington's The Science and Practice of Pharmacy
(1995). Las metodologías para unir tales fracciones a una
molécula son bien conocidas en el
ámbito.
ámbito.
El término "fragmento" se refiere a
cualquier segmento de un DNA, RNA o secuencia aminoacídica
identificados y/o cualquier segmento de cualquiera de las variantes
o derivados descritos arriba que substancialmente retienen su
actividad biológica (funcional o estructural) como es requerido por
la presente invención.
Los términos "variante", "derivado", y
"fragmento" de la presente invención se refieren aquí a
proteínas o moléculas de ácido nucleico que se pueden
aislar/purificar, sintetizar químicamente o producir mediante
tecnología de DNA recombinante. Todos estos métodos son bien
conocidos en el ámbito. Como se ejemplifica aquí abajo, las
secuencias nucleotídicas y los polipéptidos utilizados en la
presente invención se pueden modificar, por ejemplo mediante
mutagénesis in vitro.
Por ejemplo, como se define en la presente
invención, un fragmento deseado de proteína NS3 debe retener su
actividad proteasa. Un fragmento deseado de la proteína NS4A
retendría su actividad co-factor de la proteasa
(actividad funcional), y también retiene su porción hidrofóbica que
permite la incrustación a la membrana del RE (actividad
estructural). Un fragmento deseado de la proteína NS4B retendría su
actividad estructural en la medida que permitiría el tratamiento de
la poliproteína tan parecido a la salvaje como sea posible. Un
fragmento deseable de la proteína NS5A retendría su actividad
estructural para permitir el tratamiento de la poliproteína tan
parecido a la salvaje mientras que también retendría su actividad
funcional para proporcionar un sitio de escisión de NS5A/5B
funcional. Un fragmento deseado de la proteína NS5B tendría que ser
suficiente para retener un sitio de corte NS5A/5B funcional. Por
ejemplo, los primeros 6 aminoácidos de la proteína NS5B son
suficientes para este propósito. Tal actividad funcional o
estructural para cada dominio respectivo puede evaluarse fácilmente
por una persona con experiencia en el ámbito sin excesiva
experimentación.
El término "sitio de escisión" como se
utiliza aquí se refiere a un polipéptido capaz de ser escindido en
"cis" o en "trans" por la proteasa NS3 del VHC.
El término "sitio de escisión diana" o
"sitio diana" como se utiliza aquí, se refiere a un sitio de
escisión a 3' del sitio de escisión NS3/4A. Al menos se debe
escindir un sitio diana de la proteasa NS3 para obtener la
translocación del transactivador, la expresión del gel indicador y
conseguir la medida del producto del gen indicador. El sitio de
escisión NS3/4A no se considera aquí como un "sitio diana"
porque su escisión por sí misma no libera el producto del gen
indicador.
El término "sitio de escisión funcional"
como se utiliza aquí significa un sitio de escisión del polipéptido
precursor que ha sido modificado (por mutación o cualquier otro
método químico) pero que todavía permanece escindible por la
proteasa NS3. Algunos ejemplos no limitadores de esta modificación
son la sustitución conservadora de un codón de ácidos nucleicos o
de un aminoácido.
La presente invención proporciona un sistema
basado en células sustitutivas para evaluar la actividad proteasa
de la proteasa NS3 del virus de la Hepatitis C que comprende:
a) una primera molécula de DNA quimérica que
comprende:
- i)
- un sistema de expresión no citopático capaz de inducir la expresión de dicha primera quimera después de la transfección de una célula de mamífero; y
- ii)
- una molécula de DNA recombinante del VHC unida funcionalmente a dicho sistema de expresión; dicha molécula de DNA del VHC codifica la poliproteína NS3-5 que comprende:
- -
- un dominio proteasa NS3 activo,
- -
- un dominio NS4A suficiente para permitir la incrustación a la membrana del RE después de la translación y que actúa como co-factor para la actividad proteasa NS3,
- -
- los dominios NS4B y NS5A, incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de estos, y
- -
- la proteína NS5B incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de esta, suficiente para proporcionar un sitio de escisión NS5A/5B para dicha proteasa NS3;
- iii)
- Un dominio transactivador fusionado a 3' de dicha molécula de DNA del VHC, dicho dominio transactivador que codifica una molécula transactivadora capaz de iniciar la expresión del gen indicador;
b) y una segunda molécula de DNA quimérica que
codifica dicho gen indicador co-unido a un operón
que responde a dicha molécula transactivadora;
donde la expresión de dicha primera
molécula recombinante lleva a la producción de una poliproteína de
fusión anclada al retículo endoplasmático de dicha célula de
mamífero, dicha proteína anclada es capaz de ser escindida por
dicha proteasa permitiendo así la translocación de dicho dominio
transactivador para inducir la expresión de dicho gen indicador
como un modo de evaluar dicha actividad
proteasa.
La molécula quimérica incluye una secuencia
nucleotídica capaz de expresar la poliproteína del VHC con el
dominio NS3, variantes, derivados o fragmentos de este suficientes
para proporcionar una proteasa activa una vez traducida. Esto
comprende una proteína NS3 truncada para excluir el dominio
helicasa, o una proteína NS3 donde el dominio helicasa no está
activado.
El dominio NS4A necesario para el sistema basado
en células sustitutivas requiere que la proteína NS4A traducida,
variantes, derivados o fragmentos de esta, sean suficientes para
permitir la incrustación de la poliproteína en la membrana del RE
después de la traducción y actúa como co-factor de
la actividad proteasa NS3.
El dominio NS4B necesario para el sistema basado
en células sustitutivas requiere que la proteína traducida tenga
una longitud suficiente para permitir la orientación estructural
correcta de la proteasa NS3 en vista del sitio de corte diana
NS5A/5B. Por tanto, las variantes, los derivados o fragmentos de la
proteína NS4B se pueden mutar en sus sitios de escisión (4A/4B o
4B/5A), o mutados para eliminar si la actividad biológica salvaje
sin comprometer el efecto orientativo en la poliproteína.
El dominio NS5A necesario para el sistema basado
en células sustitutivas requiere que la proteína traducida tenga
una longitud suficiente para permitir la orientación estructural
correcta de la proteasa NS3 en vista del sitio de escisión diana
NS5A/5B. Por tanto, se pueden mutar las variantes, derivados o
fragmentos de la proteína NS5A en su sitio de escisión a 5'
(4B/5A), o se pueden mutar para eliminar su actividad biológica
respectiva sin comprometer su efecto orientativo en la poliproteína
y el sitio de escisión NS5A/5B.
Finalmente, el sitio de escisión NS5A/5B
necesario para lo presente debe ser funcional, es decir, reconocido
y escindido por la proteasa NS3. Tal sitio de corte diana funcional
incluye derivados, variantes o fragmentos de este mientras sea
capaz de ser escindido por la proteasa Ns3. Un sitio de escisión
NS5A/5B preferido incluye los seis primeros aminoácidos del dominio
NS5B.
En un aspecto alternativo, se proporciona la
secuencia nucleotídica que codifica la poliproteína NS3 entera.
Alternativamente, se proporciona una secuencia nucleotídica parcial
que codifica una poliproteína parcial que comprende las variantes
de los dominios necesarios como se define arriba.
Alternativamente, la molécula quimérica incluye
una secuencia nucleotídica capaz de expresar un derivado, una
variante o un fragmento de la poliproteína precursora que comprende
todos los sitios de escisión funcionales: NS3/4A; 4A/4B; 4B/5A; y
5A/5B. Alternativamente, al menos el sitio NS5A/5B es un sitio de
escisión funcional, mientras que los otros sitios de escisión
pueden haber sido modificados para volverse no funcionales.
El sistema promotor no citopático comprende el
promotor CMV, el sistema de promotor temprano SV40 o el sistema de
promotor LTR del RSV (virus del Sarcoma de Rous).
El sistema indicador comprende un dominio
trans-activador unido a la primera molécula de ácido
nucleico recombinante a través de la cual el transactivador, cuando
se escinde de la proteína de fusión expresada, migra al núcleo
para, a su vez, activar la expresión de un gen indicador el producto
del cual se puede medir como medio para evaluar la actividad
proteasa NS3. La fusión de un dominio transactivador proporciona un
nivel de amplificación para aumentar la sensibilidad del ensayo. De
acuerdo con este aspecto particular, la activación del sistema de
gen indicador por el transactivador puede inhibirse específicamente
como forma de asegurar que el corte de la poliproteína precursora
es específico (control negativo incorporado). Un aspecto particular
comprende un sistema adaptado a partir del método de Gossen, M, and
Bujard, H. (1992) que describe el diseño y el uso potencial de un
transactivador controlado por tetraciclina en una línea celular de
mamífero.
En este método, el represor tet se
fusiona al dominio de activación de la proteína 16 del virus del
herpes simples (VP16) generando así un transactivador dependiente
de tetraciclina (tTA). Este tTA inicia la transcripción/expresión
de un gen indicador bajo el control de un operón tet/promotor
viral combinados. El producto del gen indicador es una indicación
de la activación génica y expresión proteica.
El transactivador se puede localizar en
cualquier sitio de la molécula quimérica o de la proteína de fusión,
siempre que esté a 3' de los sitios de corte diana y por tanto se
libere después del corte. Más preferiblemente, el transactivador se
localiza en el extremo 3' de la molécula recombinante.
Algunos ejemplos no limitadores de
transactivador incluyen el transactivador de la tetraciclina (tTA),
NF\kappa\beta, tat del VIH-1 y
GAL-4. Más preferiblemente, el transactivador es el
tTA.
Algunos ejemplos no limitadores de una molécula
indicadora incluyen: fosfatasa alcalina secretada,
\beta-galactosidasa, luciferasa, cloramfenicol
aminotransferasa y proteína fluorescente verde. Preferiblemente, la
molécula indicadora es la SEAP o la luciferasa. Más
preferiblemente, la molécula indicadora es la SEAP.
En un aspecto preferido, el sistema indicador es
una combinación del tTA y la luciferasa (US 5,464,758); o una
combinación del tTA y la SEAP. Más preferiblemente, el sistema
indicador es una combinación del tTA y la SEAP.
Es un aspecto de la presente invención que
diferentes permutaciones de un transactivador y un sistema indicador
se pueden combinar utilizando metodologías bien conocidas en el
ámbito, todas estas dentro del alcance de esta invención.
Debido a que hay diferentes moléculas
indicadoras útiles para el propósito de esta invención, la detección
del producto del gen indicador se corresponde con el uso de los
métodos conocidos. Por ejemplo; la luciferasa se puede medir
mediante una reacción de quimioluminiscencia utilizando la coenzima
A como substrato de la luciferasa (Luciferase Assay System de
Promega, NY, EUA) y la SEAP se puede medir mediante una reacción de
quimioluminiscencia incorporando el substrato CSPD y un potenciador
(Tropix, Inc. MA, EUA).
Esta invención proporciona las moléculas de DNA
recombinante útiles en este análisis. De acuerdo con esto, se
proporciona una molécula de ácido nucleico como se define en el NÚM.
ID. SEC.: 1.
La invención abarca proteínas recombinantes
producidas a partir de las moléculas de DNA recombinante de la
invención.
De acuerdo con un aspecto específico de esto, se
proporciona una secuencia aminoacídica como se define en el NÚM.
ID. SEC.: 2.
De acuerdo con lo expuesto arriba, la secuencia
de aminoácidos y nucleótidos, todas las variantes, derivados, y
fragmentos de estas que son funcionalmente equivalentes a las
secuencias de aquí están dentro del ámbito de esta invención.
La invención también abarca los vectores que
comprenden cualquiera de esas moléculas de DNA recombinante. Es un
aspecto particular de la presente invención que la molécula de ácido
nucleico del NÚM. ID. SEC.: 1 se puede insertar a un plásmido de
expresión para la transfección a una célula de mamífero huésped. En
un aspecto preferido de la presente invención los diferentes
plásmidos, vectores o virus útiles para el propósito de esta
invención incluyen plásmidos de expresión, vectores o virus de
mamíferos que son capaces de transformar una célula huésped de
mamífero de forma estable o transitoria. Estos son bien conocidos y
están en el ámbito de esta invención. Más preferiblemente, los
plásmidos se seleccionan del grupo que consiste en: el plásmido
Puhd 15-1 basado en el promotor CMV que contiene el
gen tTA y el plásmido indicador de luciferasa o SEAP controlable
por tTA. En un aspecto más preferido de este cuarto modo de
realización, el ácido nucleico del NÚM. ID. SEC.: 1 se inserta al
plásmido pUHD15-1.
La transfección de los vectores mencionados
arriba en células huésped se puede llevar a cabo simultáneamente
(co-transfección) o secuencialmente. Como una
alternativa, la transfección del sistema indicador se puede llevar
a cabo primero, para obtener transfectantes estables, que se
utilizan más tarde para una segunda transfección del vector que
contiene el dominio VHC para obtener transfectantes dobles
(transitorios o estables) útiles para la presente invención.
La presente invención abarca células huésped
eucariotas transfectadas con estos vectores. Por tanto, de acuerdo
con un aspecto específico de esta invención, se proporciona una
célula huésped transfectada con un plásmido de expresión que
comprende la molécula quimérica como se define arriba. Más
particularmente, se proporciona una línea celular de mamífero
transfectada con la molécula de ácido nucleico del NÚM. ID. SEC.:
1.
En un aspecto preferido, la célula huésped es
una célula de mamífero que se transforma de forma estable o
transitoria. Ejemplos no limitadores de células huésped y líneas
celulares de mamífero incluyen hepatocitos primarios, líneas
celulares hepáticas, fibroblastos, linfocitos, células de riñón,
etc. Más preferiblemente, se proporciona una línea celular humana
transitoriamente transfectada con la molécula quimérica. Aún más
preferiblemente, la línea celular humana es una línea celular de
riñón o hepática. Más preferiblemente, la célula huésped se puede
seleccionar del grupo que consiste en: células 293,
Huh-7, WRL68, HepG2, y Chang.
La invención abarca un método para evaluar la
actividad proteasa NS3 mediante la utilización de las moléculas
recombinantes y las células huésped transfectadas de la invención.
En un aspecto particular de la invención, se proporciona un método
para el cribado de inhibidores anti-VHC mediante el
uso de un sistema como se define arriba.
De acuerdo con un aspecto específico de este
sexto modo de realización, se proporciona un método para analizar
la actividad proteasa NS3 del VHC, que comprende los pasos de:
- a)
- primero incubar las células huésped transfectadas como se describe arriba, bajo condiciones que causan la expresión de la poliproteína NS3-5 del VHC y de dicho producto del gen indicador; y
- b)
- medida de la cantidad de dicho producto génico expresado.
De acuerdo con otro aspecto específico, se
proporciona un método para identificar un compuesto como inhibidor
de la proteasa NS3 del VHC que comprende los pasos de:
a, b) análisis de la actividad de dicha
proteasa en ausencia de dicho compuesto mediante el método definido
arriba; y
- c)
- análisis de la actividad de dicha proteasa en presencia de dicho compuesto mediante el método que se describe arriba, en el que dicho compuesto se añade a las células huésped después de dicha primera incubación, y las células huésped se incuban antes de analizar dicha actividad; y
- d)
- comparar los resultados del paso c) con los resultados del paso b).
Los análisis y métodos de la presente invención
se conducen bajo condiciones para el crecimiento de células de
mamífero que son bien conocidos por una persona con experiencia en
el ámbito, es decir, pH fisiológico, concentraciones salinas
utilizando tampones como el PBS, temperaturas entre 30ºC y 42ºC,
medios de cultivo celular adecuados y proporcionando el tiempo
suficiente para el crecimiento celular.
En un aspecto preferido del método de esta
invención, las células huésped transfectadas se incuban durante un
tiempo suficiente para permitir la expresión y el tratamiento de la
secuencia aminoacídica precursora codificada y para la expresión de
la molécula indicadora.
Más específicamente las células se incuban
durante al menos una hora y más específicamente durante al menos 18
horas, y la cantidad de producto del gen indicador en comparación
con un estándar.
Aquí, un estándar se refiere a células huésped
que no han sido transfectadas o bien a células huésped transfectadas
con un vehículo (un vector o plásmido que no lleva la molécula de
ácido nucleico recombinante que codifica la secuencia aminoacídica
precursora).
En un aspecto preferido, las células huésped
transfectadas son además incubadas en presencia o ausencia del
compuesto(s) de prueba durante aproximadamente 30 h, más
particularmente durante aproximadamente 20 h y más particularmente
durante aproximadamente 10 h, y la cantidad de producto de gen
indicador comparado.
Todas las enzimas de restricción se compraron en
Pharmacia Biotech Inc. (Quebec, Canada). Las reacciones en cadena
de la polimerasa se llevaron a cabo con polimerasa probada por ID
que se obtuvo de ID Labs (Ontario, Canada) según las instrucciones
del fabricante. La fosfatasa alcalina termoestable se obtuvo de
Gibco-BRL (MD, USA). Las reacciones de ligación se
llevaron a cabo utilizando la ligasa de DNA del T4 obtenida de
Pharmacia Biotech Inc. (Quebec, Canada), siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las quimeras VHC-tTA
se construyeron utilizando el vector pUHD15-1 que
codifica el gen tTA expresado mediante el promotor CMV (Display
Systems Biotechnology, Inc., CA, EUA), la secuencia nucleotídica
que codifica las proteínas del VHC insertadas utilizando los
lugares de restricción Xba I. El plásmido indicador de
luciferasa pUHC13-3 también se obtuvo de Display
Systems Biotechnology. El plásmido pCR3.1 se obtuvo de Invitrogen y
el virus de la vaccinia recombinante que expresa la polimerasa de
RNA del T7 se obtuvo de Bernard Moss (NIH, MD, USA). El cDNA vírico
del VHC 1b se generó mediante la RT-PCR de una
muestra de suero humano infectada con el virus utilizando cebadores
derivados de una secuencia del VHC 1b J4/83 (Número de acceso del
GeneBank: D13558) y cebadores utilizados para la amplificación de
el extremo 3' se derivaron a partir del número de acceso D36922 de
Genebank. Este cDNA del VHC se secuenció (secuencia parcial en NÚM.
ID. SEC.:1) y se utilizó como molde en las reacciones de
amplificación de los segmentos de VHC específicos utilizados para
construir las moléculas recombinantes que se muestran en las figuras
2A a 2I. Se utilizaron los métodos habituales para todas las
reacciones de amplificación, la digestión con enzimas de
restricción, la mutagénesis oligonucleotídica dirigida, la
clonación, el aislamiento de DNA plásmido, el cultivo de células,
las transfecciones y los análisis de la transferencia Western
(Sambrook et al., 1989). Los productos de amplificación que
se generaron con los pares de cebadores descritos anteriormente, se
digirieron con las enzimas de restricción Nhe I y Xba
I, y se clonaron en el plásmido pUHD15-1
restringido con Xba I, se transformaron en E. coli.
Los transformantes se seleccionaron según la direccionalidad
mediante el análisis con enzimas de restricción. Las quimeras
VHC-tTA en el marco de lectura seleccionadas se
muestran en las figuras 2A a 2I. Cada una de estas quimeras
VHC-tTA se subclonaron adicionalmente en el plásmido
pCR3 1 mediante clonación TA (Invitrogen, CA, EUA) situando, de ese
modo, las quimeras VHC-tTA bajo el control de un
promotor T7.
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Ejemplo
1
La muestra de suero humano que contiene el RNA
del VHC 1b se transcribió inversamente y se amplificó utilizando 12
cebadores sentido y anti-sentido que abarcan la
secuencia de cDNA del VHC 1b (VHC J4/83; número de acceso D13558).
La secuencia del extremo 3' se amplificó utilizando los cebadores
derivados del VHC (número de acceso: D63922) descrito por
Kolykhalov et al. (1996). Las reacciones de
RT-PCR generaron 4 fragmentos que se solapaban que
cubrían el VHC-1 b entero. Los fragmentos se
juntaron a través de la digestión en sitios de enzimas de
restricción únicos y se ligaron formando un cDNA del VHC entero.
Este cDNA resultante se secuenció en su totalidad y se utilizó como
molde en todas las reacciones de amplificación, los productos de
amplificación se utilizaron en la construcción de quimeras
descritas en este documento. La región de poliproteínas secuenciadas
fusionada al tTA se muestra en el NÚM.ID.SEC.:1 y la secuencia
aminoacídica traducida en el NÚM.ID.SEC.:2.
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Ejemplo
2
El cebador directo GGCGCTAGCGCGCCCATCACGGCCTAC
(NÚM.ID.SEC: 3) complementario al extremo 5' del gen NS3 que
contiene un sitio Nhe I, se utilizó en todas las reacciones
de amplificación. Todos los cebadores inversos complementarios al
extremo 3' utilizados aquí contienen un sitio Xba I. El
cebador indirecto GGCTCTA
GAGTAAGGGAGGTGT GAGGC (NÚM.ID.SEC.:4) se utilizó para amplificar las secuencias para las quimeras A y B e incluye el sitio de escisión P1' a P6' de NS4B. El cebador indirecto GGCTCTAGAGTAAGGGAGGTGT
GAGGGGCGCTCTTCC (NÚM.ID.SEC.:5) se utilizó para amplificar la secuencia VHC para la quimera C y corresponde al sitio de escisión P1' a P6' de NS4B, en el que se introducen sustituciones en los residuos P1-P1 de NS4A/NS4B.
GAGTAAGGGAGGTGT GAGGC (NÚM.ID.SEC.:4) se utilizó para amplificar las secuencias para las quimeras A y B e incluye el sitio de escisión P1' a P6' de NS4B. El cebador indirecto GGCTCTAGAGTAAGGGAGGTGT
GAGGGGCGCTCTTCC (NÚM.ID.SEC.:5) se utilizó para amplificar la secuencia VHC para la quimera C y corresponde al sitio de escisión P1' a P6' de NS4B, en el que se introducen sustituciones en los residuos P1-P1 de NS4A/NS4B.
Los dos cebadores indirectos solapados
GCAGCAGACGACGTCCTCGAATTCCCGGTAG AG GAC (NÚM.ID.
SEC.:6) y GGCTCTAGACCATGTGTAGGACATCGAGCAGCAGACGACGTCCTC(NÚM.ID.SEC.:7) se utilizaron para amplificar las secuencias del VHC para las quimeras D y E, en las que el sitio de escisión NS4A/NS4B de los respectivos clones A y B se reemplaza con el sitio de escisión NS5A/NS5B.
SEC.:6) y GGCTCTAGACCATGTGTAGGACATCGAGCAGCAGACGACGTCCTC(NÚM.ID.SEC.:7) se utilizaron para amplificar las secuencias del VHC para las quimeras D y E, en las que el sitio de escisión NS4A/NS4B de los respectivos clones A y B se reemplaza con el sitio de escisión NS5A/NS5B.
Los dos cebadores indirectos solapados
GCAGCAGACGACGTCCTCGAATTCCCGGTAGAGGAC (NÚM.ID.
SEC.:6) y GGCTCTAGACCATGTGTAGGACATAGGCCTGCAGACGACGTCCTC (NÚM.ID.SEC.:8) se utilizaron para amplificar la secuencia del VHC para la quimera F y corresponde al sitio de escisión P1' a P6' de NSSB en el que se introducen sustituciones en los residuos P1-P1' de NS5A/NS5B.
SEC.:6) y GGCTCTAGACCATGTGTAGGACATAGGCCTGCAGACGACGTCCTC (NÚM.ID.SEC.:8) se utilizaron para amplificar la secuencia del VHC para la quimera F y corresponde al sitio de escisión P1' a P6' de NSSB en el que se introducen sustituciones en los residuos P1-P1' de NS5A/NS5B.
La secuencia del VHC para la quimera G se generó
amplificando el cDNA del VHC entero con los cebadores de
NÚM.ID.SEC.:3 y SEQ ID NO 7. Esto produjo una secuencia que
englobaba desde NS3 hasta el codón NS5B-P6' del
VHC, incluido. Del mismo modo, la secuencia del VHC para la quimera
I se generó amplificando el molde de cDNA del VHC entero con los
cebadores de NÚM.ID.SEC.: 3 y NÚM.ID.SEC.: 8. Esto produjo una
secuencia que engloba el des del NS3 del VHC hasta el codón
NSSB-P6', incluido, y contiene una sustitución del
sitio de escisión P1-P1'.
Los clones B, E, y H se amplificaron utilizando
un molde de cDNA del VHC modificado mediante mutagénesis dirigida
con el oligonucleótido
CCCCCGGGTGCACACAGCTGCCCGGAAGATGCCCACAACGGCCCCGAAGGG
CAGAGCAGTGGGCCACCCGCAGA GCC (NÚM.ID.SEC.:9) que introduce una mutación de serina a alanina en el residuo 1165, produciendo un mutante de sitio activo de NS3.
CAGAGCAGTGGGCCACCCGCAGA GCC (NÚM.ID.SEC.:9) que introduce una mutación de serina a alanina en el residuo 1165, produciendo un mutante de sitio activo de NS3.
Las regiones no estructurales de la poliproteína
del VHC incluyen las construcciones A a I y se procesa mediante
escisión por la proteasa NS3 en la que la especificidad se determina
mediante la secuencia aminoacídica que engloba las uniones de cada
una de las proteínas. Esta preferencia del sitio de escisión se
reprodujo previamente in vitro con sustratos péptidos y con
proteasa NS3 purificada (revisado en Kwong et al., 1998).
En la presente aplicación in vivo se
examina la escisión. La expresión de la poliproteína en una gran
variedad de sistemas de expresión de heterólogos y la aparición de
proteínas del VHC maduras se controla a través de un reconocimiento
indirecto de los productos procesados mediante análisis de la
transferencia Western. En un intento de proporcionar un ensayo
basado en indicadores de alto rendimiento óptimo para la actividad
proteasa NS3, se evaluaron diferentes construcciones de segmentos de
poliproteína del VHC fusionados a un activador/indicador que se
muestra en la figura 2A a 2I.
Se construyeron tres familias diferentes de
fusiones VHC-tTA y se examinó la eficacia de la
escisión in vivo. Los resultados mostraron que la eficacia
de la escisión NS3 no sólo se determina mediante la secuencia que
engloba el sitio de escisión, sino también por el contexto
posicional del sitio respeto a otras porciones o dominios en la
poliproteína VHC.
Las tres familias de fusiones
VHC-tTA que se utilizan para demostrar estos
descubrimientos son: clones A, B y C que van de NS3 al NS4A, tienen
el activador tTA fusionado con el 6º aminoácido de NS4B, de modo que
la escisión de tTA imita el tratamiento de la proteína NS4B;
Los clones D, E y F son similares a (i) con la
excepción de que el segmento de 12 aminoácidos que va de la unión
NS4A/NS4B(DEMEEC\downarrowASHLPY) se cambió por la
secuencia que va de la unión
NS5A/NS5B(EDVVCC\downarrowSMSY
TW), esta variante posiciona el tTA en el contexto NS4B y engloba un sitio de escisión más eficiente (NS5A/NS5B); y
TW), esta variante posiciona el tTA en el contexto NS4B y engloba un sitio de escisión más eficiente (NS5A/NS5B); y
Los clones G, H e I son regiones no
estructurales del VHC que empiezan en el extremo amino de NS3 y
terminan en el sexto aminoácido de NS5B, fusionados al tTA de modo
que la escisión del tTA imita el tratamiento de la proteína NS5B en
su contexto posicional.
Las variantes (clones B, E y H) contienen una
mutación del sitio activo de la proteasa NS3(serina 1165 a
alanina, el residuo aminoacídico está en la posición 1165 a partir
del inicio de la poliproteína del VHC), estos se utilizan como
controles para demostrar que la escisión tTA depende de una proteasa
NS3 activa.
Las variantes (clones C, F, I) contienen el
sitio de escisión P1-P1' mutado a un motivo
diaminoacídico R-P, estos se usan como controles
para demostrar que el tratamiento de tTA depende exclusivamente de
una secuencia de escisión de NS3 funcional en la unión elaborada
con el activador tTA.
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Ejemplo
3
Debido a que la expresión de la proteasa NS3 del
VHC con el promotor CMV fue demasiado baja para visualizarla con el
análisis Western, verificamos la actividad de la proteasa en cada
una de las quimeras mediante la expresión de las proteínas de
fusión en células 293 utilizando el sistema de expresión del virus
de la vaccinia T7 (vvT7-3)
(Elroy-Stein, O. and Moss, B., 1998).
Las células que han crecido hasta el 60% de
confluencia en placas de 6 pocillos en DMEM-10% FBS
se infectaron con vvT7-3 (región
10-15) y se transfectaron con 5 \mug de las
construcciones A, B y C del VHC-tTA en pCR3.1,
utilizando el método del fosfato de calcio. Dieciocho horas después
de la transfección, las células se recogieron y las proteínas de
todo el lisado celular se resolvieron mediante
SDS-PAGE, se transfirieron electroforéticamente a
la membrana y la membrana se marcó con anticuerpos policlonales
específicos para VHC.
El plásmido pCR3 1 que contiene las quimeras A,
B, C, D, E, F, G, H o I se transfectó en las células 293 infectadas
por vvT7 y se examinó el tratamiento de la proteína del VHC mediante
el análisis de la transferencia Western utilizando un anti suero
policlonal específico para el VHC. Se ha demostrado que la quimera A
produce bandas reactivas de proteínas NS3 y NS4A (figuras 3A y 3B,
carriles A, respectivamente). Debido a que la proteína NS4A
comprende sólo 54 aminoácidos, es necesario correr un gel bajo
condiciones que permitan la detección de moléculas de bajo peso
molecular (figura 3B panel inferior). La quimera B, que codifica la
mutación inactiva S1165A de NS3, no procesa el precursor de la
poliproteína como se ha demostrado mediante la ausencia de las
bandas reactivas NS3 y NS4A (figuras 3A y 3B, carriles B,
respectivamente). La quimera C, con una mutación de sitio de
escisión NS4A/NS4B produce una banda reactiva que corresponde a la
NS3 madura (figura 3A, carriles C) pero no produce una banda
reactiva de NS4A maduro. La ausencia de escisión en el sitio de
escisión NS4A-tTA (figura 3B, carriles C), se
confirma mediante la detección de la fusión NS4A-tTa
en el análisis de la transferencia Western con
anti-NS4A.
En las quimeras D, E y F el sitio de escisión
NS4A/4B se reemplazó con un sitio de escisión NS5A/5B. La expresión
de las células huésped transfectadas que contenían la quimera D
produce una banda reactiva que corresponde a la proteína NS3 madura
(figura 4, carriles D). La quimera E, con la mutación S1165A no
tiene una banda reactiva NS3 aparente (figura 4, carriles E),
demostrando que el precursor de la poliproteína no se procesa. La
quimera F, con una proteasa NS3 activa produce una NS3 madura pero
tiene una mutación en el sitio de escisión que supuestamente
bloquea la escisión en el sitio de escisión NS4A-tTA
(figura 4, carriles F).
El antisuero anti-NS4A
disponible reconoce un epítope en el extremo
C-terminal de la proteína NS4A. Se ha modificado
este segmento de las quimeras D, E y F para obtener el sitio de
escisión NS5A/NS5B. Por lo tanto, el análisis de la transferencia
Western para estas quimeras utilizando un antisuero
anti-NS4A como sonda no puede detectar el NS4A
modificado.
Las quimeras G, H e I contienen la mayoría de
las poliproteínas del VHC. La expresión de los transfectantes que
contienen la quimera G resultó en la poliproteína precursora
procesada para las proteínas maduras esperadas, NS3, NS4A, y NS5A.
Estas se visualizaron mediante análisis de la transferencia Western
marcando con el antisuero respectivo (figuras 5A, 5B y 5C, carriles
G, respectivamente). La quimera H, que tiene la mutación S1165A e
inactiva NS3 no procesa el precursor de la poliproteína y no produce
ninguna de las proteínas maduras (figuras 5, carriles H). La
quimera I, que tiene una mutación del sitio de escisión NS5A/5B,
produce proteínas NS3 y NS4A maduras (figuras 5A y 5B, carriles I)
y no puede provocar una escisión en el sitio de escisión NS5A/tTA
(figuras 5C, carriles
I).
I).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Cada una de las tres familias (clones A, D, y G)
de quimeras VHC-tTA y variantes mutadas en el sitio
de corte y en el sitio activo se cotransfectaron con el indicador
pUHC13-3 en células 293 para determinar la extensión
de la expresión de la luciferasa dependiente de NS3 (figura 6). Las
células en pocillos de 35 mm se cotransfectaron con cada una de las
construcciones descritas en las figuras 2A a 2I y el plásmido
indicador pUHC13-3, utilizando el método del
fosfato de calcio. Las células se recogieron 48 después de la
transfección y se lavaron dos veces en soluciones salinas de
fosfato tamponadas. Las células recogidas se lisaron en 200 \muL
de tampón de lisis (trifosfato 25 mM pH 7,8, DTT 2 mM, 1,2 de ácido
diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético
2 mM, glicerol al 10% y Triton X-100 al 1%) y se
centrifugaron durante 5 min a 12000 g. Se mezcló un alícuota de 10
\muL de sobrenadante con 50 \muL del reactivo del análisis de la
luciferasa (Promega) en placas de 96 pocillos y la cantidad de luz
producida se midió utilizando un luminómetro Digene o un
centellómetro Packard.
La quimera A produjo \approx 1200000 cps de
actividad luciferasa, esta señal es 2-3 veces
superior a la de la luciferasa (500000 cps) producida por la
quimera B (proteasa NS3 inactiva) y la quimera C (mutación del
sitio de esci-
sión).
sión).
La familia de fusión VHC-tTA
representada por la quimera D produjo 1300000 cps de actividad
luciferasa en las células 293. La dependencia de NS3 de esta señal
se destaca por la cantidad significativamente inferior de
luciferasa (100000-300000 cps) producida por la
quimera E (proteasa NS3 inactiva) y la quimera F (mutación del
sitio de escisión). La fusión de VHC-tTA más larga
representada por la quimera G produjo la señal luciferasa más
elevada (\approx2200000 cps). La dependencia de NS3 de esta señal
se refuerza mediante la baja cantidad de luciferasa
(100,000-300,000 cps) producida por las quimeras H
(proteasa NS3 inactiva) y la quimera I (mutación del sitio de
escisión). La señal de luciferasa dependiente de NS3 producida en
las 293 células transfectadas se puede expresar como una proporción
de la señal obtenida a partir de tipo natural/mutantes del sitio
activo (figura 7). La proporción de A/B, D/E y G/H produce una
activación de la luciferasa de 3, 15,4 y 28,1 veces mayor,
respectiva-
mente.
mente.
Estos resultados muestran que la construcción G
que tiene todos los dominios de la poliproteína
NS3-5 del VHC (incluyendo la región de NS3 hasta el
sexto aminoácido de NS5B) contiene el sitio de escisión NS5A/NS5B
precedido por su contexto "natural", produjo la activación más
elevada de luciferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Los tTA maduros expresados a partir de las
quimeras VHC-tTA funciona de un modo controlable por
tetraciclina. Por ejemplo, la figura 8 muestra que los lisados de
células cotransfectadas con la quimera G expresada a partir de los
indicadores pUD15-1 y pUHC13-3
muestra actividad luciferasa sensible a la tetraciclina. Las células
que expresan la quimera G en ausencia de tetraciclina producen más
de 2000000 cps de actividad luciferasa. En presencia de la
tetraciclina, la actividad del activador tTA maduro se inhibe,
resultando en 40000 cps de actividad luciferasa. En ausencia de la
tetraciclina, la cantidad de luciferasa producida por los
transfectantes de la quimera G es de la misma magnitud que la
cantidad de luciferasa producida a partir del control
pUHD15-1. Además, la cotransfección de la quimera H
y el pUHC13-3 demuestra que la activación tTA de la
luciferasa requiere una proteasa NS3 activa. Los transfectantes de
la quimera H que codifican una proteasa inactiva no producen un tTA
maduro, resultando en sólo 90000 cps de actividad luciferasa.
\newpage
Ejemplo
6
Debido a que el VHC se encuentra en células
hepáticas, fue importante verificar que este análisis funcionaba
igual de bien para las células hepáticas. Por lo tanto, la
activación de la luciferasa se examinó en la línea celular hepática
WRL68 para cada una de las quimeras (figura 9). Se observó que la
activación en esta línea celular era dependiente de NS3 y la
eficacia de activar la expresión en las diferentes quimeras (figura
10) es análoga a la eficacia de activación de las quimeras en
células 293.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Un aspecto crítico de los experimentos de
cotransfección es la cantidad de DNA plasmídico introducido en las
células. Estos dos componentes del sistema necesitan optimización de
las cantidades relativas de plásmido VHC-tTA y
plásmido indicador de luciferasa. Se cotransfectó una variación de
0,1 a 1 \mug de plásmido VHC-tTA G en células 293
(con una confluencia del 50% in placas de 6 pocillos) con 0,2 \mug
del plásmido indicador de luciferasa pUHC13-3
(Figura 11). La activación óptima de la luciferasa en estos
transfectantes se consiguió con de 0,4 a 0,7 \mug de plásmido
VHC-tTA. De modo similar, la activación óptima de la
luciferasa se observó en de 0,4 a 0,7 \mug de
VHC-tTA de quimera G en células WRL68 (figura
12).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
La proteasa NS3 producida a partir de la
poliproteína entera puede escindir la unión NS5A/5B en trans (Tomei
et al., 1993; Bartenschlager et al., 1994; Lin et
al., 1994). La utilidad de las quimeras VHC-tTA
se utilizó para demostrar la actividad de escisión de NS3 en trans.
La figura 13 desvela que la quimera G puede activar la expresión de
luciferasa para generar \approx2000000 cps. La quimera H y la I,
que contienen una proteasa inactiva y una mutación del sitio de
escisión en la unión tTA, respectivamente, activan una cantidad
significativamente menor de luciferasa (ver figura 5). Una triple
transfección de la quimera H, I y del indicador
pUHC13-3 en células 293 reestablece la actividad
luciferasa (2000000 cps) demostrando que la proteasa NS3 activa
expresada a partir de la quimera I puede escindir la unión
"nativa" (no modificada) NS5A/5B codificada en la quimera H.
Una transfección triple similar en la línea celular hepática WRL68
reestablece parcialmente la actividad luciferasa (figura 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Las células hepáticas Huh-7
cultivadas en medio CHO-SFMII (GIBCO BRL)
complementadas con suero bovino fetal al 10% se cotransfectaron con
la quimera G y un plásmido indicador pUHC13-3 SEAP
(pUHC 13-3 modificado) utilizando un FuGene6
Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany). El plásmido indicador pUHC
13-3 se modificó mediante la sustitución de la
luciferasa con SEAP. Después de una incubación de 5h, las células se
lavaron, se tripsinizaron y se pusieron en placas a razón de 80000
células por pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos que
contenían diferentes concentraciones del compuesto, y se incubaron
durante 24h. La cantidad de SEAP secretado en el medio se midió con
el substrato Phospha-light (Tropix Inc., MA,
EUA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El ensayo aquí descrito se validó con un
compuesto que demostró que inhibía la proteasa NS3 a una IC_{50}
de 40 nM mediante el análisis enzimático descrito en WO 00/09543. La
figura 15 muestra que la cantidad de SEAP secretada medida se
reduce en un modo de dependencia de dosis. Este resultado además
muestra que este compuesto es permeable a las células y retiene su
eficiencia inhibidora en un análisis basado en células. El
EC_{50} de este compuesto, tal y como se determina en el análisis
de la presente invención es de 75 nM. El aumento de la
concentración del compuesto resultó en una disminución dependiente
de dosis en la cantidad de SEAP secretado, correspondiente a un
aumento de la inhibición en la escisión en uno o más sitio(s)
mediante la actividad proteasa. Además, en el experimento control
(figura 15, cuadros abiertos) el compuesto no inhibió
significativamente la actividad tTA control en concentraciones por
debajo de 1 \muM. Este compuesto valida la utilidad y
especificidad del análisis de la presente invención.
Un resultado sorprendente y ventajoso de la
presente invención es que la molécula quimérica del VHC que engloba
todos los sitios de escisión de la poliproteína NS3 natural hasta
aproximadamente el sexto aminoácido del NS5B sea la construcción
más efectiva para el propósito de evaluar la actividad proteasa de
NS3 del VHC en células de mamífero. Esta quimera imita el
tratamiento de la región no estructural entera del VHC que forma el
complejo heterodímero de proteasa NS3-NS4A,
mejorando de ese modo la actividad de la actividad proteasa NS3. La
eficacia mejorada de esta actividad recombinante ha proporcionado la
base para un nuevo sistema para analizar la actividad proteasa NS3
que es más específico y sensible que otros análisis conocidos.
Además, este nuevo sistema mejorado es muy útil para establecer un
sistema de análisis para analizar los inhibidores de la actividad
proteasa que se pueden llegar a analizar un sistema de análisis de
alto rendimiento.
Como se verá en las figuras 7 y 8, el
Solicitante ha reproducido construcciones representativas de la
técnica (construcciones A y D) y ha intentado, sin obtener
resultados óptimos, utilizar este sistema en un análisis de alto
rendimiento. La señal obtenida y el índice señal/ruido no fueron
óptimos para permitir una automatización del ensayo.
Un modo de mejorar la sensibilidad del análisis
ha sido proporcionar una construcción que reproduce sustancialmente
la conformación auténtica de la poliproteína NS3-5
madura, imitando de ese modo la actividad proteasa NS3 en su
contexto natural.
Sorprendentemente, comparado con los sistemas de
la técnica, la construcción de la presente invención proporciona un
aumento de el índice de señal/ruido de x2 a x6 veces.
El Solicitante ha desarrollado, por lo tanto, un
sistema basado en células nuevo y mejorado para medir la actividad
proteasa de un modo fiable y reproducible.
Después de llevar a cabo los experimentos de las
figuras 7 y 9, el Solicitante descubrió sorprendentemente que los
sitios de escisión adicionales en el substrato de la proteasa
mejoran la señal obtenida. Esto es sorprendente en la medida que
sólo una molécula transactivadora se libera, mientras que el
sustrato se escinde en un lugar, en dos o en tres. El hecho de que
la señal aumente es imprevisto y favorable para este sistema. Más
específicamente, las figuras 7 y 9 muestran el aumento de señal
obtenido cuando se utiliza la construcción A (1 sitio de escisión,
descrito en la técnica) frente a la construcción D (un sitio de
escisión más) frente a la construcción G (poliproteína natural). El
Solicitante no podía haber pronosticado que la construcción G podía
proporcionar un aumento en la actividad suficientemente elevado y
reproducible como para establecer un análisis de alto
rendimiento.
Las figuras 8 y 10 muestran que dependiendo de
la línea celular utilizada, cada sitio de escisión adicional
proporciona entre 2 a 6 veces más señal sin aumentar la señal de
fondo, indicando que la incorporación de sitios de escisión
adicionales transmite un aumento de la actividad al sistema por
encima de lo que se esperaba, que no preveía la técnica.
Además del aumento de actividad, parece que hay
un aumento en la especificidad de las escisiones secuenciales
mediante la proteasa NS3. Una teoría que ha surgido recientemente
basada en los estudios estructurales in vitro de la proteasa
NS3 del VHC es que la maquinaria catalítica de la proteasa NS3 se
estabiliza mediante sustratos específicos que contribuyen a la
activación enzimática a través de un mecanismo inducción del encaje
(Barbato et al, 2000,EMBO J., 19, 1195-1206).
Las reivindicaciones que se desprenden de esta invención que
puntualizan que un análisis basado en células in vivo que
incorpora sustratos múltiples, tal y como se presenta en el
contexto de una poliproteína, resulta en una proteasa NS3 con una
actividad específica basada en células más elevada, proporciona un
apoyo biológico a esta teoría.
El nivel de expresión de la poliproteína es tan
bajo con los sistemas de expresión no citopáticos, como el promotor
del CMV, que no se puede visualizar la proteína expresada (a menos
que se utilice el sistema de expresión del virus de la vaccinia).
Por esta razón, es muy sorprendente que un nivel tan bajo de
expresión proporcione una detección de luciferasa o SEAP tan
buena.
Ausubel et al, 1994,
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York.
Barbato et al, 2000. EMBO J., 19,
1195-1206 Bartenschlager, R. et al,
1993, J. Virol., 67, 3835-3844.
Bartenschlager, R. et al, 1994, J. Virol.,
68, 8147-8157.
Cho, Y. G. et al, 1997,
J. Vir. Meth., 65, 201-207. Cho, Y. G.
et al, 1998, J. Vir. Meth.,
72,109-115.
Elroy-Stein, O. and
Moss, B. 1998, Current Protocois in Molecular
Biology, Wiley, New York.
Griffiths and Page, 1994,
Methods in Molec. Biol., 75, 427-440.
Gossen, M. and Bujard. H.,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89,
5547-5551. Grakoui, A. et al, 1993(a), J. Virol. 67,1385-1395.
Grakoui A, et al., 1993(b), Proc Natl Acad
Sci USA, 90, 10583-7 Hijikata, M.
et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
88, 5547-5551. Hijikata, M. et
al., 1993, J. Virol. 67,
4665-4675.
Hirowatari, Y. et al., 1995, Anal. Biochem., 225,113-220.
IUPAC-IUB Biochemical
Nomenclature Commission, 1972, Biochemistry,
11, 17261732.
Kim, D. W. et al., 1995,
Biochem. Biophys. Res. Comm., 215,160-166.
Kim et al, 1999, Arch. Virol,
144, 329-343.
Kolykhalov et al., 1996,
J. Virol., 70, 3363-3371,
Kwong A D. et al, 1998,
Antiviral Res., 40,1-18. Lin, C. et
al., 1994, J. Virol., 68,
8147-8157.
Llinas-Brunet, M. et
al, 1998, Bioorganic & Med. Chem. Letters,
8, 2719-2724. Lohmann et al.,
1999, Science, 285,110-113.
Love, R. A. et. al., 1996,
Cell, 87, 331-342.
Luckow. V. A., 1993, Curr. Op.
Biotech., 4,564-572.
Merrington et al., 1997,
Molec. Biotech., 8(3), 283-297.
Overton, H. et al., 1995, J. Gen.
Virol., 76, 3009-3019
Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Labs.
Song et al., 1996, Mol.
Cells, 6,183-189.
Steinkuhler, C. et al., 1998. Biochemistry, 37,
8899-8905. Tomel, L. et al.,
1993, J. Virol., 67, 4017-4026.
<110> BOEHRINGER INGELHEIM (CANADÁ)
LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sistema basado en células
sustitutivas y método para analizar la actividad de la proteasa NS3
del virus de la Hepatitis C.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> secuencia
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/132,360
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-04
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenteIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de cDNA parcial de VHC
(NS3-5B') fusionada a un transactivador tTA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1736
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: región de la poliproteína del VHC parcial
(NS3-5B') fusionada a un transactivador tTA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador directo complementario al extremo 5' del gen NS3
del VHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgctagcg cgcccatcac ggcctac
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador indirecto complementario al extremo 3' del
dominio NS4A, incluyendo el sitio de escisión NS4A/4B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctctagag taagggaggt gtgaggc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador indirecto complementario al extremo 3' del
dominio NS4A, incluyendo el sitio de escisión NS4A/4B mutado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctctagag taagggaggt gtgaggggcg ctcttcc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador indirecto complementario al extremo 3'del NS4A,
incluyendo los últimos 6 codones del NS5A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagcagacg acgtcctcga attcccggta gaggac
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador indirecto complementario al sitio de escisión
NS5A/5B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctctagac catgtgtagg acatcgagca gcagacgacg tcctc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador indirecto complementario al sitio de escisión
5A/5B mutado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctctagac catgtgtagg acataggcct gcagacgacg tcctc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador indirecto para el mutante NS3 S1165A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
Claims (22)
1. Un sistema basado en células experimentales
para evaluar la actividad proteasa de la proteasa NS3 del virus de
la Hepatitis C que comprende:
a) una primera molécula de DNA quimérica que
comprende:
- i)
- un sistema promotor no citopático capaz de inducir la expresión de dicha primera quimera después de la transfección a una célula de mamífero;
- ii)
- una molécula de DNA del VHC funcionalmente unida a dicho sistema de expresión, que dicha molécula de DNA del VHC se define por los nucleótidos 1 a 4206 del NÚM. ID. SEC.:1;
- y
- iii)
- y un dominio transactivador fusionado a 3' de dicha molécula de DNA del VHC. Este dominio transactivador codifica una molécula transactivadora capaz de iniciar la expresión de un gen indicador donde dicho transactivador es el transactivador de la tetraciclina (tTA) definido por los nucleótidos 4207 a 5211 del NÚM. ID. SEC.:1;
- y
b) una segunda molécula de DNA quimérica que
codifica dicho gen indicador co-unido a un operón
que responde a dicha molécula transactivadora; donde la expresión
de dicha primera molécula de DNA quimérica lleva a la producción de
una poliproteína de fusión anclada al retículo endoplasmático de
dicha célula de mamífero. Esta proteína anclada se puede cortar por
dicha proteasa permitiendo de ese modo la translocación de dicho
dominio transactivador para inducir la expresión de dicho gen
indicador como un modo de evaluar dicha actividad proteasa.
2. Un sistema basado en células experimentales
según la reivindicación 1, donde dicha molécula de DNA del VHC
codifica una poliproteína definida por los aminoácidos
1-1402 del NÚM. ID. SEC. 2.
3. Un sistema basado en células experimentales
según la reivindicación 1, donde dicho sistema promotor no
citopático se selecciona del grupo que consistente en: el promotor
CMV, el sistema promotor temprano de SV40 o el sistema promotor LTR
del RSV (virus del Sarcoma de Rous).
4. Un sistema basado en células experimentales
según la reivindicación 1, donde en iii), cuando dicho
transactivador se escinde de la proteína de fusión, migra al núcleo
para activar la expresión de un gen indicador, el producto del cual
se puede medir como un promedio para evaluar la actividad de la
proteasa NS3.
5. Un sistema basado en células experimentales
según la reivindicación 1, donde ii) y iii) de dicha primera
molécula de DNA quimérica codifica la poliproteína del NÚM. ID. SEC.
2.
6. Un sistema basado en células experimentales
según la reivindicación 1, donde dicho gen indicador codifica una
molécula indicadora que se selecciona del grupo que consiste en:
fosfatasa alcalina secretada (SEAP),
\beta-galactosidasa, luciferasa, cloramfenicol
aminotransferasa y proteína fluorescente verde.
7. Un sistema basado en células experimentales
según la reivindicación 6, donde dicha molécula indicadora es la
SEAP o la luciferasa.
8. Un sistema basado en células experimentales
según la reivindicación 7, donde dicha molécula indicadora es la
SEAP.
9. Una molécula de DNA recombinante como se
define en el NÚM. ID. SEC.: 1.
10. Una proteína recombinante como se define en
NÚM. ID. SEC.:2.
11. Un plásmido de expresión para la
transfección a una célula huésped de mamífero. Este plásmido
contiene una molécula de DNA como se define en la reivindicación
9.
12. Una célula huésped eucariota
co-transfectada con el plásmido de expresión según
la reivindicación 11 y con otro plásmido de expresión que comprende
la segunda molécula de DNA quimérica según la reivindicación 1.
13. Una línea celular de mamífero transfectada
con el plásmido de expresión según la reivindicación 11.
14. Una línea celular de mamífero según la
reivindicación 13, seleccionada del grupo que consiste en:
hepatocitos primarios, líneas celulares hepáticas, fibroblastos,
linfocitos, células renales.
15. Una línea celular de mamífero según la
reivindicación 14, seleccionada del grupo que consiste en: células
hepáticas 293, Huh-7, WRL68, HepG2, y Chang.
16. Un método para evaluar la actividad proteasa
NS3, que comprende los pasos de:
- a)
- primero incubar una célula huésped transfectada como se define en la reivindicación 13 bajo condiciones que causan la expresión de la poliproteína de la proteasa del VHC y dicho producto génico indicador; y
- b)
- medir la cantidad de dicho producto génico expresado.
17. Un método según la reivindicación 16, donde
en el paso a) se incuban las células durante al menos 1 hora.
18. Un método según la reivindicación 17, donde
se incuban las células durante aproximadamente 18 horas.
19. Un método para identificar inhibidores
potenciales de la actividad proteasa NS3 del VHC que comprende el
método de la reivindicación 16, y que además comprende los pasos
de:
- c)
- analizar la actividad de dicha proteasa en presencia de dicho inhibidor potencial mediante el método según la reivindicación 16, donde dicho compuesto se añade a las células huésped después del paso a) y las células huésped son incubadas antes de analizar dicha actividad en el paso b) y
- d)
- comparar los resultados del paso b) con los resultados del paso c).
20. Un método según la reivindicación 19, donde
las células huésped transfectadas se incuban en presencia o
ausencia de un inhibidor potencial durante aproximadamente 30
horas.
21. Un método según la reivindicación 19, donde
las células se incuban durante aproximadamente 20 horas.
22. Un método según la reivindicación 19, donde
las células se incuban durante aproximadamente 10 horas.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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