DE10234418A1

DE10234418A1 - Verfahren zur Untersuchung und Beurteilung von Virusenzymen im HTS

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Publication number: DE10234418A1
Application number: DE2002134418
Authority: DE
Inventors: Thorsten Dr. Schmidt
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2002-07-29
Publication date: 2004-02-12
Also published as: WO2004013349A2; AU2003250068A1; AU2003250068A8; WO2004013349A3

Abstract

Offenbart werden Zellkultursysteme zur Untersuchung der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) und zur Identifizierung von Substanzen im Hochdurchsatzcreening (HTS), welche die Aktivität der Proteasen modulieren. Das System ist modular aufgebaut und bietet daher die Möglichkeit, sowohl eine "cis"- als auch eine "trans"-Spaltungsaktivität je nach Proteasetyp und Aufbau zu untersuchen.

Description

Offenbart werden Zellkultursysteme zur Untersuchung der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) und zur Identifizierung von Substanzen im Hochdurchsatzscreening (HTS), welche die Aktivität der Proteasen modulieren. Das System ist modular aufgebaut und bietet daher die Möglichkeit, sowohl eine „cis" als auch eine „trans"-Spaltungsaktivität je nach Proteasetyp und Aufbau zu untersuchen.
Virale Infektionen, beispielsweise verursacht durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), das Hepatitis C Virus (HCV), das Human Cytomegalie Virus (HCMV) und die damit verbundenen Erkrankungen wie AIDS, Hepatitis, Leberzirrhose, Retinitis und Erblindung, Pneumonie, multiples Organversagen, stellen für die Gesundheit der Weltbevölkerung ein sehr großes Problem dar. So sind z.B. über 100 Millionen Menschen weltweit mit dem Hepatitis C Virus infiziert, wobei ein hoher Prozentsatz der infizierten Personen eine chronische Leberinfektion entwickelt und an den Folgen der Erkrankung wie Leberzirrhose, hepatozelluläres Karzinom verstirbt [Zein, N. (2000)]. Die Suche nach neuen antiviralen Wirkstoffen gestaltet sich aufgrund der hohen Pathogenität und Komplexität der Erreger als sehr schwierig. In vielen Fällen ist eine schnelle Identifizierung von Wirksubstanzen nicht möglich, da eine Untersuchung der Vermehrung der Viren im „Hoch Durchsatz Screening" (High Throughput Screening, HTS) aus sicherheitstechnischen Erwägungen – Erfordernis des L2 oder L3 Standards der Laboratoriumssicherheit- oder experimentellen Gründen nicht möglich ist. So gibt es z.B. zum derzeitigen Zeitpunkt kein verlässliches Zellkultursystem, in welchem die Vermehrung des HCV Virus nachgestellt werden kann. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu umgehen, besteht darin, die einzelnen enzymatischen Vorgänge wie beispielsweise die DNS-Vermehrung, die Proteinspaltung, die Virusbildung separat zu betrachten und getrennt von einander zu untersuchen. Neben den viralen Polymerasen nehmen bei der Virusvermehrung auch virale Proteasen wie beispielsweise HCV NS2/NS3, NS3, NS3/4A eine Schlüsselrolle ein, da sie für die virale Replikation essentiell sind und eine hohe virusabhängige Spezifität aufweisen. Virale Proteasen bilden somit einen interessanten Angriffspunkt für die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe [Wang et al., (2000)].
Das HCV Virus ist ein umhülltes positiv-Strang RNS-Virus, das zur Familie der Flaviviren gehört. Das RNA Genom hat eine Größe von ca. 9500 Ribonukleotiden und kodiert für ein einzelnes Polyprotein mit ca. 3000 Aminosäuren, das in vivo durch zelluläre und virale Proteasen in 10 einzelne Proteine gespalten wird. Dabei unterscheidet man zwischen den Strukturproteinen (C, E1, E2, P7) und den Nichtstrukturproteinen (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b). Die Strukturproteine, welche durch Spaltung von zellulären Proteasen aus dem Polyprotein hervorgehen, bilden die spätere Hülle des Virus. Die Nicht – Strukturproteine, welche die Vermehrung der viralen DNS katalysieren, werden hingegen durch die zwei viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A gespalten. Dabei kommt es in einem ersten Schritt durch die Metalloprotease NS2/NS3 zu einer autokatalytischen Spaltung zwischen den beiden Proteinen NS2 und NS3 („cis"-Spaltung I). In einem weiteren Schritt spaltet sich die nun aminoterminal freiliegende Protease NS3 (Serinprotease) von dem Protein NS4a ab („cis"- Spaltung II ). Nachfolgend bildet die Protease NS3 mit dem kleinen NS4a Protein einen Komplex und katalysiert die Spaltung zwischen den restlichen Nicht – Strukturproteinen („trans"-Spaltung III zwischen NS4a/NS4b, NS4b/NS5a und NS5a/NS5b) [Übersicht siehe Bartenschlager, (1999)].
Die zentrale Stellung der Proteasen NS2 und NS3 bzw. NS3/4A im Verlaufe der HCV Virusreplikation macht diese zu einem sehr interessanten Angriffspunkt auf der Suche nach Aktivitätsmodulatoren, die therapeutisch eingesetzt werden könnten. Allerdings ist, wie bereits erwähnt, kein zelluläres Vermehrungsmodell verfügbar, das im Hochdurchsatzverfahren einzusetzen ist, und auch biochemische in vitro Assays brachten bisher keinen Erfolg.
Obwohl bereits eine Vielzahl an Systemen zur Untersuchung der HCV Proteasen beschrieben sind, weisen diese jedoch verschiedene Limitationen auf, die einen Einsatz im Hochdurchsatzverfahren nicht ermöglichen bzw. aus wissenschaftlichen Gründen nicht für sinnvoll erachten lassen.
Ein System zur Messung der NS3/4A Proteaseaktivität unter Verwendung des viralen Sindbis Replikationssystems wird von Cho, Y.G. et al., (1997) beschrieben. Dabei wird ein Hybridkonstrukt, bestehend aus der HCV Protease NS3/4A, der NS4a/4b Spaltstelle und dem Sindbis Core Protein in Zellen eingebracht. Die Bildung von Sindbis Viruspartikeln ist somit von der Spaltung der NS4a/4b Schnittstelle und der Freisetzung des core-Proteins abhängig. Ein sehr großer Nachteil dieses Systems ist, dass die Proteaseaktivität indirekt über den zytopathischen Effekt der entstehenden rekombinanten Sindbis Viren gemessen werden muss, der eine längere Inkubationszeit voraussetzt, dessen Quantifizierung schwierig ist und der im Hochdurchsatzverfahren nur schwer gemessen werden kann. Des weiteren bietet dieses komplexe System eine Vielzahl von Angriffspunkten für unspezifische, d.h. nicht proteaseabhängige Inhibitoren, da auch Wirksubstanzen, die unabhängig von der Proteasefunktion die Virusbildung verhindern, als potentielle Wirksubstanzen auftreten würden. Dadurch wird die Zahl der genauer zu untersuchenden Substanzen stark erhöht, was wiederum eine zeit- und kostenaufwändige Nachtestung der Substanzen erforderlich machte. Außerdem ist eine Messung der NS2/3 Proteaseaktivität in diesem System nicht möglich.
Des weiteren beschreiben Cho, Y.G. et al., (1998) einen Proteaseassay unter Verwendung eines Expressionsvektors, bestehend aus der NS3/4A Protease und der NS4a/4b Schnittstelle fusioniert an das Secreted Alkaline Phosphatase (SEAP) Gen. Bringt man dieses Konstrukt in eukaryontische Zellen ein, kommt es durch die NS3/4A vermittelte Spaltung der NS4a/4b Schnittstelle zur Freisetzung der alkalischen Phosphatase, die in den Überstand sezerniert wird und gemessen werden kann. Ein großer Nachteil dieses Systems liegt darin, dass die Menge an freigesetzter Phosphatase linear proportional der Menge exprimierter und gespaltener Fusions proteine ist und somit das Signal keine Verstärkung erfährt und zu gering für eine Messung im Hochdurchsatzverfahren ist. Außerdem bietet der notwendige zelluläre Export der Phosphate und die damit verbundenen involvierten zellulären Vorgänge neben der Transkription und Translation einen weiteren Angriffspunkt für unspezifische Inhibitoren, was eine aufwendige Nachtestung erforderlich macht. Auch in diesem Fall ist eine Messung der NS2/3 Proteaseaktivität nicht möglich.
Ein System, in welchem verschiedene Proteasekonstrukte und entsprechend zu spaltende Zielkonstrukte über rekombinate Baculoviren in Insektenzellen eingebracht werden und die Spaltungsprodukte immunologisch im „Westernblot" nachgewiesen werden können beschreiben Overton, H. et al., (1995). Zum einen hat dieses Verfahren den Nachteil, dass die Proteasereaktion in Insektenzellen und nicht in Säugetierzellen nachgestellt wird und somit mögliche wichtige zelluläre Faktoren nicht berücksichtigt werden, zum anderen ist die Nachweismethode nicht für ein Hochdurchsatzscreening (HTS-Screening) geeignet.
Hirowatari, Y. et al. (1995) entwickelten eine Methode, bei der zwei Expressionskonstrukte in Säugetierzellen eingebracht werden. Das eine Konstrukt beinhaltet – in Kombination mit dem DHFR Gen – das NS2/3 Proteasegen bzw. Fragmente davon, an das über die NS5a/5b Schnittstellensequenz der Transaktivator Tax (HTLV-1) fusioniert ist. Das zweite Konstrukt enthält ein Reportergen (Cat), welches über einen Tax abhängigen Promotor reguliert wird. In vivo führt die Spaltung der NS5a/5b Schnittstelle durch die NS2 oder NS3 Protease zur Freisetzung des Transkriptionsfaktors Tax, der dann die Expression des Reporters hervorrufen kann. Ein großer Nachteil dieses Systems liegt darin, dass nicht zwischen der Aktivität der NS2 und NS3 Protease zu unterscheiden ist . Darüber hinaus wird in diesem System bei der Untersuchung der NS3 Aktivität nicht die modulatorische Funktion des NS3 Protease-Kofaktors NS4a berücksichtigt, da er in diesem System nicht vorhanden ist und somit wirksame Inhibitoren der NS3/4A vermittelten Transspaltung nicht identifiziert werden können.
In WO 98/00548 wird die Generierung von hybriden Picornaviren, deren Replikation abhängig von der Proteaseaktivität von NS3 ist, offenbart. Da die NS3 Aktivität indirekt über die Anzahl gebildeter Viren mittels eines zellulären Plaque-Assays quantifiziert wird, ist auch dieses System nicht im HTS-Verfahren durchführbar.
Mit einem System der Firma Agouron Pharma (WO 00/08469) wird die Aktivität der NS3 Protease über die Sekretion der sekretorischen alkalischen Phosphatase nachgewiesen. Auch hier ist nachteilig, dass beispielsweise intrazelluläre Transportvorgänge neben der Transkription und Translation einen weiteren Angriffspunkt für unspezifische Inhibitoren darstellen, was eine aufwendige Nachtestung zur Aussonderung unspezifischer Ergebnisse erforderlich macht.
Die gleichen Nachteile weist auch das System der Firma Vertex auf (US 5861267), welches die Proteaseaktivität von NS3 durch Korrelation mit der Menge von sezerniertem IL-1 quantifiziert. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass nur die Protease NS3 nicht aber NS2/3 bzw. NS3/4A nachgewiesen werden können. Zudem ist die Menge des sezernierten IL-1 Proteins linear proportional zur Proteaseaktivität, so dass keine für die Durchführung im HTS-Verfahren ausreichende Verstärkung erzielt wird.
Die Schrift WO 00/66623 offenbart ein zelluläres Surrogatsystem bestehend aus einem chimären Protein zwischen NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b und einem tetrazyclinabhängigen Transkriptionsfaktor, der nach einer NS3 abhängigen Spaltung freigesetzt wird und die Expression eines Reporters in den Zellen bewirkt. Auch hier ist ein Nachweis der NS2/3 Proteasereaktion nicht möglich. Außerdem ist durch Zugabe von Tetrazyclin eine zusätzliche Substanz in dem System, welche die Ergebnisse verfälschen kann.
Die aufgeführten Beispiele zeigen die Grenzen der gegenwärtig verfügbaren Systeme und verdeutlichen den Bedarf für die Entwicklung solcher neuen Systeme, die es ermöglichen, eine große Anzahl chemischer und biologischer Substanzen auf ihre Aktivität an HCV Proteasen zu untersuchen.
Es besteht deshalb dringender Bedarf, zelluläre Systeme zu entwickeln, die die Untersuchung der Proteasen in ihrem biologischen Umfeld – beispielsweise in Hepatozyten oder Hepatomazellen – ermöglichen, um so den Einfluss zellulärer Faktoren zu berücksichtigen, und die es gleichzeitig erlauben, die verschiedenen Proteaseaktivitäten – NS2/3 und NS3/4A – separat zu betrachten, um aufgrund der verschiedenen enzymatischen Kinetiken der Proteasereaktionen und deren Charakterisierung etwaige Wirksubstanzen einfacher und schneller auffinden zu können. Weiter müssen solche neuen Systeme in ihrer Durchführung und Auswertung einfach, schnell und sicher – also unter S1/L1 Bedingungen durchführbar – sein, um ihre Durchführung im Hochdurchsatzverfahren zu ermöglichen.
Die vorliegende Anmeldung betrifft zelluläre Systeme, die es möglich machen, die Wirksamkeit chemischer Substanzen auf die verschiedenen HCV Proteasen separat, schnell und einfach, entsprechend den vorstehend genannten Anforderungen im Hochdurchsatzverfahren, zu untersuchen.
Ein Ansatzpunkt bei der Entwicklung der nachfolgend beschriebenen Systeme gründet auf der Überlegung, dass transkriptionelle Regulatoren – transkriptionelle Regulatoren der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die die Expression eines Reportergens regulieren, also die Expression eines Reportergens erhöhen oder erniedrigen – nur dann ihrer natürlichen Funktion nachkommen können, wenn sie betreffend ihre DNA bindende und regulatorische Domäne funktional sind und im richtigen Zellkompartiment, bei Eukaryonten also dem Zellkern, lokalisiert sind. Die enzymatische Wirkweise von Proteasen bietet die Möglichkeit, sowohl die Funktionalität als auch die Lokalisation von Zielproteinen zu modulieren. Ebenso wie bei den Transkriptionsfaktoren ist auch die Funktion und Aktivität der viralen Proteasen von deren zellulärer Lokalisation abhängig, da weitere, beispielsweise gewebsspezifische co-Faktoren, die Reaktion modulieren.
Die nachfolgenden Systeme berücksichtigen die spezifischen Eigenheiten der verschiedenen Proteasen und ermöglichen, den nativen Prozess, der während der viralen Replikation abläuft, so nah wie möglich nachzustellen.
Dazu werden zwei Nachweissysteme erstellt, die in Abhängigkeit der Proteaseaktivität einen funktionalen Transkriptionsregulator ausbilden. Funktionale Transkriptionsregulatoren der Erfindung sind regulatorisch wirkende Proteine oder Nukleinsäuren, die im Zellkern lokalisiert sind und über die Bindung an ein Reportergen die Expression dieses Reportergens modulieren. Es wird ein Expressionskonstrukt kloniert, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches sich aus mindestens drei regulatorischen Komponenten – den Modulen I-III – zusammensetzt. Modul I der Erfindung bewirkt die Delokalisation des Transkriptionsregulators, es ist das Transkriptionsfaktor – inhibitorische Modul. Modul II der Erfindung ist eine proteasespezifische trans-spaltende Schnittstelle oder eine cis-spaltende funktionale Protease. Modul III der Erfindung ist ein Transkriptionsregulator, der die Expression des Reportergens moduliert .
Der Begriff modulieren, wie er in diesem Zusammenhang gebraucht wird, bezieht sich auf das Herbeiführen einer Änderung der Aktivität, der physikochemischen Eigenschaften oder der funktionellen biologischen, enzymatischen, immunologischen, regulatorischen Wirkung eines Proteins. Modulation kann herbeigeführt werden durch Einwirkung auf das Protein oder durch Einwirkung auf die das Protein kodierenden Nukleinsäuren. Modulation kann die funktionelle Aktivität eines Proteins erhöhen oder erniedrigen und seine physikochemischen Eigenschaften wie beispielsweise die Bindungsstärke gegenüber anderen Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Substanzen, verändern.
Wesentlich für das Erreichen der für das erfindungsgemäße Verfahren typischen Nachweisempfindlichkeit ist, dass durch die richtige Auswahl der für Modul I geeigneten Bausteine eine Delokalisation des Moduls III in den Zellkern nur nach spezifischer Aktivierung – der Spaltung von Modul II – erfolgen kann. Erfin dungsgemäß geeignete Bausteine für Modul I sind z.B. Membranlokalisationssignale wie beispielsweise Oberflächenproteine, Proteine mit Rezeptoreigenschaft, Transmembrandomänen, modifizierte, beispielsweise farnisylierte Proteine. Gleichermaßen kann jede Art von Transkriptionsfaktor-inhibitorischem Modul eingesetzt werden, welches die Funktion des Transkriptionsregulators inhibiert bis es vom Transkriptionsregulator abgespalten wird. Dazu eignen sich beispielsweise solche Proteine oder Proteinfragmente, die zwar die Translokation in den Zellkern nicht beeinflussen, die Bindung des Transkriptionsregulators an die Zielsequenz aber unterbinden.
Nachweissystem für die NS3/4A vermittelte „Trans"-Spaltung (Abbildung 1/7)
Zur Analyse der „Trans"-Spaltungsaktivität wird neben dem vorstehenden modularen Expressionskonstrukt, welches als Modul II die Transspaltungsschnittstelle beinhaltet, und dem Reportergen als drittes Konstrukt, ein Expressionsplasmid der zu untersuchenden Protease benötigt. Bringt man diese Konstrukte zusammen in Zellen ein und werden die verschiedenen Proteine durch ein nicht zytopathisches Expressionssystem in der Zelle gebildet, kommt es infolge der Proteaseaktivität zur Trennung des Transkriptionsfaktor-inhibitorischen Moduls (I) von dem Transkriptionsregulator, welcher dann in den Zellkern gelangen und die Expression des Reportergens modulieren kann, welches wiederum gemessen und quantifiziert werden kann. In Gegenwart einer inhibitorischen Substanz wiederum wird das Fusionsprotein nicht gespalten und der Transkriptionsregulator kann nicht in den Zellkern gelangen.
Nachweissystem für die membranassozeierte NS2/3 „cis"-Spaltung (Abbildung 2/7)
Auch hier kommt das vorstehend beschriebene chimäre Expressionskonstrukt zum Einsatz, wobei in diesem Fall die Transspaltungsschnittstelle (Modul II) durch eine komplette Protease ersetzt wird, die membranlokalisiert eine autokatalytische Enzymfunktion beispielsweise NS2/3 aufweist. Zusammen mit einem Reporterkonstrukt kommt es nach einer Transduktion der Plasmide in Säugetierzellen zur Expression des entsprechenden chimären Fusionsproteins, welches sich, an der Membran assoziiert, autokatalytisch spaltet und somit den Transkriptionsregulator freisetzt, der in den Zellkern translozieren und die Expression des Reportergens hervorrufen kann.
Die oben aufgeführten erfindungsgemäßen Systeme haben gegenüber den bisher beschriebenen Entwicklungen zahlreiche Vorteile. Zum einen bietet der einfache und modulare Aufbau die Möglichkeit, die Systeme den spezifischen Fragestellungen je nach Proteasetyp anzupassen und die Proteasen separat in ihrer spezifischen Umgebung zu testen. Die Verwendung eines transkriptionell-regulierten Ausleseverfahrens führt zur Erhöhung der Signalstärke, da eine durchgeführte Spaltung zu mehrfacher Aktivierung (oder Repression) des Reportergens führt und die damit verbundene Signalverstärkung die Durchführung im HTS ermöglicht.
Die Delokalisation des Transkriptionsregulators bewirkt eine sehr geringe Hintergrundaktivität, was wiederum einen großen Induktionsfaktor zur Folge hat, der ebenfalls für eine Durchführung im HTS Verfahren notwendig ist, um bei gegebener Streuung der Meßwerte eine Identifizierung wirksamer Substanzen zu ermöglichen.
Außerdem ist in Abhängigkeit von dem verwendeten Transduktionssystem – Transfektion, stabile Zelllinien, virale Infektion – bereits nach kürzester Zeit eine Quantifizierung unter Substanzzugabe möglich. So ist unter Verwendung eines viralen Transfektionssystems wie beispielsweise rekombinanten Baculoviren, welche sich durch eine hohe Infektionsrate in Hepatomazelllinien auszeichnen und der Sicherheitsstufe S1/L1 zuzuordnen sind, bereits nach wenigen Stunden, im allgemeinen 6 Stunden nach der Infektion der Zellen, eine Messung und Quantifizierung der Proteaseaktivität im HTS Format möglich. Zusammenfassend ist festzustellen, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Untersuchung der Aktivität viraler Proteasen im Hochdurchsatzscreening (HTS) an zellulären Systemen bereitgestellt werden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität der viralen Proteasen einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden oder die Ausbildung eines funktionalen Transskriptionsregulators ausnutzen, und zur Untersuchung der Aktivität von viralen Proteasen wie beispielsweise der viralen Proteasen (NS2/3 und NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) im Hochdurchsatzscreening (HTS) an zellulären Systemen verwendet werden können, und dadurch gekennzeichnet sind, dass Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität solcher viralen Proteasen, beispielsweise der viralen Proteasen von NS2/3 und NS3/4A einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden. Verfahren der Erfindung sind deshalb alle Verfahren, in denen als Transkriptionsregulator ein Expressionskonstrukt verwendet wird, welches sich aus mindestens drei regulatorischen Einheiten zusammensetzt, wobei a) eine der regulatorischen Einheiten ein Membranlokalisationssignal ist und die Delokalisation des Transkriptionsregulators selbst bewirkt, b) eine der regulatorischen Einheiten eine proteasespezifische trans-spaltenden Schnittstelle oder eine cis-spaltende funktionale Protease enthält, und c) eine der regulatorischen Einheiten die Expression eines Reportergens moduliert. Verfahren der Erfindung sind weiter alle vorstehend geschilderten Verfahren in denen ein Fusionsprotein enthaltend einen Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, eine virale Proteaseschnittstelle der HCV – Protease NS3/4A, und der Transkriptionsregulator Ga1VP16, eingesetzt wird, sowie Verfahren in denen das Fusionsprotein aus der DNA Sequenz 8 oder einem ihrer Homologen generieret wird, sowie Verfahren, in denen ein Fusionsprotein enthaltend einen Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, die virale HCV – NS2/3 Protease, oder den Transkriptionsregulator GalVP16, eingesetzt wird, oder Verfahren, in denen ein Fusionsprotein aus der DNA Sequenz 9 oder einem ihrer Homologen generieret wird sowie die Verwendung von Aktivitätsmodulatoren der Proteasen NS2 und NS3 bzw. NS3/4A die unter Anwendung der vorstehen geschilderten Verfahrens gefunden wurden, zur Herstellung von Arzneimitteln, die in der Prophylaxe und Therapie der HCV-Infektion verwendet werden können.
Kurzbeschreibung der Abbildungen:
1
Schematische Darstellung des Systems zur Messung der NS3/4A vermittelten „Trans"-Spaltung
2
Schematische Darstellung des Systems zur Messung der NS2/3 vermittelten „Cis"-Spaltung
3 Schematische Darstellung der verschiedenen DNA Konstrukte, die generiert wurden. Die Expression der Proteine (Konstrukte A-F) erfolgt unter der Kontrolle des nicht zytopathischen CMV Promotors. Die schwarzen Kästen stellen Transmembrandomänen dar, und die spezifischen Proteasespaltstellen sind durch einen dicken Strich gekennzeichnet.
3a Fusionsprotein bestehend aus dem humanen CD8 Rezeptor (mit Transmembrandomäne, Transkriptionsfaktor-inhibitorischem Modul), der NS3/4A Spaltstelle zwischen NS5a und NS5b und dem Transkriptionsregulator GalVP16, der sich aus der DNA bindenden Domäne des Gal4 Proteins und der transaktivierenden Domäne des VP 16 Proteins zusammensetzt.
3b HCV Protease NS3-Expressionskonstrukt
3c HCV Protease NS3/4A-Expressionskonstrukt
3d HCV Protease NS3/4A-Expressionskonstrukt, welches an der Aminosäureposition 1165 (des HCV Genoms) eine Punkt mutation aufweist (Serin zu Alanin), was zu einer Inaktivierung der Protease führt
3e Fusionsprotein bestehend aus dem humanen CD8 Rezeptor (mit Transmembrandomäne, Transkriptionsfaktor-inhibitorischem Modul), der NS2/3 Protease und dem Transkriptionsregulator GalVP16, der sich aus der DNA bindenden Domäne des Gal4 Proteins und der transaktivierenden Domäne des VP 16 Proteins zusammensetzt.
3f Fusionsprotein bestehend aus dem humanen CD8 Rezeptor (mit Transmembrandomäne, Transkriptionsfaktor-inhibitorischem Modul), der NS2/3 Protease und dem Transkriptionsregulator GalVP16. Die Protease trägt an der Aminosäureposition 993 (des HCV Genoms) eine Punktmutation (Cystein zu Alanin), was zu einer Inaktivierung der Protease führt
3g Reporterkonstrukt bestehend aus einem Gal4 abhängigen Promotor und dem Luziferasegen (firefly).
4
Nachweis der Funktionalität der Expressionskonstrukte mittels in vitro Translation. Das CD8-NS5a/b-GalVP16 Fusionsprotein (Konstrukt A) wurde in einer in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion radioaktiv markiert und danach mit der in vitro translatierten Protease (nicht radioaktiv) NS3 (Konstrukt B) bzw. NS3/4A (Konstrukt C) für 60 min inkubiert. Die Proteinansätze wurden durch eine SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet. Die Abbildung zeigt, dass nur in Anwesenheit des co- Faktors NS4a (Konstrukt A+C) eine Transspaltung des Konstruktes erfolgt.
5
Nachweis der Funktionalität der Expressionskonstrukte mittels in vitro Translation. Das CD8-NS2/3-GalVP16 Fusionsprotein wurde in einer in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion radioaktiv markiert und danach über eine SDS-Gel-elektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet. Die Abbildung zeigt, dass nur die funktionelle NS2/3 Protease zu einer Spaltung des Fusionsproteins führt (Konstrukt E), wohin gegen die NS2/3 Mutante (Konstrukt F) sich nicht autokatalytisch spaltet (K1, Kontrollplasmid 1, welches für eines der zu erwartenden Spaltprodukte kodiert, hier NS3-GalVP16
6
Nachweis der Aktivität der Expressionskonstrukte und somit der Funktionalität der verschiedenen Systeme anhand einer transienten Transfektion der verschiedenen Konstrukte in die Hepatomazelllinie HepG2 und Messung der Luziferaseaktivität.
6a NS3/4A vermittelte „Trans"-Spalung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei Kotransfektion der funktionellen NS3/4A Protease eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist (A+C+G), jedoch nicht bei NS3 (A+B+G) oder der inaktiven NS3/4A Mutante (A+D+G).
6b NS2/3 vermittelte „Cis"-Spalung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei Transfektion der funktionellen NS2/3 Protease eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist (E+G), jedoch nicht bei der inaktiven NS2/3 Mutante (F+G).
7
Nachweis der Funktionalität der Systeme im Hochdurchsatzverfahren (im Format 384).
Die verschiedenen Expressionskonstrukte und das Reporterkonstrukt wurden mittels eines bakteriellen Rekombinationsverfahren in das Genom von Baculoviren eingebracht uns somit rekombinante Baculoviren hergestellt (Sicherheitsstufe L1/S1), die nach Infektion mit Säugetierzellen die Expression der Konstrukte hervorrufen. Die Luziferasemessung (30 Sekunden, im Format 384) erfolgte 20 Stunden nach Infektion.
7a NS3/4A vermittelte „Trans"-Spalung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei Infektion mit der funktionellen NS3/4A Protease eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist (A+C+G), jedoch nicht bei Infektion mit der NS3 Protease (A+B+G). Die Signalstärke und das Signal/Hintergrundverhältnis (Faktor 54) sind HTS fähig.
7b NS2/3 vermittelte „Cis"-Spalung
Die Quantifizierung der Luziferasewerte zeigt, dass nur bei Infektion mit der funktionellen NS2/3 Protease eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist (E+G), jedoch nicht bei der inaktiven NS2/3 Mutante (F+G). ). Die Signalstärke und das Signal/Hintergrundverhältniss (Faktor 40) sind HTS fähig.
Beispiele
Materialien:
Alle Restriktionsendonukleasen wurden von der Firma Gibco BRL/Invitrogen bezogen. Die Polymerasekettenreaktionen wurden mit der Vent DNS Polymerase der Firma New England Biolabs (NEB) durchgeführt, und für die Ligationen wurde die T4 DNS Ligase von Gibco BRL/Invitrogen verwendet.
Molekularbiologische und zellbiologische Experimente wurde nach Standardprotokollen [Ausubel et al., (1994), Sambrook et al., (1989)] durchgeführt.
Die Klonierung der Expressionskonstrukte erfolgte im pcDNA3 Vektor der Firma Invitrogen. Für die Generierung der Baculoviren wurde das Fast Bac-System der Firma Gibco BRL/Invitrogen verwendet. In den Vektor pFastBacDual wurden die verschiedenen Expressionskonstrukte inclusive des CMV Promotors des pcDNA3 Vektors kloniert und nach Durchlaufen des Standardprozedurverfahrens rekombinate Baculoviren generiert.
Ein Fragment der viralen HCV 1b cDNS, die als PCR-Template für die Amplifikation der viralen Proteasen und Proteaseschnittstellen diente, wurde von Professor Roggendorf, Universität Essen, zur Verfügung gestellt (Sequenz Nr.l). Die CD8 cDNS, welche hier beispielhaft als delokalisierendes Transkriptionsregulatormodul verwendet wurde, da es eine Transmembrandomäne beinhaltet, wurde mittels rtPCR aus primären humanen Lymphozyten generiert (Sequenz Nr.2). Für die Amplifikation des GalVP16 Transkriptionsfaktors, welcher hier beispielhaft als Trankriptionsregulator verwendet wurde, diente das Konstrukt pM3-VP16 der Firma Clontech als Template (Sequenz Nr. 3). Als Reporterplasmid wurde hier beispielhaft der pFR-Luc Vektor der Firma Stratagene verwendet, welcher ein Luziferasegen unter der Kontrolle eines Gal-abhängigen Minimalpromotors beinhaltet.
Beispiel 1 Amplifikation und Klonierung der Expressionskonstrukte
Für die Klonierung der trimären Fusionsproteine (Konstrukt A, E, F) wurde in einem ersten Schritt ein Teil des CD8 Rezeptors mit den Primern 5'-cg aag ctt acc atg gcc tta cca gtg acc gcc-3' und 5'-gcg gat cca aac acg tct tcg gtt cct gtg gtt-3' amplifiziert und über die in den Primern enthaltenen Schnittstellen der Restriktionsendonukleasen Hind III und BamHI in den pcDNA3 Vektor kloniert (pcDNA3-CD8). In einem weiteren Schritt wurde der GalVP16 Transkritionsfaktor mittels der Primer 5'-g cgg atc ctg gaa ttc aag cta ctg tct tct atc gaa-3' und 5'-cg tct aga tta ccc acc gta ctc gtc aat tcc-3' amplifiziert und über die Schnittstellen BamHI und XbaI in den pcDNA3-CD8 Vektor kloniert (pcDNA3-CD8-GalVP16).
Für die Generierung des Konstruktes A (Zielprotein der NS3/4A vermittelten Transspaltung) wurde die NS3/4A Spaltstelle zwischen NS5a und NS5b mit angrenzenden Sequenzen mit Hilfe der Primer 5'-g cgg atc cag agg acg gtt gtc tta aca g-3' und 5'-gc gaa ttc gta gtg gtc gtc tag gac ttg-3'amplifiziert (Sequenz Nr. 4) und über die Restruktionsschnittstellen BamHI und EcoRI in den Vektor pcDNA3-CD8-GalVP16 kloniert.
Für die Generierung des Konstruktes E (NS2/3 vermittelten Transspaltung) wurde die NS2/3 Protease mit den Primern 5'-gc gaa ttc gac cgg gag atg gcc gca-3'und 5'gc gaa ttc gga ggt cga gtc agt tga gag-3'amplifiziert (Sequenz Nr. 5) und über die Restriktionsschnittstelle EcoRI in den Vektor pcDNA3-CD8-GalVP16 kloniert.
Für die Generierung des Konstruktes F (mutierte NS2/3 Protease) wurde in das Konstrukt E über die Primer 5'- a gac act gca gcg gcc ggg gac gtc atc -3'und 5 gat gac gtc ccc ggc cgc tgc agt gtc -3'mittels PCR eine Punktmutation eingeführt. Der daraus resultierende Aminosäurenaustasch der ursprünglichen HCV Aminosäurenposition 993 von einem Cystein zu einem Alanin führt zu einer Inaktivierung der Proteasefunktion der NS2/3 Protease.
Für das Konstrukt B (NS3 Protease) wurde eine PCR Reaktion mit den Primern 5'- gc aag ctt acc atg gct ccc atc acg gcc tat tcc -3' und 5'-gcg aat tcc tca ggt gac gac ctc cag gtc ggc-3' durchgeführt und das Fragment (Sequenz Nr. 6) über die Restriktionsschnittstellen HindIII und EcoRI in den pcDNA3 Vektor kloniert.
Für das Konstrukt C (NS3/4A Protease) wurde eine PCR Reaktion mit den Primern 5'- gc aag ctt acc atg gct ccc atc acg gcc tat tcc -3' und 5'-gcg aat tcc tca gca ctc ttc cat ctc atc gaa-3' durchgeführt und das Fragment (Sequenz Nr. 7) über die Restriktionsschnittstellen HindIII und EcoRI in den pcDNA3 Vektor kloniert.
Für die Generierung des Konstruktes D (mutierte NS3/4A Protease) wurde in das Konstrukt C über die Primer 5'- c ttg aag ggt tcc gcg ggt ggc cca ct -3'und 5'- ag tgg gcc acc cgc gga acc ctt caa g -3' mittels PCR eine Punktmutation eingeführt. Der daraus resultierende Aminosäurenaustausch der ursprünglichen HCV Aminosäurenposition 1165 von einem Serin zu einem Alanin führt zu einer Inaktivierung der Proteasefunktion der NS 3/4a Protease.
Das Konstrukt G entspricht den Angaben des Herstellers der Firma Stratagene.
Beispiel 2 in vitro Funktionalitätsnachweis der NS3/4A vermittelten „trans"-Spaltung
Zum Nachweis der Funktionalität der generierten Konstrukte A, B und C wurde eine in vitro Transkriptions- Translationsreaktion unter Verwendung des T7-in vitro Transkriptions- Translationsverfahrens der Firma Promega durchgeführt (siehe Abb. 4/7). Während die Reaktion (nach Standardbedingungen des Herstellers) für das zu spaltende Konstrukt A in einem radioaktiven Ansatz (³⁵S-Methionin Markierung) durchgeführt wurde (25 μl Ansatz), wurde die Reaktion für das Konstrukt B und C, die viralen Proteasen NS3 und NS3/4A, nicht radioaktiv durchgeführt (jeweils 25 µl). Nach einer 90 minütigen Inkubation der einzeln generierten Proben, wurden 5 µl des Konstruktes A mit jeweils 5 μl des Konstruktes B bzw. C vermischt und für weitere 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von SDS-Gel Probenpuffer zu den Ansätzen wurden die Proteinproben mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet (siehe Abb. 4/7). Das in Abbildung 4/7 dargestellte Bild der Radiographie zeigt deutlich, dass nur die durch Konstrukt C exprimierte NS3/4A Protease eine spezifische Spaltung des chimären Fusionsproteins A bewirkt, eine Abspaltung des Transkriptionsregulators GalVPl6 von dem transkriptionsfaktor-inhibitorischen Modul (CD8 Rezeptor) herbeiführt und somit ein Nachweis der Proteaseaktivität über das Freisetzen des Transkriptionsregulators möglich ist. Die NS3 Protease (Konstrukt B) führt zu keiner Spaltung.
Beispiel 3 in vitro Funktionalitätsnachweis der NS2/3 vermittelten „cis"-Spaltung
Zum Nachweis der Funktionalität der generierten Konstrukte E und F wurde wie bereits in Beispiel 2 beschrieben, eine in vitro Transkriptions- Translationsreaktion unter Verwendung des T7-in vitro Transkriptions- Translationsverfahrens der Firma Promega durchgeführt (siehe Abb. 5/7). Die Reaktionen (nach Standardbedingungen des Herstellers) für das sich selbst spaltende Konstrukt E bzw. dessen inaktive Mutante (Konstrukt F) sowie ein Kontrollplasmid K1, welches für das in Abb. 5/7 dargestellte und nach Spaltung zu erwartende NS3-GalVP16 Fusionsprotein kodiert, wurden in einem radioaktiven (³⁵S-Methionin Markierung) Ansatz durchgeführt (25 μ1 Ansatz). Nach einer 90 minütigen Inkubation der Proben wurden 5μl der Proben nach Zugabe von SDS-Gel Probenpuffer mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch ausgewertet (siehe Abb. 5/7). Das in Abbildung 5/7 dargestellte Bild der Radiographie zeigt deutlich, dass nur das durch Konstrukt E exprimierte Fusionsprotein, welches eine funktionelle NS2/3 Protease beinhaltet, eine Spaltung des chimären Fusionsproteins nach sich zieht, wohingegen die Mutante nicht autokatalytisch aktiv ist. Darüberhinaus entspricht die Größe der Banden den zu erwartenden Größen nach einer spezifischen Spaltung (Vergleich E zu K1). Auch hier führt somit das Einbringen einer aktiven Protease in das Fusionsprotein aus einem Transkriptionsregulator und einem inhibitorisch wirkenden Modul (I) zur Frei setzung des Transkriptionsregulators, wodurch der Nachweis der Spaltungsaktivität ermöglicht wird.
Beispiel 4 in vivo Aktivitätsnachweis der chimären Fusionsproteine Zum Nachweis der spezifischen Aktivität der generierten Fusionsproteine (A, E, F) und Proteasen (B, C, D) in vivo, d.h. im zytoplasmatischen Umfeld einer lebenden Zelle, wurden transiente Transfektionsexperimente in den humanen Heptomazellen HepG2 durchgeführt. Die Zellen wurden zu diesem Zweck auf 48 Well Zellkulturplatten ausplattiert und mit den in Abbildung 6/7 beschriebenen Konstrukten mittels der Lipofectamine 2000 Methode (GibcoBRL/Invitrogen) transient transfiziert. Nach einer Inkubation von 48 Stunden wurde dann zur Messung der Luziferaseaktivität ein Luziferin/Tritonpuffer in gleicher Menge zu den Zellen gegeben und nach Transfer eines Aliquots von 100 μl in eine 96 Well Zellkulturplatte die Lichtausbeute in einem Luminometer gemessen.
Die erzielten Ergebnisse der NS3/4A vermittelten Transspaltung, die in der 6a dargestellt sind, zeigen deutlich, dass nur die aktive NS3/4A Protease (Konstrukt C) eine Spaltung des chimären Fusionsproteins A bewirkt und somit eine hohe Luziferaseakivität hervorruft ( ca. 140 000 Lichteinheiten), wohingegen die Expression der NS3 Protease (Konstrukt B) bzw. der inaktiven NS3/4A Mutante (Konstrukt D) nur zu einer geringen Luziferaseaktivität führen (ca. 5000 Lichteinheiten). Weiterhin zeigt das geringe Lichtsignal unter Verwendung der inaktiven NS3/4A Mutante (Konstrukt D), dass die Freisetzung des Transkriptionsregulators und die damit verbundene Aktivierung des Reportergenkonstruktes G nicht durch endogene Proteasen der Zelle hervorgerufen wird und somit die gemessene Aktivität spezifisch für die eingebrachte virale NS3/4A Protease ist.
Auch die Ergebnisse der in 6b dargestellten NS2/3 vermittelten cis-Spaltung zeigen, dass nur unter Verwendung des Konstruktes E, der aktiven NS2/3 Protease in dem chimären Fusionsprotein, in Verbindung mit dem Reportergen konstrukt G, eine spezifische Luziferaseaktivität messbar ist (ca. 24 000 Lichteinheiten), die gegenüber der inaktiven Mutante (Konstrukt F, ca. 2000 Lichteinheiten) eine mehr als 10fach höhere Luziferaseaktivität aufweist.
Beispiel 5 in vivo Aktivitätsnachweis unter HTS-Bedingungen.
Um eine Durchführung der Proteasetestsysteme in vivo im Hochdurchsatzscreening im 384er Plattenformat zu ermöglichen, wurden in einem ersten Schritt rekombinante Baculoviren von den Konstrukten A, B, C, E, F hergestellt, da eine transiente Transfektion von Zellen unter Hochdurchsatzbedingungen nicht durchführbar ist. Baculoviren hingegen zeichnen sich, ebenso wie andere virale Transfektionssysteme (z.B. retrovirale, adenovirale Systeme) durch Ihre Eigenschaft aus, dass sie sehr effizient verschiedene humane Zelttypen, wie z.B. Hepatomazellen, reproduzierbar infizieren und Ihre DNS in die Zelle abgeben, sich jedoch in diesen Zellen nicht replizieren und keine zytopathischen Effekte hervorrufen [Kost et al., (1999)]. Sie können somit sehr gut als Transferorganismus genutzt werden und führen bereits kurz nach Infektion der Zielzelle zu der Expression des gewünschten Gens, sofern das Gen unter der Kontrolle eines geeigneten eukaryontischen Promotors steht. Des weiteren unterliegen Baculoviren nur dem Sicherheitsstandard S1/L1, was einen weiteren Vorteil für Ihre Verwendung um HTS darstellt.
Die Konstrukte A, B, C, E und F wurden unter der Kontrolle eines CMV Promotors in Baculotransfervektoren der Firma GibcoBRL/Invitrogen kloniert (pFastBacDual). Nach Durchlaufen der Standardprozedur des Herstellers (FastBAC-System) wurden Baculoviren generiert und amplifiziert. Nachdem das Virus durch Zentrifugation und Sterilfiltration (0.45 μM Filter) aufgereinigt und der Virustiter (ca. 1×10⁷ Viren /ml) bestimmt wurde, konnte das Virus direkt mit einer Konzentration von ca. 10 Viren pro ausgesäter Zelle (MOI 10) verwendet werden.
Für die Infektion der Zellen im 384er Platten-HTS Format, wurden 2000 Zellen pro Welt in 40 μl Medium ausplattiert und direkt mit den in Abbildung 7/7 beschriebenen verschiedenen Viren (MOI 10, in 5 μl Sf9 Medium) infiziert. Als Ausgangszelle diente bei diesen Experimenten eine HepG2 Zelllinie (oder Huh7 Zelllinie, Daten nicht aufgeführt), welche eine stabile Integration des Konstruktes G trägt. Nach einer 20 ständigen Inkubation wurde nach Zugabe von 25 μl einer Luziferin/Triton Lösung ein Luziferaseassay durchgeführt und in einem Luminometer ausgewertet.
Die in Abbildung 7/7 dargestellten Ergebnisse für die beiden aufgeführten Systeme der NS3/4A (7a) und NS2/3 (7b) vermittelten Proteasespaltung des chimären Fusionsproteins zeigen sehr deutlich, dass nur in Anwesenheit einer vollständigen NS3/4A Protease (A+(+G) jedoch nicht mit der NS3 Protease alleine (A+B+G) bzw. einer aktiven NS2/3 (E+G) und nicht der inaktiven NS2/3 Protease (F+G) eine Luziferaseaktivität nachweisbar ist. Darüberhinaus bildet die geringe Hintergrundaktivität, die Stärke des Signals und das sehr gute Signal/Hintergrundverhältnis der beiden beispielhaft aufgeführten Systeme optimale Bedingungen für eine Durchführung im Hochdurchsatzscreening unter Verwendung eines effizienten und schnellem Transfektionssystem wie z.B. dem hier verwendeten viralen Baculotransfektionssystem.
Literatur
US 5861267
WO 98/00548
WO 00/08469
WO 00/66623
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Zein, Nizar N. et al. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 2000: 223–235
Sequenzen die in Verbindung mit der Erfindung benötigt werden: Sequenz Nr.1: HCV Genotyp 1b cDNS Fragment

Sequenz Nr.2: humanes CD8 cDNS Fragment
Sequenz Nr.3: GalVP16 cDNS
Sequenz Nr.4: HCV NS5a/5b Spaltstelle, cDNS Fragment
Sequenz Nr.5: HCV NS2/3 Protease cDNS

Sequenz Nr.6: HCV NS3 Protease cDNS
Sequenz Nr.7: HCV NS3/4A Protease cDNS

Sequenz Nr. 8: CD8-5A/B-GalVP16 Fusionsprotein cDNS

Sequenz Nr. 9: CD8-NS2/3-GalVP16 Fusionsprotein cDNS

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Untersuchung der Aktivität viraler Proteasen im Hochdurchsatzscreening (HTS) an zellulären Systemen, dadurch gekennzeichnet, dass Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität der viralen Proteasen einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A des Hepatitis C Virus (HCV) im Hochdurchsatzscreening (HTS) an zellulären Systemen, dadurch gekennzeichnet, dass Nachweissysteme verwendet werden, die in Abhängigkeit der Aktivität der viralen Proteasen NS2/3 und NS3/4A einen funktionalen Transskriptionsregulator ausbilden.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, in dem als Transkriptionsregulator ein Expressionskonstrukt verwendet wird, welches sich aus mindestens drei regulatorischen Einheiten zusammensetzt, wobei a) eine der regulatorischen Einheiten ein Membranlokalisationssignal ist und die Delokalisation des Transkriptionsregulators selbst bewirkt, b) eine der regulatorischen Einheiten eine proteasespezifische transspaltenden Schnittstelle oder eine cis-spaltende funktionale Protease enthält, c) eine der regulatorischen Einheiten die Expression eines Reportergens moduliert
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, in dem ein Fusionsprotein enthaltend einen Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, eine virale Proteaseschnittstelle der HCV – Protease NS3/4A, und der Transkriptionsregulator GalVP16, eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4 wobei das Fusionsprotein aus der DNA Sequenz: Sequenz 8 oder einem ihrer Homologen generieret wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei ein Fusionsprotein enthaltend einen Rezeptor aus der Gruppe der CD-Rezeptoren, die virale HCV – NS2/3 Protease, und den Transkriptionsregulator GalVP16, eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4 wobei das Fusionsprotein aus der DNA Sequenz: Sequenz 9 oder einem ihrer Homologen generieret wird.
Verwendung von Aktivitätsmodulatoren der Proteasen NS2 und NS3 bzw. NS3/4A die unter Anwendung des Verfahrens gemäss der Ansprüche 1 bis 7 gefunden wurden, zur Herstellung von Arzneimitteln für die Prophylaxe und Therapie der HCV-Infektion.