DE69938600T2 - Fusionsproteine und deren verwendung zur messung von protease-aktivität - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Fusionsproteine, DNA-Moleküle. welche die Fusionsproteine codieren, Vektoren, die die DNA-Moleküle umfassen, Wirtszellen, die mit den Vektoren transformiert sind und Verfahren und Kits, um diese für die Bestimmung der Aktivität einer Protease zu verwenden. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Fusionsprotein, das eine Proteasespaltstelle, eine Ligandenbindungsdomäne und eine DNA-Bindungs-Domäne aufweist, wobei (1) die Assoziation eines Liganden mit der Ligandenbindungsdomäne des Fusionsproteins die Bindung an ein Ligandenresponsives Element („LRE") vermittelt, welches funktionell mit einem Reportergen verknüpft ist, wobei die Proteasespaltstelle des Fusionsproteins so gespalten werden kann, dass keines der resultierenden Fusionsproteinfragmente in der Lage ist, die Expression des Reportergens zu modulieren; und wobei (2) das Fusionsprotein eine Expressionsmodulatordomäne umfasst oder mit einem zweiten Protein mit einer Expressionsmodulatordomäne verbunden ist, wobei die Expressionsmodulatordomäne die Transkription des Reportergens reguliert; und wobei die Zielprotease-Spaltstelle innerhalb der DNA-Bindungs-Domäne oder innerhalb der Modulatordomäne, falls vorhanden, oder zwischen beliebigen Domänen des Fusionsproteins liegt. Die Erfindung betrifft auch Kits zum Testen von Proteaseaktivität, umfassend DNA-Moleküle, welche die Fusionsproteine codieren, einen geeigneten Liganden sowie DNA-Moleküle, welche ein Promotor-Reportergen-Konstrukt und mindestens ein LRE umfassen, das von der DNA-Bindungs-Domäne des Fusionsproteins erkannt wird. Die DNA-Moleküle in diesen Kits können isoliert sein oder in Wirtszellen vorliegen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Proteasen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation biologischer Prozesse in fast jeder Lebensform von Bakterien bis zu Viren und zu Säugern. Sie üben entscheidende Funktionen aus, beispielsweise bei der Verdauung, der Blutgerinnung, der Apoptose, der Aktivierung von Immunreaktionen, der Zymogen-Aktivierung, der Reifung von Viren, der Proteinsekretion und dem Proteintransport.
  • Man hat Proteasen als Ursache oder als Mitauslöser für verschiedene Krankheiten wie z. B. Alzheimersche Krankheit, Mucoviszidose, Emphysem, Bluthochdruck, dem Eindringen von Tumoren und der Metastase und Virus-assoziierten Krankheiten in Verbindung gebracht [z. B. Kim, T. W. et al., (1997) „Alternative Cleavage of Alzheimer-associated Presinilins During Apoptosis by a Caspase-3 Family Protease", Science 277: 373–6; Lacana et al., (1997) „Disassociation of Apoptosis and Activation of IL-1 beta-converting Enzyme/Ced-3 Proteases by ALG-2 and the Truncated Alzheimer's gene ALG-3", J. Immunol. 158: 5129–35; Birrer, P., (1995) „Proteases and Antiproteases in Cystic Fibrosis: Pathogenic Considerations and Therapeutic Strategies", Respiration 62: 25–8; Patel, T. et al., (1996) „The Role of Proteases During Apoptosis", FASEB J. 10: 587–97].
  • Auch verschiedene Virusgenome codieren Proteasen, die für den viralen Reifungsprozess wichtig sind. Zum Beispiel spaltet die virale Aspartylprotease des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) ein HIV-Polypeptid, welches die Gag und Pol Polyproteine enthält.
  • In einem anderen Beispiel erzeugt das Hepatitis C-Virus (HCV) ein langes Polypeptidtranslationsprodukt, NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B -COOH, welches so gespalten wird, dass mindestens 10 Proteine entstehen. C, E1 und E2 sind mutmaßliche Strukturproteine, und die übrigen sind als nicht-strukturelle Proteine bekannt. Eines dieser Proteine ist NS3, ein 70 kDa großes Protein, das eine Serin-Protease-Aktivität aufweist. Es ist gezeigt worden, dass die Protease-Aktivität von NS3 ausschließlich in den N-terminalen 180 Aminosäuren des Enzyms liegt. Die NS3-Protease erzeugt Spaltungen an vier Stellen in der nicht-strukturellen Region des HCV-Polypeptids (3/4A, 4A/4B, 4B/5A und 5A/5B). Ein anderes Protein, NS4A, besitzt 54 Aminosäuren und ist als ein Cofaktor für die NS3-Protease charakterisiert worden [C. Failla et al., (1994), J. Virology 68: 3753–3760]. Die C-terminalen 33 Aminosäuren von NS4A sind für die Spaltung an der 3/4A- und der 4B/5A-Stelle notwendig und beschleunigen die Spaltungsrate an der 5A/5B-Stelle. Man hat in verschiedenen Stämmen von HCV mehrere andere NS3-Serin-Protease-abhängige Spaltungsstellen-Sequenzen identifiziert [A. Grakoui et al., (1993), J. Virology 67: 2832–2843].
  • Die Fähigkeit, virale, zelluläre oder Mikroorganismus-Protease-Aktivität in einem schnellen und einfachen Test nachzuweisen, ist wichtig bei der biochemischen Charakterisierung dieser Proteasen, beim Nachweis einer viralen Infektion und beim Screenen und der Identifizierung möglicher Hemmstoffe.
  • WO 91/16436 beschreibt ein hybrides regulatorisches Protein, ein DNA-bindendes Peptid, ein Linkerpeptid, welches von einer spezifischen Protease gespalten werden konnte, und ein die DNA-Transkription modifizierendes Peptid. Dieses Hybrid-Protein wird in Protease-Assayverfahren eingesetzt.
  • WO 96/37609 beschreibt ein Fusionsprotein, umfassend eine Liganden-Bindungsdomäne, die an ein Mitglied der Superfamilie der Insekten-Steroidrezeptoren gebunden ist, eine DNA-Bindungs-Domäne und eine Transaktivierungsdomäne. Die Spaltung. des Steroidrezeptors trennt die Liganden-Bindungsdomäne ab und die entstehenden Fragmente sind nicht in der Lage, die Expression eines Reportergens zu modulieren, das von der Transaktivierungsdomäne des Fusionsproteins von WO 96/37609 gesteuert wird.
  • WO 97/38117 beschreibt ein induzierbares DNA-Konstrukt eines Säuger-Expressionssystems, umfassend ein exogenes Gen unter der Kontrolle eines auf Ecdyson ansprechenden Elements.
  • Es sind verschiedene Protease-Assays auf dem Fachgebiet bekannt. T. A. Smith et al., Proc. Natl. Acad. Scid. U.S.A. 88, S. 5159–62 (1991); B. Dasmahapatra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, S. 4159–62 (1992); und M. G. Murray et al., Gene 134, S. 123–128 (1993) beschreiben alle Protease-Assay-Systeme, die das GAL4-Protein aus Hefe benutzen. Jedes dieser Dokumente beschreibt das Einführen einer Protease-Spaltstelle zwischen der DNA-Bindungs-Domäne und der Transkriptionsaktivationsdomäne von GAL4. Eine Spaltung dieser Stelle durch eine coexprimierte Protease macht GAL4 transkriptionell inaktiv, was dazu führt, dass die transformierte Hefe nicht fähig ist, Galactose zu verstoffwechseln.
  • Y. Hirowatari et al., Anal. Biochem. 225, S. 113–120 beschreibt einen Assay um HCV-Proteaseaktivität nachzuweisen. In diesem Assay werden das Substrat, HCV-Protease und ein Reportergen in COS-Zellen co-transfiziert. Bei dem Substrat handelt es sich um ein Fusionsprotein, das aus (HCV NS2)-(DHFR)-(HCV NS3 Spaltstelle)-Taxt besteht. Das Reportergen ist Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) unter der Kontrolle des HTLV-1 Long Terminal Repeats (LTR) und befindet sich nach der Expression im Zellkern. Das ungespaltene Substrat wird wegen des HCV NS2-Teils als ein Membran-gebundenes Protein an der Oberfläche des endoplasmatischen Reticulums exprimiert. Nach der Spaltung verlagert sich das freigesetzte Taxt-Protein in den Kern und aktiviert die CAT-Expression indem es an das HTLV-1 LTR bindet. Die Protease-Aktivität wird bestimmt, indem man die CAT-Aktivität in einem Zelllysat misst.
  • Jeder der vorstehend beschriebenen Assays erfordert die gleichzeitige (1) Expression einer aktiven Protease und eines Substrats und (2) Transkription eines Reportergenkonstrukts. Die konstitutive Art dieser Assays kann häufig unkontrollierbare und unerwünschte Effekte hervorrufen. Diese Effekte können in die Irre führende oder fehlerhafte Schlussfolgerungen in Bezug auf die Aktivität der Protease zur Folge haben. Es gibt somit einen Bedarf für einen empfindlichen und quantitativen Protease-Assay, der induzierbar ist oder der leicht durch den Benutzer kontrolliert werden kann.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis indem sie neue Fusionsproteine, DNA-Moleküle, die diese codieren, Vektoren, die die DNA-Moleküle umfassen, und Wirtszellen bereitstellt, die die Vektoren enthalten, die in einem Fusionsproteinliganden-abhängigen Assay nützlich sind, die Aktivität einer Protease zu messen.
  • Das neuartige Fusionsprotein umfasst eine Proteasespaltstelle, eine Ligandenbindungsdomäne und eine DNA-Bindungs-Domäne, wobei (1) die Assoziation eines Liganden mit der Ligandenbindungsdomäne des Fusionsproteins die Bindung der DNA-Bindungs-Domäne des Fusionsproteins an ein IRE vermittelt, welches funktionell mit einem Reportergen verknüpft ist, wobei die Proteasespaltstelle des Fusionsproteins so gespalten werden kann, dass keines der resultierenden Fusionsproteinfragmente fähig ist, die Expression des Reportergens zu modulieren; und wobei (2) das Fusionsprotein eine Expressionsmodulatordomäne umfasst oder mit einem zweiten Protein mit einer Expressionsmodulatordomäne verbunden ist, wobei die Expressionsmodulatordomäne die Transkription des Reportergens reguliert und wobei die Zielprotease-Spaltstelle innerhalb der DNA-Bindungs-Domäne oder innerhalb der Modulatordomäne, falls vorhanden, oder zwischen beliebigen Domänen des Fusionsproteins liegt.
  • Gemäß den Verfahren dieser Erfindung löst die Bindung eines Liganden an die Ligandenbindungsdomäne des ungespaltenen Fusionsproteins die Aktivierung oder die Repression der Transkription des Reportergens zu einem bestimmten Zeitpunkt aus. Diese Induzierbarkeit ermöglicht es, dass der Test besser kontrolliert werden kann und somit genauere Ergebnisse liefert.
  • Eine Spaltung des Fusionsproteins an der Proteasespaltstelle dereguliert die Transkription des Reportergens indem es die Expressionsmodulatordomäne daran hindert, die Transkription positiv oder negativ zu modulieren. Die Menge an gespaltenem Fusionsprotein wird quantitativ bestimmt indem man eine Zunahme oder Abnahme der Transaktivierung des Reportergens misst, dessen Expression von einem Promotor gesteuert wird, der durch die Expressions-modulierende Domäne des Fusionsproteins moduliert wird.
  • Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Messen der inhibitorischen Aktivität einer Verbindung gegen eine Protease umfassend die Schritte Inkubieren des Fusionsproteins mit einer Protease in Gegenwart oder in Abwesenheit von einer Verbindung, deren Aktivität getestet wird, Hinzufügen eines Liganden zu der Inkubation und quantitativem Bestimmen des Genprodukts, das von dem Reportergen erzeugt worden ist.
  • Noch eine andere Ausführungsform dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vergleichen der Aktivität von zwei Proteasen oder Mutanten einer Protease, welche dieselbe Spaltstelle erkennen.
  • Die Erfindung betrifft auch Kits zum Testen von Protease-Aktivität, umfassend DNA-Moleküle, welche das Fusionsprotein codieren, das Fusionsprotein oder Wirtszellen, welche die DNA-Moleküle enthalten, wobei das Kit wahlweise DNA-Moleküle umfasst, die eine Protease codieren, DNA-Moleküle, die ein Reportergen umfassen, dessen Expression durch das Fusionsprotein reguliert ist, einen Liganden, der an das Fusionsprotein bindet und dessen Aktivität reguliert, sowie Anleitungen zur Benutzung des Kits. Bevorzugt sind die DNA-Moleküle in dem Kit in einen Vektor konstruiert worden, welcher deren Expression ermöglicht. Ein Kit gemäß dieser Erfindung kann ein beliebiges oder alle der folgenden DNA-Moleküle umfassen, die in eine einzige Wirtszelle transformiert worden sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem DNA-Molekül, das ein Fusionsprotein dieser Erfindung codiert, ein DNA-Molekül, das eine Protease codiert, ein DNA-Molekül, das einen Proteinbindungspartner für das Fusionsprotein codiert, und ein DNA-Molekül, das ein Promotor-Reportergen-Konstrukt umfasst. Die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen sind auch in den Ansprüchen beschrieben.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt die Struktur der Vektoren pVgRXR, pVgRXR-5A/5B und pVgRXR-5A(Stop)5B dar. Der umgekehrte Schrägstrich zwischen dem Cystein und dem Serin des von pVgRXR-5A/5B codierten Proteins zeigt an, wo die Spaltung stattfindet. Die zwei Sterne in der Nähe der Spaltstelle des von pVgRXR-5A(Stop)5B codierten Proteins zeigen die Platzierung der zwei Stopcodons an.
  • 2 stellt die Struktur eines DNA-Vektors dar, welcher die HCV-NS3-4A-Protease codiert, pSRα-NS3-4A.
  • 3 stellt die Struktur eines Kontrollvektors pIND und eines Reporter-Vektors für die durch Ecdyson induzierbare Luciferase-Expression dar, pIND-luc. Der Ausdruck „5XE/GRE" bezieht sich auf die auf Ecdyson/Glucocorticoid reagierenden Elemente. Der Ausdruck „PΔHSP" bezieht sich auf den Hitzeschock-Minimalpromotor. Der Ausdruck „BGH pA" bezieht sich auf das Polyadenylierungssignal von Rinderwachstumshormon.
  • 4 stellt grafisch die Ergebnisse der Transfektionsexperimente in COS-Zellen mit dem jeweils folgenden dar: (1) einem DNA-Vektor, der ein RXR-Rezeptor-Protein von Säugern codiert und ein Fusionsprotein, das die DNA-Bindungs-Domäne des Ecdyson-Rezeptors von Drososphila umfasst, welche an die Aktivierungsdomäne des VP16-Proteins des Herpes simplex-Virus (pVgRXR) fusioniert ist; (2) einen DNA-Vektor, der ein RXR-Rezeptorprotein codiert und ein Fusionsprotein, das die DNA-Bindungs-Domäne des Ecdyson-Rezeptors von Drosophila umfasst, welche an die proteolytische Spaltstelle 5A/5B von HCV fusioniert ist, welche an die Aktivierungsdomäne des VP16-Proteins fusioniert ist (pVgRXR-5A/5B); sowie (3) einen DNA-Vektor, der ein RXR-Rezeptorprotein codiert und ein Fusionsprotein wie vorstehend beschrieben mit der Ausnahme, dass die DNA, welche die 5A/5B- Spaltstelle codiert, so modifiziert ist, dass hintereinander liegende Stopcodons in der Spaltstelle enthalten sind (pVgRXR-5A(Stop)5B). Ein Plasmid, welches das Luciferase-Reportergen umfasst, wurde in jeder Transfektion mit eingeschlossen (pIND-luc). Nach der Transfektion wurde die Transkription des Reportergens durch Verabreichen von 1 μM Muristeron-A (einem Analogon von Ecdyson) an die transfizierten Zellen induziert. Die Messwerte wurden erhalten indem man wie in Beispiel 2 beschrieben die Luciferase-Aktivität maß, die in den Zelllysaten aus den transfizierten Zellen vorhanden war.
  • 5 stellt die Ergebnisse einer Cotransfektion der Plasmide pVgRXR-5A/5B und pIND-luc in COS-Zellen mit steigenden Mengen eines Plasmids, welches die HCV NS3-4A-Protease (pSRαNS3-4A) codiert, oder eines Kontrollplasmids (pSRα) dar. Nach der Transfektion wurde die Transkription des Reporterplasmids induziert indem man den transfizierten Zellen 1 μM Muristeron-A verabreichte.
  • 6 stellt grafisch die Ergebnisse einer Cotransfektion mit den Plasmiden pVgRXR-5A/5B und pIND-luc in COS-Zellen mit steigenden Mengen eines Plasmids dar, welches die HCV NS3-4A-Protease oder eine inaktive Mutante davon (pSRαNs3-4A bzw. pSRαNs3-4A(S1165A)) codierte. Nach der Transfektion wurde die Transkription des Reporterplasmids induziert indem man den transfizierten Zellen 1 μM Muristeron-A verabreichte.
  • 7 stellt grafisch die Ergebnisse einer Verabreichung von entweder 1, 3,3, 10, 33 oder 100 μM Ponasteron-A (eines Analogons von Ecdyson) an COS-Zellen nach der Cotransfektion mit den Plasmiden pVgRXR-5A/5B und pIND-luc in der Gegenwart oder in der Abwesenheit eines Plasmids dar, welches die HCV NS3-4A-Protease (pSRαNS3-4A) codierte.
  • 8 stellt grafisch die Ergebnisse eines Kontrollexperiments dar, das die Toleranz gegenüber DMSO zeigt. Die Plasmide pVgRXR-5A/5B und pIND-luc wurden mit oder ohne ein Plasmid, das die HCV-NS3-4A-Protease (pSRαNS3-4A) codierte, in COS-Zellen cotransfiziert. Nach der Transfektion wurde die Transkription des Reporterplasmids induziert indem man in der Gegenwart von steigenden Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO) 5 μM Ponasteron-A verabreichte.
  • 9 stellt grafisch die Ergebnisse einer Cotransfektion mit den Plasmiden pVgRXR-5A/5B, pIND-luc und pSRαNS3-4A in COS-Zellen und einer Verabreichung von 5 μM Ponasteron-A und unterschiedlichen Mengen eines Protease-Inhibitors (VH-25531) dar.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Werkzeuge und Verfahren zur Messung von Protease-Aktivität bereit. Die Aktivität einer Protease wird gemessen indem man ein neuartiges Fusionsprotein als Substrat in einem Transkriptions-Assay verwendet, wobei Transkription zu einem bestimmten Zeitpunkt durch Hinzufügen eines Liganden aktiviert oder unterdrückt wird nachdem eine Protease und ein Fusionsprotein dieser Erfindung zusammen inkubiert worden sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Fusionsprotein wie hierin beschrieben bereit.
  • Bei einer Proteasespaltstelle (hierin folgend „PCS") gemäß dieser Erfindung handelt es sich um ein Peptid, welches in die Primärsequenz des Fusionsproteins dieser Erfindung eingebaut ist. Sie kann sowohl in der DNA-Bindungs-Domäne als auch der Liganden-Bindungsdomäne als auch wahlweise in der Expressionsmodulatordomäne des Proteins, falls eine solche existiert, liegen als auch zwischen zwei beliebigen dieser Domänen.
  • Das Vorhandensein der Spaltstelle in dem Protein sollte die Aktivität der DNA-Bindungs-Domäne, der Liganden-Bindungsdomäne oder, falls vorhanden, der Expressionsmodulatordomäne des Fusionsproteins nicht wesentlich beeinträchtigen.
  • Um zu gewährleisten, dass die Proteasespaltstelle nicht wesentlich die Aktivität der vorstehend genannten Domänen des Fusionsproteins beeinträchtigt, kann die Aktivität eines Fusionsproteins mit der POS mit der Aktivität desselben Fusionsproteins ohne die POS mit Hilfe eines Gelshift-Assays, um die DNA-Bindung zu testen oder mittels eines Transkriptions-Assays verglichen werden (z. B. D. Latchman (1995) Eukaryotic Transcription Factors, 2. Ausg., Academic Press, London).
  • Auch sollte die Proteasespaltstelle in das Fusionsprotein konstruiert werden, so dass, wenn sie gespalten sind, keines der entstandenen Fusionsproteinfragmente in der Lage ist, die Expression eines Ziel- oder Reportergens zu modulieren.
  • Bevorzugt gibt es nur eine Ziel-Proteasespaltstelle, die innerhalb des Fusionsproteinsubstrats liegt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Proteasespaltstelle zwischen der DNA-Bindungs-Domäne und der Effektormodulatordomäne des Fusionsproteins.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung weist die PCS eine Aminosäuresequenz auf, welche eine Prozessierungs/Proteasespaltstelle in den HIV gag und gag/pol-Polyproteinen oder in dem HCV-Polyprotein umfasst. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist die HIV PCS-Stelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 1–10 [S. Pichuantes et al., (1989) „Recombinant HIV1 Protease Secreted by Saccharomyces cerevisiae Correctly Processes Myristylated gag Polyprotein", Proteins: Structure, Function and Genetics 6: 324–337].
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung weist die PCS die Aminosäuresequenz einer Spaltstelle für die HCV NS3 Serinprotease oder die HIV Aspartylprotease auf. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung besitzt die PCS die Aminosäuresequenz einer HCV 5A/5B Proteasespaltstelle. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung handelt es sich bei der 5A/5B Proteasespaltstelle um SEQ ID NO: 10.
  • Der nächste Teil des Fusionsproteins dieser Erfindung ist die Liganden-Bindungsdomäne (hierin nachfolgend „LBD"). Bei der LBD handelt es sich um eine Peptiddomäne, die an einen Liganden bindet, wobei diese Ligandenbindung für das Fusionsprotein erforderlich ist um (1) an ein LRE zu binden, in welchem das Element funktionell mit einem Reportergen verknüpft ist; und/oder (2) um in einem Zwischenschritt, der der Bindung an den resultierenden Fusionsprotein-Proteinbindungspartner-Komplex an ein LRE vorangeht, an einen Proteinbindungspartner zu binden. Somit ist die Bindung eines Liganden an die Liganden-Bindungsdomäne des Fusionsproteins für die transkriptionelle Regulation der Expression des Reportergens erforderlich.
  • Liganden-Bindungsdomänen, welche für den Einsatz in dieser Erfindung geeignet sind, können von Liganden-Bindungsdomänen von Transkriptionsfaktoren abgeleitet werden, welche auf die Bindung eines Liganden hin Transkription in Gang setzen oder unterdrücken. Zu solchen Transkriptionsfaktoren gehören Hormonrezeptoren [Freedman, L. P. (1988), „Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors: Progress in Gene Expression, Boston, Birkhauser; Tsai, M-J. (1994), „Mechanism of Steroid Hormone Regulation of Gene Transcription", Molecular Biology Intelligence Unit, Austin, R. G. Landes Co.; Eggert, M. et al., (1995), „The Glucocorticoid Hormone Receptor", Inducible Gene Expression, Band 2, Birkhauser, Boston, Massachusetts, Hrsg. P. A. Baeuerle, S. 157–185; Keaveney, M. und H. G. Stunnenberg (1995), „Retinoic Acid Receptors", Inducible Gene Expression, Band 2, Birkhauser, Boston, Massachusetts, Hrsg. P. A. Baeuerle, S. 187–242]; auf Kohlenhydrat reagierende Transkriptionsfaktoren; Metallothionein(MT)-Gene; nicht erfasste Rezeptoren; Tetracyclin-induzierbare Transkriptionsfaktoren; die IPTG-induzierbaren Transkriptionsfaktoren; Dioxinrezeptoren und Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptoren].
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist die Ligandenbindungsdomäne von den Ligandenbindungsdomänen der Superfamilie der Steroid/Thyroid-Rezeptoren abgeleitet. Aminosäuresequenzen, die Steroid- und Kernrezeptor-Ligandenbindungsdomänen codieren, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt [siehe z. B. S. Simons (1988), „Structure and Function of the Steroid and Nuclear Receptor Ligand Binding Domain", Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors: Progress in Gene Expression, Birkhauser, Boston, Massachusetts].
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Ligandenbindungsdomäne von einem Ecdyson-Rezeptor abgeleitet.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann eine Ligandenbindungsdomäne von einem Transkriptionsfaktor in dem Fusionsprotein dieser Erfindung so modifiziert werden, dass sie an einen anderen Liganden bindet. Zum Beispiel kann eine Ligandenbindungsdomäne des menschlichen Progesteronrezeptors so mutiert werden, dass sie in der Lage ist, die Anti-Progesteron-Verbindung RU486 zu binden [Wang, Y. et al. (1997), „Positive and Negative Regulation of Gene Expression in Eukaryotic Cells with an Inducible Transcriptional Regulator", Gene Ther. 4: 432–41].
  • Ein solches RU486-induzierbares GAL4 DNA-Bindungs-Domänen-Fusionsprotein wird für eine Verwendung in dieser Erfindung in Erwägung gezogen.
  • Eine DNA-Bindungs-Domäne (hierin nachfolgend „DBD") bezieht sich auf eine Peptidsequenz in dem Fusionsprotein gemäß dieser Erfindung, welche eine spezifische Nucleotidsequenz (z. B. eine DNA-Element oder ein IRE) erkennt und daran bindet. DNA-Bindungs-Domänen, die gemäß dieser Erfindung nützlich sind, können von den DNA-Bindungs-Domänen von DNA bindenden Proteinen abgeleitet werden, wie z. B. von Transkriptionsfaktoren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesen DNA bindenden Proteinen um Transkriptionsfaktoren, die DNA direkt binden und Transkription in Gang setzen oder unterdrücken. Solche Transkriptionsfaktoren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt [McKnight, S. L. und K. R. Yamamoto (1992), „Transcriptional Regulation"" Cold Spring Harbor Monograph Series, Plainview, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Latchman, D. S. (1995), Eukaryotic Transcription Factors, San Diego, Academic Press, 2. Ausg.; Latchman, D. S. (1993) „Transcription Factors: A Practical Approach", The Practical Approach Series, New York, IRL Press at Oxford University Press; Papavassiliou, A. (1997), „Transcription Factors in Eukaryotes", Molecular Biology Intelligence Unit, New York, Chapman & Hall; Eckstein, F. und D. M. J. Lilley (1997), „Mechanisms of Transcription", Nucleic Acids and Molecular Biology, Band 11, New York, Springer Verlag].
  • Zu bevorzugten DNA-Bindungs-Domänen, die für die Verwendung in dieser Erfindung in Betracht gezogen werden, gehören die DNA-Bindungs-Domänen der folgenden Transkriptionsfaktoren: Homeobox-Proteine, Zinkfingerproteine (Sluyser, M. (1993), Zinc Finger Proteins in Oncogenesis: DNA Binding and Gene Regulation, New York, New York Academy of Sciences), Helix-Turn-Helix-Proteine, Helix-Loop-Helix-Proteine (z. B. Littlewood, Trevor D. (1998), Helix-Loop-Helix Transcription Factors, 3. Ausg., New York, Oxford University Press), Leucin-Zipper-Proteine (z. B. Hurst, H. C. (1996), Leucine Zippers: Transcription Factors, 3. Ausg., San Diego, Academic Press), GAL4-Protein, Hormonrezeptoren, nicht erfasste Rezeptoren, und E. coli-Transkriptionsfaktoren wie z. B. der Lactose-Operon-Repressor, der durch Tetracyclin kontrollierte Transaktivator und FadR.
  • Die vorliegende Erfindung zieht auch die Verwendung der DBDs von Metall bindenden DNA-Bindungs-Proteinen in Betracht, die die Transkription von Metallothionein (MT) Genen regulieren. Zu solchen Metall bindenden DNA-Bindungs-Proteinen gehören MTF-1, ACE1 und AMT1. [Heuchel, R. et al., „Transcriptional Regulation by Heavy Metals, Exemplified at the Metallothionein Genes", Inducible Gene Expression, Band 1 (1995), Birkhauser, Boston, Massachusetts, Hrsg. P. A. Baeuerle, S. 206–240].
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die DNA-Bindungs-Domäne von einem Mitglied der Superfamilie von Steroid/Thyroid-Rezeptoren erhalten. Die Mitglieder der Superfamilie von Steroid/Thyroid-Rezeptoren sind auf dem Fachgebiet als Hormon bindende Proteine bekannt, die als Liganden-abhängige Transkriptionsfaktoren fungieren. Dazu gehören bekannte Mitglieder der Superfamilie von Steroid/Thyroid-Rezeptoren, für die bisher noch keine natürlichen Liganden identifiziert worden sind (die hierin als „nicht erfasste Rezeptoren" bezeichnet werden) [B. M. Forman (1998), „Orphan Nuclear Receptors and Their Ligands", Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors, L. P. Freedman, Hrsg., Birkhauser, Boston, S. 281–305].
  • Mitglieder der nicht erfassten Rezeptoren, die für diese Erfindung nützlich sind, umfassen HNF4, die COUP-Familie von Rezeptoren und die COUP-ähnlichen Rezeptoren, Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPARs), von Insekten abgeleitete knirps und knirps-verwandte Rezeptoren und verschiedene Isoformen davon.
  • Die Aminosäuresequenzen, die solche DBDs codieren, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt [F. Rastinejad (1998), „Structure and Function of the Steroid and Nuclear Receptor DNA Binding Domains", Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors: Progress in Gene Expression, Birkhauser, Boston, MA].
  • Wie die LBD, die in den Fusionsproteinen dieser Erfindung verwendet wird, können die DNA-Bindungs-Domänen dieser Erfindung aus der Sequenz, die in dem ursprünglichen Transkriptionsfaktor vorliegt, modifiziert werden, so dass er ein anderes LRE erkennt. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz eines Mitglieds der Steroid/Thyroid-Familie so modifiziert werden, dass die DNA-Bindungs-Domäne an ein LRE bindet, das von einem anderen Mitglied der Steroid/Thyroid-Familie erkannt wird. Zum Beispiel wird durch diese Erfindung eine Modifikation der Aminosäuresequenz der „P-Box" eines Mitglieds der Steroid/Thyroid-Familie in Betracht gezogen, d. h. einer Region in der DNA-Bindungs-Domäne, welche üblicherweise an der Anschlussstelle der ersten Zink-Finger- und der Linkerregion liegt (Umesono et al. (1989), Cell 57: 1139–1146, insbesondere 2 und Tabelle 1).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Bindungs-Domäne von dem Ecdyson-Rezeptor von Drosophila abgeleitet, wobei die P-Box des Ecdyson-Rezeptors, welche die Aminosäuresequenz EGCKG (SEQ ID NO: 23) aufweist, durch die Aminosäuresequenz GSCKV (SEQ ID NO: 24) ersetzt wird. Die neue P-Box-Sequenz GSCKV bewirkt, dass der Ecdyson-Rezeptor das LRE -AGAACA- anstatt des LREs -AGGTCA- erkennt.
  • Mitglieder der Superfamilie von Steroid/Thyroid-Rezeptoren, die besonders nützlich sind, um die LBD und/oder die DBD eines Fusionsproteins dieser Erfindung zur Verfügung zu stellen, umfassen Steroidrezeptoren wie z. B. den Glucocorticoid-Rezeptor (GR), den Mineralcorticoid-Rezeptor (MR), den Östrogen-Rezeptor (ER), den Progesteron-Rezeptor (PR) wie z. B. hPR-A oder hPR-B, den Androgen-Rezeptor (AR), den Vitamin D3-Rezeptor (VDR); Retinoid-Rezeptoren wie z. B. Retinolsäure-Rezeptoren (z. B. RARα, RARβ oder RARγ) und Retinoid X Rezeptoren (z. B. RXRα, RXRβ oder RXRγ); Thyroid-Rezeptoren (TR) wie z. B. TRα und TRβ); von Insekten abgeleitete Rezeptoren wie z. B. die Ecdyson-Rezeptoren; und Isoformen davon.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Fusionsprotein dieser Erfindung eine DNA-Bindungs-Domäne, die in der Nähe einer oder angrenzend an eine Ligandenbindungsdomäne konstruiert ist, und keine der beiden Domänen enthält eine PCS noch liegt eine PCS zwischen den beiden Domänen.
  • Eine optionale Komponente des Fusionsproteins dieser Erfindung ist eine Expressionsmodulatordomäne. Wie vorstehend erwähnt muss die Expressionsmodulatordomäne, falls sie nicht auf dem Fusionsprotein vorhanden ist, auf einem Protein vorhanden sein, welches sich mit dem Fusionsprotein verbindet.
  • Expressionsmodulatordomänen, die für den Einsatz in dieser Erfindung in Betracht gezogen werden, entweder als Teil des Fusionsproteins oder als ein separates Protein, das sich mit dem Fusionsprotein verbindet, leiten sich üblicherweise von DNA bindenden Proteinen wie z. B. Transkriptionsfaktoren ab. Diese Sequenzen sind auf dem Fachgebiet dafür bekannt, dass sie Transkription durch ihre Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren, die für die Transkription erforderlich sind, aktivieren oder unterdrücken.
  • In Ausführungsformen, in denen die Expressionsmodulatordomäne innerhalb eines zweiten Proteins vorliegt, das an das Fusionsprotein bindet, sollte dieses zweite Protein die Transkription in der Abwesenheit eines Fusionsproteins dieser Erfindung und seines Liganden nicht erhöhen oder verringern. In Ausführungsformen, in denen die Expressionsmodulatordomäne innerhalb des Fusionsproteins vorliegt, liegt sie bevorzugt an dem entgegengesetzten Ende zur Lage der DNA-Bindungs-Domäne.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung aktiviert die Expressionsmodulatordomäne Transkription anstatt diese Aktivität zu unterdrücken. Solche Aktivierungsdomänen umfassen die N-terminalen Bereiche, die die Aktivierungsdomänen in der Superfamilie von Steroid/Thyroid-Rezeptoren, die Aktivierungsdomänen von viralen Transkriptionsfaktoren, die Hefe GCN4-Aktivierungsdomäne oder die GAL4-Aktivierungsdomäne codieren [K. Struhl, „Yeast GCN4 Transcriptional Activator Protein", Transcriptional Regulation, Hrsg. S. L. McKnight und K. R. Yamamoto, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992), S. 833–859; A. A. F. Gann et al., „GAL11, GAL11P and the Action of GAL4", Transcriptional Regulation, Hrsg. S. L. McKnight und K. R. Yamamoto, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992), S. 931–946; K. J. Martin und M. R. Green, „Transcriptional Activation by Viral Immediate-Early Proteins: Variations an a Common Theme", Transcriptional Regulation, Hrsg. S. L. McKnight und K. R. Yamamoto, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992), S. 695–725].
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Expressionsmodulatordomäne Teil des Fusionsproteins. Eine noch stärker bevorzugte Ausführungsform liegt vor, wenn es sich bei der Expressionsmodulatordomäne um die N-terminale Aktivierungsdomäne des VP16-Proteins handelt.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Ligandenbindungsdomäne, die DNA-Bindungs-Domäne und die Expressionsmodulatordomäne nicht von demselben Transkriptionsfaktor stammen müssen.
  • Zum Beispiel kann eine Chimäre hergestellt werden, welche die DNA-Bindungs-Domäne des Retinolsäure-Rezeptors und die Ligandenbindungsdomäne des Vitamin D-Rezeptors (VDR) umfasst (Pemrick, S. et al., (1998) „Characterization of the Chineric Retinoic Acid Receptor RARα/VDR", Leukemia 12: 554–562) oder eine Chimäre, welche die Jun DNA-Bindungs-Domäne umfasst, kann mit der Ligandenbindungsdomäne und der Expressionsmodulatordomäne des Östrogen-Rezeptors fusioniert werden (Kruse, U. et al., (1997) „Hormone-regulatable Neoplastic Transformation Induced by a Jun-Estrogen Receptor Chimera", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12396–12400).
  • Andere Beispiele umfassen die Fusion der lacR DNA-Bindungs-Domäne und der VP16 Aktivierungsdomäne. Dies erzeugt ein Fusionsprotein, das IPTG benötigt um das IRE, lacO zu binden [Labow, M. et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343–3356].
  • In einem anderen Beispiel erzeugt die Fusion des tetR Proteins und der VP16 Aktivierungsdomäne ein Fusionsprotein, das in Gegenwart von Tetracyclin in Zellen und in transgenen Tieren von dem IRE, tetO freigesetzt wird [Gossen, M. und H. Bujard (1992), „Tight Control of Gene Expression in Mammalian Cells by Tetracycline-Responsive Promoters", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 5547–5551; Furth, P. A. et al., (1994) „Temporal Control of Gene Expression in Transgenic Mice by a Tetracycline-Responsive Promoter", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 9302–9306]. Ein tetR-VP16-Fusionsprotein gemäß dieser Erfindung kann eine Proteasespaltstelle in seiner DNA-Bindungs-Domäne enthalten, so dass die DNA-Bindung ausgeschaltet wird, wenn die PCS gespalten wird. Auf diese Weise würde das nicht gespaltene Fusionsprotein auf Zugabe von Tetracyclin hin weiterhin von tetO transaktivieren, wohingegen gespaltene Fusionsproteine inaktiv wären.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist die Fusion der VP16-Aktivierungsdomäne von Herpes simplex-Virus, die Ligandenbindungsdomäne eines Mitglieds der Superfamilie der Steroid/Thyroid-Rezeptoren und die DBD eines Mitglieds der Superfamilie der Steroid/Thyroid-Rezeptoren. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Mitglied der Steroid/Thyroid-Superfamilie um den Ecdyson-Rezeptor.
  • Wie vorstehend beschrieben sieht die Erfindung auch Fusionsproteine vor, die Kontakt mit einem Proteinbindungspartner („PBP") benötigen um DNA zu binden oder die Spezifität der Bindung oder die Affinität der Bindung des Fusionsproteins an sein IRE zu erhöhen. Somit handelt es sich bei einem Proteinbindungspartner gemäß dieser Erfindung um ein Protein, das an ein Fusionsprotein dieser Erfindung bindet und die Affinität oder die Spezifität der Bindung der DNA-Bindungs-Domäne des Fusionsproteins an ein spezifisches IRE erhöht. Der Proteinbindungspartner ist ein Protein, das auch an ein bestimmtes DNA-Element bindet, das funktionell mit dem Reportergen verknüpft ist. Falls das Fusionsprotein dieser Erfindung für eine erhöhte Affinität oder Spezifität der DNA-Bindung einen Proteinbindungspartner benötigt, dann ist es wünschenswert sicherzustellen, dass das Fusionsprotein eine Dimerisierungsdomäne für die Interaktion mit dem PBP umfasst.
  • Proteinbindungspartner, die geeignet sein können, mit den Dimerisierungsdomänen der Fusionsproteine dieser Erfindung zu interagieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt [z. B. T. D. Littlewood und G. I. Evan (1998), „Structure/Function Rela tionships of HLH Proteins", Helix-Loop-Helix Transcription Factors, 3. Ausg., New York, Oxford University Press, S. 27–41; Hurst, H. C. (1996), Leucine Zippers: Transcription Factors, 3. Ausg., San Diego, Academic Press, S. 27–29; und Freedman, L. P., Hrsg. (1998), „Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors: Progress in Gene Expression, Birkhauser Boston, MA].
  • Es sind zum Beispiel mehrere heterodimere Partner von basischen Helix-Loop-Helix (bHLH) Transkriptionsfaktoren auf dem Fachgebiet bekannt. [Littlewood, Trevor D. (1998), Helix-Loop-Helix Transcription Factors, 3. Ausg., New York, Oxford University Press, S. 37–41]. In einem spezielleren Beispiel heterodimerisieren bLHL Transkriptionsfaktoren wie z. B. die Liganden-abhängigen Dioxinrezeptoren und Arylkohlenwasserstoff-Rezeptoren mit dem AHR Kern-Translokator-Protein (ARNT) [Whitelaw, M. L. et al. (1994), „Identification of Transactivation and Repression Functions of the Dioxin Receptor ans Its Basic Helix-Loop-Helix/PSM-Antigens Partner Factor Arnt: Inducible Versus Constitutive Modes of Regulation", Mol. Cell. Biol. 14: 8343–8355].
  • Ein anderes Beispiel ist die Familie von Steroid/Thyroid-Rezeptoren, welche die Fähigkeit haben, miteinander oder mit anderen Mitgliedern der Familie von nicht-Steroid/Thyroid-Rezeptoren zu heterodimerisieren (z. B. Rhee et al. (1995), „Retinoid X-Receptor-alpha and Apolipoprotein Al Regulatory Protein 1 Differentially Modulate 3,5,3'-Triiodothyronine-Induced Transcription", Endocrinology 136: 2697–704; Li et al. (1997), „Coexpression of Nuclear Receptors Partners Increases Their Solubility and Biological Activities", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 2278–83).
  • Noch ein anderes Beispiel stellen die bZIP-Faktoren dar, die mit mehreren anderen Proteinen heterodimerisieren. [z. B. H. C. Hurst (1996), Leucine Zippers: Transcription Factors, 3. Ausg., London, Academic Press, S. 28].
  • Solche Heterodimere und Homodimere, die ein Fusionsprotein dieser Erfindung umfassen, werden in Erwägung gezogen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung heterodimerisiert ein in der P-Box modifizierter Ecdyson-Rezeptor mit einem RXR von Säugern.
  • Ein Fusionsprotein dieser Erfindung zur Verwendung in zellulären Transkriptionsassays sollte im Kern der Wirtszelle lokalisiert sein. Ein Kernlokalisierungssignal, das bereits innerhalb einer Domäne eines Fusionsproteins dieser Erfindung vorhanden ist, kann das Kernlokalisierungssignal bereitstellen. Alternativ kann ein auf dem Fachgebiet bekanntes Kernlokalisierungssignal in das Fusionsprotein konstruiert werden, um eine Kernlokalisierung zu gewährleisten. [z. B. D. B. DeFranco (1998), „Subcellular and Subnuclear Trafficking of Steroid Receptors", Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors: Progress in Gene Expression, Birkhauser, Boston, MA; Guiochon-Mantel, A. et al. (1996), „The Ernst Schering Poster Award. Intracellular Traffic of Steroid Hormone Receptors", J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 56: 3–9].
  • In einer anderen Ausführungsform der Verfahren dieser Erfindung fehlt dem Fusionsprotein eine Ligandenbindungsdomäne. Genau gesagt umfasst das Fusionsprotein in dieser Ausführungsform (1) eine DNA-Bindungs-Domäne und (2) eine Proteasespaltstelle. Bei diesen Verfahren ist die transkriptionelle Aktivität des Fusionsproteins durch Ändern der Temperatur der Transkriptionsumgebung oder durch Verursachen von Stress für die Zellen, in denen das Transkriptionsereignis stattfindet, induzierbar. Zum Beispiel ist die Bindung mit hoher Affinität eines Hitzeschockfaktors („HSF") an sein Response Element, HSE, von einem Hitzeschock-Stimulus abhängig. [z. B. J. Lis und C. Wu (1992), „Heat Shock Factor", Transcriptional Regulation, Hrsg. S. L. McKnight und K. R. Yamamoto, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 907–930; D. S. Latchman (1995), „Transcription Factors and Inducible Gene Expression", Eukaryotic Transcription Factors, 2. Ausg., London, Academic Press Limited, S. 71–78].
  • Eine Proteasespaltstelle von Interesse kann in das HSF-Protein konstruiert werden, so dass die transkriptionelle Aktivität des gespaltenen HSF-Fusionsproteins im Vergleich zu dem ungespaltenen HSF-Fusionsprotein nach der Hitzestimulierung niedriger oder vernachlässigbar ist.
  • Die von den Verfahren dieser Erfindung vorgesehene Verwendung der Fusionsproteine, DNA-Moleküle und Vektoren dieser Erfindung schließt zelluläre und in vitro Transkriptionsreaktionen ein.
  • Verfahren zur Durchführung von Transkriptionsassays in Zellen sind bekannt. [z. B. R. White und M. Parker, „Analysis of Cloned Factors", Transcription Factors: A Practical Approach, Hrsg. D. S. Latchman, IRL Press, Oxford (1993), S. 145–152; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1991); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Kurz gesagt, eine DNA, die ein Fusionsprotein dieser Erfindung codiert, ein Reportergen-Plasmid, eine Protease und, wahlweise, ein zweites Protein, das eine Expressionsmodulatordomäne aufweist, werden in eine Zelle eingeführt. Als nächstes wird die transkriptionelle Aktivität des Fusionsproteins induziert, indem man einen Liganden hinzufügt oder indem man die Umgebung der Zelle ändert (z. B. die Temperatur der Umgebung der Zelle verändert). Die Menge an mRNA, die Menge an Reporterprotein oder die Aktivität des Reporterproteins wird gemessen, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Standardtechniken eingesetzt werden. Die Transkription in Abwesenheit der Protease kann mit der Transkription in Gegenwart der Protease verglichen werden.
  • Verfahren zur Durchführung von in vitro Transkriptionsreaktionen sind ebenfalls bekannt [Sierra, F. et al., „In vitro Transcription with Nuclear Extracts from Differentiated Tissues", Gene Transcription: A Practical Approach (1993), Oxford University Press, Walton Street, Oxford, Hrsg. D. Harnes und S. Higgins, S. 125–152; Snoek, R. et al., (1996), „Induction of Cell-Free In Vitro Transcription by Recombinant Androgen Receptor Peptides", J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 59: 243–250; Dignam, J. D. et al., (1992), „Preparation of Nuclear and Cytoplasmic Extracts from Mammalian Cells" in Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg. von F. A. Ausubel et al.), John Wiley and Sons, New York, S. 12.1.1–12.1.9; Klein-Hitpass, L. et al., (1990), „The Progesteron Receptor Stimulates Cell-Free Transcription by Enhancing the Formation of a Stable Preinitiation Complex", Cell 60: 247–257].
  • Kurz gesagt würden zelluläre Extrakte hergestellt werden, die nach Protokollen zubereitet sind, von denen gezeigt worden ist, dass sie in vitro Transkriptionsreaktionen unterstützen. Aufgereinigte oder teilweise aufgereinigte Proteine würden zusammen mit einem Reporterplasmid zu dem Zellextrakt hinzugegeben werden. Solche aufgereinigten oder teilweise aufgereinigten Proteine wie z. B. das Fusionsprotein dieser Erfindung können durch Überexpression in einer Zelle hergestellt werden, in welche die das Fusionsprotein codierende DNA eingeführt worden ist, z. B. SF9-Zellen über eine Baculovirus-Infektion, Pflanzenzellen, Hefezellen, Säugerzellen und Bakterienzellen. Proteine wie z. B. die Protease und, wahlweise, das zweite Protein, das eine Expressionsmodulatordomäne besitzt, und/oder ein Proteinbindungspartner können ebenfalls aus ihren ursprünglichen Quellen hergestellt werden, indem man auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet um sie auf zureinigen.
  • Als nächstes wird die transkriptionelle Aktivität des Fusionsproteins induziert werden, indem man einen Liganden hinzufügt. Die Menge an hergestellter mRNA, die Menge an hergestelltem Reporterprotein oder die Aktivität des Reporterproteins wird gemessen werden, indem man auf dem Fachgebiet bekannte Standardverfahren verwendet. Die Transkription in Gegenwart der Protease kann mit der Transkription in Abwesenheit der Protease verglichen werden.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf Hemmung von Protease-Aktivität bereit. Man kann eine zu screenende Verbindung zur gleichen Zeit hinzufügen, zu der der Ligand hinzugefügt wird oder während der anfänglichen Expression/Inkubation der Protease mit einem Fusionsprotein. Die optimale Menge der Verbindung, die erforderlich ist, um die größte Hemmung der Protease zu erreichen, kann durch eine Titration der Verbindung bestimmt werden.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Vergleichen der Aktivität von zwei Proteasen bereit, welche die gleiche Proteasespaltstelle erkennen. Das Verfahren ist nützlich zum Vergleichen der Aktivität von mutanten und nicht mutanten Proteasen, z. B. HIV-Aspartylproteasen von Patienten.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Vergleichen der Aktivität einer Protease gegen verschiedene Proteasespaltstellen bereit. Das Verfahren ist nützlich, um die Substratspezifität einer vorgegebenen Protease zu bestimmen.
  • Die Erfindung stellt auch Kits zum Testen von Protease-Aktivität bereit. Falls das Kit in einem in vitro Transkriptionsassay eines Reportergens eingesetzt werden soll, dann kann es einen in vitro Transkriptionsextrakt umfassen, einen wie vorstehend beschriebenen Vektor, der ein Reportergen enthält, einen Vorrat an Ligand sowie Anweisungen. Wahlweise kann es einen Vorrat an Fusionsprotein dieser Erfindung bereitstellen, ein zweites Protein, das eine Expressionsmodulatordomäne umfasst, und/oder eine Protease, die von einer Quelle exprimiert ist, die Bakterien, Insektenzellen, Säugerzellen und Hefe umfasst.
  • Falls das Kit einem zellulären Transkriptionsassay eingesetzt werden soll, kann das Kit eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Fusionsprotein dieser Erfindung codiert, und einen Vektor, der ein wie vorstehend beschriebenes Reporterplasmid codiert, einen Liganden, der an das durch die DNA-Sequenz des Proteins codierte Fusionsprotein bindet und dessen Aktivität reguliert; sowie Anweisungen zur Ver wendung des Kits zum Testen von Protease-Aktivität.
  • Proteasen, welche besonders nützlich bei den Verfahren dieser Erfindung sind, sind Proteasen, welche zu den Symptomen oder zum Ausbruch einer Krankheit beitragen. Zum Beispiel jene Proteasen, die an der Verdauung, der Blutgerinnung, der Apoptose, der Aktivierung von Immunreaktionen, der Zymogen-Aktivierung, der viralen Reifung, der Proteinsekretion und dem Proteintransport beteiligt sind. In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Proteasen von Interesse diejenigen, die an der Alzheimerschen Krankheit, der Mucoviscidose, dem Emphysem, dem Bluthochdruck, dem Eindringen von Tumoren und der Metastase und Virus-assoziierten Krankheiten beteiligt sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung handelt es sich bei den Proteasen um die HIV-Aspartyl-Protease und die HCV NS3 Protease und aktive Fragmente oder Fusionsproteine davon.
  • In einer Ausführungsform dieser Erfindung können ein beliebiges oder alle der DNA-Moleküle, welche die Fusionsproteine codieren, PBP, Proteasen und zweite Proteine, welche die Expressionsmodulatordomäne umfassen, weiter modifiziert werden, um eine zusätzliche Polypeptidsequenz für eine vereinfachte Aufreinigung oder zum Nachweis der Expression des Proteins bereitzustellen. Zum Beispiel können solche Polypeptidsequenzen ein Epitop für die Bindung eines Antikörpers, einen Fc-Teil eines Antikörpers um an Protein A-Kügelchen zu binden, Glutathion-S-Transferase, Maltose-Bindungsprotein, His(n), FLAG und Strep-Tag enthalten. Diese Tags, nach denen man screenen kann, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und stehen einem Fachmann ohne Einschränkung zur Verfügung.
  • Mehrere Vektoren, die für die Überexpression der Proteine dieser Erfindung nützlich sind, sind im Handel erhältlich oder bekannt für Expression in Hefe, Insektenzellen, Bakterien, Hefe, Pflanzenzellen und Säugerzellen.
  • Wirtszellen, die gemäß den Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Falls die Aktivität einer exogenen Protease untersucht wird, ist es wünschenswert, dass die Wirtszelle keine hohen Mengen endogener Proteasen exprimiert, welche die Proteasespaltstelle(n) erkennen, auf die man abzielt. Geeignete Wirtszellen können CHO-Zellen, HeLa-Zellen, Leberzellen, CV-1-Zellen, P19-Zellen, NT2/D1-Zellen, Maus L-Zellen, Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze wie z. B. COS-7-Zellen oder andere COS-Zellen, menschliche embryonale Nierenzellen wie z. B. HEK 293, DG44-Zellen Itk–-Zellen, Maus NIH 3T3- Zellen, und Hefezellen umfassen. Die Wirtszellen können transient transfiziert sein oder es kann sich um stabil transformierte Zelllinien handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung sind die Wirtszellen COS-Zellen oder Zellen von einer Leberzellinie.
  • Liganden, die für den Einsatz in den Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Die Liganden sollten an die Ligandenbindungsdomänen der Transkriptionsfaktoren binden, von denen die Ligandenbindungsdomänen abgeleitet worden sind, oder an modifizierte Ligandenbindungsdomänen davon (siehe vorstehend). Bevorzugt verstärkt oder unterdrückt der Ligand Transkription von dem Promotor nicht wesentlich, solange nicht ein IRE für das Fusionsprotein gespleißt wird oder in einen Vektor eingesetzt wird, der einen Promotor und ein Reportergen umfasst, wobei das IRE auf eine Weise mit dem Promotor verknüpft ist, die dazu führt, dass die transkriptionelle Aktivität von dem Promotor funktionell auf den Liganden anspricht.
  • Die Wahl des zu verwendenden Liganden wird notwendigerweise von der Ligandenbindungsdomäne des verwendeten Fusionsproteins abhängen. Geeignete Liganden zur Verwendung mit Metall bindenden DNA-Fusionsproteinen können zum Beispiel Zink, Cadmium und Kupfer umfassen.
  • Geeignete Liganden zur Verwendung mit Steroid bindenden oder modifizierten Steroid bindenden Fusionsproteinen können zum Beispiel Androgen, Glucocorticoid, Mineralcorticoide, Thyroidhormone, Östrogen, Progesteron, Gestagen, Retinolsäure, Vitamin D3, 20-Hydroxy-Ecdyson, Ponasteron A, 26-Jodponasteron A, Muristeron A, Inokosteron, 26-Mesyinokosteron, Mifepriston (RU 486) und Analoga davon umfassen.
  • Wie hierin verwendet schließen Androgene Dihydroxytestosteron und Analoga davon ein, einschließlich Methyltrienolon.
  • Wie hierin verwendet schließen Glucocorticoid-Hormone Cortisol, Hydrocortison und Corticosteron und Analoga davon ein, einschließlich Dexamethason, Desoxycorticosteron und Triamcinolonacetonid.
  • Wie hierin verwendet schließen Mineralcorticoide Aldosteron, Corticosteron und Desoxycorticosteron ein.
  • Wie hierin verwendet schließen Thyroidhormone Thyroxin (T4) und Trijodthyronin (T3) ein.
  • Wie hierin verwendet schließen Östrogene Östradiol-17-beta und Analoga davon ein, einschließlich Diethylstilbestrol.
  • Wie hierin verwendet schließen Gestagen-Analoga von Progesteron ein, einschließlich Promegeston.
  • Geeignete Liganden für Tetracyclin-induzierbare Fusionsproteine schließen Tetracyclin und Analoga davon ein.
  • Geeignete Liganden für Zucker-induzierbare Fusionsproteine schließen Arabinose, Lactose und Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ein.
  • Geeignete Liganden für Arylkohlenwasserstoff-induzierbare Fusionsproteine schließen Dioxin ein.
  • Geeignete Liganden für nicht erfasste Rezeptoren schließen die folgenden ein: Phytensäure, 9-cis-Retinolsäure und LG100268 für den RXR-Rezeptor; 8S-HETE und Wy 14,643 für den PPARα-Rezeptor; 15-Desoxy-Δ12,14-PGJ2 und BRL 49653 für den PPARγ-Rezeptor; Linolensäure und Carbaprostacyclin für den PPARδ-Rezeptor; Farnesol für den FXR-Rezeptor; und 24(S),25-Epoxycholesterin für den LXR-Rezeptor. [B. M. Forman (1998), „Orphan Nuclear Receptors and Their Ligands", Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors, L. P. Freedman, Hrsg., Birkhauser, Boston, S. 281–305].
  • Bei den LREs und den PBP-DNA-Elementen in dieser Erfindung handelt es sich um Nucleinsäuremoleküle, die DNA-Bindungsstellen für die Fusionsproteine bzw. die Proteinbindungspartner bereitstellen. Beide Elemente sollten funktionell mit einem Promotor verknüpft sein, um die Aktivierung oder die Unterdrückung der Transkription eines Reportergens zu kontrollieren. Der Ausdruck „funktionell verknüpft" bezieht sich auf das Verbinden eines Nucleinsäuremoleküls (z. B. einem Reportergen, das ein Reporterprotein codiert) mit einem IRE und einem PBP-DNA-Element (falls die Bindung eines PBP für die Transkription erforderlich ist) und mit Transkriptionskontrollsequenzen auf eine Weise, dass das Nucleinsäuremolekül exprimiert werden kann, wenn es in eine Wirtszelle eingeführt wird (z. B. transfiziert, transformiert, transduziert, konjugiert oder mittels Rekombination oder Infektion).
  • Transkriptionskontrollsequenzen sind Sequenzen, welche die Initiation, die Elongation und die Termination der Transkription kontrollieren. Besonders wichtige Transkriptionskontrollsequenzen sind diejenigen, welche die Initiation der Trans kription kontrollieren wie z. B. der Promotor. Bevorzugt ist der Promotor ein Minimalpromotor. Der Ausdruck „Minimalpromotor" soll eine partielle Promotorsequenz beschreiben, welche die Startstelle der Transkription für die zu transkribierende Sequenz definiert, aber die für sich allein nicht in der Lage ist, in einer bestimmten Zellumgebung Transkription effizient, wenn überhaupt, in Gang zu setzen. Aus diesem Grund hängt die Aktivität eines solchen Minimalpromotors von der Bindung eines Fusionsproteins dieser Erfindung ab.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der Minimalpromotor aus dem Drosophila Hitzeschock-Promotor und das Ziel-LRE für das Fusionsprotein ist AGAACA, das wie in PCT/US97/05330 hergestellt wird.
  • LREs gemäß dieser Erfindung sollten so funktionieren, dass sie Reaktionsfähigkeit gegenüber einem Liganden verleihen. In einer weiteren Ausführungsform können DNA-Elemente, die an PBP dieser Erfindung binden, auch auf Liganden ansprechen, falls es sich bei dem verwendeten PBP um ein Protein handelt, das Liganden bindet. Die Wahl des IRE und (gegebenenfalls) des DNA-Elements und die Anordnung dieser Elemente zueinander werden von dem verwendeten Fusionsprotein oder dem PBP abhängen. Zum Beispiel würde das IRE wahrscheinlich das Konsensus-DNA-Hexamer CANNTG (auch als „E-Box" bekannt) umfassen, falls die DNA-Bindungs-Domäne des Fusionsproteins von einem basischen Helix-Loop-Helix-Protein stammt (z. B. Littlewood et al., vorstehend, Seite 31).
  • Die bevorzugten DNA-Bindungsstellen (d. h. LREs und DNA-Elemente) für viele Transkriptionsfaktoren sind bekannt. [D. J. Mangelsdorf und R. M. Evans (1992), „Retinoid Receptors as Transcription Factors", Transcriptional Regulation, Hrsg. S. L. McKnight und K. R. Yamamoto, S. 1137–1167; L. P. Freedman, Hrsg. (1988), Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors: Progress in Gene Expression, Birkhauser, Boston, MA, S. 111–113 und PCT/US97/05330 ].
  • Der Promotor, der die Expression der Fusionsproteine, PBP und Proteasen in einer Säugerzelle kontrolliert, kann konstitutiv sein wie z. B. der Cytomegalievirus (CMV) Promotor, der frühe SV40 Promotor und der Rous Sarkomvirus (RSV) Promotor. Zur besseren Kontrolle können die Fusionsproteine, PBP und Proteasen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehen. Es ist wünschenswert, dass der induzierbare Promotor nicht derselbe ist wie der Promotor, der die Transkription des Reportergens steuert.
  • Reportergene, die gemäß den Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zu solchen Reportergenen gehört das Luciferasegen, das Gen des grün fluoreszierenden Proteins ( US 5,491,084 ), β-Galactosidase, das Gen der sezernierten alkalischen Phosphatase und das Gen für die Chloramphenicolacetyltransferase. Die Erfindung sieht auch Reportergene vor, die ein Markerprotein mit einer Signalsequenz für die Sekretion aus der Zelle heraus codieren, wie z. B. das Gen für IL-1 beta.
  • Vektoren, die das Reportergen funktionell verknüpft mit einem IRE und einem DNA-Element enthalten (d. h. das Reporterplasmid), lassen sich aus im Fachgebiet verfügbaren Materialien herstellen. Solche Reporterplasmide schließen bevorzugt zum Beispiel das Folgende ein: einen Replikationsursprung und einen selektierbaren (selektierbare) Marker. Das Reporterplasmid kann wahlweise auch andere DNA-Sequenzen beinhalten, wie z. B. long terminal repeats („LTRs"), um den Einbau des Vektors in das Genom einer Zelllinie zu bewirken.
  • Vektoren, die für die Expression der Fusionsproteine, PBP, Proteine mit einer Expressionsmodulatordomäne oder Proteasen in Bakterien oder Säugerzellen geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Solche Vektoren können zum Beispiel das Folgende beinhalten: einen Replikationsursprung, einen selektierbaren Marker und Transkriptionskontrollsequenzen wie z. B. einen Promotor und eine Polyadenylierungssequenz. So sollten die Fusionsproteine, PBPs, Proteine mit Expressionsmodulatordomänen und Proteasen funktionell mit einem konstitutiven oder einem induzierbaren Promotor wie vorstehend beschrieben verknüpft sein. Die Vektoren können auf eine solche Weise konstruiert werden, dass zwei oder mehr der folgenden Proteine: das Fusionsprotein, die Protease und optional der PBP und/oder das Protein, welches die Expressionsmodulatordomäne aufweist (falls dies für die Funktion des Fusionsproteins erforderlich ist), in demselben Vektor vorhanden sind. Die Transkription dieser Gene kann durch denselben oder durch verschiedene Promotoren kontrolliert werden. Zum Beispiel kann jedes Gen durch einen unterschiedlichen induzierbaren Promotor kontrolliert werden oder jedes Gen kann durch denselben konstitutiven Promotor kontrolliert werden.
  • Das Reporterplasmid und die Vektoren für die Expression der Fusionsproteine, PBPs, Proteasen und die zweiten Proteine, welche die Expressionsmodulatordomäne umfassen, können zwei selektierbare Marker enthalten – einen, der Wachstum in prokaryontischen Zellen wie z. B. Bakterien überträgt, und einen, der in Gegenwart spezieller Verbindungen Wachstum in eukaryontischen Zellen wie z. B. Hefe, Säuger- oder Pflanzenzellen überträgt. Selektierbare Marker, die in dieser Erfindung nützlich sind, können Resistenz gegenüber Medikamenten wie z. B. Ampicillin, Kanamycin, Hygromycin, Neomycin oder G418 übertragen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung codiert der Vektor das Fusionsprotein, welches die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 19 aufweist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Vektor als Kontrolle verwendet, der das Fusionsprotein codiert, welches die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 21 aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Reporterplasmid von pIND von Invitrogen abgeleitet.
  • Falls die Vektoren und Reporterplasmide in einem Transkriptionsassay in einer Zelle eingesetzt werden sollen, können sie in die Wirtszellen durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden eingeführt werden, wie z. B. Transfektion, Lipofektion, Cytofektion, Bombardierung mit Kugelpartikeln, Elektroporation, Mikroinjektion oder Virus-Infektion [z. B. F. M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1991); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
  • Im Fall einer Virus-Infektion kann die DNA von Interesse in einen viralen Vektor zwischen zwei retrovirale LTRs cloniert, zur Herstellung von Retrovirus und zur Infektion von Zellen mit dem Virus verwendet werden. Zu anderen Viren, die gemäß dieser Erfindung nützlich sind, gehören Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Vaccinia-Virus.
  • Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit eines Reportergenprodukts sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zum Beispiel sind Verfahren zum Testen der mRNA bekannt, die von der Transkription des Reportergens herrührt [Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 2. Ausg.; Hrsg. F. M. Ausubel et al., (1991), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 5. Ausg.]. Verfahren zum Testen des von dem Reportergen codierten Proteins sind ebenfalls bekannt, und es sind Kits von Firmen verfügbar um dieses zu bestimmen (z. B. Promega).
  • Überall in der Patentschrift und in den Ansprüchen ist das Word „umfassen" oder Abwandlungen davon wie z. B. „umfasst" selbstverständlich so zu verstehen, dass es den Einschluss einer spezifizierten ganzen Zahl oder einer Gruppe von ganzen Zahlen bedeutet, jedoch nicht den Ausschluss von jeder beliebigen anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen.
  • Damit die hierin beschriebene Erfindung besser verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele dargelegt. Diese Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht so zu interpretieren, dass sie diese Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
  • Beispiel 1 – Konstruktion von DNA-Vektoren
  • A. Materialien
  • (1) Vektoren
  • Das Plasmid pVgRXR wurde von Invitrogen bezogen. pVgRXR ist ein 8728 bp großer Vektor, der sowohl einen modifizierten Ecdyson-Rezeptor (VgEcR) als auch einen Retinoid X-Rezeptor (RXR) exprimiert, um einen heterodimeren Kernrezeptor zu bilden (1). Die Transkription des VgEcR-Gens wird von dem unmittelbar frühen Cytomegalievirus (CMV) Promotor gesteuert. Die Transkription des RXR-Gens wird von dem Rous Sarkomvirus (RSV) Promotor gesteuert. Stabile Zelllinien, welche die Gene exprimieren, können durch Selektion auf dem Antibiotikum ZeocinTM hergestellt werden. Die Produktinformation bezüglich der Eigenschaften und des Umgangs mit dem Vektor pVgRXR und dem Ecdyson-System-Kit sind durch. Bezugnahme auf das technische Handbuch von Invitrogen aufgenommen.
  • Das Plasmid pIND wurde von Invitrogen bezogen (3). Das Plasmid pIND ist ein 5024 bp großer Vektor, der auf dem Vektor pcDNA3.1 basiert. Es weist fünf hybride LREs auf, d. h. fünf Ecdyson/Glucocorticoid-Response-Elemente (E/GRE) und den Hitzeschock-Minimalpromotor. Die E/GREs können von einem modifizierten Ecdyson-Rezeptor erkannt werden, der von pVgRXR exprimiert wird. Das Plasmid pIND-luc wurde hergestellt, indem das Luciferase-Gen einschließlich seiner Kozak-Sequenz und Methionin-Startstelle aus einem anderen Plasmid herausgeschnitten und in den Polylinker von pIND cloniert wurde, d. h. stromabwärts von dem Hitze schock-Minimalpromotor (3). Beide Plasmide haben Neomycin- und Ampicillin-Resistenzgene für Selektionszwecke. Die Produktinformation bezüglich der Eigenschaften und des Umgangs mit den Vektoren pIND und pIND-luc ist durch Bezugnahme auf das technische Handbuch von Invitrogen aufgenommen.
  • Das Säuger-Expressionsplasmid pSRα ist im Stand der Technik beschrieben worden [Y. Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8, S. 466–72 (1988). Das Plasmid enthält ein Promotor-System, welches aus dem unmittelbar frühen Promotor des Simianvirus 40 (SV 40) und dem R-Segment und einem Teil der U5-Sequenz (R-U5') des Long Terminal Repeat des menschlichen T-Zell-Leukämievirus Typ 1 (HTLV-1) aufgebaut ist. Das Plasmid enthält auch eine 16S-Spleißstelle, ein SV40 Polyadenylierungssignal und ein Ampicillin-Resistenzgen. Die HTLV LTR Enhancer/Promotor-Sequenz bewirkt eine hohe Expression von stromabwärts clonierten Genen. Gene von Interesse können in die PstI- und EcoRI-Stellen cloniert werden, die 3' von der 16S-Spleißstelle gelegen sind.
  • (2) Primer
  • Der Primer VP16/5A5BF (SEQ ID NO: 12) ist ein 28-mer, welches konstruiert wurde, um an die XbaI-Stelle stromaufwärts von der VP16 codierenden Region des Plasmids pVgRXR zu hybridisieren.
  • Der Primer VP16/5A5BR (SEQ ID NO: 13) ist ein 86-mer, welches konstruiert wurde, um zum Teil an den Antisense-Strang in der 3'-Region der DNA zu hybridisieren, welche die VP16-Aktivierungsdomäne des Plasmids pVgRXR codiert. Der Primer enthält auch Nucleotide, die komplementär zu den codierenden Sequenzen für die 5A/5B-Spaltstelle der HCV NS3-4A-Protease und einer XbaI-Stelle sind.
  • Der Primer VP16/5A**5BR (SEQ ID NO: 14) ist ein 92-mer, welches konstruiert wurde, um zum Teil an den Antisense-Strang in der 3'-Region der DNA zu hybridisieren, welche die VP16-Aktivierungsdomäne des Plasmids pVgRXR codiert. Der Primer enthält auch Nucleotidsequenzen, die komplementär zu den codierenden Sequenzen für die 5A/5B-Spaltstelle der HCV NS3-4A-Protease sind. Die die 5A/5B-Spaltstelle codierende DNA hat jedoch zusätzlich eine sechs Nucleotide lange Insertion zwischen den DNA-Sequenzen, welche ein Cystein- und ein Serincodon codieren. Die sechs Nucleotide lange Insertion codiert zwei Stopcodons.
  • Der Primer NS3-4AF (SEQ ID NO: 15) ist ein 47-mer, welches konstruiert wurde, um zum Teil an den Anfang der NS3 codierenden Region zu binden (ent sprechend Aminosäure #1027–1032 in dem HCV-Polypeptid). Der Rest des Oligonucleotids enthält mehrere Restriktionsstellen für eine leichte Clonierung.
  • Der Primer NS3-4AB (SEQ ID NO: 16) ist ein 44-mer, welches konstruiert wurde, um zum Teil an das 3'-Ende der NS4 codierenden Region zu binden (entsprechend Aminosäure #1705–1711 in dem HCV-Polypeptid). Der Rest des Oligonucleotids enthält mehrere Restriktionsstellen für eine leichte Clonierung.
  • Jeder Primer wurde unter Standardbedingungen synthetisiert, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wobei ein Oligonucleotid-Synthesegerät verwendet wurde.
  • B. Polymerasekettenreaktionen (PCR) und Clonierungsstrategie
  • Die PCR-Reaktionen wurden unter Standardbedingungen durchgeführt (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Plainview, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • (1) Vektor pVgRXR-5a/5B und Vektor pVgRXR-5A**5B
  • Der erste Schritt zur Herstellung des Expressionsvektors, der VgRXR-5A/5B (SEQ ID NO: 19) codiert, beinhaltete eine PCR-Reaktion mit dem Primer VP16/5A5BF (SEQ ID NO: 12), dem Primer VP16/5A5BR (SEQ ID NO: 13) und dem Plasmid pVgRXR als der Matrize. Als nächstes wurde das PCR-Produkt mit XbaI verdaut. Es wurde ein Vektor zur Ligierung mit dem PCR-Produkt hergestellt, indem der Vektor pVgRXR mit XbaI verdaut wurde, um die DNA zu entfernen, welche die VP16-Aktivierungsdomäne codiert. Das Grundgerüst des Vektors wurde isoliert und die verdaute PCR-Insertion wurde in die XbaI-Stelle des Grundgerüsts ligiert. Die Ligierungen wurden mittels Sequenzierung durchmustert, um die korrekte Orientierung der Insertion und die Richtigkeit ihrer Nucleotidsequenz zu gewährleisten.
  • Der erste Schritt zur Herstellung des Expressionsvektors, der VgRXR-5A**5B (SEQ ID NO: 21) codiert, beinhaltete eine PCR-Reaktion mit dem Primer VP16/ 5A5BF (SEQ ID NO: 12), dem Primer VP16/5A**5BR (SEQ ID NO: 14) und dem Plasmid pVgRXR als der Matrize. Als nächstes wurde das PCR-Produkt mit XbaI verdaut. Es wurde ein Vektor zur Ligierung mit dem PCR-Produkt hergestellt, indem der Vektor pVgRXR mit XbaI verdaut wurde, um die DNA zu entfernen, welche die VP16-Aktivierungsdomäne codiert. Das Grundgerüst des Vektors wurde isoliert und die verdaute PCR-Insertion wurde in die XbaI-Stelle des Grundgerüsts ligiert. Die Ligierungen wurden mittels Sequenzierung durchmustert, um die korrekte Orientierung der Insertion und die Richtigkeit ihrer Nucleotidsequenz zu gewährleisten.
  • (2) pSRα-NS3-4A und pSRα-NS3-4A(S1165A)
  • Der erste Schritt zur Herstellung des Vektors pSRα-NS3-4A, der die NS3-4A Spaltstelle codiert (SEQ ID NO: 10), beinhaltete eine PCR-Reaktion mit dem Primer NS3-4AF (SEQ ID NO: 15), dem Primer NS3-4AB (SEQ ID NO: 16) und der Volllänge-cDNA des H-Stamms von HCV als einer Matrize (Inchauspe et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10292–10296. Als nächstes wurde das PCR-Produkt mit PstI und EcoRI verdaut. Es wurde ein Vektor zur Ligierung mit dem PCR-Produkt hergestellt, indem der Vektor pSRα mit PstI und EcoRI verdaut wurde. Das Grundgerüst des Vektors wurde isoliert und die PCR-Insertion wurde in die PstI-EcoRI-Stelle in dem Grundgerüst ligiert.
  • Der erste Schritt zur Herstellung des Vektors pSRα-NS3-4A(S1165A), der die mutante Protease NS3-4A codiert, beinhaltete eine PCR-Reaktion mit dem Primer NS3-4AF (SEQ ID NO: 15), dem Primer NS3-4AB (SEQ ID NO: 16) und der cDNA der NS3-Mutante im katalytischen Zentrum S1165A [A. Grakoui et al., (1993), J. Virol. 67: 2832–43. Als nächstes wurde das PCR-Produkt mit PstI und EcoRI verdaut. Es wurde ein Vektor zur Ligierung mit dem PCR-Produkt hergestellt, indem der Vektor pSRα mit PstI und EcoRI verdaut wurde. Das Grundgerüst des Vektors wurde isoliert und die PCR-Insertion wurde in die PstI-EcoRI-Stelle in dem Grundgerüst ligiert. NS3-4A(S1165A) weist eine Serin zu Alanin-Substitution an der Aminosäure Nr. 1165 auf, welche die Protease inaktiv macht. Vergleichen Sie SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11.
  • Beispiel 2 – Der Ecdyson-induzierbare Luciferase-Assay der Protease NS3-4A
  • Ecdyson-induzierbare Luciferase-Assays der Protease NS3-4A wurden im Allgemeinen wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
  • COS-Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze wurden mit ungefähr 150.000 Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen ausplattiert. Am Tag darauf wurden ungefähr 3,6 μg Plasmid-DNA in 100 μl Dulbecco's Modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Gibco-BRL) gelöst, mit 29 μl Superfect-Reagenz (Qiagen) kombiniert und dann durch Pipettieren gemischt. Das Gemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Mengen an DNA, die üblicherweise in jedem Experiment eingesetzt wurden, waren wie folgt: 0,6 μg von pIND-Luc, 0,6 μg von pVgRXR-5a/5B oder pVgRXR-5A**5B, und 0–2,4 μg von pSRα-NS3-4A oder pSRα-NS3-4A(S1165A) oder pSRα.
  • Als nächstes wurden 600 μl DMEM mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum (10% FBS-DMEM) zu dem DNA-Gemisch hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt. Die Zellen in der Platte mit 6 Vertiefungen wurden mit 2,5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Das PBS wurde von den Zellen weggenommen und durch das DNA-Gemisch ersetzt. Die Zellen wurden für 3 Stunden bei 37°C in einem Inkubator bei 5% CO2 in dem DNA-Gemisch inkubiert.
  • Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Das PBS wurde entfernt und 10% FBS-DMEM wurde zu den Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden in 10% FBS-DMEM über nacht in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C inkubiert.
  • Am nächsten Tag wurde ein exogener Ligand zu den Zellen hinzugegeben, um die Transkription des Reportergens zu induzieren. Genau gesagt wurde das 10% FBS-DMEM von den Zellen abgesaugt und mit einer 10% FBS-DMEM-Lösung ersetzt, die eine Konzentration von 1–10 μM Muristeron A oder 1–10 μM Ponasteron A enthielt (Invitrogen, Vereinigtes Königreich). In einigen Fällen wurde auch ein in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöster Protease-Inhibitor in einer Endkonzentration von 1–40 μM zu den Zellen hinzugegeben. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C in einem Inkubator bei 5% CO2 mit Muristeron A oder Ponasteron A inkubiert.
  • Am folgenden Tag wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Die Aktivität des Luciferase-Proteins wurde mit einem Luciferase-Assay-Kit (Promega) gemessen. Genau gesagt wurden die Zellen in 250 μl Zellkultur-Lysisreagenz lysiert. Die Zellen wurden von der Platte abgeschabt und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Der Extrakt wurde für 5 Sekunden bei 12.000 × g abzentrifugiert. Zwanzig Mikroliter von jeder Probe wurden zu 100 μl Luciferase-Assayreagenz hinzugegeben. Das durch die Reaktion der Luciferase mit dem Reagenz erzeugte Licht wurde in einem Luminometer gemessen und wurde als relative Lichteinheiten (RLU) dargestellt.
  • Die meisten Experimente wurden mehrere Male im Dreifachansatz durchgeführt. Fehlerbalken, die die Standardabweichung der Datenpunkte wiedergeben, sind in den Figuren eingeschlossen.
  • Beispiel 3 – Das Einfügen einer 5A/5B-Verbindungsstelle zwischen der Aktivierungsdomäne und der DNA-Bindungs-Domäne interferiert nicht mit der durch Muristeron A induzierten Transaktivierung
  • Vektoren, die Fusionsproteine (VgRXR, VgRXR-5A/5B oder VgRXR-5A(Stop) 5B) codieren, und pIND-Luc wurden wie vorstehend beschrieben in COS-Zellen transfiziert (Beispiel 2). Am folgenden Tag wurden einige der Zellen für 24 Stunden mit 1 μM Muristeron inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und wie vorstehend beschrieben auf Luciferase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
  • Das von pVgRXR-5A(Stop)5B exprimierte Kontrollfusionsprotein, dem die Ecdyson-DNA-Bindungs-Domäne fehlt, zeigt vernachlässigbare Aktivität. Ein geringer oder kein Unterschied ist zwischen den Aktivitäten der von VgRXR und VgRXR-5A/5B exprimierten Fusionsproteine zu beobachten. Die Ergebnisse sind ein Hinweis darauf, dass das Einfügen der 5A/5B-Verbindungsstelle in dem von VgRXR exprimierten Protein nicht mit der von Muristeron A induzierten Aktivität interferiert.
  • Beispiel 4 – Cotransfektion zunehmender Mengen von pSRαNS3-4A mit pVgRXR-5A/5B führt zu einer Dosis-abhängigen Abnahme der durch Muristeron A induzierbaren Transaktivierung
  • Das Reporterplasmid pIND-Luc wurde wie in 5 angegeben entweder mit pVgRXR-5A/5B oder mit pVgRXR und zunehmenden Mengen (μg) der die Protease NS3-4A codierenden DNA cotransfiziert. Am folgenden Tag wurden die Zellen in 1 μM Muristeron A inkubiert. Als nächstes wurden die Zellen lysiert und wie vorstehend beschrieben auf kucf-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
  • Die Transkription des Luciferase-Reporterkonstrukts zeigte, wenn dieses mit dem die Säuger-RXR und die Ecdyson-Rezeptor/VP16-Fusionsproteine codierenden Konstrukt VgRXR cotransfiziert wurde, geringe oder keine Veränderung, wenn dieses mit der Protease NS3-4A coexprimiert wurde. Auf der anderen Seite erzeugte das von VgRXR-5A/5B codierte Protein eine Dosis-abhängige Abnahme an Luciferase-Aktivität, wenn es mit dem NS3-4A-Protein coexprimiert wurde. Diese Ergebnisse legen es nahe, dass die Protease NS3-4A die 5A/5B-Verbindungsstelle spaltet, jedoch nicht andere Bereiche des Fusionsproteins, die für Aktivität notwendig sind.
  • Beispiel 5 – Cotransfektion zunehmender Mengen von pSRαNS3-4A(S1165A) mit pVgRXR-5A/5B zeigt keinen Einfluss auf die durch Muristeron A induzierbare Transaktivierung
  • Wir setzten 0,6 μg von pVgRXR-5A/5B und 0,6 μg von pIND-Luc ein, um diese wie in 6 angegeben mit unterschiedlichen Mengen (μg) der Vektoren zu cotransfizieren, die NS3-Protease oder eine inaktive Mutante davon codierten. Die Gesamtmenge an DNA, die für jede Transfektion eingesetzt wurde, betrug mit der Zugabe von pSRα 3,6 μg. Am folgenden Tag wurden die Zellen in 1 μM Muristeron A inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und wie zuvor beschrieben auf Luciferase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
  • Wie in den vorherigen Ergebnissen zu sehen war (Beispiel 4), zeigte das durch VgRXR-5A/5B codierte Fusionsprotein eine hohe Aktivität in Abwesenheit der NS3-4A-Protease. Die Aktivität der durch VgRXR-5A/5B vermitttelten Luciferase-Aktivität nahm in einer Dosis-abhängigen Weise mit der Cotransfektion der DNA ab, die die NS3-4A-Protease codierte, aber nicht mit der DNA, die die mutante Protease NS3-4A(1165A) codierte. Dies liegt mutmaßlich an der Unfähigkeit der mutanten NS3-4A-Protease, das Ecdyson/VP16-Fusionsprotein zu spalten.
  • Dosis-Abhängigkeits-Studien wie Beispiele 4 und 5 waren nützlich, um das optimale Verhältnis von Fusionsprotein codierender DNA und von Protease codierender DNA für den Einsatz in zukünftigen Assays zu bestimmen.
  • Beispiel 6 – Dosis-Wirkungs-Verhältnis von Ponasteron A
  • Das Plasmid pIND-Luc (0,6 μg) wurde mit pVgRXR-5A/5B (0,6 μg) in der Abwesenheit oder der Gegenwart von 1,8 μg pSRαNS3-4A cotransfiziert. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit unterschiedlichen Mengen Ponasteron A inkubiert, einem Liganden, welcher die Heterodimerisierung des Ecdyson-Rezeptors mit dem Säuger-Retinolsäure-Rezeptor, RXR, induziert. Die Zellen wurden lysiert und wie zuvor beschrieben auf Luciferase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt.
  • Die Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass Ponasteron A wirksam ist, das Fusionsprotein EdR5A/5B (d. h. das von VgRXR-5A/5B codierte Protein) in der Abwesenheit der Protease NS3-4A zu aktivieren. Für die Zwecke dieser Experimente trat die höchste Aktivierung des Fusionsproteins auf, wenn Ponasteron A in einer Konzentration zwischen 3,3–10 μM vorlag. Allgemein wurde festgestellt, dass Ponasteron A in diesen Assays gleich wirksam war, Translation zu induzieren wie Muristeron A.
  • Beispiel 7 – Induktion durch Ponasteron A und % DMSO-Kontrolle
  • Das Plasmid pIND-Luc (0,6 μg) wurde mit pVgRXR-5A/5B (0,6 μg) in der Abwesenheit oder der Gegenwart von 1,8 μg pSRαNS3-4A cotransfiziert. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 5 μM Ponasteron A inkubiert.
  • Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde ebenfalls in einer Endkonzentration von 0–1% DMSO (v/v) zu den Zellen hinzugegeben. Die Zellen wurden lysiert und wie zuvor beschrieben auf Luciferase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt.
  • In diesem Kontrollexperiment wurde DMSO zu den Zellen hinzugegeben, um festzustellen, ob dessen Anwesenheit mit der Aktivierung des Fusionsproteins durch Ponasteron A interferierte. DMSO ist ein Lösungsmittel, das manchmal dazu verwendet wurde, um Proteaseinhibitor-Verbindungen vor der Zugabe zu diesen Assays zu lösen. In den meisten Experimenten lag die Konzentration von DMSO nicht über 0,1%. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass DMSO-Konzentrationen bis zu 1% eine geringe oder keine Auswirkung auf die durch Ponasteron A induzierte Luciferase-Aktivität in diesem Assay hatten.
  • Die nachstehenden Beispiele zeigen, wie dieser Assay nützlich sein kann, um Verbindungen zu screenen, die möglicherweise als Hemmer einer Protease nützlich sind.
  • Beispiel 8 – Dosis-abhängige Hemmung der Aktivität von NS3-4A durch VRT-25,531
  • Das Plasmid pIND-Luc (0,6 μg) wurde mit pVgRXR-5A/5B (0,6 μg) in der Gegenwart von 1,8 μg pSRαNS3-4A (Verhältnis 1:3) cotransfiziert. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 5 μM Ponasteron A und unterschiedlichen Mengen einer Verbindung VH-25531 inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und wie zuvor beschrieben auf Luciferase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt.
  • Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass VH-25531 in der Abwesenheit der Protease NS3-4A die Aktivität des Fusionsproteins nicht signifikant erhöht oder erniedrigt (Vergleichen Sie Spuren 1 und 3, 9). Jedoch inhibiert VH-25531 die Aktivität der Protease NS3-4A, besonders bei 20 μM (Vergleichen Sie die Spuren 4–11 mit Anspruch 2, 9). In der Tat weisen die Ergebnisse darauf hin, dass VH-25531 die Protease NS3-4A bei einer Konzentration von 20 μM bis zu 55,5% inhibieren kann. Die prozentuale Inhibition der Protease-Aktivität bei 20 μM VH-25531 wurde überschlagsmäßig berechnet, indem die Werte der Spuren 3 und 2 (19900 – 5177 = 14732) voneinander abgezogen wurden, die Werte der Spuren 4 und 2 (13356 – 5177 = 8179) voneinander abgezogen wurden und dann die zwei Werte durcheinander geteilt wurden (8179/14723 = 0,555).
  • Während wir hierin vorstehend eine Reihe von Ausführungsformen dieser Erfindung vorgestellt haben, ist es offensichtlich, dass unsere Basiskonstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, welche sich die Verfahren dieser Erfindung zunutze machen. Es ist aus diesem Grund ersichtlich, dass der Geltungsbereich dieser Erfindung durch die Ansprüche und die Beschreibung zu definieren ist statt durch die speziellen Ausführungsformen, die hierin beispielhaft dargelegt sind.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (25)

  1. DNA-Molekül, das ein Fusionsprotein codiert, umfassend: (a) eine Zielprotease-Spaltstelle; (b) eine Ligandenbindungsdomäne; (c) eine DNA-Bindungsdomäne; wobei die Assoziation eines Liganden mit dem Fusionsprotein die Bindung des Fusionsproteins an ein Liganden-responsives Element („LRE") vermittelt, das funktionell mit einem Reportergen verbunden ist; wobei die Proteasespaltstelle des Fusionsproteins so gespalten werden kann, dass keines der resultierenden Fusionsproteinfragmente fähig ist, die Expression des Reportergens zu modulieren; und wobei das Fusionsprotein auch eine Expressionsmodulatordomäne umfasst oder mit einem zweiten Protein mit einer Expressionsmodulatordomäne verbunden ist, wobei die Expressionsmodulatordomäne die Transkription des Reportergens reguliert; und wobei die Zielprotease-Spaltstelle innerhalb der DNA-Bindungsdomäne oder innerhalb der Modulatordomäne, falls vorhanden, oder zwischen beliebigen Domänen des Fusionsproteins liegt.
  2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Proteasespaltstelle durch HCV-NS3-Protease oder durch HIV-Aspartylprotease erkannt wird.
  3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aminosäuresequenz der Proteasespaltstelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis 10.
  4. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA-Bindungsdomäne ausgewählt ist aus einer DNA-Bindung eines Rezeptors der Steroid/Thyroid-Superfamilie.
  5. DNA-Molekül nach Anspruch 4, wobei die DNA-Bindungsdomäne vom Ecdysonrezeptor stammt und wobei der Ecdysonrezeptor die Assoziation mit einem Proteinbindungspartner erfordert, um die Bindung an DNA zu ermöglichen.
  6. DNA-Molekül nach Anspruch 5, wobei die DNA-Bindungsdomäne so modifiziert ist, dass die P-Box-Region die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 24 aufweist oder das DNA-Molekül die Sequenz von SEQ ID NO: 19 aufweist.
  7. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Expressionsmodulatordomäne die Aktivierungsdomäne des VP16-Proteins ist.
  8. DNA-Molekül, das ein Fusionsprotein codiert, das die Sequenz von SEQ ID NO: 20 aufweist.
  9. Vektor, umfassend das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  10. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 9 transformiert ist.
  11. Wirtszelle nach Anspruch 10, ferner umfassend ein DNA-Molekül, das umfasst: (a) ein LRE, das an die DNA-Bindungsdomäne des Fusionsproteins bindet, wobei die Bindung durch die Anwesenheit eines Liganden moduliert wird und gegebenenfalls durch die Anwesenheit eines Proteinbindungspartners des Fusionsproteins moduliert wird; (b) einen Promotor, der durch die Expressions-modulierende Domäne des Fusionsproteins moduliert wird; und (c) ein Reportergen, dessen Expression durch den Promotor kontrolliert wird.
  12. Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei der Promotor ein Hitzeschockpromotor aus einem Säuger ist.
  13. Wirtszelle nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Reportergen das Luciferasegen ist.
  14. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, zusätzlich umfassend ein DNA-Molekül, das einen zur Aktivierung der DNA-Bindungsdomäne des Fusionsproteins erforderlichen Proteinbindungspartner codiert.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, umfassend die Schritte des Züchtens einer Wirtszelle nach Anspruch 10 unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsproteins führen.
  16. Fusionsprotein, das von dem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 codiert wird oder mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 15 erhältlich ist.
  17. Verfahren zum Testen der Proteaseaktivität in vitro, umfassend die Schritte: (a) Inkubieren des Fusionsproteins nach Anspruch 16 in einem in vitro-Transkriptionsextrakt mit einer Protease, die fähig ist, das Fusionsprotein an der Proteasespaltstelle zu spalten, und einem DNA-Molekül, wobei die DNA-Moleküle umfassen: (i) ein LRE, das an die DNA-Bindungsdomäne des Fusionsproteins bindet; (ii) einen Promotor, der durch die Expressions-modulierende Domäne des Fusionsproteins moduliert wird; und (iii) ein Reportergen, dessen Expression durch den Promotor kontrolliert wird, wobei die Proteasespaltstelle des Fusionsproteins von der Protease gespalten werden kann, deren Aktivität getestet wird; (b) Hinzufügen eines sich mit dem Fusionsprotein verbindenden Liganden zur Inkubation, wobei der Ligand erforderlich ist, damit das Fusionsprotein (i) an das LRE oder an einen Proteinbindungspartner bindet und (ii) die Transkription des Reportergens moduliert; und (c) Quantifizieren des von dem Reportergen produzierten Genprodukts.
  18. Verfahren zum Testen der Proteaseaktivität in einer Zelle, umfassend die Schritte: (a) Züchten der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14 unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsprotein führen, und, falls vorhanden, des Proteinbindungspartners, wobei die Wirtszelle die zu testende Protease exprimiert und wobei die Proteasespaltstelle des Fusionsproteins durch die Protease gespalten werden kann; (b) Hinzufügen eines mit dem Fusionsprotein assoziierenden und dessen Aktivität regulierenden Liganden zur Wirtszelle, wobei der Ligand erforderlich ist, damit das Fusionsprotein (i) an das funktionell mit dem Reportergen verbundene LRE oder an einen Proteinbindungspartner bindet; und (ii) die Transkription des Reportergens moduliert; und (c) Quantifizieren des von dem Reportergen produzierten Genprodukts.
  19. Verfahren zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität einer Verbindung gegenüber einer Protease, umfassend die Schritte: (a) Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14 in einer ersten Kultur in Abwesenheit der Verbindung unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsproteins führen, wobei die Wirtszelle die zu testende Protease exprimiert und wobei die Proteasespaltstelle des Fusionsproteins durch die Protease gespalten werden kann; (b) Züchten der in Schritt (a) verwendeten Wirtszelle in einer zweiten Kultur in Anwesenheit der Verbindung unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsproteins führen; (c) Hinzufügen eines Liganden zur ersten und zweiten Wirtszellkultur, wobei der Ligand erforderlich ist, damit das Fusionsprotein (i) an das funktionell mit einem Reportergen verbundene IRE oder an einen Proteinbindungspartner bindet und (ii) die Transkription des Reportergens moduliert; und (d) Vergleich der Menge an von dem Reportergen produzierten Genprodukt in der ersten Wirtszellkultur und der zweiten Wirtszellkultur.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, umfassend die zusätzlichen Schritte: (a) Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14 in einer dritten Kultur unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsproteins führen, und wobei die Wirtszelle keine Protease exprimiert, die die Proteasespaltstelle im Fusionsprotein erkennt; und, als Teil von Schritt (d), (b) Vergleich der Menge an von dem Reportergen produzierten Genprodukt in der Wirtszellkultur mit der Menge an von dem Reportergen produzierten Genprodukt in der ersten und zweiten Wirtszellkultur.
  21. Verfahren zum Vergleich der Aktivität zweier Proteasen, die dieselbe Spaltstelle erkennen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Züchten einer ersten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14 unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsproteins führen, und, falls vorhanden, des Proteinbindungspartners, wobei die erste Wirtszelle eine erste Protease exprimiert, die fähig ist, die Proteasespaltstelle des Fusionsproteins zu spalten; (b) Züchten einer zweiten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14 unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsproteins führen, und, falls vorhanden, des Proteinbindungspartners, wobei die zweite Wirtszelle eine zweite Protease exprimiert, die fähig ist, die Proteasestelle des Fusionsproteins zu spalten; (c) Hinzufügen eines Liganden zur ersten und zweiten Wirtszellkultur, wobei der Ligand erforderlich ist, damit das Fusionsprotein (i) an das funktionell mit dem Reportergen verbundene IRE oder an einen Proteinbindungspartner bindet, und (ii) die Transkription des Reportergens moduliert; und (d) Vergleich der Menge an von dem Reportergen produzierten Genprodukt in der ersten Wirtszellkultur und der zweiten Wirtszellkultur.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die erste und die zweite Protease Formen der HIV-Protease sind.
  23. Kit zum Testen von Proteaseaktivität, umfassend: (a) ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einen Vektor nach Anspruch 9; (b) eine DNA, umfassend: (i) ein IRE, das fähig ist, an die DNA-Bindungsdomäne des von dem DNA-Molekül unter (a) codierten Fusionsproteins gebunden zu werden; (ii) einen Promotor, der fähig ist, durch die Expressions-modulierende Domäne des von dem DNA-Molekül unter (a) codierten Fusionsproteins moduliert zu werden; und (iii) ein Reportergen, dessen Expression durch den Promotor kontrolliert wird, (c) einen Liganden, wobei der Ligand erforderlich ist, damit das Fusionsprotein (i) an das funktionell mit einem Reportergen verbundene LRE oder an einen Proteinbindungspartner bindet; und (ii) die Transkription des Reportergens moduliert; und (e) Anweisungen zur Verwendung des Kits zum Testen von Proteaseaktivität.
  24. Kit nach Anspruch 23, ferner umfassend ein DNA-Molekül, das einen Proteinbindungspartner des Fusionsproteins codiert, oder einen Vektor, der das DNA-Molekül umfasst.
  25. Kit nach Anspruch 23, wobei das DNA-Molekül sowohl gemäß (a) als auch gemäß (b) in einer Wirtszelle vorhanden sind.
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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA05003026A (es) 1996-10-18 2005-06-15 Vertex Pharma Inhibidores de proteasas de serina, particularmente proteasas ns3 del virus de hepatitis c.
US20060235209A9 (en) * 1997-03-10 2006-10-19 Jin-An Jiao Use of anti-tissue factor antibodies for treating thromboses
US5986065A (en) * 1997-03-10 1999-11-16 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US7749498B2 (en) * 1997-03-10 2010-07-06 Genentech, Inc. Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US20030109680A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-12 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
AU8356498A (en) * 1997-07-22 1999-02-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for gene screening with the use of nuclear receptors
US6884870B2 (en) * 1998-03-20 2005-04-26 California Institute Of Technology Fusion proteins for identifying proteases, protease target sites and regulators of protease activity in living cells
HUP0200945A3 (en) 1999-05-04 2004-07-28 Boehringer Ingelheim Ca Ltd Surrogate cell-based system and method for assaying the activity of hapatitis c virus ns3 protease
US20040033600A1 (en) * 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
SV2003000617A (es) 2000-08-31 2003-01-13 Lilly Co Eli Inhibidores de la proteasa peptidomimetica ref. x-14912m
US8105825B2 (en) * 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US9249207B2 (en) 2001-02-20 2016-02-02 Intrexon Corporation Substitution mutant receptors and their use in an ecdysone receptor-based inducible gene expression system
DK1373470T3 (da) 2001-02-20 2013-07-29 Intrexon Corp Hidtil ukendte substitutionsmutantreceptorer og deres anvendelse i et cellekernereceptorbaseret inducerbart genekspressionssystem
ATE545705T1 (de) 2001-02-20 2012-03-15 Intrexon Corp Neues induzierbares genexpressionssystem auf ecdysonrezeptor/invertebraten-retinoid-x-rezept r-basis
MXPA03007492A (es) * 2001-02-20 2004-10-15 Rheogene Holdings Inc Receptores de retinoide x quimerico y su uso en un sistema de expresion de gen inducible basado en receptor de ecdisona novedoso.
EP1421210A4 (de) * 2001-07-31 2005-02-16 Clontech Lab Inc Verfahren zum nachweis von proteaseaktivität in einer zelle
WO2003014381A1 (en) * 2001-08-10 2003-02-20 Ahram Biosystems Inc. System for detecting protease
MXPA04002810A (es) 2001-09-26 2005-06-06 Rheogene Holdings Inc Acidos nucleicos receptores de ecdisona de saltarilla, polipeptidos, y sus usos.
US20030190705A1 (en) * 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
JP2003180393A (ja) * 2001-12-13 2003-07-02 Otsuka Pharmaceut Co Ltd レポータージーンアッセイ法
JP2005521430A (ja) * 2002-03-25 2005-07-21 アプレーラ コーポレイション レポーター酵素変異体相補体を用いた核レセプター機能の検出のためのシステムおよび方法
US7109217B2 (en) 2002-11-12 2006-09-19 Merck & Co., Inc. Phenylcarboxamide beta-secretase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease
US7304161B2 (en) * 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
WO2004085611A2 (en) * 2003-03-21 2004-10-07 The Research Foundation Of State University Of New York Model for mutually exclusive domain folding molecular switch
KR100912381B1 (ko) * 2003-06-19 2009-08-19 타녹스 인코퍼레이티드 응고 관련 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법
US20070224615A1 (en) * 2003-07-09 2007-09-27 Invitrogen Corporation Methods for assaying protein-protein interactions
US7049076B2 (en) * 2003-07-09 2006-05-23 Sentigen Biosciences, Inc. Method for assaying protein—protein interaction
AR045596A1 (es) 2003-09-05 2005-11-02 Vertex Pharma Inhibidores de proteasas de serina en particular proteasa ns3-ns4a del vhc
JP2007505603A (ja) * 2003-09-12 2007-03-15 ヴァーテックス ファーマシューティカルズ、 インコーポレイテッド プロテアーゼ活性および肝障害のための動物モデル
US20070087346A1 (en) * 2003-10-24 2007-04-19 Gennaro Ciliberto Orthogonal gene switches
US20050214890A1 (en) * 2003-11-26 2005-09-29 Zhiqun Tan Novel "Cleave-N-Read" system for protease activity assay and methods of use thereof
US7935510B2 (en) * 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
CA2580796C (en) 2004-09-24 2013-03-26 Amgen Inc. Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions
CA2617679A1 (en) * 2005-08-02 2007-02-08 Steve Lyons Inhibitors of serine proteases
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US8399615B2 (en) 2005-08-19 2013-03-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Processes and intermediates
AR055395A1 (es) 2005-08-26 2007-08-22 Vertex Pharma Compuestos inhibidores de la actividad de la serina proteasa ns3-ns4a del virus de la hepatitis c
US7964624B1 (en) 2005-08-26 2011-06-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of serine proteases
EP1991229A2 (de) 2006-02-27 2008-11-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Kokristalle und pharmazeutische zusammensetzungen damit
WO2007109080A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-27 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Deuterated hepatitis c protease inhibitors
TW200846343A (en) 2007-02-27 2008-12-01 Vertex Pharma Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same
MX2009009176A (es) 2007-02-27 2009-09-28 Vertex Pharma Inhibidores de serina-proteasas.
JP2010537623A (ja) * 2007-03-27 2010-12-09 クリストファー ホーヴェンス 前立腺癌を治療する方法及び組成物
JP5443360B2 (ja) * 2007-08-30 2014-03-19 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 共結晶体およびそれを含む医薬組成物
KR20150129034A (ko) 2013-03-15 2015-11-18 인트렉손 코포레이션 붕소-함유 디아실하이드라진류
MX2017003403A (es) 2014-09-17 2017-06-19 Intrexon Corp Compuestos de diacilhidrazina que contienen boro.
KR20200080749A (ko) * 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 n-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0421109A3 (en) * 1989-09-11 1992-01-08 American Cyanamid Company Screening methods for protease inhibitors
WO1991016436A1 (en) * 1990-04-13 1991-10-31 Schering Corporation Novel protease assays
US5599906A (en) * 1990-04-13 1997-02-04 Schering Corporation Protease assays
WO1993001305A1 (en) * 1991-07-09 1993-01-21 Robert Balint A method for the identification of protease inhibitors
US5413914A (en) * 1993-07-07 1995-05-09 The Regents Of The University Of Colorado Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases
US5861267A (en) * 1995-05-01 1999-01-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity
PL323587A1 (en) * 1995-05-26 1998-04-14 Zeneca Ltd Gene changing-over system including edisone receptor
IL126418A0 (en) * 1996-04-05 1999-05-09 Salk Inst For Biological Studi Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes and pharmaceutical compositions for modulating the same
WO1998041866A1 (en) * 1997-03-14 1998-09-24 Merck & Co., Inc. A high throughput assay using fusion proteins

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Publication number Publication date
CA2341636A1 (en) 2000-03-09
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US20030083467A1 (en) 2003-05-01
EP1109920B1 (de) 2008-04-23

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