JP2002523102A - プロテアーゼ活性を測定するために有用な融合タンパク質、ｄｎａ分子、ベクター、および宿主細胞 - Google Patents
プロテアーゼ活性を測定するために有用な融合タンパク質、ｄｎａ分子、ベクター、および宿主細胞Info
- Publication number
- JP2002523102A JP2002523102A JP2000567713A JP2000567713A JP2002523102A JP 2002523102 A JP2002523102 A JP 2002523102A JP 2000567713 A JP2000567713 A JP 2000567713A JP 2000567713 A JP2000567713 A JP 2000567713A JP 2002523102 A JP2002523102 A JP 2002523102A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion protein
- protease
- host cell
- protein
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- G01N2333/035—Herpes simplex virus I or II
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規な転写アッセイを使用してプロテアーゼ活性を測定する際の使用のための、新規な融合タンパク質、その融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、プロテアーゼに対する化合物の阻害活性を測定するための方法、および同じ切断部位を認識する２つのプロテアーゼの活性を比較するための方法に関する。本発明の融合タンパク質基質をコードするＤＮＡ分子を含む、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットもまた、意図される。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、融合タンパク質、その融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そ
のＤＮＡ分子を含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、ならび
にプロテアーゼ活性を測定するためにそれらを使用するための方法およびキット
に関する。詳細には、本発明は、プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン
、およびＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質に関し、ここで、（１）こ
の融合タンパク質のリガンド結合ドメインとのリガンドの結合は、この融合タン
パク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるリガ
ンド応答エレメント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介し；そしてここで、（２）こ
の融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、発現モジュレータ
ードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここで、この発現モジュレータ
ードメインは、レポーター遺伝子の転写を調節する。本発明はまた、この融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡ分子、適切なリガンド、ならびにプロモーター−レ
ポーター遺伝子構築物およびこの融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインによって
認識される少なくとも１つのＬＲＥを含むＤＮＡ分子を含む、プロテアーゼ活性
をアッセイするためのキットに関する。これらのキット中のＤＮＡ分枝は、単離
されうるか、または宿主細胞中に存在し得る。
のＤＮＡ分子を含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、ならび
にプロテアーゼ活性を測定するためにそれらを使用するための方法およびキット
に関する。詳細には、本発明は、プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン
、およびＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質に関し、ここで、（１）こ
の融合タンパク質のリガンド結合ドメインとのリガンドの結合は、この融合タン
パク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるリガ
ンド応答エレメント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介し；そしてここで、（２）こ
の融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、発現モジュレータ
ードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここで、この発現モジュレータ
ードメインは、レポーター遺伝子の転写を調節する。本発明はまた、この融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡ分子、適切なリガンド、ならびにプロモーター−レ
ポーター遺伝子構築物およびこの融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインによって
認識される少なくとも１つのＬＲＥを含むＤＮＡ分子を含む、プロテアーゼ活性
をアッセイするためのキットに関する。これらのキット中のＤＮＡ分枝は、単離
されうるか、または宿主細胞中に存在し得る。
【０００２】 （発明の背景） プロテアーゼは、細菌からウイルスそして哺乳動物までのほとんど全ての生存
形態における生物学的プロセスの調節において、重要な役割を果たす。プロテア
ーゼは、例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫応答の活性化、酵素原活
性化、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク質輸送において、重要な機
能を果たす。
形態における生物学的プロセスの調節において、重要な役割を果たす。プロテア
ーゼは、例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫応答の活性化、酵素原活
性化、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク質輸送において、重要な機
能を果たす。
【０００３】 プロテアーゼは、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、気腫、高血圧、腫瘍の浸
潤および転移、ならびにウイルス関連疾患のような、いくつかの疾患の要因また
は原因として関連付けられている［例えば、Ｋｉｍ，Ｔ．Ｗ．ら、（１９９７）
「Ａｌｔｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｅｓｉｎｉｌｉｎｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｔｏｓ
ｉｓ ｂｙ ａ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２７７：３７３−６；Ｌａｃａｎａ，Ｅら、（１９９７）「Ｄｉ
ｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１ ｂｅｔａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ／
Ｃｅｄ−３ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｙ ＡＬＧ−２ ａｎｄ Ｔｒｕｎｃａｔ
ｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｇｅｎｅ ＡＬＧ−３」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５８；５１２９−３５；Ｂｉｒｒｅｒ、Ｐ．，（１９９５）「Ｐｒｏｔｅａ
ｓｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏ
ｓｉｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｎｓｉｄｅａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ６
２：２５−８；Ｐａｔｅｌ，Ｔ．ら、（１９９６）「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、ＦＡＳＥＢ Ｊ．
１０：５８７−９７］。
潤および転移、ならびにウイルス関連疾患のような、いくつかの疾患の要因また
は原因として関連付けられている［例えば、Ｋｉｍ，Ｔ．Ｗ．ら、（１９９７）
「Ａｌｔｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｅｓｉｎｉｌｉｎｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｔｏｓ
ｉｓ ｂｙ ａ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２７７：３７３−６；Ｌａｃａｎａ，Ｅら、（１９９７）「Ｄｉ
ｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１ ｂｅｔａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ／
Ｃｅｄ−３ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｙ ＡＬＧ−２ ａｎｄ Ｔｒｕｎｃａｔ
ｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｇｅｎｅ ＡＬＧ−３」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５８；５１２９−３５；Ｂｉｒｒｅｒ、Ｐ．，（１９９５）「Ｐｒｏｔｅａ
ｓｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏ
ｓｉｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｎｓｉｄｅａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ６
２：２５−８；Ｐａｔｅｌ，Ｔ．ら、（１９９６）「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、ＦＡＳＥＢ Ｊ．
１０：５８７−９７］。
【０００４】 いくつかのウイルスゲノムもまた、ウイルス成熟プロセスにおいて重要である
プロテアーゼをコードする。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のウイル
スアスパルチルプロテアーゼは、Ｇａｇポリタンパク質およびＰｏｌポリタンパ
ク質を含むＨＩＶポリペプチドを切断する。
プロテアーゼをコードする。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のウイル
スアスパルチルプロテアーゼは、Ｇａｇポリタンパク質およびＰｏｌポリタンパ
ク質を含むＨＩＶポリペプチドを切断する。
【０００５】 別の例において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、長いポリペプチド翻訳産物
である、ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ
−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨを生成し、これは、切断されて少なくとも１０
タンパク質を生成する。Ｃ、Ｅ１およびＥ２は、推定構造タンパク質であり、そ
して残りは、非構造（ＮＳ）タンパク質として公知である。これらのタンパク質
のうちの１つは、セリンプロテアーゼ活性を有する７０キロダルトンのタンパク
質である、ＮＳ３である。ＮＳ３のプロテアーゼ活性は、この酵素のＮ末端の１
８０アミノ酸中に唯一存在することが示されている。ＮＳ３プロテアーゼは、Ｈ
ＣＶポリペプチド（３／４Ａ、４Ａ／４Ｂ、４Ｂ／５Ａ、および５Ａ／５Ｂ）の
非構造領域における４つの部位で切断する。別のタンパク質であるＮＳ４Ａは、
５４アミノ酸を有し、そしてＮＳ３プロテアーゼの補因子として特徴付けられて
いる［Ｃ．Ｆａｉｌｌａら、（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：３７５
３−３７６０］。ＮＳ４ＡのＣ末端の３３アミノ酸は、３／４Ａ部位および４Ｂ
／５Ａ部位での切断に必要であり、そして５Ａ／５Ｂ部位での切断速度を加速す
る。いくつかの他のＮＳ３セリンプロテアーゼ依存性切断部位配列は、ＨＣＶの
種々の株において同定されている［Ａ．Ｇｒａｋｏｕｉら、（１９９３）Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−２８４３（本明細書中に参考として援用され
る）］。
である、ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ
−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨを生成し、これは、切断されて少なくとも１０
タンパク質を生成する。Ｃ、Ｅ１およびＥ２は、推定構造タンパク質であり、そ
して残りは、非構造（ＮＳ）タンパク質として公知である。これらのタンパク質
のうちの１つは、セリンプロテアーゼ活性を有する７０キロダルトンのタンパク
質である、ＮＳ３である。ＮＳ３のプロテアーゼ活性は、この酵素のＮ末端の１
８０アミノ酸中に唯一存在することが示されている。ＮＳ３プロテアーゼは、Ｈ
ＣＶポリペプチド（３／４Ａ、４Ａ／４Ｂ、４Ｂ／５Ａ、および５Ａ／５Ｂ）の
非構造領域における４つの部位で切断する。別のタンパク質であるＮＳ４Ａは、
５４アミノ酸を有し、そしてＮＳ３プロテアーゼの補因子として特徴付けられて
いる［Ｃ．Ｆａｉｌｌａら、（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：３７５
３−３７６０］。ＮＳ４ＡのＣ末端の３３アミノ酸は、３／４Ａ部位および４Ｂ
／５Ａ部位での切断に必要であり、そして５Ａ／５Ｂ部位での切断速度を加速す
る。いくつかの他のＮＳ３セリンプロテアーゼ依存性切断部位配列は、ＨＣＶの
種々の株において同定されている［Ａ．Ｇｒａｋｏｕｉら、（１９９３）Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−２８４３（本明細書中に参考として援用され
る）］。
【０００６】 ウイルスプロテアーゼ、細胞性プロテアーゼ、または微生物プロテアーゼの活
性を、迅速かつ簡単なアッセイにおいて検出するための能力は、これらのプロテ
アーゼの生化学的特徴付け、ウイルス感染の検出、ならびに潜在的なインヒビタ
ーのスクリーニングおよび同定において重要である。
性を、迅速かつ簡単なアッセイにおいて検出するための能力は、これらのプロテ
アーゼの生化学的特徴付け、ウイルス感染の検出、ならびに潜在的なインヒビタ
ーのスクリーニングおよび同定において重要である。
【０００７】 いくつかのプロテアーゼアッセイは、当該分野で公知である。Ｔ．Ａ．Ｓｍｉ
ｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５１５９−６
２頁（１９９１）；Ｂ．Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４１５９−６２（１９９２）；およびＭ．Ｇ．
Ｍｕｒｒａｙら、Ｇｅｎｅ、１３４、１２３−１２８頁（１９９３）の各々は、
酵母ＧＡＬ４タンパク質を利用するプロテアーゼアッセイ系を記載する。これら
の文献の各々は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの間に
プロテアーゼ切断部位を挿入することを記載する。共発現されたプロテアーゼに
よるこの部異の切断は、ＧＡＬ４を転写不活性化にし、これは、この形質転換さ
れた酵母がガラクトースを代謝することを不可能にさせる。
ｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５１５９−６
２頁（１９９１）；Ｂ．Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４１５９−６２（１９９２）；およびＭ．Ｇ．
Ｍｕｒｒａｙら、Ｇｅｎｅ、１３４、１２３−１２８頁（１９９３）の各々は、
酵母ＧＡＬ４タンパク質を利用するプロテアーゼアッセイ系を記載する。これら
の文献の各々は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの間に
プロテアーゼ切断部位を挿入することを記載する。共発現されたプロテアーゼに
よるこの部異の切断は、ＧＡＬ４を転写不活性化にし、これは、この形質転換さ
れた酵母がガラクトースを代謝することを不可能にさせる。
【０００８】 Ｙ．Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２５，１１３
−１２０頁（１９９５）は、ＨＣＶプロテアーゼ活性を検出するためのアッセイ
を記載する。このアッセイにおいて、基質、ＨＣＶプロテアーゼおよびレポータ
ー遺伝子が、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトされる。この基質は、（ＨＣＶ
ＮＳ２）−（ＤＨＦＲ）−（ＨＣＶ ＮＳ３切断部位）−Ｔａｘ１からなる融
合タンパク質である。このレポーター遺伝子は、ＨＴＬＶ−１長末端反復配列（
ＬＴＲ）の制御下のクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であり
、発現後にその細胞核に存在する。未切断の基質は、ＨＣＶ ＮＳ２部分に起因
する小胞体の表面上の膜結合タンパク質として発現される。切断の際に、放出さ
れるＴａｘ１タンパク質は、核に移行し、そしてＨＴＬＣ−１ ＬＴＲに結合す
ることによってＣＡＴ発現を活性化する。プロテアーゼ活性は、細胞溶解物中の
ＣＡＴ活性を測定することによって決定される。
−１２０頁（１９９５）は、ＨＣＶプロテアーゼ活性を検出するためのアッセイ
を記載する。このアッセイにおいて、基質、ＨＣＶプロテアーゼおよびレポータ
ー遺伝子が、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトされる。この基質は、（ＨＣＶ
ＮＳ２）−（ＤＨＦＲ）−（ＨＣＶ ＮＳ３切断部位）−Ｔａｘ１からなる融
合タンパク質である。このレポーター遺伝子は、ＨＴＬＶ−１長末端反復配列（
ＬＴＲ）の制御下のクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であり
、発現後にその細胞核に存在する。未切断の基質は、ＨＣＶ ＮＳ２部分に起因
する小胞体の表面上の膜結合タンパク質として発現される。切断の際に、放出さ
れるＴａｘ１タンパク質は、核に移行し、そしてＨＴＬＣ−１ ＬＴＲに結合す
ることによってＣＡＴ発現を活性化する。プロテアーゼ活性は、細胞溶解物中の
ＣＡＴ活性を測定することによって決定される。
【０００９】 上記のアッセイの各々は、（１）活性プロテアーゼおよび基質の発現、ならび
に（２）レポーター遺伝子構築物の転写を、同時に必要とする。これらのアッセ
イの構成的性質はしばしば、制御不可能な、所望しない効果を生じ得る。これら
の効果は、このプロテアーゼの活性に関わる、誤誘導されたか、または不適切な
結論を生じ得る。従って、誘導性であるか、または使用者によって容易に制御さ
れ得る、高感度かつ定量的なプロテアーゼアッセイの必要性が存在する。
に（２）レポーター遺伝子構築物の転写を、同時に必要とする。これらのアッセ
イの構成的性質はしばしば、制御不可能な、所望しない効果を生じ得る。これら
の効果は、このプロテアーゼの活性に関わる、誤誘導されたか、または不適切な
結論を生じ得る。従って、誘導性であるか、または使用者によって容易に制御さ
れ得る、高感度かつ定量的なプロテアーゼアッセイの必要性が存在する。
【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、プロテアーゼの活性を測定するための融合タンパク質リガンド依存
性転写アッセイにおいて有用な、新規な融合タンパク質、その融合タンパク質を
コードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含むベクター、およびそのベクターを
含む宿主細胞を提供することによって、この必要性を満たす。
性転写アッセイにおいて有用な、新規な融合タンパク質、その融合タンパク質を
コードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含むベクター、およびそのベクターを
含む宿主細胞を提供することによって、この必要性を満たす。
【００１１】 この新規な融合タンパク質は、プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン
、およびＤＮＡ結合ドメインをを含み、ここで、（１）リガンドの、この融合タ
ンパク質のリガンド結合ドメインとの結合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合
ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるＬＲＥへの結合を媒介し
；そしてここで、（２）この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを
含むか、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここ
で、この発現モジュレータードメインは、このレポーター遺伝子の転写を調節す
る。
、およびＤＮＡ結合ドメインをを含み、ここで、（１）リガンドの、この融合タ
ンパク質のリガンド結合ドメインとの結合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合
ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるＬＲＥへの結合を媒介し
；そしてここで、（２）この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを
含むか、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここ
で、この発現モジュレータードメインは、このレポーター遺伝子の転写を調節す
る。
【００１２】 本発明の方法に従って、未切断の融合タンパク質のリガンド結合ドメインへの
リガンドの結合は、別々の時点で、このレポーター遺伝子の転写活性化または抑
制を開始する。この誘導可能性は、このアッセイをより良好に制御されるものに
し、従って、より正確な結果を生じる。
リガンドの結合は、別々の時点で、このレポーター遺伝子の転写活性化または抑
制を開始する。この誘導可能性は、このアッセイをより良好に制御されるものに
し、従って、より正確な結果を生じる。
【００１３】 プロテアーゼ切断部位でのこの融合タンパク質の切断は、この発現モジュレー
タードメインが転写をポジティブまたはネガティブに調節することを妨げること
によって、このレポーター遺伝子に転写を調節解除する。切断された融合タンパ
ク質の量は、レポーター遺伝子のトランス活性化における増加または減少をアッ
セイすることによって定量され、このレポーター遺伝子の発現は、この融合タン
パク質の発現調節ドメインによって調節されるプロモーターによって駆動される
。
タードメインが転写をポジティブまたはネガティブに調節することを妨げること
によって、このレポーター遺伝子に転写を調節解除する。切断された融合タンパ
ク質の量は、レポーター遺伝子のトランス活性化における増加または減少をアッ
セイすることによって定量され、このレポーター遺伝子の発現は、この融合タン
パク質の発現調節ドメインによって調節されるプロモーターによって駆動される
。
【００１４】 本発明はまた、プロテアーゼに対する化合物の阻害活性を測定するための方法
に関し、この方法は、その活性が試験される化合物の存在下または非存在下で融
合タンパク質をプロテアーゼとともにインキュベートする工程、そのインキュベ
ーションにリガンドを添加する工程、およびレポーター遺伝子から生成された遺
伝子産物を定量する工程を包含する。
に関し、この方法は、その活性が試験される化合物の存在下または非存在下で融
合タンパク質をプロテアーゼとともにインキュベートする工程、そのインキュベ
ーションにリガンドを添加する工程、およびレポーター遺伝子から生成された遺
伝子産物を定量する工程を包含する。
【００１５】 本発明のなお別の実施態様は、２つのプロテアーゼまたは同じ切断部位を認識
するプロテアーゼの変異体の活性を比較するための方法に関する。
するプロテアーゼの変異体の活性を比較するための方法に関する。
【００１６】 本発明はまた、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットに関し、このキ
ットは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含む融合タ
ンパク質または宿主細胞を含み、ここでこのキットは、必要に応じて、プロテア
ーゼをコードするＤＮＡ分子、その発現がその融合タンパク質によって調節され
るレポーター遺伝子を含むＤＮＡ分子、その融合タンパク質に会合し、その活性
を調節するリガンド、およびこのキットを使用するための説明書を備える。好ま
しくは、キット中のＤＮＡ分子は、その発現を可能にするベクターに操作されて
いる。本発明に従うキットは、以下からなる群から選択される、単一宿主細胞に
形質転換される以下のＤＮＡ分子のいずれか１つまたは全てを含み得る：本発明
の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、プロテアーゼをコードするＤＮＡ分
子、融合タンパク質についてのタンパク質結合パートナーをコードするＤＮＡ分
子、およびプロモーター−レポーター遺伝子構築物を含むＤＮＡ分子。
ットは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含む融合タ
ンパク質または宿主細胞を含み、ここでこのキットは、必要に応じて、プロテア
ーゼをコードするＤＮＡ分子、その発現がその融合タンパク質によって調節され
るレポーター遺伝子を含むＤＮＡ分子、その融合タンパク質に会合し、その活性
を調節するリガンド、およびこのキットを使用するための説明書を備える。好ま
しくは、キット中のＤＮＡ分子は、その発現を可能にするベクターに操作されて
いる。本発明に従うキットは、以下からなる群から選択される、単一宿主細胞に
形質転換される以下のＤＮＡ分子のいずれか１つまたは全てを含み得る：本発明
の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、プロテアーゼをコードするＤＮＡ分
子、融合タンパク質についてのタンパク質結合パートナーをコードするＤＮＡ分
子、およびプロモーター−レポーター遺伝子構築物を含むＤＮＡ分子。
【００１７】 （発明の詳細な説明） 本発明は、プロテアーゼ活性を測定するための新規なツールおよび方法を提供
する。プロテアーゼの活性は、転写アッセイにおいて、基質として新規な融合タ
ンパク質を使用することによって測定され、ここで転写は、プロテアーゼおよび
本発明の融合タンパク質がともにインキュベートされた後に、リガンドの添加に
より、不連続の時点にて活性化または抑制される。
する。プロテアーゼの活性は、転写アッセイにおいて、基質として新規な融合タ
ンパク質を使用することによって測定され、ここで転写は、プロテアーゼおよび
本発明の融合タンパク質がともにインキュベートされた後に、リガンドの添加に
より、不連続の時点にて活性化または抑制される。
【００１８】 本発明は、以下を含む融合タンパク質を提供する：プロテアーゼ切断部位、リ
ガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメイン、ここで（１）リガンドとこの
融合タンパク質のリガンド結合ドメインとの会合は、この融合タンパク質のＤＮ
Ａ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたリガンド応答エレ
メント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介する；そしてここで、この融合タンパク質
は、発現モジュレータードメインを含むか、または発現モジュレータードメイン
を有する第２のタンパク質と会合し、ここでこの発現モジュレータードメインは
、レポーター遺伝子の転写を調節する。
ガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメイン、ここで（１）リガンドとこの
融合タンパク質のリガンド結合ドメインとの会合は、この融合タンパク質のＤＮ
Ａ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたリガンド応答エレ
メント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介する；そしてここで、この融合タンパク質
は、発現モジュレータードメインを含むか、または発現モジュレータードメイン
を有する第２のタンパク質と会合し、ここでこの発現モジュレータードメインは
、レポーター遺伝子の転写を調節する。
【００１９】 本発明に従うプロテアーゼ切断部位（本明細書中以後、「ＰＣＳ」）は、本発
明の融合タンパク質の一次配列に組み込まれたペプチドである。この部位は、タ
ンパク質の任意のＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または必要に応
じて、発現モジュレータードメイン（存在する場合）に、そして任意の２つのこ
れらのドメインの間に位置し得る。
明の融合タンパク質の一次配列に組み込まれたペプチドである。この部位は、タ
ンパク質の任意のＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または必要に応
じて、発現モジュレータードメイン（存在する場合）に、そして任意の２つのこ
れらのドメインの間に位置し得る。
【００２０】 タンパク質における切断部位の存在は、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン
、リガンド結合ドメイン、または発現モジュレータードメイン（存在する場合）
の活性を実質的に妨害しないべきである。
、リガンド結合ドメイン、または発現モジュレータードメイン（存在する場合）
の活性を実質的に妨害しないべきである。
【００２１】 プロテアーゼ切断部位が、融合タンパク質の上記のドメインの活性を実質的に
妨害しないことを確実にするために、ＰＣＳを有する融合タンパク質の活性を、
ＰＣＳを有しない同じ融合タンパク質の活性と、ＤＮＡ結合を評価するためのゲ
ルシフトアッセイまたは転写アッセイによって比較し得る（例えば、Ｄ．Ｌａｔ
ｃｈｍａｎ，（１９９５）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒｓ，第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ）。
妨害しないことを確実にするために、ＰＣＳを有する融合タンパク質の活性を、
ＰＣＳを有しない同じ融合タンパク質の活性と、ＤＮＡ結合を評価するためのゲ
ルシフトアッセイまたは転写アッセイによって比較し得る（例えば、Ｄ．Ｌａｔ
ｃｈｍａｎ，（１９９５）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒｓ，第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００２２】 また、プロテアーゼ切断部位は、切断した場合に、得られる融合タンパク質フ
ラグメントは標的遺伝子の発現もレポーター遺伝子の発現も調節し得ないように
、融合タンパク質に操作されるべきである。
ラグメントは標的遺伝子の発現もレポーター遺伝子の発現も調節し得ないように
、融合タンパク質に操作されるべきである。
【００２３】 好ましくは、融合タンパク質基質内に位置する標的プロテアーゼ切断部位が１
つのみ存在する。
つのみ存在する。
【００２４】 好ましい実施態様に従って、プロテアーゼ切断部位は、ＤＮＡ結合ドメインと
、融合タンパク質のエフェクターモジュレータードメインとの間に位置する。
、融合タンパク質のエフェクターモジュレータードメインとの間に位置する。
【００２５】 本発明の好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＩＶ ｇａｇおよびｇａｇ
／ｐｏｌポリタンパク質またはＨＣＶタンパク質タンパク質においてプロセシン
グ／プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を有する。本発明のより好ましい
実施態様において、ＨＩＶ ＰＣＳ部位は、配列番号１〜１０からなる群より選
択される（Ｓ．Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、（１９８９）「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ ＨＩＶ１ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ
Ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｅｄ ｇａｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
６：３２４−３３７を参考として援用する）。本発明のより好ましい実施態様
において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼまたはＨＩＶアスパル
チルプロテアーゼについての切断部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおよ
り好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ５Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断
部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおより好ましい実施態様において、５
Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断部位は、配列番号１０である。
／ｐｏｌポリタンパク質またはＨＣＶタンパク質タンパク質においてプロセシン
グ／プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を有する。本発明のより好ましい
実施態様において、ＨＩＶ ＰＣＳ部位は、配列番号１〜１０からなる群より選
択される（Ｓ．Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、（１９８９）「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ ＨＩＶ１ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ
Ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｅｄ ｇａｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
６：３２４−３３７を参考として援用する）。本発明のより好ましい実施態様
において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼまたはＨＩＶアスパル
チルプロテアーゼについての切断部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおよ
り好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ５Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断
部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおより好ましい実施態様において、５
Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断部位は、配列番号１０である。
【００２６】 本発明の融合タンパク質の次の部分は、リガンド結合ドメイン（本明細書中以
後、「ＬＢＤ」）である。ＬＢＤは、リガンドに結合するペプチドドメインであ
り、ここでこのリガンド結合は、この融合タンパク質が、（１）ＬＲＥに結合す
る（ここで、このエレメントは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される）；
および／または（２）ＬＲＥに対する得られる融合タンパク質−タンパク質結合
パートナー複合体の結合の前の中間工程として、タンパク質結合パートナーに結
合するために必要とされる。従って、融合タンパク質リガンド結合ドメインへの
リガンド結合は、このレポーター遺伝子の発現の転写調節に必須である。
後、「ＬＢＤ」）である。ＬＢＤは、リガンドに結合するペプチドドメインであ
り、ここでこのリガンド結合は、この融合タンパク質が、（１）ＬＲＥに結合す
る（ここで、このエレメントは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される）；
および／または（２）ＬＲＥに対する得られる融合タンパク質−タンパク質結合
パートナー複合体の結合の前の中間工程として、タンパク質結合パートナーに結
合するために必要とされる。従って、融合タンパク質リガンド結合ドメインへの
リガンド結合は、このレポーター遺伝子の発現の転写調節に必須である。
【００２７】 本発明における使用に適切なリガンド結合ドメインは、リガンド結合の際に転
写を開始または抑制する転写因子のリガンド結合ドメインに由来し得る。このよ
うな転写因子としては、以下が挙げられる：ホルモンレセプター（Ｆｒｅｅｄｍ
ａｎ，Ｌ．Ｐ．，１９９８、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓ
ｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
」，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ
：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ；Ｔｓａｉ，Ｍ−Ｊ．，１９９４、「Ｍｅｃｈａｎｉｓ
ｍ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ：Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ
Ｃｏ．；Ｅｇｇｅｒｔ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ
Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ，第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１３１−１５６頁；
Ｐｉｅｄｒａｆｉｔａ，Ｆ．Ｊ．およびＭ．Ｐｆａｈｌ，「Ｔｈｅ Ｔｈｙｒｏ
ｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔ
ｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１５７−１
８５頁；Ｋｅａｖｅｎｅｙ Ｍ．およびＨ．Ｇ．Ｓｔｕｎｎｅｂｅｒｇ，「Ｒｅ
ｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓ
ｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１８７−
２４２頁（これらの各々を、本明細書中で参考として援用する）；炭水化物応答
性転写因子；メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子；オーファンレセプター；テトラ
サイクリン誘導性転写因子；ＩＰＴＧ誘導性転写因子；ダイオキシンレセプター
；およびアリール炭水化物レセプター。
写を開始または抑制する転写因子のリガンド結合ドメインに由来し得る。このよ
うな転写因子としては、以下が挙げられる：ホルモンレセプター（Ｆｒｅｅｄｍ
ａｎ，Ｌ．Ｐ．，１９９８、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓ
ｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
」，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ
：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ；Ｔｓａｉ，Ｍ−Ｊ．，１９９４、「Ｍｅｃｈａｎｉｓ
ｍ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ：Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ
Ｃｏ．；Ｅｇｇｅｒｔ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ
Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ，第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１３１−１５６頁；
Ｐｉｅｄｒａｆｉｔａ，Ｆ．Ｊ．およびＭ．Ｐｆａｈｌ，「Ｔｈｅ Ｔｈｙｒｏ
ｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔ
ｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１５７−１
８５頁；Ｋｅａｖｅｎｅｙ Ｍ．およびＨ．Ｇ．Ｓｔｕｎｎｅｂｅｒｇ，「Ｒｅ
ｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓ
ｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１８７−
２４２頁（これらの各々を、本明細書中で参考として援用する）；炭水化物応答
性転写因子；メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子；オーファンレセプター；テトラ
サイクリン誘導性転写因子；ＩＰＴＧ誘導性転写因子；ダイオキシンレセプター
；およびアリール炭水化物レセプター。
【００２８】 本発明の好ましい実施態様において、リガンド結合ドメインは、ステロイド／
甲状腺ホルモンレセプタースーパーファミリーのリガンド結合ドメインに由来す
る。ステロイドおよび核レセプターリガンド結合ドメインをコードするアミノ酸
配列は、当該分野で周知である（例えば、Ｓ．Ｓｉｍｏｎｓ，（１９９８）「Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ
ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｄｏｍａｉｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉ
ｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇ
ｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂ
ｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこ
と）。より好ましい実施態様において、リガンド結合ドメインは、エクジソンレ
セプターに由来する。
甲状腺ホルモンレセプタースーパーファミリーのリガンド結合ドメインに由来す
る。ステロイドおよび核レセプターリガンド結合ドメインをコードするアミノ酸
配列は、当該分野で周知である（例えば、Ｓ．Ｓｉｍｏｎｓ，（１９９８）「Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ
ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｄｏｍａｉｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉ
ｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇ
ｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂ
ｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこ
と）。より好ましい実施態様において、リガンド結合ドメインは、エクジソンレ
セプターに由来する。
【００２９】 本発明のさらなる実施態様において、転写因子由来のリガンド結合ドメインは
、異なるリガンドに結合するように、本発明の融合タンパク質において改変され
得る。例えば、ヒトプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインは、抗プロ
ゲステロン化合物ＲＵ４８６（Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、（１９９７）「Ｐｏｓｉｔｉ
ｖｅ ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ
ｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏ
ｒ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４：４３２−４１（その開示を、本明細書中で参
考として援用する））を結合し得るように変異され得る。このようなＲＵ４８６
誘導性ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質は、本発明における使用が
意図される。
、異なるリガンドに結合するように、本発明の融合タンパク質において改変され
得る。例えば、ヒトプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインは、抗プロ
ゲステロン化合物ＲＵ４８６（Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、（１９９７）「Ｐｏｓｉｔｉ
ｖｅ ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ
ｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏ
ｒ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４：４３２−４１（その開示を、本明細書中で参
考として援用する））を結合し得るように変異され得る。このようなＲＵ４８６
誘導性ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質は、本発明における使用が
意図される。
【００３０】 ＤＮＡ結合ドメイン（本明細書中以後、「ＤＢＤ」）とは、特定のヌクレオチ
ド配列（例えば、ＤＮＡエレメントまたはＬＲＥ）を認識し、かつそれに結合す
る、本発明に従う融合タンパク質におけるペプチド配列をいう。本発明に従って
有用なＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）のＤ
ＮＡ結合ドメインに由来し得る。
ド配列（例えば、ＤＮＡエレメントまたはＬＲＥ）を認識し、かつそれに結合す
る、本発明に従う融合タンパク質におけるペプチド配列をいう。本発明に従って
有用なＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）のＤ
ＮＡ結合ドメインに由来し得る。
【００３１】 好ましい実施態様において、これらのＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡを直接
結合しかつ転写を開始または抑制する転写因子である。このような転写因子は、
当該分野で周知である（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．およびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍ
ｏｔｏ，１９９２、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅ
ｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，１
９９５、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ
，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版；Ｌａｔｃｈｍ
ａｎ，Ｄ．Ｓ．，１９９３，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａ
ｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｐａｐａｖａｓｓｉｌ
ｉｏｕ，Ａ．，（１９９７）「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ
ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔ
ｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ
；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ，１９９７，「Ｍｅ
ｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１１巻、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（これらの開示を、本明細書中で参
考として援用する）。
結合しかつ転写を開始または抑制する転写因子である。このような転写因子は、
当該分野で周知である（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．およびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍ
ｏｔｏ，１９９２、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅ
ｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，１
９９５、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ
，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版；Ｌａｔｃｈｍ
ａｎ，Ｄ．Ｓ．，１９９３，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａ
ｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｐａｐａｖａｓｓｉｌ
ｉｏｕ，Ａ．，（１９９７）「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ
ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔ
ｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ
；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ，１９９７，「Ｍｅ
ｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１１巻、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（これらの開示を、本明細書中で参
考として援用する）。
【００３２】 本発明における使用が意図される好ましいＤＮＡ結合ドメインとしては、以下
の転写因子のＤＮＡ結合ドメインが挙げられる：ホメオボックスタンパク質、ジ
ンクフィンガータンパク質（Ｓｌｕｙｓｅｒ，Ｍ．，１９９３，Ｚｉｎｃ Ｆｉ
ｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ：ＤＮＡ Ｂｉｎ
ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ヘリックス−ターン
−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質（例えば
、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏ
ｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ロイシン
ジッパータンパク質（例えば、Ｈｕｒｓｔ、Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎ
ｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ＧＡＬ４タンパク質、
ホルモンレセプター、オーファンレセプター、およびＥ．ｃｏｌｉ転写因子（例
えば、ラクトースオペロンリプレッサー）、テトラサイクリン制御トランスアク
チベーター、およびＦａｄＲ。
の転写因子のＤＮＡ結合ドメインが挙げられる：ホメオボックスタンパク質、ジ
ンクフィンガータンパク質（Ｓｌｕｙｓｅｒ，Ｍ．，１９９３，Ｚｉｎｃ Ｆｉ
ｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ：ＤＮＡ Ｂｉｎ
ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ヘリックス−ターン
−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質（例えば
、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏ
ｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ロイシン
ジッパータンパク質（例えば、Ｈｕｒｓｔ、Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎ
ｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ＧＡＬ４タンパク質、
ホルモンレセプター、オーファンレセプター、およびＥ．ｃｏｌｉ転写因子（例
えば、ラクトースオペロンリプレッサー）、テトラサイクリン制御トランスアク
チベーター、およびＦａｄＲ。
【００３３】 本発明はまた、メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子の転写を調節する金属結合Ｄ
ＮＡ結合タンパク質のＤＢＤの使用を意図する。このような金属結合ＤＮＡ結合
タンパク質としては、ＭＴＦ−１、ＡＣＥ１、およびＡＭＴ１が挙げられる（Ｈ
ｅｕｃｈｅｌ，Ｒ．ら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏｎ ｂｙ Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔａｌｓ，Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｔ ｔｈ
ｅ Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ Ｇｅｎｅｓ」、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇ
ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，第１巻（１９９５）Ｂｒｉｋｈａｕｓｅｒ：Ｂ
ｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ．Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、２０
６−２４０頁）。
ＮＡ結合タンパク質のＤＢＤの使用を意図する。このような金属結合ＤＮＡ結合
タンパク質としては、ＭＴＦ−１、ＡＣＥ１、およびＡＭＴ１が挙げられる（Ｈ
ｅｕｃｈｅｌ，Ｒ．ら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏｎ ｂｙ Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔａｌｓ，Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｔ ｔｈ
ｅ Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ Ｇｅｎｅｓ」、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇ
ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，第１巻（１９９５）Ｂｒｉｋｈａｕｓｅｒ：Ｂ
ｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ．Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、２０
６−２４０頁）。
【００３４】 本発明の好ましいより実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、レセプター
のステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーから得られる。レセプター
のステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーは、リガンド依存性転写因
子として機能するホルモン結合タンパク質として当該分野で公知である。そのメ
ンバーとしては、特異的天然のリガンドがまだ同定されていないレセプターのス
テロイド／甲状腺スーパーファミリーの同定されたメンバーが挙げられる（本明
細書中で「オーファンレセプター」といわれる）（Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１
９９８）「Ｏｒｐｈａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈ
ｅｉｒ Ｌｉｇａｎｄｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔ
ｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，
Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３
０５頁）。
のステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーから得られる。レセプター
のステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーは、リガンド依存性転写因
子として機能するホルモン結合タンパク質として当該分野で公知である。そのメ
ンバーとしては、特異的天然のリガンドがまだ同定されていないレセプターのス
テロイド／甲状腺スーパーファミリーの同定されたメンバーが挙げられる（本明
細書中で「オーファンレセプター」といわれる）（Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１
９９８）「Ｏｒｐｈａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈ
ｅｉｒ Ｌｉｇａｎｄｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔ
ｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，
Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３
０５頁）。
【００３５】 本発明における使用に有用なオーファンレセプターのメンバーとしては、ＨＮ
Ｆ４、ＣＯＵＰファミリーのレセプターおよびＣＯＵＰ様レセプター、ペルオキ
シソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＲＡＲ）、昆虫に由来するＫｎｉｒｐｓ
およびＫｎｉｒｐｓ関連レセプター、ならびにそれらの様々なアイソフォームが
挙げられる。
Ｆ４、ＣＯＵＰファミリーのレセプターおよびＣＯＵＰ様レセプター、ペルオキ
シソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＲＡＲ）、昆虫に由来するＫｎｉｒｐｓ
およびＫｎｉｒｐｓ関連レセプター、ならびにそれらの様々なアイソフォームが
挙げられる。
【００３６】 このようなＤＢＤをコードするアミノ酸配列は、当該分野で周知である（Ｆ．
Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ，（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏ
ｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書
中で参考として援用する）。
Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ，（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏ
ｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書
中で参考として援用する）。
【００３７】 本発明の融合タンパク質において使用されるＬＢＤと同様に、本発明のＤＮＡ
結合ドメインは、ソース転写因子に存在する配列から、異なるＬＲＥを認識する
ように改変され得る。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーメンバーのＤＮＡ
結合ドメインのアミノ酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインが別のステロイド／甲状腺
ファミリーのメンバーによって認識されるＬＲＥに結合するように改変され得る
。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーの「Ｐボックス」アミノ酸
配列（すなわち、代表的には、第１のジンクフィンガーとリンカー領域との接合
部に位置するＤＮＡ結合ドメインにおける領域）の改変が、本発明によって意図
される（Ｕｍｅｓｏｎｏら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：１１３９−１１４６
、特に図２および表１；この開示を本明細書中で参考として援用する）。
結合ドメインは、ソース転写因子に存在する配列から、異なるＬＲＥを認識する
ように改変され得る。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーメンバーのＤＮＡ
結合ドメインのアミノ酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインが別のステロイド／甲状腺
ファミリーのメンバーによって認識されるＬＲＥに結合するように改変され得る
。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーの「Ｐボックス」アミノ酸
配列（すなわち、代表的には、第１のジンクフィンガーとリンカー領域との接合
部に位置するＤＮＡ結合ドメインにおける領域）の改変が、本発明によって意図
される（Ｕｍｅｓｏｎｏら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：１１３９−１１４６
、特に図２および表１；この開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００３８】 好ましい実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａエ
クジソンレセプターに由来し、ここでアミノ酸配列ＥＧＣＫＧ（配列番号２３）
を有するエクジソンレセプターのＰボックスは、アミノ酸配列ＧＳＣＫＶ（配列
番号２４）と置換される。新たなＰボックス配列ＧＳＣＫＶは、エクジソンレセ
プターにＬＲＥ−ＡＧＧＴＣＡ−の代わりにＬＲＥ−ＡＧＡＡＣＡを認識させる
。
クジソンレセプターに由来し、ここでアミノ酸配列ＥＧＣＫＧ（配列番号２３）
を有するエクジソンレセプターのＰボックスは、アミノ酸配列ＧＳＣＫＶ（配列
番号２４）と置換される。新たなＰボックス配列ＧＳＣＫＶは、エクジソンレセ
プターにＬＲＥ−ＡＧＧＴＣＡ−の代わりにＬＲＥ−ＡＧＡＡＣＡを認識させる
。
【００３９】 本発明の融合タンパク質のＬＢＤおよび／またはＤＢＤを提供するに特に有用
なレセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーとしては、以
下のようなステロイドレセプターが挙げられる：グルココルチロイドレセプター
（ＧＲ）、ミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）；エストロゲンレセプター
（ＥＲ）；ｈＰＲ−ＡまたはｈＰＲ−Ｂのようなプロゲステロンレセプター（Ｐ
Ｒ）；アンドロゲンレセプター（ＡＲ）；ビタミンＤ３レセプター（ＶＤＲ）；
レチノイン酸レセプター（例えば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、またはＲＡＲγ）およ
びレチノイドＸレセプター（例えば、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、またはＲＸＲγ）の
ようなレチノイドレセプター；ＴＲαおよびＴＲβのような甲状腺レセプター（
ＴＲ）；エクジソンレセプターのような昆虫に由来するレセプター；ならびにそ
れらのアイソフォーム。
なレセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーとしては、以
下のようなステロイドレセプターが挙げられる：グルココルチロイドレセプター
（ＧＲ）、ミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）；エストロゲンレセプター
（ＥＲ）；ｈＰＲ−ＡまたはｈＰＲ−Ｂのようなプロゲステロンレセプター（Ｐ
Ｒ）；アンドロゲンレセプター（ＡＲ）；ビタミンＤ３レセプター（ＶＤＲ）；
レチノイン酸レセプター（例えば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、またはＲＡＲγ）およ
びレチノイドＸレセプター（例えば、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、またはＲＸＲγ）の
ようなレチノイドレセプター；ＴＲαおよびＴＲβのような甲状腺レセプター（
ＴＲ）；エクジソンレセプターのような昆虫に由来するレセプター；ならびにそ
れらのアイソフォーム。
【００４０】 １つの好ましい実施態様に従って、本発明の融合タンパク質は、リガンド結合
ドメインの付近もしくは隣に操作されるＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてこの
２つのドメインはいずれもＰＣＳを含まず、この２つのドメイン間に位置するＰ
ＣＳでもない。
ドメインの付近もしくは隣に操作されるＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてこの
２つのドメインはいずれもＰＣＳを含まず、この２つのドメイン間に位置するＰ
ＣＳでもない。
【００４１】 本発明の融合タンパク質の任意成分は、発現モジュレータードメインである。
上記のように、発現モジュレータードメインが融合タンパク質上に存在しない場
合、発現モジュレータードメインは、融合タンパク質と会合するタンパク質上に
存在しなければならない。
上記のように、発現モジュレータードメインが融合タンパク質上に存在しない場
合、発現モジュレータードメインは、融合タンパク質と会合するタンパク質上に
存在しなければならない。
【００４２】 本発明における使用が意図される発現モジュレータードメイン（融合タンパク
質の一部または融合タンパク質と会合する別のタンパク質のいずれかとして）は
、代表的には、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）に由来する。これら
の配列は、転写に必要な他の転写因子との相互作用を介して、転写を活性化また
は抑制することが、当該分野で公知である。
質の一部または融合タンパク質と会合する別のタンパク質のいずれかとして）は
、代表的には、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）に由来する。これら
の配列は、転写に必要な他の転写因子との相互作用を介して、転写を活性化また
は抑制することが、当該分野で公知である。
【００４３】 発現モジュレータードメインが融合タンパク質に結合する第２のタンパク質内
に存在する実施態様において、その第２のタンパク質は、本発明の融合タンパク
質およびそのリガンドの非存在下で転写を増加または減少させるべきである。発
現モジュレータードメインが融合タンパク質内に存在する実施態様において、発
現モジュレータードメインは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインの位置と反対の
末端に配置される。
に存在する実施態様において、その第２のタンパク質は、本発明の融合タンパク
質およびそのリガンドの非存在下で転写を増加または減少させるべきである。発
現モジュレータードメインが融合タンパク質内に存在する実施態様において、発
現モジュレータードメインは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインの位置と反対の
末端に配置される。
【００４４】 本発明の好ましい実施態様において、発現モジュレータードメインは、その活
性を抑制するのとは反対に、転写を活性化する。このような活性化ドメインとし
ては、以下が挙げられる：ステロイド／甲状腺スーパーファミリーのレセプター
において活性化ドメインをコードするＮ末端領域、ウイルス転写因子の活性化ド
メイン、酵母ＧＣＮ４活性化ドメインまたはＧＡＬ４活性化ドメイン（Ｋ．Ｓｔ
ｒｕｈｌ，「Ｙｅａｓｔ ＧＣＮ４ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔ
ｉｖａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（
１９９２）、８３３−８５９頁；Ａ．Ａ．Ｆ．Ｇａｎｎら、「ＧＡＬ１１，ＧＡ
Ｌ１１Ｐ，ａｎｄ ｔｈｅ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＬ４」、Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ
．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、９３１−９４６頁；Ｋ．Ｊ．Ｍａｒｔ
ｉｎおよびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉ
ｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｅａｒｌｙ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ：Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｈｅｍｅ」、Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇ
ｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、６９５−７２５頁；これ
らの開示を本明細書中で参考として援用する）。
性を抑制するのとは反対に、転写を活性化する。このような活性化ドメインとし
ては、以下が挙げられる：ステロイド／甲状腺スーパーファミリーのレセプター
において活性化ドメインをコードするＮ末端領域、ウイルス転写因子の活性化ド
メイン、酵母ＧＣＮ４活性化ドメインまたはＧＡＬ４活性化ドメイン（Ｋ．Ｓｔ
ｒｕｈｌ，「Ｙｅａｓｔ ＧＣＮ４ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔ
ｉｖａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（
１９９２）、８３３−８５９頁；Ａ．Ａ．Ｆ．Ｇａｎｎら、「ＧＡＬ１１，ＧＡ
Ｌ１１Ｐ，ａｎｄ ｔｈｅ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＬ４」、Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ
．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、９３１−９４６頁；Ｋ．Ｊ．Ｍａｒｔ
ｉｎおよびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉ
ｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｅａｒｌｙ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ：Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｈｅｍｅ」、Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇ
ｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、６９５−７２５頁；これ
らの開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００４５】 別の好ましい実施態様では、この発現調節ドメインは、融合タンパク質の一部
である。ましてなおさら好ましいのは、発現調節ドメインが、ＶＰ１６タンパク
質のＮ末端活性化ドメインである場合である。
である。ましてなおさら好ましいのは、発現調節ドメインが、ＶＰ１６タンパク
質のＮ末端活性化ドメインである場合である。
【００４６】 リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび発現モジュレータードメイ
ンが、同じ転写因子に由来する必要がないことが理解されるべきである。
ンが、同じ転写因子に由来する必要がないことが理解されるべきである。
【００４７】 例えば、レチノイン酸レセプターのＤＮＡ結合ドメイン、およびビタミンＤレ
セプター（ＶＤＲ）のリガンド結合ドメインを含むキメラが、作製され得る（Ｐ
ｅｍｒｉｃｋ，Ｓ．，ら、（１９９８）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ＲＡＲα／ＶＤＲ」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：５５４−５６２）か、ま
たはＪｕｎ ＤＮＡ結合ドメインを含むキメラは、エストロゲンレセプターリガ
ンド結合ドメインおよび発現モジュレーター活性化ドメインに融合され得る（Ｋ
ｒｕｓｅ，Ｕ．ら、（１９９７）「Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ
Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ａ Ｊｕｎ−Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｈｉｍｅｒａ」、ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ９４：１２３９６−１２４００）。
セプター（ＶＤＲ）のリガンド結合ドメインを含むキメラが、作製され得る（Ｐ
ｅｍｒｉｃｋ，Ｓ．，ら、（１９９８）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ＲＡＲα／ＶＤＲ」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：５５４−５６２）か、ま
たはＪｕｎ ＤＮＡ結合ドメインを含むキメラは、エストロゲンレセプターリガ
ンド結合ドメインおよび発現モジュレーター活性化ドメインに融合され得る（Ｋ
ｒｕｓｅ，Ｕ．ら、（１９９７）「Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ
Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ａ Ｊｕｎ−Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｈｉｍｅｒａ」、ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ９４：１２３９６−１２４００）。
【００４８】 他の例は、ｌａｃＲ ＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６活性化ドメインとの融合
を含む。これは、ＬＲＥ、ｌａｃＯに結合するためにＩＰＴＧを必要とする融合
タンパク質を作製する［Ｌａｂｏｗ，Ｍ．ら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６］。別の例では、ｔｅｔＲタンパク質とＶ
Ｐ１６活性化ドメインとの融合は、細胞中およびトランスジェニック動物中にお
いてテトラサイクリンの存在下で、ＬＲＥ、ｔｅｔＯから放出する融合タンパク
質を作製する［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，（１９９２）［Ｔ
ｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍ
ａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏ
ｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：５５４７−５５
５１；Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、（１９９４）「Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｍｉｃｅ ｂｙ ａ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：９３０２−９３０６］。本発明に従う
ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質は、そのＤＮＡ結合ドメイン中にプロテアー
ゼ切断部位を含み得る。その結果、ＰＣＳが切断される場合に、ＤＮＡ結合が排
除される。従って、テトラサイクリンの添加の際に、未切断融合タンパク質は、
ｔｅｔＯからトランス活性化し続け、一方切断された融合タンパク質は、不活化
する。
を含む。これは、ＬＲＥ、ｌａｃＯに結合するためにＩＰＴＧを必要とする融合
タンパク質を作製する［Ｌａｂｏｗ，Ｍ．ら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６］。別の例では、ｔｅｔＲタンパク質とＶ
Ｐ１６活性化ドメインとの融合は、細胞中およびトランスジェニック動物中にお
いてテトラサイクリンの存在下で、ＬＲＥ、ｔｅｔＯから放出する融合タンパク
質を作製する［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，（１９９２）［Ｔ
ｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍ
ａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏ
ｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：５５４７−５５
５１；Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、（１９９４）「Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｍｉｃｅ ｂｙ ａ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：９３０２−９３０６］。本発明に従う
ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質は、そのＤＮＡ結合ドメイン中にプロテアー
ゼ切断部位を含み得る。その結果、ＰＣＳが切断される場合に、ＤＮＡ結合が排
除される。従って、テトラサイクリンの添加の際に、未切断融合タンパク質は、
ｔｅｔＯからトランス活性化し続け、一方切断された融合タンパク質は、不活化
する。
【００４９】 本発明の好ましい実施態様は、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６活性化ドメイ
ンと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーのリガンド
結合ドメインと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバー
のＤＢＤとの融合である。より好ましい実施態様では、ステロイド／甲状腺レセ
プタースーパーファミリーのメンバーは、エクジソンレセプターである。
ンと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーのリガンド
結合ドメインと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバー
のＤＢＤとの融合である。より好ましい実施態様では、ステロイド／甲状腺レセ
プタースーパーファミリーのメンバーは、エクジソンレセプターである。
【００５０】 上記のように、本発明はまた、ＤＮＡを結合するために、あるいはそのＬＲＥ
への融合タンパク質の結合の特異性または結合の親和性を増加させるために、タ
ンパク質結合パートナー（「ＰＢＰ」）との接触を必要とする融合タンパク質を
意図する。従って、本発明に従うタンパク質結合パートナーは、本発明の融合タ
ンパク質に結合し、そして融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの結合の特定の
ＬＲＥへの親和性または特異性を増加させるタンパク質である。タンパク質結合
パートナーは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される特定のＤＮＡエレメン
トにもまた結合するタンパク質である。本発明の融合タンパク質が、ＤＮＡ結合
の親和性または特異性を増加させるためにタンパク質結合パートナーを必要とす
る場合、それは、融合タンパク質がＰＢＰと相互作用するために二量体化ドメイ
ンを含むことを保証することが望ましい。
への融合タンパク質の結合の特異性または結合の親和性を増加させるために、タ
ンパク質結合パートナー（「ＰＢＰ」）との接触を必要とする融合タンパク質を
意図する。従って、本発明に従うタンパク質結合パートナーは、本発明の融合タ
ンパク質に結合し、そして融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの結合の特定の
ＬＲＥへの親和性または特異性を増加させるタンパク質である。タンパク質結合
パートナーは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される特定のＤＮＡエレメン
トにもまた結合するタンパク質である。本発明の融合タンパク質が、ＤＮＡ結合
の親和性または特異性を増加させるためにタンパク質結合パートナーを必要とす
る場合、それは、融合タンパク質がＰＢＰと相互作用するために二量体化ドメイ
ンを含むことを保証することが望ましい。
【００５１】 本発明の融合タンパク質の二量体化ドメインと相互作用するために適切であり
得るタンパク質結合パートナーは、当該分野で公知である。「例えば、Ｔ．Ｄ．
ＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄおよびＧ．Ｉ．Ｅｖａｎ（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ＨＬＨ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ」、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２７−４１頁；Ｈｕｒｓｔ，Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕ
ｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第
３版、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２７−２９頁；お
よびＬ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂ
ｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．］。
得るタンパク質結合パートナーは、当該分野で公知である。「例えば、Ｔ．Ｄ．
ＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄおよびＧ．Ｉ．Ｅｖａｎ（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ＨＬＨ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ」、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２７−４１頁；Ｈｕｒｓｔ，Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕ
ｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第
３版、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２７−２９頁；お
よびＬ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂ
ｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．］。
【００５２】 例えば、いくつかの塩基性（ｂａｓｉｃ）−へリックス−ループ−へリックス
（ｂＨＬＨ）転写因子のヘテロ二量体パートナーは、当該分野で公知である。［
Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８，Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ
−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）３７−４１頁
］。より詳細な例では、ｂＨＬＨ転写因子（例えば、リガンド依存性ダイオキシ
ンレセプターおよびアリール炭化水素レセプター（ＡＨＲ））は、ＡＨＲ核トラ
ンスロケータータンパク質（ＡＲＮＴ）とへテロ二量体化する。［Ｗｈｉｔｅｌ
ａｗ，Ｍ．Ｌ．ら、（１９９４）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒ
ａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｏｘｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｂａｓ
ｉｃ Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ／ＰＡＳ Ｐａｒｔｎｅｒ Ｆａｃｔ
ｏｒ Ａｒｎｔ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖ
ｅ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．
１４：８３４３−８３５５］。
（ｂＨＬＨ）転写因子のヘテロ二量体パートナーは、当該分野で公知である。［
Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８，Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ
−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）３７−４１頁
］。より詳細な例では、ｂＨＬＨ転写因子（例えば、リガンド依存性ダイオキシ
ンレセプターおよびアリール炭化水素レセプター（ＡＨＲ））は、ＡＨＲ核トラ
ンスロケータータンパク質（ＡＲＮＴ）とへテロ二量体化する。［Ｗｈｉｔｅｌ
ａｗ，Ｍ．Ｌ．ら、（１９９４）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒ
ａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｏｘｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｂａｓ
ｉｃ Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ／ＰＡＳ Ｐａｒｔｎｅｒ Ｆａｃｔ
ｏｒ Ａｒｎｔ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖ
ｅ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．
１４：８３４３−８３５５］。
【００５３】 別の例は、ステロイド／甲状腺ファミリーのレセプターをお互いに、または他
の非ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーと、二量体化する能力を有するス
テロイド／甲状腺ファミリーのレセプターである（例えば、Ｒｈｅｅら、（１９
９５）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ Ａｐ
ｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ３，５，３’−Ｔｒｉｉ
ｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：２６９７−７０４；Ｌｉら、（１９９７
）「Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，ＰＮＡＳ ＵＳＡ
９４：２２７８−８３）」。
の非ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーと、二量体化する能力を有するス
テロイド／甲状腺ファミリーのレセプターである（例えば、Ｒｈｅｅら、（１９
９５）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ Ａｐ
ｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ３，５，３’−Ｔｒｉｉ
ｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：２６９７−７０４；Ｌｉら、（１９９７
）「Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，ＰＮＡＳ ＵＳＡ
９４：２２７８−８３）」。
【００５４】 なお別の例は、いくつかの他のタンパク質と二量体化するｂＺＩＰ因子である
。［例えば、Ｈ．Ｃ．Ｈｕｒｓｔ，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６），２８頁］。
。［例えば、Ｈ．Ｃ．Ｈｕｒｓｔ，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６），２８頁］。
【００５５】 本発明のタンパク質を含むこのようなヘテロ二量体およびホモ二量体が意図さ
れる。
れる。
【００５６】 本発明の好ましい実施態様では、Ｐ−ボックス修飾エクジソンレセプターは、
哺乳動物ＲＸＲとヘテロ二量体化する。
哺乳動物ＲＸＲとヘテロ二量体化する。
【００５７】 細胞転写アッセイにおける使用のための本発明の融合タンパク質は、宿主細胞
の核に局在するべきである。本発明の融合タンパク質のドメイン内に既に存在す
る核局在化シグナルは、核局在化シグナルを提供し得る。あるいは、当該分野で
公知の核局在化シグナルは、核局在化を保証するように融合タンパク質へと操作
され得る。［例えば、Ｄ．Ｂ．ＤｅＦｒａｎｃｏ，（１９９８）「Ｓｕｂｃｅｌ
ｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ
Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉ
ｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ Ａ
ら、（１９９６）、「Ｔｈｅ Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｏｓｔｅｒ
Ａｗａｒｄ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃ ｏｆ Ｓｔｅｒｏ
ｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：３−９，これらの開示は、本明細書中で参考
として援用される］。
の核に局在するべきである。本発明の融合タンパク質のドメイン内に既に存在す
る核局在化シグナルは、核局在化シグナルを提供し得る。あるいは、当該分野で
公知の核局在化シグナルは、核局在化を保証するように融合タンパク質へと操作
され得る。［例えば、Ｄ．Ｂ．ＤｅＦｒａｎｃｏ，（１９９８）「Ｓｕｂｃｅｌ
ｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ
Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉ
ｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ Ａ
ら、（１９９６）、「Ｔｈｅ Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｏｓｔｅｒ
Ａｗａｒｄ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃ ｏｆ Ｓｔｅｒｏ
ｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：３−９，これらの開示は、本明細書中で参考
として援用される］。
【００５８】 本発明の方法の代替的実施態様では、融合タンパク質は、リガンド結合ドメイ
ンを欠く。詳細には、この実施態様では、融合タンパク質は、（１）ＤＮＡ結合
ドメインおよび（２）プロテアーゼ切断部位を含む。これらの方法では、融合タ
ンパク質の転写活性は、転写環境の温度を変化させることか、または転写事象が
生じる細胞にストレスを引き起こすことによって誘導し得る。例えば、熱ショッ
ク因子（「ＨＳＦ」）の、その応答エレメントであるＨＳＥに対する高親和性結
合は、熱ショック刺激に依存する。［例えば、Ｊ．ＬｉｓおよびＣ．Ｗｕ、「Ｈ
ｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｆａｃｔｏｒ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ
編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９２）、９０７−９３０頁；Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ，「Ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒｓ、第２版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌ
ｉｍｉｔｅｄ，（１９９５）７１−７８頁］。
ンを欠く。詳細には、この実施態様では、融合タンパク質は、（１）ＤＮＡ結合
ドメインおよび（２）プロテアーゼ切断部位を含む。これらの方法では、融合タ
ンパク質の転写活性は、転写環境の温度を変化させることか、または転写事象が
生じる細胞にストレスを引き起こすことによって誘導し得る。例えば、熱ショッ
ク因子（「ＨＳＦ」）の、その応答エレメントであるＨＳＥに対する高親和性結
合は、熱ショック刺激に依存する。［例えば、Ｊ．ＬｉｓおよびＣ．Ｗｕ、「Ｈ
ｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｆａｃｔｏｒ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ
編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９２）、９０７−９３０頁；Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ，「Ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒｓ、第２版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌ
ｉｍｉｔｅｄ，（１９９５）７１−７８頁］。
【００５９】 目的のプロテアーゼ切断部位は、ＨＳＦタンパク質へと操作され得、その結果
切断されたＨＳＦ融合タンパク質の転写活性は、熱による刺激後の切断されない
ＨＳＦ融合タンパク質と比べてより低いかまたは無視できる。
切断されたＨＳＦ融合タンパク質の転写活性は、熱による刺激後の切断されない
ＨＳＦ融合タンパク質と比べてより低いかまたは無視できる。
【００６０】 本発明の方法によって意図される本発明の融合タンパク質の使用、ＤＮＡ分子
およびベクターは、細胞性転写反応およびインビトロ転写反応を含む。
およびベクターは、細胞性転写反応およびインビトロ転写反応を含む。
【００６１】 細胞において転写アッセイを行うための方法は公知である［例えば、Ｒ．Ｗｈ
ｉｔｅおよびＭ．Ｐａｒｋｅｒ，「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｆ
ａｃｔｏｒｓ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅ
ｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ（１９９３）１４５−１５２頁；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］。簡単には、本発明の融合タンパク質
をコードするＤＮＡ、レポータープラスミド、プロテアーゼ、および、必要に応
じて、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質が細胞へと導入さ
れる。次いで、融合タンパク質の転写活性は、リガンドを添加することによって
か、または細胞の環境を変化させる（例えば、細胞の環境の温度を変化させる）
ことによって誘導される。ｍＲＮＡの量、レポータータンパク質の量、またはレ
ポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定され
る。プロテアーゼの非存在下での転写は、プロテアーゼの存在下での転写と比較
され得る。
ｉｔｅおよびＭ．Ｐａｒｋｅｒ，「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｆ
ａｃｔｏｒｓ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅ
ｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ（１９９３）１４５−１５２頁；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］。簡単には、本発明の融合タンパク質
をコードするＤＮＡ、レポータープラスミド、プロテアーゼ、および、必要に応
じて、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質が細胞へと導入さ
れる。次いで、融合タンパク質の転写活性は、リガンドを添加することによって
か、または細胞の環境を変化させる（例えば、細胞の環境の温度を変化させる）
ことによって誘導される。ｍＲＮＡの量、レポータータンパク質の量、またはレ
ポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定され
る。プロテアーゼの非存在下での転写は、プロテアーゼの存在下での転写と比較
され得る。
【００６２】 インビトロでの転写反応を行うための方法もまた公知である［Ｓｉｅｒｒａ，
Ｆ．ら、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃ
ｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｔｉ
ｓｓｕｅｓ，「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ：Ｗａｌｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｄ．Ｈａｍｅｓおよび
Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１２５−１５２頁；Ｓｎｏｅｋ，Ｒ．ら、（１９９６）
「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５９：２４３−２５０；Ｄｉｇｎａｍ，Ｊ．Ｄ．ら、（
１９９２）「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔ
ｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌ
ｌｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １２．１．１−１２．１．９頁；Ｋｌｅｉｎ−Ｈ
ｉｔｐａｓｓ，Ｌ．ら、（１９９０）「Ｔｈｅ Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ」，Ｃｅｌ
ｌ ６０：２４７−２５７］。
Ｆ．ら、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃ
ｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｔｉ
ｓｓｕｅｓ，「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ：Ｗａｌｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｄ．Ｈａｍｅｓおよび
Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１２５−１５２頁；Ｓｎｏｅｋ，Ｒ．ら、（１９９６）
「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５９：２４３−２５０；Ｄｉｇｎａｍ，Ｊ．Ｄ．ら、（
１９９２）「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔ
ｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌ
ｌｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １２．１．１−１２．１．９頁；Ｋｌｅｉｎ−Ｈ
ｉｔｐａｓｓ，Ｌ．ら、（１９９０）「Ｔｈｅ Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ」，Ｃｅｌ
ｌ ６０：２４７−２５７］。
【００６３】 簡単には、インビトロでの転写反応を補助することが示されているプロトコル
により調製された細胞抽出物が調製される。精製タンパク質または部分的精製タ
ンパク質は、レポータープラスミドと共に細胞抽出物に添加される。このような
精製タンパク質または部分的精製タンパク質（例えば、本発明の融合タンパク質
）は、融合タンパク質をコードするＤＮＡを導入された細胞（例えば、バキュロ
ウイルス感染によるＳＦ９細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および細
菌細胞）中での過剰発現によって産生され得る。タンパク質（例えば、プロテア
ーゼ）および、必要に応じて、発現調節ドメインおよび／またはタンパク質結合
パートナーを有する第２のタンパク質はまた、これらを精製する当該分野で公知
の方法を用いてこれらの本来の供給源から調製され得る。
により調製された細胞抽出物が調製される。精製タンパク質または部分的精製タ
ンパク質は、レポータープラスミドと共に細胞抽出物に添加される。このような
精製タンパク質または部分的精製タンパク質（例えば、本発明の融合タンパク質
）は、融合タンパク質をコードするＤＮＡを導入された細胞（例えば、バキュロ
ウイルス感染によるＳＦ９細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および細
菌細胞）中での過剰発現によって産生され得る。タンパク質（例えば、プロテア
ーゼ）および、必要に応じて、発現調節ドメインおよび／またはタンパク質結合
パートナーを有する第２のタンパク質はまた、これらを精製する当該分野で公知
の方法を用いてこれらの本来の供給源から調製され得る。
【００６４】 次いで、融合タンパク質の転写活性は、リガンドを添加することによって誘導
される。産生されたｍＲＮＡの量、産生されたレポータータンパク質の量、また
はレポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定
される。プロテアーゼの存在下での転写は、プロテアーゼの非存在下での転写と
比較され得る。
される。産生されたｍＲＮＡの量、産生されたレポータータンパク質の量、また
はレポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定
される。プロテアーゼの存在下での転写は、プロテアーゼの非存在下での転写と
比較され得る。
【００６５】 本発明はまた、阻害性のプロテアーゼ活性について化合物をスクリーニングす
るための方法を提供する。スクリーニングされるべき化合物は、リガンドが添加
されるのと同時に添加され得るか、または融合タンパク質とプロテアーゼの最初
の発現／インキュベーションの間に添加され得る。このプロテアーゼの最高の阻
害を達成するために必要な化合物の最適なレベルは、化合物の滴定によって決定
され得る。
るための方法を提供する。スクリーニングされるべき化合物は、リガンドが添加
されるのと同時に添加され得るか、または融合タンパク質とプロテアーゼの最初
の発現／インキュベーションの間に添加され得る。このプロテアーゼの最高の阻
害を達成するために必要な化合物の最適なレベルは、化合物の滴定によって決定
され得る。
【００６６】 本発明はまた、同一のプロテアーゼ切断部位を認識する２つのプロテアーゼの
活性を比較するための方法を提供する。この方法は、変異体プロテアーゼの活性
と非変異体プロテアーゼ（例えば、患者由来のＨＩＶアスパルチルプロテアーゼ
）の活性を比較するために有用である。
活性を比較するための方法を提供する。この方法は、変異体プロテアーゼの活性
と非変異体プロテアーゼ（例えば、患者由来のＨＩＶアスパルチルプロテアーゼ
）の活性を比較するために有用である。
【００６７】 本発明はまた、異なるプロテアーゼ切断部位に対するプロテアーゼの活性を比
較するための方法を提供する。この方法は、所定のプロテアーゼの基質特異性を
決定するために有用である。
較するための方法を提供する。この方法は、所定のプロテアーゼの基質特異性を
決定するために有用である。
【００６８】 本発明はまた、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットを提供する。こ
のキットが、レポーター遺伝子のインビトロでの転写アッセイに用いられる場合
、このキットは、インビトロでの転写抽出物、レポーター遺伝子を含む上記のよ
うなベクター、リガンドの供給、および使用説明書を含み得る。必要に応じて、
これは本発明の融合タンパク質、発現モジュレータードメインを含む第２のタン
パク質、および／または細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および酵母を含む供給
源から発現されるプロテアーゼの供給を提供し得る。
のキットが、レポーター遺伝子のインビトロでの転写アッセイに用いられる場合
、このキットは、インビトロでの転写抽出物、レポーター遺伝子を含む上記のよ
うなベクター、リガンドの供給、および使用説明書を含み得る。必要に応じて、
これは本発明の融合タンパク質、発現モジュレータードメインを含む第２のタン
パク質、および／または細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および酵母を含む供給
源から発現されるプロテアーゼの供給を提供し得る。
【００６９】 このキットが、細胞転写アッセイに用いられる場合、このキットは、本発明の
融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列および上記のようなレポータープラスミ
ドをコードするベクター、そのタンパク質のＤＮＡ配列によりコードされる上記
融合タンパク質と会合しかつその活性を調節するリガンド；ならびにプロテアー
ゼ活性をアッセイするために上記キットを使用するための使用説明書を含み得る
。
融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列および上記のようなレポータープラスミ
ドをコードするベクター、そのタンパク質のＤＮＡ配列によりコードされる上記
融合タンパク質と会合しかつその活性を調節するリガンド；ならびにプロテアー
ゼ活性をアッセイするために上記キットを使用するための使用説明書を含み得る
。
【００７０】 本発明の方法において特に有用であるプロテアーゼは、症状または疾患の発症
に寄与するプロテアーゼである。例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫
応答の活性化、チモーゲン活性、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク
質輸送に関与するプロテアーゼ。本発明の１つの実施態様では、目的のプロテア
ーゼは、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、気腫、高血圧症、腫瘍の侵襲および
転移ならびにウイルス関連疾患に関与するものである。本発明の好ましい実施態
様に従って、このプロテアーゼは、ＨＩＶアスパルチルプロテアーゼおよびＨＣ
Ｖ ＮＳ３プロテアーゼ、ならびにそれらの活性フラグメントまたは融合タンパ
ク質である。
に寄与するプロテアーゼである。例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫
応答の活性化、チモーゲン活性、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク
質輸送に関与するプロテアーゼ。本発明の１つの実施態様では、目的のプロテア
ーゼは、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、気腫、高血圧症、腫瘍の侵襲および
転移ならびにウイルス関連疾患に関与するものである。本発明の好ましい実施態
様に従って、このプロテアーゼは、ＨＩＶアスパルチルプロテアーゼおよびＨＣ
Ｖ ＮＳ３プロテアーゼ、ならびにそれらの活性フラグメントまたは融合タンパ
ク質である。
【００７１】 本発明の１つの実施態様では、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＰＢ
Ｐ、プロテアーゼ、および発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質
のいずれか１つまたは全ては、タンパク質の精製またはその発現の同定を容易に
するための、さらなるポリペプチド配列を提供するように、さらに改変され得る
。例えば、このようなポリペプチド配列は、抗体を結合するためのエピトープ、
タンパク質Ａビーズを結合するための抗体のＦｃ部分、グルタチオンＳトランス
フェラーゼ、マルトース結合タンパク質、Ｈｉｓ（ｎ）、ＦＬＡＧ、およびＳｔ
ｒｅｐ−タグを含み得る。これらのスクリーニング可能なタグは、当該分野で全
て周知であり、そして当業者に完全に利用可能である。
Ｐ、プロテアーゼ、および発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質
のいずれか１つまたは全ては、タンパク質の精製またはその発現の同定を容易に
するための、さらなるポリペプチド配列を提供するように、さらに改変され得る
。例えば、このようなポリペプチド配列は、抗体を結合するためのエピトープ、
タンパク質Ａビーズを結合するための抗体のＦｃ部分、グルタチオンＳトランス
フェラーゼ、マルトース結合タンパク質、Ｈｉｓ（ｎ）、ＦＬＡＧ、およびＳｔ
ｒｅｐ−タグを含み得る。これらのスクリーニング可能なタグは、当該分野で全
て周知であり、そして当業者に完全に利用可能である。
【００７２】 本発明のタンパク質の過剰発現に有用ないくつかのベクターは、酵母、昆虫細
胞、細菌、酵母、植物細胞、および哺乳動物細胞における発現について市販され
ているか、または公知である。
胞、細菌、酵母、植物細胞、および哺乳動物細胞における発現について市販され
ているか、または公知である。
【００７３】 本発明の方法に従って有用な宿主細胞は、当該分野で周知である。外来のプロ
テアーゼの活性が研究される場合、宿主細胞は、標的とされるプロテアーゼ切断
部位を認識する高レベルの内在性のプロテアーゼを発現しないことが望ましい。
適切な宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞；ＨｅＬａ細胞；肝臓細胞；ＣＶ−１細胞
；Ｐ１９細胞；ＮＴ２／Ｄ１細胞；マウスＬ細胞；アフリカミドリザル（Ａｆｒ
ｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞また
は他のＣＯＳ細胞）；ヒト胎児性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３）；ＤＧ４
４細胞、ｌｔｋ細胞、マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞および酵母細胞が挙げられ得る
。この宿主細胞は、一過性のトランスフェクト細胞株または安定な形質転換細胞
株であり得る。本発明の好ましい実施態様では、この宿主細胞は、肝臓細胞株由
来のＣＯＳ細胞である。
テアーゼの活性が研究される場合、宿主細胞は、標的とされるプロテアーゼ切断
部位を認識する高レベルの内在性のプロテアーゼを発現しないことが望ましい。
適切な宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞；ＨｅＬａ細胞；肝臓細胞；ＣＶ−１細胞
；Ｐ１９細胞；ＮＴ２／Ｄ１細胞；マウスＬ細胞；アフリカミドリザル（Ａｆｒ
ｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞また
は他のＣＯＳ細胞）；ヒト胎児性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３）；ＤＧ４
４細胞、ｌｔｋ細胞、マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞および酵母細胞が挙げられ得る
。この宿主細胞は、一過性のトランスフェクト細胞株または安定な形質転換細胞
株であり得る。本発明の好ましい実施態様では、この宿主細胞は、肝臓細胞株由
来のＣＯＳ細胞である。
【００７４】 本発明の方法における使用のために適切なリガンドは、当該分野で周知である
。このリガンドは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインが由来する転写因子
のリガンド結合ドメイン、または改変されたそれらのリガンド結合ドメイン（上
記を参照のこと）に結合すべきである。好ましくは、このリガンドは、融合タン
パク質についてのＬＲＥが、プロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクタ
ーに、スプライスまたは挿入されない（ここで、ＬＲＥは、プロモーターに、リ
ガンドに機能的に応答するようにプロモーターからの転写活性を作る様式で、連
結される）限り、プロモーターからの転写を実質的に増強しないか、または抑制
しない。
。このリガンドは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインが由来する転写因子
のリガンド結合ドメイン、または改変されたそれらのリガンド結合ドメイン（上
記を参照のこと）に結合すべきである。好ましくは、このリガンドは、融合タン
パク質についてのＬＲＥが、プロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクタ
ーに、スプライスまたは挿入されない（ここで、ＬＲＥは、プロモーターに、リ
ガンドに機能的に応答するようにプロモーターからの転写活性を作る様式で、連
結される）限り、プロモーターからの転写を実質的に増強しないか、または抑制
しない。
【００７５】 使用するリガンドの選択は、使用される融合タンパク質のリガンド結合ドメイ
ンに必然的に依存する。例えば、金属結合ＤＮＡ融合タンパク質と共に使用する
ために適切なリガンドとしては、亜鉛、カドミウム、および銅が挙げられ得る。
ンに必然的に依存する。例えば、金属結合ＤＮＡ融合タンパク質と共に使用する
ために適切なリガンドとしては、亜鉛、カドミウム、および銅が挙げられ得る。
【００７６】 例えば、ステロイド結合融合タンパク質、または改変されたステロイド結合融
合タンパク質と共に使用するために適切なリガンドは、アンドロゲン、糖質コル
チコイド、鉱質コルチコイド、甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン
、プロゲストゲン、レチノイン酸、ビタミンＤ３、２０−ヒドロキシ−エクジソ
ン、ポナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ、２６−ヨードポナステロンＡ
、ミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａ、イノステロン、２６−メシリノ
コステロン、ミフェプリストン（ＲＵ ４８６）およびそれらのアナログを含み
得る。
合タンパク質と共に使用するために適切なリガンドは、アンドロゲン、糖質コル
チコイド、鉱質コルチコイド、甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン
、プロゲストゲン、レチノイン酸、ビタミンＤ３、２０−ヒドロキシ−エクジソ
ン、ポナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ、２６−ヨードポナステロンＡ
、ミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａ、イノステロン、２６−メシリノ
コステロン、ミフェプリストン（ＲＵ ４８６）およびそれらのアナログを含み
得る。
【００７７】 本明細書中で用いられる場合、アンドロゲンは、ジヒドロキシテストステロン
およびメチルトリエノロンを含むそれらのアナログを含む。
およびメチルトリエノロンを含むそれらのアナログを含む。
【００７８】 本明細書中で用いられる場合、糖質コルチコイドホルモンは、コルチゾール、
ヒドロコルチゾン、およびコルチコステロン、ならびにデキサメタゾン、デオキ
シコルチコステロン、およびトリアムシノロンアセトニドを含むそれらのアナロ
グを含む。
ヒドロコルチゾン、およびコルチコステロン、ならびにデキサメタゾン、デオキ
シコルチコステロン、およびトリアムシノロンアセトニドを含むそれらのアナロ
グを含む。
【００７９】 本明細書中で用いられる場合、鉱質コルチコイドは、アルドステロン、コリコ
ステロン（ｃｏｒｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）およびデオキシコルチコステロンを含
む。
ステロン（ｃｏｒｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）およびデオキシコルチコステロンを含
む。
【００８０】 本明細書中で用いられる場合、甲状腺ホルモンは、サイロキシン（Ｔ４）およ
びトリヨードサイロニン（ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）（Ｔ３）を含む。
びトリヨードサイロニン（ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）（Ｔ３）を含む。
【００８１】 本明細書中で用いられる場合、エストロゲンは、エストラジオール−１７β、
およびジエチルスチルベストロールを含むそれらのアナログを含む。
およびジエチルスチルベストロールを含むそれらのアナログを含む。
【００８２】 本明細書中で用いられる場合、プロゲストゲンは、プロメゲストロン（ｐｒｏ
ｍｅｇｅｓｔｒｏｎｅ）を含むプロゲステロンのアナログを含む。
ｍｅｇｅｓｔｒｏｎｅ）を含むプロゲステロンのアナログを含む。
【００８３】 テトラサイクリン誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、テトラサイクリ
ンおよびそれらのアナログを含む。
ンおよびそれらのアナログを含む。
【００８４】 糖質誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、アラビノース、ラクトース、
およびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む。
およびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む。
【００８５】 アリール炭化水素誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、ダイオキシンを
含む。
含む。
【００８６】 オーファンレセプターに適切なリガンドは、以下を含む：ＲＸＲレセプターに
ついてフィチン酸、９−シスレチノイン酸、およびＬＧ１００２６８；ＰＰＡＲ
αレセプターについて８Ｓ−ＨＥＴＥおよびＷｙ１４，６４３；ＰＰＡＲγレセ
プターについて１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ２およびＢＲＬ ４９６５３
；ＰＰＡＲδレセプターについてリノール酸およびカルバ−プロスタサイクリン
（ｃａｒｂａ−ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ）；ＦＸＲレセプターについてファル
ネソール；ならびにＬＸＲレセプターについて２４（Ｓ），２５−エポキシコレ
ステロール。［Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１９９８）「ＯｒｐｈａｎＮｕｃｌｅ
ａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏ
ｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅ
ｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３０５頁］。
ついてフィチン酸、９−シスレチノイン酸、およびＬＧ１００２６８；ＰＰＡＲ
αレセプターについて８Ｓ−ＨＥＴＥおよびＷｙ１４，６４３；ＰＰＡＲγレセ
プターについて１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ２およびＢＲＬ ４９６５３
；ＰＰＡＲδレセプターについてリノール酸およびカルバ−プロスタサイクリン
（ｃａｒｂａ−ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ）；ＦＸＲレセプターについてファル
ネソール；ならびにＬＸＲレセプターについて２４（Ｓ），２５−エポキシコレ
ステロール。［Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１９９８）「ＯｒｐｈａｎＮｕｃｌｅ
ａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏ
ｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅ
ｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３０５頁］。
【００８７】 本発明におけるＬＲＥおよびＰＢＰ−ＤＮＡエレメントは、それぞれ、融合タ
ンパク質およびタンパク質結合パートナーについてのＤＮＡ結合部位を提供する
核酸分子である。両方のエレメントは、レポーター遺伝子の転写の活性化または
抑制を制御するために、プロモーターに作動可能に連結されるべきである。句「
作動可能に結合される」とは、核酸分子が、宿主細胞へと導入される（例えば、
トランスフェクトされるか、形質転換されるか、形質導入されるか、結合体化さ
れるか、または組換えによってか、もしくは感染によって）場合に、発現される
得るような様式で、核酸分子（例えば、レポータータンパク質をコードするレポ
ーター遺伝子）を、ＬＲＥエレメントおよびＰＢＰ−ＤＮＡエレメント（ＰＢＰ
結合が転写に必要な場合）に、ならびに転写制御配列に連結することをいう。
ンパク質およびタンパク質結合パートナーについてのＤＮＡ結合部位を提供する
核酸分子である。両方のエレメントは、レポーター遺伝子の転写の活性化または
抑制を制御するために、プロモーターに作動可能に連結されるべきである。句「
作動可能に結合される」とは、核酸分子が、宿主細胞へと導入される（例えば、
トランスフェクトされるか、形質転換されるか、形質導入されるか、結合体化さ
れるか、または組換えによってか、もしくは感染によって）場合に、発現される
得るような様式で、核酸分子（例えば、レポータータンパク質をコードするレポ
ーター遺伝子）を、ＬＲＥエレメントおよびＰＢＰ−ＤＮＡエレメント（ＰＢＰ
結合が転写に必要な場合）に、ならびに転写制御配列に連結することをいう。
【００８８】 転写制御配列は、転写の開始、伸長、そして停止を制御する配列である。特に
重要な転写制御配列は、プロモーターのような転写の開始を制御するものである
。好ましくは、このプロモーターは、最小プロモーターである。用語「最小プロ
モーター」は、転写されるべき結合配列についての転写開始部位を定義するが、
それ自身では、特定の細胞環境において、あったとしても効率的には転写を開始
し得ない、部分的プロモーター配列を記載することを意図する。従って、このよ
うな最小プロモーターの活性は、本発明の融合タンパク質の結合に依存する。
重要な転写制御配列は、プロモーターのような転写の開始を制御するものである
。好ましくは、このプロモーターは、最小プロモーターである。用語「最小プロ
モーター」は、転写されるべき結合配列についての転写開始部位を定義するが、
それ自身では、特定の細胞環境において、あったとしても効率的には転写を開始
し得ない、部分的プロモーター配列を記載することを意図する。従って、このよ
うな最小プロモーターの活性は、本発明の融合タンパク質の結合に依存する。
【００８９】 好ましい実施態様では、最小プロモーターは、ショウジョウバエの熱ショック
プロモーター由来であり、そして融合タンパク質に対する標的ＬＲＥは、ＰＣＴ
／ＵＳ９７／０５３３０（本明細書中で参考として援用される）に記載されるよ
うに生成されるＡＧＡＡＣＡである。
プロモーター由来であり、そして融合タンパク質に対する標的ＬＲＥは、ＰＣＴ
／ＵＳ９７／０５３３０（本明細書中で参考として援用される）に記載されるよ
うに生成されるＡＧＡＡＣＡである。
【００９０】 本発明に従うＬＲＥは、リガンドに応答性を与えるように作動すべきである。
さらなる実施態様では、本発明のＰＢＰに結合するＤＮＡエレメントはまた、用
いられるＰＢＰが、リガンド結合タンパク質である場合に、リガンド応答性であ
り得る。ＬＲＥエレメントおよびＤＮＡエレメント（必要な場合）の選択、なら
びにお互いについてのこれらのエレメントの配置は、用いられる融合タンパク質
またはＰＢＰに依存する。例えば、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、塩
基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質に由来する場合、ＬＲＥは、コ
ンセンサスＤＮＡヘキサマーＣＡＮＮＴＧ（「Ｅボックス」としてもまた公知で
ある）を含むようである（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら、前出、３１頁）。
さらなる実施態様では、本発明のＰＢＰに結合するＤＮＡエレメントはまた、用
いられるＰＢＰが、リガンド結合タンパク質である場合に、リガンド応答性であ
り得る。ＬＲＥエレメントおよびＤＮＡエレメント（必要な場合）の選択、なら
びにお互いについてのこれらのエレメントの配置は、用いられる融合タンパク質
またはＰＢＰに依存する。例えば、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、塩
基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質に由来する場合、ＬＲＥは、コ
ンセンサスＤＮＡヘキサマーＣＡＮＮＴＧ（「Ｅボックス」としてもまた公知で
ある）を含むようである（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら、前出、３１頁）。
【００９１】 多くの転写因子についての好ましいＤＮＡ結合部位（すなわち、ＬＲＥおよび
ＤＮＡエレメント）は公知である。［Ｄ．Ｊ．ＭａｎｇｅｌｓｄｏｒｆおよびＲ
．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，（１９９２）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａ
ｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙ
ａｍａｍｏｔｏ編、１１３７−１１６７頁、；Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（
１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎ
ｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏ
ｎ，ＭＡ．，１１１−１１３頁；およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（本明細
書中で参考として援用される）］。
ＤＮＡエレメント）は公知である。［Ｄ．Ｊ．ＭａｎｇｅｌｓｄｏｒｆおよびＲ
．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，（１９９２）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａ
ｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙ
ａｍａｍｏｔｏ編、１１３７−１１６７頁、；Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（
１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎ
ｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏ
ｎ，ＭＡ．，１１１−１１３頁；およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（本明細
書中で参考として援用される）］。
【００９２】 哺乳動物細胞中で融合タンパク質、ＰＢＰ、およびプロテアーゼの発現を制御
するプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０
初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターのように
構成的であり得る。添加されるコントロールについて、融合タンパク質、ＰＢＰ
、およびプロテアーゼは、誘導性プロモーターの制御化にあり得る。誘導性プロ
モーターは、レポーター遺伝子の転写を駆動するプロモーターと同じではないこ
とが望ましい。
するプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０
初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターのように
構成的であり得る。添加されるコントロールについて、融合タンパク質、ＰＢＰ
、およびプロテアーゼは、誘導性プロモーターの制御化にあり得る。誘導性プロ
モーターは、レポーター遺伝子の転写を駆動するプロモーターと同じではないこ
とが望ましい。
【００９３】 本発明の方法に従って有用であるレポーター遺伝子は、当該分野で周知である
。このようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパ
ク質遺伝子（ＵＳ ５，４９１，０８４）、β−ガラクトシダーゼ、分泌アルカ
リホスファターゼ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を含む。また、本発明は、細胞外の分泌のためのシグナル配列を有す
るマーカータンパク質をコードするレポーター遺伝子（例えば、ＩＬ−１β遺伝
子）を意図する。
。このようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパ
ク質遺伝子（ＵＳ ５，４９１，０８４）、β−ガラクトシダーゼ、分泌アルカ
リホスファターゼ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を含む。また、本発明は、細胞外の分泌のためのシグナル配列を有す
るマーカータンパク質をコードするレポーター遺伝子（例えば、ＩＬ−１β遺伝
子）を意図する。
【００９４】 ＬＲＥエレメントおよびＤＮＡエレメントに作動可能に連結されるレポーター
遺伝子を含むベクター（すなわち、レポータープラスミド）は、当該分野で利用
可能な材料から調製され得る。このようなレポータープラスミドはまた、好まし
くは、例えば、以下を含む：複製起点および選択マーカー。このレポータープラ
スミドはまた、必要に応じて、細胞株のゲノムへのベクターの挿入を生じるため
に、長末端反復配列（「ＬＴＲ」）のような他のＤＮＡ配列を含み得る。
遺伝子を含むベクター（すなわち、レポータープラスミド）は、当該分野で利用
可能な材料から調製され得る。このようなレポータープラスミドはまた、好まし
くは、例えば、以下を含む：複製起点および選択マーカー。このレポータープラ
スミドはまた、必要に応じて、細胞株のゲノムへのベクターの挿入を生じるため
に、長末端反復配列（「ＬＴＲ」）のような他のＤＮＡ配列を含み得る。
【００９５】 細菌または哺乳動物細胞中で融合タンパク質、ＰＢＰ発現モジュレータードメ
インを有するタンパク質もしくはプロテアーゼの発現のために適切なベクターは
、当該分野で周知である。このようなベクターは、例えば、以下を含み得る：複
製起点、選択マーカーおよび転写制御配列（例えば、プロモーターおよびポリア
デニル化配列）。従って、融合タンパク質、ＰＢＰ、発現モジュレータードメイ
ンを有するタンパク質およびプロテアーゼは、上記のように、構成性または誘導
性プロモーターと作動可能に連結されているはずである。このベクターは、以下
のタンパク質の２つ以上が同じベクター中に存在するように構築され得る：融合
タンパク質、プロテアーゼ、ならびに必要に応じて、ＰＢＰおよび／または発現
モジュレーターを有するタンパク質（融合タンパク質の機能にとって必要であれ
ば）。これらの遺伝子の転写は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターに
よって制御され得る。例えば、各遺伝子は、異なる誘導性プロモーターによって
制御されてもよいし、各遺伝子は、同じ構成性プロモーターによって制御されて
もよい。
インを有するタンパク質もしくはプロテアーゼの発現のために適切なベクターは
、当該分野で周知である。このようなベクターは、例えば、以下を含み得る：複
製起点、選択マーカーおよび転写制御配列（例えば、プロモーターおよびポリア
デニル化配列）。従って、融合タンパク質、ＰＢＰ、発現モジュレータードメイ
ンを有するタンパク質およびプロテアーゼは、上記のように、構成性または誘導
性プロモーターと作動可能に連結されているはずである。このベクターは、以下
のタンパク質の２つ以上が同じベクター中に存在するように構築され得る：融合
タンパク質、プロテアーゼ、ならびに必要に応じて、ＰＢＰおよび／または発現
モジュレーターを有するタンパク質（融合タンパク質の機能にとって必要であれ
ば）。これらの遺伝子の転写は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターに
よって制御され得る。例えば、各遺伝子は、異なる誘導性プロモーターによって
制御されてもよいし、各遺伝子は、同じ構成性プロモーターによって制御されて
もよい。
【００９６】 融合タンパク質、ＰＢＰ、プロテアーゼおよび発現モジュレータードメインを
含む第２のタンパク質を発現するためのレポータープラスミドおよびベクターは
、選択マーカーを含み得る−一方は、原核生物細胞（例えば、細菌）における増
殖を付与し、そしてもう一方は、特定の化合物の存在下で真核生物細胞（例えば
、酵母、哺乳動物細胞または植物細胞）における増殖を付与する。本発明におい
て有用な選択マーカーは、薬物（例えば、アンピシリン、カナマイシン、ハイグ
ロマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）に対する耐性を付与しうる。
含む第２のタンパク質を発現するためのレポータープラスミドおよびベクターは
、選択マーカーを含み得る−一方は、原核生物細胞（例えば、細菌）における増
殖を付与し、そしてもう一方は、特定の化合物の存在下で真核生物細胞（例えば
、酵母、哺乳動物細胞または植物細胞）における増殖を付与する。本発明におい
て有用な選択マーカーは、薬物（例えば、アンピシリン、カナマイシン、ハイグ
ロマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）に対する耐性を付与しうる。
【００９７】 本発明の好ましい実施態様において、このベクターは、ＤＮＡ配列である配列
番号１９を有する融合タンパク質をコードする。本発明のさらに好ましい実施態
様において、ＤＮＡ配列である配列番号２１を有する融合タンパク質をコードす
るベクターは、コントロールとして使用される。本発明の好ましい実施態様にお
いて、レポータープラスミドは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＩＮＤに由来する。
番号１９を有する融合タンパク質をコードする。本発明のさらに好ましい実施態
様において、ＤＮＡ配列である配列番号２１を有する融合タンパク質をコードす
るベクターは、コントロールとして使用される。本発明の好ましい実施態様にお
いて、レポータープラスミドは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＩＮＤに由来する。
【００９８】 このベクターおよびレポータープラスミドが細胞における転写アッセイにおい
て使用されるべき場合、それらは、当該分野で公知の技術（例えば、トランスフ
ェクション、リポフェクチン、サイトフェクチン、粒子ビーズボンバードメント
、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはウイルス感染）に
より宿主細胞へ導入され得る（例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ
ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ−
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。
て使用されるべき場合、それらは、当該分野で公知の技術（例えば、トランスフ
ェクション、リポフェクチン、サイトフェクチン、粒子ビーズボンバードメント
、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはウイルス感染）に
より宿主細胞へ導入され得る（例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ
ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ−
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。
【００９９】 ウイルス感染の場合において、目的のＤＮＡは、レトロウイルスを生成するた
めに使用される２つのレトロウイルスＬＴＲの間のウイルスベクターへクローニ
ングされ得、そしてウイルスで細胞を感染させ得る。本発明に従う有用な他のウ
イルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびワクシニアウイ
ルスが挙げられる。
めに使用される２つのレトロウイルスＬＴＲの間のウイルスベクターへクローニ
ングされ得、そしてウイルスで細胞を感染させ得る。本発明に従う有用な他のウ
イルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびワクシニアウイ
ルスが挙げられる。
【０１００】 レポーター遺伝子産物の存在をアッセイするための方法は、当該分野で周知で
ある。例えば、レポーター遺伝子の転写から得られるｍＲＮＡをアッセイするた
めの方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ
．），第２版；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第５版）。レポーター遺伝子により
コードされるタンパク質をアッセイするための方法もまた公知であり、そしてこ
のタンパク質を測定するためのキットが会社から市販される（例えば、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）。
ある。例えば、レポーター遺伝子の転写から得られるｍＲＮＡをアッセイするた
めの方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ
．），第２版；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第５版）。レポーター遺伝子により
コードされるタンパク質をアッセイするための方法もまた公知であり、そしてこ
のタンパク質を測定するためのキットが会社から市販される（例えば、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）。
【０１０１】 本明細書および特許請求の範囲全体を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ
）」またはそのバリエーション「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（
含んでいる）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた完全なもの（ｉｎｔｅ
ｇｅｒ）または完全なものの群の包含を暗に含むが、任意の他の完全なものまた
は完全なものの群の排除が暗示されないことが理解される。
）」またはそのバリエーション「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（
含んでいる）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた完全なもの（ｉｎｔｅ
ｇｅｒ）または完全なものの群の包含を暗に含むが、任意の他の完全なものまた
は完全なものの群の排除が暗示されないことが理解される。
【０１０２】 本明細書中に記載される本発明は、より十分に理解され得るために、以下の実
施例が記載される。これらの実施例は、例示目的にすぎず、そしていずれの様式
においても本発明を制限すると見なされるべきではない。
施例が記載される。これらの実施例は、例示目的にすぎず、そしていずれの様式
においても本発明を制限すると見なされるべきではない。
【０１０３】 （実施例１：ＤＮＡベクターの構築） （Ａ．材料） （１）ベクター プラスミドｐＶｇＲＸＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ｐＶｇＲＸＲは
、改変エクジソンレセプター（ＶｇＥｃＲ）およびレチノイドＸレセプター（Ｒ
ＸＲ）の両方を発現して、ヘテロダイマー核レセプターを形成する、８７２８ｋ
ｂのベクターである（図１）。ＶｇＥｃＲ遺伝子の転写は、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）前初期プロモーターにより駆動される。ＲＸＲ遺伝子の転写は、ラ
ウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターにより駆動される。これらの遺伝子を
発現する安定な細胞株は抗生物質ＺｅｏｃｉｎTMでの選択により作製され得る。
ｐＶｇＲＸＲベクターおよびエクジソンシステムキットの特徴および維持管理に
関する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用
される。
、改変エクジソンレセプター（ＶｇＥｃＲ）およびレチノイドＸレセプター（Ｒ
ＸＲ）の両方を発現して、ヘテロダイマー核レセプターを形成する、８７２８ｋ
ｂのベクターである（図１）。ＶｇＥｃＲ遺伝子の転写は、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）前初期プロモーターにより駆動される。ＲＸＲ遺伝子の転写は、ラ
ウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターにより駆動される。これらの遺伝子を
発現する安定な細胞株は抗生物質ＺｅｏｃｉｎTMでの選択により作製され得る。
ｐＶｇＲＸＲベクターおよびエクジソンシステムキットの特徴および維持管理に
関する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用
される。
【０１０４】 プラスミドｐＩＮＤは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た（図３）。プラスミド
ｐＩＮＤは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに基づいた５０２４ｂｐのベクターであ
る。このベクターは、５つのハイブリッドＬＲＥ（すなわち、５つのエクジソン
／グルココルチコイド応答エレメント（Ｅ／ＧＲＥ））および熱ショック最小プ
ロモーターを有する。このＥ／ＧＲＥは、ｐＶｇＲＸＲから発現される改変エク
ジソンレセプターにより認識され得る。プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、別のプ
ラスミドからのルシフェラーゼ遺伝子（コザック配列およびメチオニン開始部位
を含む）を消化し、そしてｐＩＮＤのポリリンカー（すなわち、最小熱ショック
プロモーターの下流）にこれをクローニングすることにより作製した（図３）。
両方のプラスミドは、選択目的でネオマイシンおよびアンピシリンの耐性遺伝子
を有する。ｐＩＮＤおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃベクターの特徴および維持管理に関
する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用さ
れる。
ｐＩＮＤは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに基づいた５０２４ｂｐのベクターであ
る。このベクターは、５つのハイブリッドＬＲＥ（すなわち、５つのエクジソン
／グルココルチコイド応答エレメント（Ｅ／ＧＲＥ））および熱ショック最小プ
ロモーターを有する。このＥ／ＧＲＥは、ｐＶｇＲＸＲから発現される改変エク
ジソンレセプターにより認識され得る。プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、別のプ
ラスミドからのルシフェラーゼ遺伝子（コザック配列およびメチオニン開始部位
を含む）を消化し、そしてｐＩＮＤのポリリンカー（すなわち、最小熱ショック
プロモーターの下流）にこれをクローニングすることにより作製した（図３）。
両方のプラスミドは、選択目的でネオマイシンおよびアンピシリンの耐性遺伝子
を有する。ｐＩＮＤおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃベクターの特徴および維持管理に関
する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用さ
れる。
【０１０５】 哺乳動物発現プラスミドｐＳＲαは、当該分野で記載されている（本明細書中
に参考として援用される、Ｙ．Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
，８，４６６−７２頁（１９８８））。このプラスミドは、シミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）初期プロモーターならびにヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴ
ＬＶ−１）のＲセグメントおよび長末端反復のＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）の一部か
ら構成されるプロモーター系を含む。プラスミドはまた、１６Ｓ スプライス接
合部、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。
ＨＴＬＶ ＬＴＲエンハンサー／プロモーター配列は、下流にクローニングされ
た遺伝子の高レベル発現を駆動する。目的の遺伝子を、１６Ｓ スプライス接合
部に対して３’に位置づけされるＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニング
し得る。
に参考として援用される、Ｙ．Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
，８，４６６−７２頁（１９８８））。このプラスミドは、シミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）初期プロモーターならびにヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴ
ＬＶ−１）のＲセグメントおよび長末端反復のＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）の一部か
ら構成されるプロモーター系を含む。プラスミドはまた、１６Ｓ スプライス接
合部、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。
ＨＴＬＶ ＬＴＲエンハンサー／プロモーター配列は、下流にクローニングされ
た遺伝子の高レベル発現を駆動する。目的の遺伝子を、１６Ｓ スプライス接合
部に対して３’に位置づけされるＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニング
し得る。
【０１０６】 （２）プライマー ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２）は、ｐＶｇＲＸＲプラスミ
ドのＶＰ１６コード領域の上流にあるＸｂａＩ部位にハイブリダイズするように
設計された２８マーである。
ドのＶＰ１６コード領域の上流にあるＸｂａＩ部位にハイブリダイズするように
設計された２８マーである。
【０１０７】 ＶＰ１６／５Ａ５ＢＲプライマー（配列番号１３）は、ｐＶｇＲＸＲプラスミ
ドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖
に一部ハイブリダイズするように設計された８６マーである。 このプライマーはまた、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部
位およびＸｂａＩ部位についてのコード配列に相補的なヌクレオチドを含む。
ドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖
に一部ハイブリダイズするように設計された８６マーである。 このプライマーはまた、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部
位およびＸｂａＩ部位についてのコード配列に相補的なヌクレオチドを含む。
【０１０８】 ＶＰ１６／５Ａ**５ＢＲプライマー（配列番号１４）はｐＶｇＲＸＲプラスミ
ドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖
に一部ハイブリダイズするように設計された９２マーである。このプライマーは
また、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部位についてのコー
ド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。しかし、５Ａ／５Ｂ切断部位をコ
ードするＤＮＡはさらに、システインおよびセリンコドンをコードするＤＮＡ配
列の間に６つのヌクレオチド挿入を有する。この６つのヌクレオチド挿入は、２
つの停止コドンをコードする。
ドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖
に一部ハイブリダイズするように設計された９２マーである。このプライマーは
また、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部位についてのコー
ド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。しかし、５Ａ／５Ｂ切断部位をコ
ードするＤＮＡはさらに、システインおよびセリンコドンをコードするＤＮＡ配
列の間に６つのヌクレオチド挿入を有する。この６つのヌクレオチド挿入は、２
つの停止コドンをコードする。
【０１０９】 ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）は、ＮＳ３コード領域（ＨＣＶポ
リペプチドにおけるアミノ酸番号１０２７〜１０３２に対応する）の開始部位に
一部結合するように設計された４７マーである。このオリゴヌクレオチドの残余
部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
リペプチドにおけるアミノ酸番号１０２７〜１０３２に対応する）の開始部位に
一部結合するように設計された４７マーである。このオリゴヌクレオチドの残余
部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
【０１１０】 ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）は、ＮＳ４Ａコード領域（ＨＣＶ
ポリペプチドにおけるアミノ酸番号１７０５〜１７１１に対応する）の３’末端
に一部結合するように設計された４４マーである。このオリゴヌクレオチドの残
余部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
ポリペプチドにおけるアミノ酸番号１７０５〜１７１１に対応する）の３’末端
に一部結合するように設計された４４マーである。このオリゴヌクレオチドの残
余部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
【０１１１】 各プライマーを、オリゴヌクレオチド合成機を用いて、当該分野で公知の標準
的条件下で合成した。
的条件下で合成した。
【０１１２】 Ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびクローニングストラテジー ＰＣＲ反応を、標準の条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ
．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｐｌａｉｎ
ｖｉｅｗ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）で行った。
．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｐｌａｉｎ
ｖｉｅｗ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）で行った。
【０１１３】 （１）ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢベクターおよびｐＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ａベ
クター ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（配列番号１９）をコードする発現ベクターを調製す
ることに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２
）、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＲプライマー（配列番号１３）およびｐＶｇＲＸＲプラ
スミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣＲ
産物を、ＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、Ｖ
Ｐ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産
物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消
化したＰＣＲ挿入物を、この骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、こ
の挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために
配列決定することによりスクリーニングした。
クター ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（配列番号１９）をコードする発現ベクターを調製す
ることに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２
）、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＲプライマー（配列番号１３）およびｐＶｇＲＸＲプラ
スミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣＲ
産物を、ＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、Ｖ
Ｐ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産
物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消
化したＰＣＲ挿入物を、この骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、こ
の挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために
配列決定することによりスクリーニングした。
【０１１４】 ＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ｂ（配列番号２１）をコードする発現ベクターを調製す
ることに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２
）、ＶＰ１６／５Ａ**５ＢＲプライマー（配列番号１４）およびｐＶｇＲＸＲプ
ラスミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣ
Ｒ産物をＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、Ｖ
Ｐ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産
物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消
化したＰＣＲ挿入物をこの骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、この
挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために配
列決定することによりスクリーニングした。
ることに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２
）、ＶＰ１６／５Ａ**５ＢＲプライマー（配列番号１４）およびｐＶｇＲＸＲプ
ラスミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣ
Ｒ産物をＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、Ｖ
Ｐ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産
物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消
化したＰＣＲ挿入物をこの骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、この
挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために配
列決定することによりスクリーニングした。
【０１１５】 （２）ｐＳＲα−ＮＳ３−４ＡおよびｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ
） ＮＳ３−４Ａ切断部位をコードするｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａベクター（配列番
号１０）を調製することに関する最初の工程は、ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配
列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）および全長ＨＣＶ
Ｈ株ｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲ反応を包含した（本明細書中
に参考として援用されるＩｎｃｈａｕｓｐｅら，（１９９１），ＰＮＡＳ ＵＳ
Ａ ８８：１０２９２−１０２９６）。次いで、このＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよ
びＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲ１で消化
することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベ
クター骨格を単離し、そしてこのＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ部位に連結した。
） ＮＳ３−４Ａ切断部位をコードするｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａベクター（配列番
号１０）を調製することに関する最初の工程は、ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配
列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）および全長ＨＣＶ
Ｈ株ｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲ反応を包含した（本明細書中
に参考として援用されるＩｎｃｈａｕｓｐｅら，（１９９１），ＰＮＡＳ ＵＳ
Ａ ８８：１０２９２−１０２９６）。次いで、このＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよ
びＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲ１で消化
することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベ
クター骨格を単離し、そしてこのＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ部位に連結した。
【０１１６】 ＮＳ３−４Ａ変異プロテアーゼをコードするｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１
６５Ａ）（Ｓ１１６５Ａ）ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＮＳ
３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号
１６）およびＮＳ３活性部位変異Ｓ１１６５ＡのｃＤＮＡを用いるＰＣＲ反応を
包含した（本明細書中に参考として援用されるＡ．Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９
３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−４３）。次いで、このＰＣＲ産物
をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化することにより、ＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製し
た。このベクター骨格を単離し、そしてＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ部位に連結した。ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）は、アミノ酸番号１１
６５でセリンからアラニンへの置換（これは、このプロテアーゼを不活性にする
）を有する。配列番号１０と配列番号１１とを比較のこと。
６５Ａ）（Ｓ１１６５Ａ）ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＮＳ
３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号
１６）およびＮＳ３活性部位変異Ｓ１１６５ＡのｃＤＮＡを用いるＰＣＲ反応を
包含した（本明細書中に参考として援用されるＡ．Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９
３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−４３）。次いで、このＰＣＲ産物
をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化することにより、ＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製し
た。このベクター骨格を単離し、そしてＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ部位に連結した。ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）は、アミノ酸番号１１
６５でセリンからアラニンへの置換（これは、このプロテアーゼを不活性にする
）を有する。配列番号１０と配列番号１１とを比較のこと。
【０１１７】 （実施例２：ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ エクジソン−誘導性ルシフェラーゼ
アッセイ） ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ エクジソン−誘導性ルシフェラーゼアッ
セイを、一般に、以下に記載の通り行った。
アッセイ） ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ エクジソン−誘導性ルシフェラーゼアッ
セイを、一般に、以下に記載の通り行った。
【０１１８】 ＣＯＳアフリカミドリザル腎臓細胞を、約１５０，０００細胞／ウェルで、６
ウェルプレート中にプレートした。翌日、約３．６μｇのプラスミドＤＮＡを、
２９μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）と合わせたダルベッコ改変
イーグル培地−Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＤＭＥＭ）１００μｌ中に溶解し、次いで
、ピペッティングして混合した。この混合物を、室温で１０分間インキュベート
した。
ウェルプレート中にプレートした。翌日、約３．６μｇのプラスミドＤＮＡを、
２９μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）と合わせたダルベッコ改変
イーグル培地−Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＤＭＥＭ）１００μｌ中に溶解し、次いで
、ピペッティングして混合した。この混合物を、室温で１０分間インキュベート
した。
【０１１９】 各実験で代表的に使用されたＤＮＡの量は、以下のとおりである：０．６μｇ
のｐＩＮＤ−Ｌｕｃ、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢもしくはｐＶｇＲ
ＸＲ−５Ａ**５Ｂ、および０〜２．４μｇのｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａもしくはｐ
ＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）もしくはｐＳＲα。
のｐＩＮＤ−Ｌｕｃ、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢもしくはｐＶｇＲ
ＸＲ−５Ａ**５Ｂ、および０〜２．４μｇのｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａもしくはｐ
ＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）もしくはｐＳＲα。
【０１２０】 次いで、ｖ／ｖ １０％ ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ−Ｄ
ＭＥＭ）６００μｌを、ＤＮＡ混合物に添加し、そしてピペッティングして混合
した。６ウェルプレート中の細胞を、２．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で洗浄した。このＰＢＳを細胞から取り除き、そしてＤＮＡ混合物と置き
換えた。この細胞を、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、ＤＮＡ混合物中、
３７℃で３時間インキュベートした。
ＭＥＭ）６００μｌを、ＤＮＡ混合物に添加し、そしてピペッティングして混合
した。６ウェルプレート中の細胞を、２．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で洗浄した。このＰＢＳを細胞から取り除き、そしてＤＮＡ混合物と置き
換えた。この細胞を、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、ＤＮＡ混合物中、
３７℃で３時間インキュベートした。
【０１２１】 インキュベーション後、この細胞をＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを取り除き、そ
して細胞に１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを添加した。この細胞を、５％ ＣＯ2イ
ンキュベーターの中で、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中、３７℃で一晩インキュベ
ートした。
して細胞に１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを添加した。この細胞を、５％ ＣＯ2イ
ンキュベーターの中で、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中、３７℃で一晩インキュベ
ートした。
【０１２２】 その翌日、外因性リガンドをこの細胞に添加して、レポーター遺伝子の転写を
誘導した。具体的には、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを細胞から吸引し、そして１
〜１０μＭ ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａまたは１〜１０μＭ ポ
ナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕｎｉｔｅ
ｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の濃度を含む１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ溶液と置き換えた
。いくつかの場合には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解したプロテ
アーゼインヒビターもまた１〜４０μＭの終濃度で細胞に添加した。細胞をムリ
ステロンＡまたはポナステロンＡとともに、５％ ＣＯ2インキュベーターの中
で、３７℃で２４時間インキュベートした。
誘導した。具体的には、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを細胞から吸引し、そして１
〜１０μＭ ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａまたは１〜１０μＭ ポ
ナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕｎｉｔｅ
ｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の濃度を含む１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ溶液と置き換えた
。いくつかの場合には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解したプロテ
アーゼインヒビターもまた１〜４０μＭの終濃度で細胞に添加した。細胞をムリ
ステロンＡまたはポナステロンＡとともに、５％ ＣＯ2インキュベーターの中
で、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１２３】 翌日、細胞をＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼタンパク質の活性を、ルシフ
ェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。具体的には、細
胞を２５０μｌの細胞培養物溶解試薬で溶解した。これらの細胞をプレートから
掻き取り、そして微量遠心チューブに移した。抽出物を、１２，０００×ｇで５
秒間遠心分離した。２０μｌの各サンプルを、１００μｌのルシフェラーゼアッ
セイ試薬に添加した。ルシフェラーゼと試薬との反応によって生じた光を、ルミ
ノメーターで測定し、そして相対的光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕ
ｎｉｔｓ；ＲＬＵ）として報告した。
ェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。具体的には、細
胞を２５０μｌの細胞培養物溶解試薬で溶解した。これらの細胞をプレートから
掻き取り、そして微量遠心チューブに移した。抽出物を、１２，０００×ｇで５
秒間遠心分離した。２０μｌの各サンプルを、１００μｌのルシフェラーゼアッ
セイ試薬に添加した。ルシフェラーゼと試薬との反応によって生じた光を、ルミ
ノメーターで測定し、そして相対的光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕ
ｎｉｔｓ；ＲＬＵ）として報告した。
【０１２４】 実験のほとんどを、三連で数回行った。データ点の標準偏差を反映するエラー
バーは、図面に中に含まれている。
バーは、図面に中に含まれている。
【０１２５】 （実施例３：活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間の５Ａ／５Ｂ接合部
の挿入は、ムリステロンＡ誘導トランス活性化を妨げない） 融合タンパク質（ＶｇＲＸＲ、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢまたはＶｇＲＸＲ−５
Ａ（Ｓｔｏｐ）５Ｂ）ならびにｐＩＮＤ−Ｌｕｃをコードするベクターを、上記
（実施例２）に記載されるように、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。翌日に
、これらの細胞のいくつかを、１μＭのムリステロンとともに２４時間インキュ
ベートした。この細胞を溶解し、そして以前に記載されたようにルシフェラーゼ
活性をアッセイした。結果を図４に示す。
の挿入は、ムリステロンＡ誘導トランス活性化を妨げない） 融合タンパク質（ＶｇＲＸＲ、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢまたはＶｇＲＸＲ−５
Ａ（Ｓｔｏｐ）５Ｂ）ならびにｐＩＮＤ−Ｌｕｃをコードするベクターを、上記
（実施例２）に記載されるように、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。翌日に
、これらの細胞のいくつかを、１μＭのムリステロンとともに２４時間インキュ
ベートした。この細胞を溶解し、そして以前に記載されたようにルシフェラーゼ
活性をアッセイした。結果を図４に示す。
【０１２６】 ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（Ｓｔｏｐ）５Ｂ（これは、エクジソンＤＮＡ結合ドメイ
ンを欠く）によって発現されたコントロール融合タンパク質は、ごくわずかな活
性を示す。ＶｇＲＸＲおよびＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ発現融合タンパク質の活性
の間には、ほとんどまたは全く差異がなかった。これらの結果は、ＶｇＲＸＲ発
現タンパク質における５Ａ／５Ｂ接合部の挿入が、ムリステロンＡが誘導した活
性を妨げないことを示す。
ンを欠く）によって発現されたコントロール融合タンパク質は、ごくわずかな活
性を示す。ＶｇＲＸＲおよびＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ発現融合タンパク質の活性
の間には、ほとんどまたは全く差異がなかった。これらの結果は、ＶｇＲＸＲ発
現タンパク質における５Ａ／５Ｂ接合部の挿入が、ムリステロンＡが誘導した活
性を妨げないことを示す。
【０１２７】 （実施例４：漸増量のｐＳＲαＮＳ３−４ＡとｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂとの
同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス活性化の用量依存
減少を導く） レポータープラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、図５に示されるように、ｐＶｇＲ
ＸＲ−５Ａ／５ＢまたはｐＶｇＲＸＲのいずれかと、プロテアーゼＮＳ３−４Ａ
をコードするＤＮＡの漸増量（μｇ）とともに同時トランスフェクトした。翌日
に、細胞を、１μＭ ムリステロンＡとともにインキュベートした。次いで、細
胞を溶解し、以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果
を図５に示す。
同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス活性化の用量依存
減少を導く） レポータープラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、図５に示されるように、ｐＶｇＲ
ＸＲ−５Ａ／５ＢまたはｐＶｇＲＸＲのいずれかと、プロテアーゼＮＳ３−４Ａ
をコードするＤＮＡの漸増量（μｇ）とともに同時トランスフェクトした。翌日
に、細胞を、１μＭ ムリステロンＡとともにインキュベートした。次いで、細
胞を溶解し、以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果
を図５に示す。
【０１２８】 哺乳動物ＲＸＲおよびエクジソンレセプター／ＶＰ１６融合タンパク質をコー
ドするＶｇＲＸＲ構築物で同時トランスフェクトした場合のルシフェラーゼレポ
ーター構築物の転写は、プロテアーゼＮＳ３−４Ａで同時発現させた場合と、ほ
とんどまたは全く変化しないことを示した。対照的に、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ
コードタンパク質は、ＮＳ３−４Ａタンパク質で同時発現させた場合、ルシフェ
ラーゼ活性の用量依存的減少を生じた。これらの結果は、プロテアーゼＮＳ３−
４Ａが、５Ａ／５Ｂ接合部を切断するが、活性に必要な融合タンパク質の他の領
域を切断しないことを示唆する。
ドするＶｇＲＸＲ構築物で同時トランスフェクトした場合のルシフェラーゼレポ
ーター構築物の転写は、プロテアーゼＮＳ３−４Ａで同時発現させた場合と、ほ
とんどまたは全く変化しないことを示した。対照的に、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ
コードタンパク質は、ＮＳ３−４Ａタンパク質で同時発現させた場合、ルシフェ
ラーゼ活性の用量依存的減少を生じた。これらの結果は、プロテアーゼＮＳ３−
４Ａが、５Ａ／５Ｂ接合部を切断するが、活性に必要な融合タンパク質の他の領
域を切断しないことを示唆する。
【０１２９】 （実施例５：漸増量のｐＳＲαＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）とｐＶｇＲＸＲ
−５Ａ／５Ｂとの同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス
活性化に影響を及ぼさない） 本発明者らは、図６に示すように、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂお
よび０．６μｇのｐＩＮＤ−Ｌｕｃを用いて、ＮＳ３プロテアーゼまたはそれら
の不活性変異体をコードする可変量（μｇ）のベクターで同時トランスフェクト
した。各トランスフェクションに使用したＤＮＡの総量は、ｐＳＲαと足して３
．６μｇであった。翌日に、細胞を１μＭのムリステロンＡ中でインキュベート
した。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッ
セイした。結果を図６に示す。
−５Ａ／５Ｂとの同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス
活性化に影響を及ぼさない） 本発明者らは、図６に示すように、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂお
よび０．６μｇのｐＩＮＤ−Ｌｕｃを用いて、ＮＳ３プロテアーゼまたはそれら
の不活性変異体をコードする可変量（μｇ）のベクターで同時トランスフェクト
した。各トランスフェクションに使用したＤＮＡの総量は、ｐＳＲαと足して３
．６μｇであった。翌日に、細胞を１μＭのムリステロンＡ中でインキュベート
した。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッ
セイした。結果を図６に示す。
【０１３０】 前の結果においてみられるように（実施例４）、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂによ
ってコードされるこの融合タンパク質は、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの非存在下
で高レベルの活性を示した。ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ媒介ルシフェラーゼ活性の
活性は、変異型プロテアーゼＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）をコードするＤＮＡ
ではなく、ＮＳ３−４ＡプロテアーゼをコードするＤＮＡでの同時トランスフェ
クションに伴う用量依存性様式で減少した。これは、おそらく、変異体ＮＳ３−
４Ａプロテアーゼがエクジソン／ＶＰ１６融合タンパク質を切断できないことに
起因する。
ってコードされるこの融合タンパク質は、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの非存在下
で高レベルの活性を示した。ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ媒介ルシフェラーゼ活性の
活性は、変異型プロテアーゼＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）をコードするＤＮＡ
ではなく、ＮＳ３−４ＡプロテアーゼをコードするＤＮＡでの同時トランスフェ
クションに伴う用量依存性様式で減少した。これは、おそらく、変異体ＮＳ３−
４Ａプロテアーゼがエクジソン／ＶＰ１６融合タンパク質を切断できないことに
起因する。
【０１３１】 実施例４および５のような用量依存研究は、融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａと、将来のアッセイにおいて使用するためのプロテアーゼをコードするＤＮＡ
との最適比を決定するために有用であった。
Ａと、将来のアッセイにおいて使用するためのプロテアーゼをコードするＤＮＡ
との最適比を決定するために有用であった。
【０１３２】 （実施例６：ポナステロンＡ用量応答） プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３
−４Ａの非存在下または存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）とと
もに同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を可変量のポナステロンＡ、エク
ジソンレセプターと哺乳動物レチノイン酸レセプター（ＲＸＲ）とのヘテロダイ
マー化を誘導するリガンドとともにインキュベートした。細胞を溶解し、そして
以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図７に示す
。
−４Ａの非存在下または存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）とと
もに同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を可変量のポナステロンＡ、エク
ジソンレセプターと哺乳動物レチノイン酸レセプター（ＲＸＲ）とのヘテロダイ
マー化を誘導するリガンドとともにインキュベートした。細胞を溶解し、そして
以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図７に示す
。
【０１３３】 この結果は、ポナステロンＡが、プロテアーゼＮＳ３−４Ａの非存在下で融合
タンパク質ＥｄＲ５Ａ／５Ｂ（すなわち、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂによってコー
ドされるタンパク質）を活性化するにおいて有効であることを示す。これらの実
験の目的については、ポナステロンＡが３．３〜１０μＭの間の濃度で存在した
場合に、融合タンパク質の最も大きな活性化が生じた。一般には、ポナステロン
Ａは、これらのアッセイにおいて転写を誘導するにおいてムリステロンＡと等し
く有効であることが分かった。
タンパク質ＥｄＲ５Ａ／５Ｂ（すなわち、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂによってコー
ドされるタンパク質）を活性化するにおいて有効であることを示す。これらの実
験の目的については、ポナステロンＡが３．３〜１０μＭの間の濃度で存在した
場合に、融合タンパク質の最も大きな活性化が生じた。一般には、ポナステロン
Ａは、これらのアッセイにおいて転写を誘導するにおいてムリステロンＡと等し
く有効であることが分かった。
【０１３４】 （実施例７：ポナステロンＡ誘導および％ＤＭＳＯ制御） プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３
−４Ａの存在下または非存在下で、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と
同時トランスフェクトした。翌日、細胞を５μＭ ポナステロンＡとともにイン
キュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、０〜１％ ＤＭＳＯの
終濃度（ｖ／ｖ）まで細胞に添加した。細胞を溶解し、そして以前に記載したよ
うに、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図８に示す。
−４Ａの存在下または非存在下で、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と
同時トランスフェクトした。翌日、細胞を５μＭ ポナステロンＡとともにイン
キュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、０〜１％ ＤＭＳＯの
終濃度（ｖ／ｖ）まで細胞に添加した。細胞を溶解し、そして以前に記載したよ
うに、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図８に示す。
【０１３５】 このコントロール実験において、ＤＭＳＯを細胞に加えて、その存在が、ポナ
ステロンＡによる融合タンパク質の活性化を妨げるか否かを決定した。ＤＭＳＯ
は、これらのアッセイに添加する前に、プロテアーゼインヒビター化合物を溶解
するためにときおり使用された溶媒である。大部分の実験で、細胞培養物中のＤ
ＭＳＯ濃度は、０．１％を超えなかった。これらの結果は、１％までのＤＭＳＯ
濃度が、このアッセイにおいてポナステロンＡ誘導ルシフェラーゼ活性に対する
影響をほとんどまたは全く有さないことを示す。
ステロンＡによる融合タンパク質の活性化を妨げるか否かを決定した。ＤＭＳＯ
は、これらのアッセイに添加する前に、プロテアーゼインヒビター化合物を溶解
するためにときおり使用された溶媒である。大部分の実験で、細胞培養物中のＤ
ＭＳＯ濃度は、０．１％を超えなかった。これらの結果は、１％までのＤＭＳＯ
濃度が、このアッセイにおいてポナステロンＡ誘導ルシフェラーゼ活性に対する
影響をほとんどまたは全く有さないことを示す。
【０１３６】 以下の実施例は、プロテアーゼのインヒビターとして潜在的に有用な化合物を
スクリーニングするために、このアッセイがどの程度有用であり得るかを示す。
スクリーニングするために、このアッセイがどの程度有用であり得るかを示す。
【０１３７】 （実施例８：ＶＲＴ−２５，５３１によるＮＳ３−４Ａ活性の用量依存的阻害
） プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３
−４Ａ（１：３の比）の存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と同
時トランスフェクトした。翌日に、細胞を、図９に記載されるように、５μＭ
ポナステロンＡおよび可変量の化合物ＶＨ−２５５３１とともにインキュベート
した。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッ
セイした。結果を図９に示す。
） プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３
−４Ａ（１：３の比）の存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と同
時トランスフェクトした。翌日に、細胞を、図９に記載されるように、５μＭ
ポナステロンＡおよび可変量の化合物ＶＨ−２５５３１とともにインキュベート
した。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッ
セイした。結果を図９に示す。
【０１３８】 この結果は、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの非存在下でのＶＨ−２５５３１が融
合タンパク質の活性を有意には増加も減少もさせないことを示す（図９のレーン
１および３を比較のこと）。しかし、ＶＨ−２５５３１は、特に２０μＭでＮＳ
３−４Ａプロテアーゼの活性を阻害しない。（請求項２に伴うレーン４〜１１（
図９）を比較のこと）。事実、これらの結果は、ＶＨ−２５５３１が、２０μＭ
濃度で、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼを５５．５％ほど阻害し得ることを示す。２
０μＭ ＶＨ−２５５３１でのプロテアーゼ活性の阻害％を、レーン３の値から
レーン２の値を差し引くこと（１９９００−５１７７＝１４７３２）、レーン４
の値からレーン２の値を差し引くこと（１３３５６−５１７７＝８１７９）、次
いで、２つの値を用いて除算すること（８１７９／１４７２３＝０．５５５）に
より概算した。
合タンパク質の活性を有意には増加も減少もさせないことを示す（図９のレーン
１および３を比較のこと）。しかし、ＶＨ−２５５３１は、特に２０μＭでＮＳ
３−４Ａプロテアーゼの活性を阻害しない。（請求項２に伴うレーン４〜１１（
図９）を比較のこと）。事実、これらの結果は、ＶＨ−２５５３１が、２０μＭ
濃度で、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼを５５．５％ほど阻害し得ることを示す。２
０μＭ ＶＨ−２５５３１でのプロテアーゼ活性の阻害％を、レーン３の値から
レーン２の値を差し引くこと（１９９００−５１７７＝１４７３２）、レーン４
の値からレーン２の値を差し引くこと（１３３５６−５１７７＝８１７９）、次
いで、２つの値を用いて除算すること（８１７９／１４７２３＝０．５５５）に
より概算した。
【０１３９】 本発明者らは、本明細書中前記に本発明の多くの実施態様を提示したが、本発
明者らの基本的な構築物が、本発明の方法を利用する他の実施態様を提供するよ
うに改変され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲が、本明細書中で
例示される特定の実施態様ではなく、むしろ特許請求の範囲および明細書により
規定されるべきことが理解される。
明者らの基本的な構築物が、本発明の方法を利用する他の実施態様を提供するよ
うに改変され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲が、本明細書中で
例示される特定の実施態様ではなく、むしろ特許請求の範囲および明細書により
規定されるべきことが理解される。
【配列表】
【図１】 図１は、ベクターｐＶｇＲＸＲ、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ、およびｐＶｇＲ
ＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂの構造を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂにコードされ
るタンパク質のシステインとセリンとの間に位置するバックスラッシュは、切断
が生じる場所を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂにコードされるタンパク
質の切断部位付近の２つのアスタリスクは、２つの停止コドンの位置を示す。
ＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂの構造を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂにコードされ
るタンパク質のシステインとセリンとの間に位置するバックスラッシュは、切断
が生じる場所を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂにコードされるタンパク
質の切断部位付近の２つのアスタリスクは、２つの停止コドンの位置を示す。
【図２】 図２は、ＨＣＶ ＮＳ３−４ＡプロテアーゼをコードするＤＮＡベクターであ
るｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａの構造を示す。
るｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａの構造を示す。
【図３】 図３は、コントロールベクターｐＩＮＤおよびエクジソン誘導性ルシフェラー
ゼ発現のためのレポーターベクターであるｐＩＮＤ−ｌｕｃの構造を示す。用語
「５ＸＥ／ＧＲＥ」とは、エクジソン／グルココルチコイド応答エレメントをい
う。用語「ＰΔＨＳＰ」とは、熱ショック最小プロモーターをいう。用語「ＢＧ
Ｈ ｐＡ」とは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをいう。
ゼ発現のためのレポーターベクターであるｐＩＮＤ−ｌｕｃの構造を示す。用語
「５ＸＥ／ＧＲＥ」とは、エクジソン／グルココルチコイド応答エレメントをい
う。用語「ＰΔＨＳＰ」とは、熱ショック最小プロモーターをいう。用語「ＢＧ
Ｈ ｐＡ」とは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをいう。
【図４】 図４は、以下のいずれか１つを用いるＣＯＳ細胞へのトランスフェクション実
験の結果をグラフで示す：（１）哺乳動物ＲＸＲレセプタータンパク質、および
単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ）の活性化ドメインに
融合されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを
含む融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター；（２）ＲＸＲレセプタータン
パク質、およびＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ）の活性化ドメ
インに融合されたＨＣＶの５Ａ／５Ｂタンパク質分解性切断部位に融合されたＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タン
パク質をコードするＤＮＡベクター；ならびに（３）ＲＸＲレセプタータンパク
質、および上記の融合タンパク質（５Ａ／５Ｂ切断部位をコードするＤＮＡが、
その切断部位におけるタンデム停止コドンを含むように改変されていることを除
く）をコードするＤＮＡベクター（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂ）。ルシフ
ェラーゼレセプター遺伝子を含むプラスミドを、各トランスフェクションにおい
て含ませた（ｐＩＮＤ−ｌｕｃ）。トランスフェクション後、レポーター遺伝子
の転写を、１μＭのミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（エクジソン
アナログ）をトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。この
データを、実施例１に記載のように、トランスフェクトした細胞からの溶解物に
存在するルシフェラーゼ活性を測定することによって得た。
験の結果をグラフで示す：（１）哺乳動物ＲＸＲレセプタータンパク質、および
単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ）の活性化ドメインに
融合されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを
含む融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター；（２）ＲＸＲレセプタータン
パク質、およびＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ）の活性化ドメ
インに融合されたＨＣＶの５Ａ／５Ｂタンパク質分解性切断部位に融合されたＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タン
パク質をコードするＤＮＡベクター；ならびに（３）ＲＸＲレセプタータンパク
質、および上記の融合タンパク質（５Ａ／５Ｂ切断部位をコードするＤＮＡが、
その切断部位におけるタンデム停止コドンを含むように改変されていることを除
く）をコードするＤＮＡベクター（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂ）。ルシフ
ェラーゼレセプター遺伝子を含むプラスミドを、各トランスフェクションにおい
て含ませた（ｐＩＮＤ−ｌｕｃ）。トランスフェクション後、レポーター遺伝子
の転写を、１μＭのミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（エクジソン
アナログ）をトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。この
データを、実施例１に記載のように、トランスフェクトした細胞からの溶解物に
存在するルシフェラーゼ活性を測定することによって得た。
【図５】 図５は、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする漸増量のプラスミド
（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）または漸増量のコントロールプラスミド（ｐＳＲα）
を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ
−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果を示す。トランスフェクション後、レポ
ータープラスミドの転写を、１μＭのミュリステロンＡをトランスフェクトした
細胞に投与することによって誘導した。
（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）または漸増量のコントロールプラスミド（ｐＳＲα）
を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ
−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果を示す。トランスフェクション後、レポ
ータープラスミドの転写を、１μＭのミュリステロンＡをトランスフェクトした
細胞に投与することによって誘導した。
【図６】 図６は、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする漸増量のプラスミド
または漸増量のその不活性変異体（それぞれ、ｐＳＲαＮｓ３−４ＡまたはｐＳ
Ｒα３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ））を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲ
ＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果をグラ
フで示す。トランスフェクション後、レポーター遺伝子の転写を、１μＭのミュ
リステロンＡをトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。
または漸増量のその不活性変異体（それぞれ、ｐＳＲαＮｓ３−４ＡまたはｐＳ
Ｒα３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ））を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲ
ＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果をグラ
フで示す。トランスフェクション後、レポーター遺伝子の転写を、１μＭのミュ
リステロンＡをトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。
【図７】 図７は、１、３．３、１０、３３または１００μＭのいずれかのポナステロン
Ａ（エクジソンアナログ）を、ＨＣＶ−ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする
プラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）の存在下または非存在下でプラスミドｐＶ
ｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃで同時トランスフェクトした後の
ＣＯＳ細胞に投与した結果をグラフで示す。
Ａ（エクジソンアナログ）を、ＨＣＶ−ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする
プラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）の存在下または非存在下でプラスミドｐＶ
ｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃで同時トランスフェクトした後の
ＣＯＳ細胞に投与した結果をグラフで示す。
【図８】 図８は、ＤＭＳＯ寛容性を実証するコントロール実験の結果をグラフで示す。
プラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、ＨＣＶ−ＮＳ
３−４Ａプロテアーゼをコードするプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）ありま
たはなしで、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後
、レポータープラスミドの転写を、漸増濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）の存在下で５μＭのポナステロンＡを投与することによって誘導した。
プラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、ＨＣＶ−ＮＳ
３−４Ａプロテアーゼをコードするプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）ありま
たはなしで、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後
、レポータープラスミドの転写を、漸増濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）の存在下で５μＭのポナステロンＡを投与することによって誘導した。
【図９】 図９は、プラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ、ｐＩＮＤ−ＬｕｃおよびｐＳ
ＲαＮＳ３−４ＡをＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトし、次いで５μＭのポナ
ステロンＡおよび変動量のプロテアーゼインヒビター（ＶＨ−２５５３１）を投
与した結果をグラフで示す。
ＲαＮＳ３−４ＡをＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトし、次いで５μＭのポナ
ステロンＡおよび変動量のプロテアーゼインヒビター（ＶＨ−２５５３１）を投
与した結果をグラフで示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 9/99 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 130 Ｗａｖｅｒｌｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓ ｅｔｔｓ 02139−4242， Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 フック， トーマス アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02144， ソマービル， ナンバー２， リバティ アベニュー 36 (72)発明者 クウォン， アン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02138， ケンブリッジ， サンセット ロード 45 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 BA80 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QQ42 QQ79 QR16 QR32 QR55 QR62 QS05 QS34 QS36 4B064 AG01 AG20 AG21 CA10 CA19 CC24 DA13 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA51 DA56 EA55 FA74
Claims (27)
- 【請求項１】 以下を含む、融合タンパク質であって： ａ．プロテアーゼ切断部位； ｂ．リガンド結合ドメイン；および ｃ．ＤＮＡ結合ドメイン； ここで、該融合タンパク質とのリガンドの結合は、レポーター遺伝子に作動可
能に連結されたリガンド応答性エレメント（「ＬＲＥ」）への該融合タンパク質
の結合を媒介し；そして ここで、該融合タンパク質はまた、発現モジュレータードメインを含むか、ま
たは発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここで、
該発現モジュレータードメインは、該レポーター遺伝子の転写を調節する、 融合タンパク質。 - 【請求項２】 前記プロテアーゼ切断部位が、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ
によって認識される、請求項１に記載の融合タンパク質。 - 【請求項３】 前記プロテアーゼ切断部位が、ＨＩＶアスパルチルプロテア
ーゼによって認識される、請求項１に記載の融合タンパク質。 - 【請求項４】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ステロイド／甲状腺スーパーフ
ァミリーレセプターのＤＮＡ結合ドメインから選択される、請求項１に記載の融
合タンパク質。 - 【請求項５】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、エクジソンレセプター由来であ
り、そしてここで、該エクジソンレセプターは、ＤＮＡに結合し得るためにタン
パク質結合パートナーとの結合を必要とする、請求項１に記載の融合タンパク質
。 - 【請求項６】 前記ＤＮＡ結合ドメインが、そのＰ−ｂｏｘ領域が、配列番
号２４のアミノ酸配列を有するように改変される、請求項５に記載の融合タンパ
ク質。 - 【請求項７】 前記発現モジュレータードメインは、ＶＰ１６タンパク質の
活性化ドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。 - 【請求項８】 配列番号１８の配列を有する、請求項１に記載の融合タンパ
ク質。 - 【請求項９】 前記プロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列が、配列番号１〜
１０からなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。 - 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコ
ードする、ＤＮＡ分子。 - 【請求項１１】 前記ＤＮＡ配列が、配列番号１７である、請求項１０に記
載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載のＤＮＡ分子を含む、ベクタ
ー。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞
。 - 【請求項１４】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を生
成する方法であって、請求項１３に記載の宿主細胞を該融合タンパク質の発現を
引き起こす条件下で培養する工程を包含する、方法。 - 【請求項１５】 請求項１３に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、以
下： ａ．前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメインに結合するＬＲＥであって
、ここで、該結合は、リガンドの存在によって調節され、そして該融合タンパク
質のタンパク質結合パートナーの存在によって必要に応じて調節される、ＬＲＥ
； ｂ．該融合タンパク質の前記発現調節ドメインによって調節される、プロモー
ター；および ｃ．その発現が該プロモーターによって制御される、レポーター遺伝子 を含むＤＮＡ分子をさらに含む、宿主細胞。 - 【請求項１６】 前記プロモーターが、哺乳動物熱ショックプロモーターで
ある、請求項１５に記載の宿主細胞。 - 【請求項１７】 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である、
請求項１５に記載の宿主細胞。 - 【請求項１８】 請求項１５に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、前
記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメインを活性化するために必要なタンパク
質結合パートナーをコードするＤＮＡ分子をさらに含む、宿主細胞。 - 【請求項１９】 インビトロでプロテアーゼ活性をアッセイするための方法
であって、該方法は、以下の工程： ａ．インビトロ転写抽出物中の請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タン
パク質を、該融合タンパク質を前記プロテアーゼ切断部位で切断し得るプロテア
ーゼ、およびＤＮＡ分子と共にインキュベートする工程であって、ここで、該Ｄ
ＮＡ分子は、（ｉ）該融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメインに結合するＬＲ
Ｅ；（ｉｉ）該融合タンパク質の前記発現調節ドメインによって調節されるプロ
モーター；および（ｉｉｉ）その発現が該プロモーターによって制御される、レ
ポーター遺伝子を含み、ここで、該融合タンパク質の該プロテアーゼ切断部位は
、該プロテアーゼによって切断され得、該プロテアーゼの活性がアッセイされる
、工程； ｂ．該インキュベーションに該融合タンパク質と結合するリガンドを添加する
工程であって、ここで、該リガンドは、（ｉ）該ＬＲＥに結合するか、またはタ
ンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉｉ）該レポーター遺伝子の転写
を調節するために、該融合タンパク質に必要とされる、工程；ならびに ｃ．該レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物を定量する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２０】 細胞中のプロテアーゼ活性をアッセイするための方法であ
って、該方法は、以下の工程： ａ．請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク
質、および存在する場合には、前記タンパク質結合パートナーの発現を引き起こ
す条件下で培養する工程であって、ここで、該宿主細胞は、該アッセイされるプ
ロテアーゼを発現し、そしてここで、該融合タンパク質の前記プロテアーゼ切断
部位は、該プロテアーゼによって切断され得る、工程； ｂ．該宿主細胞培養物に、該融合タンパク質に結合し、そして該融合タンパク
質の活性を調節するリガンドを添加する工程であって、ここで、該リガンドは、
（ｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結される前記ＬＲＥに結合するか、また
はタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉｉ）該レポーター遺伝子の
転写を調節するために、該融合タンパク質に必要とされる、工程；ならびに ｃ．該レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物を定量する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２１】 プロテアーゼに対する、化合物の阻害活性を測定するため
の方法であって、該方法は、以下の工程： ａ．請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク
質の発現を引き起こす条件下で、該化合物の非存在下の第１の培養物中で培養す
る工程であって、ここで、該宿主細胞は、該アッセイされるプロテアーゼを発現
し、そしてここで、該融合タンパク質の前記プロテアーゼ切断部位は、該プロテ
アーゼによって切断され得る、工程； ｂ．工程ａで用いた該宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現を引き起こす条
件下、該化合物の存在下の第２の培養物中で培養する工程； ｃ．該第１および第２の宿主細胞培養物に、リガンドを添加する工程であって
、ここで、該リガンドは、（ｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結される前記
ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉ
ｉ）該融合タンパク質に結合する該レポーター遺伝子の転写を調節するために、
該融合タンパク質に必要とされる、工程；ならびに ｄ．該第１の宿主細胞培養物および該第２の宿主細胞培養物中の該レポーター
遺伝子から生成される遺伝子産物の量を比較する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、該方法は、以下のさら
なる工程： ａ．請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク
質の発現を引き起こす条件下で、第３の培養物中で培養する工程であって、そし
てここで、該宿主細胞は、該融合タンパク質における前記プロテアーゼ切断部位
を認識するプロテアーゼを発現しない、工程；および、工程ｄの一部として、 該宿主細胞培養物中の前記レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物の量を
、前記第１の宿主細胞培養物および前記第２の宿主細胞培養物中の前記レポータ
ー遺伝子から生成される遺伝子産物の量と比較する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２３】 同じ切断部位を認識する２つのプロテアーゼの活性を比較
する方法であって、該方法は、以下の工程： ａ．請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の第１の宿主細胞を、前記融合タ
ンパク質、および存在する場合には、前記タンパク質結合パートナーの発現を引
き起こす条件下で培養する工程であって、ここで、該第１の宿主細胞は、該融合
タンパク質の該プロテアーゼ切断部位を切断し得る第１のプロテアーゼを発現す
る、工程； ｂ．請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の第２の宿主細胞を、前記融合タ
ンパク質、および存在する場合には、前記タンパク質結合パートナーの発現を引
き起こす条件下で培養する工程であって、ここで、該第２の宿主細胞は、該融合
タンパク質の該プロテアーゼ切断部位を切断し得る第２のプロテアーゼを発現す
る、工程； ｃ．該第１および第２の宿主細胞培養物に、リガンドを添加する工程であって
、ここで、該リガンドは、（ｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結される前記
ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉ
ｉ）該レポーター遺伝子の転写を調節するために、該融合タンパク質に必要とさ
れる、工程；ならびに ｄ．該第１の宿主細胞培養物および該第２の宿主細胞培養物中の該レポーター
遺伝子から生成される遺伝子産物の量を比較する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２４】 前記第１のプロテアーゼおよび前記第２のプロテアーゼが
、ＨＩＶプロテアーゼの形態である、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 以下を含む、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキッ
ト： ａ．請求項１０または１１に記載のＤＮＡ分子、あるいは請求項１２に記載の
ベクター； ｂ．以下を含む、ＤＮＡ分子： ｉ．ａのＤＮＡ分子によってコードされる前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ
結合ドメインに結合され得る、ＬＲＥ； ｉｉ．ａのＤＮＡ分子によってコードされる該融合タンパク質の前記発現調
節ドメインによって調節され得る、プロモーター；および ｉｉｉ．その発現が該プロモーターによって制御される、レポーター遺伝子
； ｃ．リガンドであって、ここで、該リガンドは、（ｉ）レポーター遺伝子に作
動可能に連結される該ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに
結合して；そして（ｉｉ）該レポーター遺伝子の転写を調節するために、該融合
タンパク質に必要とされる、リガンド；ならびに ｄ．プロテアーゼ活性をアッセイするための該キットを使用するための説明書
。 - 【請求項２６】 前記ａ．のＤＮＡ分子および前記ｂ．のＤＮＡ分子の両方
が、宿主細胞中に存在する、請求項２５に記載のキット。 - 【請求項２７】 前記融合タンパク質のタンパク質結合パートナーをコード
するＤＮＡ分子または該ＤＮＡ分子を含むベクターをさらに含む、請求項２６に
記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/144,759 | 1998-08-31 | ||
| US09/144,759 US6117639A (en) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | Fusion proteins, DNA molecules, vectors, and host cells useful for measuring protease activity |
| PCT/US1999/019926 WO2000012727A1 (en) | 1998-08-31 | 1999-08-31 | Fusion proteins, dna molecules, vectors, and host cells useful for measuring protease activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002523102A true JP2002523102A (ja) | 2002-07-30 |
| JP4530387B2 JP4530387B2 (ja) | 2010-08-25 |
Family
ID=22510009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000567713A Expired - Fee Related JP4530387B2 (ja) | 1998-08-31 | 1999-08-31 | プロテアーゼ活性を測定するために有用な融合タンパク質、ｄｎａ分子、ベクター、および宿主細胞 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6117639A (ja) |
| EP (1) | EP1109920B1 (ja) |
| JP (1) | JP4530387B2 (ja) |
| AT (1) | ATE393228T1 (ja) |
| AU (1) | AU760441B2 (ja) |
| CA (1) | CA2341636C (ja) |
| DE (1) | DE69938600T2 (ja) |
| ES (1) | ES2306537T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000012727A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002542812A (ja) * | 1999-05-04 | 2002-12-17 | ベーリンガー インゲルハイム （カナダ） リミテッド | 代理細胞ベースシステム及びｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの活性を評価する方法 |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4080541B2 (ja) | 1996-10-18 | 2008-04-23 | バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | セリンプロテアーゼ、特にｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの阻害因子 |
| US20030109680A1 (en) * | 2001-11-21 | 2003-06-12 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| US5986065A (en) * | 1997-03-10 | 1999-11-16 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| US7749498B2 (en) * | 1997-03-10 | 2010-07-06 | Genentech, Inc. | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| US20060235209A9 (en) * | 1997-03-10 | 2006-10-19 | Jin-An Jiao | Use of anti-tissue factor antibodies for treating thromboses |
| WO1999005292A1 (fr) * | 1997-07-22 | 1999-02-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de criblage de genes utilisant les recepteurs nucleaires |
| US6884870B2 (en) * | 1998-03-20 | 2005-04-26 | California Institute Of Technology | Fusion proteins for identifying proteases, protease target sites and regulators of protease activity in living cells |
| US20040033600A1 (en) | 2001-03-21 | 2004-02-19 | Palli Subba Reddy | Ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
| SV2003000617A (es) | 2000-08-31 | 2003-01-13 | Lilly Co Eli | Inhibidores de la proteasa peptidomimetica ref. x-14912m |
| US8105825B2 (en) * | 2000-10-03 | 2012-01-31 | Intrexon Corporation | Multiple inducible gene regulation system |
| MXPA03007493A (es) | 2001-02-20 | 2004-10-15 | Rheogene Holdings Inc | Nuevo sistema de expresion genetica inducible a base de receptor de ecdisona/receptor x retinoide de invertebrado. |
| EP1373470B1 (en) | 2001-02-20 | 2013-04-24 | Intrexon Corporation | Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
| WO2002066615A2 (en) | 2001-02-20 | 2002-08-29 | Rheogene, Inc. | Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
| DK1572862T3 (da) | 2001-02-20 | 2012-11-26 | Intrexon Corp | Kimære, retinoide x-receptorer og deres anvendelse i et hidtil ukendt ecdysonrecepttorbaseret inducerbart genekspressionssystem |
| EP1421210A4 (en) * | 2001-07-31 | 2005-02-16 | Clontech Lab Inc | METHOD FOR DETECTING PROTEASE ACTIVITY IN ONE CELL |
| CN101684161A (zh) * | 2001-08-10 | 2010-03-31 | 阿赫姆生物系统公司 | 蛋白酶检测系统 |
| MXPA04002810A (es) * | 2001-09-26 | 2005-06-06 | Rheogene Holdings Inc | Acidos nucleicos receptores de ecdisona de saltarilla, polipeptidos, y sus usos. |
| US20030190705A1 (en) * | 2001-10-29 | 2003-10-09 | Sunol Molecular Corporation | Method of humanizing immune system molecules |
| JP2003180393A (ja) * | 2001-12-13 | 2003-07-02 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | レポータージーンアッセイ法 |
| EP1520010B1 (en) * | 2002-03-25 | 2007-11-07 | Applera Corporation | Systems and methods for detection of nuclear receptor function using reporter enzyme mutant complementation |
| EP1562897B1 (en) | 2002-11-12 | 2009-09-16 | Merck & Co., Inc. | Phenylcarboxamide beta-secretase inhibitors for the treatment of alzheimer s disease |
| US7304161B2 (en) | 2003-02-10 | 2007-12-04 | Intrexon Corporation | Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex |
| US7456315B2 (en) | 2003-02-28 | 2008-11-25 | Intrexon Corporation | Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
| WO2004085611A2 (en) * | 2003-03-21 | 2004-10-07 | The Research Foundation Of State University Of New York | Model for mutually exclusive domain folding molecular switch |
| WO2005004793A2 (en) * | 2003-06-19 | 2005-01-20 | Tanox Inc. | Compositions and methods for treating coagulation related disorders |
| CA2531698A1 (en) * | 2003-07-09 | 2005-01-27 | Sentigen Biosciences, Inc. | Method for assaying protein-protein interaction |
| US20070224615A1 (en) * | 2003-07-09 | 2007-09-27 | Invitrogen Corporation | Methods for assaying protein-protein interactions |
| TW201127828A (en) | 2003-09-05 | 2011-08-16 | Vertex Pharma | Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease |
| AU2004272114B2 (en) * | 2003-09-12 | 2010-11-04 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Animal model for protease activity and liver damage |
| JP2007535906A (ja) * | 2003-10-24 | 2007-12-13 | イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー | 直交遺伝子スイッチ |
| US20050214890A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-09-29 | Zhiqun Tan | Novel "Cleave-N-Read" system for protease activity assay and methods of use thereof |
| US7935510B2 (en) * | 2004-04-30 | 2011-05-03 | Intrexon Corporation | Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
| EP1797127B1 (en) | 2004-09-24 | 2017-06-14 | Amgen Inc. | Modified fc molecules |
| AU2006275413B2 (en) * | 2005-08-02 | 2012-07-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of serine proteases |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| US8399615B2 (en) | 2005-08-19 | 2013-03-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Processes and intermediates |
| AR055395A1 (es) | 2005-08-26 | 2007-08-22 | Vertex Pharma | Compuestos inhibidores de la actividad de la serina proteasa ns3-ns4a del virus de la hepatitis c |
| US7964624B1 (en) | 2005-08-26 | 2011-06-21 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of serine proteases |
| JP5436864B2 (ja) | 2006-02-27 | 2014-03-05 | バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | Ｖｘ−９５０を含む共結晶体およびそれを含む医薬組成物 |
| EP1993994A2 (en) * | 2006-03-16 | 2008-11-26 | Vertex Pharmceuticals Incorporated | Deuterated hepatitis c protease inhibitors |
| ES2379905T3 (es) | 2007-02-27 | 2012-05-04 | Vertex Pharmceuticals Incorporated | Co-cristales y composiciones farmacéuticas que los comprenden |
| NZ579295A (en) | 2007-02-27 | 2012-03-30 | Vertex Pharma | Inhibitors of serine proteases |
| JP2010537623A (ja) * | 2007-03-27 | 2010-12-09 | クリストファー ホーヴェンス | 前立腺癌を治療する方法及び組成物 |
| CL2008002549A1 (es) * | 2007-08-30 | 2010-09-03 | Vertex Pharma | Cocristal que comprende vx-950 y un formador de cocristal seleccionado de acido 3-metoxi-4hidroxibenzoico,acido 2,4-dihidroxibenzoico y acido 2,5-dihidroxibenzoico; metodo de preparacion; composicion farmaceutica que comprende el cocristal, util como agente antiviral en el tratamiento del hcv. |
| NZ712167A (en) | 2013-03-15 | 2018-05-25 | Intrexon Corp | Boron-containing diacylhydrazines |
| JP6567657B2 (ja) | 2014-09-17 | 2019-08-28 | イントレキソン コーポレーション | ホウ素含有ジアシルヒドラジン化合物 |
| KR20200080749A (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 n-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991016436A1 (en) * | 1990-04-13 | 1991-10-31 | Schering Corporation | Novel protease assays |
| WO1996037609A1 (en) * | 1995-05-26 | 1996-11-28 | Zeneca Limited | A gene switch comprising an ecdysone receptor |
| WO1997038117A1 (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0421109A3 (en) * | 1989-09-11 | 1992-01-08 | American Cyanamid Company | Screening methods for protease inhibitors |
| US5599906A (en) * | 1990-04-13 | 1997-02-04 | Schering Corporation | Protease assays |
| WO1993001305A1 (en) * | 1991-07-09 | 1993-01-21 | Robert Balint | A method for the identification of protease inhibitors |
| US5413914A (en) * | 1993-07-07 | 1995-05-09 | The Regents Of The University Of Colorado | Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases |
| US5861267A (en) * | 1995-05-01 | 1999-01-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity |
| WO1998041866A1 (en) * | 1997-03-14 | 1998-09-24 | Merck & Co., Inc. | A high throughput assay using fusion proteins |
-
1998
- 1998-08-31 US US09/144,759 patent/US6117639A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-31 DE DE69938600T patent/DE69938600T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-31 WO PCT/US1999/019926 patent/WO2000012727A1/en active IP Right Grant
- 1999-08-31 EP EP99968247A patent/EP1109920B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-31 JP JP2000567713A patent/JP4530387B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-31 ES ES99968247T patent/ES2306537T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-31 CA CA2341636A patent/CA2341636C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-31 AU AU60234/99A patent/AU760441B2/en not_active Ceased
- 1999-08-31 AT AT99968247T patent/ATE393228T1/de not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-12 US US09/570,267 patent/US6528276B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-11-20 US US10/300,757 patent/US20030083467A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991016436A1 (en) * | 1990-04-13 | 1991-10-31 | Schering Corporation | Novel protease assays |
| WO1996037609A1 (en) * | 1995-05-26 | 1996-11-28 | Zeneca Limited | A gene switch comprising an ecdysone receptor |
| WO1997038117A1 (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002542812A (ja) * | 1999-05-04 | 2002-12-17 | ベーリンガー インゲルハイム （カナダ） リミテッド | 代理細胞ベースシステム及びｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの活性を評価する方法 |
| JP4782927B2 (ja) * | 1999-05-04 | 2011-09-28 | ベーリンガー インゲルハイム （カナダ） リミテッド | 代理細胞ベースシステム及びｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの活性を評価する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1109920A1 (en) | 2001-06-27 |
| US6117639A (en) | 2000-09-12 |
| DE69938600D1 (de) | 2008-06-05 |
| ATE393228T1 (de) | 2008-05-15 |
| AU760441B2 (en) | 2003-05-15 |
| ES2306537T3 (es) | 2008-11-01 |
| DE69938600T2 (de) | 2009-06-10 |
| CA2341636C (en) | 2010-12-21 |
| WO2000012727A1 (en) | 2000-03-09 |
| EP1109920B1 (en) | 2008-04-23 |
| CA2341636A1 (en) | 2000-03-09 |
| AU6023499A (en) | 2000-03-21 |
| US20030083467A1 (en) | 2003-05-01 |
| JP4530387B2 (ja) | 2010-08-25 |
| US6528276B1 (en) | 2003-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1109920B1 (en) | Fusion proteins useful for measuring protease activity | |
| US5217867A (en) | Receptors: their identification, characterization, preparation and use | |
| Verrijdt et al. | Selective DNA recognition by the androgen receptor as a mechanism for hormone-specific regulation of gene expression | |
| Casanova et al. | Functional evidence for ligand-dependent dissociation of thyroid hormone and retinoic acid receptors from an inhibitory cellular factor | |
| US5906920A (en) | Methods for the detection of ligands for retinoid X receptors | |
| US7060490B1 (en) | DNA encoding novel estrogen receptor | |
| Ohno et al. | The Drosophila Nuclear Receptors FTZ-Flα and FTZ-F1β Compete as Monomers for Binding to a Site in the fushi tarazu Gene | |
| US5262300A (en) | Receptors: their identification, characterization, preparation and use | |
| CA2174416A1 (en) | Methods for screening for regulators of intracellular receptor transcription using progesterone receptor a subtype | |
| JPH09504111A (ja) | Ｇａｌ４−受容体構築体の新規な使用 | |
| US6458926B1 (en) | Heterodimer complex of RXR and NURR1 or NGFI-B | |
| AU639699B2 (en) | Dominant negative members of the steroid/thyroid superfamily of receptors | |
| Uppaluri et al. | Genetic dissection of thyroid hormone receptor β: identification of mutations that separate hormone binding and transcriptional activation | |
| US5602009A (en) | Dominant negative chimeras of the steroid/thyroid superfamily of receptors | |
| Sarlis et al. | Quantity of partial agonist activity for antiglucocorticoids complexed with mutant glucocorticoid receptors is constant in two different transactivation assays but not predictable from steroid structure | |
| EP1544307A1 (en) | LAC9 chimeric receptor and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060828 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090529 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090828 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091008 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091225 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100107 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100205 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100215 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100305 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100312 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100329 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100602 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100607 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130618 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |