ES2306537T3 - Proteinas de fusion utiles para medir la actividad de una proteasa. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que comprende: (a) un sitio de escisión de la proteasa objetivo; (b) un dominio de unión de ligando; y (c) un dominio de unión de ADN; en la que la asociación de un ligando con dicha proteína de fusión media la unión de la proteína de fusión a un elemento de respuesta al ligando ("ERL") operativamente unido a un gen indicador; en la que dicho sitio de escisión de proteasa de dicha proteína de fusión se puede escindir de modo que ninguno de los fragmentos de la proteína de fusión resultantes sea capaz de modular la expresión de dicho gen indicador; y en la que la proteína de fusión también comprende un dominio modulador de expresión o se asocia con una segunda proteína que tiene un dominio modulador de expresión, en la que dicho dominio modulador de expresión regula la transcripción de dicho gen indicador; y en la que dicho sitio de escisión de la proteasa objetivo está situado en el dominio de unión de ADN o en el dominio modulador, si está presente, o entre cualquiera de los dominios de dicha proteína de fusión.
Description
Proteínas de fusión útiles para medir la
actividad de una proteasa.
La invención se refiere a proteínas de fusión,
moléculas de ADN que codifican las proteínas de fusión, vectores
que comprenden las moléculas de ADN, células hospedantes
transformadas con los vectores, y a métodos y kits para usarlos
para determinar la actividad de una proteasa. Específicamente, la
invención se refiere a una proteína de fusión que tiene un sitio de
escisión de proteasa, un dominio de unión de ligando, un dominio de
unión de ADN, en la que (1) la asociación de un ligando con el
dominio de unión de ligando de dicha proteína de fusión media la
unión del dominio de unión de ADN de dicha proteína de fusión a un
elemento de respuesta al ligando ("ERL") que está
operativamente unido a un gen indicador, en la que dicho sitio de
escisión de proteasa de dicha proteína de fusión se puede escindir
de modo que ninguno de los fragmentos de la proteína de fusión
resultantes sea capaz de modular la expresión de dicho gen
indicador, y en la que (2) la proteína de fusión comprende un
dominio modulador de expresión o se asocia con una segunda proteína
que tiene un dominio modulador de expresión, en la que dicho
dominio modulador de expresión regula la transcripción del gen
indicador y en el que dicho sitio de escisión de proteasa objetivo
está situado en el dominio de unión de ADN o en el dominio
modulador si está presente, o entre cualquiera de los dominios de
dicha proteína de fusión. La invención también se refiere a kits
para ensayar moléculas de ADN que comprenden actividad de proteasa,
que codifican las proteínas de fusión, a un ligando adecuado y a
moléculas de ADN que comprenden una construcción de gen
indicador-promotor y al menos un ERL reconocido por
el dominio de unión de ADN de la proteína de fusión. Las moléculas
de ADN en estos kits se pueden aislar o pueden estar presentes en
células hospedantes.
Las proteasas tienen una función importante en
la regulación de procesos biológicos prácticamente en todas las
formas de vida desde bacterias a virus y a mamíferos. Realizan
funciones críticas, por ejemplo, en la digestión, coagulación de la
sangre, apoptosis, activación de respuestas inmunitarias, activación
de zimógeno, maduración vírica, secreción de proteínas y tráfico de
proteínas.
Las proteasas se han implicado como la causa o
que contribuyen en varias enfermedades tales como la enfermedad de
Alzheimer, fibrosis quística, enfisema, hipertensión, invasión
tumoral y metástasis y enfermedades asociadas con virus [p. ej.,
Kim, T.W., et al., (1997) "Alternative Cleavage of
Alzheimer-associated Presinilins During Apoptosis
by a Caspase-3 Family Protease", Science
277:373-6; Lacana, E. et al., (1997)
"Disassociation of Apoptosis and Activation of
IL-i beta-converting
Enzyme/Ced-3 Proteases by ALG-2 and
the Truncated Alzheimer's gene ALG-3", J.
immunol. 158:5129-35; Birrer, P., (199.5)
"Proteases and Antiproteases in Cystic Fibrosis: Pathogenic
Considerations and Therapeutic Strate gies", Respiration
62:25-8; Patel, T., et al., (1996) "The
Role of Proteases During Apoptosis", FASEB J.
10:587-97].
Varios genomas víricos también codifican
proteasas que son importantes en los procesos de maduración víricos.
Por ejemplo, la aspartil proteasa vírica del virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) escinde un polipéptido del VIH que
contienen las poliproteínas Gag y Pol.
En otro ejemplo, el virus de la hepatitis C
(VHC) produce un producto de traducción polipeptídico largo,
NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH,
que se escinde para producir al menos 10 proteínas. C, E1 y E2 son
proteínas estructurales putativas, y el resto se conocen como
proteínas no estructurales (NS). Una de estas proteínas es NS3, una
proteína de 70 kilodalton que tiene actividad de serina proteasa.
Se ha mostrado que la actividad de proteasas de NS3 reside
exclusivamente en los 180 aminoácidos N-terminales
de la enzima. La proteasa NS3 escinde en cuatro sitios en la región
no estructural del polipéptido del VHC (3/4A, 4A/4B, 4B/5A y
5A/5B). Otra proteína, NS4A, tiene 54 aminoácidos y se ha
caracterizado como un cofactor para la proteasa NS3 [C. Failla,
et al., (1994) J. Virology
68:3753-3760]. Los 33 aminoácidos
C-terminales de NS4A son necesarios para la escisión
en el sitio 3/4A y los sitios 4B/5A y acelera la velocidad de
escisión en el sitio 5A/5B. Se han identificado otras varias
secuencias de sitios de escisión dependientes de la serina proteasa
NS3 en diferentes cepas del VHC [A. Grakoui, et al., (1993)
J. Virology 67: 2832-2843].
La capacidad para detectar la actividad de
proteasa vírica, celular o de microorganismo en un ensayo rápido y
sencillo es importante en la caracterización bioquímica de estas
proteasas, en la detección de infección vírica y en el cribado e
identificación de potenciales inhibidores. El documento WO 91/16436
describe una proteína reguladora híbrida que comprende un péptido
de unión del ADN, un péptido conector susceptible de escisión por
una proteasa específica y un péptido modificador de la transcripción
del ADN. Dicha proteína híbrida se usa en procedimientos de ensayo
de proteasas.
El documento WO 96/37609 describe una proteína
de fusión que comprende un dominio de unión de ligando unido a un
miembro de la superfamilia de receptores de esteroides de insecto,
un dominio de unión de ADN y un dominio de transactivación. La
escisión del receptor de esteroides separa el dominio de unión de
ligando y los fragmentos resultantes no pueden modular la expresión
de un gen indicador que es dirigida por el dominio de
transactivación de la proteína de fusión del documento WO
96/37609.
El documento 97/38117 describe una construcción
de sistema de ADN-expresión de mamífero inducible
que comprende un gen endógeno controlado por el elemento de
respuesta a la ecdisona.
Se conocen varios ensayos de proteasas en la
técnica. T.A. Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88, pp. 5159-62 (1991); B. Dasmahapatra
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,
pp.4159-62 (1992); y M.G. Murray et al.,
Gene, 134, pp. 123-128 (1993), describen cada
uno sistemas de ensayo de proteasas que usan la proteína GAL4 de
levadura. Cada uno de estos documentos describe la inserción de un
sitio de escisión de proteasa entre el dominio de unión de ADN y el
dominio de activación transcripcional de GAL4. La escisión de este
sitio por una proteasas coexpresada hace que GAL4 sea
transcripcionalmente inactiva conduciendo a la incapacidad de la
levadura transformada de metabolizar la galactosa.
Y. Hirowatari et al., Anal.
Biochem., 225, pp. 113-120 (1995) describen un
ensayo para detectar la actividad de proteasa del VHC. En este
ensayo, el sustrato, la proteasa del VHC y un gen indicador se
cotransfectan en células COS. El sustrato es una proteína de fusión
que consiste en (NS2 de VHC)-(DHFR)-(sitio de escisión de NS3 de
VHC)-Tax1. El gen indicador está controlado por
cloranfenicol-acetil-transferasa
(CAT) controlado por la repetición terminal larga (RTL) de
HTLV-1 y reside en el núcleo de la célula después de
la expresión. El sustrato no escindido es expresado como una
proteína de unión a membrana sobre la superficie del retículo
endoplásmico debido a la parte NS2 del VHC. Tras la escisión, la
proteína Tax1 liberada se trasloca al núcleo y activa la expresión
de CAT por unión a la RTL de HTLV-1. La actividad de
proteasa se determina midiendo la actividad de CAT en el lisato
celular.
Todos los ensayos descritos antes requieren (1)
la expresión simultánea de una proteasa activa y un sustrato, y (2)
la transcripción de una construcción de gen indicador. La naturaleza
constitutiva de estos ensayos a menudo puede producir efectos
incontrolables e indeseables. Estos efectos pueden dar lugar a
conclusiones engañosas o imprecisas en relación con la actividad de
la proteasa. Por lo tanto, se necesita un ensayo de proteasas
sensible y cuantitativo que sea inducible o pueda ser controlado
fácilmente por el usuario.
La presente invención satisface esta necesidad
al proporcionar nuevas proteínas de fusión, moléculas de ADN que
las codifican, vectores que comprenden las moléculas de ADN y
células hospedantes que contienen los vectores útiles en un ensayo
transcripcional dependiente de ligando de proteína de fusión para
determinar la actividad de proteasa.
La nueva proteína de fusión comprende un sitio
de escisión de proteasa, un dominio de unión de ligando, un dominio
de unión de ADN, en la que (1) la asociación de un ligando con el
dominio de unión de ligando de dicha proteína de fusión media la
unión del dominio de unión de ADN de dicha proteína de fusión a un
ERL que está operativamente unido a un gen indicador, en la que
dicho sitio de escisión de proteasa de dicha proteína de fusión
puede ser escindido de modo que ninguno de los fragmentos de la
proteína de fusión resultantes sea capaz de modular la expresión de
dicho gen indicador; y en la que (2) la proteína de fusión comprende
un dominio modulador de expresión o se asocia con una segunda
proteína que tiene un dominio modulador de expresión, en la que
dicho dominio modulador de expresión regula la transcripción del gen
indicador y en la que dicho sitio de escisión de proteasa objetivo
está situado dentro del dominio de unión de ADN o dentro del dominio
modulador si está presente, o entre cualquiera de los dominios de
dicha proteína de fusión.
De acuerdo con los métodos de esta invención, la
unión de un ligando al dominio de unión de ligando de la proteína
de fusión no escindida inicia la activación o represión de la
transcripción del gen indicador en un punto de tiempo discreto.
Esta capacidad de inducción permite que el ensayo se controle mejor
y por lo tanto, produce resultados más precisos.
La escisión de la proteína de fusión en el sitio
de escisión de proteasa desregula la transcripción del gen
indicador previniendo que el dominio modulador de la expresión
module la transcripción favoreciéndola o reduciéndola. La cantidad
de proteína de fusión escindida se cuantifica ensayando un aumento o
disminución de la transactivación de un gen indicador, cuya
expresión está dirigida por un promotor que es modulado por el
dominio modulador de expresión de la proteína de fusión.
Esta invención también se refiere a un método
para medir la actividad inhibidora de un compuesto frente a una
proteasa, que comprende las etapas de incubar la proteína de fusión
con una proteasa en presencia o ausencia de un compuesto cuya
actividad se va a ensayar, añadir un ligando a la incubación y
cuantificar el producto génico producido por un gen indicador.
Otra realización más de esta invención se
refiere a un método para comparar la actividad de dos proteasas o
mutantes de una proteasa que reconocen el mismo sitio de
escisión.
La invención también se refiere a kits para
ensayar la actividad de proteasa que comprende moléculas de ADN que
codifican la proteína de fusión, la proteína de fusión o células
hospedantes que contienen moléculas de ADN, en el que el kit
opcionalmente incluye moléculas de ADN que codifican una proteasa,
moléculas de ADN que comprenden un gen indicador cuya expresión es
regulada por dicha proteína de fusión, un ligando que se asocia y
regula la actividad de dicha proteína de fusión e instrucciones para
usar dicho kit. Preferiblemente, las moléculas de ADN en el kit se
han diseñado en un vector que permite su expresión. Un kit de
acuerdo con esta invención, puede comprender una cualquiera o todas
las siguientes moléculas de ADN transformadas en una célula
hospedante individual, seleccionada del grupo que consiste en una
molécula de ADN que codifica una proteína de fusión de esta
invención, una molécula de ADN que codifica una proteasa, una
molécula de ADN que codifica una pareja de unión a la proteína para
la proteína de fusión y una molécula de ADN que comprende una
construcción génica de promotor-indicador. Las
realizaciones descritas antes también están caracterizadas en las
reivindicaciones.
La figura 1 representa la estructura de los
vectores pVgRXR, pVgRXR-5A/5B y
pVgRXR-5A(parada)5B. La barra inversa
situada entre la cisteína y la serina de la proteína codificada
pVgRxR-5A/5B indica donde se producirá la escisión.
Los dos asteriscos cerca del sitio de escisión de la proteína
codificada VgRXR-SA(parada)5B indica
la situación de los dos codones de parada.
La figura 2 representa la estructura de un
vector de ADN que codifica la proteasa NS3-4A del
VHC, pSR\alpha-NS3-4A.
La figura 3 representa la estructura de un
vector de control pIND y un vector indicador para la expresión de
luciferasa inducible por ecdisona, pIND-luc. El
término "5XE/GRE" se refiere a los elementos de respuesta a
ecdisona/glucocorticoide. El término "P\DeltaHSP" se refiere
al promotor mínimo de choque térmico. El término "BGH pA" se
refiere a la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento
bovina.
La figura 4 representa en una gráfica los
resultados de los experimentos de transfecciones en células COS con
uno de los siguientes: (1) un vector de ADN que codifica una
proteína receptora RXR de mamífero y una proteína de fusión que
comprende el dominio de unión de ADN del receptor de ecdisona de
Drosophila fusionado con el dominio de activación de la
proteína VP16 del virus herpes símplex (pVgRXR); (2) un vector de
ADN que codifica una proteína receptora RXR y una proteína de
fusión que comprende el dominio de unión de ADN del receptor de
ecdisona de Drosophila fusionado con el sitio de escisión
proteolítica 5A/5B del VHC fusionado con el dominio de activación
de la proteína VP16 (pVgRXR-5A/5B); y (3) un vector
de ADN que codifica una proteína receptora de RXR y una proteína de
fusión como se ha descrito antes, excepto que el ADN que codifica el
sitio de escisión 5A/5B está modificado para contener codones de
parada en tándem en el sitio de escisión
(pVgRXR-5A(parada)5B). Se incluía un
plásmido que comprende un gen indicador de luciferasa en cada
transfección (pIND-luc). Después de la
transfección, se indujo la transcripción del gen indicador por
administración de muristerona A 1 \muM (un análogo de ecdisona) a
las células transfectadas. Los datos se obtuvieron midiendo la
actividad de luciferasa presente en los lisatos de las células
transfectadas como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 5 representa los resultados de la
cotransfección de plásmidos pVgRXR-5A/5B y
pIND-luc en células COS con cantidades crecientes
de un plásmido que codifica la proteasa NS3-4A de
VHC (pSR\alphaNs3-4A) o un plásmido de control
(pSR\alpha). Después de la transfección, se indujo la
transcripción del plásmido indicador por administración de
muristerona A 1 \muM a las células transfectadas.
La figura 6 representa en una gráfica los
resultados de la cotransfección de plásmidos
pVgRXR-5A/5B y pIND-luc en células
COS con cantidades crecientes de un plásmido que codifica la
proteasa NS3-4A de VHC o un mutante inactivo de la
misma (pSR\alphaNs3-4A o
pSR\alphaNs3-4A(S1165A), respectivamente).
Después de la transfección, se indujo la transcripción del plásmido
indicador por administración de muristerona A 1 \muM a las células
transfectadas.
La figura 7 representa en una gráfica los
resultados de administrar ponasterona A (un análogo de ecdisona) 1,
3,3, 10, 33 o 100 \muM a células COS después de la transfección
con plásmidos pVgRXR-5A/5B y
pIND-luc en presencia o ausencia de un plásmido que
codifica la proteasa NS3-4A de VHC
(pSR\alphaNs3-4A).
La figura 8 representa en una gráfica los
resultados de un experimento de control que demuestra la tolerancia
al DMSO. Se cotransfectaron plásmidos pVgRXR-5A/5B
y pIND-luc en células COS con o sin un plásmido que
codifica la proteasa NS8-4A de VHC
(pSR\alphaNs3-4A). Después de la transfección, se
indujo la transcripción del plásmido indicador por administración
de ponaterona A 5 \muM en presencia de concentraciones crecientes
de dimetilsulfóxido (DMSO).
La figura 9 representa en una gráfica los
resultados de la cotransfección de plásmidos
pVgRXR-5A/5B, pIND-luc y
pSR\alphaNs3-4A en células COS y después
administración de ponasterona A 5 \muM y cantidades que varían de
un inhibidor de proteasa (VH-25531).
La presente invención proporciona nuevas
herramientas y métodos para medir la actividad de proteasa. La
actividad de una proteasa se mide usando una nueva proteína de
fusión como un sustrato en un ensayo transcripcional en el que la
transcripción es activada o reprimida en un punto de tiempo discreto
por adición de un ligando después de incubar juntos una proteasa y
una proteína de fusión de esta invención.
La presente invención proporciona una proteína
de fusión como se describe en esta memoria.
Un sitio de escisión de proteasa (en lo sucesivo
"SEP") de acuerdo con esta invención, es un péptido incorporado
en la secuencia primaria de la proteína de fusión de esta
invención. Puede estar situado en cualquiera del dominio de unión
de ADN, dominio de unión de ligando, u opcionalmente, el dominio
modulador de la expresión, si existe uno, de la proteína, así como
entre cualesquiera dos de estos dominios.
La presencia del sitio de escisión en la
proteína no debe interferir sustancialmente con la actividad del
dominio de unión de ADN de la proteína de fusión, dominio de unión
de ligando, o, si está presente, el dominio modulador de
expresión.
Para asegurar que el sitio de escisión de la
proteasa no interfiere sustancialmente con la actividad de los
dominios anteriores de la proteína de fusión, la actividad de la
proteína de fusión con el SEP se puede comparar con la actividad de
la misma proteína de fusión sin el SEP por ensayos de desplazamiento
en gel para evaluar la unión de ADN o por ensayo transcripcional
(p. ej Latchman, (1995) Eukaryotic Transcription Factors, 2nd Ed.
Academic Press: London).
Además, el sitio de escisión de proteasa debe
diseñarse en la proteína de fusión de modo que cuando se escinde
ninguno de los fragmentos de la proteína de fusión resultantes sea
capaz de modular la expresión de un gen objetivo o indicador.
Preferiblemente, sólo hay un sitio de escisión
de proteasa objetivo situado en la proteína de fusión sustrato.
De acuerdo con una realización preferida, el
sitio de escisión de proteasa está situado entre el dominio de
unión de ADN y el dominio modulador efector de la proteína de
fusión.
En una realización preferida de esta invención,
el SEP tiene una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de
procesamiento/escisión de proteasa en las poliproteínas gag y
gag/pol del VIH o en la poliproteína del VHC. En una realización
más preferida de esta invención el sitio SEP del VIH se selecciona
del grupo que consiste en los ID Sec Nº 1-10 [S.
Pichuantes, et al., (1S89) "Recombinant HIV1 Protease
Secreted by Saccharomyces cervisiae Correctly Processes
Myristylated gag Polyprotein", Proteins: Structure, Function,
and Genetics 6:324-337].
En una realización más preferida de esta
invención, el SEP tiene una secuencia de aminoácidos de un sitio de
escisión para la serina proteasa NS3 del VHC o la aspartil proteasa
del VIH. En una realización todavía más preferida de esta
invención, el SEP tiene una secuencia de aminoácidos de un sitio de
escisión de proteasa 5A/5B del VHC. En una realización todavía más
preferida de esta invención, el sitio de escisión de proteasa 5A/5B
es el ID Sec Nº 10.
La siguiente parte de la proteína de fusión de
esta invención es el dominio de unión de ligando (en lo sucesivo
"DUL"). El DUL es un dominio peptídico que se une a un ligando,
en el que dicha unión de ligando es necesaria para que dicha
proteína de fusión (1) se una a un ERL, en el que el elemento está
operativamente unido a un gen indicador; y/o (2) se una a una
pareja de unión de proteína como una etapa temporal que precede a la
unión del complejo de pareja de unión a
proteína-proteína de fusión resultante al ERL. Por
lo tanto, la unión del ligando al dominio de unión de ligando de la
proteína de fusión es necesaria para la regulación transcripcional
de la expresión de dicho gen indicador.
Los dominios de unión de ligando adecuados para
usar en esta invención se pueden obtener de dominios de unión de
ligando de factores de transcripción que inician o reprimen la
transcripción tras la unión del ligando. Dichos factores de
transcripción incluyen receptores de hormona [Freedman, L.P., 1998,
"Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors",
Progress in Gene Expression, Boston: Birkhauser; Tsai,
M-J., 1994, "Mechanism of Steroid Hormone
Regulation of Gene Transcription". Molecular Biology
Intelligence Unit, Austin: R.G. Landes Co.; Eggert, M. et
al., "The Glucocorticoid Hormone Receptor", Inducible
Gene Expression, vol. 2 (1995) Birkhauser: Boston,
Massachusetts. Ed. P.A. Baeuerle. pp. 131-156;
Piedrafita, P.J. and M. Pfahl, "The Thyroid Hormone
Receptors", Inducible Gene Expression, vol. 2 (1995)
Birkhauser: Boston, Massachusetts. Ed. P.A. Baeuerle. pp.
157-185; Keaveney M. y H.G. Stunnenberg, "Retinoic
Acid Receptors", Inducible Gene Expression, vol. 2 (1995)
Birkhauser: Boston, Massachusetts. Ed. P.A. Baeuerle. pp.
187-242)]; factores de transcripción sensibles a
carbohidratos; genes de metalotioneína (MT); receptores huérfanos;
factores de transcripción inducibles por tetraciclinas; factores de
transcripción inducibles por IPTG; receptores de dioxina; y
receptores de hidrocarburo arílico].
En una realización preferida de esta invención,
el dominio de unión de ligando se obtiene de los dominios de unión
de ligando de la superfamilia de receptores de hormonas
esteroideas/tiroideas. Las secuencias de aminoácidos que codifican
los dominios de unión de ligando del receptor esteroideo y nuclear
son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, S; Simons, (1998)
"Structure and Function of the Steroid and Nuclear Receptor
Ligand Binding Domain", Molecular Biology of Steroid and
Nuclear Hormone Receptors: Progress in Gene Expression,
Birkhauser: Bostn, MA.].
En una realización más preferida, el dominio de
unión de ligando se obtiene de un receptor de ecdisona.
En otra realización de esta invención, se puede
modificar un dominio de unión de ligando de un factor de
transcripción en la proteína de fusión de esta invención, de modo
que se una a un ligando diferente. Por ejemplo, un dominio de unión
de ligando de receptor de progesterona humano se puede mutar de modo
que sea capaz de unir el compuesto antiprogesterona RU486 (Wang,
Y., et al., (1997) "Positive and Negative Regulation of
Gene Expression in Eukaryotic Cells with an Inducible
Trariscriptional Regulator", Gene Ther.
4:432-41).
Dicha proteína de fusión con dominio de unión de
ADN GAL4 inducible por RU486 está contemplada para usar en esta
invención.
Un dominio de unión de ADN (en lo sucesivo
"DUA") se refiere a una secuencia de péptido en la proteína de
fusión de acuerdo con esta invención, que reconoce y se une a una
secuencia de nucleótidos específica (p. ej., un elemento de ADN o
un ERL). Los dominios de unión de ADN útiles de acuerdo con esta
invención se pueden obtener de dominios de unión de ADN de
proteínas de unión de ADN, tales como factores de transcripción.
En una realización preferida, estas proteínas de
unión de ADN son factores de transcripción que unen directamente
ADN e inician o reprimen la transcripción. Dichos factores de
transcripción son conocidos en la técnica [McKhight, S.L. y K.R.
Yamamoto, 1992, "Transcriptional Regulation", Cold Spring
Harbor Monograph Series, Plainview, New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press; Latchman, D.S., 1995, Eukaryotic Transcription
Factors, San Diego: Academic Press, 2.ed.; Latchman, D.S.,
1993, "Transcription Factors: A Practical Approach", The
Practical Approach Series, New York: IRL Press at Oxford
University Press; Papavassiliou, A., (1997) "Transcription
Factors in Eukaryotes", Molecular Biology Intelligence
Unit, New York: Chapman & Hall; Eckstein, F., and D.M.J.
Lilley, 1997, "Mechanisms of Transcription", Nucleic Acids
and Molecular Biology, Vol. 11, New York: Springer-
Verlag].
Verlag].
Los dominios de unión de ADN preferidos
contemplados para usar en esta invención incluyen los dominios de
unión de ADN de los siguientes factores de transcripción: proteínas
homosecuencia, proteínas de dedo de cinc (Sluyser, M., 1993, Zinc
Finger Proteins in Oncogenesis: DNA Binding and Gene Regulation, New
York: New York Academy of Sciences), proteínas de
hélice-vuelta-hélice, proteínas de
hélice-bucle-hélice (p. ej.,
Littlewood, Trevor D., 1998,
Helix-Loop-Helix Transcription
Factors, 3rd. Ed., New York: Oxford University Press), proteínas de
cremallera de leucina (p. ej., Hurst, H.C., 1996, Leucine Zippers:
Transcription Factors, 3rd. ed., San Diego: Academic Press),
proteína GAL4, receptores de hormona, receptores huérfanos, y
factores de transcripción de E. coli, tales como el represor
del operón de lactosa, transactivador controlado por tetraciclina, y
FadR.
La presente invención también contempla el uso
de los DUA de proteínas de unión a ADN que unen metales que regulan
la transcripción de genes de metalotioneína (MT). Dichas proteínas
de unión de ADN que unen metales incluyen MTF-1,
ACE1 y AMT1. [Heuchel, R., et al., "Transcriptional
Regulation by Heavy Metals, Exemplified at the Metallothionein
Genes", Inducible Gene Expression, vol. 1 (1995)
Birkhauser: Boston, Massachusetts. Ed. P.A. Baeuerle. pp.
206-240.]
En una realización más preferida de esta
invención, el dominio de unión de ADN se obtiene de un miembro de
la superfamilia de receptores esteroideos/tiroideos. Los miembros de
la superfamilia de receptores esteroideos/tiroideos son conocidos
en la técnica como proteínas de unión a hormonas que funcionan como
factores de transcripción dependientes de ligando. Incluyen
miembros identificados de la superfamilia de receptores
esteroideos/tiroideos para los que todavía no se han identificado
ligandos naturales específicos (denominados en esta memoria como
"receptores huérfanos") [B.M. Forrnan, (1998) "Orphan Nuclear
Receptors and Their Ligands", Molecular Biology of Steroid
and Nuclear Hormone Receptors, L.P. Freedman, Ed., Birhauser:
Boston, pp. 281-305].
Los miembros de los receptores huérfanos útiles
en esta invención incluyen HNF4, la familia de receptores COUP y
receptores de tipo COUP, receptores activados por el proliferador de
peroxisoma (PPAR), receptores knirps y relacionados con knirps
derivados de insectos, y diferentes isoformas de los mismos.
Las secuencias de aminoácidos que codifican
dichos DUA son conocidas en la técnica [F. Rastjinejad, (1998)
"Structure and Function of the Steroid and Nuclear Receptor DNA
Binding Domains", Molecular Biology of Steroid and Nuclear
Hormone Receptors: Progress in Gene Expression Birkhauser:
Boston, MA.].
Como el DUL usado en las proteínas de fusión de
esta invención, los dominios de unión de ADN de esta invención se
pueden modificar a partir de la secuencia presente en el factor de
transcripción original de modo que reconozca un ERL diferente. Por
ejemplo, la secuencia de aminoácidos del dominio de unión de ADN de
un miembro de la familia de esteroides/tiroides se puede modificar
de modo que el dominio de unión de ADN se una a un ERL reconocido
por otro miembro de la familia de esteroides/tiroides. Por ejemplo
la modificación de la secuencia de aminoácidos
"secuencia-P" de un miembro de la familia de
esteroides/tiroides, es decir, una región en el dominio de unión de
ADN que normalmente está situado en la unión del primer dedo de cinc
y la región conectora, está contemplada en esta invención (Umesono
et al., (1989) Cell 57:1139-1146, en
particular la Figura 2 y la Tabla 1).
En una realización preferida, el dominio de
unión de ADN se obtiene del receptor de ecdisona de
Drosophila, en el que la secuencia-P del
receptor de ecdisona que tiene la secuencia de aminoácidos EGCKG (ID
SEC Nº: 23) se sustituye por la secuencia de aminoácidos GSCKV (ID
SEC Nº: 24). La nueva secuencia secuencia-P GSGKV
hace que el receptor de ecdisona reconozca el ERL -AGAACA- en lugar
del ERL -AGGTCA-.
Los miembros de la superfamilia de receptores
esteroideos/tiroideos que son particularmente útiles para
proporcionar el DUL y/o DUA de una proteína de fusión de esta
invención, incluyen los receptores esteroideos tales como el
receptor glucocorticoide (GR), el receptor mineralocorticoide (MR),
el receptor de estrógenos (ER), el receptor de progesterona (PR)
tal como hPR-A o hPR-B, el receptor
de andrógenos (AR), el receptor de vitamina D3 (VDR); receptores de
retinoides tales como receptores de ácido retinoico (p. ej.,
RAR\alpha, RAR\beta o RAR\gamma) y receptores de retinoide X
(p. ej., RXR\alpha, RXR\beta o RXR-\gamma);
receptores tiroideos (TR) tales como TR\alpha y TR\beta;
receptores derivados de insectos tales como los receptores de
ecdisona; e isoformas de los mismos.
De acuerdo con una realización preferida, una
proteína de fusión de esta invención contiene un dominio de unión
de ADN que se diseña cerca o al lado de un dominio de unión de
ligando, y ninguno de los dos dominios contiene un SEP ni hay un
SEP situado entre los dos dominios.
Un componente opcional de la proteína de fusión
de esta invención es un dominio modulador de expresión. Como se ha
expuesto antes, si el dominio modulador de expresión no está
presente en la proteína de fusión, debe estar presente en una
proteína que se asocie con la proteína de fusión.
Los dominios moduladores de expresión
contemplados para usar en esta invención, sea como parte de la
proteína de fusión o una proteína separada que se asocia con la
proteína de fusión, normalmente se obtienen de proteína de unión de
ADN, tales como factores de transcripción. Se sabe en la técnica,
que estas secuencias activan o reprimen la transcripción, a través
de su interacción con otros factores de transcripción necesarios
para la transcripción.
En realizaciones en las que el dominio modulador
de la expresión está presente en una segunda proteína que se une a
la proteína de fusión, esta segunda proteína no debe aumentar o
disminuir la transcripción en ausencia de una proteína de fusión de
esta invención y su ligando. En realizaciones en las que el dominio
modulador de expresión está presente en la proteína de fusión,
preferiblemente está situado en el extremo opuesto a la
localización del dominio de unión de ADN.
En una realización preferida de esta invención,
el dominio modulador de expresión activa la transcripción en
contraposición a la represión de esta actividad. Dichos dominios de
activación incluyen las regiones N-terminales que
codifican los dominios de activación en la superfamilia de
receptores esteroideos/tiroideos, los dominios de activación de los
factores de transcripción víricos, el dominio de activación GCN4 de
levadura o el dominio de activación GAL4 [K. Struhl, "Yeast GCN4
Transcriptional Activator Protein", Transcriptional
Regulation, Eds, S.L. Mcknight and K.R. Yamamoto, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1992), pp. 833-859; A.A.F.
Gann et al., "GAL11, GAL11P, and the Action of GAL4",
Transcriptional Regulation, Eds. S.L. McKnight and. K.R.
Yamamoto, Gold Spring Harbor Laboratory Press (1992), pp.
931-946; K.J. Martin and M.R, Green,
"Transcriptional Activation by Viral
immediate-Early Proteins: Variations on a Common
Theme", Transcriptional Regulation, Eds. S.L. McKnight
and K.R. Yamamoto, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992), pp.
695-725].
En otra realización preferida, el dominio
modulador de la expresión es parte de la proteína de fusión. Es
incluso más preferido cuando el dominio modulador de expresión es el
dominio de activación N-terminal de la proteína
VP16.
Debe entenderse que no es necesario que el
dominio de unión de ligando, dominio de unión de ADN y dominio
modulador de expresión, procedan del mismo factor de
transcripción.
Por ejemplo, se puede hacer una quimera que
comprenda el dominio de unión de ADN del receptor de ácido retinoico
y el dominio de unión de ligando del receptor de vitamina D (VDR)
(Pemrick, S., et al., (1998) "Characterization of the
Chimeric Retinoic Acid Receptor RARa/VDR", Leukemia
12:554-562) o una quimera que comprende el dominio
de unión de ADN Jun que se puede fusionar con el dominio de unión de
ligando del receptor de estrógenos y el dominio de activación del
modulador de expresión (Kruse, U., et al., (1997)
"Hormone-regulatable Neoplastic Transformation
Induced by a Jun-Estrogen Receptor Chimera",
PNAS USA 94:12396-12400).
Otros ejemplos incluyen el dominio de unión de
ADN lacR y el dominio de activación de VP16. Esto crea una
proteína de fusión que requiere que IPTG se una al ERL, lacO
[Labow, M. et al., (1990) Mol. Cell. Biol.
10:3343-3356]. En otro ejemplo, la fusión de la
proteína tetR y el dominio de activación de VP16 crea una
proteína de fusión que se libera del ERL, tetO, en presencia
de tetraciclinas en células y en animales transgénicos [Gossen, M.
y H. Bujard, (1992) "Tight Control of Gene Expression in Mammalian
Cells by Tetracycline-Responsive Promoters",
PNAS USA 89: 5547-5551; Furth, P.A., et
al., (1994) "Temporal Control of Gene Expression in
Transgenic Mice by a Tetracycline-Responsive
Promoter", PNAS USA 89:9302-9306], Una
proteína de fusión tetR-VP16 de acuerdo con esta
invención puede contener un sitio de escisión de proteasa en su
dominio de unión de ADN de modo que la unión de ADN se elimina
cuando se escinde el SEP. Por lo tanto, tras la adición de
tetraciclina, la proteína de fusión no escindida continuará
transactivándose a partir de tetO, mientras que las
proteínas de fusión serían inactivas.
Una realización preferida de esta invención es
la fusión del dominio de activación de VP16 del virus herpes
símplex, el dominio de unión de ligando de un miembro de la
superfamilia de receptores esteroideos/tiroideos y el DUA de un
miembro de la superfamilia de receptores esteroideos/tiroideos. En
una realización más preferida, el miembro de la superfamilia de
receptores esteroideos/tiroideos es el receptor de ecdisona.
Como se ha descrito antes, la invención también
contempla proteínas de fusión que requieren el contacto con una
pareja de unión a la proteína "PUP" con el fin de unir el ADN o
aumentar la especificidad de unión o afinidad de unión de la
proteína de fusión a su ERL. Así pues, una pareja de unión a la
proteína de acuerdo con esta invención es una proteína que se une a
una proteína de fusión de esta invención y aumenta la afinidad o
especificidad de unión del dominio de unión de ADN de la proteína
de fusión a un ERL específico. La pareja de unión a la proteína es
una proteína que también se une a un elemento de ADN particular que
está operativamente unido al gen indicador. Si la proteína de
fusión de esta invención requiere una pareja de unión a la proteína
para aumentar la afinidad o especificidad de la unión de ADN,
entonces es conveniente asegurar que la proteína de fusión incluye
un dominio de dimerización para la interacción con la PUP.
Las parejas de unión a la proteína que pueden
ser adecuadas para interaccionar con los dominios de dimerización
de las proteínas de fusión de esta invención se conocen en la
técnica [p. ej., T.D. Littlewood and G.I. Evan (1998)
"Structure/Function Relationships of HLH Proteins",
Helix-Loop-Helix Transcription
Factors, 3rd. Ed., New York: Oxford University Press, pp.
27-41; Hurst, H.C., 1996, Leucine Zippers:
Transcription Factors, 3rd. ed., San Diego: Academic Press, pp.
27-29; y L.P. Freedman, Ed., (1998) Molecular
Biology of Steroid an Nuclear Hormone Receptors: Progress in
Gene Expression, Birkhauser: Boston, MA.].
Por ejemplo, en la técnica se conocen varias
parejas heterodímeras de factores de transcripción de
hélice-bucle-hélice básicos (bHLH)
[Littlewood, Trevor D., 1998,
Helix-Loop-Helix Transcription
Factors, 3rd. Ed., New York: Oxford University Press) pp.
37-41]. En un ejemplo más específico, los factores
de transcripción de bHLH tales como los receptores de dioxina
dependientes de ligando y receptores de hidrocarburo arílico (AHR)
heterodimerizan con la proteína de translocación nuclear AHR (ARNT)
[Whitelaw, M.L. et al., (1994) "Identification of
Transactivation and Repression Functions of the Dioxin Receptor and
Its Basic Helix-Loop-Helix/PAS
Partner Factor Arnt: Inducible Versus Constitutive Modes of
Regulation", Mol. Cell. Bio.
14:8343-8355].
Otro ejemplo es la familia de receptores
esteroideos/tiroideos que tiene la capacidad de heterodimerizar
entre sí o con otros miembros de la familia de receptores
esteroideos/tiroideos (p. ej., Rhee, et al., (1995)
"Retinoid X-Receptor-alpha and
Apolipoprotein Al Regulatory Protein 1 Differentially Modulate
3,5,3'-Triiodothyronine-Induced
Transcription", Endocrinology
136:2697-704; Li, et al. (1997)
"Coexpression of Nuclear Receptors Partners Increases Their
Solubility and Biological Activities", PNAS USA
94:2278-83).
Otro ejemplo más son los factores bZIP que
heterodimerizan con otras varias proteínas [p. ej., H.C. Hurst,
Leucine Zippers: Transcription Factors, 3rd Ed. London: Academic
Press, (1996), page, 28].
Dichos heterodímeros y homodímeros que
comprenden una proteína de fusión de esta invención están
contemplados.
En una realización preferida de esta invención,
un receptor de ecdisona modificado por secuencia-P
heterodimeriza con el RXR de mamífero.
Una proteína de fusión de esta invención para
usar en los ensayos de transcripción celular debe localizarse en el
núcleo de la célula hospedante. Una señal de localización nuclear
que ya está presente en un dominio de una proteína de fusión de
esta invención puede proporcionar la señal de localización nuclear.
Alternativamente, se puede diseñar una señal de localización
nuclear conocido en la técnica, en la proteína de fusión para
asegurar la localización celular [p. ej., D.B. DeFranco, (1998)
"Subcellular and Subnuclear Trafficking of Steroid Receptors",
Molecular Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors:
Progress in Gene Expression, Birkhauser: Boston, MA;
Guiochon-Mantel A, et al., (1996) "The
Ernst Schering Poster Award. Intracellular Traffic of Steroid
Hormone Receptors", J. Steroid Biochem. Mol. Biol.
56:3-9].
En una realización alternativa de los métodos de
la invención, la proteína de fusión carece de un dominio de unión
de ligando.
Específicamente, en esta realización, la
proteína de fusión comprende (1) un dominio de unión de ADN y (2)
un sitio de escisión de proteasa. En estos métodos, la actividad
transcripcional de la proteína de fusión es inducible por
alteración de la temperatura del entorno de transcripción o causando
estrés a las células en las que se va a producir el suceso de
transcripción. Por ejemplo, la unión de alta afinidad de un factor
de choque térmico ("HSF") a su elemento de respuesta, HSE,
depende de un estímulo de choque término. [p. ej., J. Lis y G. Wu,
"Heat Shock Factor", Transcriptional Regulation, Eds.
S.L. McKnight y K.R. Yamamoto, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1992), pp. 907-930; D.S. Latchman, "Transcription
Factors and Inducible Gene Expression;" Eukaryotic
Transcription Factors, 2nd Ed. London: Academic Press Limited,
(1995) pp. 71-78.]
Se puede diseñar un sitio de escisión de
proteasa de interés en la proteína HSF de modo que la actividad de
transcripción de la proteína de fusión HSF escindida sea menor o
sea despreciable comparado con la proteína de fusión HSF no
escindida después del estímulo térmico.
El uso de las proteínas de fusión, moléculas de
ADN y vectores de esta invención contemplados por los métodos de
esta invención, incluyen las reacciones de transcripción celular e
in vitro.
Los métodos para llevar a cabo los ensayos de
transcripción en células son conocidos. [p. ej., R. White y M.
Parker, "Analysis of Cloned Factors", Transcription Factors:
A Practical Approach, Ed. D.S. Latchman, IRL Press: Oxford
(1993) pp. 145-152; F.M. Ausubel et al., Eds.
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Associates & Wiley-lnterscience: New York
(1991); Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
Brevemente, se introducirán en una célula el ADN que codifica la
proteína de fusión de esta invención, un plásmido indicador, una
proteasa y opcionalmente una segunda proteína que tiene un dominio
modulador de expresión. Después, la actividad transcripcional de la
proteína de fusión se inducirá por adición de un ligando o alterando
el entorno de la célula (p. ej., cambiando la temperatura del
entorno de la célula). La cantidad de ARNm, la cantidad de proteína
indicadora o la actividad de la proteína indicadora se medirán
usando técnicas convencionales conocidas en la materia. Se puede
comparar la transcripción en ausencia de proteasa con la
transcripción en presencia de proteasa.
Los métodos para llevar a cabo las reacciones de
transcripción in vitro también son conocidos. [Sierra, F.,
et al., "In vitro Transcription with Nuclear
Extracts from Differentiated Tissues", Gene Transcription: A
Practical Approach (1993) Oxford University Press, Walton
Street, Oxford. Ed. D. Hames y S. Higgins., pp.
1.25-152; Snoek, R. et al., (1996)
"Induction of Cell-Free, In Vitro
Transcription by Recombinant Androgen Receptor Peptides", J.
Steroid Biochem. Molec. Biol. 59;
243-250; Dignam, J.D., et al., (1992)
"Preparation of Nuclear and Cytoplasmic Extracts from Mammalian
Cells", en Current Protocols in Molecular Biology (Ed.
por F.A. Ausubel et al.) John Wiley and Sons; New York pp.
12.1.1-12.1.9.; Klein-Hitpass, L.,
et al., (1990) "The Progesterone Receptor Stimulates
Cell-Free Transcription by Enhancing the Formation
of a Stable Preinitiation Complex", Cell
60:247-257].
Brevemente, se prepararán extractos celulares
preparados por protocolos que han mostrado sostener las reacciones
de transcripción in vitro. Se añadirán las proteínas
purificadas o parcialmente purificadas al extracto celular junto
con un plásmido indicador. Dichas proteínas purificadas o
parcialmente purificadas, tales como la proteína de fusión de esta
invención se pueden producir por la sobreexpresión en una célula en
la que se ha introducido el ADN que codifica la proteína de fusión,
p. ej. células SF9 por infección por baculovirus, células de
plantas, células de levaduras, células de mamíferos y células
bacterianas. También se pueden preparar proteínas tales como la
proteasa, y opcionalmente, la segunda proteína que tiene un dominio
modulador de expresión y/o una pareja de unión a la proteína, a
partir de sus fuentes originales usando métodos conocidos en la
técnica para purificarlas.
Después, se inducirá la actividad
transcripcional de la proteína de fusión por adición de un ligando.
La cantidad de ARNm producido, la cantidad de proteína indicadora
producida o la actividad de la proteína indicadora se medirán
usando técnicas convencionales conocidas en la materia. La
transcripción en presencia de proteasa se puede comparar con la
transcripción en ausencia de proteasa.
La invención también proporciona un método para
cribar compuestos que inhiban la actividad de proteasa. Se puede
añadir un compuesto que se vaya a cribar al mismo tiempo que se
añade el ligando, o se puede añadir durante la expresión/incubación
iniciales de la proteasa con una proteína de fusión. El nivel óptimo
de compuesto necesario para lograr la mayor inhibición de la
proteasa se puede determinar por valoración del compuesto.
La invención también proporciona un método para
comparar la actividad de dos proteasas que reconocen el mismo sitio
de escisión de proteasa. El método es útil para comparar la
actividad de proteasas mutantes y no mutantes, p. ej., aspartil
proteasas de VIH de pacientes.
La invención también proporciona un método para
comparar la actividad de una proteasa frente a diferentes sitios de
escisión de proteasa. Este método es útil para determinar la
especificidad del sustrato en una proteasa dada.
La invención también proporciona kits para
evaluar la actividad de proteasa. Si el kit se va a usar en un
ensayo de transcripción in vitro de un gen indicador,
entonces puede comprender un extracto de transcripción in
vitro, un vector como se ha descrito antes que contiene un gen
indicador, un suministrador de ligando e instrucciones.
Opcionalmente, puede proporcionar una proteína de fusión de esta
invención, una segunda proteína que comprende un dominio modulador
de expresión, y/o una proteasa expresada de una fuente que incluye
bacterias, células de insecto, células de mamífero y levadura.
Si el kit se va a usar en un ensayo de
transcripción celular, el kit puede incluir una secuencia de ADN que
codifica una proteína de fusión de esta invención y un vector que
codifica un plásmido indicador como se ha descrito antes, un
ligando que se asocia y regula la actividad de dicha proteína de
fusión codificada por la secuencia de ADN de la proteína; e
instrucciones para usar dicho kit para ensayar la actividad de
proteasa.
Las proteasas que son particularmente útiles en
los métodos de esta invención son proteasas que contribuyen a los
síntomas o al inicio de la enfermedad. Por ejemplo, las proteasas
implicadas en la digestión, coagulación de la sangre, apoptosis,
activación de respuestas inmunitarias, activación de zimógeno,
maduración vírica, secreción de proteínas y tráfico de proteínas.
En una realización de la invención, las proteasas de interés son
las implicadas en la enfermedad de Alzheimer, fibrosis quística,
enfisema, hipertensión, invasión tumoral y metástasis y
enfermedades asociadas con virus. De acuerdo con una realización
preferida de esta invención, las proteasas son la aspartil proteasa
del VIH, proteasa NS3 del VHC, y sus fragmentos activos o proteínas
de fusión.
En una realización de esta invención, una
cualquiera o todas las moléculas de ADN que codifican las proteínas
de fusión, PUP, proteasas y proteínas segundas que comprenden el
dominio modulador de expresión, se pueden modificar más para
proporcionar una secuencia de polipéptido adicional para facilitar
la purificación o identificación de la expresión de la proteína.
Por ejemplo, dichas secuencias de polipéptidos pueden incluir un
epítopo para unir un anticuerpo, una parte Fc de un anticuerpo para
unir perlas de proteína A, glutatión S-transferasa,
proteína de unión a maltosa, His(n), FLAG y marcador Strep.
Estos marcadores seleccionables son todos conocidos en la técnica y
están totalmente disponibles para el experto en la técnica.
Varios vectores útiles para la sobreexpresión de
proteínas de esta invención están disponibles en el comercio o son
conocidos para la expresión en levaduras, células de insectos,
bacterias, levaduras, células de plantas y células de
mamíferos.
Las células hospedantes de acuerdo con los
métodos de esta invención son conocidas en la técnica. Si se va a
estudiar la actividad de una proteasa exógena, es conveniente que la
célula hospedante no exprese niveles altos de proteasas exógenas
que reconozcan el o los sitios de escisión de la proteasa a la que
se dirige. Las células hospedantes adecuadas pueden incluir células
CHO; células HeLa; células hepáticas; células CV-1;
células P19; células NT2/D1; células L de ratón; células de riñón de
mono verde africano, tales como células COS-7 u
otras células COS; células de riñón embrionario humano, tales como
HEK 293; células DG44, células Itk, células NIH 3T3 y células de
levadura. Las células hospedantes pueden ser líneas celulares
transfectadas de forma transitoria o transformadas de forma
estable. En una realización preferida de esta invención, las
células hospedantes son células COS o células de una línea celular
hepática.
Los ligandos adecuados para usar en los métodos
de esta invención son conocidos en la técnica. Los ligandos deben
unirse a los dominios de unión de ligando de los factores de
transcripción a partir de los cuales se han obtenido los dominios
de unión de ligando de las proteínas de fusión, o a sus dominios de
unión de ligando modificados (véase antes). Preferiblemente, el
ligando no potencia o reprime sustancialmente la transcripción a
partir del promotor salvo que un ERL para la proteína de fusión sea
religado o insertado en un vector que comprende un promotor y un
gen indicador, en el que el ERL está unido a un promotor de una
forma que hace que la actividad transcripcional del promotor sea
operativamente sensible al ligando.
La elección del ligando para usar dependerá
necesariamente del dominio de unión del ligando de la proteína de
fusión que se use. Por ejemplo, los ligandos adecuados para usar con
proteínas de fusión con ADN que se une a metal pueden incluir cinc,
cadmio y cobre.
Por ejemplo, los ligandos adecuados para usar
con proteínas de fusión de unión a esteroide o unión a esteroide
modificado, pueden incluir andrógenos, glucocorticoide,
mineralocorticoides, hormonas tiroideas, estrógeno, progesterona,
progestágeno, ácido retinoico, vitamina D3,
20-hidroxi-ecdisona, ponasterona A,
26-yodoponasterona A, muristerona A, inokosterona,
26-mesil-inokosterona, mifepristona
(RU 486) y sus análogos.
Tal como se usa en esta memoria, andrógenos
incluye dihidroxitestosterona y sus análogos incluyendo
metiltrienolona.
Tal como se usa en esta memoria, hormonas
glucocorticoides incluye cortisol, hidrocortisona y corticosterona
y sus análogos, incluyendo dexametasona, desoxicorticoesterona y
triamcinolon-acetónido.
Tal como se usa en esta memoria,
mineralcorticoides incluye aldosterona, corticosterona y
desoxicorticosterona.
Tal como se usa en esta memoria, hormonas
tiroideas incluye tiroxina (T4) y triyodotironina (T3).
Tal como se usa en esta memoria, estrógenos
incluye estradiol-17 beta, y sus análogos incluyendo
dietilestilbestrol.
Tal como se usa en esta memoria, progestágenos
incluyen análogos de progesterona incluyendo promegestona.
Los ligandos adecuados para las proteínas de
fusión inducibles por tetraciclinas incluyen la tetraciclina y sus
análogos.
Los ligandos adecuados para proteínas de fusión
inducibles por carbohidratos incluyen arabinosa, lactosa e
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
(IPTG).
Los ligandos adecuados para proteínas de fusión
inducibles por hidrocarburos arílicos incluyen la dioxina.
Los ligandos adecuados para receptores huérfanos
incluyen los siguientes: ácido fiténico, ácido
9-cis-retinoico y LG100268 para el
receptor RXR; 8S-HETE y Wy 14.643 para el receptor
PPAR\alpha;
15-desoxi-\Delta^{12,14}-PGJ2
y BRL 49653 para el receptor PPAR\gamma; ácido linoleico y
carbaprostaciclina para el receptor PPAR\delta; farnesol para el
receptor FXR; y 24(S),25-epoxicolesterol
para el receptor LXR. [B.M. Forman, (1998) "Orphan Nuclear
Receptors and Their Ligands", Molecular Biology of Steroid and
Nuclear Hormone Receptors, L.P. Freedman, Ed., Birhauser:
Boston, pp. 281-305.]
Los ERL y los elementos de
ADN-PUP en esta invención son moléculas de ácido
nucleico que proporcionan sitios de unión de ADN para las proteínas
de fusión y las parejas de unión a la proteína, respectivamente.
Ambos elementos deben unirse operativamente a un promotor para
controlar la activación o represión de la transcripción de un gen
indicador. La frase "operativamente unido" se refiere a la
unión de una molécula de ácido nucleico (p. ej., un gen indicador
que codifica una proteína indicadora) a un ERL y un elemento de
ADN-PUP (si la unión de la PUP es necesaria para la
transcripción) y a secuencias de control de transcripción de una
forma tal que la molécula de ácido nucleico pueda ser expresada
cuando se introduce (p. ej., transfectada, transformada,
transducida, conjugada o por recombinación o por infección) en una
célula hospedante.
Las secuencias de control de transcripción son
secuencias que controlan el inicio, elongación y terminación de la
transcripción. Son secuencias de control de la transcripción
particularmente importantes aquellas que controlan el inicio de la
transcripción tales como el promotor. Preferiblemente, el promotor
es un promotor mínimo. La expresión "promotor mínimo" se
pretende que describa una secuencia parcial de promotor que define
el sitio de inicio de la transcripción para la secuencia unida que
va a ser transcrita, pero que por sí misma no sea capaz de iniciar
la transcripción de forma eficaz, o nada en absoluto, en
determinados entornos celulares. Por lo tanto, la actividad de
dicho promotor mínimo depende de la unión de una proteína de fusión
de esta invención.
En una realización preferida, el promotor mínimo
es del promotor de choque térmico de drosophila y el ERL objetivo
para la proteína de fusión es AGAACA generado como se describe en el
documento PCT/US97/05330.
Los ERL de acuerdo con esta invención deben ser
operativos para conferir sensibilidad a un ligando. En otra
realización, los elementos de ADN que se unen a las PUP de esta
invención también pueden ser sensibles al ligando, si la PUP usada
es una proteína de unión de ligando. La elección del ERL y el
elemento de ADN (cuando sea necesario) y la disposición de esos
elementos uno con respecto al otro, dependerá de la proteína de
fusión o la PUP usados. Por ejemplo, si el dominio de unión de ADN
de la proteína de fusión es de una proteína de
hélice-bucle-hélice-básica,
el ERL probablemente comprenderá el hexámero de ADN consenso CANNTG
(llamado también "secuencia-E") (p. ej.,
Littlewood et al., véase antes, página 31).
Se conocen los sitios de unión de ADN preferidos
(es decir, ERL y elementos de ADN) para muchos factores de
transcripción. [DJ. Mahgelsdorf and R.M; Evans, (1992) "Retinoid
Receptors as Transcription Factors", Trariscriptional
Regulation, Eds. S..L McKnight y K.R. Yamamoto, pp.
1137-1167; LP. Freedman, Ed., (1998) Molecular
Biology of Steroid and Nuclear Hormone Receptors; Progress
in Gene Expression, Birkhauser: Boston, MA., pp.
111-113; y documento PCT/US97/05330].
El promotor que controla la expresión de las
proteínas de fusión, las PUP y las proteasas en una célula de
mamífero pueden ser constitutivos, tales como el promotor del
citomegalovirus (CMV), el promotor temprano de SV40 y el promotor
del virus de sarcoma de Rous (RSV). Para un mayor control, la
proteína de fusión, las PUP y las proteasas pueden estar
controladas por un promotor inducible. Es conveniente que el
promotor inducible no sea el mismo que el promotor que dirige la
transcripción del gen indicador.
Los genes indicadores útiles de acuerdo con los
métodos de esta invención son conocidos en la técnica. Dichos genes
indicadores incluyen el gen de la luciferasa, gen de la proteína
fluorescente verde (documento US 5.491.084),
b-galactosidasa, gen de la fosfatasa alcalina
segregada y el gen de
cloranfenicol-acetil-transferasa. La
invención también contempla los genes indicadores que codifican una
proteína marcadora con una secuencia señal para la secreción fuera
de la célula, tal como el gen de IL-1 beta.
Los vectores que contienen el gen indicador
operativamente unido a un ERL y un elemento de ADN (es decir, el
plásmido indicador) se pueden preparar a partir de materiales
disponibles en la técnica. Dichos plásmidos indicadores
preferiblemente incluyen también, por ejemplo, lo siguiente: un
origen de replicación y un marcador o marcadores seleccionables. El
plásmido indicador también puede incluir opcionalmente otras
secuencias de ADN, tales como repeticiones terminales largas
("RTL"), para producir la inserción del vector en el genoma de
una línea
celular.
celular.
Los vectores adecuados para expresar las
proteínas de fusión, las PUP, proteínas que tienen un dominio
modulador de expresión o proteasas, en bacterias o células de
mamíferos, son conocidos en la técnica. Dichos vectores pueden
incluir, por ejemplo, lo siguiente: un origen de replicación, un
marcador seleccionable y secuencias de control de transcripción
tales como un promotor y una secuencia de poliadenilación. Por lo
tanto, las proteínas de fusión, las PUP, las proteínas que tienen
dominios moduladores de expresión y las proteasas deben estar
operativamente unidos a un promotor constitutivo o inducible como se
ha descrito antes. Los vectores se pueden construir de modo que dos
o más de las siguientes proteínas: la proteína de fusión, la
proteasa y opcionalmente la PUP y/o la proteína que tiene el
dominio modulador de expresión (si es necesaria para la función de
la proteína de fusión), están presentes en el mismo vector. La
transcripción de estos genes puede estar controlada por los mismos
o diferentes promotores. Por ejemplo, cada gen puede estar
controlado por un promotor inducible diferente o cada gen puede
estar controlado por el mismo promotor constitutivo.
El plásmido indicador y los vectores para
expresar las proteínas de fusión, las PUP, las proteasas y las
segundas proteínas que comprenden el dominio modulador de
expresión, pueden comprender dos marcadores seleccionables, uno que
confiera crecimiento en células procariotas tales como bacterias y
uno que confiera crecimiento en células eucariotas tales como
levaduras, células de mamíferos o de plantas, en presencia de
compuestos específicos. Los marcadores seleccionables útiles en
esta invención pueden conferir resistencia a fármacos tales como
ampicilina, kanamicina, higromicina, neomicina o G418.
En una realización preferida de esta invención,
el vector codifica la proteína de fusión que tiene la secuencia de
ADN del ID Sec Nº 19. En otra realización preferida de esta
invención, se usa un vector que codifica la proteína de fusión que
tiene la secuencia de ADN ID Sec Nº 21, como control. En una
realización preferida de esta invención, el plásmido indicador se
obtiene de pIND de Invitrogen.
Si los vectores y los plásmidos indicadores se
van a usar en un ensayo transcripcional en una célula, se pueden
introducir en las células hospedantes por técnicas conocidas en la
materia tales como transfección, lipofección, citofección,
bombardeo con perlas de partículas, microinyección o infección
vírica [p. ej., F.M. Ausubel y col., Eds. Current Protocols in
Molecular Biology, Greene Publishing Associates &
Wiley-lnterscience: New York (1991); Sambrook et
al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press
(1989)].
(1989)].
En el caso de infección vírica, el ADN de
interés se puede clonar en un vector vírico entre dos RTL
retrovíricas, usado para generar retrovirus, e infectar células con
el virus. Otros virus útiles de acuerdo con esta invención incluyen
adenovirus, virus adenoasociados, y virus vaccinia.
Los métodos para ensayar la presencia de un
producto de gen indicador son conocidos en la técnica. Por ejemplo,
son conocidos los métodos para ensayar el ARNm resultante de la
transcripción del gen indicador [Sambrook et al., (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Lab. Press: Plainview, New York), 2nd Ed.; Eds. F.M. Ausubel et
al., (1991) Current Protocols In Molecular Biology (John
Wiley & Sons: New York, 5th Ed.]. También se conocen los
métodos para ensayar la proteína codificada por el gen indicador y
los kits disponibles de las empresas para determinar los mismos (p.
ej. Promega).
A lo largo de esta memoria descriptiva y las
reivindicaciones, la palabra "comprender" o variaciones tales
como "comprende" o "que comprende", se entenderá que
implican la inclusión de un número entero o grupo de números
enteros expuestos, pero no la exclusión de cualquier otro número
entero o grupo de números enteros.
Con el fin de que la invención descrita en esta
memoria se entienda de forma más completa, se exponen los
siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen sólo propósitos
ilustrativos y no deben considerarse limitantes de esta invención
de ninguna forma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El plásmido pVgRXR se obtuvo de Invitrogen.
pVgRXR es un vector de 8728 pb que expresa tanto un receptor de
ecdisona modificado (VgEcR) como un receptor de retinoide X (RXH)
para formar un receptor nuclear heterodímero (Figura 1). La
transcripción del gen de VgEcR está dirigida por el promotor
temprano inmediato del citomegalovirus (CMV). La transcripción del
gen de RXR está dirigida por el promotor del virus del sarcoma de
Rous (RSV). Las líneas celulares estables que expresan los genes se
pueden hacer por selección con el antibiótico Zeocina^{TM}. La
información del producto respecto a las características y el
mantenimiento del vector pVgRXR y el kit del sistema de ecdisona,
se incorporan por referencia del manual técnico de Invitrogen.
Los plásmidos pIND se obtuvieron de Invitrogen
(Figura 3). El plásmido pIND es un vector de 5024 pb basado en el
vector pcDNA3.1. Tiene cinco ERL híbridos, es decir, cinco elementos
de respuesta a ecdisona/glucocorticoide (ERE/G) y el promotor
mínimo de choque térmico. Los ERE/G pueden ser reconocidos por un
receptor de ecdisona modificado expresado por pVgRXR. El plásmido
pIND-Luc se hizo haciendo digerir el gen de
luciferasa fuera de otro plásmido, incluyendo su secuencia Kozak y
el sitio de inicio de metionina, y clonándolo en el policonector de
pIND, es decir, secuencia abajo del promotor mínimo de choque
térmico (Figura 3). Ambos plásmidos tienen genes de resistencia a
la neomicina y la ampicilina con propósitos de selección. La
información del producto respecto a las características y el
mantenimiento de los vectores pIND y pIND-Luc, se
incorporan por referencia del manual técnico de Invitrogen.
El plásmido de expresión de mamífero pSR\alpha
se ha descrito en la técnica. [Y. Takebe et al., Mol.
Cell. Biol., 8, pp. 466-72 (1988)]. El plásmido
contiene un sistema promotor compuesto del promotor temprano del
virus de simio 40 (SV40) y el segmento R y parte de la secuencia U5
(R-U5') de la repetición terminal larga del virus
de leucemia de células T de tipo 1 (HTLV-1). El
plásmido también contiene una unión de religación 16S, una señal de
poliadenilación de SV40 y un gen de resistencia a la ampicilina. La
secuencia potenciadora/promotora de RTL de HTV dirige un nivel alto
de expresión de genes clonados secuencia abajo. Los genes de interés
se pueden clonar en los sitios Pst I y EcoRI situados en 3'
respecto a la unión de religación 16S.
El cebador VP16/5A5BF (ID Sec Nº 12) es un
oligonucleótido de 28 bases diseñado para hibridar con un sitio Xba
I secuencia arriba de la región de codificación de VP16 del plásmido
pVgRXR.
El cebador VP16/5A5BR (ID Sec Nº 13) es un
oligonucleótido de 86 bases diseñado para hibridar en parte con la
cadena antisentido en la región 3' del ADN que codifica el dominio
de activación de VP16 del plásmido pVgRXR. El cebador también
comprende los nucleótidos complementarios a las secuencias que
codifican el sitio de escisión 5A/5B de la proteasa
NS3-4A del VHC y un sitio Xba I.
El cebador VP16/5A**5BR (ID Sec Nº 14) es un
oligonucleótido de 92 bases diseñado para hibridar en parte con la
cadena antisentido en la región 3' del ADN que codifica el dominio
de activación de VP16 del plásmido pVgRXR. El cebador también tiene
secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias que
codifican el sitio de escisión 5A/5B de la proteasa
NS3-4A del VHC. Sin embargo, el ADN que codifica el
sitio de escisión 5A/5B tiene adicionalmente una inserción de seis
nucleótidos entre las secuencias de ADN que codifican un codón de
cisteína y de serina. La inserción de seis nucleótidos codifica dos
codones de parada.
El cebador NS3-4AF (ID Sec Nº
15) es un oligonucleótido de 47 bases diseñado para unirse
parcialmente al inicio de la región que codifica NS3
(correspondiente a los aminoácidos nº 1027-1032 en
el polipéptido del VHC). El resto del oligonucleótido contiene
múltiples sitios de restricción para facilitar la clonación.
El cebador NS3-4AB (ID Sec Nº
16) es un oligonucleótido de 44 bases diseñado para unirse
parcialmente al extremo 3' de la región que codifica NS4A (que
corresponde a los aminoácidos nº 1705-1711 en el
polipéptido del VHC). El resto del oligonucleótido contiene
múltiples sitios de restricción para facilitar la clonación.
Cada cebador se sintetizó en condiciones
estándar conocidas en la técnica, usando una máquina de síntesis de
oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo en
condiciones estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T.
(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second
Edition, Plainview, New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press).
\vskip1.000000\baselineskip
La primera etapa para preparar el vector de
expresión que codifica VgRXR-5A/5B (ID Sec Nº 19)
implicaba una reacción PCR usando el cebador VP16/5A5BF (ID Sec Nº
12), el cebador VP16/5A5BR (ID Sec Nº 13) y el plásmido pVgRXR como
molde. Después, el producto de la PCR se hizo digerir con Xba I. Se
preparó un vector para ligar con el producto de la PCR haciendo
digerir el vector pVgRXR con Xba I para eliminar el ADN que codifica
el dominio de activación de VP16. Se aisló la cadena principal del
vector y el inserto de la PCR digerido se ligó en el sitio Xba I en
la cadena principal. Las ligaciones se cribaron por secuenciación
para asegurar la orientación adecuada del inserto y que su
secuencia de nucleótidos fuera correcta.
La primera etapa para preparar el vector de
expresión que codifica VgRXR-5A**5B (ID Sec Nº 21)
implicaba una reacción PCR usando el cebador VP16/5A5BF (ID Sec Nº
12), el cebador VP16/5A**5BR (ID Sec Nº 14) y el plásmido pVgRXR
como molde. Después, el producto de la PCR se hizo digerir con Xba
I. Se preparó un vector para ligar con el producto de la PCR
haciendo digerir el vector pVgRXR con Xba I para eliminar el ADN que
codifica el dominio de activación de VP16. Se aisló la cadena
principal del vector y el inserto de la PCR digerido se ligó con el
sitio Xba I en la cadena principal. Las ligaciones se cribaron por
secuenciación para asegurar la orientación adecuada del inserto y
que su secuencia de nucleótidos era correcta.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera etapa para preparar el vector
pSR\alpha-NS3-4A que codifica el
sitio de escisión NS3-4A (ID Sec Nº 10) implicaba
una reacción PCR usando el cebador NS3-4AF (ID Sec
Nº 15), el cebador NS3-4AB (ID Sec Nº 16) y el ADNc
de la cepa H del VHC de longitud completa como molde [Inchauspe
et al., (1991), PNAS USA
88:10292-10296]. Después, el producto de la PCR se
hizo digerir con Pst1 y EcoR1. Se preparó un vector para ligar con
el producto de la PCR, haciendo digerir el vector pSR\alpha con
Pst 1 y EcoR1. La cadena principal del vector se aisló y el inserto
de la PCR se ligó en el sitio Pst1 -EcoR1 de la cadena
principal.
La primera etapa para preparar el vector
pSR\alpha-NS3-4A(S1165A)
que codifica el las proteasa mutante de NS3-4A
implicaba una reacción PCR usando el cebador NS3-4AF
(ID Sec Nº 15), el cebador NS3-4AB (ID Sec Nº 16) y
el ADNc del sitio activo NS3 del mutante S1165A [A. Grakoui et
al., (1993) J. Virology 67:2832-43].
Después, el producto de la PCR se hizo digerir con Pst1 y EcoR1. Se
preparó un vector para ligar con el producto de la PCR, haciendo
digerir el vector pSR\alpha con Pst1 y EcoR1. La cadena principal
del vector se aisló y el inserto de la PCR se ligó en el sitio Pst1
-EcoR1 de la cadena principal. El
NS3-4A(S1165A) tiene una sustitución de
serina por alanina en el aminoácido número 1165, que hace a la
proteasa inactiva. Compárese los ID Sec Nº 10 y ID Sec
Nº 11.
Nº 11.
\newpage
Ejemplo
2
Los ensayos de luciferasa inducible por ecdisona
de la proteasa NS3-4A de VHC se llevaron a cabo en
general como se describe a continuación.
Se pusieron en placa células de riñón de mono
verde africano con aproximadamente 150.000 células/pocillo en una
placa de 6 pocillos. Al día siguiente, se disolvieron
aproximadamente 3,6 \mug de ADN plasmídico en 100 \mul de medio
Eagle modificado por Dulbecco de Gibco BRL (DMEM), combinados con 29
\mul de reactivo Superfect (Qiagen), y después se mezclaron
pipeteando. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 10
minu-
tos.
tos.
Las cantidades de ADN usadas normalmente en cada
experimento eran las siguientes: 0,6 \mug de
pIND-Luc, 0,6 \mug de
pVgRXR-5A/5B o pVgRXR-5A**5B, y
0-2,4 \mug de
pSR\alpha-NS3-4A o
pSR\alpha-NS3-4A(S1165A) o
pSR\alpha.
Después se añadieron 600 \mul de DMEM con
suero bovino fetal al 10% en v/v (FBS-DMEM al 10%) a
la mezcla de ADN y se mezcló pipeteando. Las células en la placa de
6 pocillos se lavaron con 2,5 ml de solución salina tamponada con
fosfato (PBS). El PBS se separó de las células y se sustituyó por la
mezcla de ADN. Las células se incubaron en la mezcla de ADN durante
3 horas a 37ºC en un incubador con CO_{2} al 5%.
Después de la incubación, las células se lavaron
con PBS. El PBS se separó y se añadió FBS-DMEM al
10% a las células. Las células se incubaron en
FBS-DMEM al 10% toda la noche a 37ºC en un incubador
con CO_{2} al 5%.
Al día siguiente, se añadió un ligando exógeno a
las células para inducir la transcripción del gen indicador.
Específicamente, el FBS-DMEM al 10% se aspiró de las
células y se sustituyó por una solución de FBS-DMEM
al 10% que contenía una concentración de muristerona A
1-10 \muM (Invitrogen, Reino Unido). En algunos
casos, también se añadió un inhibidor de proteasa disuelto en
dimetilsulfóxido (DMSO) a las células hasta una concentración final
de 1-40 \muM. Las células se incubaron con
muristerona A o ponasterona A durante 24 horas a 37ºC en un
incubador con CO_{2} al 5%.
Al día siguiente las células se lavaron con PBS.
La actividad de la proteína luciferasa se midió usando un kit de
ensayo de luciferasa (Promega). De forma específica, las células se
lisaron en 250 \mul de reactivo de lisis de cultivo celular. Las
células se sacaron de la placa y se transfirieron a un tubo de
microfuga. El extracto se centrifugó a 12.000xg durante 5 segundos.
Se añadieron 20 \mul de cada muestra a 100 \mul de reactivo de
ensayo de luciferasa. La luz producida por la reacción de la
luciferasa con el reactivo se midió en un luminómetro y se registró
en unidades de luz relativas (ULR).
La mayoría de los experimentos se hicieron
varias veces por triplicado. Las barras de error que reflejan la
desviación típica de los puntos de datos están incluidas en las
figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los vectores que codifican proteínas de fusión
(VgRXR, VgRXR-5A/5B o
VgRXR-5A(parada)5B) y
pIND-Luc se transfectaron en células COS como se ha
descrito antes (Ejemplo 2). Al día siguiente, se incubaron algunas
de las células con muristerona 1 \muM durante 24 horas. Las
células se lisaron y se ensayó la actividad de la luciferasa como
se ha descrito previamente. Los resultados se representan en la
Figura 4.
La proteína de fusión de control expresada por
VgRXR-5A(parada)5B, que carece del
dominio de unión de ADN de ecdisona muestra una actividad
despreciable. Se observa poca o ninguna diferencia entre las
actividades de las proteínas de fusión expresadas por VgRXR y
VgRXR-5A/5B. Los resultados indican que la inserción
de la unión 5A/5B en la proteína expresada por VgRXR no interfiere
con la actividad inducida por la muristerona A.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El plásmido indicador pIND-Luc
se contransfectó con pVgRXR-5A/5B o pVgRXR y
cantidades crecientes (\mug) del ADN que codifica la proteasa
NS3-4A como se indica en la Figura 5. Al día
siguiente, las células se incubaron con muristerona A 1 \muM.
Después, las células se lisaron y se ensayó la actividad de la
luciferasa como se ha descrito previamente. Los resultados se
representan en la Figura 5.
La transcripción de la construcción de indicador
de luciferasa cuando se cotransfectaba con la construcción VgRXR
que codifica el RXR de mamífero y las proteínas de fusión de
receptor de ecdisona/VP16, mostró poco o ningún cambio cuando se
coexpresaban con la proteasa NS3-4A. Por otra parte,
la proteína codificada por pVgRXR-5A/5B, produjo
una disminución dependiente de la dosis en la actividad de la
luciferasa cuando se coexpresaba con la proteína
NS3-4A. Estos resultados sugieren que la proteasa
NS3-4A escinde la unión 5A/5B pero no otras zonas
de la proteína de fusión necesarias para la actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se usaron 0,6 \mug de
pVgRXR-5A/5B y 0,6 \mug de
pIND-Luc para cotransfectar con diferentes
cantidades (\mug) de los vectores que codifican la proteasa NS3 o
un mutante inactivo de la misma como se indica en la Figura 6. La
cantidad total de ADN usado para cada transfección era 3,6 \mug
con la adición de pSR\alpha. Al día siguiente, las células se
incubaron en muristerona A 1 \muM. Las células se lisaron y se
ensayó la actividad de luciferasa como se ha descrito previamente.
Los resultados se representan en la Figura 6.
Como se ha visto en los resultados previos
(Ejemplo 4), la proteína de fusión codificada por
pVgRXR-5A/5B demostró un nivel alto de actividad en
ausencia de la proteasa NS3-4A. La actividad de
luciferasa mediada por pVgRXR-5A/5B disminuyó de
una forma dependiente de la dosis con la cotransfección de ADN que
codifica la proteasa NS3-4A, pero no con el ADN que
codifica la proteasa mutante NS3-9A(S1165A).
Esto se debe probablemente a la incapacidad de la proteasa
NS3-4A mutante a escindir la proteína de fusión de
ecdisona/VP16.
Los estudios de dependencia de la dosis tales
como los ejemplos 4 y 5 eran útiles para determinar la relación
óptima de ADN que codifica la proteína de fusión y ADN que codifica
la proteasa, para usar en futuros ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El plásmido pIND-Luc (0,6
\mug) se cotransfectó con pVgRXR-5A/5B (0,6
\mug) en ausencia o presencia de 1,8 \mug de
pSR\alphaNS3-4A. Al día siguiente, las células se
incubaron con cantidades variables de ponasterona A, un ligando que
induce la heterodimerización del receptor de ecdisona con el
receptor de ácido retinoico de mamífero, RXR. Las células se
lisaron y se ensayó la actividad de luciferasa como se ha descrito
previamente. Los resultados se representan en la Figura 7.
Los resultados indican que la ponasterona A es
eficaz en la activación de la proteína de fusión EdR5A/5B (es
decir, la proteína codificada por VgRXR-5A/5B) en
ausencia de la proteasa NS3-4A. Para los propósitos
de estos experimentos, la activación mayor de la proteína de fusión
ocurría cuando la ponasterona A estaba presente en una
concentración entre 3,3-1,0 \muM. En general, se
encontró que la ponasterona A era igual de eficaz que la
muristerona A en la inducción de transcripción en estos ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
El plásmido pIND-Luc (0,6
\mug) se cotransfectó con pVgRXR-5A/5B (0,6
\mug) en ausencia o presencia de 1,8 \mug de
pSRaNS3-4A. Al día siguiente, las células se
incubaron con ponasterona A 5 \muM. También se añadió
dimetilsulfóxido (DMSO) a las células hasta una concentración final
de DMSO al 0-1% (v/v). Las células se lisaron y se
ensayó la actividad de luciferasa como se ha descrito previamente.
Los resultados se representan en la Figura 8.
En este experimento de control, se añadió DMSO a
las células para determinar si la presencia de éste interfería con
la activación de la proteína de fusión por la ponasterona A. El DMSO
es un disolvente que se usa a veces para disolver los compuestos
inhibidores de proteasa antes de añadirlos a estos ensayos. En la
mayoría de los experimentos, la concentración de DMSO en el cultivo
celular no superó 0,1%. Estos resultados indican que las
concentraciones de DMSO hasta 1% tienen poco o ningún efecto en la
actividad de luciferasa inducida por ponasterona A en este
ensayo.
ensayo.
Los siguientes ejemplos demuestran cómo puede
ser útil este ensayo para cribar compuestos potencialmente útiles
como inhibidores de proteasa.
\newpage
Ejemplo
8
El plásmido pIND-Luc (0,6
\mug) se cotransfectó con pVgRXR-5A/5B (0,6
\mug) en presencia de 1,8 \mug de
pSR\alphaNS3-4A (relación 1:3). Al día siguiente,
las células se incubaron con ponasterona A 5 \muM y cantidades
variables del compuesto VH-25531 como se indica en
la Figura 9. Las células se lisaron y se ensayó la actividad de
luciferasa como se ha descrito previamente. Los resultados se
representan en la Figura 9.
Los resultados indican que
VH-25531 en ausencia de la proteasa
NS3-4A no aumenta ni disminuye significativamente
la actividad de la proteína de fusión (compárense las calles 1 y 3,
Figura 9). Sin embargo, VH-25531 inhibe la
actividad de la proteasa NS3-4A en especial con 20
\muM (compárense las calles 4-11 con la
reivindicación 2, Figura 9). De hecho, los resultados indican que
VH-25531 puede inhibir la proteasa
NS3-4A como mucho 55,5% con una concentración 20
\muM. El porcentaje de inhibición de la actividad de proteasa con
VH-25531 20 \muM se calculó aproximadamente
restando los valores de las calles 3 y 2
(19900-5177=14732), restando los valores de las
calles 4 y 3 (13356-5177=8179), y después dividiendo
los dos valores (8179/19723=0,555).
Aunque en lo que antecede se han presentado una
serie de realizaciones de esta invención, es evidente que la
construcción básica de los autores de la invención se puede alterar
para proporcionar otras realizaciones que usan los métodos de esta
invención. Por lo tanto, se apreciará que el alcance de esta
invención está definido por las reivindicaciones y la memoria
descriptiva y no por las realizaciones específicas que se ilustran
aquí.
<110> VERTEX PHARMACEUTICALS
INCORPORATED
\hskip1cmHoock, Thomas
\hskip1cmGermann, Ursula
\hskip1cmKwong, Ann
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN, MOLÉCULAS DE
ADN, VECTORES Y CÉLULAS HOSPEDANTES ÚTILES PARA MEDIR LA ACTIVIDAD
DE PROTEASA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> VPI/98-08
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: virus de la hepatitis C mutado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 746
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 764
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia artificial sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (25)
1. Una molécula de ADN que codifica una proteína
de fusión que comprende:
(a) un sitio de escisión de la proteasa
objetivo;
(b) un dominio de unión de ligando; y
(c) un dominio de unión de ADN;
en la que la asociación de un ligando con dicha
proteína de fusión media la unión de la proteína de fusión a un
elemento de respuesta al ligando ("ERL") operativamente unido a
un gen indicador; en la que dicho sitio de escisión de proteasa de
dicha proteína de fusión se puede escindir de modo que ninguno de
los fragmentos de la proteína de fusión resultantes sea capaz de
modular la expresión de dicho gen indicador; y
en la que la proteína de fusión también
comprende un dominio modulador de expresión o se asocia con una
segunda proteína que tiene un dominio modulador de expresión, en la
que dicho dominio modulador de expresión regula la transcripción de
dicho gen indicador; y
en la que dicho sitio de escisión de la proteasa
objetivo está situado en el dominio de unión de ADN o en el dominio
modulador, si está presente, o entre cualquiera de los dominios de
dicha proteína de fusión.
2. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en
la que dicho sitio de escisión de proteasa es reconocido por la
proteasa NS3 del VHC o por la aspartil proteasa del VIH.
3. La molécula de ADN de la reivindicación 1 ó
2, en la que la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de
proteasa se selecciona del grupo que consiste en los ID SEC Nº: 1 a
10.
4. La molécula de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho dominio de unión de ADN se
selecciona de una unión de ADN de un receptor de la superfamilia de
esteroides/tiroides.
5. La molécula de ADN de la reivindicación 4, en
la que dicho dominio de unión de ADN es del receptor de ecdisona y
en la que dicho receptor de ecdisona requiere la asociación con una
pareja de unión a la proteína para permitir la unión al ADN.
6. Una molécula de ADN de la reivindicación 5,
en la que dicho dominio de unión de ADN se modifica de modo que la
región de secuencia-P tiene la secuencia de
aminoácidos del ID SEC Nº: 24 o la molécula de ADN tiene la
secuencia del ID SEC Nº: 19.
7. La molécula de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho dominio modulador de
expresión es el dominio de activación de la proteína VP16.
8. Una molécula de ADN que codifica una proteína
de fusión que tiene la secuencia del ID SEC Nº: 20.
9. Un vector que comprende la molécula de ADN de
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Una célula hospedante transformada con un
vector de acuerdo con la reivindicación 9.
11. La célula hospedante de la reivindicación
10, que además comprende una molécula de ADN que comprende:
(a) un ERL que se une a dicho dominio de unión
de ADN de dicha proteína de fusión, en el que dicha unión es
modulada por la presencia de un ligando y es modulada opcionalmente
por la presencia de una pareja de unión a la proteína de dicha
proteína de fusión;
(b) un promotor que es modulado por dicho
dominio modulador de expresión de dicha proteína de fusión; y
(c) un gen indicador, cuya expresión es
controlada por dicho promotor.
12. La célula hospedante de la reivindicación
11, en la que dicho promotor es un promotor de choque térmico de
mamífero.
13. La célula hospedante de la reivindicación 11
ó 12, en el que dicho gen informador es el gen de la luciferasa.
14. La célula hospedante de cualquiera las
reivindicaciones 11 a 13, que además comprende una molécula de ADN
que codifica una pareja de unión a la proteína necesaria para
activar dicho dominio de unión de ADN de dicha proteína de
fusión.
15. Un método para producir una proteína de
fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, que comprende las etapas de cultivar una célula hospedante de la
reivindicación 10 en condiciones que produzcan la expresión de
dicha proteína de fusión.
16. Una proteína de fusión que es codificada por
la molécula de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o
que se puede obtener por el método de la reivindicación 15.
17. Un método para ensayar la actividad de
proteasa in vitro que comprende las etapas de:
(a) incubar la proteína de fusión de la
reivindicación 16 en un extracto de transcripción in vitro
con una proteasa capaz de escindir dicha proteína de fusión en
dicho sitio de escisión de proteasa y una molécula de ADN, en la
que dichas moléculas de ADN comprenden (i) un ERL que se une al
dominio de unión de ADN de dicha proteína de fusión; (ii) un
promotor que es modulado por el dominio modulador de expresión de la
proteína de fusión; y (iii) un gen indicador, cuya expresión es
controlada por el promotor, en el que dicho sitio de escisión de
proteasa de dicha proteína de fusión puede ser escindido por dicha
proteasa cuya actividad se ensaya;
(b) añadir a dicha incubación un ligando que se
asocia con dicha proteína de fusión, en el que dicho ligando es
necesario para que dicha proteína de fusión (i) se una a dicho ERL o
se una a una pareja de unión a la proteína, y (ii) module la
transcripción de dicho gen indicador; y
(c) cuantificar el producto génico producido por
dicho gen indicador.
18. Un método para ensayar la actividad de
proteasa en una célula, que comprende las etapas de:
(a) cultivar la célula hospedante de una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en condiciones que
produzcan la expresión de dicha proteína de fusión, y si está
presente, dicha pareja de unión a la proteína, en el que dicha
célula hospedante expresa la proteasa que se va a ensayar y en el
que dicho sitio de escisión de proteasa de la proteína de fusión
puede ser escindido por dicha proteasa;
(b) añadir a dicho cultivo de la célula
hospedante un ligando que se asocie con y que regule la actividad
de dicha proteína de fusión, en el que dicho ligando es necesario
para que dicha proteína de fusión
- (i)
- se una a dicho ERL operativamente unido a un gen indicador o se una a una pareja de unión a la proteína, y
- (ii)
- module la transcripción de dicho gen indicador; y
(c) cuantificar el producto génico producido por
dicho gen indicador.
19. Un método para determinar la actividad
inhibidora de un compuesto frente a una proteasa, que comprende las
etapas de:
(a) cultivar en un primer cultivo la célula
hospedante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en ausencia
de dicho compuesto en condiciones que produzcan la expresión de
dicha proteína de fusión, en el que dicha célula hospedante expresa
la proteasa que se va a ensayar y en el que dicho sitio de escisión
de proteasa de dicha proteína de fusión puede ser escindido por
dicha proteasa;
(b) cultivar en un segundo cultivo la célula
hospedante usada en la etapa a) en presencia de dicho compuesto en
condiciones que producen la expresión de dicha proteína de
fusión;
(c) añadir un ligando a dicho primer y dicho
segundo cultivos de células hospedantes, en el que dicho ligando es
necesario para que dicha proteína de fusión (i) se una a dicho ERL
operativamente unido a un gen indicador o se una a una pareja de
unión a la proteína, y (ii) module la transcripción de dicho gen
indicador; y
(d) comparar la cantidad de producto génico
producido por dicho gen indicador en dicho primer cultivo de células
hospedantes y dicho segundo cultivo de células hospedantes.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
19, que comprende las etapas adicionales de:
(a) cultivar en un tercer cultivo una célula
hospedante de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en
condiciones que producen la expresión de dicha proteína de fusión y
en el que dicha célula hospedante no expresa una proteasa que
reconoce el sitio de escisión de proteasa en dicha proteína de
fusión; y, como parte de la etapa d),
(b) comparar la cantidad de producto génico
producido por dicho gen indicador en dicho cultivo de células
hospedantes con la cantidad producto génico producido por dicho gen
indicador en dichos primer y segundo cultivos de células
hospedantes.
21. Un método para comparar la actividad de dos
proteasas que reconocen el mismo sitio de escisión, comprendiendo
dicho método las etapas de:
(a) cultivar una primera célula hospedante de
una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en condiciones que
producen la expresión de dicha proteína de fusión, y si está
presente, dicha pareja de unión a la proteína, en el que dicha
primera célula hospedante expresa una primera proteasa que es capaz
de escindir dicho sitio de escisión de proteasa de dicha proteína
de fusión;
(b) cultivar una segunda célula hospedante de
una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en condiciones que
producen la expresión de dicha proteína de fusión, y si está
presente, dicha pareja de unión a la proteína, en el que dicha
segunda célula hospedante expresa una segunda proteasa que es capaz
de escindir dicho sitio de escisión de la proteasa de dicha
proteína de fusión;
(c) añadir un ligando a dicho primer y dicho
segundo cultivos de células hospedantes, en el que dicho ligando es
necesario para que dicha proteína de fusión
- (i)
- se una a dicho ERL operativamente unido a un gen indicador o se una a una pareja de unión a la proteína, y
- (ii)
- module la transcripción de dicho gen indicador; y
(d) comparar la cantidad de producto génico
producido por dicho gen indicador en dicho primer cultivo de células
hospedantes y dicho segundo cultivo de células hospedantes.
22. El método de acuerdo con la reivindicación
21, en el que dicha primera y dicha segunda proteasas son formas de
la proteasa del VIH.
23. Un kit para ensayar la actividad de proteasa
que comprende:
(a) una molécula de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 o un vector de la reivindicación 9,
(b) un ADN que comprende:
- (i)
- un ERL que es capaz de unirse a dicho dominio de unión de ADN de dicha proteína de fusión codificada por la molécula de ADN de a);
- (ii)
- un promotor que es capaz de ser modulado por dicho dominio modulador de expresión de dicha proteína de fusión codificada por la molécula de ADN de a); y
- (iii)
- un gen indicador, cuya expresión es controlada por dicho promotor,
(c) un ligando, en el que dicho ligando es
necesario para que dicha proteína de fusión
- (i)
- se una a dicho ERL operativamente unido a un gen indicador o se una a una pareja de unión a la proteína, y
- (ii)
- module la transcripción de dicho gen indicador; y
(d) instrucciones para usar dicho kit para
ensayar la actividad de proteasa.
24. El kit de la reivindicación 23, que además
comprende una molécula de ADN que codifica una pareja de unión a la
proteína de dicha proteína de fusión o un vector que comprende la
molécula de ADN.
25. El kit de acuerdo con la reivindicación 23,
en el que dicha molécula de ADN de (a) y (b) están ambas presentes
en una célula hospedante.
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