JP4994563B2 - 新規置換突然変異体受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用 - Google Patents

新規置換突然変異体受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用 Download PDF

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    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Description

本発明は、バイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本発明は遺伝子発現の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は置換突然変異を含む新規核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用、ならびにこの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を変調する方法に関する。
種々の刊行物が本明細書中で引用され、その開示は出典明示によりその全体を本明細書の一部とみなす。しかしながら、本明細書中におけるいずれの文献の引用も、かかる文献が本出願に対する「先行技術」として利用できることを認めたものと理解されるべきではない。
遺伝子工学の分野においては、遺伝子発現の正確な制御は、発生および他の生理学的プロセスを研究し、操作し、および制御するための価値あるツールである。遺伝子発現は、多数の特異的蛋白質−蛋白質相互作用に関連する複雑な生物学的プロセスである。遺伝子発現が蛋白質合成における最初の工程として必要なRNAを生産するように遺伝子発現がトリガーされるためには、転写アクチベーターが、遺伝子転写を制御するプロモーターの近くに運ばれなければならない。典型的には、転写アクチベーターそれ自体は、遺伝子のプロモーター領域に存在するDNA結合部位に結合する少なくとも1つのDNA結合ドメインを有する蛋白質に関連する。かくして、遺伝子発現が起こるためには、DNA結合ドメインおよび該DNA結合ドメインから適当な距離をおいて位置するトランス活性化ドメインを含む蛋白質が遺伝子のプロモーター領域中の正しい位置に運ばれなければならない。
伝統的なトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的プロモーターを利用して、設計されたトランスジーンの発現を促進させる。トランスジーンを含有するDNA構築体が、まず、宿主ゲノムに組み込まれる。転写アクチベーターによってトリガーされると、与えられた細胞型でトランスジーンの発現が起こる。
細胞中での外来性遺伝子の発現を調節する他の手段は誘導性プロモーターを介するものである。そのような誘導性プロモーターの使用の例としては、PR1−aプロモーター、原核生物リプレッサー−オペレーターシステム、免疫抑制−イムノフィリンシステム、およびステロイドホルモン受容体システムのような高等真核生物転写活性化システムが挙げられ、これは後記する。
病原体の攻撃後の全身獲得抵抗性応答(systemic acquired resistance response)の間に、タバコからのPR1−aプロモーターが誘導される。PR1−aの使用は限定されるであろう。何故ならば、それは、しばしば、内因性物質、ならびに病原体、UV−B放射線および汚染物のような外来因子に応答するからである。熱ショック、インターフェロンおよび重金属によって誘導されたプロモーターに基づく遺伝子調節システムが記載されてきた(Wurnら、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5414−5418;Arnheiterら、1990、Cell 62:51−61;Filmusら、1992、Nucleic Acids Research 20:27550−27560)。しかしながら、これらのシステムは、非−標的遺伝子の発現に対するその効果のため制限を有する。これらのシステムは遺漏性(leaky)でもある。
原核生物リプレッサー−オペレーターシステムは細菌リプレッサー蛋白質およびそれらが結合する独自のオペレーターDNA配列を利用する。細菌Escherichia coliからのテトラサイクリン(「Tet」)およびラクトース(「Lac」)リプレッサー−オペレーターシステムが、遺伝子発現を制御するために植物および動物で用いられてきた。Tetシステムにおいて、テトラサイクリンはTetRリプレッサー蛋白質に結合し、立体配座の変化をもたらし、これはオペレーターからリプレッサー蛋白質を放出させ、その結果、転写が起こる。Lacシステムでは、ラクトース、またはイソプロピル−b−D−チオガラクトシドのような合成アナログの存在に応答してlacオペロンが活性化される。あいにく、そのようなシステムの使用は、リガンド、すなわち、テトラサイクリンおよびラクトース、の不安定な化学、それらの毒性、それらの天然の存在、または誘導もしくは抑制に比較的高レベル必要であることよって制限される。同様の理由により、動物へのこのようなシステムの使用も制限される。
FK506、ラパマイシンおよびシクロスポリンAのような免疫抑制分子は、イムノフィリンFKBP12、シクロフィリン等に結合することができる。この情報を用い、単に、FK506を2つの蛋白質の各々の上に置くことによって、またはFK506を1つの上に、およびシクロスポリンAをもう1つの上に置くことによって、任意の2つの蛋白質を一緒に運ぶ一般的戦略が工夫されてきた。次いで、FK506の合成ホモダイマー(FK1012)またはFK506−シクロスポリンの融合から得られた化合物(FKCsA)を用いて、これらの分子の二量体化を誘導することができる(Spencerら、1993、Science 262:1019−24;Belshawら、1996、Proc Natl Acad Sci USA 93:4604−7)。FKBP12に融合したGal4 DNA結合ドメインおよびシクロフィリンに融合したVP16アクチベータードメイン、ならびにFKCsA化合物を用いて、Gal4結合部位を含有するプロモーターの制御下でレポーター遺伝子のヘテロ二量体化および活性化が示された。あいにく、このシステムは、望まない副作用を有しかねない免疫抑制剤を含み、従って、種々の哺乳動物遺伝子のスイッチ適用でのその使用が制限される。
ステロイドホルモン受容体システムのような高等真核生物転写活性化システムも使用されてきた。ステロイドホルモン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物細胞で見出される。あいにく、特に植物および哺乳動物における遺伝子発現の調節のために受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、そのような生物における多くの他の元来の生物学的経路におけるその関与のため制限される。そのような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体(EcR)を用いる代替システムが開発されている。
昆虫における成長、脱皮および発生はエクジソンステロイドホルモン(脱皮ホルモン)および幼若ホルモンによって調節される(Dhadiallaら、1998、Annu.Rev.Entomol.43:545−569)。昆虫におけるエクジソンに対する分子標的は、少なくともエクジソン受容体(EcR)およびウルトラスピラクル蛋白質(USP)よりなる。EcRは、シグニチャーDNAおよびリガンド結合ドメイン、ならびに活性化ドメインによって特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである(Koelleら、1991、Cell、67:59−77)。EcR受容体は、ポナステロンAおよびムリステロンAのような多数のステロイド化合物に対して応答性である。最近、エクジステロイドアゴニスト活性を持つ非−ステロイド化合物が記載されており、これは、Rohm and Haas社によって世界的に販売されている市販の殺虫剤テブフェノジドおよびメトキシフェノジドを含む(国際特許出願第PCT/EP96/00686号および米国特許第5,530,028号参照)。両アナログは他の生物に対して例外的な安全性プロフィールを有する。
昆虫エクジソン受容体(EcR)はウルトラスピラクル(USP)、哺乳動物RXRの昆虫ホモログとでヘテロ二量体化し、エクジステロイドおよびエクジソン受容体応答エレメントに結合し、エクジソン応答遺伝子の転写を活性化させる(Riddifordら、2000)。EcR/USP/リガンド複合体は、昆虫の発生および生殖の間に重要な役割を演じる。EcRはステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、5つのモジュールドメイン、A/B(トランス活性化)、C(DNA結合、ヘテロ二量体化)、D(ヒンジ、ヘテロ二量体化)、E(リガンド結合、へテロ二量体化およびトランス活性化)およびF(トランス活性化)ドメインを有する。A/B、CおよびEのようなこれらのドメインのいくつかは、それらが他の蛋白質に融合された場合にそれらの機能を保持する。
綿密に調節された誘導性遺伝子発現システムまたは「遺伝子スイッチ」は、遺伝子治療、細胞における蛋白質の大規模生産、細胞ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック植物および動物における特性の調節のような種々の適用で有用である。
EcRベースの遺伝子スイッチの第1のバージョンは、Drosophila melanogaster EcR(DmEcR)およびMus musculus RXR(MmRXR)を用い、ステロイド、ポナステロンAの存在下においてこれらの受容体が哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウス中のレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した(Christophersonら、1992;Noら、1996)。後に、Suhrら、1998は、外因性ヘテロダイマーパートナーの不存在下で、Bombyx mori EcR(BmEcR)を介して、非−ステロイドエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子の高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
国際特許出願第PCT/US97/05330号(WO97/38117号)およびPCT/US99/08381号(WO99/58155号)は外因性遺伝子の発現を変調する方法を開示しており、ここに、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むDNA構築体が、そのためのリガンドの存在下、かつ所望によりサイレントパートナーとして作用することができる受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第2のDNA構築体によって活性化される。選択されたエクジソン受容体はDrosophila melanogasterから単離された。典型的には、そのようなシステムは、最適な活性化を提供するためにサイレントパートナー、好ましくはレチノイドX受容体(RXR)の存在を必要とする。哺乳動物細胞では、昆虫エクジソン受容体(EcR)は、レチノイドX受容体(RXR)とでヘテロ二量体化し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願第PCT/US98/14215号(WO99/02683号)は、カイコガ Bombyx moriから単離されたエクジソン受容体が、外因性ダイマーパートナーの必要性なくして哺乳動物系で機能できることを開示する。
米国特許第6,265,173B1号は、受容体のステロイド/甲状腺スーパーファミリーの種々のメンバーを、遺伝子発現システムにおける使用のために、Drosophila melanogasterウルトラスピラクル受容体(USP)または少なくともUSPの二量体化ドメインを含むその断片と組み合わせることができることを開示する。米国特許第5,880,333号は、トランス活性化ドメインおよびDNA結合ドメインが2つの異なるハイブリッド蛋白質上に位置する植物で使用されるDrosophila melanogaster EcRおよびウルトラスピラクル(USP)ヘテロダイマーシステムを開示する。あいにく、これらのUSP−ベースのシステムは動物細胞において構成的であり、従って、レポーター遺伝子発現を調節するのに効果的ではない。
これらの場合の各々において、(国際特許出願第PCT/US98/14215号におけるように天然EcRとして、または国際特許出願第PCT/US97/05330号におけるように修飾されたEcRとして)トランス活性化ドメインおよびDNA結合ドメインが単一の分子に組み込まれ、他のヘテロダイマーパートナー(USPまたはRXRいずれか)は、その天然状態で用いられた。
前記EcR−ベースの遺伝子調節システムの欠点は、リガンドの不存在下におけるかなりのバックグラウンド活性ならびに植物および動物双方において用いるためのこれらのシステムの非−適用性が挙げられる(米国特許第5,880,333号および第6,265,173B1号参照)。
遺伝子発現の変調に頼るほとんどの適用では、これらのEcR−ベースのシステムは望ましくない。従って、植物および動物双方において外因性遺伝子の発現を正確に変調するための改良されたシステムに対する要望が当該分野に存在する。そのような改良されたシステムは、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック動物における特性(trait)の調節のような適用で有用であろう。単純であり、コンパクトであり、かつ比較的安価で、容易に入手でき、宿主に対して毒性の低いものであるリガンドに依存する改良されたシステムは、生物学的システムを調節するのに有用なことが判明するであろう。
最近、出願人は、トランス活性化およびDNA結合ドメインが、それらを2つの異なる蛋白質上に置くことによって相互に分離されたエクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムが結果として、リガンドの不存在下においてバックグラウンド活性を大いに低下させ、リガンドの存在下においてバックグラウンドを越えて活性をかなり増加させたことを示した(ここに出典明示してその全体を本明細書の一部としてみなす係属中の出願PCT/US01/09050号)。この2−ハイブリッドシステムは、出願PCT/US97/05330号およびPCT/US98/14215号に開示されたシステムと比較してかなり改良された誘導性遺伝子発現変調システムである。該2−ハイブリッドシステムは、DNA結合ドメインが遺伝子上のDNA結合部位に結合すると、トランス活性化ドメインがプロモーターをより効果的に活性化するように、トランス活性化ドメインをDNA結合ドメインに対してより好都合な位置に運び込む一対の相互作用蛋白質の能力を開発する(例えば、米国特許第5,283,173号参照)。簡単に述べれば、該2−ハイブリッド遺伝子発現システムは2つの遺伝子発現カセットを含む;第1のカセットは核受容体ポリペプチドに融合したDNA結合ドメインをコードし、第2のカセットは異なる核受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードする。リガンドの存在下において、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの相互作用は、DNA結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に連結させる。DNA結合およびトランス活性化ドメインは2つの異なる分子に存在するので、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は大いに低下する。
また、2−ハイブリッドシステムは、ステロイドリガンド、例えば、ポナステロンA(「PonA」)またはムリステロンA(「MurA」)と比較した場合、非−ステロイドリガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する改良された感受性を提供する。すなわち、ステロイドと比較すると、非−ステロイドリガンドはより低い濃度においてより高い活性を提供する。加えて、EcR遺伝子スイッチに基づくトランス活性化はしばしば細胞系依存性であるので、各適用につき最大トランス活性化能力を得るためにスイッチングシステムを仕立てるのはより容易である。さらに、2−ハイブリッドシステムは、非修飾RXRがスイッチングパートナーとして用いられた場合にしばしば起こるRXRの過剰発現によるいくつかの副作用を回避する。好ましい2−ハイブリッドシステムにおいては、EcRまたはRXRの天然DNA結合およびトランス活性化ドメインは排除され、その結果、これらのハイブリッド分子は、細胞に存在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用するチャンスは低く、その結果、副作用は低下する。
出願人は、最近、エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおける脊椎動物RXRと同様またはそれよりも良好に無脊椎動物RXRが機能できるという驚くべき発見をなした(ここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の米国出願第60/294,814号参照)。
RXRは核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー2、グループBに分類される(ここでは、「グループB核受容体」という)。各グループのメンバーはE(リガンド結合)ドメインにおいて40−60%アミノ酸同一性を共有する(Laudetら、A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily、1999;Cell 97:161−163)。レチノイドX受容体に加えて、この核受容体サブファミリー2、グループBの他のメンバーは、H−2領域II結合蛋白質(H−2RIIBP)、核受容コレギュレーター1(RCoR−1)、ウルトラスピラクル(USP)、2C1核受容体、および漿膜因子(chorion factor)1(CF−1)を含む。
改良された核受容体リガンド結合ドメインを提供する努力において、出願人は、今回、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいてリガンド感受性および誘導の大きさに影響するグループB核受容体内のアミノ酸残基を同定した。出願人は、本明細書において、これらの臨界的残基において置換突然変異を含むグループB核受容体(本明細書中では「置換突然変異体」という)の構築、およびこれらの置換突然変異体核受容体が遺伝子発現を変調する方法で有用である証明を記載する。本明細書中で示されるように、出願人の新規な置換突然変異体核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用は、リガンド感受性およびトランス活性化の大きさが適用に応じて所望であれば選択することができる原核生物および真核生物宿主細胞双方における改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。
国際特許出願第PCT/EP96/00686号明細書 米国特許第5,530,028号明細書 国際特許出願第PCT/US97/05330号(WO97/38117号)明細書 国際特許出願第PCT/US99/08381号(WO99/58155号)明細書 国際特許出願第PCT/US98/14215号(WO99/02683号)明細書 米国特許第6,265,173B1号明細書 Wurnら、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5414−5418 Arnheiterら、1990、Cell 62:51−61 Filmusら、1992、Nucleic Acids Research 20:27550−27560) Spencerら、1993、Science 262:1019−24 Belshawら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:4604−7 Dhadiallaら、1998、Annu.Rev.Entomol.43:545−569 Koelleら、1991、Cell、67:59−77)
出願人は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な核受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムを開発した。出願人は、そのような置換突然変異の効果がリガンド結合活性またはリガンド感受性を増大させることができ、それは、ステロイドまたは非−ステロイド特異的であり得ることを示した。かくして、出願人の発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の発現を変調するのに有用なグループB核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを提供する。出願人の新規な誘導性遺伝子発現システムおよび宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法におけるその使用は、現在入手できる誘導性発現システムの制限を克服し、当業者に遺伝子発現を制御するための効果的な手段を提供する。
本発明は、遺伝子発現レベルの制御が望ましい、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、直交リガンドスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、およびトランスジェニック生物における特性の調節のような適用で有用である。出願人の発明の利点は、それが、遺伝子発現を調節し、使用者の要件に適合するように発現レベルを仕立てるための手段を提供することにある。
定義
本開示においては、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が設けられ、それは、本発明の範囲および実施を理解するのに助けとなるはずである。
特定の実施形態において、用語「約」または「ほぼ」は与えられた値または範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内、なおより好ましくは1%以内を意味する。
用語「実質的に含まない」は、組成物中(AおよびBが属する種のカテゴリーに応じて)少なくとも約75重量%の蛋白質、DNA、ベクターが「A」である場合に、「A」を含む組成物が(「A」は単一の蛋白質、DNA分子、ベクター、組換え宿主細胞等である)が「B」(「B」は1以上の混入蛋白質、DNA分子、ベクター等を含む)を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、「A」は、組成物においてA+B種の少なくとも約90重量%、より好ましくは少なくとも約99重量%を含む。また、混入物を実質的に含まない組成物が、注目する種の活性または特徴を有する単一分子量の種のみを含有するのも好ましい。
本発明の目的では、用語「単離された」は、その元来の環境(それが天然に存在する環境)から取り出された生物学的物質(核酸または蛋白質)を示す。例えば、植物または動物中にて天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然で存在する隣接核酸から分離された同一ポリヌクレオチドは「単離された」と考えられる。用語「精製された」は、他の化合物の存在を排除して、物質が絶対的純粋さを呈する形態で存在することを要しない。それはむしろ相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは、少なくとも1桁の大きさ、好ましくは2または3桁、より好ましくは4または5桁の大きさだけ出発物質または天然物質が精製された後に「精製された」状態にあるものである。
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合したものを含んでなる高分子化合物である。核酸はポリリボ核酸(RNA)およびポリデオキシリボ核酸(DNA)を含み、共に一本鎖または二本鎖であり得る。DNAは限定されるものではないが、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNAおよび半合成DNAを含む。DNAは直鎖状、環状またはスーパーコイルであり得る。
「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスの、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン;「RNA分子」)またはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン;「DNA分子」)のリン酸エステルポリマー形態、あるいはホスホロチオエートおよびチオエステルのようなそれらの任意のホスホエステルアナログもいう。二本鎖DNA−DNA、DNA−RNAおよびRNA−RNAヘリックスが可能である。用語核酸分子、特にDNAまたはRNA分子とは、分子の一次および二次構造のみをいい、それをいずれかの特定の三次形態に限定しない。かくして、この用語は、とりわけ、直鎖状または環状DNA分子(例えば、制限断片)、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖DNAを含む。特定の二本鎖DNA分子の構造の議論において、本明細書中では、DNAの非−転写ストランド(すなわち、mRNAに対して相同な配列を有するストランド)に沿って5’から3’への方向の配列のみを与える通常の慣例に従って配列を記載することができる。「組換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
用語「断片」は参照核酸に対して減少した長さのヌクレオチド配列を意味し、共通の部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むと理解されるであろう。本発明に従うそのような核酸断片は、適切には、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。そのような断片は、本発明による核酸の少なくとも6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000または1500の連続的ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドを含むか、あるいはそれよりなる。
本明細書中で用いるように「単離された核酸断片」は、所望により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有してもよい、一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAのポリマーである。DNAのポリマーの形態である単離された核酸断片はcDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの1以上のセグメントを含んでなることができる。
「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリーをいい、cDNAおよびゲノムDNA核酸を含む。また、「遺伝子」とは、コーディング配列に先立つ調節配列(5’非−コーディング配列)およびコーディング配列に続く調節配列(3’非−コーディング配列)を含めた、特定の蛋白質またはポリペプチドを発現する核酸断片をいう。「天然遺伝子」とは、それ自身の調節配列を持つ天然で見出される遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒に見出されない調節配列および/またはコーディング配列を含む、天然遺伝子ではないいずれの遺伝子もいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同一源に由来するが、天然で見出されるものと異なって配列した調節配列およびコーディング配列を含むことができる。キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコーディング配列および/または異なる源に由来する調節配列を含むことができる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおけるその天然の位置での天然遺伝子をいう。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物に通常は見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子をいう。外来性遺伝子は非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」は、形質転換手法によってゲノムに導入された遺伝子である。
「異種」DNAとは、細胞、または細胞の染色体部位に天然では位置しないDNAをいう。好ましくは、異種DNAは細胞に対して外来性である遺伝子を含む。
用語「ゲノム」は染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスDNAまたはRNAを含む。
核酸分子は、当該核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合に、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAのようなもう1つの核酸分子に「ハイブリダイズすることができる」(Sambrookら、1989、後掲参照)。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor(1989)、特にその中の第11章および表11.1(引用によりその全体を本明細書の一部とみなす)に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
ストリンジェンシー条件は、密接に関連する生物から機能性酵素を複製する遺伝子のような高度に同様な断片に対して、余り関連の無い生物からの相同配列のような中程度に同様な断片につきスクリーニングするように調整することができる。相同核酸についての予備的スクリーニングでは、55°のTに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる。例えば、5×SSC、0.1%SDS、0.25%ミルク、およびホルムアミド無し;または30%ホルムアミド、5×SSC、0.5%SDS。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いT、例えば、5×または6×SCCにての40%ホルムアミドに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は最高のT、例えば、50%ホルムアミド、5×または6×SCCに対応する。
ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能であるが、2つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基の間の関係を記載するのに用いる。例えばDNAに関しては、アデノシンはチミジンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明は、本明細書中で開示するまたは用いる完全な配列ならびにそれらの実質的に同様な核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。
本発明の特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、前記した条件を利用する55℃のTにおけるハイブリダイゼーション工程を含むハイブリダイゼーション条件を使用することによって検出される。好ましい実施形態において、Tは60℃である;より好ましい実施形態においては、Tは63℃である;なおより好ましい実施形態においては、Tは65℃である。
ポスト−ハイブリダイゼーション洗浄もストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の1つの組は室温にて15分間の6×SSC、0.5%SDSで出発し、次いで、45℃にて30分間 2×SSC、0.5%SDSを反復し、次いで、50℃にて30分間 0.2×SSC、0.5%SDSを2回反復する一連の洗浄を用いる。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い温度を用い、そこでは、0.2×SSC、0.5%SDSにおける最後の2回の30分間の洗浄の温度を60℃に上昇させる以外は洗浄は前記のものと同一である。高度にストリンジェントな条件の他の好ましい組は、65℃における0.1×SSC、0.1%SDSでの2回の最終洗浄を用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基の間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とする。
核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェンシーは、核酸の長さ、相補性の程度、当該分野でよく知られた変数に依存する。2つのヌクレオチド配列の間の同様性または相同性の程度が大きくなれば、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのTの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの(より高いTに対応する)相対的安定性は以下の順序で減少する:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100ヌクレオチドを超えるハイブリッドについては、Tを計算するための方程式が誘導されている(Sambrookら、前掲、9.50−0.51参照)。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する(Sambrookら、前掲、11.7−11.8参照)。
本発明の特定の実施形態においては、500mM未満の塩における、少なくとも37℃でのハイブリダイゼーション工程、および2×SSPEでの少なくとも63℃における洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによってポリヌクレオチドが検出される。好ましい実施形態においては、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程につき、200mM未満の塩および少なくとも37℃を含む。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程双方につき2×SSPEおよび63℃を含む。
1つの実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは少なくとも約10ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての好ましい最小の長さは少なくとも約15ヌクレオチドであり;より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドであり;最も好ましくは、該長さは少なくとも30ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄溶液塩の濃度は、プローブの長さといったファクターに従って必要に応じて調整することができる。
用語「プローブ」とは、相補的一本鎖標的核酸とで塩基対を形成して、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子をいう。
本明細書中で用いるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムDNA分子、cDNA分子、プラスミドDNAまたはmRNA分子にハイブリダイズすることができる、一般に少なくとも18ヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、32P−ヌクレオチド、またはビオチンのようなラベルが共有結合したヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。オリゴヌクレオチド(その一方または双方を標識することができる)を、核酸の全長または断片をクローニングするために、あるいは核酸の存在を検出するためにPCRプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを用いて、DNA分子とで三重ヘリックスを形成することができる。一般に、好ましくは核酸合成器でオリゴヌクレオチドを合成により調製する。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などのような天然に生じないホスホエステルアナログ結合を有するように調製することができる。
「プライマー」は、適当な条件下でDNA合成のための開始点として機能することができる二本鎖核酸領域を生じさせるために標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーはポリメラーゼ連鎖反応で用いることができる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はPCRと略され、酵素により特定の核酸配列を増幅するためのイン・ビトロ方法を意味する。PCRは、3つの段階:標的分子のストランドを分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖PCRオリゴヌクレオチドのプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびDNAポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含む各サイクルに伴う一連の繰り返し温度サイクルを含む。PCRは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。
「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応」はRT−PCRと省略され、RNA分子から標的cDNA分子を酵素的に生産し、続いて、前記したように標的cDNA分子内で特定の核酸配列の酵素的増幅を行うイン・ビトロ方法を意味する。また、RT−PCRは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。
DNAの「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下においた場合に、イン・ビトロまたはイン・ビボにて、細胞中にて転写されて、ポリペプチドに翻訳される二本鎖DNA配列である。「適当な調節配列」とは、コーディング配列の上流(5’非−コーディング配列)、その中、または下流(3’非−コーディング配列)に位置し、かつ関連するコーディング配列の転写、RNAプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含むことができる。コーディング配列の境界は、5’(アミノ)末端における開始コドンおよび3’(カルボキシル)末端における翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、mRNAからのcDNA、ゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえ含むことができる。もしコーディング配列が真核生物細胞における発現を意図するならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、通常、コーディング配列に対して3’側に位置するであろう。
「オープンリーディングフレーム」はORFと省略され、ATGまたはAUGのような翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつ潜在的にポリペプチド配列に翻訳されることができるある長さの核酸配列(DNA、cDNAまたはRNAいずれか)を意味する。
本明細書中では、用語「ヘッド−対−ヘッド」は、相互に対して2つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するために用いる。一方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの5’末端が他方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの5’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他方のポリヌクレオチドの5’末端から遠ざかるように進行する場合、2つのポリヌクレオチドはヘッド−対−ヘッド向きに位置する。用語「ヘッド−対−ヘッド」は、(5’)−対−(5’)と省略でき、また、記号(←→)または(3’←5’5’→3’)によって示すこともできる。
本明細書中では、用語「テール−対−テール」は、相互に対して2つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。一方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの3’末端が他方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの3’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の向きが他方のポリヌクレオチドに向かって進行する場合、2つのポリヌクレオチドはテール−対−テール向きに位置する。用語「テール−対−テール」は(3’)−対−(3’)と省略することができ、また、記号(→←)または(5’→3’3’←5’)によって示すこともできる。
本明細書中では、用語「ヘッド−対−テール」は、相互に対して2つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。一方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの5’末端が他方のポリヌクレオチドのコーディングストランドの3’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他方のポリヌクレオチドのそれと同一向きに進行する場合、2つのポリヌクレオチドはヘッド−対−テール向きに位置する。用語「ヘッド−対−テール」は(5’)−対−(3’)と省略することができ、また、記号(→→)または(5’→3’5’→3’)によって示すこともできる。
用語「下流」とは参照ヌクレオチド配列に対して3’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、下流ヌクレオチド配列は、一般に、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して5’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、上流ヌクレオチド配列は、一般に、コーディング配列または転写の開始点の5’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始点の上流に位置する。
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、二本鎖DNA内の特定のヌクレオチド配列内に結合し、それを切断する酵素をいう。
「相同組換え」とは、他のDNA分子への外来性DNA配列の挿入、例えば、染色体へのベクターの挿入をいう。好ましくは、ベクターは相同組換え用の特定の染色体部位を標的とする。特定の相同組換えでは、ベクターは、染色体の配列に対して相同性である十分に長い領域を含有して、相補的結合および染色体へのベクターの組み込みを可能とするであろう。相同性であるより長い領域、および配列同様性のより大きな程度は、相同組換えの効率を増加させることができる。
当該分野で知られたいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを増幅させることができる。一旦適当な宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増幅させ、定量的に調製することができる。本明細書中に記載するように、用いることができる発現ベクターは、限定されるものではないが、少数の名前を挙げれば、以下のベクターまたはその誘導体:ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス;バキュロウイルスのような昆虫ウイルス;酵母ベクター;バクテリオファージベクター(例えば、ラムダ)、およびプラスミドおよびコスミドDNAベクターを含む。
「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローニングおよび/または導入のためのいずれかの手段である。ベクターは、他のDNAセグメントを結合させて、結合したセグメントの複製を行うことができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、イン・ビボでDNA複製の自律ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができるいずれかの遺伝的エレメント(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス)である。用語「ベクター」は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボにて核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段の両方を含む。当該分野で知られた非常に多数のベクターを用いて、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むなどすることができる。可能なベクターは、例えば、ラムダ誘導体といったバクテリオファージ、またはpBR322もしくはpUCプラスミド誘導体といったプラスミド、またはBluescriptベクターなどの、例えばプラスミドまたは修飾ウイルスを含む。例えば、適当なベクターへの応答エレメントおよびプロモーターに対応するDNA断片の挿入は、相補的粘着末端を有する選択されたベクターへ適当なDNA断片を連結することによって達成することができる。別法として、DNA分子の末端は酵素的に修飾することができるか、またはヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端に連結することによっていずれの部位も生じさせることができる。そのようなベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞の選択を供する選択マーカー遺伝子を含有するように作成することができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされた蛋白質を組み込み、それを発現する宿主細胞の同定および/または選択を可能とする。
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、ならびに生きた動物対象における広く種々の遺伝子送達適用で用いられてきた。用いることができるウイルスベクターは、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ−随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタン−バール、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカウリモウイルスベクターを含む。非−ウイルスベクターはプラスミド、リポソーム、荷電脂質(サイトフェクチン)、DNA−蛋白質複合体、およびバイオポリマーを含む。核酸に加え、ベクターは、1以上の調節領域、および/または核酸導入の結果(いずれの組織への導入、発現の持続など)を選択し、測定し、およびモニターするのに有用な選択マーカーを含むこともできる。
用語「プラスミド」とは、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖DNA分子の形態である、遺伝子をしばしば運ぶ染色体外エレメントをいう。そのようなエレメントは任意の源に由来する、一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNAの自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列(直鎖状、環状またはスーパーコイル)であってよく、ここに、多数のヌクレオチド配列が、適当な3’非翻訳配列と共にプロモーター断片および選択された遺伝子産物についてのDNA配列を細胞に導入することができる独自の構築物に合体または組み換えられている。
「クローニングベクター」は、他の核酸セグメントを結合させて、結合されたセグメントの複製を行うことができる、プラスミド、ファージまたはコスミドのような、順次複製する核酸、好ましくは、DNAの単位長さであって、複製起点を含む「レプリコン」である。クローニングベクターは1つの細胞型で複製することができ、もう1つにおいて発現することができる(「シャトルベクター」)。
ベクターは、当該分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、またはDNAベクタートランスポーターによって、所望の宿主細胞に導入されることができる(例えば、Wuら、1992、J.Biol.Chem.267:963−967;WuおよびWu、1988、J.Biol.Chem.263:14621−14624;およびHartmutら、1990年3月15日に出願されたカナダ国特許出願第2,012,311号参照)。
また、本発明によるポリヌクレオチドはリポフェクションによってイン・ビボによって導入することもできる。過去10年間、イン・ビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大してきた。リポソーム−媒介トランスフェクションが遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のイン・ビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる(Felgnerら、1987、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413;Mackeyら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027−8031;およびUlmerら、1993、Science 259:1745−1748)。カチオン脂質の使用は負に荷電した核酸のカプセル化を促進し、また、負に荷電した細胞膜との融合も促進することができる(FelgnerおよびRingold、1989、Science 337:387−388)。核酸の導入のための特に有用な脂質化合物および組成物は国際特許公開WO95/18863号およびWO96/17823号、および米国特許第5,459,127号に記載されている。外来性遺伝子をイン・ビボで特定の器官に導入するためのリポフェクションの使用はある現実的な利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は利点の1つの領域を表す。トランスフェクションを特定の細胞型に向けるのは、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような細胞異種性を持つ組織において特に好ましいであろうことが明らかである。脂質は、標的化の目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる(Mackeyら、1988、前掲)。標的化されたペプチド、例えば、ホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体のような蛋白質、または非−ペプチド分子を化学的にリポソームにカップリングさせることができよう。
また、カチオンオリゴペプチド(例えばWO95/21931号)、DNA結合蛋白質に由来するペプチド(例えば、WO96/25508号)、またはカチオンポリマー(例えばWO95/21931号)のような他の分子も、イン・ビボにて核酸のトランスフェクションを容易とするのに有用である。
また、裸のDNAプラスミドとしてイン・ビボにてベクターに導入することも可能である(米国特許第5,693,622号、第5,589,466号および第5,580,859号参照)。また、受容体−媒介DNA送達アプローチも用いることができる(Curielら、1992、Hum.Gene Ther.3:147−154;ならびにWuおよびWu、1987、J.Biol.Chem.262:4429−4432)。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または異種RNAまたはDNAの取り込みを意味する。外来性または異種RNAまたはDNAが細胞内部に導入された場合、細胞はそのようなRNAまたはDNAによって「トランスフェクトされている」。トランスフェクトされたRNAまたはDNAが表現型の変化をもたらす場合、細胞は外来性または異種RNAまたはDNAによって「形質転換されている」。形質転換RNAまたはDNAは染色体DNAに(共有結合的に)組み込まれ、細胞のゲノムを形成する。
「形質転換」とは、宿主の生物のゲノムへの核酸断片の導入をいい、その結果、遺伝的に安定な遺伝がもたらされる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物という。
用語「遺伝子領域」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域をいう。
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅またはその発現が求められる細胞宿主における複製用の1以上の起点、マーカーまたは選択マーカーを含むことができる。
用語「選択マーカー」は、同定因子、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択することができる因子を意味し、通常は、抗生物質または化学的抵抗性遺伝子であり、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、および/または注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。当該分野で知られ、用いられる選択マーカー遺伝子としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を供する遺伝子;および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を意味し、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定し、および/または遺伝子発現の誘導または転写を測定する。当該分野で知られ、用いられるレポーター遺伝子の例はルシフェラーゼ(Luc)、緑色蛍光蛋白質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β−ガラクトシダーゼ(LacZ)、β−グルクロニダーゼ(Gus)などを含む。選択マーカー遺伝子はレポーター遺伝子と考えることもできる。
「プロモーター」とは、コーディング配列または機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列をいう。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の3’側に位置する。プロモーターは天然遺伝子からその全体が由来してもよく、あるいは天然で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてよく、あるいは合成DNAセグメントを含んでなるものでさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることは当業者に理解される。遺伝子をほとんどの機会、ほとんどの細胞型で発現させるプロモーターは、通常「構成的プロモーター」といわれる。遺伝子を特定の細胞型で発現させるプロモーターは、通常、「細胞−特異的プロモーター」または「組織−特異的プロモーター」といわれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階で発現させるプロモーターは、通常、「発生−特異的プロモーター」または「細胞分化−特異的プロモーター」といわれる。当該プロモーターを誘導する物質、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などでの細胞の暴露または処理に続いて誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」といわれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有することができることはさらに認識されている。
「プロモーター配列」は、細胞中でRNAポリメラーゼに結合し、下流(3’方向)コーディング配列の転写を開始させることができるDNA調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、転写開始部位によってその3’末端において境があり、上流(5’方向)に伸びて、バックグラウンドを越えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、(例えば、ヌクレアーゼS1でのマッピングによって便宜に画定される)転写開始部位、ならびにRNAポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合ドメイン(コンセンサス配列)が見出されるであろう。
コーディング配列は、RNAポリメラーゼがコーディング配列をmRNAに転写し、次いで、それが(もしコーディング配列がイントロンを含むならば)トランス−RNAスプライシングされ、コーディング配列によってコードされた蛋白質に翻訳される場合、細胞中での転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなDNA調節配列である。真核生物細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
用語「応答エレメント」は、第1のキメラ遺伝子のDNA−結合ドメインとの相互作用を介して媒介されたプロモーターに対する応答性を付与する1以上のシス−作用性DNAエレメントを意味する。このDNAエレメントはその配列が回文構造(完全または不完全)であるか、あるいは可変数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフまたはハーフ部位よりなることからできる。該ハーフ部位は同様または同一であり、直接または逆転反復いずれかとして、あるいは単一ハーフ部位またはタンデムな隣接ハーフ部位のマルチマーとして配列できる。応答エレメントは、当該応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に応じて異なる生物から単離された最小プロモーターを含むことができる。第1のハイブリッド蛋白質のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下または不存在下で、応答エレメントのDNA配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントについてのDNA配列の例としてはRRGG/TTCANTGAC/ACYY(Cherbas L.ら、(1991)、Genes Dev.5、120−131参照);AGGTCAN(n)AGGTCA(N(n)は1以上のスペーサーヌクレオチドであり得る)(D’Avino PP.ら、(1995)、Mol.Cell.Endocrinol、113、1−9);およびGGGTTGAATGAATTT(Antoniewski C.ら、(1994)、Mol.Cell Biol.14、4465−4474)が挙げられる。
用語「作動可能に連結した」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸断片に対する核酸配列の関連をいう。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響できる(すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある)場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンス向きに調節配列に作動可能に連結することができる。
本明細書中で用いるように、用語「発現」とは、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写および安定した蓄積をいう。また、発現はmRNAの蛋白質またはポリペプチドへの翻訳もいうこともできる。
用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特定の制限部位において、あるいは相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるDNAのセグメントをいう。DNAのセグメントは注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレームにてカセットの挿入を確実とするように設計される。「形質転換カセット」とは、注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易とするエレメントを有する特定のベクターをいう。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットは、宿主細胞における注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能とするエレメントも含むことができる。これらのエレメントは、限定されるものではないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含むことができる。
本発明の目的では、用語「遺伝子スイッチ」とは、プロモーターと関連した応答エレメント、および1以上のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれる遺伝子の発現を変調するEcRベースのシステムの組合せをいう。
用語「変調する」は、核酸または遺伝子の発現を誘導し、減少させ、または阻害し、その結果、蛋白質またはポリペプチド生産をそれぞれ誘導し、減少させまたは阻害することを意味する。
本発明によるプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞において遺伝子の発現を駆動するのに適当な少なくとも1つのプロモーターを含むことができる。用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換に続いて挿入された核酸配列の発現を可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。クローン化遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどのような制御エレメントの制御下におかれる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動することができる実質的にいずれのプロモーターも本発明で適当であり、限定されるものではないが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター;CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、(Saccharomycesにおける発現で有用な)アルカリホスファターゼプロモーター;(Pichiaにおける発現で有用な)AOX1プロモーター;(Escherichia coliにおける発現で有用な)β−ラクタマーゼ、lac、ara、tet、trp、lP、lP、T7、tacおよびtrcプロモーター;光調節−、種子特異的−、花粉特異的−、子房特異的−、病原または病気関連−、カリフラワーモザイクウイルス35S、CMV 35S最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス(CsVMV)、クロロフィルa/b結合蛋白質、リブロース1,5−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ、茎−特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロバシリフォームウイルス、植物スーパー−プロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、ニトレートレダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白質、およびアントシアニンプロモーター(植物細胞における発現で有用);を含み;当該分野で知られた動物および哺乳動物プロモーターは、限定されるものではないが、SV40早期(SV40e)プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス(RSV)の3’ロングターミナルリピート(LTR)に含まれたプロモーター、アデノウイルス(Ad)のE1Aのプロモーターまたは主要後期プロモーター(MLP)遺伝子、サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、伸長因子1アルファ(EF1)プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)プロモーター、ユビキチン(Ubc)プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Lプロモーターの調節配列および転写制御領域、ユビキタスプロモーター(HPRT、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど)、中間フィラメント(デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAPなど)のプロモーター、(MDR、CFTRまたは第VIII型因子などの)治療遺伝子のプロモーター、病因または病気関連−プロモーター、および組織特異性を呈しトランスジェニック動物で利用されてきたプロモーターで;例えば膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域、膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域;肝臓で活性な、アルブミン遺伝子、Apo AIおよびApo AII制御領域、肝臓で活性なアルファ−フェト蛋白質遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ1−アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞で活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳中の稀突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−2遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域;ピルベートキナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸蛋白質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーターなどを含む。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって修飾することもできる。
本発明の実施形態で用いることができるエンハンサーは、限定されるものではないが、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー、伸長因子1(EF1)エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどを含む。
終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列もまた好ましい宿主本来の種々の遺伝子に由来することができる。所望により、終止部位は必要ではないが、もし含まれれば最も好ましい。本発明の好ましい実施形態において、終止制御領域は合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、SV40後期ポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などを含むことができるか、またはそれに由来することができる。
用語「3’非−コーディング配列」または「3’非翻訳領域(UTR)」とは、コーディング配列の下流(3’側)に位置するDNA配列をいい、それは、ポリアデニル化[ポリ(A)]認識配列およびmRNAプロセッシングまたは遺伝子発現に影響することができる調節シグナルをコードする他の配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することによって特徴付けられる。
「調節領域」は、第2の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特定の核酸(相同領域)を発現することを天然で担う配列を含むことをできるか、あるいは異なる蛋白質または合成蛋白質(異種領域)でさえ発現することを担う異なる起源の配列を含むことができる。特に、該配列が原核生物、真核生物またはウイルス遺伝子の配列であり得るか、または特異的もしくは非特異的に、かつ誘導または非誘導様式で遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列であり得る。調節領域は複製起点、RNAスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路へと向かわせるシグナル配列を含む。
「異種源」からの調節領域は、発現された核酸と天然では関連しない調節領域である。異種調節領域内には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列および天然では生じないが当業者によって設計される調節配列が含まれる。
「RNA転写体」とは、DNA配列のRNAポリメラーゼ−触媒転写に由来する産物をいう。RNA転写体がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写体といい、あるいはそれは一次転写体の転写後プロセッシングに由来するRNA配列であってよく、これは成熟RNAという。「メッセンジャーRNA(mRNA)」とは、イントロンが無く、細胞によって蛋白質に翻訳することができるRNAをいう「cDNA」とは、mRNAに相補的であり、それに由来する二本鎖DNAをいう。「センス」RNAとは、mRNAを含み、従って、細胞によって蛋白質に翻訳することができるRNA転写体をいう。「アンチセンスRNA」とは、標的一次転写体またはmRNAの全てまたは一部に相補的であって、標的遺伝子の発現をブロックするRNA転写体をいう。アンチセンスRNAの相補性は特定の遺伝子転写体のいずれかの部分、すなわち、5’非−コーディング配列、3’非−コーディング配列、またはコーディング配列におけるものであり得る。「機能的RNA」とは、アンチセンスRNA、リボザイムRNA、または翻訳されていないが、細胞プロセスに対して影響を有する他のRNAをいう。
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基を含んでなるポリマー化合物である。アミノ酸は以下の構造式を有する。
Figure 0004994563
アミノ酸は側鎖Rに基づいて7つの群に分類される:(1)脂肪族側鎖、(2)ヒドロキシル(OH)基を含む側鎖、(3)硫黄原子を含む側鎖、(4)酸性基またはアミド基を含む側鎖、(5)塩基性基を含む側鎖、(6)芳香族環を含む側鎖、および(7)側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸、プロリン。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約14のアミノ酸を含む。
「蛋白質」は、生きた細胞において構造的または機能的役割を行うポリペプチドである。
「単離されたポリペプチド」または「単離された蛋白質」とは、通常はその天然状態においてそれと関連する化合物(例えば、他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質)を実質的に含まないポリペプチドまたは蛋白質である。「単離された」とは、他の化合物との人工的または合成的混合物、または生物学的活性に干渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定化剤の添加、または医薬上許容される製剤への調合のため存在し得る不純物の存在を排除することを意味しない。
「置換突然変異体ポリペプチド」または「置換突然変異体」は、野生型または天然に生じるポリペプチドに対して異なるアミノ酸を持つ少なくとも1つの野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む突然変異体ポリペプチドを意味すると理解されるであろう。置換突然変異体ポリペプチドは、1つの野生型または天然に生じるアミノ酸置換のみを含むことができ、これは、「点突然変異体」または「単一点突然変異体」ポリペプチドということができる。あるいは、置換突然変異体ポリペプチドは、野生型または天然に生じるポリペプチドに対する2以上のアミノ酸による、2以上の野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含むことができる。本発明によれば、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然に生じるグループB核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドに対して異なるアミノ酸による、少なくとも1つの野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む。
置換突然変異体ポリペプチドが、2以上の野生型または天然に生じるアミノ酸の置換を含む場合、この置換は、置換につき欠失されたのと同等数の野生型または天然に生じるアミノ酸、すなわち、2つの非−野生型または非−天然に生じるアミノ酸で置換された2つの野生型または天然に生じるアミノ酸、または置換につき欠失された非−同等数の野生型アミノ酸、すなわち、1つの非−野生型アミノ酸で置換された2つの野生型アミノ酸(置換+欠失突然変異)、または、3つの非−野生型アミノ酸で置換された2つの野生型アミノ酸(置換+挿入突然変異)のいずれかを含むことができる。
置換突然変異体は、参照ポリペプチド配列内で置換されたアミノ酸の残基および数ならびに置換された新しいアミノ酸残基を示す省略命名システムを用いて記載することができる。例えば、ポリペプチドの20番目のアミノ酸残基が置換された置換突然変異体は、「x20z」と略することができ、ここに、「x」は置換されるべきアミノ酸であり、「20」はポリペプチド内のアミノ酸残基の位置または数であって、「z」は新しい置換されたアミノ酸である。従って、相互交換可能に「E20A」または「Glu20Ala」と略された置換突然変異体は、当該突然変異体が、ポリペプチドの位置20において(当該分野において通常は「E」または「Glu」と略される)グルタミン酸の代わりに(当該分野では通常「A」または「Ala」と略される)アラニン残基を含むことを示す。
置換突然変異は、限定されるものではないが、イン・ビトロ部位特異的変異誘発(site−directed mutagenesis)(Hutchinson,C.ら、1978、J.Biol.Chem.253:6551;ZollerおよびSmith、1984、DNA 3:479−488;Oliphantら、1986、Gene 44:177;Hutchinsonら、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:710)、TAB(登録商標)リンカー(Pharmacia)の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化/断片欠失および置換、PCR−媒介/オリゴヌクレオチド特異的変異誘発等を含めた、当該分野で知られた突然変異誘発についてのいずれかの技術によってなすことができる。PCR−ベースの技術は部位特異的変異誘発について好ましい(Higuchi、1989、「Using PCR to Engineer DNA」、PCR Technology中:Principles and Applications for DNA Amplification、H.Erlich編、Stockton Press、第6章、ページ61−70参照)。
本発明によるポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドの配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドに関する全部分にわたり、同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解されるであろう。そのような断片は、適切には、それらがその一部であるより大きなポリペプチドに含まれることができる。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、少なくとも2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240または300のアミノ酸の長さを有することができる。
ポリペプチドまたは蛋白質の「変種」は、ポリペプチドまたは蛋白質に由来し、かつ当該ポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも1つの生物学的特性を保持する全てのアナログ、断片、誘導体または突然変異体である。ポリペプチドまたは蛋白質の異なる変種は天然に存在することができる。これらの変種は、蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴付けられる対立遺伝子変種であってもよく、あるいはディファレンシャルスプライシング(differential splicing)または翻訳後修飾を含むことができる。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変種を生じさせることができる。これらの変種は、とりわけ、(a)1以上のアミノ酸残基が保存的または非−保存的アミノ酸で置き換えられた変種、(b)1以上のアミノ酸がポリペプチドまたは蛋白質に付加された変種、(c)1以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および(d)ポリペプチドまたは蛋白質が血清アルブミンのような他のポリペプチドと融合した変種を含むことができる。遺伝的(抑制、欠失、突然変異等)、化学的および酵素的技術を含めた、これらの変種を得るための技術は当業者に知られている。変種ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約14のアミノ酸を含む。
「異種蛋白質」とは、細胞中で天然では生じない蛋白質をいう。
「成熟蛋白質」とは、翻訳後に加工されたポリペプチド;すなわち、それから、一次翻訳産物中に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されたものをいう。「前駆体」蛋白質とは、mRNAの翻訳の一次産物をいう;すなわち、プレおよびプロペプチドが依然として存在する。プレおよびプロペプチドは、限定されるものではないが、細胞内局在シグナル(intracellular localization signal)であり得る。
用語「シグナルペプチド」とは分泌される成熟蛋白質に先行するアミノ末端ポリペプチドをいう。シグナルペプチドは切断され、従って、成熟蛋白質には存在しない。シグナルペプチドは、分泌された蛋白質を細胞膜を横切るように向け、移動させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナル蛋白質ともいう。
「シグナル配列」は、細胞の表面に発現されるべき蛋白質のコーディング配列の始めに含まれる。この配列は成熟ポリペプチドに対してN−末端側にあり、宿主細胞に指令してポリペプチドを移動させるシグナルペプチドをコードする。用語「移動(translocation)シグナル配列」は、ここでは、この種類のシグナル配列をいうのに用いられる。移動シグナル配列は真核生物および原核生物に対して天然の種々の蛋白質と関連することが分かっており、しばしば、双方のタイプの生物で機能できる。
用語「相同性」とは、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド部分の間の同一性のパーセントをいう。1つの部分からの配列およびもう1つからの配列の間の対応性は、当該分野で知られた技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、かつ容易に入手できるコンピュータプログラムを用いることによって、2つのポリペプチド分子の間の配列情報の直接的比較によって決定することができる。別法として、相同性は、相同領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリライゼーション、続いての、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化された断片のサイズ測定によって決定することができる。
本明細書中で用いるように、全てのその文法の形式およびスペリングの変化における用語「相同な」とは、スーパーファミリー(例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー)からの蛋白質および異なる種からの相同蛋白質(例えば、ミオシン軽鎖等)を含めた、「共通の進化起源」を保有する蛋白質の間の関係をいう(Reeckら、1987、Cell 50:667)。そのような蛋白質(およびそのコーディング遺伝子)は、その高い配列同様性の程度によって反映される配列相同性を有する。しかしながら、通常の用法および本出願においては、用語「相同な」は、「高度に」のような副詞で修飾された場合、配列同様性を言うことができ、共通の進化起源をいわない。
従って、全てのその文法的形式における用語「配列同様性」とは、共通の進化起源を有しても有さなくてもよい蛋白質の核酸もしくはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の程度をいう(Reeckら、1987、Cell 50:667参照)。
特定の実施形態においては、ヌクレオチドの少なくとも約50%(好ましくは少なくとも約75%、最も好ましくは少なくとも約90または95%)がDNA配列の画定された長さにわたってマッチする場合、2つのDNA配列は「実質的に相同」または「実質的に同様」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手できる標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、その特定のシステムにつき定義された、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の画定は当業者の技量内のものである。例えば、Sambrookら、1989、前掲参照。
本明細書中で用いるように「実質的に同様な」とは、1以上のヌクレオチド塩基の変化の結果、1以上のアミノ酸が置換されるが、DNA配列によってコードされる蛋白質の機能的特性には影響しない核酸断片をいう。また、「実質的に同様な」とは、1以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたは共抑制技術による遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片もいう。また、「実質的に同様な」とは、得られる転写体の機能的特性に実質的に影響しない1以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入のような本発明の核酸断片の修飾もいう。従って、本発明は特定の具体的配列以上のものを含むことが理解される。提案された修飾の各々は、コードされた産物の生物学的活性の保持の測定と同様に、十分に当業者のルーチン的技量内のものである。
さらに、当業者であれば、本発明に含まれる実質的に同様な配列は、ストリンジェントな条件(0.1×SSC、0.1%SDS、65℃および洗浄2×SSC、0.1%SDS、続いての0.1×SSC、0.1%SDS)下で、本明細書中に例示した配列にハイブリダイズするそれらの能力によって、画定されることを認識するであろう。本発明の実質的に同様な核酸断片は、そのDNA配列が本明細書に報告した核酸断片のDNA配列と少なくとも70%同一であるものである。本発明の実質的に好ましい核酸断片は、そのDNA配列が、本明細書に報告した核酸断片のDNA配列と少なくとも80%同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、本明細書に報告する核酸断片のDNA配列に少なくとも90%同一である。なおより好ましいのは、ここに報告する核酸断片のDNA配列に対して少なくとも95%同一である核酸断片である。
約40%を超えるアミノ酸が同一であるか、あるいは60%を超えて同様である(機能的に同一である)場合に、2つのアミノ酸配列は「実施的に相同」または「実質的に同様」である。好ましくは、同様または相同な配列は、例えば、GCG(Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、Version 7、Madison Wisconsin)パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。
用語「に対応する」は、ここでは、正確な位置が同様性または相同性が測定される分子と同一であるかまたは異なるかを問わず、同様なまたは相同な配列をいうのに用いられる。核酸またはアミノ酸配列アラインメントはスペースを含むことができる。かくして、用語「に対応する」とは、配列同様性をいい、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングをいわない。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価によるか、またはBLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul,S.F.ら、(1993)、J.Mol.Biol.215:403−410;またwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/参照)のようなアルゴリズムを用いるコンピュータ−自動配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、10以上の連続アミノ酸または30以上のヌクレオチドの配列が、ポリペプチドまたは核酸配列が既知の蛋白質または遺伝子に相同であるかを推定的に同定するのに必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、20−30の連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定(例えば、サザンハイブリダイゼーション)および単離(例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのイン・サイチュハイブリダイゼーション)の配列−依存的方法で用いることができる。加えて、12−15塩基の短いオリゴヌクレオチドをPCRにおける増幅プライマーとして用いて、プライマーを含む特定の核酸断片を得ることができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、該配列を含む核酸断片を特異的に同定しおよび/または単離するのに十分な配列を含む。
当該分野で知られたように、用語「同一性パーセント」は、配列を比較することによって決定されるように、2以上のポリペプチド配列または2以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野においては、「同一性」とは、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味し、この場合には、かかる配列のストリングの間のマッチによって決定され得る。「同一性」および「同様性」は、Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編)Oxford University Press、New York(1988);Biocomputing;Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編)Academic Press、New York(1993);Computer Analysis of Sequence Data、Part I(Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編)Humana Press、New Jersey(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.編)Academic Press(1987);およびSequence Analysis Primer(Gribskov,M.およびDevereux,J.編)Stockton Press、New York(1991)に記載されたものを含めた公知の方法によって容易に計算することができるが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、テストする配列の間で最良のマッチを与えるように設計される。同一性および同様性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに編修されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、LASER GENEバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのMegalignプログラム(DNASTAR Inc.、Madison、WI)を用いて行うことができる。配列の多重アラインメントは、デフォルトパラメーター(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10)を備えたアラインメントのClustal方法(HigginsおよびSharp(1989)CABIOS.5:151−153)を用いて行うことができる。Clustal方法を用いる対様式のアラインメントについてのデフォルトパラメーターを選択することができる:KTUPLE 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5およびDIAGONALS SAVED=5。
用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析で有用ないずれのコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムもいう。「配列分析ソフトウェア」は、市販で入手できるか、あるいは独立して開発することができる。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定されるものではないが、プログラムのGCGスイート(Wisconsin Package Version 9.0、Genetics Computer Group(GCG)、Madison、WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschulら、J.Mol.Biol.215:403−410(1990))、およびDNASTAR(DNASTAR,Inc.1228 S.Park St.Madison、WI 53715 USA)を含むであろう。本出願の文脈内では配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合、特に断りのない限り、分析の結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づくであろう。本明細書中で用いる「デフォルト値」とは、最初に初期化した時に最初にソフトウェアにロードされた値またはパラメーターのいずれの組も意味するであろう。
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手法を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを連結し、アニールして、遺伝子セグメントを形成させ、次いで、これを酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。DNAの配列に関連する「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドがイン・ビトロで組み立てられたことを意味する。DNAの手動化学合成はよく確立された手法を用いて達成することができるか、あるいは多数の市販で入手可能なマシーンのうちの1つを用いて自動化学合成を行うことができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づく最適遺伝子発現となるように仕立てることができる。もし、コドン利用が宿主に好都合なコドンに偏るならば、当業者であれば首尾よい遺伝子発現の確率を認識するであろう。好ましいコドンの決定は、配列の情報が入手可能な場合には、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
本明細書で用いるように、2以上の個々に作動できる遺伝子調節システムは、a)選択された濃度において、その各リガンドによる与えられたシステムの各々の変調の結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさが測定可能に変化し、およびb)該変化が、現実の変調の同時性または順次性に関わらず、細胞、組織または生物において同時に作動することができる全ての他のシステムの発現の変化とは統計学的に有意に異なる場合、「直交している」と言われる。好ましくは、各々が独自で作動できる遺伝子調節システムの変調は、細胞、組織または生物における全ての他の作動可能なシステムよりも少なくとも2倍より大きく遺伝子発現の変化に影響する。より好ましくは、該変化は少なくとも5倍大きい。なおより好ましくは、該変化は少なくとも10倍大きい。さらにより好ましくは、該変化は少なくとも100倍大きい。さらになおより好ましくは、該変化は少なくとも500倍大きい。理想的には、選択された濃度におけるその各リガンドによる与えられたシステムの各々の変調の結果、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定可能な変化が起こり、細胞、組織または生物において作動できる全ての他のシステムの発現の測定可能な変化は起きない。そのような場合、多重誘導性遺伝子調節システムは「十分に直交している」と言われる。本発明は、ここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の米国出願第60/237,446号に記載されたもののような直交リガンドおよび直交受容体−ベースの遺伝子発現システムにつきサーチするのに有用である。
本発明の遺伝子発現変調システム
かくして、出願人らは、グループB−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるリガンド感受性および誘導の大きさに影響するアミノ酸残基をここに同定した。出願人らは、ここに、これらの臨界的残基における置換突然変異を含むグループB核受容体(ここでは、「置換突然変異体」という)の構築、およびこれらの置換突然変異体核受容体が遺伝子発現を変調する方法で有用であるという証明を記載する。本明細書中で提示するように、出願人らの新規な置換突然変異体核受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用は、適用に応じてリガンド感受性およびトランス活性化の大きさを所望により選択することができる、原核生物および真核生物両宿主細胞における改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。
かくして、本発明は、新規な置換突然変異体グループB核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、そのような突然変異したグループB核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システム、およびそのような核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を変調する方法に関する。
特に、本発明は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現変調システムに関する。好ましくは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、レチノイドX受容体α、レチノイドX受容体β、レチノイドX受容体γ、H−2領域II結合蛋白質(H−2RIIBP)、核受容体コレギュレーター−1(RCoR−1)、ウルトラスピラクル蛋白質、2C1核受容体、および漿膜因子1(CF−1)からのものである。より好ましくは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、脊椎動物レチノイドX受容体α、脊椎動物レチノイドX受容体β、脊椎動物レチノイドX受容体γ、または無脊椎動物レチノイドX受容体からのものである。
特定の実施形態において、遺伝子発現変調システムは、a)トランス活性化ドメイン、その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するDNA−結合ドメイン;および置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む第1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第1の遺伝子発現カセット、およびb)核受容体リガンド結合ドメインを含む第2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第2の遺伝子発現カセットを含む。該遺伝子発現変調システムは、さらに、i)第1のポリペプチドのDNA−結合ドメインによって認識される応答エレメント;ii)第1のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター;およびiii)その発現を変調すべき遺伝子を含む第3の遺伝子発現カセットを含むことができる。
好ましい実施形態においては、第2のポリペプチドは、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体(UR)、オーファン受容体1(OR−1)、NER−1、受容体相互作用蛋白質15(RIP−15)、肝臓X受容体β(LXRβ)、ステロイドホルモン受容体−様蛋白質(RLD−1)、肝臓X受容体(LXR)、肝臓X受容体(LXRα)、ファルネソイドX受容体(FXR)、受容体相互作用蛋白質14(RIP−14)、およびファルネゾール受容体(HRR−1)リガンド結合ドメインよりなる群から選択されるグループH核受容体リガンド結合ドメインを含む。
他の特定の実施形態において、遺伝子発現変調システムは、その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するDNA−結合ドメインおよび第1の核受容体リガンド結合ドメインを含む第1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第1の遺伝子発現カセット、およびトランス活性化ドメインおよび第2の核受容体リガンド結合ドメインを含む第2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第2の遺伝子発現カセットを含み、ここに、核受容体リガンド結合ドメインのうちの1つは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインである。好ましい実施形態においては、第1のポリペプチドはトランス活性化ドメインを実質的に含まず、第2のポリペプチドはDNA結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的では、「実施的に含まない」とは、問題の蛋白質が、活性化または結合活性を供するのに十分な問題のドメインの配列を含まないことを意味する。遺伝子発現変調システムは、さらに、i)第1の遺伝子発現カセットの第1のポリペプチドのDNA−結合ドメインによって認識される応答エレメント;ii)第2の遺伝子発現カセットの第2のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター;およびiii)その発現を変調すべき遺伝子を含む第3の遺伝子発現カセットを含むことができる。
好ましい実施形態においては、ただ1つの核受容体リガンド結合ドメインが置換突然変異を含むグループBリガンド結合ドメインである場合、他の核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むグループBリガンド結合ドメインとでダイマーを形成するいずれかの他の核受容体からのものであってよい。特定の実施形態においては置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインであり、他の核受容体リガンド結合ドメイン(「パートナー」)はグループH核受容体からのものである。好ましい実施形態においては、グループH核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体(UR)、オーファン受容体1(OR−1)、NER−1、受容体相互作用蛋白質15(RIP−15)、肝臓X受容体β(LXRβ)、ステロイドホルモン受容体−様蛋白質(RLD−1)、肝臓X受容体(LXR)、肝臓X受容体(LXRα)、ファルネソイドX受容体(FXR)、受容体相互作用蛋白質14(RIP−14)、およびファルネゾール受容体(HRR−1)、リガンド結合ドメインよりなる群から選択される。
エクジソン受容体(EcR)リガンド結合ドメイン(LBD)は、無脊椎動物EcRからのものであってよく、好ましくは節足動物(Arthropod)網EcRから選択される。好ましくは、EcRは鱗翅目(Lepidopteran)EcR、双翅目(Dipteran)EcR、直翅目(Orthopteran EcR)、同翅目(Homopteran)EcRおよび半翅目(Hemipteran)EcRよりなる群から選択される。より好ましくは、本発明で用いるEcRリガンド結合ドメインは、ハマキガ科のガ Choristoneura fumiferana(トウヒシントメハマキ)EcR(「CfEcR」)、甲虫 Tenebrio molitor(チャイロコメノゴミムシダマシ)EcR(「TmEcR」)、Manduca sexta(タバコスズメガ)EcR(「MsEcR」)、Heliothies virescens(オオタバコガ)EcR(「HvEcR」)、ユスリカ Chironomus tentans(キミドリユスリカ)EcR(「CtEcR」)、カイコガ Bombyx mori EcR(「BmEcR」)、ヤブニラミブッシュブラウン Bicyclus anynana EcR(「BanEcR」)、トチノキ Junonia coenia(アメリカタテハモドキ)EcR(「JcEcR」)、ミバエ Drosophila melanogaster(キイロショウジョウバエ)EcR(「DmEcR」)、カ Aedes aegypti(ネッタイシマカ)EcR(「AaEcR」)、クロバエ Lucilia capitata(「LcEcR」)、クロバエ Lucilia cuprina(ヒツジキンバエ)EcR(「LucEcR」)、クロバエ Calliphora vicinia(ホホアカクロバエ)EcR(「CvEcR」)、地中海ミバエ Ceratitis capitata(チチュウカイミバエ)EcR(「CcEcR」)、バッタ Locusta migratoria(トノサマバッタ)EcR(「LmEcR」)、アブラムシ Myzus persicae(モモアカアブラムシ)EcR(「MpEcR」)、シオマネキ Celuca pugilator EcR(「CpEcR」)、コナジラミ Bamecia argentifoli(シルバーリーフコナジラミ)EcR(「BaEcR」、配列番号:74)、ヨコバイ Nephotetix cincticeps(ツマグロヨコバイ)EcR(「NcEcR」、配列番号:75)またはマダニ Amblyomma americanum EcR(「AmaEcR」)からのものである。より好ましくは、LBDはCfEcR、DmEcRまたはAmaEcRからのものである。
「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、さらに、トランケーション突然変異、欠失突然変異、第2の置換突然変異、または他の修飾を含むことができる。
特定の実施形態においては、LBDはトランケートされたEcRポリペプチドからのものである。EcRポリペプチドトランケーションの結果、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260または265のアミノ酸の欠失をもたらす。好ましくは、EcRポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも部分的ポリペプチドドメインの欠失がもたらされる。より好ましくは、EcRポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも全ポリペプチドドメインの欠失がもたらされる。特定の実施形態においてはEcRポリペプチドのトランケーションの結果、A/B−ドメイン、C−ドメイン、D−ドメイン、F−ドメイン、A/B/C−ドメイン、A/B/1/2−C−ドメイン、A/B/C/D−ドメイン、A/B/C/D/F−ドメイン、A/B/F−ドメイン、A/B/C/F−ドメイン、部分的Eドメイン、または部分的Fドメインの欠失をもたらす。いくつかの完全なおよび/または部分的なドメイン欠失の組み合わせがなされ得る。
特定の実施形態においてその発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して相同な遺伝子である。他の特定の実施形態において、その発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して異種遺伝子である。
後記する本発明で用いるリガンドは、核受容体のリガンド結合ドメインと一緒になった場合、次いで核受容体が遺伝子に連結した応答エレメントに結合し、遺伝子の発現の外部一時的調節のための手段を提供する。例えば、リガンドとリガンド結合ドメイン、DNA−結合ドメインと応答エレメント、トランス活性化ドメインとプロモーターのように、本発明の種々の構成要素が相互に結合する結合メカニズムまたは順序は臨界的ではない。
特定の例においては、グループB核受容体および、所望により、その核受容体リガンド結合ドメインパートナーのリガンド結合ドメインへの該リガンドの結合は、遺伝子の発現または抑制を可能とする。このメカニズムは、グループB核受容体(GBNR)またはそのパートナーへのリガンド結合に対するポテンシャル、および活性ホモダイマー複合体(例えば、GBNR+GBNRまたはパートナー+パートナー)の形成が得られることを排除しない。好ましくは、受容体ドメインの1以上は変化し、ハイブリッド遺伝子スイッチを生じる。典型的には、3つのドメイン、DNA結合ドメイン(DBD)、リガンド結合ドメイン(LBD)およびトランス活性化ドメイン(AD)のうちの1以上は、ハイブリッド遺伝子およびその結果としてのハイブリッド蛋白質がトランス活性化の活性、リガンドの相補的結合、および特定の応答エレメントの認識につき選択された宿主細胞または生物において最適化されるように、他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。加えて、応答エレメントそれ自体は、酵母からのGAL−4蛋白質(Sadowskiら(1988)Nature、335:563−564参照)もしくはEscherichia coliからのLexA蛋白質(BrentおよびPtashne(1985)、Cell、43:729−736)をはじめとする他のDNA結合蛋白質ドメインについての応答エレメントで、または特定の相互作用(例えば、Kimら(1997)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94:3616−3620参照)のために設計され、修飾されおよび選択された蛋白質との標的化相互作用につき特異的な合成応答エレメントで、修飾または置換されることができ、ハイブリッド受容体を適応させる。2−ハイブリッドシステムの他の利点は、所望の最終目的に従い遺伝子発現を駆動させるのに用いるプロモーターの選択が可能であることである。そのような二重制御は遺伝子治療の領域で重要であり得、特に細胞毒性蛋白質が生産される場合に、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞を共に制御できるために重要であり得る。適当なプロモーターに作動可能に連結した遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性遺伝子の発現は本発明のシステムの存在によって制御される。プロモーターは構成的にまたは誘導的に調節することができるか、組織−特異的(すなわち、特定のタイプの細胞でのみ発現される)、または生物のある発生段階に特異的であってよい。
レチノイドX受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであって、サブファミリー2、グループB(ここでは「グループB核受容体」という)に分類される。各グループのメンバーはE(リガンド結合)ドメインにおいて40−60%アミノ酸同一性を共有する(Laudetら、A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily、1999:Cell 97:161−163)。レチノイドX受容体に加え、この核受容体サブファミリー2、グループBの他のメンバーは、H−2領域II結合蛋白質(H−2RIIBP)、核受容体コレギュレーター−1(RCoR−1)、ウルトラスピラクル蛋白質(USP)、2C1核受容体、および漿膜因子1(CF−1)を含む。
出願人らは、以前に、エクジソン受容体−ベースの遺伝子発現システムと一緒になった脊椎動物RXRが、増大したリガンド感受性およびトランス活性化の大きさによって特徴付けられる酵母および哺乳動物細胞における誘導性遺伝子発現システムを提供することを証明した(係属中の出願PCT/US01/09050号参照)。最近、出願人らは、遺伝子発現システムの遺伝子トランス活性化およびリガンド感受性を増加させることによってエクジソン受容体−ベースの遺伝子発現システムにおいて、無脊椎動物RXRが脊椎動物RXRと同様に、またはそれよりも良好に機能できることを示した(係属中の出願US第60/294、814号参照)。
本明細書中で記載するように、出願人らは、今回、核受容体−ベースの発現システムのトランス活性化およびリガンド感受性に影響するRXRのリガンド結合ドメイン内の臨界的なアミノ酸残基を同定した。後記実施例2−4において、出願人らは、脊椎動物RXRのアミノ酸とは異なる無脊椎動物レチノイドX受容体(実施例2および3参照)および無脊椎動物ウルトラスピラクル蛋白質(実施例4参照)リガンド結合ドメインからアミノ酸を同定した。出願人らは、それらの類似の位置において、野生型脊椎動物RXRアミノ酸を無脊椎動物RXRまたはUSPのアミノ酸に置き換えることによって、脊椎動物RXRリガンド結合ドメイン内で置換突然変異をなし、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいて遺伝子発現をトランス活性化するその能力につきこれらの置換突然変異体をテストした。本明細書中の実施例に提示するように、出願人らは、今回、トランス活性化活性および/またはリガンド感受性の予期せぬかつ驚くべきレベルを呈するいくつかの新規なレチノイドX受容体リガンド結合ドメイン置換突然変異体を同定した。
他のグループB核受容体に対するレチノイドX受容体の密接な関連性を仮定すれば、出願人らの同定したレチノイドX受容体リガンド結合ドメインの置換突然変異は、他のグループB核受容体のリガンド結合ドメインの類似の位置に導入して、グループB核受容体−ベースの遺伝子発現システムにおいてリガンド結合またはリガンド感受性を修飾した場合に働くと予測される。出願人らの新規な置換突然変異したグループB核受容体リガンド結合ドメインのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産、および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用につき、核受容体−ベースの誘導性遺伝子変調システムで有用である。
特に、出願人らは、本明細書中において、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な遺伝子発現変調システムを記載する。この遺伝子発現システムは、トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメインおよびリガンド結合ドメインが1つのコードされたポリペプチド上にある「単一スイッチ」−ベースの遺伝子発現システムであり得る。別法として、該遺伝子発現変調システムは、トランス活性化ドメインおよびDNA−結合ドメインが2つの異なるコードされたポリペプチド上に位置する「デュアルスイッチ」−または「2−ハイブリッド」−ベースの遺伝子発現変調システムであり得る。出願人らは、置換突然変異した核受容体が、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムの構成要素として用いることができ、原核生物および真核生物細胞双方においてリガンド結合活性および/またはリガンド特異性を修飾することができることを初めて証明した。本明細書中で議論するように出願人らの知見は予測せぬかつ驚くべきことである。
好ましくは、本発明のグループB核受容体−ベースの遺伝子発現変調システムは、ヘテロダイマーまたはホモダイマーいずれかであってよい。好ましい実施形態においては、グループB核受容体リガンド結合ドメインはエクジソン受容体リガンド結合ドメインとヘテロ二量体化して、機能的EcR複合体を形成する。機能的EcR複合体は、一般に、ステロイド受容体ファミリーの2つのメンバー、種々の昆虫から得られたエクジソン受容体蛋白質、およびウルトラスピラクル(USP)蛋白質またはUSPの脊椎動物ホモログ、レチノイドX受容体蛋白質よりなるヘテロダイマー蛋白質複合体をいう(Yaoら(1993)Nature 366、476−479;Yaoら、(1992)Cell 71、63−72参照)。しかしながら、複合体は後に詳細に記載するように、ホモダイマーであってもよい。また、機能的エクジステロイド受容体複合体はイムノフィリンのようなさらなる蛋白質を含むこともできる。(DHR38またはベータFTZ−1のような)転写因子として知られた蛋白質のステロイド受容体ファミリーのさらなるメンバーもまた、EcR、USP、および/またはRXRにつきリガンド依存的または非依存的パートナーであり得る。加えて、(アダプターまたはメディエーターともいう)一般にコアクチベーターとして知られた蛋白質のような他の補因子も必要であろう。これらの蛋白質はDNAに配列−特異的に結合せず、基礎転写に関与しない。それらは、クロマチン構造に影響することによって、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することによって、アクチベーターのDNA−結合の刺激を含めた種々のメカニズムを介して転写活性化にそれらの影響を及ぼし得る。そのようなコアクチベーターの例としては、RIP140、TIF1、RAP46/Bag−1、ARA70、SRC−1/NCoA−1、TIF2/GRIP/NCoA−2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIPならびに乱交雑(promiscous)コアクチべーターC応答エレメントB結合蛋白質、CBP/p300が挙げられる(レビューについては、Glassら、Curr.Opin.Cell Biol.9:222−232、1997参照)。また、(リプレッサー、サイレンサーまたはサイレンシングメディエーターとしても知られた)一般にコリプレッサーとして知られた蛋白質補因子が、リガンドの不存在下において転写活性化を効果的に阻害するのに必要であろう。これらのコリプレッサーは、非リガンド化エクジソン受容体と相互作用して、応答エレメントにおける活性をサイレントとすることができる。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体の立体配座を変化させ、その結果、コリプレッサーの放出、および前記したコアクチベーターの動員をもたらし、それにより、そのサイレンシング活性をなくすることを示唆する。コリプレッサーの例としては、N−CoRおよびSMRTが挙げられる(レビューには、Horwitzら、Mol.Endocrinol.10:1167−1177、1996参照)。これらの補因子は細胞または生物内で内因性であってよいか、あるいは、調節または非調節いずれかの様式にて発現されるべきトランスジーンとして外因的に添加することができる。エクジソン受容体蛋白質、USPまたはRXRのホモダイマー複合体もまたある状況下で機能的であり得る。
エクジソン受容体複合体は、典型的には、全てのメンバーが、一般に、アミノ−末端トランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン(「DBD」)、およびヒンジ領域によってDBDから分離されたリガンド結合ドメイン(「LBD」)の存在によって特徴付けられる核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含む。本明細書中で用いるように、用語「DNA結合ドメイン」は、DNA結合ドメインが特定の応答エレメントと関連するように機能する限り、DNA結合蛋白質の全長までのDNA結合蛋白質の最小ポリペプチド配列を含む。また、核受容体スーパーファミリーのメンバーは4または5ドメイン:A/B、C、D、E、およびあるメンバーではFの存在によって特徴付けられる(米国特許第4,981,784号およびEvans、Science 240:889−895(1988))。「A/B」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「C」はDNA結合ドメインに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、および「E」はリガンド結合ドメインに対応する。また、ファミリーのいくつかのメンバーは、「F」に対応するLBDのカルボキシ−末端側にもう1つのトランス活性化ドメインを有することもできる。
DBDは、その間に、エクジソン応答エレメントについての特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P−ボックスおよびD−ボックスがある2つのシステイン亜鉛フィンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは天然であり、修飾されており、あるいは異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラであり得る。ステロイド受容体ファミリーのサブセットと同様にEcR受容体は、へテロ二量体化特性を担うあまりよくは画定されていない領域も保有する。核受容体のドメインは本来モジュールであるので、LBD、DBDおよびトランス活性化ドメインを相互に交換することができる。
エクジソン受容体複合体からの構成要素を組み込む遺伝子スイッチシステムは知られている。しかしながら、これらの既知のシステムにおいては、EcRが用いられる場合は常に、EcRは、同一分子上の天然もしくは修飾されたDNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインと関連する。USPまたはRXRは、典型的には、サイレントパートナーとして用いられる。出願人らは、以前に、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが同一分子の上にあると、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は高く、そのような活性は、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが異なる分子の上、すなわち、ヘテロダイマーまたはホモダイマー複合体の2つのパートナーの各々の上にあると、劇的に低下することを示した(PCT/US01/09050号参照)。
本発明の遺伝子発現カセット
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、宿主細胞において発現させることができる少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含み、ここに、遺伝子発現カセットは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。かくして、出願人らの発明は、本発明の遺伝子発現システムで用いることができる新規な遺伝子発現カセットも提供する。
特定の実施形態において、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセットは、a)トランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド;b)DNA−結合ドメインおよび置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞で発現させることができる遺伝子発現カセットを提供し、該遺伝子発現カセットは、a)トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメイン、および置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド;b)DNA−結合ドメインおよび置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明によるハイブリッドポリペプチドは少なくとも2つのポリペプチド断片を含み、ここに、各ポリペプチド断片は異なる源、すなわち、異なる核受容体、異なる種などからのものである。本発明によるハイブリッドポリペプチドは少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むことができ、ここに、各ポリペプチドドメインは異なる源からのものである。
特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体α(RXRα)、レチノイドX受容体β(RXRβ)、レチノイドX受容体γ(RXRγ)、H−2領域II結合蛋白質(H−2RIIBP)、核受容体コレギュレーター−1(RCoR−1)、ウルトラスピラクル蛋白質(USP)、2C1核受容体、または漿膜因子1(CF−1)からのものである。好ましい実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインは脊椎動物レチノイドX受容体α、脊椎動物レチノイドX受容体β、脊椎動物レチノイドX受容体γ、または無脊椎動物レチノイドX受容体からのものである。
かくして、本発明は、a)トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメイン、および置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド;b)DNA−結合ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットも提供する。好ましくは、該遺伝子発現カセットは、a)トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメイン、および置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド;b)DNA−結合ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメインおよび置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み;ここに、コードされたハイブリッドポリペプチドは少なくとも2つのポリペプチド断片を含み、ここに、各ポリペプチド断片は異なる源からのものである。
レチノイドX受容体(RXR)リガンド結合ドメイン(LBD)は無脊椎動物または脊椎動物RXRからのものであってよい。好ましくは、本発明で用いるRXRリガンド結合ドメインは、ヒト Homo sapiens(ヒト)(HsRXR)、マウス Mus musculus(ハツカネズミ)(MmRXR)、ラット Rattus norvegicus(ラット)(RnRXR)、ニワトリ Gallus gallus(チャボ)(GgRXR)、家畜ブタ Sus scrofa domestica(ブタ)(SsRXR)、カエル Xenopus laevis(アフリカツメガエル)(XlRXR)、ゼブラフィッシュ Danio rerio(ゼブラダニオ)(DrRXR)、甲虫 Tenebrio molitor(チャイロコメノゴミムシダマシ)RXRホモログ(「TmRXR」)、バッタ Locusta migratoria(トノサマバッタ)USP/RXRホモログ(「LmUSP」または「LmRXR」ともいう)、アブラムシ Myzus persicae(モモアカアブラムシ)RXRホモログ(「MpRXR」)、ミツバチ Apis mellifera(ヨーロッパミツバチ)RXRホモログ(「AmRXR」)、シオマネキ Celuca pugilator RXRホモログ(CpRXR)、マダニ Amblyomma americanum RXRホモログ1(「AmaRXR1」)、マダニ Amblyomma americanum RXRホモログ2(「AmaRXR2」)、ホヤ Polyandrocarpa misakiensis(ミサキマメイタボヤ)(PmRXR)、またはクラゲ Tripedalia cystophora RXR(TcRXR)からのものである。より好ましくはLBDはMmRXRまたはHsRXRからのものである。
特定の実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインは、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、ここにアミノ酸残基は、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、344、355、385、431、442、462、470、472、473、495、500、511、516または528、d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置にある。好ましい実施形態においては、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
他の特定の実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429のアミノ酸と同等または類似の位置におけるセリン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337、495、500または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基355または511と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基431または462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基442のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、j)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基473のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基516のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基321のアミノ酸と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン酸残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基450のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、o)配列番号:2のアミノ酸残基455のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456のアミノ酸と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、p)配列番号:2のアミノ酸残基470のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473のアミノ酸と同等または類似の位置におけるチロシン残基、q)配列番号:2のアミノ酸残基475、477および478のアミノ酸と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基476のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479のアミノ酸と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはr)配列番号:2のアミノ酸残基481のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483のアミノ酸と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、D344N、K355R、S385A、M431L、R442K、V462L、S470A、E471D、T473E、A495S、E500S、K511R、T516V、またはA528S、d)配列番号:2のG321L、P322R、およびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインである。
他の特定の実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインは、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、344、355、385、431、442、462、470、472、473、495、500、511、516または528、d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483のアミノ酸残基と同等または類似の位置における置換突然変異を含む。好ましい実施形態においては、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
好ましくは、グループB核受容体リガンド結合ドメインは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429のアミノ酸と同等または類似の位置におけるセリン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337、495、500または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基355または511のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基431または462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基442のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、j)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基473のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基516のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基321のアミノ酸と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基450のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451のアミノ酸と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、o)配列番号:2のアミノ酸残基455のアミノ酸と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456のアミノ酸と同等または類似の位置にセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、p)配列番号:2のアミノ酸残基470のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473のアミノ酸と同等または類似の位置におけるチロシン残基、q)配列番号:2のアミノ酸残基475、477および478のアミノ酸と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基476のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479のアミノ酸と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはr)配列番号:2のアミノ酸残基481のアミノ酸と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482のアミノ酸と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483のアミノ酸と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。好ましい実施形態においては、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインであり、ここに、置換突然変異は、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、D344N、K355R、S385A、M431L、R442K、V462L、S470A、E471D、T473E、A495S、E500S、K511R、T516V、またはA528S、d)配列番号:2のG321L、P322R、およびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される。
DNA結合ドメイン(DBD)は、合成およびキメラDNA結合ドメイン、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾体を含めた、既知の応答エレメントを持ついずれのDNA結合ドメインでもあり得る。好ましくは、DBDはGAL4 DBD、LexA DBD、転写因子DBD、グループB核受容体メンバーDBD、ステロイド/甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーDBD、細菌LacZ DBD、またはDBDである。より好ましくは、DBDはエクジソン受容体(EcR)DBD[配列番号;3(ポリヌクレオチド)または配列番号:4(ポリペプチド)]、GAL4 DBD[配列番号:5(ポリヌクレオチド)または配列番号:6(ポリペプチド)]、またはLexA DBD[配列番号:7(ポリヌクレオチド)または配列番号:8(ポリペプチド)]である。
(「AD」または「TA」と省略される)トランス活性化ドメインはいずれのグループB核受容体メンバーAD、ステロイド/甲状腺ホルモン核受容体AD、合成またはキメラAD、ポリグルタミンAD、塩基性または酸性アミノ酸AD、VP16 AD、GAL4 AD、NF−κB AD、BP64 AD、B42酸性活性化ドメイン(B42AD)、P65活性化ドメイン(P65AD)、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾体であってもよい。
特定の実施形態において、ADは合成もしくはキメラADであるか、あるいはエクジソン受容体、グルココルチコイド受容体、VP16、GAL4、NF−κB、またはB42酸性活性化ドメインADから得られる。好ましくは、ADはEcR AD[配列番号:9(ポリヌクレオチド)または配列番号:10(ポリペプチド)]、VP16 AD[配列番号:11(ポリヌクレオチド)または配列番号:12(ポリペプチド)]、B42 AD[配列番号:13(ポリヌクレオチド)または配列番号:14(ポリペプチド)]、またはp65 AD[配列番号:15(ポリヌクレオチド)または配列番号:16(ポリペプチド)]である。
特定の実施形態は、遺伝子発現カセットは、a)配列番号:3、配列番号:5または配列番号:7の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたDNA−結合ドメイン;配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13または配列番号:15の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメイン;および本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメイン;b)配列番号:3、配列番号:5または配列番号:7の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたDNA−結合ドメイン、および本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメイン、またはc)配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13または配列番号:15の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたトランス活性化ドメイン;および本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメイン;を含むハイブリッドポリペプチドをコードする。好ましくは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。
他の特定の実施形態において、遺伝子発現カセットは、a)配列番号:4、配列番号:6または配列番号:8のアミノ酸配列を含むDNA−結合ドメイン;配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14または配列番号:16のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメイン;および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメイン、b)配列番号:4、配列番号:6または配列番号:8のアミノ酸配列を含むDNA−結合ドメイン;および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメイン、またはc)配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14または配列番号:16のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメイン;および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。好ましくは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、本発明による置換突然変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである。
応答エレメント(「RE」)は、既知のDNA結合ドメインを持ついずれの応答エレメント、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾体であってもよい。単一のREを使用することができるか、あるいは複数RE(同一REの複数コピーまたは2以上の異なるRE)を本発明で用いることができる。特定の実施形態において、REは、GAL4からのRE(「GAL4RE」)、LexAからのRE、グループB核受容体RE、ステロイド/甲状腺ホルモン核受容体RE、または合成DNA結合ドメインを認識する合成REである。好ましくは、REは、配列番号:17のポリヌクレオチド配列を含むエクジソンRE(EcRE)、配列番号:18のポリヌクレオチド配列を含むGAL4RE、または配列番号:19のポリヌクレオチド配列を含むLexA RE(オペロン、「op」)(「2XLexAopRE」)である。
本発明によるステロイド/甲状腺ホルモン核受容体DNA結合ドメイン、活性化ドメインまたは応答エレメントは、甲状腺ホルモン受容体α(TRα)、甲状腺受容体1(c−erbA−1)、甲状腺ホルモン受容体β(TRβ)、レチノイン酸受容体α(RARα)、レチノイン酸受容体β(RARβ、HAP)、レチノイン酸受容体γ(RARγ)、レチノイン酸受容体ガンマ−様(RARD)、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体α(PPARα)、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体β(PPARβ)、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体δ(PPARδ、NUC−1)、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化関連受容体(FFAR)、ペルオキシソームプロリファレーター−活性化受容体γ(PPARγ)、甲状腺ホルモン受容体αの非−コーディングストランドによってコードされたオーファン受容体(REVERBα)、v−erb A関連受容体(EAR−1)、v−erb関連受容体(EAR−1A)、γ)、甲状腺ホルモン受容体βの非−コーディングストランドによってコードされたオーファン受容体(REVERBβ)、v−erb関連受容体(EAR−1β)、オーファン核受容体BD73(BD73)、rev−erbA−関連受容体(RVR)、亜鉛フィンガー蛋白質126(HZF2)、エクジソン−誘導性蛋白質E75(E75)、エクジソン−誘導性蛋白質E78(E78)、Drosophila受容体78(DR−78)、レチノイド−関連オーファン受容体α(RORα)、レチノイドZ受容体α(RZRα)、レチノイド関連オーファン受容体β(RORβ)、レチノイドZ受容体β(RZRβ)、レチノイド−関連オーファン受容体γ(RORγ)、レチノイドZ受容体γ(RZRγ)、レチノイド−関連オーファン受容体(TOR)、ホルモン受容体3(HR−3)、Drosophilaホルモン受容体3(DHR−3)、manducaホルモン受容体(MHR−3)、Galleriaホルモン受容体3(GHR−3)、C.elegans核受容体3(CNR−3)、Choristoneuraホルモン受容体3(CHR−3)、C.elegans核受容体14(CNR−14)、エクジソン受容体(ECR)、ユビキタス受容体(UR)、オーファン核受容体(OR−1)、NER−1、受容体−相互作用蛋白質15(RIP−15)、肝臓X受容体β(LXRβ)、ステロイドホルモン受容体様蛋白質(RLD−1)、肝臓X受容体(LXR)、肝臓X受容体α(LXRα)、ファルネソイドX受容体(FXR)、受容体−相互作用蛋白質14(RIP−14)、HRR−1、ビタミンD受容体(VDR)、オーファン核受容体(ONR−1)、プレグナンX受容体(PXR)、ステロイドおよび生体内異物受容体(SXR)、ベンゾエートX受容体(BXR)、核受容体(MB−67)、構成的アンドロスタン受容体1(CAR−1)、構成的アンドロスタン受容体α(CARα)、構成的アンドロスタン受容体2(CAR−2)、構成的アンドロスタン受容体β(CARβ)、Drosophilaホルモン受容体96(DHR−96)、核ホルモン受容体1(NHR−1)、肝細胞核因子4(HNF−4)、肝細胞核因子4G(HNF−4G)、肝細胞核因子4B(HNF−4B)、肝細胞核因子4D(HNF−4D、DHNF−4)、レチノイドX受容体α(RXRα)、レチノイドX受容体β(RXRβ)、H−2領域II結合蛋白質(H−2RIIBP)、核受容体コレギュレーター−1(RCoR−1)、レチノイドX受容体γ(RXRγ)、ウルトラスピラクル(USP)、2C1核受容体、漿膜因子1(CF−1)、精巣受容体2(TR2)、精巣受容体2−11(TR2−11)、精巣受容体4(TR4)、TAK−1、Drosophilaホルモン受容体(DHR78)、テールレス(TLL)、テールレスホモログ(TLX)、XTLL、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子I(COUP−TFI)、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子A(COUP−TFA)、EAR−3、SVP−44、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子II(COUP−TFII)、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子B(COUP−TFB)、ARP−1、SVP−40、SVP、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子III(COUP−TFIII)、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子G(COUP−TFG)、SVP−46、EAR−2、エストロゲン受容体α(ERα)、エストロゲン受容体β(ERβ)、エストロゲン関連受容体1(ERR1)、エストロゲン関連受容体α(ERRα)、エストロゲン関連受容体2(ERR2)、エストロゲン関連受容体β(ERRβ)、グルココルチコイド受容体(GR)、ミネラロコルチコイド受容体(MR)、プロゲステロン受容体(PR)、アンドロゲン受容体(AR)、神経成長因子誘導遺伝子B(NGFI−B)、Nur−77と同様の核受容体(TRS)、N10、オーファン受容体(NUR−77)、ヒト初期応答遺伝子(NAK−1)、Nurr関連因子1(NURR−1)、ヒト即時型−初期応答遺伝子(NOT)、再生肝臓核受容体1(RNR−1)、造血亜鉛フィンガー3(HZF−3)、Nur関連蛋白質−1(TINOR)、核オーファン受容体1(NOR−1)、NOR1関連受容体(MINOR)、Drosophilaホルモン受容体38(DHR−38)、C.elegans核受容体8(CNR−8)、C48D5、ステロイド産生因子1(SF1)、エンドゼピン−様ペプチド(ELP)、fushi tarazu因子1(FTZ−F1)、副腎4結合蛋白質(AD4BP)、肝臓受容体ホモログ(LRH−1)、Ftz−F1−関連オーファン受容体A(xFFrA)、Ftz−F1−関連オーファン受容体B(xFFrB)、LRH−1に関連した核受容体(FFLR)、LRH−1に関連した核受容体(PHR)、フェト蛋白質転写因子(FTF)、胚細胞核因子(GCNFM)、レチノイド受容体−関連精巣−関連受容体(RTR)、knirps(KNI)、knirps関連(KNRL)、胚性生殖腺(EGON)、リガンド依存性核受容体についてのDrosophila遺伝子(EAGLE)、トリソラックス(trithorax)と同様な核受容体(ODR7)、トリソラックス、用量感受性性逆転副腎発育不全先天性臨界領域染色体X遺伝子(DAX−1)、副腎発育不全先天性および下垂体性機能不全生殖機能不全(AHCH)、および短いヘテロダイマーパートナー(SHP)よりなる群から選択されるステロイド/甲状腺ホルモン核受容体から得ることができる。
かくして、本発明は、i)DNA結合ドメインを含むポリペプチドによって認識されるドメインを含む応答エレメント;ii)トランス活性化ドメインを含むポリペプチドによって活性化されるプロモーター;およびiii)その発現が変調されるべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットも提供する。
出願人らの遺伝子発現カセットで用いられる注目する遺伝子は、内因性遺伝子または異種遺伝子であり得る。所望の遺伝子もしくは蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列情報は、多くの公共アクセスデータベースの1つ、例えば、GENBANK、EMBL、Swiss−ProtおよびPIRにおいて、あるいは多くの生物学関連雑誌刊行物で突き止めることができる。かくして、当業者であれば、実質的にすべての既知の遺伝子につき核酸配列情報にアクセスできる。従って、そのような情報を用いて、本明細書中で記載した出願人らの方法に用いる遺伝子発現カセット内への注目する遺伝子の挿入のための所望の構築体を構築することができる。
出願人らの遺伝子発現カセットで用いる注目する遺伝子の例としては、限定されるものではないが、疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに使用され得る;例えば、モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子もしくは成分、遺伝子治療用のウイルスベクター、ワクチン用のウイルス、薬物発見用の、機能的ゲノミクス用の、ならびにプロテオミクスの分析用および適用用の標的などをはじめとする治療上望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子が挙げられる。
本発明の目的では、核受容体およびグループB核受容体もまた合成およびキメラ核受容体およびグループB核受容体およびそれらのホモログを含む。
本発明のポリヌクレオチド
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む。これらの遺伝子発現カセット、それらが含むポリヌクレオチド、およびそれらがコードするポリペプチドは、宿主細胞内で遺伝子の発現を変調するための核受容体−ベースの遺伝子発現システムの構成要素として有用である。かくして、本発明は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
特定の実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインは、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、ここに、該アミノ酸残基は、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号;1の401および429、c)配列番号:2の337、344、355、385、431、442、462、470、472、473、495、500、511、516または528、d)配列番号2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるものである。好ましい実施形態においては、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
他の特定の実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337、495、500または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基355または511と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基431または462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基442と同等または類似の位置におけるリジン残基、j)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基516と同等または類似の位置におけるバリン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基321と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323と同等または類似の位置におけるバリン残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基450と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、o)配列番号:2のアミノ酸残基455と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、p)配列番号:2のアミノ酸残基470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるチロシン残基、q)配列番号:2のアミノ酸残基475、477および478と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基476と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはr)配列番号:2のアミノ酸残基481と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい実施形態においては、グループB核受容体リガンド結合ドメインドはレチノイドX受容体からのものである。
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、D344N、K355R、S385A、M431L、R442K、V462L、S470A、E471D、T473E、A495S、E500S、K511R、T516VまたはA528S、d)配列番号:2のG321L、P322R、およびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされる置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインである。
また、本発明は、a)トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド;b)DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
特定の実施形態において、該単離されたポリヌクレオチドは、a)トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド;b)DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードする。
また、本発明は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する。
特に、本発明は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含み、ここに、該アミノ酸残基はa)配列番号:1のアミノ酸残基401または429、またはb)配列番号:2のアミノ酸残基344、431、442、495、511または528と同等または類似の位置におけるものである。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基431と同等または類似の位置におけるロイシン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基442と同等または類似の位置におけるリジン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基495または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはg)配列番号:2のアミノ酸残基511と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、およびb)配列番号:2のD344N、M431L、R442K、A495S、K511RまたはA528Sよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイドリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含み、ここに、該アミノ酸残基はa)配列番号:1のアミノ酸残基401または429、またはb)配列番号:2のアミノ酸残基344、431、442、495、511または528と同等または類似の位置におけるものである。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基431と同等または類似の位置におけるロイシン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基442と同等または類似の位置におけるリジン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基495または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはg)配列番号:2のアミノ酸残基511と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはa)配列番号:1のE401DまたはG429S、およびb)配列番号:2のD344N、M431L、R442K、A495S、K511RまたはA528Sよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異を含む。
加えて、本発明はまた置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強する。
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、355、385、462、470、472、473または500、d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはa)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン酸残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337または500と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基355と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、j)配列番号:2のアミノ酸残基321と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323と同等または類似の位置におけるバリン残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基450と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基455と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるチロシン残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基475、477および478と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基476と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはo)配列番号:2のアミノ酸残基481と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483と同等または類似の位置におけるプロリン残基よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドはa)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、K355R、S385A、V462L、S470A、E471D、T473E、またはE500S、d)配列番号:2のG321L、P322RおよびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含む。
他の特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強させる。好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、355、385、462、470、472、473または500、d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。より好ましくは、該単離されたポリヌクレオチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337または500と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基355と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるグルタミン酸、j)配列番号:2のアミノ酸残基321と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323と同等または類似の位置におけるバリン残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基450と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基455と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるチロシン残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基475、477および478と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基476と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、o)配列番号:2のアミノ酸残基481と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換をもたらすコドン突然変異を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリヌクレチドは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、K355R、S385A、V462L、S470A、E471D、T473EまたはE500S、d)配列番号:2のG321L、P322RおよびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される置換突然変異をもたらすコドン突然変異または複数コドン突然変異を含む。
他の特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループBリガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性双方を増強させる。
他の特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該置換突然変異は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させる。特定の実施形態において、該二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。他の特定の実施形態において該二量体化パートナーはトランケートされたEcRポリペプチドである。
加えて、本発明は、転写調節エレメントに作動可能に連結した、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましくは、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、発現能力の有る宿主細胞において核受容体リガンド結合ドメインの発現を可能とする発現制御配列と作動可能に連結している。該発現制御配列は、発現が望まれる宿主細胞中で機能するプロモーターを含むことができる。該ベクターはプラスミドDNA分子またはウィルスベクターであり得る。好ましいウィルスベクターはレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ−随伴ウイルス、ヘルペスウィルスおよびワクシニアウィスルを含む。本発明は、さらに、そのゲノム中に前記した置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む複製欠陥組換えウィルスに関する。かくして、本発明はそのような発現ベクターを含む単離された宿主細胞にも関し、ここに、転写調節エレメントは宿主細胞中で作動できる。
また、本発明は本発明によるポリヌクレオチドによってコードされた単離されたポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチド
本発明の新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む。かくして、本発明は本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドも提供する。
他の特定の実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインは、アミノ酸残基a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、344、355、385、431、442、462、470、472、473、495、500、511、516または528、d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483と同等または類似の位置における置換突然変異を含む。
好ましくは、グループB核受容体リガンド結合ドメインはa)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337、495、500、または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基355または511と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基431または462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基442と同等または類似の位置におけるリジン残基、j)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基516と同等または類似の位置におけるバリン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基321と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323と同等または類似の位置におけるバリン残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基450と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、o)配列番号:2のアミノ酸残基455と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、p)配列番号:2のアミノ酸残基470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるチロシン残基、q)配列番号:2のアミノ酸残基475、477、および478と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基476と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基またはr)配列番号:2のアミノ酸残基481と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。好ましい実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
他の特定の実施形態において、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインは、置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインであり、ここに、該置換突然変異は、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、D344N、K355R、S385A、M431L、R442K、V462L、S470A、E471D、T473E、A495S、E500S、K511R、T516VまたはA528S、d)配列番号:2のG321L、P322RおよびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される。
また、本発明は、a)トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチド;b)DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドよりなる群から選択される単離されたポリペプチドを提供する。好ましい実施形態においては、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
また、本発明は、a)トランス活性化ドメイン、DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチド;b)DNA−結合ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチド;およびc)トランス活性化ドメイン、および本発明による置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチドよりなる群から選択される単離されたハイブリッドポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、グループB核受容体リガンド結合ドメインはレチノイドX受容体からのものである。
また、本発明は、グループB核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。
特に、本発明は、グループB核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む単離されたグループB核受容体ポリペプチドに関する。
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異は、グループB核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401または429、またはb)配列番号:2のアミノ酸残基344、431、442、495、511または528と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基431と同等または類似の位置におけるロイシン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基442と同等または類似の位置におけるリジン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基495または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはg)配列番号:2のアミノ酸残基511と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、およびb)配列番号:2のD344N、M431L、R442K、A495S、K511RまたはA528Sよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
特定の実施形態において、本発明は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイドリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401または429、またはb)配列番号:2のアミノ酸残基344、431、442、495、511、または528と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン酸残基、c)配列番号:2のアミノ酸残基344と同等または類似の位置におけるアスパラギン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基431と同等または類似の位置におけるロイシン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基442と同等または類似の位置におけるリジン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基495または528と同等または類似の位置におけるセリン残基、またはg)配列番号:2のアミノ酸残基511と同等または類似の位置におけるアルギニン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、およびb)配列番号:2のD344N、M431L、R442K、A495S、K511RまたはA528Sよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
加えて、本発明は、グループB核受容体リガンド結合ドメインのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させる置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
特定の実施形態において、本発明は、グループB核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させる置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、355、385、462、470、472、473または500、d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337または500と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基355と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、j)配列番号:2のアミノ酸残基321と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323と同等または類似の位置におけるバリン残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基450と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基455と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるチロシン残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基475、477、および478と同等または類似の位置におけるスレオニン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基476と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基またはo)配列番号:2のアミノ酸残基481と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。なおより好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、K355R、S385A、V462L、S470A、E471D、T473EまたはE500S、d)配列番号:2のG321L、P322RおよびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
他の特定の実施形態において、本発明は、グループB核受容体リガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強させる置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、355、385、462、470、472、473または500、d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483よりなる群から選択されるアミノ酸残基と同等または類似の位置におけるアミノ酸残基の置換を含む。より好ましくは、該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、b)配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン酸残基、c)配列番号:1のアミノ酸残基401と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:1のアミノ酸残基429と同等または類似の位置におけるセリン残基、d)配列番号:2のアミノ酸残基337または500と同等または類似の位置におけるセリン残基、e)配列番号:2のアミノ酸残基355と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、f)配列番号:2のアミノ酸残基385または470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、g)配列番号:2のアミノ酸残基462と同等または類似の位置におけるロイシン残基、h)配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、i)配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、j)配列番号:2のアミノ酸残基321と同等または類似の位置におけるロイシン残基、配列番号:2のアミノ酸残基322と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基323と同等または類似の位置におけるバリン残基、k)配列番号:2のアミノ酸残基450と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基451と同等または類似の位置におけるバリン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基452と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、l)配列番号:2のアミノ酸残基455と同等または類似の位置におけるリジン残基、配列番号:2のアミノ酸残基456と同等または類似の位置におけるセリン残基、配列番号:2のアミノ酸残基457と同等または類似の位置におけるアラニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基458と同等または類似の位置におけるグルタミン残基、m)配列番号:2のアミノ酸残基470と同等または類似の位置におけるアラニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基472と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基473と同等または類似の位置におけるチロシン残基、n)配列番号:2のアミノ酸残基475、477、および478と同等または類似の位置におけるスレオニン残基、配列番号:2のアミノ酸残基476と同等または類似の位置におけるアルギニン残基、および配列番号:2のアミノ酸残基479と同等または類似の位置におけるヒスチジン残基、またはo)配列番号:2のアミノ酸残基481と同等または類似の位置におけるアスパラギン酸残基、配列番号:2のアミノ酸残基482と同等または類似の位置におけるグルタミン酸残基、および配列番号:2のアミノ酸残基483と同等または類似の位置におけるプロリン残基の置換を含む。なおより好ましくは該単離されたポリペプチドは、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、K355R、S385A、V462L、S470A、E471D、T473EまたはE500S、d)配列番号:2のG321L、P322RおよびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される置換突然変異を含む。
他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異はグループB核受容体リガンド結合ドメインのステロイド結合活性またはステロイド感受性および非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性双方を増強させる。
他の特定の実施形態において、本発明は、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関し、ここに、該置換突然変異は置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させる。特定の実施形態において、該二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。他の特定の実施形態において、該二量体化パートナーはトランケートされたEcRポリペプチドである。
また、本発明は、本発明による単離されたポリペプチドを含む組成物に関する。
本発明の遺伝子発現の変調方法
また、出願人らの発明は、本発明の遺伝子発現変調システムを用いて宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法に関する。具体的には、出願人らの発明は、a)本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し;さらに、b)該宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、ここに、変調すべき遺伝子は、i)該遺伝子発現システムのDNA結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント;ii)該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター;およびiii)その発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。
また、本発明は、a)本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し、b)本発明の遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入し、ここに、該遺伝子発現カセットはi)該遺伝子発現システムからのDNA結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント;ii)該遺伝子発現システムのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター;およびiii)その発現を変調すべき遺伝子を含み;さらに、c)宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。
また、出願人らの発明は、それに対して遺伝子発現変調システムの第1のハイブリッドポリペプチドからのDNA結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント;遺伝子発現変調システムの第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター;およびその発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法であって、該方法がa)本発明の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し;さらに、b)宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする該方法を提供する。
出願人らの方法を用いる宿主細胞における発現のための注目する遺伝子は内因性遺伝子または異種遺伝子であってもよい。所望の遺伝子もしくは蛋白質についての核酸もしくはアミノ酸配列の情報は多くの公のアクセスデータベースのうちの1つ、例えば、GENBANK、EMBL、Swiss−ProtおよびPIRにおいて、あるいは多くの生物学関連雑誌刊行物に見出すことができる。かくして、当業者は、実質的に全ての公知の遺伝子につき核酸配列の情報にアクセスできる。従って、そのような情報を用いて、本明細書中に記載する出願人らの方法で用いる遺伝子発現カセット内への注目する遺伝子の挿入のための所望の構築体を構築することができる。
出願人らの方法を用いる宿主細胞における発現用の注目する遺伝子の例としては、限定されるものではないが、ワクチンとして植物で生産される抗原、アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシラーゼおよびキシラナーゼのような酵素、昆虫、線虫、真菌類、細菌、ウイルス、および無生物ストレス、栄養補給食品、抗原、医薬、ビタミンに対する抵抗性についての遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、寒気、日照りおよび熱許容性、産業製品、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の出力特性を修飾する遺伝子;疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに用いることができる、例えばモノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子または構成成分、遺伝子治療用のウィルスベクター、ワクチン用のウィルス、薬物発見用、機能的ゲノミクス用、およびプロテオミクスの分析および適用等の標的のような、治療上望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子を含む。
許容されるリガンドは、リガンドの存在下における応答エレメントへの本発明の遺伝子発現システムのDNA結合ドメインの結合の結果、遺伝子の発現の活性化または抑制がもたらされる場合に、遺伝子の発現を変調する、任意のものである。好ましいリガンドはエクジソン、20−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、ムリステロンA等のようなエクジステロイド、9−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成アナログ、米国特許第6,013,836号、第5,117,057号、第5,530,028号および第5,378,726号に開示されたもののようなN,N’−ジアシルヒドラジン;欧州出願第461,809号に開示されたもののようなジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン;米国特許第5,225,443号に開示されたもののようなN−アルキル−N,N’−ジアロイルヒドラジン;欧州出願第234,994号に開示されたもののようなN−アシル−N−アルキルカルボニルヒドラジン;米国特許第4,985,461号に記載されたもののようなN−アロイル−N−アルキル−N’−アロイルヒドラジン(その各々、ここに引用して本明細書の一部とみなす);ならびに3,5−ジ−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−N−イソブチル−ベンズアミド、8−O−アセチルハルパジド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコレステロール、25−エポキシコレステロール、T0901317、5−アルファ−6−アルファ−エポキシコレステロール−3−スルフェート(ECHS)、7−ケトコレステロール−3−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、1,1−ビフォスフォネートエステル、幼若ホルモンIII、9−シス−レチノイン酸、4−(1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)エテニル)安息香酸(3−メチル−TTEB)、((E)−2)2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−3,5,5,8,8−ペンタメチル−2−ナフチル)プロペン−1−イル)−4−チオフェンカルボン酸)、2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−3,5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフチル)−2−(カルボキシフェニル)−1,3−ジオキソラン、4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−ジベンゾ(b,e)(1,4)ジアゼピン−11−イル)安息香酸(HX600)もしくはそのチアジアゼピンアナログ、3,7,11,15−テトラメチルヘキサデコン酸(フィタン酸)、6−(1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロナフタレン−2−イル)シクロプロピル)ニコチン酸、2−(4−カルボキシフェニル)−2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5、5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)−1,3−ジチアン、または4−(2−メチル)−1−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)プロペニル)安息香酸等を含めた他の同様の物質を含む。
好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドは式:
Figure 0004994563
の化合物である。
式中、
Eは第三級炭素を含有する(C−C)アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ(C−C)アルキルであり;
はH、Me、Et、i−Pr、F、ホルミル、CF、CHF、CHCl、CHF、CHCl、CHOH、CHOMe、CHCN、CN、CCH、1−プロピニル、2−プロピニル、ビニル、OH、OMe、OEt、シクロプロピル、CFCF、CH=CHCN、アリル、アジド、SCNまたはSCHFであり;
はH、Me、Et、n−Pr、i−Pr、ホルミル、CF、CHF、CHCl、CHF、CHCl、CHOH、CHOMe、CHCN、CN、CCH、1−プロピニル、2−プロピニル、ビニル、Ac、F、Cl、OH、OMe、OEt、O−n−Pr、OAc、NMe、NEt、SMe、SEt、SOCF、OCFCFH、COEt、シクロプロピル、CFCF、CH=CHCN、アリル、アジド、OCF、OCHF、O−i−Pr、SCN、SCHF、SOMe、NH−CNであるか、またはR、ならびにRおよびRが結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し;
はH、Etであるか、またはR、ならびにRおよびRが結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接した酸素を持つジヒドロピリル環を形成し;
、RおよびRは独立してH、Me、Et、F、Cl、Br、ホルミル、CF、CHF、CHCl、CHF、CHCl、CHOH、CN、CCH、1−プロピニル、2−プロピニル、ビニル、OMe、OEt、SMeまたはSEtである。
他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドはエクジソン、20−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンAまたはムリステロンAである。
他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドは9−シス−レチノイン酸、4−(1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)−エテニル)安息香酸(3−メチル−TTEB)、((E)−2)2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−3,5,5,8,8−ペンタメチル−2−ナフチル)プロペン−1−イル)−4−チオフェンカルボン酸)、2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−3,5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフチル)−2−(カルボキシフェニル)−1,3−ジオキソラン、4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−ジベンゾ(b,e)(1,4)ジアゼピン−11−イル)安息香酸(HX600)またはそのチアジアゼピンアナログ、3,7,11,15−テトラメチルヘキサデコン酸(フィタン酸)、6−(1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロナフタレン−2−イル)シクロプロピル)ニコチン酸、2−(4−カルボキシフェニル)−2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)−1,3−ジチアン、または4−(2−メチル)−1−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)プロペニル)安息香酸である。
他の好ましい実施形態において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法において前記で議論した第1のリガンドに加えて第2のリガンドを用いることができる。好ましくは、この第2のリガンドは9−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである。
本発明の宿主細胞および非−ヒト生物
前記したように、本発明の遺伝子発現変調システムを用いて、宿主細胞において遺伝子発現を変調することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は、注目する種々の遺伝子の発現で有用であり得る。出願人らの発明は、原核生物および真核生物宿主細胞における遺伝子発現の変調を提供する。トランスジェニック宿主細胞における発現は、限定されるものではないが、ワクチンとして植物で生産される抗原、アルファ−アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシラーゼおよびキシラナーゼのような酵素、昆虫、線虫、真菌類、細菌、ウィルスおよび無生物ストレス、栄養補給食品、抗原、医薬、ビタミンに対する抵抗性についての遺伝子、アミノ酸含有量、除草剤抵抗性、寒気、日照りおよび熱許容性、産業製品、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不稔植物、花、燃料、他の出力特性、治療ポリペプチド、経路中間体を修飾する遺伝子を含めた注目する種々のポリペプチドの発現に有用であり;宿主を用いて以前には可能でなかった新しい産物の合成のための、宿主に既に存在する経路の変調;細胞ベースのアッセイ;機能的ゲノミクスアッセイ、バイオ治療蛋白質生産、プロテオミクスアッセイ等の変調に有用である。加えて、遺伝子産物は、宿主のより高い増殖量を付与するのに、あるいは利用すべき別の増殖様式を可能とするのに有用であり得る。
かくして、出願人らの発明は、本発明による遺伝子発現システムを含む単離された宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明による遺伝子発現カセットを含む単離された宿主細胞を提供する。また、出願人らの発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む単離された宿主細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、本発明による発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は細菌細胞、真菌類細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞または哺乳動物細胞であり得る。なおさらなる実施形態において、本発明は、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインの生産方法に関し、ここに、該方法は、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下で、培地中で前記宿主細胞を培養し、さらに、該培養から置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインを単離することを含む。
特定の実施形態において、単離された宿主細胞は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。他の特定の実施形態において単離された宿主細胞は無脊椎動物宿主細胞または脊椎動物宿主細胞である。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞、真菌類細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メスウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、またはヒト細胞である。
好ましい宿主細胞としては、限定されるものではないが、Aspergillus、Trichoderma、Saccharomyces、Pichia、Candida、Hansenulaのような真菌類または酵母種、またはSynechocystis、Synechococcus、Salmonella、Bacillus、Acinetobacter、Rhodococcus、Streptomyces、Escherichia、Pseudomonas、Methylomonas、Methylobacter、Alcaligenes、Synechocystis、Anabaena、Thiobacillus、MethanobacteriumおよびKlebsiella属におけるもののような細菌種、リンゴ、Arabidopsis、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Panicum、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Phaseolus、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦よりなる群から選択される植物種、動物および哺乳動物宿主細胞が挙げられる。
特定の実施形態において、宿主細胞は、Saccharomyces、PichiaおよびCandida宿主細胞よりなる群から選択される酵母細胞である。
他の特定の実施形態において、宿主細胞は、Caenorhabdus elegans線虫細胞である。
他の特定の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。
他の特定の実施形態において、宿主細胞はリンゴ、Arabidopsis、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Panicum、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Phaseolus、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦細胞よりなる群から選択される植物細胞である。
他の特定の実施形態において、宿主細胞はゼブラフィッシュ細胞である。
他の特定の実施形態において、宿主細胞はニワトリ細胞である。
他の特定の実施形態において、宿主細胞はハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞およびヒト細胞よりなる群から選択される哺乳動物細胞である。
宿主細胞の形質転換は当該分野でよく知られており、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ウィルス感染、プラスミド/ベクタートランスフェクション、非−ウィルスベクター媒介トランスフェクション、Agrobacterium−媒介形質転換、パーティクル衝撃等を含めた種々の方法によって達成することができる。所望の遺伝子産物の発現は、適当な条件下で形質転換宿主細胞を培養し、形質転換遺伝子の発現を誘導することを含む。原核生物および真核生物細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコルは当該分野でよく知られている(実施例の一般的方法セクション参照)。遺伝子産物に特異的なプロトコルに従い、細胞を回収し、遺伝子産物を単離することができる。
加えて、挿入されたポリヌクレオチドの発現を変調するか、または所望の特定の様式にてポリペプチド産物を修飾および加工する宿主細胞を選択することができる。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後のプロセッシングおよび修飾[例えば、グリコシル化、(例えば、シグナル配列の)切断]についての特徴的かつ特異的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主システムを選択して、発現される外来性蛋白質の所望の修飾およびプロセッシングを確実とすることができる。例えば、細菌システムにおける発現を用いて、非−グリコシル化コア蛋白質産物を生産することができる。しかしながら、細菌で発現されたポリペプチドは適切には折り畳まれていないであろう。酵母における発現はグリコシル化産物を生じさせることができる。真核生物細胞における発現は、「天然」グリコシル化の確立および異種蛋白質の折り畳みを増加させることができる。さらに、哺乳動物細胞における発現はポリペプチドの活性を復元または構成するためのツールを提供することができる。さらに、異なるベクター/宿主発現系は、蛋白質分解切断のようなプロセッシング反応に異なる程度影響し得る。
出願人らの発明は、本発明による単離された宿主細胞を含む非−ヒト生物にも関する。特定の実施形態において、非−ヒト生物は原核細胞生物または真核生物である。他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は無脊椎動物生物または脊椎動物生物である。
好ましくは、非−ヒト生物は細菌、真菌類、酵母、線虫、昆虫、魚類、植物、鳥類、動物および哺乳動物よりなる群から選択される。より好ましくは、非−ヒト生物は酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、メウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、類人猿、サルまたはチンパンジーよりなる群から選択される。
特定の実施形態において、非−ヒト生物はSaccharomyces、PichiaおよびCandidaよりなる群から選択される酵母である。
他の特定の実施形態において、非−ヒト生物はCaenorhabdus elegans線虫である。
他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は、リンゴ、Arabidopsis、パールミレット、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックグラム、ヒヨコマメ、トウガラシ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、Panicum、パパイヤ、落花生、エンドウ、コショウ、ハトマメ、パイナップル、Phaseolus、ジャガイモ、カボチャ、米、ソルガム、大豆、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、および小麦よりなる群から選択される植物である。
他の特定の実施形態において、非−ヒト生物は、Mus musculusマウスである。
遺伝子発現/転写の測定
本発明の出願人らの方法の1つの有用な測定は、RNA、好ましくはmRNA種の同一性および存在量を含めた細胞の転写状態の測定である。そのような測定は、いくつかの現存する遺伝子発現技術のうちのいずれかによってcDNAの存在量を測定することによって簡便に行われる。
核酸アレイ技術は異なるmRNA発現を決定するための有用な技術である。そのような技術は、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびDNAマイクロアレイを含む。これらの技術は、固体支持体に固定化し、細胞、組織または生物全体から抽出された全mRNAプールから調製され、cDNAに変換されたプローブにハイブリダイズする異なる遺伝子またはcDNAに対応するDNA断片またはオリゴヌクレオチドに頼る。オリゴヌクレオチドチップは、フォトリソグラフィー技術を用いて基材上で合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。1700までの遺伝子につき分析することができるチップが製造されている。DNAマイクロアレイは、機械的に顕微鏡スライドグラスにプリントされるDNA試料、典型的には、PCR産物のアレイである。各遺伝子は、全長または部分長の標的DNA配列によって分析される。10,000までの遺伝子を持つマイクロアレイは、今日、ルーチン的に商業生産される。これらの2つの技術の間の主な差は、オリゴヌクレオチドチップが、典型的には、短いDNA分子の分画を可能とする25−量体オリゴヌクレオチドを利用するのに対し、マイクロアレイのより大きなDNA標的(ほぼ1000塩基対)は複雑なDNA混合物を分画する際により大きな感受性を提供できることである。
本発明の出願人らの方法の他の有用な測定は、当該分野でよく知られたプロセスを用いて、細胞に存在する構成蛋白質種の存在量を測定することによって細胞の翻訳状態を決定するものである。
種々の生理学的機能に関連する遺伝子の同定が望まれる場合、アッセイを使用することができ、ここに、細胞増殖、アポトーシス、老化、分化、接着、特定の分子への結合、他の細胞への結合、細胞組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋発生、神経発生および/または造血のような機能の変化が測定される。
加えて、選択マーカーまたはレポーター遺伝子発現を用いて、出願人らの発明を用いた遺伝子発現変調を測定することができる。
遺伝子発現の産物を検出する他の方法は当該分野でよく知られており、サザンブロット(DNA検出)、ドットまたはスロットブロット(DNA、RNA)、ノーザンブロット(RNA)、RT−PCR(RNA)、ウェスタンブロット(ポリペプチド検出)、およびELISA(ポリペプチド)分析を含む。余り好ましくはないが、標識された蛋白質を用いて、それにハイブリダイズする特定の核酸配列を検出することができる。
いくつかの場合において、核酸配列の量を増幅する必要がある。これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)、リガーゼ鎖反応(「LCR」)、ストランド置換増幅(「SDA」)、転写−ベースの増幅等を含めた多数の適当な方法のうちの1以上を用いて行なうことができる。PCRは公知の技術に従って行われ、ここに、例えば、ハイブリダイズする条件下で、熱安定DNAポリメラーゼの存在下で、核酸試料をオリゴヌクレオチドプライマーの1つの対で処理し、1つのプライマーは検出すべき特定の配列の1つのストランド(鋳型)にハイブリダイズする。プライマーは、それにハイブリダイズする特定の配列の各鋳型ストランドに対して十分に相補的である。各プライマーの伸長産物を合成し、それは、それにハイブリダイズする核酸鋳型ストランドに対して相補的である。各プライマーから合成された伸長産物は、同一プライマーを用いる伸長産物のさらなる合成のための鋳型としても機能することができる。十分な数のラウンドの伸長産物の合成に続き、前記したように試料を分析して、検出すべき配列が存在するか否かを分析することができる。
リガンドスクリーニングアッセイ
また、本発明は、核受容体リガンド結合ドメインを候補分子と接触させ、リガンドの存在下でレポーター遺伝子の活性を検出することによる、細胞において置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインのトランス活性化を誘導または抑制する化合物につきスクリーニングする方法に関する。候補化合物は、核受容体リガンド結合ドメインのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。好ましい実施形態においては、核受容体リガンド結合ドメインは細胞中のポリヌクレオチドから発現され、トランス活性化活性(すなわち、レポーター遺伝子の発現または抑制)または化合物の結合活性が測定される。
従って、核受容体リガンド結合ドメインの構造に基づくアゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計に加え、本発明では、当該分野で知られた種々のスクリーニングアッセイを用いて核受容体リガンド結合ドメインの特異的リガンドを同定するための別法が考えられる。
当該分野で知られたいずれものスクリーニング技術を用いて、グループB核受容体リガンド結合ドメインのアゴニストまたはアンタゴニストにつきスクリーニングすることができる。例えば、本発明による核受容体−ベースの遺伝子発現システムを含む適当な細胞系を、誘導性または抑制性プロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子をコードする遺伝子発現カセットでトランスフェクトすることができる。次いで、トランスフェクトされた細胞を、候補アゴニストまたはアンタゴニスト化合物を含むテスト溶液に暴露し、次いで、マーカー遺伝子の発現または抑制につきアッセイする。テスト溶液に暴露されなかった対照細胞に対するより多くのマーカー遺伝子発現の存在は、テスト溶液中におけるアゴニスト化合物の存在の指標である。逆に、テスト溶液に暴露されなかった対照細胞に対するより少ないマーカー遺伝子発現の存在は、テスト溶液中におけるアンタゴニスト化合物の存在指標である。
本発明では、小さな分子リガンドまたはリガンドアナログおよびミミックについてのスクリーニング、ならびにイン・ビボにおける本発明によるグループB核受容体リガンド結合ドメインに結合し、かつ作動もしくは拮抗する天然リガンドについてのスクリーニングが考えられる。例えば、天然産物ライブラリーは、核受容体−ベースの遺伝子発現システムの活性に作動または拮抗する分子につき、本発明のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
アンタゴニストの同定およびスクリーニングは、例えば、X−線結晶回析、中性子回折、核磁気共鳴分光分析、および構造決定のための他の技術を用いて蛋白質の構造特徴を決定することによってさらに容易とされる。これらの技術はアゴニストおよびアンタゴニストの合理的設計または同定を提供する。
他のアプローチは、大きなライブラリーを生産するために組換えバクテリオファージを用いる。「ファージ方法」[ScottおよびSmith、1990、Science 249:386−390(1990);Cwirlaら、Proc.Natl.Acad.Sci.、87:6378−6382(1990);Devlinら、Science、249:404−406(1990)]を用い、非常に大きなライブラリーを構築することができる(10−10化学存在)。第2のアプローチは主として化学的方法を用い、そのうち、Geysen方法[Geysenら、Molecular Immunology 23:709−715(1986);Geysenら、J.Immunologic Method 102:259−274(1987)]およびFodorらの方法[Science 251:767−773(1991)]がその例である。Furkaら[14th International Congress of Biochemistry、Volume 5、Abstract FR:013(1988);Furka,Int.J.Peptide Protein Res.37:487−493(1991)]、Houghton [1986年12月に発行された米国特許第4,631,211号]およびRutterら[1991年4月23日に発行された米国特許第5,010,175号]は、アゴニストまたはアンタゴニストとしてテストすることができるペプチドの混合物を製造する方法を記載する。
他の態様において、合成ライブラリー[Needelsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10700−4(1993);Ohlmeyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922−10926(1993);Lamら、国際特許出願公開第WO92/00252号;Kocisら、国際特許出願公開第WO9428028号(その各々を、ここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす)]等を用いて、本発明に従って候補リガンドにつきスクリーニングすることができる。
該スクリーニングは、本発明に従い核受容体リガンド結合ドメインを発現する組換え細胞で、あるいは別法として、例えば、前記したように組換えにより製造された精製蛋白質を用いて、行うことができる。例えば、標識された可溶性核受容体リガンド結合ドメインを用いて、これまでの引例に記載されたように、ライブラリーをスクリーニングすることができる。
1つの実施形態において、本発明によるグループB核受容体リガンド結合ドメインを直接的に標識することができる。他の実施形態において、標識された二次試薬を用いて、注目する分子、例えば、固相支持体に結合した分子、への本発明の核受容体リガンド結合ドメインの結合を検出することができる。結合は、酵素標識による発色団のイン・サイチュ形成によって検出することができる。適当な酵素は、限定されるものではないが、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。さらなる実施形態において、注目する異なるアクセプター分子上に2つの酵素標識を持つ2つの発色性基材を用いる2色アッセイを用いることができる。交差−反応性および単一−反応性リガンドを2色アッセイで同定することができる。
本発明で用いられる他の標識は、着色ラテックスビーズ、磁性ビーズ、蛍光標識(例えば、数個のフルオロフォアの名前を挙げれば、蛍光イソチオシアナート(FITC)、フィコエリスリン(PE)、テキサスレッド(TR)、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド族塩、特にEu3+)、ケミルミネセント分子、放射性同位体、または磁気共鳴イメージング標識を含む。2色アッセイは、2以上の着色ラテックスビーズ、または異なる波長において発光するフルオロフォアで行うことができる。標識された分子または細胞は、視覚により、または機械的/光学的手段によって検出することができる。機械的/光学的手段は、FACSに類似の蛍光活性化ソーティング、およびミクロマニピュレーター除去手段を含む。
以下の非限定的実施例によって本発明はより良好に理解でき、これは本発明の例示として提供する。
実施例
出願人らは、置換突然変異を含むグループB核受容体リガンド結合ドメインを含む新規な核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを開発した。出願人らは、そのような置換突然変異の効果はリガンド結合活性またはリガンド感受性を増加させることができ、それはステロイドまたは非−ステロイド特異的であることを示した。かくして、出願人らの発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の発現の変調に有用なグループB核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを提供する。出願人らの新規な誘導性遺伝子発現システムおよび宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法におけるその使用は、現在入手可能な誘導性発現システムの制限を克服し、当業者に、遺伝子発現を制御するための効果的な手段を提供する。
出願人らの新規な置換突然変異した核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、限定されるものではないが、遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用のための核受容体−ベースの誘導性遺伝子変調システムで有用である。
一般的方法
ここに用いる標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該分野でよく知られており、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual:Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor、N.Y.(1989)(Maniatis)によって、およびT.J.Silhavy、M.L.BennanおよびL.W.Enquist、Experiments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.(1984)によって、およびAusubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc.およびWiley−Interscience(1987)によって記載されている。
細菌培養の維持および増殖に適当な材料および方法は当該分野でよく知られている。以下の実施例で用いるのに適した技術は、Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt、R.G.E.Murray、Ralph N.Costilow、Eugene W.Nester、Willis A.Wood、Noel R.Krieg およびG.Briggs Phillips編)、American Society for Microbiology、Washington,DC.(1994))、またはThomas D.BrockによるBiotechnology中:A Textbook of Industrial Microbiology、第2版、Sinauer Associates,Inc.、Sunderland、MA(1989)に記載されているのを見出すことができる。宿主細胞の増殖および維持で用いる全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Aldrich Chemicals(Milwaukee、WI)、DIFCO Laboratories(Detroit、MI)GIBCO/BRL(Gaithersburg、MD)またはSigma Chemical Company(St.Louis、MO)から入手した。
遺伝子配列の操作は、Genetics Computer Group Inc.(Wisconsin Package Version 9.0、Genetics Computer Group(GCG)、Madison、WI)から入手できるプログラムのスイートを用いて達成することができる。GCGプログラム「Pileup」を用いる場合、12のギャップ創生デフォルト値、および4のギャップ伸長デフォルト値を用いることができる。CGC「Gap」または「Bestfit」プログラムを用いる場合、50のデフォルトギャップ創生ペナルティおよび3のデフォルトギャップ伸長ペナルティを用いることができる。いずれの場合にも、GCGプログラムパラメーターを指令しない場合、これらまたはいずれかの他のGCGプログラムにおいては、デフォルト値を用いることができる。
略語の意味は以下の通りである:「h」は時間を意味し、「min」は分を意味し、「sec」は秒を意味し、「d」は日を意味し、「μl」はマイクロリットルを意味し、「ml」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「μM」はマイクロモラーを意味し、「mM」はミリモラーを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「mg」はミリグラムを意味し、「A」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「T」はチミンまたはチミジンを意味し、「G」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「C」はシチジンまたはシトシンを意味し、「xg」は重力の倍数を意味し、「nt」はヌクレオチドを意味し、「aa」はアミノ酸を意味し、「bp」は塩基対を意味し、「kb」はキロベースを意味し、「k」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、および「℃」は摂氏度を意味する。
本実施例は、核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムで用いる本発明の新規な置換突然変異したグループB核受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むいくつかの遺伝子発現カセットの構築を記載する。出願人らは、ハマキガ Choristoneura fumiferana EcR「CfEcR」)、マウス Mus musculusレチノイドX受容体α(「MmRXRα」)、ヒト Homo sapienceレチノイドX受容体β(「HsRXRβ」)、バッタ Locusta migratoriaウルトラスピラクル蛋白質(ここでは相互交換的に「LmUSP」または「LmRXR」とも言う)(これは、脊椎動物RXRの無脊椎動物RXRホモログである)、およびC.fumiferana USP(「CfUSP」)に基づくいくつかの遺伝子発現カセットを構築した。調製された受容体構築体は、EcR、無脊椎動物USP、脊椎動物RXR、または無脊椎動物RXRのいずれかのリガンド結合ドメイン;およびGAL4 DNA結合ドメイン(DBD)またはVP16トランス活性化ドメイン(AD)を含む。レポーター構築体は、Gal4 DBDが結合するGAL4応答エレメントを含む合成プロモーター構築体に作動可能に連結した、レポーター遺伝子、ルシフェラーゼまたはLacZ(β−ガラクトシダーゼ)を含む。これらの受容体およびレポーター構築体の種々の組合せを、後記実施例2−4に記載したように、哺乳動物細胞に共トランスフェクトした。
遺伝子発現カセット:遺伝子発現カセット(スイッチ)は、当該分野で入手できる標準的なクローニング方法を用いて以下のように構築した。以下に、本明細書中に記載する実施例で用いる各スイッチの調製および組成を簡単に記載する。
1.1−GAL4CfEcR−DEF/VP16LmUSP−EF:ハマキガ Choristoneura fumiferana EcRからの野生型D、EおよびFドメイン(「CfEcR−DEF」;配列番号:20)をGAL4 DNA結合ドメイン(「Gal4DNABD」または「Gal4DBD」;配列番号:5)に融合させ、SV40eプロモーター(配列番号:21)の制御下に置いた。バッタ Locusta migratoriaウルトラスピラクル蛋白質からのEおよびFドメイン(「LmUSP−EF」;配列番号:22)をVP16からのトランス活性化ドメイン(「VP16AD」;配列番号:11)に融合させ、SV40eプロモーター(配列番号:21)の制御下に置いた。5つのコンセンサスGAL4応答エレメント結合部位(配列番号:18を含むGAL4REの5つのコピーを含む「5XGAL4RE」)を合成E1b最小プロモーター(配列番号:23)に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子(配列番号:24)の上流に置いた。
1.2−GAL4CfEcR−DEF/VP16MmRXRα−EF:LmUSP−EFをMmRXRαのEおよびFドメイン(「MmRXRα−EF」;配列番号:25)で置き換えた以外は、前記スイッチ1.1と同様にこの構築体を調製した。
1.3−GAL4CfEcR−DEF/VP16突然変異体MmRXRα−EF:野生型MmRXRα−EFを、後記表1から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体MmRXRα−EFで置き換えた以外は、前記スイッチ1.2と同様にしてこの構築体を調製した。
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1.4−GAL4CfEcR−DEF/VP16MmRXRαH1−7−LmUSP−H8−12キメラ:LmUSP−EFを、MmRXRα−EFのヘリックス(H)1−7およびLmUSP−EFのヘリックス8−12を含むキメラリガンド結合ドメイン(配列番号:26)で置き換える以外は、前記スイッチ1.1と同様にしてこの構築体を調製した。
1.5−GAL4CfEcR−DEF/VP16HsRXRβ−EF:LmUSP−EFを、HsRXRβのEおよびFドメイン(「HsRXRβ−EF」:配列番号:27)で置き換える以外は、前記スイッチ1.1と同様にしてこの構築体を調製した。
1.6−GAL4CfEcR−DEF/VP16突然変異体HsRXRβ−EF:野生型HsRXRβ−EFを、後記表2から選択された置換突然変異を含むリガンド結合ドメインを含む突然変異体HsRXRβ−EFで置き換える以外は、前記スイッチ1.5と同様にしてこの構築体を調製した。
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置換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメインの構築
RXRトランス活性化の活性を修飾する努力において、配列比較に基づいて重要であると予測されたRXRリガンド結合ドメイン内の残基を、2つの異なる生物からのRXRにおいて突然変異させた。表1および2は、突然変異させ、トランス活性化能力の修飾につき調べた、MmRXRαおよびHsRXRβのリガンド結合ドメイン内の各々のアミノ酸残基を示す。
表1および2にリストしたアミノ酸置換突然変異の各々の1つは、PCR媒介部位特異的変異誘発によってRXR cDNAにおいて構築した。1つの二重点突然変異体RXR LBD(表1参照)、4つの異なる三重点突然変異体RXR LBD(表2参照)、1つの四重点突然変異体RXR LBD(表2参照)、および1つの五重点突然変異体RXR LBD(表2参照)も構築した。
PCR部位特異的変異誘発は、以下のように、反応条件およびサイクリングパラメーターを用い、Quikchange部位特異的変異誘発キット(Stratagene、La Jolla、CA)を用いて行った。PCR部位特異的変異誘発は、50μLの最終反応容量中の1×反応緩衝液(製造業者によって供給された)、50ngのdsDNA鋳型、125ngの順方向プライマー(FP)、125ngの逆方向相補的プライマー(RCP)、および1μlのdNTPミックス(製造業者によって供給された)を用いて行った。各RXR置換突然変異を生じさせるのに用いる順方向プライマーおよび逆方向相補的プライマー対を表3および4に提示する。用いたサイクリングパラメーターは、1サイクルの30秒間の95℃における変性、続いて16サイクルの30秒間の95℃における変性、1分間の55℃におけるアニーリング、および22分間の68℃の伸長よりなるものであった。
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突然変異体RXRリガンド結合ドメインをコードする得られたPCR核酸産物を、次いで、各々前記実施例1.3および1.6に記載したようにVP16トランス活性化ドメインに融合させた。VP16/突然変異体RXR受容体構築体を、非−ステロイドリガンドの存在下でGAL4/CfEcR−DEFおよびpFRLucと共にNIH3T3細胞にトランスフェクトすることによって、活性につきテストした。
リガンド:非−ステロイドリガンドN−(2−エチル−3−メトキシベンゾイル)−N’−(3,5−ジメチルベンゾイル)−N’−tert−ブチルヒドラジン(GS(商標)−E)はRohm and Haas Companyで合成された合成安定エクジステロイドリガンドである。該リガンドをDMSOに溶解させ、DMSOの最終濃度を対照および処理双方において0.1%に維持した。
トランスフェクション:実施例1.1−1.6に概説した種々のスイッチ構築体に対応するDNAを以下のようにマウスNIH3T3細胞(ATCC)にトランスフェクトした。細胞の培養および維持についての標準的な方法は以下の通りであった。細胞が50%密集に到達するとそれを回収し、各々、10%胎児ウシ血清(FBS)を含有する増殖培地2.5、1.0または0.5ml中に各々、125,000、50,000または25,000細胞にて6−、12−または24−ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、4時間トランスフェクトした。Superfect(商標)(Qiagen Inc.)をトランスフェクション試薬として用いた。12−ウェルプレートでは、4μlのSuperfect(商標)を100μlの増殖培地と混合した。1μgのレポーター構築体および分析すべき受容体対の0.25μgの各受容体構築体を該トランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ(TK)構成的プロモーターに作動可能に連結し、かつその制御下に置かれたRenillaルシフェラーゼ遺伝子を含む第2のレポーター構築体を添加し[pTKRL(Promega)、0.1μg/トランスフェクションミックス]、標準化で用いた。トランスフェクションミックスの内容物を撹拌ミキサー中で混合し、室温にて30分間放置した。インキュベーションの最後に、トランスフェクションミックスを、400μlの増殖培地中に維持した細胞に添加した。細胞を37℃および5%COに4時間維持した。インキュベーションの最後に、20%FBSおよびジメチルスルホキシド(DMSO;対照)もしくは非−ステロイドリガンドのDMSO溶液いずれかを含有する500μlの増殖培地を添加し、細胞を37℃および5%COに48時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をアッセイした。全ての試薬を6ウェルプレートで2倍にし、24−ウェルプレートで半分にした以外は、同一手法を6および24ウェルプレートでも行った。
レポーターアッセイ:リガンドを添加した40時間後に細胞を回収した。125μlの受動の溶解緩衝液(Promega CorporationからのDual−luciferase(商標)レポーターアッセイシステムの一部)を、24−ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを15分間ロータリーシェーカー上に置いた。20μlの溶解物をアッセイした。製造業者の指示に従い、Promega CorporationからのDual−luciferase(商標)レポーターアッセイシステムを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。製造業者の指示に従い、TROPIXからのGalacto−Star(商標)アッセイキットを用い、β−ガラクトシダーゼを測定した。標準としてのRenillaルシフェラーゼを用い、全てのルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を標準化した。リガンド処理細胞中の標準化された相対的光単位(「RLU」)をDMSO処理細胞(未処理対照)中の標準化されたRLUで除することによって、活性倍数を計算した。
哺乳動物細胞において、昆虫(Choristoneura fumiferana)エクジソン受容体(CfEcR)はウルトラスピラクル(USP)またはそのホモログレチノイドX受容体(RXR)とヘテロ二量体化し、同族応答エレメントの制御下に置かれた遺伝子をトランス活性化する。このEcR−ベースのトランス活性化のリガンド誘導性はそのヘテロ二量体化パートナーに依存する。出願人らによって以前示されたように、昆虫USPと一緒になってCfEcRを介するトランス活性化はリガンド非依存性であるのに対し、無脊椎動物または脊椎動物RXRと一緒になってCfEcRを介するトランス活性化はリガンド依存性である(ここに引用してその全体を本明細書の一部とみなす係属中の米国特許出願第60/294,814号参照)。出願人らは、今回、リガンド結合ドメインの置換突然変異によってRXRの配列を修飾して、トランス活性化の大きさならびにEcR−ベースの誘導性遺伝子発現システムのリガンド感受性に影響させることができることを見出した。
本実施例は、非−ステロイドリガンドに応答する改良されたリガンド感受性を呈する3つのMmRXRαリガンド結合ドメイン置換突然変異体の同定を記載する。簡単に述べれば、出願人らは3つのマウスRXRアイソフォームαリガンド結合ドメイン置換突然変異体を構築し、Quikchange PCR−媒介部位特異的変異誘発キット(Stratagene、La Jolla、CA)を用いて前記実施例1に記載したようにVP16/突然変異体MmRXRα−EF cDNA遺伝子発現カセットを創製した。突然変異したcDNAを、GAL4−駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてGAL4/CfEcR−DEFと共にテストし、結果を、マウスNIH3T3細胞における野生型VP16/MmRXRα−EFおよびVP16/MmRXRα−LmUSPキメラ−EFスイッチと比較した。
トランスフェクション:実施例1に概説した種々のスイッチ構築体、具体的にはスイッチ1.1−1.4に対応するDNAを以下のようにマウスNIH3T3細胞(ATCC)にトランスフェクトした。細胞が50%密集に到達すると、それを回収し、10%胎児ウシ血清(FBS)を含有する0.5mlの増殖培地中で12,500細胞/ウェルにて24ウェルプレート中で平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、4時間トランスフェクトした。Superfect(商標)(Qiagen Inc.)は3T3細胞についての最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。2μlのSuperfect(商標)を100μlの増殖培地と混合し、50ngのGAL4/CfEcR−DEFカセット、50ngの:VP16/LmUSP−EF、VP16/野生型MmRXRα−EF、VP16/MmRXRα−LmUSPキメラ−EFまたはVP16/突然変異体MmRXRα−EF、および200ngのpFRLucをトランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ(TK)構成的プロモーターと作動可能に連結し、その制御下に置かれたRenillaルシフェラーゼ遺伝子を含む第2のレポーター構築体を添加し[pTKRL(Promega)、0.05μg/トランスフェクションミックス]、これを標準化で用いた。トランスフェクションミックスの内容物を攪拌ミキサーで混合し、室温で30分間放置した。インキュベーションの最後に、トランスフェクションミックスを、200μlの増殖培地中に維持した細胞に添加した。細胞を37℃および5%COにて4時間維持した。インキュベーションの最後に、20%FBSおよびジメチルスルホキシド(DMSO;対照)または0.2、1もしくは10μMのGS(商標)−E[N−(2−エチル−3−メトキシベンゾイル)N’−(3,5−ジメチルベンゾイル)−N’−tert−ブチルヒドラジン]非−ステロイドリガンドのDMSO溶液のいずれかを含有する250μlの増殖培地を添加し、細胞を37℃および5%COにて40時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性を前記したようにアッセイした。リガンド処理細胞における標準化相対光単位(「RLU」)をDMSO処理細胞における標準化RLU(未処理対象)で割ることによって、活性倍数を計算した。
前記したように、出願人らは、以前、非−鱗翅目/非−双翅目無脊椎動物RXRおよびRXRホモログ(USP)(ここでは集合的に無脊椎動物RXRという)が、哺乳動物細胞において脊椎動物RXRによって達成されるよりも高いレベルにてEcRおよびトランス活性レポーターに結合することを示した。しかしながら、脊椎動物RXRはリガンドの不存在下でより低いバックグラウンドレベルを供する。出願人らは、脊椎動物RXRおよび無脊椎動物RXRのリガンド結合ドメインからのアミノ酸配列を比較し、全ての脊椎動物RXRで保存されているが、無脊椎動物RXRでは異なる2つの特定のアミノ酸を同定した。出願人らは、脊椎動物RXRのアミノ酸を無脊椎動物RXRアミノ酸で置き換える結果、誘導に際してより高い活性をもたらすが、リガンドの不存在下では低いバックグラウンドを依然として供するか否かを判断した。
出願人らは、今回、置換した場合に、非−ステロイドリガンドに対して増大した感受性を呈する突然変異体RXRを生じる脊椎動物マウスRXR、アイソフォームαのEFドメイン(「MmRXRα−EF」)内で2つのアミノ酸残基を同定した。突然変異したMmRXRα−EF受容体の活性に対するこれらの2つの置換突然変異:配列番号:1のアミノ酸残基401におけるアスパラギン酸置換(E401D突然変異体)および配列番号:1のアミノ酸残基429におけるセリン置換(G429S突然変異体)の効果を図1に示す。
NIH3T3細胞におけるトランス活性化アッセイにおいて、E401D突然変異体は、より高いバックグラウンドおよび、より高い誘導レベル双方によって証明することによって、脊椎動物RXRよりも無脊椎動物RXRのように挙動した(図1参照)。G429S突然変異体は、より無脊椎動物RXRのように挙動し、これは、リガンドに対する増大した感受性を示すが、より低いバックグラウンドを示す(図1参照)。かくして、出願人らは、リガンドの存在下および不存在下において、単一のアミノ酸変化がMmRXRα−EFの挙動を劇的に改変することができるという驚くべきかつ予期せぬ結果を示した。
これらの2つの突然変異の組合せがいずれかの単一点突然変異単独よりもさらに改良されたRXRを供するかを判断するために、出願人らは、E401DおよびG429S双方の位置において点突然変異を含む二重置換突然変異体MmRXMα−EFを作成した。これらの二重突然変異体(DM)の3つの独立したクローンをNIH3T3細胞において分析し、各単一点突然変異体単独、MmRXRα−EF、およびキメラ脊椎動物RXR/無脊椎動物RXRと比較した(図2参照)。出願人らの結果は、これらの二重突然変異体がキメラRXRと同程度働くことを示し、これは、リガンドの不存在下における低バックグラウンドレベルならびに増大した誘導レベルおよびリガンド感受性を証明する。これらの新規な二重置換突然変異体は、イン・ビボ適用で用いる有利なRXRを提供する。
また、出願人らは、これらのMmRXRα−EF置換突然変異体が、図1および図2に提示するGS(商標)−Eに対するそれらの応答と同様に、ステロイドリガンド、ポナステロンA(Invitrogen)の存在下で野生型HsRXRβ−EFよりも応答することを測定した(データは示さず)。
前記したように、CfEcRに対するヘテロダイマーパートナーとしての無脊椎動物RXR、LmUSP(ここではLmRXRともいう)の使用は、CfEcR−ベースの誘導性遺伝子発現システムの感受性および誘導の大きさ双方を改良した。出願人らは、LmRXRおよびHsRXRβリガンド結合ドメイン(ドメインEF)のポリペプチド配列を整列させ、これらの2つの蛋白質の間で異なるアミノ酸残基を同定した。この実施例は、HsRXRβにおける野生型残基の代わりにLmRXRアミノ酸を置き換えるHsRXRβ置換突然変異体の出願人らの分析を記載する。出願人らは、今回、哺乳動物細胞におけるCfEcR−ベースの誘導性遺伝子発現システムの感受性および誘導の大きさを共に修飾するいくつかの置換突然変異体を同定した。
簡単に述べれば、出願人らはヒトRXRアイソフォームβ−EF(HsRXRβ−EF)における置換突然変異体を構築し、分析し、ここに、無脊椎動物RXRホモログLmUSP−EFと比較してHsRXRβ−EFにおいて異なるアミノ酸をLmUSP−EFのアミノ酸残基に突然変異させ、0、0.04、0.2、1、5または25μMのGS(商標)−E[N−(2−エチル−3−メトキシベンゾイル)N’−(3’5−ジメチルベンゾイル)−N’−tert−ブチルヒドラジン]非−ステロイドリガンドの存在下にて、前記実施例2に記載したようにNIH3T3細胞におけるトランス活性化の活性に対するそれらの効果につきアッセイした。細胞を回収し、前記したようにレポーター活性をアッセイした。リガンド処理細胞における標準化された相対光単位(「RLU」)をDMSO処理細胞(未処理対照)における標準化RLUで割ることによって、活性の倍数を計算した。
図3に示すように、HsRXRβ−EF置換突然変異体T/S、DAK/EVR、SNPS/KSAQ、V/L、S/A、T/E、CKQKY/TRTTHおよびEQQ/DEPは誘導倍数および誘導の大きさを改良した。出願人らのHsRXRβ−EF置換突然変異体DAK/EVR、SNPS/KSAQ、V/L、S/A、T/E、CKQKY/TRTTHおよびEQQ/DEPは非−ステロイドリガンドの感受性も改良した(図3参照)。
また、図3に提示した結果は、HsRXRβ−EF置換突然変異体D344N、A495S(30の誘導倍数を持つA/Sとして標識)、およびA528S(21の誘導倍数を持つA/Sとして標識)は、野生型と比較して低下した誘導倍数、誘導の大きさおよび/またはリガンド感受性を呈する。
また、出願人らは、図3に提示したGS(商標)−Eに対するそれらの応答と同様に、ステロイドリガンド、ポナステロンA(Invitrogen)の存在下にて、これらのHsRXRβ−EF置換突然変異体が野生型HsRXRβ−EFよりも良好に応答することを測定した(データは示さず)。
前記したように、CfEcR−ベースの遺伝子調節システムは、RXRをヘテロダイマーパートナーとして用いる場合にはリガンド依存性であり、USPをヘテロダイマーパートナーとして用いる場合にはリガンド非依存性である。しかしながら、CfUSPをヘテロダイマーパートナーとして用いる場合には、レポーター遺伝子発現は非常に高いレベルで誘導される。ヘテロダイマーパートナーとしてRXRを改良するために、出願人らは、いくつかのUSPおよびRXRリガンド結合ドメイン(ドメインEF)のポリペプチド配列を整列させ、これらの2つの核受容体ファミリーメンバーの間で異なるアミノ酸残基を同定した。特に、出願人らは、全てのUSPにおいて保存されているが、RXRにおいて異なる残基を同定し、HsRXRβにおいてこれら残基を突然変異させた。0、0.04、0.2、1、5または25μMのGS(商標)−E[N−(2−エチル−3−メトキシベンゾイル)N’−(3,5−ジメチルベンゾイル)−N’−tert−ブチルヒドラジン]非−ステロイドリガンドの存在下で、前記実施例2に記載したように、これらの置換突然変異体をNIH3T3細胞において分析した。細胞を回収し、前記したようにレポーターの活性をアッセイした。リガンド処理細胞における標準化相対光単位(「RLU」)をDMSO処理細胞(未処理対照)における標準化RLUで割ることによって、活性の倍数を計算した。
簡単に述べれば、本実施例は、ヒトRXRアイソフォームβ−EF(HsRXRβ−EF)における置換突然変異体の構築および分析を記載し、ここに、ウルトラスピラクル蛋白質の保存された残基と比較してHsRXRβ−EFにおいて異なるアミノ酸をUSPアミノ酸残基に突然変異させ、NIH3T3細胞におけるトランス活性化の活性に対するそれらの効果につきアッセイした。
図4に示されるように、HsRXRβ−EF置換突然変異体GPG/LRV、K/R、S/A、およびG/Sは、EcRベースの遺伝子調節システムの、誘導倍数および誘導の大きさを向上させた。HsRXRβ−EF置換突然変異体GPG/LRV、S/A、E/D、SET/ADY、およびG/Sは、EcRベースの遺伝子調節システムのリガンド感受性を向上させた(図4参照)。
また、図4に示される結果は、HsRXRβ−EF置換突然変異体M431L、R442K、およびK551Rが、野生型に対して低減された、誘導倍数、誘導の大きさおよび/またはリガンド感受性を示したことを示す。HsRXRβ−EF置換突然変異体M/Lは、トランス活性化活性を本質的に取り除いた(図4参照)。このM/L突然変異体は直交リガンドスクリーニングアッセイに有用である。
また、出願人らは、図4に提示したGS(商標)−Eに対するそれらの応答と同様に、ステロイドリガンド、ポナステロンA(Invitrogen)の存在下にて、これらのHsRXRβ−EF置換突然変異体が野生型HsRXRβ−EFよりも良好に応答することを測定した(データは示さず)。
図1は、GAL4/CfEcR−DEFおよびpFRLucと共にNIH3T3細胞にトランスフェクトされたVP16/MmRXRα−EF、VP16/LmUSP−EF、またはVP16/MmRXRα−EF突然変異体E265D(RXRmutE/D)またはG293S(RXRmutG/S)のレポーター遺伝子トランス活性化を示す。0、0.2、1および10μM GS(商標)−Eの存在下で細胞を48時間増殖させ、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。 図2は、GAL4/CfEcR−DEFおよびpFRLucと共にNIH3T3細胞にトランスフェクトされたVP16/MmRXRα−EF(RXR−E)、VP16/LmUSP−EF(LmUSP−E)、VP16/キメラ脊椎動物RXR/無脊椎動物RXR(キメラ)、またはVP16/MmRXRα−EF突然変異体E401D(MutE265D)、G429S(MutG293S)、または二重突然変異体E401D+G429S(DM1、DM2およびDM4)の3つの独立したクローンのレポーター遺伝子トランス活性化を示す。0、0.2、1および10μM GS(商標)−Eの存在下で細胞を48時間増殖させ、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。 図3は、NIH3T3細胞にトランスフェクトされたGAL4CfEcRDEF、pFRLUCおよびVP16HsRXREFβまたはその突然変異体バージョンDNAのレポーター遺伝子トランス活性化を示す。DMSOまたはDMSO中の0.04、0.2、1、5もしくは25μMのGS(商標)−Eを含有する培地の存在下で、トランスフェクトされた細胞を増殖させた。リガンドを添加した48時間後、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。 図4は、NIH3T3細胞にトランスフェクトされたGAL4CfEcRDEF、pFRLUCおよびVP16HsRXREFβまたはその突然変異体バージョンDNAのレポーター遺伝子トランス活性化を示す。DMSOまたはDMSO中の0.04、0.2、1、5もしくは25μMのGS(商標)−Eを含有する培地の存在下で、トランスフェクトされた細胞を増殖させた。リガンドを添加した48時間後、レポーター活性をアッセイした。バーの頂部の数は最大誘導倍数を示す。

Claims (7)

  1. a)i)その発現を変調させるべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するDNA−結合ドメインと;
    ii)エクジソン受容体リガンド結合ドメインと
    を含む第1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセット;
    b)i)トランス活性化ドメインと;
    ii)換突然変異を含むレチノイドX受容体リガンド結合ドメイン
    を含む、第2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞中で発現させることができる遺伝子発現カセット;および
    c)i)DNA−結合ドメインによって認識される応答エレメントと;
    ii)トランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーターと;
    iii)その発現が変調されるべき遺伝子と
    を含む遺伝子発現カセット
    を含み、
    レチノイドX受容体リガンド結合ドメインが、アミノ酸残基の置換をもたらすコドン突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされ、ここに、該アミノ酸残基が、a)配列番号:1の401または429、b)配列番号:1の401および429、c)配列番号:2の337、55、385、62、470、472、473、または500d)配列番号:2の321、322および323、e)配列番号:2の450、451および452、f)配列番号:2の455、456、457および458、g)配列番号:2の470、472および473、h)配列番号:2の475、476、477、478および479、ならびにi)配列番号:2の481、482および483位置にあ
    置換突然変異が、a)配列番号:1のE401DまたはG429S、b)配列番号:1のE401DおよびG429S、c)配列番号:2のT337S、K355R、S385A、V462L、S470A、E472D、T473E、またはG500S、d)配列番号:2のG321L、P322RおよびG323V、e)配列番号:2のD450E、A451VおよびK452R、f)配列番号:2のS455K、N456S、P457AおよびS458Q、g)配列番号:2のS470A、E472DおよびT473Y、h)配列番号:2のC475T、K476R、Q477T、K478TおよびY479H、ならびにi)配列番号:2のE481D、Q482EおよびQ483Pよりなる群から選択される、
    遺伝子発現変調システム。
  2. 該DNA−結合ドメインが、エクジソン受容体DNA−結合ドメイン、GAL4 DNA−結合ドメイン、およびLexA DNA−結合ドメインよりなる群から選択される、請求項記載の遺伝子発現変調システム。
  3. トランス活性化ドメインが、エクジソン受容体トランス活性化ドメイン、VP16トランス活性化ドメイン、B42酸性アクチベータートランス活性化ドメインおよびp65トランス活性化ドメインよりなる群から選択される、請求項記載の遺伝子発現変調システム。
  4. a)請求項記載の遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し;さらに、
    b)宿主細胞にリガンドを導入する
    工程を含む、宿主細胞中で遺伝子の発現を変調する方法。
  5. 該リガンドが、
    a)式:
    Figure 0004994563
    [式中、Eは第三級炭素を含有する(C−C)アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ(C−C)アルキルであり;
    は、H、Me、Et、i−Pr、F、ホルミル、CF、CHF、CHCl、CHF、CHCl、CHOH、CHOMe、CHCN、CN、CCH、1−プロピニル、2−プロピニル、ビニル、OH、OMe、OEt、シクロプロピル、CFCF、CH=CHCN、アリル、アジド、SCNまたはSCHFであり;
    はH、Me、Et、n−Pr、i−Pr、ホルミル、CF、CHF、CHCl、CHF、CHCl、CHOH、CHOMe、CHCN、CN、CCH、1−プロピニル、2−プロピニル、ビニル、Ac、F、Cl、OH、OMe、OEt、O−n−Pr、OAc、NMe、NEt、SMe、SEt、SOCF、OCFCFH、COEt、シクロプロピル、CFCF、CH=CHCN、アリル、アジド、OCF、OCHF、O−i−Pr、SCN、SCHF、SOMe、NH−CNであるか、またはR、ならびにRおよびRが結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し;
    はH、Etであるか、またはR、ならびにRおよびRが結合したフェニル炭素と一緒になってエチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し;
    、RおよびRは独立してH、Me、Et、F、Cl、Br、ホルミル、CF、CHF、CHCl、CHF、CHCl、CHOH、CN、CCH、1−プロピニル、2−プロピニル、ビニル、OMe、OEt、SMeまたはSEtである]
    の化合物;
    b)エクジソン、20−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、またはムリステロンA;
    c)オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコレステロール、25−エポキシコレステロール、T0901317、5−アルファ−6−アルファ−エポキシコレステロール−3−スルフェート、7−ケトコレステロール−3−スルフェート、ファルネゾール、胆汁酸、1,1−ビフォスフォネートエステル、または幼若ホルモンIII;または
    d)9−シス−レチノイン酸、4−(1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロ−2−ナフチル)−エテニル)安息香酸(3−メチル−TTEB)、((E)−2)2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−3,5,5,8,8−ペンタメチル−2−ナフチル)プロペン−1−イル)−4−チオフェンカルボン酸)、2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−3,5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフチル)−2−(カルボキシフェニル)−1,3−ジオキソラン、4−(5H−2,3−(2,5−ジメチル−2,5−ヘキサノ)−5−メチル−ジベンゾ(b,e)(1,4)ジアゼピン−11−イル)−安息香酸(HX600)もしくはそのチアジアゼピンアナログ、3,7,11,15−テトラメチルヘキサデコン酸(フィタン酸)、6−(1−(3,5,5,8,8−ペンタメチル−5,6,7,8−テトラヒドロナフタレン−2−イル)シクロプロピル)ニコチン酸、2−(4−カルボキシフェニル)−2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)−1,3−ジチアン、または4−(2−メチル)−1−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)プロペニル)安息香酸
    である、請求項記載の方法。
  6. さらに宿主細胞に第2のリガンドを導入することを含み、該第2のリガンドが9−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである、請求項記載の方法。
  7. 請求項記載の遺伝子発現変調システムを含む宿主細胞。
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Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
DK1534738T3 (da) 2001-02-20 2012-10-01 Intrexon Corp Nye substitutionsmutantreceptorer og anvendelse heraf i et inducérbart genekpressionssystem på basis af en nuklear receptor
WO2002066612A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
CA2438119C (en) 2001-02-20 2014-12-16 Rheogene Holdings, Inc. Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
CA2441444C (en) 2001-02-20 2013-09-03 Rheogene Holdings, Inc. Novel ecdysone receptor/invertebrate retinoid x receptor-based inducible gene expression system
MXPA04002810A (es) 2001-09-26 2005-06-06 Rheogene Holdings Inc Acidos nucleicos receptores de ecdisona de saltarilla, polipeptidos, y sus usos.
JP2005507247A (ja) 2001-09-26 2005-03-17 レオジーン・ホールディングス,インコーポレーテッド コナジラミエクジソン受容体核酸、ポリペプチド、およびそれらの使用
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
AU2006272922A1 (en) 2005-07-22 2007-02-01 Amgen Inc. Aniline sulfonamide derivatives and their uses
KR20090035011A (ko) 2006-07-26 2009-04-08 인트렉손 코포레이션 질병을 치료하는 방법 및 조성물
CN104761466A (zh) 2007-05-29 2015-07-08 英特拉克森公司 通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体
EP2179044A4 (en) 2007-07-06 2012-06-06 Temasek Life Sciences Lab Ltd LEXA BASED INDUCIBLE GENE EXPRESSION SYSTEM FOR TRANSGENIC ANIMALS
MX2010001993A (es) 2007-08-23 2010-03-11 Intrexon Corp Metodos y composiciones para diagnosticar una enfermedad.
EP2205249B1 (en) 2007-09-28 2018-11-07 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
JP2010539993A (ja) 2007-10-08 2010-12-24 イントレキソン コーポレーション 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用
MX2010009996A (es) 2008-03-14 2010-10-20 Intrexon Corp Ligandos esteroides y su uso en la modulacion de genes interruptores.
US20110265192A1 (en) * 2008-09-05 2011-10-27 Syddansk Universitet Nuclear receptor sensor system in transgenic animal
TWI688395B (zh) 2010-03-23 2020-03-21 英翠克頌公司 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途
WO2012122025A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
WO2012145572A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
CN105283439B (zh) 2013-03-15 2018-02-02 英特瑞克斯顿股份有限公司 含硼的二酰基肼类化合物
WO2015012924A2 (en) 2013-04-29 2015-01-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof
JP6567657B2 (ja) 2014-09-17 2019-08-28 イントレキソン コーポレーション ホウ素含有ジアシルヒドラジン化合物
CN108135994B (zh) 2015-05-13 2022-01-25 宾夕法尼亚州大学信托人 Aav-介导的抗-流感抗体的表达及其使用方法
WO2017062953A1 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
EP3387010A1 (en) 2015-11-11 2018-10-17 Intrexon Corporation Compositions and methods for expression of multiple biologically active polypeptides from a single vector for treatment of cardiac conditions and other pathologies
WO2017214333A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Intrexon Corporation Cd33 specific chimeric antigen receptors
UY37343A (es) 2016-07-25 2018-02-28 Intrexon Corp Control del fenotipo en plantas
NZ752941A (en) 2016-11-09 2023-04-28 Intrexon Corp Frataxin expression constructs
SG11201906213UA (en) 2017-01-10 2019-08-27 Intrexon Corp Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems
FI3589730T3 (fi) 2017-02-28 2024-02-22 Univ Pennsylvania Kladin f adenoassosioitunut virus (aav) -vektori ja sen käyttötapoja
TW201837170A (zh) 2017-02-28 2018-10-16 賓州大學委員會 新穎aav媒介的流感疫苗
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
US11674138B2 (en) 2017-03-13 2023-06-13 President And Fellows Of Harvard College Methods of modulating expression of target nucleic acid sequences in a cell
IL270990B2 (en) 2017-06-07 2024-02-01 Precigen Inc Expression of new cell markers
CA3092935A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Precigen, Inc. Hepatitis b vaccines and uses of the same
WO2020206056A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Greenvenus Llc Peptides and methods of plant protection
CN110476898B (zh) * 2019-09-16 2021-08-10 中国烟草总公司福建省公司 一种激素及温度对烟蚜茧蜂僵蚜出蜂的调控方法
WO2021220451A1 (ja) 2020-04-30 2021-11-04 東芝三菱電機産業システム株式会社 電力変換装置及び故障解析方法
TW202237850A (zh) 2020-12-01 2022-10-01 賓州大學委員會 具有組織特異性靶向基序的新穎構成物及含有其之組成物
AU2022262771A1 (en) 2021-04-23 2023-11-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel compositions with brain-specific targeting motifs and compositions containing same
TW202325845A (zh) 2021-10-02 2023-07-01 賓州大學委員會 新穎aav衣殼及含其之組成物
WO2023147304A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4631211A (en) 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
US4985461A (en) 1985-10-21 1991-01-15 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
US5117057A (en) 1985-10-21 1992-05-26 Rohm And Haas Company Insecticidal N' substituted-N-N'-disubstituted-hydrazines
US5424333A (en) 1985-10-21 1995-06-13 Rohm And Haas Company Anthelmintic N'-substituted-N,N'-disubstitutedhydrazines
FR2593630B1 (fr) 1986-01-27 1988-03-18 Maurice Francois Ecran d'affichage a matrice active a resistance de drain et procedes de fabrication de cet ecran
US4859609A (en) 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5225443A (en) 1986-05-01 1993-07-06 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N'-substituted N,N'-diacylhydrazines
US5071773A (en) 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5171671A (en) 1987-12-02 1992-12-15 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor composition
US5429952A (en) 1988-02-02 1995-07-04 Biocode, Inc. Marking of products to establish identity and source
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
WO1989012690A1 (en) 1988-06-13 1989-12-28 American Biogentic Sciences, Inc. Method for the production of monoclonal antibodies utilizing a germfree animal
DK0463039T3 (da) 1989-03-15 1994-11-07 Hu Metal Eng Pty Ltd Apparat til formning af et rør fra en metalblikplade
US4954655A (en) 1989-03-31 1990-09-04 Rohm And Haas Company Preparation of alkylhydrazines
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
EP0514488B1 (en) 1990-02-09 2000-09-13 The Salk Institute For Biological Studies Retinoid receptor compositions and methods
CA2076386C (en) 1990-02-26 2003-04-22 David S. Hogness Identification and expression of insect steroid receptor dna sequence
US5688691A (en) 1990-03-22 1997-11-18 The Salk Institute For Biological Studies Insect retinoid-like receptor compositions and methods
US7119077B1 (en) 1990-03-22 2006-10-10 The Salk Institute For Biological Studies Multimeric forms of members of the steroid/thyroid superfamily of receptors with the ultraspiracle receptor
WO1991014695A1 (en) 1990-03-22 1991-10-03 The Salk Institute For Biological Studies Insect retinoid receptor compositions and methods
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
CA2043775A1 (en) 1990-06-14 1991-12-15 Dat P. Le Dibenzoylakylcyanohydrazines
US5139749A (en) 1990-06-22 1992-08-18 Tas, Inc. Fluidized calcining process
IL100643A (en) 1991-01-25 1996-10-31 Nippon Kayaku Kk History of hydrazine and pesticides containing these histories as an active ingredient
WO1993003713A1 (en) 1991-08-23 1993-03-04 The Salk Institute For Biological Studies Use of selective ligands for treatment of disease states responsive to steroid or steroid-like hormones
US5668175A (en) 1991-08-23 1997-09-16 The Salk Institute For Biological Studies Use of selective ligands for treatment of disease states responsive to steroid or steroid-like retinoids
AU2579692A (en) 1991-09-17 1993-04-27 Salk Institute For Biological Studies, The Receptor of the thyroid/steroid hormone receptor superfamily
JPH07503609A (ja) 1991-12-06 1995-04-20 ザ ソールク インスチチュート フォア バイオロジカル スタディズ リセプターのステロイド/甲状腺スーパーファミリーのメンバーの多量体型
JPH06510206A (ja) 1992-01-24 1994-11-17 アンスティテュー・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル 新規ヘテロダイマー核レセプタータンパク質、それをコードする遺伝子、およびその使用
US6013836A (en) 1992-02-28 2000-01-11 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-disubstitutedhydrazines
US5530028A (en) 1992-11-23 1996-06-25 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
NZ267843A (en) 1993-05-27 1997-10-24 Selectide Corp Libraries of synthetic test compound attached to separate phase synthesis supports
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
US6326166B1 (en) 1995-12-29 2001-12-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA-binding proteins
EP0809509A4 (en) 1995-01-13 2000-02-02 Salk Inst For Biological Studi ALLOSTERIC REGULATION OF NUCLEAR HORMONE RECEPTORS
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
ES2237764T3 (es) * 1995-03-03 2005-08-01 Syngenta Participations Ag Control de la expresion genica en plantas por transactivacion mediada por un receptor en presencia de un ligando quimico.
TR199701436T1 (xx) 1995-05-26 1998-03-21 Zeneca Limited Bir ekdison resept�r�n� i�eren bir gen anahtar�.
US5939442A (en) 1995-06-07 1999-08-17 The Salk Institute For Biological Studies Modulations of peroxisome proliferator activated receptor-γ, and methods for the use thereof
US6266622B1 (en) * 1995-12-13 2001-07-24 Regents Of The University Of California Nuclear receptor ligands and ligand binding domains
GB9606126D0 (en) 1996-03-22 1996-05-22 British Biotech Pharm Biosensors
CA2200423C (en) 1996-03-26 2006-12-19 Sietse Mosselman Novel estrogen receptor
EP0910652B1 (en) 1996-04-05 2014-10-08 The Salk Institute For Biological Studies Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6723531B2 (en) 1996-04-05 2004-04-20 The Salk Institute For Biological Studies Method for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6610828B1 (en) 1996-05-24 2003-08-26 Syngenta Limited Heliothis ecdysone receptor
US6025483A (en) 1996-06-05 2000-02-15 The Regents Of The University Of California Maize and cauliflower apetalai gene products and nucleic acid molecules encoding same
US5919667A (en) 1996-06-20 1999-07-06 The Salk Institute For Biological Studies Modular assembly retroviral vectors and uses thereof
US5942444A (en) 1997-01-27 1999-08-24 Biocode, Inc. Marking of products to establish identity, source and fate
WO1999002683A1 (en) 1997-07-10 1999-01-21 The Salk Institute For Biological Studies Modified lepidopteran receptors and hybrid multifunctional proteins for use in regulation of transgene expression
US6300488B1 (en) 1997-07-10 2001-10-09 The Salk Institute For Biological Studies Modified lepidopteran receptors and hybrid multifunctional proteins for use in transcription and regulation of transgene expression
EP1017829A2 (en) 1997-08-26 2000-07-12 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Fusion proteins comprising a dimerization, trimerization or tetramerization domain and an additional heterologous transcription activation, transcription repression, dna binding or ligand binding domain
US7101681B1 (en) 1997-11-21 2006-09-05 Amgen, Inc. Nuclear hormone receptor drug screens
US6756491B2 (en) 1998-01-09 2004-06-29 The Salk Institute For Biological Studies Steroid-activated nuclear receptors and uses therefor
AUPP135698A0 (en) 1998-01-15 1998-02-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Insectical modalities
US6410245B1 (en) 1998-04-01 2002-06-25 Affymax, Inc. Compositions and methods for detecting ligand-dependent nuclear receptor and coactivator interactions
US6475733B1 (en) 1998-04-06 2002-11-05 Lerner Pharmaceuticals, Inc. Cell surface receptors for the detection and identification of compounds
US6333318B1 (en) 1998-05-14 2001-12-25 The Salk Institute For Biological Studies Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6258603B1 (en) 1998-06-17 2001-07-10 Rohm And Haas Company Ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US6117639A (en) 1998-08-31 2000-09-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Fusion proteins, DNA molecules, vectors, and host cells useful for measuring protease activity
US6380354B1 (en) 1998-09-03 2002-04-30 Zymogenetics, Inc. Kunitz domain polypeptide zkun6
JP2002525053A (ja) 1998-09-10 2002-08-13 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル, インコーポレイテッド エクジソンレセプターおよびそれらの使用のための方法
US5989863A (en) 1998-10-14 1999-11-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human ankyrin family protein
WO2000071743A1 (fr) 1999-05-25 2000-11-30 Eisai Co., Ltd. Methode bihybride dans une cellule de mammifere
JP2003505019A (ja) 1999-07-01 2003-02-12 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼーション ステロイドおよび幼若ホルモン受容体ポリペプチドをコードする新規遺伝子配列ならびにその用途
US7057015B1 (en) 1999-10-20 2006-06-06 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor functional dimers and methods of their use
AU2001241682A1 (en) 2000-02-24 2001-09-03 The Salk Institute For Biological Studies Gene expression system based on chimeric receptors
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
CA2404253C (en) 2000-03-22 2014-05-13 Rohm And Haas Company Novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
US20020037514A1 (en) 2000-03-24 2002-03-28 Klein Elliott S. Identification of nuclear receptor-dependent coregulator recruitment
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
DK1534738T3 (da) 2001-02-20 2012-10-01 Intrexon Corp Nye substitutionsmutantreceptorer og anvendelse heraf i et inducérbart genekpressionssystem på basis af en nuklear receptor
CA2438119C (en) 2001-02-20 2014-12-16 Rheogene Holdings, Inc. Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
CA2441444C (en) 2001-02-20 2013-09-03 Rheogene Holdings, Inc. Novel ecdysone receptor/invertebrate retinoid x receptor-based inducible gene expression system
WO2002066612A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
CN1161325C (zh) 2001-03-26 2004-08-11 江苏省农药研究所 作为杀虫剂的二酰基肼类化合物及制备此种化合物的中间体以及它们的制备方法
MXPA04002810A (es) 2001-09-26 2005-06-06 Rheogene Holdings Inc Acidos nucleicos receptores de ecdisona de saltarilla, polipeptidos, y sus usos.
JP2005507247A (ja) 2001-09-26 2005-03-17 レオジーン・ホールディングス,インコーポレーテッド コナジラミエクジソン受容体核酸、ポリペプチド、およびそれらの使用
US20050228016A1 (en) 2002-06-13 2005-10-13 Enrique Michelotti Tetrahydroquinolines for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7304162B2 (en) 2003-02-21 2007-12-04 Intrexon Corporation Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use

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