ES2392508T3 - Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso - Google Patents

Abstract

Un sistema de modulación de la expresión génica que comprende: a) un primer casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y b) un segundo casete de expresión génica que se puede expresar en la célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico que comprende, o bien (A) las hélices 1-7 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un RXR de invertebrado, o bien (B) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un RXR de invertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero.

Description

Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso 5

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología o ingeniería genética. Específicamente, la presente invención se refiere al campo de la expresión génica. Más específicamente, la presente invención se refiere a un sistema inducible de expresión génica basado en receptores X retinoides quiméricos/receptores de ecdisona novedoso y a métodos de modulación de la expresión de un gen en una célula huésped usando este sistema inducible de expresión génica.

Antecedentes de la invención

15 La mención de cualquier referencia en el presente documento no debe considerarse una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" de la presente solicitud.

En el campo de la ingeniería genética, el control preciso de la expresión génica es una herramienta útil para el estudio, la manipulación y el control del desarrollo y otros procesos fisiológicos. La expresión génica es un proceso biológico complejo que implica una serie de interacciones proteína-proteína específicas. Para desencadenar la expresión génica, de forma que produzca el ARN necesario como la primera etapa de la síntesis de proteínas, debe aproximarse un activador de la transcripción a un promotor que controle la transcripción génica. Normalmente, el propio activador de la transcripción está asociado con una proteína que tiene al menos un dominio de unión a ADN

25 que se une a sitios de unión a ADN presentes en las regiones promotoras de genes. Por tanto, para que se produzca la expresión génica, una proteína que comprenda un dominio de unión a ADN y un dominio de transactivación a una distancia apropiada del dominio de unión a ADN debe situarse en la posición correcta en la región promotora del gen.

El enfoque transgénico tradicional utiliza un promotor específico de célula para dirigir la expresión de un transgén diseñado. En primer lugar, se incorpora en un genoma huésped una construcción de ADN que contiene el transgén. Cuando se desencadena por un activador de la transcripción, se produce la expresión del transgén en un tipo celular determinado.

35 Otro medio para regular la expresión de genes exógenos en células es por medio de promotores inducibles. Los ejemplos del uso de estos promotores inducibles incluyen el promotor PR1-a, sistemas procariotas de represoroperador, sistemas de inmunofilina inmunosupresores y sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores, tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas, y se describen a continuación.

El promotor PR1-a del tabaco se induce durante la respuesta sistémica de resistencia adquirida tras un ataque patógeno. El uso de PR1-a puede ser limitado porque, frecuentemente, responde a materiales endógenos y factores externos tales como patógenos, radiación UV-B y contaminantes. Se han descrito sistemas de regulación génica basados en promotores inducidos por choque térmico, interferón y metales pesados (Wurn et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5414-5418; Arnheiter et al., 1990, Cell 62: 51-61; Filmus et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:

45 27550-27560). Sin embargo, estos sistemas presentan limitaciones debido a su efecto sobre la expresión de genes que no son su objetivo. Estos sistemas también son poco consistentes.

Los sistemas procariotas de represor-operador utilizan proteínas represoras bacterianas y las secuencias de ADN de operador único a las que se unen. Tanto el sistema de represor-operador de tetraciclina ("Tet") como el de lactosa ("Lac") de la bacteria Escherichia coli se han usado en plantas y animales para controlar la expresión génica. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteína represora TetR, dando lugar a un cambio conformacional que libera la proteína represora del operador, que como consecuencia, permite que se produzca la transcripción. En el sistema Lac, se activa un operón lac en respuesta a la presencia de lactosa o análogos sintéticos tales como isopropil-b-Dtiogalactósido. Desafortunadamente, el uso de estos sistemas está restringido por la química inestable de los

55 ligandos, es decir, tetraciclina y lactosa, su toxicidad, su presencia natural o los niveles relativamente altos necesarios para la inducción o la represión. Por motivos similares, la utilidad en animales de estos sistemas es limitada.

Las moléculas inmunosupresoras tales como FK506, rapamicina y ciclosporina A se pueden unir a inmunofilinas FKBP12, ciclofilina, etc. Usando esta información se ha ideado una estrategia general para juntar dos proteínas cualesquiera simplemente situando FK506 sobre cada una de las dos proteínas o situando FK506 sobre una y ciclosporina A sobre la otra. Después, se puede usar un homodímero sintético de FK506 (FK1012) o un compuesto resultante de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) para inducir la dimerización de estas moléculas (Spencer et al., 1993, Science 262:1019-24; Belshaw et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:4604-7). El dominio de unión a 65 ADN de Gal4 fusionado con FKBP12 y el dominio activador VP16 fusionado con ciclofilina, y el compuesto FKCsA se usaron para mostrar la heterodimerización y activación de un gen indicador bajo el control de un promotor que

contiene sitios de unión a Gal4. Desafortunadamente, este sistema incluye inmunosupresores que pueden tener efectos secundarios no deseados y, por lo tanto, limita su uso para diversas aplicaciones de interruptores génicos de mamífero.

5 También se han empleado sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores, tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas. Los receptores de hormonas esteroideas son miembros de la superfamilia de receptores nucleares y se encuentran en células de vertebrado e invertebrado. Desafortunadamente, el uso de compuestos esteroideos que activan los receptores para la regulación de la expresión génica, en particular en plantas y mamíferos, está limitado debido a su implicación en muchas otras rutas biológicas naturales en estos organismos. Para superar estas dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo usando receptores de ecdisona (EcR) de insecto.

El crecimiento, la muda y el desarrollo de los insectos están regulados por la hormona esteroidea ecdisona (hormona de la muda) y las hormonas juveniles (Dhadialla, et al., 1998, Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569). El objetivo

15 molecular de la ecdisona en insectos consiste en al menos un receptor de ecdisona (EcR) y una proteína ultraespiráculo (USP). El EcR es un miembro de la superfamilia de receptores esteroideos nucleares que se caracteriza por dominios de unión a ADN distintivo y a ligando y un dominio de activación (Koelle et al. 1991, Cell, 67:59-77). Los receptores EcR son sensibles a una serie de compuestos esteroideos tales como ponasterona A y muristerona A. Recientemente, se han descrito compuestos no esteroideos con actividad ecdiesteroide agonista, incluidos los insecticidas comercialmente disponibles tebufenozida y metoxifenozida, que se comercializan en todo el mundo por Rohm and Haas Company (véase la solicitud de patente internacional n.º PCT/EP96/00686 y la patente de EE. UU. 5.530.028). Ambos análogos tienen perfiles de seguridad excepcionales para otros organismos.

Las solicitudes de patente internacional N.º PCT/US97/05330 (documento WO 97/38117) y PCT/US99/08381

25 (documento WO 99/58155) divulgan métodos para modular la expresión de un gen exógeno en los que una construcción de ADN que comprende el gen exógeno y un elemento de respuesta a ecdisona se activa por una segunda construcción de ADN que comprende un receptor de ecdisona que, en presencia de un ligando para ello, y opcionalmente en presencia de un receptor que puede actuar como compañero silencioso, se une al elemento de respuesta a ecdisona para inducir la expresión génica. El receptor de ecdisona elegido se aisló a partir de Drosophila melanogaster. Normalmente, estos sistemas requieren la presencia de un compañero silencioso, preferentemente un receptor X retinoide (RXR), para proporcionar una activación óptima. En células de mamífero, el receptor de ecdisona de insecto (EcR) forma un heterodímero con el receptor X retinoide (RXR) y regula la expresión de genes objetivo de manera dependiente de ligando. La solicitud de patente internacional N.º PCT/US98/14215 (documento WO 99/02683) divulga que el receptor de ecdisona aislado a partir de la polilla de seda Bombyx mori es funcional en

35 sistemas de mamífero sin necesidad de un compañero de dímero exógeno.

La patente de EE. UU. N.º 5.880.333 divulga un sistema de heterodímero de ultraespiráculo (USP) y EcR de Drosophila melanogaster usado en plantas en las que el dominio de transactivación y el dominio de unión a ADN están situados en dos proteínas híbridas diferentes. Desafortunadamente, este sistema no es eficaz para inducir la expresión de genes indicadores en células animales (para comparación, véase el ejemplo 1.2, más adelante).

En cada uno de estos casos, el dominio de transactivación y el dominio de unión de ADN (bien como EcR nativo como en la solicitud de patente internacional n.º PCT/US98/14215 o bien como EcR modificado como en la solicitud de patente internacional N.º PCT/US97/05330) se incorporaron en una sola molécula y los demás compañeros

45 heterodiméricos, USP o RXR, se usaron en su estado nativo.

Las desventajas de los sistemas de regulación génica basados en EcR descritos anteriormente incluyen una considerable actividad de fondo en ausencia de ligandos y la imposibilidad de aplicar estos sistemas para su uso tanto en plantas como en animales (véase la patente de EE. UU. N.º 5.880.333). Para la mayoría de las aplicaciones que se basan en la modulación de la expresión génica, no son deseables estos sistemas basados en EcR. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de proporcionar sistemas mejorados para modular de forma precisa la expresión de genes exógenos tanto en plantas como en animales. Estos sistemas mejorados serían útiles para aplicaciones tales como tratamiento génico, producción de proteínas y anticuerpos a gran escala, ensayos de rastreo de alto rendimiento basados en células, genómica funcional y regulación de rasgos en animales transgénicos. Los

55 sistemas mejorados simples, compactos y dependientes de ligandos que son relativamente baratos, fácilmente disponibles y de baja toxicidad para el huésped, resultarían útiles para regular sistemas biológicos.

Recientemente, los solicitantes han mostrado que un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona en el que los dominios de transactivación y de unión a ADN se separan entre sí situándolos en dos proteínas diferentes, da lugar a una actividad de fondo enormemente reducida en ausencia de un ligando y significativamente aumentada con respecto al fondo en presencia de un ligando (en la solicitud en trámite PCT/US01/09050). Este sistema de dos híbridos es un sistema inducible de expresión génica significativamente mejorado en comparación con los dos sistemas divulgados en las solicitudes PCT/US97/05330 y PCT/US98/14215.

65 Los solicitantes demostraron anteriormente que un sistema de expresión génica basado en receptores de ecdisona en asociación con una proteína ultraespiráculo (USP) de díptero (Drosophila melanogaster) o de lepidóptero (Choristoneura fumiferana) se expresa de forma constitutiva en células de mamífero, mientras que un sistema de expresión génica basado en receptores de ecdisona en asociación con un receptor X retinoide (RXR) de vertebrado es inducible en células de mamífero (en la solicitud en trámite PCT/US01/09050). Recientemente, los solicitantes realizaron el sorprendente descubrimiento de que un RXR de invertebrado distinto de díptero y de lepidóptero puede

5 funcionar de forma similar al RXR de vertebrado en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona (en la solicitud de EE. UU. presentada junto al presente documento).

Los solicitantes han mostrado ahora que un dominio de unión a ligando de RXR quimérico, que comprende al menos dos fragmentos polipeptídicos, en el que el primer fragmento polipeptídico es de RXR de una especie de vertebrado/invertebrado y el segundo fragmento polipeptídico es de RXR de una especie diferente de vertebrado/invertebrado, de modo que se produce un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de vertebrado/invertebrado, un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de vertebrado/vertebrado o un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de invertebrado/invertebrado, puede funcionar de forma similar a o mejor que el RXR de vertebrado original o bien el RXR de invertebrado original en un sistema inducible de expresión génica

15 basado en receptores de ecdisona. Como se describe en el presente documento, el sistema inducible de expresión génica basado en receptores X retinoides quiméricos/receptores de ecdisona proporciona un sistema inducible de expresión génica en células de bacterias, hongos, levaduras, animales y mamíferos que se caracteriza por un aumento de la sensibilidad a ligando y de la magnitud de la transactivación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un sistema inducible de expresión génica basado en receptores X retinoides quiméricos/receptores de ecdisona novedoso, polinucleótidos y polipéptidos de receptores quiméricos novedosos para su uso en el sistema inducible de expresión génica novedoso y métodos de modulación de la expresión de un

25 gen en una célula huésped usando este sistema inducible de expresión génica. En particular, la invención de los solicitantes se refiere a un sistema novedoso de modulación de la expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de RXR quimérico (LBD).

Específicamente, la presente invención se refiere a un sistema de modulación de la expresión génica que comprende: a) un primer casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y b) un segundo casete de expresión génica que se puede expresar en la célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido híbrido que

35 comprende: i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico.

La presente invención también se refiere a un sistema de modulación de la expresión génica que comprende: a) un primer casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico; y b) un segundo casete de expresión génica que se puede expresar en la célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona.

45 La presente invención también se refiere a un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la invención que además comprende c) un tercer casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta al que se une el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular.

La presente invención también se refiere a un casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende, bien i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular o bien ii) un dominio de transactivación; y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico.

55 La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido híbrido que comprende, o bien i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular o bien ii) un dominio de transactivación; y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico de vertebrado e invertebrado. La presente invención también se refiere a un polipéptido híbrido aislado codificado por el polinucleótido de acuerdo con la invención.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de RXR quimérico. En una realización específica, el polinucleótido aislado codifica un LBD truncado de RXR quimérico, en el que la mutación por truncamiento afecta a la actividad de unión a ligando o a la sensibilidad a ligando del LBD de 65 RXR quimérico. En otra realización específica, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido truncado de RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento que aumenta la sensibilidad a ligando de un heterodímero

que comprende el polipéptido truncado de RXR quimérico y un compañero de dimerización. En una realización específica, el compañero de dimerización es un polipéptido de receptor de ecdisona.

La presente invención también se refiere a un polipéptido aislado codificado por un polinucleótido de acuerdo con la 5 invención de los solicitantes.

La presente invención también se refiere a un polipéptido híbrido que comprende, o bien i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular o bien ii) un dominio de transactivación; y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico.

La presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento, en el que el LBD truncado de RXR quimérico está codificado por un polinucleótido de acuerdo con la invención.

15 Por tanto, la presente invención también se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que afecta a la actividad de unión a ligando o a la sensibilidad a ligando de dicho LBD truncado de RXR quimérico.

La presente invención también se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que aumenta la sensibilidad a ligando de un heterodímero que comprende el LBD truncado de RXR quimérico y un compañero de dimerización. En una realización específica, el compañero de dimerización es un polipéptido de receptor de ecdisona.

La invención de los solicitantes también se refiere a métodos de modulación de la expresión génica en una célula

25 huésped usando un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la invención. Específicamente, la invención de los solicitantes proporciona un método de modulación de la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la invención; b) introducir en la célula huésped un casete de expresión génica que comprende i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular; y c) introducir en la célula huésped un ligando; de modo que, tras la introducción del ligando en el huésped, se modula la expresión del gen de b)iii).

La invención de los solicitantes también proporciona un método de modulación de la expresión de un gen en una

35 célula huésped que comprende un casete de expresión génica que comprende un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y un gen cuya expresión se quiere modular; en el que el método comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la invención; y b) introducir en la célula huésped un ligando; de modo que, tras la introducción del ligando en el huésped, se modula la expresión del gen.

La invención de los solicitantes también proporciona una célula huésped aislada que comprende un sistema inducible de expresión génica de acuerdo con la invención. La presente invención también se refiere a una célula huésped aislada que comprende un casete de expresión génica, un polinucleótido o un polipéptido de acuerdo con la

45 invención. En consecuencia, la invención de los solicitantes también se refiere a un organismo no humano que comprende una célula huésped de acuerdo con la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Datos de expresión de VP16LmUSP-EF, VP16MmRXRα-EF y tres clones independientes de VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP (8-12)-EF en células NIH3T3 junto con GAL4CfEcR-CDEF y pFRLuc en presencia de ligando no esteroideo (GSE).

Figura 2: Datos de expresión de VP16LmUSP-EF, VP16MmRXRα-EF y dos clones independientes de

55 VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP (8-12)-EF en células NIH3T3 junto con GAL4CfEcR-CDEF y pFRLuc en presencia de ligando no esteroideo (GSE).

Figura 3: Datos de expresión de VP16LmUSP-EF, VP16MmRXRα-EF y dos clones independientes de VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP (8-12)-EF en células A549 junto con GAL4CfEcR-CDEF y pFRLuc en presencia de ligando no esteroideo (GSE).

Figura 4: Alineaciones de secuencias de aminoácidos de los dominios EF de seis RXR de vertebrado (A) y seis RXR de invertebrado (B). B6, B8, B9, B10 y B11 indican uniones βquimera. A1 indica unión para αquimera. Las hélices 112 se indican como H1-H12 y las láminas β plegadas se indican como S1 y S2. F indica la unión del dominio F.

65 Figura 5: Datos de expresión de interruptores génicos 1.3-1.6 basados en RXR quimérico GAL4CfEcR-CDEF/VP16 en células NIH3T3 junto con pFRLuc en presencia de ligando no esteroideo (GSE).

Figura 6: Datos de expresión de interruptores génicos que comprenden los dominios DEF de EcR de CfEcR,

5 DmEcR, TmEcR o AmaEcR fusionados con el dominio de unión a ADN de GAL4 y los dominios EF de RXR/USP de CfUSP, DmUSP, LmUSP, MrnRXRα, una quimera entre MmRXRα y LmUSP (quimera), AmaRXR1 o AmaRXR2 fusionados con un dominio de activación VP16 junto con pFRLuc en células NIH3T3 en presencia de ligando esteroideo (PonA) o no esteroideo (GSE). Las diferentes construcciones de RXR/USP se compararon en asociación con GAL4CfEcR-DEF.

Figura 7: Datos de expresión de interruptores génicos que comprenden los dominios DEF de EcR de CfEcR, DmEcR, TmEcR o AmaEcR fusionados con el dominio de unión a ADN de GAL4 y los dominios EF de RXR/USP de CfUSP, DmUSP, LmUSP, MrnRXRα, una quimera entre MmRXRα y LmUSP (Quimera), AmaRXR1 o AmaRXR2 fusionados con un dominio de activación VP16 junto con pFRLuc en células NIH3T3 en presencia de ligando

15 esteroideo (PonA) o no esteroideo (GSE). Las diferentes construcciones de RXR/USP se compararon en asociación con GAL4DmEcR-DEF.

Figura 8: Datos de expresión de interruptores génicos que comprenden los dominios DEF de EcR de CfEcR, DmEcR, TmEcR o AmaEcR fusionados con el dominio de unión a ADN de GAL4 y los dominios EF de RXR/USP de CfUSP, DmUSP, LmUSP, MrnRXRα, una quimera entre MmRXRα y LmUSP (Quimera), AmaRXR1 o AmaRXR2 fusionados con un dominio de activación VP16 junto con pFRLuc en células NIH3T3 en presencia de ligando esteroideo (PonA) o no esteroideo (GSE). Las diferentes construcciones de EcR se compararon en asociación con un RXR-EF quimérico (MmRXRα-(1-7)-LmUSP(8-12)-EF).

25 Figura 9: Datos de expresión de VP16/MmRXRα-EF (αRXR), VP16/quimera entre MmRXRα-EF y LmUSP-EF (MmRXRα-(1-7)-LmUSP(8-12)-EF; aQ7), VP16/LmUSP-EF (LmUSP) y tres clones independientes de cada una de las cinco VP16/quimeras entre HsRXRβ-EF y LmUSP-EF (véase la tabla 1 para construcciones quiméricas de RXR; bRXRQ6, bRXRQ8, bRXRQ9, bRXRQ10 y bRXRQ11) se transfectaron en células NIH3T3 junto con GAL4/CfEcR-DEF y pFRLuc. Las células transfectadas se hicieron crecer en presencia de 0, 0,2, 1 y 10 μM de ligando no esteroideo (GSE). La actividad indicadora se cuantificó 48 horas después de añadir los ligandos.

Figura 10: Datos de expresión de W16/MmRXRα-EF (αRXR), VP16/quimera entre MmRXRα-EF y LmUSP-EF (MmRXRα-(1-7)-LmUSP(8-12)-EF; aQ7), VP16/LmUSP-EF (LmUSP) y tres clones independientes de cada una de las cinco VP16/quimeras entre HsRXRβ-EF y LmUSP-EF (véase la tabla 1 para construcciones quiméricas de RXR;

35 bRXRQ6, bRXRQ8, bRXRQ9, bRXRQ10 y bRXRQ11) se transfectaron en células NIH3T3 junto con GAL4/CfEcR-DEF y pFRLuc. Las células transfectadas se hicieron crecer en presencia de 0, 0,2, 1 y 10 μM de ligando esteroideo (PonA) o 0, 0,04, 0,2, 1 y 10 μM de ligando no esteroideo (GSE). La actividad indicadora se cuantificó 48 horas después de añadir los ligandos.

Figura 11: Datos de expresión de VP16/MmRXRα-EF (αRXR), VP16/quimera entre MmRXRα-EF y LmUSP-EF (MmRXRα-(1-7)-LmUSP(8-12)-EF; aQ7), VP16/LmUSP-EF (LmUSP) y tres clones independiente de cada una de las cinco VP16/quimeras entre HsRXRβ-EF y LmUSP-EF (véase la tabla 1 para construcciones quiméricas de RXR; bRXRQ6, bRXRQ8, bRXRQ9, bRXRQ10 y bRXRQ11) se transfectaron en células NIH3T3 junto con GAL4/DmEcR-DEF y pFRLuc. Las células transfectadas se hicieron crecer en presencia de 0, 0,2, 1 y 10 μM de ligando esteroideo

45 (PonA) o 0, 0,04, 0,2, 1 y 10 μM de ligando no esteroideo (GSE). La actividad indicadora se cuantificó 48 horas después de añadir los ligandos.

Figura 12: Efecto del ácido 9-cis-retinoico sobre el potencial de transactivación del interruptor génico GAL4CfEcRDEF/VP16HsRXRβ-(1-8)-LmUSP-(9-12)-EF (βquimera 9) junto con pFRLuc en células NIH 3T3 en presencia de no esteroide (GSE) y ácido 9-cis-retinoico (9Cis) durante 48 horas.

Descripción detallada de la invención

Los solicitantes han mostrado ahora que los dominios de unión a ligando de RXR quiméricos son funcionales dentro

55 de un sistema inducible de modulación de la expresión génica basado en Ec-R en células de mamífero y que estos LBD de RXR presentan sensibilidades a ligando y capacidades de transactivación ventajosas. Por tanto, la invención de los solicitantes proporciona un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso que comprende un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico. En una realización particularmente deseable, la invención de los solicitantes proporciona un sistema inducible de expresión génica que tiene un nivel reducido de expresión génica de fondo y es sensible a concentraciones submicromolares de ligando no esteroideo. Por tanto, el sistema inducible de expresión génica novedoso de los solicitantes y su uso en método de modulación de la expresión génica en una célula huésped superan las limitaciones de los sistemas inducibles de expresión génica disponibles actualmente y proporcionan al experto un medio eficaz para controlar la expresión génica.

65 La presente invención es útil para aplicaciones tales como tratamiento génico, producción de anticuerpos a gran escala, ensayos de rastreo de alto rendimiento basados en células, genómica funcional, análisis de proteómica y metabolómica y regulación de rasgos en organismos transgénicos, donde es deseable el control de los niveles de expresión génica. Una ventaja de la invención de los solicitantes es que proporciona un medio para regular la

5 expresión génica y para adaptar los niveles de expresión génica para adecuarlos a las necesidades del usuario.

Definiciones

En la presente divulgación, se usan una serie de términos/expresiones y abreviaturas. Se proporcionan las

10 definiciones siguientes y deberían ser útiles para la comprensión del alcance y la puesta en práctica de la presente invención.

En una realización específica, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro del 20 %, preferentemente dentro del 10 %, más preferentemente dentro del 5 % e incluso más preferentemente dentro del

15 1 % de un valor o intervalo dado.

La expresión "no tiene sustancialmente" significa que una composición que comprende "A" (donde "A" es una sola proteína, molécula de ADN, vector, célula huésped recombinante, etc.) no tiene, sustancialmente, "B" (donde "B" comprende una o más proteínas, moléculas de ADN, vectores, etc., contaminantes) cuando al menos alrededor del

20 75 % en peso de las proteínas, ADN, vectores (en función de la categoría de las especies a las que pertenezcan A y B) de la composición es "A". Preferentemente, "A" comprende al menos alrededor del 90 % en peso de las especies A + B de la composición, lo más preferentemente, al menos alrededor del 99 % en peso. También se prefiere que una composición que no tiene, sustancialmente, contaminación, contenga únicamente especies de un sólo peso molecular que tengan la actividad o característica de la especie de interés.

25 El término "aislado" con los fines de la presente invención designa un material biológico (ácido nucleico o proteína) que se ha sacado de su entorno original (el entorno en el que se encuentra presente de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido presente en el estado natural en un planta o un animal no está aislado, sin embargo, el mismo nucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes en los que está presente de forma natural, se considera

30 "aislado". El término "purificado" no requiere que el material esté presente en una forma que presente una pureza absoluta, que excluya la presencia de otros compuestos. Es más bien una definición relativa.

Un polinucleótido está en el estado "purificado" después de la purificación del material de partida o del material natural en al menos un orden de magnitud, preferentemente 2 o 3 y preferentemente 4 o 5 órdenes de magnitud.

35 Un "ácido nucleico" es un compuesto polimérico formado por subunidades enlazadas covalentemente denominadas nucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen ácido polirribonucleico (ARN) y ácido polidesoxirribonucleico (ADN), ambos de los cuales pueden ser monocatenarios o bicatenarios. El ADN incluye, entre otros, ADNc, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN sintético y ADN semisintético. El ADN puede ser lineal, circular o superenrollado.

40 Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica de ésteres de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN"), o cualquier análogo de fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, tanto en forma monocatenaria como en una hélice bicatenaria.

45 Pueden existir hélices bicatenarias de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico y, en particular, molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. Así, este término incluye ADN bicatenario que se encuentra, entre otros, en moléculas de ADN lineal o circular (p. ej., fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. En el análisis de la estructura de moléculas de ADN bicatenarias concretas, se pueden describir las secuencias en el

50 presente documento de acuerdo con el consenso normal de dar únicamente la secuencia en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la hebra de ADN no transcrita (es decir, la hebra que tiene una secuencia homóloga al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido manipulación biológica molecular.

Se entenderá que el término "fragmento" significa una secuencia de nucleótidos de longitud reducida con respecto al

55 ácido nucleico de referencia y que comprende, a lo largo de la porción común, una secuencia de nucleótidos idéntica al ácido nucleico de referencia. Un fragmento de ácido nucleico de este tipo de acuerdo con la invención, puede estar, si es apropiado, incluido en un polinucleótido mayor del que forma parte. Estos fragmentos comprenden, o de forma alternativa consisten en, oligonucleótidos cuya longitud varía desde al menos 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200,

60 300, 500, 720, 900, 1000 o 1500 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Como se usa en el presente documento, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o ADN que es mono o bicatenario, que contiene opcionalmente bases de nucleótido sintéticas, artificiales o modificadas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar formado por uno o más

65 segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Un "gen" se refiere a un conjunto de nucleótidos que codifican un polipéptido, e incluye ácidos nucleicos de ADNc y ADN genómico. "Gen" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína o un polipéptido específicos, incluidas las secuencias reguladoras anteriores (secuencias no codificantes en 5') y posteriores (secuencias no codificantes en 3') a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como 5 se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y/o codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de distintas fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Un gen quimérico puede comprender secuencias codificantes derivadas de fuentes diferentes y/o secuencias reguladoras derivadas de fuentes diferentes. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "exógeno" o gen "heterólogo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, sino que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia génica. Los genes exógenos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. Un

15 "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

ADN "heterólogo" se refiere a ADN ubicado de forma artificial en la célula o en un sitio cromosómico de la célula. Preferentemente, el ADN heterólogo incluye un gen exógeno a la célula.

El término "genoma" incluye ADN o ARN cromosómico, así como mitocodrial, cloroplástico y vírico.

Una molécula de ácido nucleico "se puede hibridar" con otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico se puede alinear con la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase

25 Sambrook et al., 1989 infra). Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), en particular en el capítulo 11 y la tabla 11.1 de dicho documento. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación.

Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para rastrear de fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas de organismos relacionados de forma lejana, a fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Para el rastreo preliminar de ácidos nucleicos homólogos, se pueden usar condiciones de hibridación poco rigurosas, que corresponden a una Tm de 55 º, p. ej., SSC 5x, SDS al 0,1 %, leche al 0,25 % y sin formamida; o formamida al 30 %, SSC 5x, SDS al 0,5 %).

35 La condiciones de hibridación moderadamente rigurosas corresponden a una Tm mayor, p. ej., formamida al 40 %, con SSC 5x o 6x. Las condiciones de hibridación altamente rigurosas corresponden a la mayor Tm, p. ej., formamida al 50 %, SSC 5x o 6x. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque en función de la rigurosidad de la hibridación, pueden existir apareamientos erróneos entre bases.

El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos que pueden hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. En consecuencia, la presente invención también incluye fragmentos de ácido nucleico aislado que son complementarios a las secuencias completas como se divulgan o se usan en el presente documento, así como aquellas secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares.

45 En una realización específica, el término "condiciones de hibridación estándar" se refiere a una Tm de 55 ºC, y utiliza condiciones expuestas anteriormente. En una realización preferida, la Tm es de 60 ºC; en una realización más preferida, la Tm es de 65 ºC.

Los lavados posteriores a la hibridación también determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones preferidas usa una serie de lavados que comienzan con SSC 6x, SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 15 minutos (min), repetido después con SSC 2x, SDS al 0,5 % a 45 ºC durante 30 minutos, y repetido después dos veces con SSC 0,2x, SDS al 0,5 % a 50 ºC durante 30 minutos. Un conjunto de condiciones rigurosas más preferido usa temperaturas más altas en las que los lavados son idénticos a los anteriores, excepto por la

55 temperatura de los dos lavados finales de 30 min en SSC 0,2x, SDS al 0,5 %, que se aumentó hasta 60 ºC. Otro conjunto preferido de condiciones altamente rigurosas usa dos lavados finales en SSC 0,1x, SDS al 0,1 % a 65 ºC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos comprendan secuencias complementarias, aunque en función de la rigurosidad de la hibridación, pueden existir apareamientos erróneos entre bases.

La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una Tm mayor) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de 65 longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-0.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los apareamientos erróneos adquiere más

importancia y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8).

En una realización la longitud de un ácido nucleico hibridable es de al menos 10 nucleótidos. Preferentemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de al menos alrededor de 15 nucleótidos; más preferentemente

5 de al menos alrededor de 20 nucleótidos; y lo más preferentemente la longitud es de al menos 30 nucleótidos. Además, el experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración salina de la solución de lavado se pueden ajustar según sea necesario, de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.

El término "sonda" se refiere a una molécula de ácido nucleico monocatenaria que puede aparear sus bases con un ácido nucleico objetivo monocatenario complementario para formar una molécula bicatenaria. Como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, en general de al menos 18 nucleótidos, que es hibridable con una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc, un ADN plasmídico o una moléculas de ARNm. Los oligonucleótidos pueden estar marcados, p. ej., con 32P-nucleótidos o nucleótidos a los que se ha conjugado covalentemente una marca, tal como biotina. Un oligonucleótido marcado se puede usar

15 como sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico. Los oligonucleótidos (de los que pueden estar marcados uno o ambos) se pueden usar como cebadores de PCR, para clonar un fragmento de ácido nucleico o uno de longitud completa, o para detectar la presencia de un ácido nucleico. Un oligonucleótido también se puede usar para formar una triple hélice con una molécula de ADN. En general, los oligonucleótidos se preparan sintéticamente, preferentemente en un sintetizador de ácidos nucleicos. En consecuencia, se pueden preparar oligonucleótidos con enlaces fosfoéster análogos artificiales, tales como enlaces tioéster, etc.

Un "cebador" es un oligonucleótido que hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos objetivo para crear una región de ácido nucleico bicatenario que puede servir como punto de inicio para la síntesis de ADN bajo condiciones adecuadas. Estos cebadores se pueden usar en la reacción en cadena de la polimerasa.

25 "Reacción en cadena de la polimerasa" se abrevia como PCR y significa un método in vitro para amplificar enzimáticamente secuencias de ácidos nucleicos específicas. La PCR implica una serie repetitiva de ciclos de temperatura, comprendiendo cada ciclo tres etapas: desnaturalización del ácido nucleico molde para separar las hebras de la moléculas objetivo, alineación de un cebador oligonucleotídico de PCR con el ácido nucleico molde y extensión del/de los cebador(es) mediante la polimerasa de ADN. La PCR proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula objetivo y, bajo condiciones cuantitativas o semicuantitativas, para determinar la cantidad relativa de esa molécula objetivo en el grupo de ácidos nucleicos de partida.

"La reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa" se abrevia RT-PCR y significa un método in vitro

35 para producir enzimáticamente una molécula o moléculas de ADNc objetivo a partir de una molécula o moléculas de ARN, seguido de la amplificación enzimática de una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos específicas de la molécula o moléculas de ADNc descritas anteriormente. La RT-PCR también proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula objetivo y, bajo condiciones cuantitativas o semicuantitativas, para determinar la cantidad relativa de esa molécula objetivo en el grupo de ácidos nucleicos de partida.

Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y se traduce en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. "Secuencias reguladoras adecuadas" se refiere a secuencias de nucleótidos situadas corriente arriba (secuencias no codificantes en 5'), dentro o corriente abajo (secuencias no codificantes en 3') de una secuencia codificante, y que

45 influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión a efectores y estructuras de tallolazo. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' terminal (amino) y un codón de detención de la traducción en el extremo 3' terminal (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, entre otras, secuencias procariotas, ADNc de ARNm, secuencias de ADN genómico e incluso secuencias de ADN sintéticas. Si la secuencia codificante está destinada a la expresión en una célula eucariota, habitualmente habrá una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción situadas en 3' de la secuencia codificante.

55 "Marco de lectura abierto" se abrevia ORF y significa una extensión de secuencia de ácidos nucleicos, bien de ADN, ADNc o ARN, que comprende una señal de inicio o un codón de inicio de la traducción, tal como un ATG o AUG, y un codón de terminación y se puede traducir potencialmente en una secuencia polipeptídica.

El término "cabeza-cabeza" se usa en el presente documento para describir la orientación de dos secuencias polinucleotídicas una con respecto a la otra. Dos polinucleótidos están situados en una orientación cabeza-cabeza cuando el extremo 5' de la hebra codificante de un polinucleótido está adyacente al extremo 5' de la hebra codificante del otro polinucleótido, de modo que la dirección de la transcripción de cada polinucleótido avanza alejándose del extremo 5' del otro polinucleótido. El término "cabeza-cabeza" se puede abreviar como (5')-a-(5') y también se puede indicar mediante los símbolos (+-) o (3'+5'5'-3').

65 El término "cola-cola" se usa en el presente documento para describir la orientación de dos secuencias polinucleotídicas una con respecto a la otra. Dos polinucleótidos están situados en una orientación cola-cola cuando el extremo 3' de la hebra codificante de un polinucleótido está adyacente al extremo 3' de la hebra codificante del otro polinucleótido, de modo que la dirección de la transcripción de cada polinucleótido avanza hacia el otro polinucleótido. El término "cola-cola" se puede abreviar como (3')-a-(3') y también se puede indicar mediante los

5 símbolos (-+) o (5'-3'3'+5').

El término "cabeza-cola" se usa en el presente documento para describir la orientación de dos secuencias polinucleotídicas una con respecto a la otra. Dos polinucleótidos están situados en una orientación cabeza-cola cuando el extremo 5' de la hebra codificante de un polinucleótido está adyacente al extremo 3' de la hebra codificante del otro polinucleótido, de modo que la dirección de la transcripción de cada polinucleótido avanza en la misma dirección que la del otro polinucleótido. El término "cabeza-cola" se puede abreviar como (5')-a-(3') y también se puede indicar mediante los símbolos (--) o (5'-5'5'-3').

El término "corriente abajo" se refiere a una secuencia de nucleótidos que está situada en 3' de la secuencia de

15 nucleótidos de referencia. En particular, las secuencias de nucleótidos corriente abajo se refieren, en general, a secuencias posteriores al punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, el codón de inicio de la traducción de un gen se sitúa corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción.

El término "corriente arriba" se refiere a una secuencia de nucleótidos que está situada en 5' de la secuencia de nucleótidos de referencia. En particular, las secuencias de nucleótidos corriente arriba se refieren, en general, a secuencias que se sitúan en el lado 5' de una secuencia codificante o punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, la mayor parte de los promotores se sitúan corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción.

Los términos "endonucleasa de restricción" y "enzima de restricción" se refieren a una enzima que se une y corta en 25 una secuencia de nucleótidos específica de un ADN bicatenario.

"Recombinación homóloga" se refiere a la inserción de una secuencia de ADN exógeno en otra molécula de ADN, p. ej., la inserción de un vector en un cromosoma. Preferentemente, el vector se dirige a un sitio cromosómico específico para su recombinación homóloga. Para la recombinación homóloga específica, el vector contendrá regiones de homología con las secuencias del cromosoma lo suficientemente largas como para permitir la unión complementaria y la incorporación del vector en el cromosoma. Regiones de homología más largas y grados de similitud de secuencia mayores pueden aumentar la eficacia de la recombinación homóloga.

Se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica para propagar un polinucleótido de acuerdo con la

35 invención. Una vez establecidos un sistema huésped y unas condiciones de crecimiento adecuados, se pueden propagar y preparar en cantidad vectores de expresión recombinantes. Como se describe en el presente documento, los vectores de expresión que se pueden usar, incluyen, entre otros, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levaduras; vectores bacteriófagos (p. ej., lambda) y vectores de ADN plasmídico y cosmídico, por mencionar algunos.

Un "vector" es cualquier medio para la clonación y/o la transferencia de un ácido nucleico en una célula huésped. Un vector puede ser un replicón al que se puede unir otro segmento de ADN para que se produzca la duplicación del segmento unido. Un "replicón" es cualquier elemento genético (p. ej., plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) 45 que funciona como una unidad autónoma de duplicación de ADN in vivo, es decir, que puede duplicarse bajo su propio control. El término "vector" incluye medios tanto víricos como no víricos para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Se pueden usar una gran cantidad de vectores conocidos en la técnica para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores en genes, etc. Los vectores posibles incluyen, por ejemplo, plásmidos o virus modificados incluidos, por ejemplo bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como derivados de los plásmidos PBR322 o pUC, o el vector Bluescript. Por ejemplo, la inserción de los fragmentos de ADN correspondientes a elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado se puede lograr ligando los fragmentos de ADN apropiados en un vector elegido que tenga extremos cohesivos complementarios. De forma alternativa, se pueden modificar enzimáticamente los extremos de las moléculas de ADN o se puede producir cualquier sitio ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los

55 extremos del ADN. Estos vectores se pueden genomanipular para que contengan genes marcadores seleccionables que permiten la selección de células que han incorporado el marcador en el genoma celular. Estos marcadores permiten la identificación y/o la selección de células huésped que incorporan y expresan las proteínas codificadas por el marcador.

Los vectores víricos, y en particular los vectores retrovíricos, se han usado en una amplia variedad de aplicaciones de administración de genes en células, así como en sujetos animales vivos. Los vectores víricos que se pueden usar incluyen, entre otros, vectores de retrovirus, virus adenoasociados, viruela, baculovirus, vaccinia, herpes simplex, Epstein-Barr, adenovirus, geminivirus and caulimovirus. Los vectores no víricos incluyen plásmidos, liposomas, lípidos cargados eléctricamente (citofectinas), complejos de ADN-proteína y biopolímeros. Además de un ácido 65 nucleico, un vector también puede comprender una o más regiones reguladoras y/o marcadores seleccionables útiles para seleccionar, medir y monitorizar los resultados de la transferencia de ácidos nucleicos (transferencia a

qué tejidos, duración de la expresión, etc.).

El término "plásmido" se refiere a un elemento extracromosómico que frecuentemente porta un gen que no forma parte del metabolismo central de la células, y habitualmente en forma de moléculas de ADN bicatenario circular.

5 Estos elementos pueden ser secuencias de duplicación autónoma, secuencias que forman parte del genoma, secuencias de fagos o de nucleótidos, lineales, circulares o superenrolladas de un ADN o ARN mono o bicatenario, derivado de cualquier fuente, en el que las secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una única construcción que puede introducir un fragmento promotor y la secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con la secuencia no traducida en 3' apropiada en una célula.

Un "vector de clonación" es un "replicón", que es una extensión unitaria de ácido nucleico, preferentemente ADN, que se duplica de forma secuencial y que comprenden un origen de duplicación, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de ácido nucleico para que se produzca la duplicación del segmento unido. Los vectores de clonación pueden ser capaces de replicarse en un tipo celular y expresarse en otro ("vector

15 lanzadera").

Los vectores se pueden introducir en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, p. ej., transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola génica o un transportador de vectores de ADN (véanse, p. ej., Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624; y Hartmut et al., en la solicitud de patente canadiense N.º 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

Un polinucleótido de acuerdo con la invención también se puede introducir in vivo mediante lipofección. Durante la última década, ha aumentado el uso de liposomas para la encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. 25 Los lípidos catiónicos diseñados para limitar las dificultades y riesgos encontrados con la transfección mediada por liposomas se pueden usar para preparar liposomas para transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Feigner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413; Mackey, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85: 8027-8031; y Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745-1748). El uso de lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos cargados negativamente, y también promover la fusión con membranas celulares cargadas negativamente (Feigner y Ringold, 1989, Science 337: 387-388). En las publicaciones de patente internacional WO 95/18863 y WO 96/17823 y en la patente de EE. UU. N.º 5.459.127 se describen composiciones y compuestos lipídicos especialmente útiles para la transferencia de ácidos nucleicos. El uso de lipofección para introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo presenta determinadas ventajas prácticas. La dirección molecular de liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Resulta evidente que dirigir la

35 transfección a tipos celulares concretos se preferiría especialmente en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñón y el cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas con el fin de dirigirlos (Mackey, et al., 1988, supra). Se podrían acoplar químicamente a liposomas péptidos dirigidos, p. ej., hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas.

También son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo otras moléculas, tales como un oligopéptido catiónico (p. ej., en el documento WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión a ADN (p. ej., en el documento WO 96/25508) o un polímero catiónico (p. ej., en el documento WO 95/21931).

También se puede introducir un vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo (véanse las patentes de EE. UU.

45 5.693.622, 5.589.466 y 5.580.859). También se pueden usar enfoques de administración de ADN mediada por receptor (Curiel et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147-154; y Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432).

El término "transfección" significa la incorporación de ARN o ADN exógeno o heterólogo por una célula. Una célula se ha "transfectado" con ARN o ADN exógeno o heterólogo cuando ese ARN o ADN se ha introducido en la célula. Una célula se ha "transformado" con ARN o ADN exógeno o heterólogo cuando el ARN o ADN transfectado efectúa un cambio fenotípico. El ARN o ADN transformante se puede integrar (enlazado covalentemente) en ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula.

"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de un organismo

55 huésped, dando lugar a una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contiene los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos" o "recombinantes" o "transformados".

El término "región genética" se referirá a una región de una molécula de ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos que comprende un gen que codifica un polipéptido.

Además, el vector recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención puede incluir uno o más orígenes para la duplicación en los huéspedes celulares en los que se desea su amplificación o su expresión, marcadores o marcadores seleccionables.

65 El término "marcador seleccionable" significa un factor identificador, habitualmente un gen de resistencia química o a antibiótico, que se puede seleccionar basándose en el efector del gen marcador, es decir, resistencia a un antibiótico, resistencia a un herbicida, marcadores colorimétricos, enzimas, marcadores fluorescentes y similares, en los que el efecto se usa para seguir la herencia de un ácido nucleico de interés y/o para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables conocidos en la técnica incluyen: genes que proporcionan resistencia a ampicilina, estreptomicina, gentamicina,

5 kanamicina, higromicina, herbicida bialafós, sulfonamida y similares; y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir, genes reguladores de antocianina, gen de la isopentil transferasa y similares.

El término "gen indicador" significa un ácido nucleico que codifica un factor identificador que se puede identificar basándose en el efecto del gen indicador, en el que el efecto se usa para seguir la herencia de un ácido nucleico de interés, para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés y/o para medir la inducción de la expresión o la transcripción del gen. Los ejemplos de genes indicadores conocidos y usados en la técnica incluyen: luciferasa (Luc), proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), βgalactosidasa (LacZ), β-glucuronidasa (Gus) y similares. Los genes marcadores seleccionables también se pueden considerar genes indicadores.

15 "Promotor" se refiere a una secuencia de ADN que puede controlar la expresión de una secuencia codificante o un ARN funcional. En general, una secuencia codificante se sitúa en 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo o estar formados por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que promotores diferentes pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos celulares diferentes, o en etapas diferentes del desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales o fisiológicas diferentes. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares en la mayoría de las ocasiones se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Los promotores que hacen que un gen se exprese en un tipo celular específico se denominan comúnmente "promotores específicos de célula" o "promotores

25 específicos de tejido". Los promotores que hacen que un gen se exprese en una etapa del desarrollo o la diferenciación celular específica se denominan comúnmente "promotores específicos del desarrollo" o "promotores específicos de la diferenciación celular". Los promotores que se inducen y hacen que un gen se exprese tras la exposición o el tratamiento de la célula con un agente, molécula biológica, compuesto químico, ligando, luz o similar, que induce el promotor se denominan comúnmente "promotores inducibles" o "promotores regulables". Se reconoce además que, dado que en la mayoría de los casos no se han definido totalmente los límites exactos de las secuencias reguladores, fragmentos de ADN de longitudes diferentes pueden tener una actividad promotora idéntica.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN que se puede unir a la polimerasa de ARN en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo (en dirección 3'). Para el propósito de

35 definir la presente invención, la secuencia promotora está unida en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (en dirección 5') para incluir el mínimo número de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del nivel de fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, mapeando con la nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de la polimerasa de ARN.

Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando la polimerasa de ARN transcribe la secuencia codificante en ARNm, que después sufre un ayuste de trans-ARN (si la secuencia codificante contiene intrones) y se traduce en la proteína codificada por la secuencia

45 codificante.

"Secuencias de control de la transcripción y la traducción" son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que permiten la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped. En células eucariotas, las señales de poliadenilación son secuencias de control.

El término "elemento de respuesta" significa uno o más elementos de ADN que actúan en cis que confieren sensibilidad en un promotor mediada a través de la interacción con los dominios de unión a ADN del primer gen quimérico. Este elemento de ADN puede ser de secuencia palindrómica (perfecta o imperfecta) o estar formado por motivos de secuencia o semisitios separados por un número variable de nucleótidos. Los semisitios pueden ser

55 similares o idénticos y estar dispuestos como repeticiones directas o inversas o como un solo semisitio o multímeros de semisitios adyacentes en tándem. El elemento de respuesta puede comprende un promotor mínimo aislado a partir de diferentes organismos en función de la naturaleza de la célula u organismo en el que se va a incorporar el elemento de respuesta. El dominio de unión a ADN de la primera proteína híbrida se une, en presencia o ausencia de un ligando, a la secuencia de ADN de un elemento de respuesta para iniciar o suprimir la transcripción de genes corriente abajo bajo la regulación de este elemento de respuesta. Los ejemplos de secuencias de ADN para elementos de respuesta del receptor de ecdisona natural incluyen: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (véase Cherbas L., et. al., (1991), Genes Dev. 5,120-131); AGGTCAN(n)AGGTCA, donde N(n) puede ser uno o más nucleótidos espaciadores (véase D'Avino PP., et. al., (1995), Mol. Cell. Endocrinol, 113, 1-9); y GGGTTGAATGAATTT (véase Antoniewski C., et. al., (1994), Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474).

65 La expresión "enlazado de manera funcional" se refiere a la asociación de secuencias de ácidos nucleicos en un solo fragmento de ácido nucleico, de forma que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está enlazado de manera funcional con una secuencia codificante cuando puede afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes se pueden enlazar de manera funcional a secuencias reguladoras en orientación

5 sentido o antisentido.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado a partir de un ácido nucleico o polinucleótido. Expresión también se puede referir a la traducción de ARNm en una proteína o polipéptido.

10 Los términos "casete", "casete de expresión" y "casete de expresión génica" se refieren a un segmento de ADN que se puede insertar en un ácido nucleico o polinucleótido en sitios de restricción específicos o mediante recombinación homóloga. El segmento de ADN comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, y el casete y los sitios de restricción se diseñan para garantizar la inserción del casete en el marco de lectura correcto para la

15 transcripción y la traducción. "Casete de transformación" se refiere a un vector específico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés y que tiene elementos además del polinucleótido que facilitan la transformación de una célula huésped en particular. Los casetes, casetes de expresión, casetes de expresión génica y casetes de transformación de la invención también pueden comprender elementos que permitan la expresión potenciada de un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés en una célula huésped. Estos elementos

20 puede incluir, entre otros: un promotor, un promotor mínimo, un potenciador, un elemento de respuesta, una secuencia de terminación, una secuencia de poliadenilación y similares.

Para los propósitos de la presente invención, el término "interruptor génico" se refiere a la combinación de un elemento de respuesta asociado con un promotor, y un sistema basado en EcR que, en presencia de uno o más

25 ligandos, modula la expresión de un gen en el que están incorporados el elemento de respuesta y el promotor.

Los términos "modulan" y "modula" significan inducir, reducir o inhibir la expresión de un gen o un ácido nucleico, dando lugar a la correspondiente inducción, reducción o inhibición de la producción de proteína o polipéptido.

30 Los plásmidos o vectores de acuerdo con la invención pueden comprender además al menos un promotor adecuado para dirigir la expresión de un gen en una célula huésped. El término "vector de expresión" significa un vector, plásmido o vehículo diseñado para permitir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos insertada tras la transformación en el huésped. El gen clonado, es decir, la secuencia de ácidos nucleicos insertada, se sitúa habitualmente bajo el control de elementos de control tales como un promotor, un promotor mínimo, un potenciador

35 o similares. Las regiones de control de la iniciación o promotores, que son útiles para dirigir la expresión de un ácido nucleico en la célula huésped deseada son numerosos y conocidos por los expertos en la técnica. Prácticamente cualquier promotor que pueda dirigir estos genes es adecuado para la presente invención, incluidos, entre otros: promotores víricos, promotores bacterianos, promotores animales, promotores de mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores específicos de tejido, promotores específicos del desarrollo, promotores

40 inducibles, promotores regulados por luz; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, promotores de fosfatasa alcalina (útiles para la expresión en Saccharomyces); promotor AOX1 (útil para la expresión en Pichia); β-lactamasa, promotores lac, ara, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac, y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli); promotores regulados por luz; los promotores animales y de mamíferos conocidos en la técnica incluyen, entre otros, la región del promotor temprano del SV40 (SV40e), el promotor

45 contenido en la repetición terminal larga (RTL) en 3' del virus del sarcoma de Rous (VSR), los genes de los promotores del E1A o de los promotores tardíos principales (MLP) de adenovirus (Ad), el promotor temprano del citomegalovirus (CMV), el promotor de timidina cinasa (TK) del virus herpes simplex (VHS), un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1), un promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK), un promotor de ubiquitina (Ubc), un promotor de albúmina, las secuencias reguladoras del promotor de la metalotioneína-L de ratón y regiones de control de la

50 transcripción, los promotores ubicuos (HPRT, vimentina, α-actina, tubulina y similares), los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP y similares), los promotores de genes terapéuticos (de tipo MDR, CFTR o factor VIII y similares), promotores relacionados con la patogénesis o enfermedades y promotores que presentan especificidad de tejido y que se han utilizado en animales transgénicos, tales como la región de control del gen de la elastasa I que está activa en células acinares del páncreas; la región de

55 control del gen de la insulina activa en células beta del páncreas, la región de control del gen de la inmunoglobulina activa en células linfoides, la región de control del virus de tumores mamarios en ratones activa en células de testículo, mama, linfoides y mastocitos; las regiones de control del gen de la albúmina, Apo AI y Apo AII activas en el hígado, la región de control del gen de la alfa-fetoproteína activa en el hígado, la región de control del gen de la alfa 1-antitripsina activa en el hígado, la región de control del gen de la beta-globina activa en células mieloides, la región

60 de control del gen de la proteína básica de mielina activa en oligodendrocitos del cerebro, la región de control del gen 2 de cadena ligera de la miosina activa en músculo esquelético y la región de control del gen de liberación de la hormona gonadotropina activa en el hipotálamo, el promotor de piruvato cinasa, el promotor de vilina, el promotor de la proteína intestinal de unión a ácidos grasos, el promotor de la α-actina de células de músculo liso y similares. Además, estas secuencias de expresión se pueden modificar mediante la adición de un potenciador o secuencias

65 reguladoras y similares.

Los potenciadores que se puede usar en la realizaciones de la invención incluyen, entre otros: un potenciador del SV40, un potenciador del citomegalovirus (CMV), un potenciador del factor de elongación 1 (EF1), potenciadores de levaduras, potenciadores génicos víricos y similares.

5 La regiones de control de la terminación, es decir, secuencias de terminación o poliadenilación, también pueden derivar de diversos genes nativos de los huéspedes preferidos. Opcionalmente, puede no ser necesario un sitio de terminación, aunque lo más preferido es que se incluya. En una realización preferida de la invención, la región de control de la terminación puede estar comprendida o derivar de una secuencia sintética, una señal de poliadenilación sintética, una señal de poliadenilación tardía del SV40, una señal de poliadenilación del SV40, una señal de

10 poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH), secuencias de terminación víricas o similares.

Las expresiones "secuencias no codificantes en 3'" o "región no traducida (UTR) en 3'" se refieren a secuencias de ADN situadas corriente abajo (3') de una secuencia codificante y pueden comprender secuencias de reconocimiento de poliadenilación [poly(A)] y otras secuencias que codifican señales reguladoras que pueden afectar al

15 procesamiento del ARNm o a la expresión génica. Habitualmente, la señal de poliadenilación se caracteriza por afectar a la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor del ARNm.

"Región reguladora" significa una secuencia de ácidos nucleicos que regula la expresión de una segunda secuencia de ácidos nucleicos. Una región reguladora puede incluir secuencias que son responsables de forma natural de la 20 expresión de un ácido nucleico en particular (una región homóloga) o puede incluir secuencias de un origen diferente que son responsables de la expresión de diferentes proteínas o incluso proteínas sintéticas (una región heteróloga). En particular, las secuencias pueden ser secuencias de genes procariotas, eucariotas o víricos, o secuencias derivadas que estimulan o reprimen la transcripción de un gen de manera específica o inespecífica y de manera inducible o no inducible. Las regiones reguladoras incluyen orígenes de duplicación, sitios de ayuste de ARN,

25 promotores, potenciadores, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias señal que dirigen al polipéptido hacia las rutas de secreción de la célula objetivo.

Una región reguladora de una "fuente heteróloga" es una región reguladora que no está asociada de forma natural con el ácido nucleico expresado. Entre las regiones reguladoras heterólogas se incluyen regiones reguladoras de

30 una especie distinta, regiones reguladoras de un gen diferente, secuencias reguladoras híbridas y secuencias reguladoras que no existen en la naturaleza, sino que están diseñadas por un experto en la técnica.

"Transcrito de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por la polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se 35 denomina transcrito primario o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento postranscripcional del transcrito primario y se denomina ARN maduro. "ARN mensajero (ARNm)" se refiere al ARN que no tiene intrones y que se puede traducir en una proteína por la célula. "ADNc" se refiere a un ADN bicatenario que es complementario con y deriva del ARNm. ARN "sentido" se refiere a un transcrito de ARN que incluye el ARNm y, por lo tanto, se puede traducir en una proteína por la célula. "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es

40 complementario a la totalidad o a parte de un transcrito primario o ARNm objetivo y que bloquea la expresión de un gen objetivo. La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito del gen específico, es decir, en la secuencia no codificante en 5', en la secuencia no codificante en 3' o en la secuencia codificante. "ARN funcional" se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que no se traduce pero tiene un efecto sobre los procesos celulares.

45 Un "polipéptido" es un compuesto polimérico formado por residuos de aminoácido enlazados covalentemente. Los aminoácido tienen la siguiente estructura general:

Los aminoácidos se clasifican en siete grupos en función de la cadena lateral R: (1) cadenas laterales alifáticas, (2) cadenas laterales que contienen un grupo hidroxílico (OH), (3) cadenas laterales que contienen átomos de azufre,

(4)

cadenas laterales que contienen un grupo ácido o amida, (5) cadenas laterales que contienen un grupo básico,

(6)

cadenas laterales que contienen un anillo aromático y (7) prolina, un iminoácido en el que la cadena lateral está

55 fusionado al grupo amino. Preferentemente, un polipéptido de la invención comprende al menos alrededor de 14 aminoácidos.

Una "proteína" es un polipéptido que desempeña un papel estructural o funcional en una célula viva.

Un "polipéptido aislado" o "proteína aislada" es un polipéptido o proteína que no tiene, sustancialmente, los compuestos que normalmente están asociados con él/ella en su estado natural (p. ej., otras proteínas o polipéptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos). Con "aislado" no se pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas

5 con otros compuestos, o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad biológica, y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a una purificación incompleta, la adición de estabilizantes, o la formación de compuestos en una preparación farmacéuticamente aceptable.

Se entenderá que "fragmento" de un polipéptido de acuerdo con la invención significa un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es más corta que la del polipéptido de referencia y que comprende, en la totalidad de la porción con estos polipéptidos de referencia, una secuencia de aminoácidos idéntica. Estos fragmentos pueden incluirse, cuando sea apropiado, en un polipéptido mayor del que forman parte. Estos fragmentos de un polipéptido de acuerdo con la invención pueden tener una longitud de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240 o 300 aminoácidos.

15 Una "variante" de un polipéptido o proteína es cualquier análogo, fragmento, derivado o mutante que deriva de un polipéptido o proteína y que mantiene al menos una propiedad biológica del polipéptido o la proteína. Pueden existir diferentes variantes del polipéptido o proteína en la naturaleza. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por diferencias en las secuencias de nucleótidos del gen estructural que codifica la proteína, o pueden implicar ayuste diferencial o modificación postraduccional. El experto en la técnica puede producir variantes con sustituciones, deleciones, adiciones o reemplazos de aminoácidos individuales o múltiples. Estas variantes pueden incluir, entre otras: (a) variantes en las que se sustituyen uno o más residuos de aminoácido con aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las que se añaden uno o más aminoácidos al polipéptido o proteína, (c) variantes en las que uno o más de los aminoácidos incluye un grupo sustituyente y (d)

25 variantes en las que el polipéptido o proteína se fusiona con otro polipéptido tal como seroalbúmina. Las técnicas para obtener estas variantes, que incluyen técnicas genéticas (supresiones, deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, son conocidas por los expertos en la técnica. Preferentemente, un polipéptido variante comprende al menos alrededor de 14 aminoácidos.

Una "proteína heteróloga" se refiere a una proteína que no se produce de forma natural en la célula.

Una "proteína madura" se refiere a un polipéptido procesado postraduccionalmente; es decir, uno del cual se han eliminado todos los pre- o propéptidos presentes en el producto primario de la traducción. Proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción del ARNm; es decir, con pre- y propéptidos presentes todavía. Los pre- y

35 propéptidos pueden ser, pero no se limitan a señales de localización intracelular.

El término "péptido señal" se refiere a un polipéptido amino terminal que precede a la proteína madura secretada. El péptido señal se escinde de ella y, por lo tanto, no está presenta en la proteína madura. Los péptidos señal tienen la función de dirigir y translocar proteínas secretadas a través de membranas celulares. El péptido señal también se denomina proteína señal.

Una "secuencia señal" se incluye en el comienzo de la secuencia codificante de una proteína que se va a expresar en la superficie de una célula. Esta secuencia codifica un péptido señal, en N-terminal del polipéptido maduro, que dirige a la célula huésped para translocar el polipéptido. En el presente documento se usa el término "secuencia

45 señal de translocación" para referirse a este tipo de secuencia señal. Las secuencias señal de translocación se pueden encontrar asociadas con una variedad de proteínas nativas de eucariotas y procariotas y, con frecuencia, son funcionales en ambos tipos de organismos.

El término "homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos restos de polinucleótido o dos de polipéptido. La correspondencia entre la secuencia de un resto y otro se puede determinar mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la homología se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas polipeptídicas alineando la información de secuencia y usando programas de ordenador fácilmente disponibles. De forma alternativa, la homología se puede determinar mediante la hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguida de digestión con

55 nucleasas específicas de una hebra y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.

Como se usa en el presente documento, el término "homólogo" es todas sus formas gramaticales y variantes ortográficas se refiere a la relación entre proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluidas proteínas de superfamilias (p. ej., la superfamilia de las inmunoglobulinas) y proteínas homólogas de especies diferentes (p. ej., cadena ligera de la miosina, etc.) (Reeck et al., 1987, Cell 50:667.). Estas proteínas (y sus genes codificantes) tienen homología de secuencia, como refleja su alto grado de similitud de secuencia. Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente", se puede referir a similitud de secuencia y no a un origen evolutivo común.

65 En consecuencia, el término "similitud de secuencia" en todas sus formas gramaticales se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos de proteínas que pueden compartir o no un origen evolutivo común (véase Reeck et al., 1987, Cell 50:667).

En una realización específica, dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando al menos alrededor del 50 % (preferentemente al menos alrededor del 75 % y lo más

5 preferentemente al menos alrededor del 90 o el 95 %) de los nucleótidos coindicen a lo largo de la extensión definida de las secuencias de ADN. Se pueden identificar secuencias que son sustancialmente homólogas comparando las secuencias usando programas informáticos estándar disponibles en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de bandas southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas definidas para ese sistema en particular. La definición de condiciones de hibridación apropiadas forma parte del conocimiento de la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra.

Como se usa en el presente documento, "sustancialmente similar" se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases de nucleótido dan lugar a la sustitución de uno o más aminoácidos, pero no afectan a las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. "Sustancialmente similar"

15 también se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases de nucleótido no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la modificación de la expresión génica mediante tecnología antisentido o de cosupresión. "Sustancialmente similar" también se refiere a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención tales como deleción o inserción de una o más bases de nucleótido que no afectan sustancialmente a las propiedades funcionales del transcrito resultante. Por lo tanto, se entiende que la invención engloba más que las secuencias ejemplares. Cada una de las modificaciones propuestas forma parte de los conocimientos rutinarios de la técnica, como lo está la determinación del mantenimiento de la actividad biológica de los productos codificados.

Además, el experto en la técnica reconoce que las secuencias sustancialmente similares englobadas por la presente

25 invención también se definen por su capacidad para hibridar, bajo condiciones rigurosas (SSC 0,1x, SDS al 0,1 %, 65 ºC y lavado con SSC 2x, SDS al 0,1 % seguido de SSC 0,1x, SDS al 0,1 %), con las secuencias ejemplificadas en el presente documento. Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares de la presente invención son aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son al menos un 70 % idénticas a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico de los que se informa en el presente documento. Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares preferidos de la presente invención son aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son al menos un 80 % idénticas a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico de los que se informa en el presente documento. Se prefieren más los fragmentos de ácido nucleico que son al menos un 90 % idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico de los que se informa en el presente documento. Se prefieren aún más los fragmentos de ácido nucleico que son al menos un 95 %

35 idénticos a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico de los que se informa en el presente documento.

Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más de alrededor del 40 % de los aminoácidos son idénticos, o más del 60 % son similares (funcionalmente idénticos). Preferentemente, las secuencias similares u homólogas se identifican mediante alineación usando, por ejemplo, el programa Pileup de GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versión 7, Madison, Wisconsin).

La expresión "correspondiente a" se usa en el presente documento para referirse a secuencias similares u

45 homólogas, tanto si la posición exacta es idéntica como si es diferente de la de la molécula frente a la que se mide la similitud o la homología. Una alineación de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos puede incluir espacios. Así, el término "correspondiente a" se refiere a la similitud de secuencia y no a la numeración de los residuos de aminoácidos o las bases de nucleótido.

Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos comprende lo suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar teóricamente ese polipéptido

o gen, bien mediante evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica o bien mediante comparación de secuencias automatizada por ordenador e identificación usando algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; véase también

55 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). En general, es necesaria una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos para identificar teóricamente una secuencia polipeptídica o de ácidos nucleicos como homóloga a una proteína o un gen conocido. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, se pueden usar sondas oligonucleotídicas específicas de genes que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos en métodos dependientes de secuencia de identificación (p. ej., hibridación de bandas southern) y aislamiento (p. ej., hibridación in situ de colonias bacteriana o placas de bacteriófagos) de genes. Además, se pueden usar oligonucleótidos cortos de 12-15 bases como cebadores de amplificación en PCR para obtener un fragmento de ácido nucleico en particular que comprenda los cebadores. En consecuencia, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende lo suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprenda la secuencia.

65 El término "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o entre dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada comparando las secuencias. En la

técnica, "identidad" también significa el grado de relación entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, Nueva York (1988); Biocomputing: Informatics and 5 Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., ed.) Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); y Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., ed.) Stockton Press, Nueva York (1991). Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia se diseñan para dar la mejor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas de ordenador disponibles públicamente. Las alineaciones de secuencias y los cálculos de porcentaje de identidad se pueden realizar usando el programa Megalign del paquete de aplicaciones de bioinformática de LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Se puede realizar una alineación múltiple de las secuencias usando el método Clustal de alineación (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros por defecto (PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=10). Los parámetros

15 por defecto para alineaciones por parejas usando el método Clustal se pueden seleccionar: KTUPLE 1, PENALIZACIÓN POR HUECO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5.

El término "programa informático de análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo de ordenador o programa informático que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El "programa informático de análisis de secuencias" puede estar comercialmente disponible o desarrollarse de forma independiente. Los programas informáticos de análisis de secuencias típicos incluirán, entre otros, el conjunto de programas de GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WT), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990) y DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 EE. UU.). En el contexto de la presente solicitud, se entenderá que cuando se use un programa

25 informático de análisis de secuencias para el análisis, los resultados del análisis se basarán en los "valores por defecto" del programa mencionado, a menos que se especifique lo contrario. Como se usa en el presente documento, "valores por defecto" significará cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el programa informático cuando se inicia por primera vez.

Se pueden ensamblar "genes sintéticos" a partir de bloques oligonucleotídicos de construcción que se sintetizan químicamente usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos bloques de construcción se enlazan y alinean para formar segmentos génicos que después se ensamblan enzimáticamente para construir el gen completo. "Sintetizada químicamente", en relación con una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos que la componen se ensamblaron in vitro. La síntesis química manual de ADN se puede lograr usando procedimientos bien

35 establecidos, o se puede realizar una síntesis química automatizada usando una de una serie de máquinas comercialmente disponibles. En consecuencia, se pueden adaptar los genes para una expresión génica óptima basada en la optimización de la secuencia de nucleótidos para reflejar el sesgo de los codones de la célula huésped. El experto en la técnica aprecia la probabilidad de una expresión génica satisfactoria si el uso de los codones está sesgado hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de los codones preferidos se puede basar en un estudio de genes derivados de la célula huésped donde está disponible la información de secuencia.

Sistema de modulación de la expresión génica de la invención

Los solicitantes han mostrado anteriormente que separar los dominios de transactivación y de unión a ADN

45 situándolos en dos proteínas diferentes da lugar a una actividad de fondo enormemente reducida en ausencia de un ligando y significativamente aumentada son respecto al fondo en presencia de un ligando (en la solicitud en trámite PCT/US01/09050). Este sistema de dos híbridos es un sistema inducible de modulación de la expresión génica significativamente mejorado en comparación con los dos sistemas divulgados en las solicitudes de patente internacional PCT/US97/05330 y PCT/US98/14215. El sistema de dos híbridos aprovecha la capacidad de un par de proteínas que interaccionan para llevar el dominio de activación de la transcripción a una posición más favorable con respecto al dominio de unión a ADN, de forma que cuando el dominio de unión a ADN se une al sitio de unión a ADN en el gen, el dominio de transactivación activa el promotor de forma más eficaz (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 5.283.173). Brevemente, el sistema de expresión génica de dos híbridos comprende dos casetes de expresión génica; el primero codifica un dominio de unión a ADN fusionado con un polipéptido de receptor nuclear y

55 el segundo codifica un dominio de transactivación fusionado con un polipéptido de receptor nuclear diferente. En presencia de un ligando, la interacción del primer polipéptido con el segundo polipéptido une de forma eficaz el dominio de unión de ADN al dominio de transactivación. Dado que los dominios de unión a ADN y de transactivación se encuentran en dos moléculas diferentes, la actividad de fondo en ausencia de un ligando disminuye enormemente.

El sistema de modulación de la expresión génica basado en receptores de ecdisona de dos híbridos puede ser heterodimérico u homodimérico. En general, un complejo de EcR funcional se refiere a un complejo proteico heterodimérico que consiste en dos miembros de la familia de receptores de esteroides, una proteína de receptor de ecdisona obtenida a partir de diversos insectos y una proteína ultraespiráculo (USP) o el homólogo de vertebrado de 65 la USP, la proteína de receptor X retinoide (véase Yao, et al. (1993) Nature 366,476-479; Yao, et al., (1992) Cell 71,63-72). Sin embargo, el complejo también puede ser un homodímero como se detalla a continuación. El complejo receptor de ecdiesteroides funcional también puede incluir proteína(s) adicional(es) tales como inmunofilinas. Otros miembros de la familia de proteínas de receptores de esteroides, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38 o betaFTZ-1), también puede ser compañeros dependientes de ligando o independientes para EcR, USP y/o RXR. Adicionalmente, pueden ser necesarios otros cofactores tales como proteínas conocidas de forma 5 general como coactivadores (también denominadas adaptadores o mediadores). Estas proteínas no se unen de forma específica de secuencia al ADN y no participan en la transcripción basal. Pueden ejercer su efecto sobre la activación de la transcripción a través de diversos mecanismos, incluida la estimulación de la unión al ADN de activadores, afectando a la estructura de la cromatina o mediando las interacciones activador-complejo de iniciación. Los ejemplos de coactivadores de este tipo incluyen RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP, así como el coactivador promiscuo proteína de unión B al elemento de respuesta C, CBP/p300 (para una revisión, véase Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9: 222-232, 1997). Asimismo, pueden ser necesarios cofactores proteicos conocidos de forma general como correpresores (también conocidos como represores, silenciadores o mediadores de silenciación) para inhibir de forma eficaz la activación transcripcional en ausencia de ligando. Estos correpresores pueden interaccionar con el receptor de ecdisona sin

15 ligando para silenciar la actividad en el elemento de respuesta. Las pruebas actuales indican que la unión del ligando cambia la conformación del receptor, lo que da lugar a la liberación del correpresor y al reclutamiento de los coactivadores descritos anteriormente, eliminando de este modo su actividad silenciadora. Los ejemplos de correpresores incluyen N-CoR y SMRT (para una revisión, véase Horwitz et al. Mol Endocrinol. 10: 1167-1177, 1996). Estos cofactores pueden ser endógenos, en el interior de la célula u organismo, o se pueden añadir de forma exógena como transgenes para que se expresen de manera regulada o no regulada. Los complejos homodiméricos de la proteína de receptor de ecdisona, USP o RXR también pueden ser funcionales bajo algunas circunstancias.

Normalmente, el complejo receptor de ecdisona incluye proteínas que son miembros de la superfamilia de receptores nucleares en la que, en general, todos los miembros se caracterizan por la presencia de un dominio de 25 transactivación aminoterminal, un dominio de unión a ADN ("DBD") y un dominio de unión a ligando ("LBD") separado del DBD por una región bisagra. Como se usa en el presente documento, el término "dominio de unión a ADN" comprende una secuencia polipeptídica mínima de una proteína de unión a ADN, hasta la longitud completa de una proteína de unión a ADN, siempre que el dominio de unión a ADN funcione para asociarse con un elemento de respuesta en particular. Los miembros de la superfamilia de receptores nucleares también se caracterizan por la presencia de cuatro o cinco dominios: A/B, C, D, E y, en algunos miembros, F (véanse la patente de EE. UU.

4.981.784 y Evans, Science 240:889-895 (1988)). El dominio "A/B" corresponde al dominio de transactivación, "C" corresponde al dominio de unión a ADN, "D" corresponde a la región bisagra y "E" corresponde al dominio de unión a ligando. Algunos miembros de la familia también pueden tener otro dominio de transactivación en el lado carboxiloterminal del LBD, que corresponde a "F".

35 El DBD se caracteriza por la presencia de dos dedos de cinc de cisteínas entre los que se encuentran dos motivos de aminoácidos, la caja P y la caja D, que confieren especificidad por los elementos de respuesta a ecdisona. Estos dominios pueden ser nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de proteínas de receptor heterólogas. Este receptor EcR, como un subconjunto de la familia de receptores de esteroides, también posee regiones peor definidas responsables de las propiedades de heterodimerización. Debido a que los dominios de EcR, USP y RXR son de naturaleza modular, los dominios LBD, DBD y de transactivación se pueden intercambiar.

Se conocen sistemas de interruptores génicos que incorporan componentes del complejo receptor de ecdisona. Sin embargo, en estos sistemas conocidos, siempre que se usa el EcR está asociado con dominios de unión a ADN y 45 dominios de transactivación nativos o modificados en la misma molécula. Normalmente se usan USP o RXR como compañeros silenciosos. Los solicitantes han mostrado anteriormente que cuando los dominios de unión a ADN y los dominios de transactivación están en la misma molécula, la actividad de fondo en ausencia de un ligando es alta y que esta actividad disminuye drásticamente cuando los dominios de unión a ADN y los dominios de transactivación están en moléculas diferentes, es decir, en cada uno de los dos compañeros de un complejo heterodimérico u homodimérico (véase el documento PCT/US01/09050). Este sistema de dos híbridos también proporciona una sensibilidad mejorada a ligandos no esteroideos, por ejemplo, diacilhidrazinas, en comparación con ligandos esteroideos, por ejemplo, ponasterona A ("PonA") o muristerona A ("MurA"). Es decir, en comparación con los esteroides, los ligandos no esteroideos proporcionan una actividad mayor a una concentración menor. Además, dado que la transactivación basada en interruptores génicos del EcR depende frecuentemente de la línea celular, es

55 más fácil adaptar los sistemas de interruptores para obtener la máxima capacidad de transactivación para cada aplicación. Además, el sistema de dos híbridos evita algunos efectos secundarios debidos a la sobreexpresión de RXR que ocurren con frecuencia cuando se usa RXR no modificado como compañero de interruptor. En una realización específica del sistema de dos híbridos, se eliminan el dominio de unión a ADN y los dominios de transactivación nativos de EcR o RXR y, como consecuencia, estas moléculas quiméricas tienen menos posibilidades de interaccionar con otros receptores de hormonas esteroideas presentes en la línea celular, dando lugar a una reducción de los efectos secundarios.

Los solicitantes han mostrado anteriormente que un receptor de ecdisona en asociación con una proteína ultraespiráculo (USP) de díptero (mosca de la fruta Drosophila melanogaster) o de lepidóptero (gusano de las yemas 65 de la pícea Choristoneura fumiferana) se expresa de forma constitutiva en células de mamífero, mientras que un receptor de ecdisona en asociación con un receptor X retinoide (RXR) de vertebrado es inducible en células de

mamífero (en la solicitud en trámite PCT/US01/09050). Recientemente, los solicitantes realizaron el sorprendente descubrimiento de que la proteína ultraespiráculo de Locusta migratoria ("LmUSP") y el homólogo 1 de RXR y el homólogo 2 de RXR de la garrapata ixódida Amblyomma americanum ("AmaRXR1" y "AmaRXR2", respectivamente) y sus homólogos que no son de díptero ni de lepidóptero, incluidos, entre otros: un homólogo de RXR de cangrejo

5 violinista Celuca pugilator ("CpRXR"), un homólogo de RXR de escarabajo Tenebrio molitor ("TmRXR"), un homólogo de RXR de abeja melífera Apis mellifera ("AmRXR") y un homólogo de RXR de pulgón Myzus persicae ("MpRXR"), todos los cuales se denominan conjuntamente en el presente documento RXR de invertebrado, pueden funcionar de forma similar al receptor X retinoide (RXR) de vertebrado en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona inducible en células de mamífero (en la solicitud de EE. UU. presentada junto al presente documento).

Como se describe en el presente documento, los solicitantes han descubierto ahora que un dominio de unión a ligando de RXR quimérico que comprende al menos dos fragmentos polipeptídicos, en el que el primer fragmento polipeptídico es de RXR de una especie de vertebrado/invertebrado y el segundo fragmento polipeptídico es de RXR

15 de una especie diferente de vertebrado/invertebrado, de modo que se produce un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de vertebrado/invertebrado, un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de vertebrado/vertebrado o un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de invertebrado/invertebrado, puede funcionar en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona. Sorprendentemente, el sistema inducible de expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos novedoso de los solicitantes puede funcionar de forma similar a o mejor que el sistema de expresión génica basado en EcR/RXR de vertebrado (en el documento PCT/US01/09050) y el sistema de expresión génica basado en EcR/RXR de invertebrado (en la solicitud de EE. UU. presentada junto al presente documento) en términos de sensibilidad a ligando y magnitud de inducción génica. Por tanto, la presente invención proporciona un sistema inducible de expresión génica basado en EcR para su uso en células bacterianas, fúngicas, de levaduras, de animales y de mamíferos.

25 En particular, los solicitantes describen en el presente documento un sistema de dos híbridos novedosos que comprende un dominio de unión a ligando de RXR quimérico. Este sistema de expresión génica novedoso demuestra por primera vez que un polipéptido que comprende un dominio de unión a ligando de RXR quimérico puede funcionar como componente de un sistema inducible de expresión génica basado en EcR inducible en células de levadura y de mamífero. Como se analiza en el presente documento, este descubrimiento es tanto inesperado como sorprendente.

Específicamente, la invención de los solicitantes se refiere a un sistema de modulación de la expresión génica que comprende: a) un primer casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped, en el que el

35 primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y b) un segundo casete de expresión génica que se puede expresar en la célula huésped, en el que el segundo casete de expresión génica comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico.

La presente invención también se refiere a un sistema de modulación de la expresión génica que comprende: a) un primer casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped, en el que el primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende i) un

45 dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico; y b) un segundo casete de expresión génica que se puede expresar en la célula huésped, en el que el segundo casete de expresión génica comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona.

La presente invención también se refiere a un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la presente invención que además comprende c) un tercer casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta al que se une el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular.

55 En una realización específica, el gen cuya expresión se quiere modular es un gen homólogo con respecto a la célula huésped. En otra realización específica, el gen cuya expresión se quiere modular es un gen heterólogo con respecto a la célula huésped.

Los ligandos para su uso en la presente invención como se describe a continuación, cuando se combinan con un dominio de unión a ligando de EcR y un dominio de unión a ligando de RXR quimérico, que a su vez están unidos al elemento de respuesta enlazado a un gen, proporcionan los medios para la regulación temporal externa de la expresión del gen. El mecanismo de unión o el orden en el que los diversos componentes de la presente invención se unen entre sí, es decir, por ejemplo, ligando a receptor, primer polipéptido híbrido a elemento de respuesta, 65 segundo polipéptido híbrido a promotor, etc., no es crucial. La unión del ligando al dominio de unión a ligando del EcR y al dominio de unión a ligando del RXR quimérico permite la expresión o supresión del gen. Este mecanismo no excluye el potencial de unión de ligando a EcR o RXR quimérico y la consiguiente formación de complejos homodiméricos activos (p. ej. EcR + EcR o RXR quimérico + RXR quimérico). Preferentemente, se varían uno o más de dominios del receptor, produciendo un interruptor génico híbrido. Normalmente, se pueden escoger uno o más de los tres dominios, DBD, LBD y el dominio de transactivación, de una fuente diferente de la fuente de los demás 5 dominios de forma que los genes híbridos y las proteínas híbridas resultantes se optimizan en la célula u organismo huésped escogido para la actividad de transactivación, la unión complementaria del ligando y el reconocimiento de un elemento de respuesta específico. Además, el propio elemento de respuesta se puede modificar o sustituir con elementos de respuesta para otros dominios proteicos de unión a ADN tales como la proteína GAL-4 de levadura (véase Sadowski, et al. (1988), Nature 335: 563-564) o la proteína LexA de Escherichia coli (véase Brent y Ptashne (1985), Cell 43: 729-736) o elementos de respuesta sintéticos específicos para interacciones dirigidas con proteínas diseñadas, modificadas y seleccionadas para estas interacciones específicas (véase, por ejemplo, Kim, et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 3616-3620) para adaptar los receptores híbridos. Otra ventaja de los sistemas de dos híbridos es que permiten escoger un promotor usado para dirigir la expresión génica de acuerdo con un resultado final deseado. Este doble control puede ser particularmente importante en áreas de tratamiento génico, 15 especialmente cuando se producen proteínas citotóxicas, porque se pueden controlar tanto el momento de la expresión como las células en las que se produce la expresión. Cuando se introducen genes, enlazados de manera funcional a un promotor adecuado, en las células del sujeto, la expresión de los genes exógenos se controla por la presencia del sistema de la presente invención. Los promotores se pueden regular de forma constitutiva o inducible

o pueden ser específicos de tejido (es decir, expresados sólo en un tipo de células en particular) o específicos de determinadas etapas del desarrollo del organismo.

Casetes de expresión génica de la invención

El sistema inducible de expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos novedoso de la invención comprende

25 casetes de expresión génica que se pueden expresar en una célula huésped, en los que los casetes de expresión génica comprenden cada uno un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido. Así, la invención de los solicitantes también proporciona casetes de expresión génica para su uso en el sistema de expresión génica de la invención.

Específicamente, la presente invención proporciona un casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido. En particular, la presente invención proporciona un casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende o bien i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta o bien ii) un dominio de transactivación; y un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona o un

35 dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico.

En una realización específica, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta y un dominio de unión a ligando de EcR.

En otra realización específica, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta y un dominio de unión a ligando de RXR quimérico.

En otra realización específica, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un 45 dominio de transactivación y un dominio de unión a ligando de EcR.

En otra realización específica, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión a ligando de RXR quimérico.

En una realización preferida, el dominio de unión a ligando (LBD) es un LBD de EcR, un LBD de RXR quimérico o un LBD o un LBD quimérico de un miembro de la familia de receptores nucleares de hormonas esteroideas/tiroideas relacionado, o análogo, combinación o modificación de los mismos. En una realización específica, el LBD es un LBD de EcR o un LBD de RXR quimérico. En otra realización específica, el LBD es de un LBD truncado de EcR o un LBD truncado de RXR quimérico. Una mutación por truncamiento se puede realizar mediante cualquier método usado en

55 la técnica, incluidos, entre otros, la digestión/deleción con endonucleasas de restricción, la deleción mediada por PCR/dirigida por oligonucleótidos, la mutagénesis química, la rotura de hebras de ADN y similares.

El EcR puede ser un EcR de invertebrado, preferentemente seleccionado de la clase de los artrópodos. Preferentemente, el EcR se selecciona del grupo que consiste en un EcR de lepidóptero, un EcR de díptero, un EcR de ortóptero, un EcR de homóptero y un EcR de hemíptero. Más preferentemente, el EcR para su uso es un EcR del gusano de las yemas de la pícea Choristoneura fumiferana ("CfEcR"), un EcR del escarabajo Tenebrio molitor ("TmEcR"), un EcR de Manduca sexta ("MsEcR"), a EcR de Heliothies virescens ("HvEcR"), un EcR del mosquito pequeño Chironomus tentans ("CtEcR"), un EcR de la polilla de la seda Bombyx mori ("BmEcR"), un EcR de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmEcR"), un EcR del mosquito Aedes aegypti ("AaEcR"), un EcR de la 65 moscarda Lucilia capitata ("LcEcR"), un EcR de la moscarda Lucilia cuprina ("LucEcR"), un EcR de la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata ("CcEcR"), un EcR de la langosta Locusta migratoria ("LniEcR"), un Ecr del

pulgón Myzus persicae ("MpEcR"), un EcR del cangrejo violinista Celuca pugilator ("CpEcR"), un EcR de la garrapata ixódida Amblyomma americanum ("AmaEcR"), un EcR de la mosca blanca Bamecia argentifoli ("BaEcR", SEQ ID NO: 68) o un EcR de la cigarra Nephotetix cincticeps ("NcEcR", SEQ ID NO: 69). En una realización específica, el LBD es del EcR del gusano de las yemas de la pícea (Choristoneura fumiferana) ("CfEcR") o del EcR

5 de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmEcR").

En una realización específica, el LBD de EcR comprende dominios EF de longitud completa. En una realización preferida, los dominios EF de longitud completa están codificados por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

En una realización específica, el LBD es de un LBD de EcR truncado. El truncamiento del LBD de EcR da lugar a una deleción de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235 o 240 aminoácidos. En otra realización específica, el truncamiento del LBD de EcR da lugar a una

15 deleción de al menos un dominio polipeptídico parcial. En otra realización específica, el truncamiento del LBD de EcR da lugar a una deleción de al menos un dominio polipeptídico entero. Más preferentemente, el truncamiento del polipéptido de EcR da lugar a una deleción de al menos un dominio A/B, un dominio C, un dominio D, un dominio F, unos dominios A/B/C, unos dominios A/B/1/2-C, unos dominios A/B/C/D, unos dominios A/B/C/D/F, unos dominios A/B/F, unos dominios A/B/C/F, un dominio E parcial o un dominio F parcial. También se puede realizar una combinación de varias deleciones parciales y/o totales.

En una realización, el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 2 (DmEcR-EF), SEQ ID NO: 3 (CfEcR-DE) y SEQ ID NO: 4 (DmEcR-DE).

25 En una realización preferida, el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 59 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 71 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 73 (AmaEcR-DEF).

En una realización, el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 (CfEcR-EF), SEQ ID NO: 6 (DmEcR-EF), SEQ ID NO: 7 (CfEcR-DE) y SEQ ID NO: 8 (DmEcR-DE).

35 En una realización preferida, el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 72 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 74 (AmaEcR-DEF).

Preferentemente, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende al menos dos fragmentos polipeptídicos seleccionados del grupo que consiste en un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de vertebrado, un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado y un fragmento polipeptídico de homólogo de RXR de una especie de invertebrado que no es ni díptero ni lepidóptero. Un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de acuerdo con la invención puede comprender al menos dos fragmentos polipeptídicos de RXR de especies diferentes, o cuando la especie es la misma, los dos o más fragmentos polipeptídicos pueden ser de

45 dos o más isoformas diferentes del fragmento polipeptídico de RXR de la especie.

En una realización específica, el fragmento polipeptídico de RXR de una especie de vertebrado es de un RXR de ratón Mus musculus ("MmRXR") o un RXR de ser humano Homo sapiens ("HsRXR"). El polipéptido de RXR puede ser una isoforma RXRα, RXRβ o RXRy.

En una realización preferida, el fragmento polipeptídico de RXR de una especie de vertebrado es de un dominio EF de RXR de una especie de vertebrado codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. En otra realización preferida, el fragmento polipeptídico de RXR de una

55 especie de vertebrado es de un dominio EF de RXR de una especie de vertebrado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.

En otra realización específica, el fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado es de un polipéptido de espiráculo de la langosta Locusta migratoria ("LmUSP"), un homólogo 1 de RXR de la garrapata ixódida Amblyomma americanum ("AmaRXR1"), un homólogo 2 de RXR de la garrapata ixódida Amblyomma americanum ("AmaRXR2"), un homólogo de RXR del cangrejo violinista Celuca pugilator ("CpRXR"), un homólogo de RXR del escarabajo Tenebrio molitor ("TmRXR"), un homólogo de RXR de abeja melífera Apis mellifera ("AmRXR") y un homólogo de RXR del pulgón Myzus persicae ("MpRXR").

65 En una realización preferida, el fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado es de un dominio EF de RXR de una especie de invertebrado codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26. En otra realización preferida, el fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado es de un dominio EF de RXR de una especie de invertebrado que comprende una

5 secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32.

En otra realización específica, el fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado es de un homólogo de RXR de una especie de invertebrado que no es ni díptero ni lepidóptero.

En una realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de vertebrado y un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado.

15 En otra realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de vertebrado y un fragmento polipeptídico de homólogo de RXR de una especie de invertebrado que no es ni díptero ni lepidóptero.

En otra realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado y un fragmento polipeptídico de homólogo de RXR de una especie de invertebrado que no es ni díptero ni lepidóptero.

En otra realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de vertebrado y un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de

25 vertebrado diferente.

En otra realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado y un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado diferente.

En otra realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende al menos un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado que no es ni díptero ni lepidóptero y un fragmento polipeptídico de RXR de una especie de invertebrado que no es ni díptero ni lepidóptero diferente.

35 En una realización específica, el LBD de RXR quimérico comprende un dominio LBD de RXR que comprende al menos un fragmento polipeptídico seleccionado del grupo que consiste en una hélice 1 de dominio EF, una hélice 2 de dominio EF, una hélice 3 de dominio EF, una hélice 4 de dominio EF, una hélice 5 de dominio EF, una hélice 6 de dominio EF, una hélice 7 de dominio EF, una hélice 8 de dominio EF, una hélice 9 de dominio EF, una hélice 10 de dominio EF, una hélice 11 de dominio EF, una hélice 12 de dominio EF, un dominio F y un dominio EF (lámina β plegada, en el que el fragmento polipeptídico es de RXR de especies diferentes, es decir, quimérico con respecto al dominio LBD de RXR, de las del dominio LBD de RXR.

En otra realización específica, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 1-6, las hélices 1-7, las hélices 1-8, las hélices 1-9, las hélices 1-10, las hélices 1-11 o las

45 hélices 1-12 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 7-12, las hélices 8-12, las hélices 9-12, las hélices 10-12, las hélices 11-12, la hélice 12 o el dominio F del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención, respectivamente.

En una realización preferida, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 1-6 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 7-12 del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención.

55 En otra realización preferida, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 1-7 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 8-12 del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención.

En otra realización preferida, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 1-8 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 9-12 del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención.

65 En otra realización preferida, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 1-9 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 10-12 del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención.

En otra realización preferida, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico

5 comprende las hélices 1-10 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 11-12 del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención.

En otra realización preferida, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende las hélices 1-11 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende la hélice 12 del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención.

En otra realización preferida, el primer fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico

15 comprende las hélices 1-12 del RXR de una primera especie de acuerdo con la invención, y el segundo fragmento polipeptídico del dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende un dominio F del RXR de una segunda especie de acuerdo con la invención.

En otra realización específica, el LBD de de un dominio de unión a ligando truncado de RXR quimérico. El truncamiento del LBD de RXR quimérico da lugar a una deleción de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235 o 240 aminoácidos. Preferentemente, el truncamiento del LBD de RXR quimérico da lugar a una deleción de al menos un dominio polipeptídico parcial. Más preferentemente, el truncamiento del LBD de RXR quimérico da lugar a una

25 deleción de al menos un dominio polipeptídico entero. En una realización preferida, el truncamiento del LBD de RXR quimérico da lugar a una deleción de al menos un dominio E parcial, un dominio E completo, un dominio F parcial, un dominio F completo, una hélice 1 de dominio EF, una hélice 2 de dominio EF, una hélice 3 de dominio EF, una hélice 4 de dominio EF, una hélice 5 de dominio EF, una hélice 6 de dominio EF, una hélice 7 de dominio EF, una hélice 8 de dominio EF, una hélice 9 de dominio EF, una hélice 10 de dominio EF, una hélice 11 de dominio EF, una hélice 12 de dominio EF o una lámina β plegada de dominio EF. También se puede realizar una combinación de varias deleciones parciales y/o totales.

En una realización preferida, el dominio de unión a ligando truncado de RXR quimérico está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID

35 NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38. En otra realización preferida, el dominio de unión a ligando truncado de RXR quimérico comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, o SEQ ID NO: 44.

En una realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 45, b) los nucleótidos 1-348 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 268-630 de la SEQ ID NO: 21, c) los nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, d) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21, e) los nucleótidos 1-555 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 490630 de la SEQ ID NO: 21, f) los nucleótidos 1-624 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 547-630 de la SEQ ID NO:

45 21, g) los nucleótidos 1-645 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 601-630 de la SEQ ID NO: 21 y h) los nucleótidos 1-717 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 613-630 de la SEQ ID NO: 21.

En otra realización preferida, el dominio de unión a ligando de RXR quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 46, b) los aminoácidos 1-116 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 90-210 de la SEQ ID NO: 21, c) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, d) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135210 de la SEQ ID NO: 21, e) los aminoácidos 1-185 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 164-210 de la SEQ ID NO: 21, f) los aminoácidos 1-208 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 183-210 de la SEQ ID NO: 21, g) los aminoácidos 1-215 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 201-210 de la SEQ ID NO: 21 y h) los aminoácidos 1-239

55 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 205-210 de la SEQ ID NO: 21.

Para los propósitos de la presente invención, EcR, RXR de vertebrado, RXR de invertebrado y RXR quimérico también incluyen EcR, RXR de vertebrado, RXR de invertebrado y RXR quiméricos sintéticos e híbridos y sus homólogos.

El dominio de unión a ADN puede ser cualquier dominio de unión a ADN con un elemento de respuesta conocido, incluidos dominios de unión a ADN sintéticos y quiméricos, o análogo, combinación o modificación de los mismos. Preferentemente, el DBD es un DBD de GAL4, un DBD de LexA, un DBD de un factor de transcripción, un DBD de un miembro de la superfamilia de receptores nucleares de hormonas esteroideas/tiroideas, un DBD de LacZ 65 bacteriano o un DBD de put de levadura. Más preferentemente, el DBD es un DBD de GAL4 [SEQ ID NO: 47 (polinucleótido) o SEQ ID NO: 48 (polipéptido)] o un DBD de LexA [(SEQ ID NO: 49 (polinucleótido) o SEQ ID NO:

50 (polipéptido)].

El dominio de transactivación (abreviado "AD" o "TA") puede ser cualquier AD de receptor nuclear de hormonas esteroideas/tiroideas, AD sintético o quimérico, AD de poliglutamina, AD de aminoácidos básico o ácidos, un AD de

5 VP16, un AD de GAL4, un AD de NF-kB, un AD de BP64, un dominio de activación ácido de B42 (B42AD), o un análogo, combinación o modificación de los mismos. En una realización específica, el AD es un AD sintético o quimérico o se obtiene a partir de un AD de VP16, GAL4, NF-kB o un dominio de activación ácido de B42. Preferentemente, el AD es un AD de VP16 [SEQ ID NO: 51 (polinucleótido) o SEQ ID NO: 52 (polipéptido)] o un AD de B42 [SEQ ID NO: 53 (polinucleótido) o SEQ ID NO: 54 (polipéptido)].

En una realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 47) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 49) y un dominio de unión a ligando de EcR codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos

15 nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 59 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 71 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 73 (AmaEcR-DEF).

En otra realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 48) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 50) y un dominio de unión a ligando de EcR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 72 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 74 (AmaEcR-DEF).

25 En otra realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 47) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 49) y un dominio de unión a ligando de RXR quimérico codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 45, b) los nucleótidos 1-348 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 268-630 de la SEQ ID NO: 21, c) los nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, d) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21, e) los nucleótidos 1-555 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 490-630 de la SEQ ID NO: 21, f) los nucleótidos 1-624 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 547-630 de la SEQ ID NO: 21, g) los nucleótidos 1645 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 601-630 de la SEQ ID NO: 21 y h) los nucleótidos 1-717 de la SEQ ID

35 NO: 13 y los nucleótidos 613-630 de la SEQ ID NO: 21.

En otra realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 48) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 50) y un dominio de unión a ligando de RXR quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 46, b) los aminoácidos 1-116 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 90-210 de la SEQ ID NO: 21, c) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, d) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21, e) los aminoácidos 1-185 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 164-210 de la SEQ ID NO: 21, f) los aminoácidos 1-208 de la SEQ ID NO: 13 y los

45 aminoácidos 183-210 de la SEQ ID NO: 21, g) los aminoácidos 1-215 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 201210 de la SEQ ID NO: 21, y h) los aminoácidos 1-239 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 205-210 de la SEQ ID NO: 21.

En otra realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 53 y un dominio de unión a ligando de EcR codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 59 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 71 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 73 (AmaEcR-DEF).

55 En otra realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52 o la SEQ ID NO: 54 y un dominio de unión a ligando de EcR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 72 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 74 (AmaEcR-DEF).

En otra realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 53 y un dominio de unión a ligando de RXR quimérico codificado por un 65 polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 45, b) los nucleótidos 1-348 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 268-630 de la SEQ ID NO: 21, c) los

nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, d) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21, e) los nucleótidos 1-555 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 490-630 de la SEQ ID NO: 21, f) los nucleótidos 1-624 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 547630 de la SEQ ID NO: 21, g) los nucleótidos 1-645 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 601-630 de la SEQ ID NO:

5 21 y h) los nucleótidos 1-717 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 613-630 de la SEQ ID NO: 21.

En otra realización preferida, el casete de expresión génica codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52 o la SEQ ID NO: 54 y un dominio de unión a ligando de RXR quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del 10 grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 46, b) los aminoácidos 1-116 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 90210 de la SEQ ID NO: 21, c) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, d) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21, e) los aminoácidos 1-185 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 164-210 de la SEQ ID NO: 21, f) los aminoácidos 1-208 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 183-210 de la SEQ ID NO: 21, g) los aminoácidos 1-215 de la SEQ ID NO:

15 13 y los aminoácidos 201-210 de la SEQ ID NO: 21 y h) los aminoácidos 1-239 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 205-210 de la SEQ ID NO: 21.

El elemento de respuesta ("RE") puede ser cualquier elemento de respuesta con un dominio de unión a ADN conocido, o un análogo, combinación o modificación de los mismos. En la presente invención se puede emplear un 20 único RE o varios RE, ya sean varias copias del mismo RE o dos o más RE diferentes. En una realización específica, el RE es un RE de GAL4 ("GAL4RE"), LexA, un RE de un receptor nuclear de hormonas esteroideas/tiroideas o un RE sintético que reconoce un dominio de unión a ADN sintético. Preferentemente, el RE es un GAL4RE que comprende una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 55 o un LexARE (operón "op") que comprende una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 56 (2XLexAop). Preferentemente, la primera proteína

25 híbrida no tiene, sustancialmente, un dominio de transactivación y la segunda proteína híbrida no tiene, sustancialmente, un dominio de unión a ADN. Para los propósitos de la presente invención, "no tiene, sustancialmente" significa que la proteína en cuestión no contiene una secuencia suficiente del dominio en cuestión para proporcionar una actividad de activación o unión.

30 Por tanto, la presente invención también se refiere a un casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta que comprende un dominio al que se une un polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN; ii) un promotor que se activa por un polipéptido que comprende un dominio de transactivación; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular.

35 Los genes de interés para su uso en los casetes de expresión génica de los solicitantes pueden ser genes endógenos o genes heterólogos. La información de la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos para una proteína o gen deseado se puede localizar en una de las muchas bases de datos de acceso público, por ejemplo, GENBANK, EMBL, Swiss-Prot y PIR, o en muchas publicaciones periódicas relacionadas con la biología. Así, los expertos en la técnica tienen acceso a la información de secuencia de ácidos nucleicos para prácticamente todos los

40 genes conocidos. Después, se puede usar esta información para construir las construcciones deseadas para la inserción del gen de interés en el interior de los casetes de expresión génica usados en los métodos de los solicitantes descritos en el presente documento.

Los ejemplos de genes de interés para su uso en los casetes de expresión génica de los solicitantes incluyen, entre

45 otros: genes que codifican polipéptidos terapéuticamente deseables o productos que se pueden usar para tratar una afección, una enfermedad, un trastorno, una disfunción, un defecto genético, tales como anticuerpos monoclonales, enzimas, proteasas, citocinas, interferones, insulina, eritropoyetina, factores de coagulación, otros factores o componentes sanguíneos, vectores víricos para tratamiento génico, virus para vacunas, objetivos para el descubrimiento de fármacos, genómica funcional y aplicaciones de análisis de proteómica y similares.

50 Polinucleótidos de la invención

El sistema inducible de expresión génica basado en receptores X retinoides quiméricos/receptores de ecdisona novedoso de la invención comprende un casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica

55 un polipéptido híbrido que comprende a) un dominio de unión a ADN o un dominio de transactivación y b) un dominio de unión a ligando de EcR o un dominio de unión a ligando de RXR quimérico. Estos casetes de expresión génica, los polinucleótidos que comprenden y los polipéptidos híbridos que codifican, son útiles como componentes de un sistema de expresión génica basado en EcR para modular la expresión de un gen en una célula huésped.

60 Por tanto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido híbrido que comprende a) un dominio de unión a ADN o un dominio de transactivación de acuerdo con la invención y b) un dominio de unión a ligando de EcR o un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de acuerdo con la invención.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión a ligando de 65 RXR quimérico de acuerdo con la invención.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de EcR o un LBD truncado de RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento de acuerdo con la invención. Específicamente, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión a ligando truncado de EcR o RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento que afecta a la actividad

5 de unión a ligando o a la sensibilidad a ligando que es útil en la modulación de la expresión génica en una célula huésped.

En una realización específica, el polinucleótido aislado que codifica un LBD de EcR comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 59 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 71 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 73 (AmaEcR-DEF).

En otra realización específica, el polinucleótido aislado codifica un LBD de EcR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 72 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 74 (AmaEcR-DEF).

15 En otra realización específica, el polinucleótido aislado que codifica un LBD de RXR quimérico comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 45, b) los nucleótidos 1-348 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 268-630 de la SEQ ID NO: 21, c) los nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, d) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21, e) los nucleótidos 1-555 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 490-630 de la SEQ ID NO: 21, f) los nucleótidos 1-624 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 547-630 de la SEQ ID NO: 21, g) los nucleótidos 1645 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 601-630 de la SEQ ID NO: 21 y h) los nucleótidos 1-717 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 613-630 de la SEQ ID NO: 21.

25 En otra realización específica, el polinucleótido aislado codifica un LBD de RXR quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en a) la SEQ ID NO: 46, b) los aminoácidos 1-116 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 90-210 de la SEQ ID NO: 21, c) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113210 de la SEQ ID NO: 21, d) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21, e) los aminoácidos 1-185 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 164-210 de la SEQ ID NO: 21, f) los aminoácidos 1-208 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 183-210 de la SEQ ID NO: 21, g) los aminoácidos 1-215 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 201-210 de la SEQ ID NO: 21 y h) los aminoácidos 1-239 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 205-210 de la SEQ ID NO: 21.

En particular, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de RXR

35 quimérico que comprende una mutación por truncamiento, en el que la mutación reduce la actividad de unión a ligando o la sensibilidad a ligando del LBD truncado de RXR quimérico. En una realización específica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento que reduce la actividad de unión a esteroides o la sensibilidad a esteroides del LBD truncado de RXR quimérico.

En otra realización específica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento que reduce la actividad de unión a no esteroide o la sensibilidad a no esteroide del LBD truncado de RXR quimérico.

45 La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento, en el que la mutación potencia la actividad de unión a ligando o la sensibilidad a ligando del LBD truncado de RXR quimérico. En una realización específica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento que potencia la actividad de unión a esteroides o la sensibilidad a esteroides del LBD truncado de RXR quimérico.

En otra realización específica, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de RXR quimérico que comprende una mutación por truncamiento que potencia la actividad de unión a no esteroide o la sensibilidad a no esteroide del LBD truncado de RXR quimérico.

55 La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un LBD truncado de receptor X retinoide quimérico que comprende una mutación por truncamiento que aumenta la sensibilidad a ligando de un heterodímero que comprende el LBD truncado de receptor X retinoide quimérico y un compañero de dimerización. En una realización específica, el compañero de dimerización es un polipéptido de receptor de ecdisona. Preferentemente, el compañero de dimerización es un polipéptido truncado de EcR. Más preferentemente, el compañero de dimerización es un polipéptido de EcR en el que se han eliminado los dominios A/B. Incluso más preferentemente, el compañero de dimerización es un polipéptido de EcR que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 72 (TmEcR-DEF) o SEQ ID NO: 74 (AmaEcR-DEF).

65 Polipéptidos de la invención El sistema inducible de expresión génica basado en receptores X retinoides quiméricos/receptores de ecdisona novedoso de la invención comprende un casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende a) un dominio de unión a ADN o un dominio de transactivación y b) un dominio

5 de unión a ligando de EcR o un dominio de unión a ligando de RXR quimérico. Estos casetes de expresión génica, los polinucleótidos que comprenden y los polipéptidos híbridos que codifican, son útiles como componentes de un sistema de expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos para modular la expresión de un gen en una célula huésped.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un polipéptido híbrido que comprende a) un dominio de unión a ADN o un dominio de transactivación de acuerdo con la invención y b) un dominio de unión a ligando de EcR o un dominio de unión a ligando de RXR quimérico de acuerdo con la invención.

La presente invención también se refiere a un polipéptido aislado que comprende un dominio de unión a ligando de 15 RXR quimérico de acuerdo con la invención.

La presente invención también se refiere a un LBD truncado de EcR aislado o un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento de acuerdo con la invención. Específicamente, la presente invención se refiere a un LBD truncado de EcR aislado o un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que afecta a la actividad de unión a ligando o a la sensibilidad a ligando.

En una realización específica, el polipéptido de LBD de EcR aislado está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 59 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 71 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 73

25 (AmaEcR-DEF).

En otra realización específica, el polipéptido de LBD de EcR aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 72 (TmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 74 (AmaEcR-DEF).

En otra realización específica, el LBD truncado de RXR quimérico aislado está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 45, b) los nucleótidos 1-348 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 268-630 de la SEQ ID NO: 21, c) los nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, d) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y

35 los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21, e) los nucleótidos 1-555 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 490630 de la SEQ ID NO: 21, f) los nucleótidos 1-624 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 547-630 de la SEQ ID NO: 21, g) los nucleótidos 1-645 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 601-630 de la SEQ ID NO: 21 y h) los nucleótidos 1-717 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 613-630 de la SEQ ID NO: 21.

En otra realización preferida, el LBD truncado de RXR quimérico aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la SEQ ID NO: 46, b) los aminoácidos 1-116 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 90-210 de la SEQ ID NO: 21, c) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, d) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21, e) los aminoácidos 1-185 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 164-210 de la SEQ ID NO: 21, f) los

45 aminoácidos 1-208 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 183-210 de la SEQ ID NO: 21, g) los aminoácidos 1-215 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 201-210 de la SEQ ID NO: 21 y h) los aminoácidos 1-239 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 205-210 de la SEQ ID NO: 21.

La presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que reduce la actividad de unión a ligando o la sensibilidad a ligando de dicho LBD truncado de RXR quimérico.

Por tanto, la presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que reduce la actividad de unión a ligando o la sensibilidad a ligando de dicho LBD

55 truncado de RXR quimérico.

En una realización específica, la presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que reduce la actividad de unión a esteroides o la sensibilidad a esteroides del LBD truncado de RXR quimérico.

En otra realización específica, la presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que reduce la actividad de unión a no esteroide o la sensibilidad a no esteroide del LBD truncado de RXR quimérico.

65 Además, la presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que potencia la actividad de unión a ligando o la sensibilidad a ligando del LBD truncado de RXR quimérico.

La presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que potencia la actividad de unión a ligando o la sensibilidad a ligando del LBD truncado de RXR

5 quimérico. En una realización específica, la presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que potencia la actividad de unión a esteroides o la sensibilidad a esteroides del LBD truncado de RXR quimérico.

En otra realización específica, la presente invención se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que potencia la actividad de unión a no esteroide o la sensibilidad a no esteroide del LBD truncado de RXR quimérico.

La presente invención también se refiere a un LBD truncado de RXR quimérico aislado que comprende una mutación por truncamiento que aumenta la sensibilidad de un heterodímero que comprende el LBD truncado de RXR

15 quimérico y un compañero de dimerización.

En una realización específica, el compañero de dimerización es un polipéptido de receptor de ecdisona. Preferentemente, el compañero de dimerización es un polipéptido truncado de EcR. Preferentemente, el compañero de dimerización es un polipéptido de EcR en el que se han eliminado los dominios A/B o A/B/C. Incluso más preferentemente, el compañero de dimerización es un polipéptido de EcR que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF), SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF), SEQ ID NO: 72 (TmEcR-DEF) o SEQ ID NO: 74 (AmaEcR-DEF).

Método de modulación de la expresión génica de la invención

25 La invención de los solicitantes también se refiere a métodos de modulación de la expresión génica en una célula huésped usando un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la invención. Específicamente, la invención de los solicitantes proporciona un método de modulación de la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la invención; y b) introducir en la célula huésped un ligando; en el que el gen que se quiere modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular, de modo que, tras la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen.

35 La invención también proporciona un método de modulación de la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la invención; b) introducir en la célula huésped un casete de expresión génica que comprende i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular; y c) introducir en la célula huésped un ligando; de modo que se modula la expresión del gen en la célula huésped.

Los genes de interés para su expresión en una célula huésped usando los métodos de los solicitantes pueden ser

45 genes endógenos o genes heterólogos. La información de la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos para una proteína o gen deseado se puede localizar en una de las muchas bases de datos de acceso público, por ejemplo, GENBANK, EMBL, Swiss-Prot y PIR, o en muchas publicaciones periódicas relacionadas con la biología. Así, los expertos en la técnica tienen acceso a la información de secuencia de ácidos nucleicos para prácticamente todos los genes conocidos. Después, se puede usar esta información para construir las construcciones deseadas para la inserción del gen de interés en el interior de los casetes de expresión génica usados en los métodos de los solicitantes descritos en el presente documento.

Los ejemplos de genes de interés para su uso en una célula huésped usando los métodos de los solicitantes incluyen, entre otros: genes que codifican polipéptidos terapéuticamente deseables o productos que se pueden usar

55 para tratar una afección, una enfermedad, un trastorno, una disfunción, un defecto genético, tales como anticuerpos monoclonales, enzimas, proteasas, citocinas, interferones, insulina, eritropoyetina, factores de coagulación, otros factores o componentes sanguíneos, vectores víricos para tratamiento génico, virus para vacunas, objetivos para el descubrimiento de fármacos, genómica funcional y aplicaciones de análisis de proteómica y similares.

Son ligandos aceptables todos los que modulan la expresión del gen cuando la unión del dominio de unión a ADN del sistema de dos híbridos al elemento de respuesta en presencia del ligando da lugar a la activación o supresión de la expresión de los genes. Los ligandos preferidos incluyen ponasterona, muristerona A, ácido 9-cis-retinoico, análogos sintéticos del ácido retinoico, N,N'-diacilhidrazinas tales como las divulgadas en las patentes de EE. UU. N.º 6013836, 5117057, 5530028 y 5378726; dibenzoilalquil cianohidrazinas tales como las divulgadas en la solicitud

65 europea N.º 461809; N-alquil-N,N'-diaroilhidrazinas tales como la divulgadas en la patente de EE. UU. N.º 5225443; N-acil-N-alquilcarbonilhidrazinas tales como las divulgadas en la solicitud europea N.º 234994; N-aroil-N-alquil-N'-aroilhidrazinas tales como las descritas en la patente de EE. UU. N.º 4985461; y otros materiales similares, incluidos 3,5-di-terc-butil-4-hidroxi-N-isobutil-benzamida, 8-Oacetilharpágido y similares.

En una realización preferida, el ligando para su uso en el método de los solicitantes de modulación de la expresión de un gen es un compuesto de la fórmula:

10 en la que:

E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono terciario; R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo,

15 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2;

R2

es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, CI, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, o se une

20 con R3 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

R3 es H, Et, o se une con R2 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un

25 anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, CI, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.

30 En otra realización preferida, se puede usar un segundo ligando además del primer ligando analizado anteriormente en el método de los solicitantes de modulación de la expresión de un gen, en el que el segundo ligando es ácido 9cis-retinoico o un análogo sintético del ácido retinoico.

35 La invención de los solicitantes permite la modulación de la expresión génica en células huésped procariotas y eucariotas. Por tanto, la presente invención también se refiere a un método de modulación de la expresión génica en una célula huésped seleccionada del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula animal y una célula de mamífero. Preferentemente, la célula huésped es una célula de levadura, una célula de hámster, una célula de ratón, una célula de mono o una célula de ser humano.

40 La expresión en células huésped transgénicas puede ser útil para la expresión de diversos polipéptidos de interés, incluidos, entre otros, polipéptidos terapéuticos, intermedios de rutas; para la modulación de rutas ya existentes en el huésped para la síntesis de nuevos productos que hasta ahora era imposible usando el huésped; ensayos basados en células; ensayos de genómica funcional, producción de proteínas bioterapéuticas, ensayos de proteómica y

45 similares. Adicionalmente, los productos génicos pueden ser útiles para conferir mayores rendimientos de crecimiento del huésped o para permitir que se utilice un modo de crecimiento alternativo.

Células huésped y organismos no humanos de la invención

50 Como se describe anteriormente, el sistema de modulación de la expresión génica de la presente invención se puede usar para modular la expresión génica en una célula huésped. La expresión en células huésped transgénicas puede ser útil para la expresión de diversos genes de interés. Por tanto, la invención de los solicitantes proporciona una célula huésped aislada que comprende un sistema de expresión génica de acuerdo con la invención. La presente invención también proporciona una célula huésped aislada que comprende un casete de expresión génica

55 de acuerdo con la invención. La invención de los solicitantes también proporciona una célula huésped aislada que comprende un polinucleótido o un polipéptido de acuerdo con la invención. La célula huésped aislada puede ser una célula huésped procariota o eucariota.

Preferentemente, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula animal y una célula de mamífero. Los ejemplos de células huésped preferidas incluyen, entre otras, células huésped de especies fúngicas o de levaduras tales como Aspergillus,

5 Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, o de especies bacterianas tales como las de los géneros Synechocystis, Synechococcus, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas, Methylomonas, Methylobacter, Alcaligenes, Synechocystis, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium y Klebsiella, animales y de mamífero.

En una realización específica, la célula huésped es una célula de levadura seleccionada del grupo que consiste en una célula huésped de Saccharomyces, de Pichia y de Candida.

En otra realización específica, la célula huésped es una célula de hámster.

15 En otra realización específica, la célula huésped es una célula murina.

En otra realización específica, la célula huésped es una célula de mono.

En otra realización específica, la célula huésped es una célula de ser humano.

La transformación de células huésped se conoce bien en la técnica y se puede lograr mediante una variedad de métodos, incluidos, entre otros, electroporación, infección vírica, transfección de plásmido/vector, transfección mediada por vector no vírico, bombardeo de partículas y similares. La expresión de productos génicos deseados implica cultivar las células huésped transformadas bajo condiciones adecuadas e inducir la expresión del gen

25 transformado. Las condiciones de cultivo y los protocolos de expresión génica en células procariotas y eucariotas son bien conocidos en la técnica (véanse la sección de métodos generales de los ejemplos). Se pueden recoger las células y aislar los productos génicos de acuerdo con protocolos específicos para el producto génico.

Además, se puede escoger una célula huésped que module la expresión del polinucleótido insertado o que modifique y procese el producto polipeptídico de la manera específica deseada. Las diferentes células huésped presentan características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación traduccional y postraduccional [p. ej., glucosilación, escisión (p. ej., de la secuencia señal)] de proteínas. Se pueden escoger líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína exógena expresada. Por ejemplo, se puede usar la expresión en un sistema bacteriano para producir un

35 producto de proteína del núcleo no glucosilada. Sin embargo, un polipéptido expresado en bacterias puede no plegarse correctamente. La expresión en levaduras puede producir un producto glucosilado. La expresión en células eucariotas puede aumentar la probabilidad de glucosilación y plegamiento "nativo" de una proteína heteróloga. Además, la expresión en células de mamífero puede proporcionar una herramienta para reconstituir, o constituir, la actividad del polipéptido. Además, los diferentes sistemas de expresión de vector/huésped pueden afectar a las reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolíticas, en diferente medida.

La invención de los solicitantes también se refiere a un organismo no humano que comprende una célula huésped aislada de acuerdo con la invención. Preferentemente, el organismo no humano se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, un hongo, una levadura, un animal y un mamífero. Más preferentemente, el organismo no

45 humano es una levadura, un ratón, una rata, un conejo, un gato, un perro, un bóvido, una cabra, un cerdo, un caballo, una oveja, un mono o un chimpancé.

En una realización específica, el organismo no humano es una levadura seleccionada del grupo que consiste en Saccharomyces, Pichia, y Candida.

En otra realización específica, el organismo no humano es un ratón Mus musculus.

Medida de la transcripción/expresión génica

55 Una medida útil de los métodos de la invención de los solicitantes es la del estado transcripcional de la célula, incluidas las identidades y abundancias de ARN, preferentemente de especies de ARNm. Estas medidas se llevan a cabo convenientemente midiendo las abundancias de ADNc mediante cualquiera de las diversas tecnologías de expresión génica existentes.

La tecnología de matriz de ácido nucleico es una técnica útil para determinar la expresión diferencial de ARNm. Esta tecnología incluye, por ejemplo, chips oligonucleotídicos y micromatrices de ADN. Estas técnicas se basan en fragmentos de ADN u oligonucleótidos que corresponden a diferentes genes o ADNc que están inmovilizados sobre un soporte sólido e hibridados con sondas preparadas a partir de conjuntos de ARNm extraído a partir de células, tejidos u organismos completos y convertidos en ADNc. Los chips oligonucleotídicos son matrices de 65 oligonucleótidos sintetizadas sobre un sustrato usando técnicas fotolitográficas. Se han producido chips que pueden analizar hasta 1700 genes. Las micromatrices de ADN son matrices de muestras de ADN, normalmente productos

de PCR, que se imprimen robóticamente sobre un portaobjetos de microscopio. Cada gen se analiza mediante una secuencia de ADN de longitud completa o parcial. Actualmente se preparan comercialmente de forma rutinaria micromatrices con hasta 10.000 genes. La principal diferencia entre estas dos técnicas es que, normalmente, los chips oligonucleotídicos utilizan oligonucleótidos 25-meros que permiten el fraccionamiento de moléculas de ADN

5 cortas, mientras que los objetivos de ADN mayores de las micromatrices, aproximadamente 1000 pares de bases, pueden proporcionar una mayor sensibilidad al fraccionar mezclas complejas de ADN.

Otra medida útil de los métodos de la invención de los solicitantes es la de determinar el estado traduccional de la célula midiendo las abundancias de las especies proteicas constituyentes presentes en la célula usando procesos bien conocidos en la técnica.

Cuando se desea identificar los genes asociados con diversas funciones fisiológicas, se puede emplear un ensayo en el que se midan cambios en funciones tales como el crecimiento celular, la apoptosis, la senescencia, la diferenciación, la adhesión, la unión a moléculas específicas, la unión a otra célula, la organización celular, la

15 organogénesis, el transporte intracelular, la facilitación del transporte, la conversión energética, el metabolismo, la miogénesis, la neurogénesis y/o la hematopoyesis.

Además, se puede usar la expresión de un gen indicador o un marcador seleccionable para medir la modulación de la expresión génica usando la invención de los solicitantes.

En la técnica se conocen bien otros métodos para detectar los productos de expresión génica e incluyen análisis por transferencia de bandas southern (detección de ADN), transferencia en mancha o en ranura (ADN, ARN), transferencia de bandas northern (ARN), RT-PCR (ARN), transferencia de bandas western (detección de polipéptidos) y ELISA (polipéptidos). Aunque es menos preferido, se pueden usar proteínas marcadas para detectar

25 una secuencia de ácido nucleico en particular con la que hibrida.

En algunos casos, es necesario amplificar la cantidad de una secuencia de ácido nucleico. Esto se puede llevar a cabo usando uno o más de una serie de métodos adecuados, incluidos, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"), la reacción en cadena de la ligasa ("LCR"), amplificación por desplazamiento de hebra ("SDA"), amplificación basada en la transcripción y similares. La PCR se lleva a cabo de acuerdo con técnicas conocidas en las que, por ejemplo, se trata una muestra de ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ADN termoestable, bajo condiciones de hibridación, con un par de cebadores oligonucleotídicos, hibridando un cebador con una hebra (molde) de la secuencia específica que se quiere detectar. Los cebadores son lo suficientemente complementarios con cada hebra molde de la secuencia específica como para hibridar con ellas. Se sintetiza un producto de extensión

35 de cada cebador y es complementario con la hebra molde de ácidos nucleicos con la que hibridó. El producto de extensión sintetizado a partir de cada cebador también puede servir como molde para la síntesis adicional de productos de extensión usando los mismos cebadores. Tras un número suficiente de ciclos de síntesis de productos de extensión, se puede analizar la muestra como se describe anteriormente para evaluar si la secuencia o secuencias que se quieren detectar están presentes.

La presente invención se puede comprender mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se proporcionan como ejemplares de la invención.

Ejemplos

45 Métodos generales

La técnicas estándar de ADN recombinante y de clonación molecular usadas en el presente documento son bien conocidas en la técnica y se describen por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) (Maniatis) y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc y Wiley-Interscience (1987).

55 En la técnica se conocen bien materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y el crecimiento de cultivos bacterianos. Se pueden encontrar técnicas adecuadas para su uso en los ejemplos siguientes expuestas en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis

A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, ed), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) o por Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales usados para el crecimiento y el mantenimiento de las células huésped se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GDBCO/BRL (Gaithersburg, MD) o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), a menos que se especifique lo contrario.

65 Las manipulaciones de secuencias genéticas se pueden lograr usando el conjunto de programas disponible de Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI).

Cuando se usa el programa "Pileup" de GCG, se pueden usar el valor por defecto de 12 por creación de huecos y el valor por defecto de 4 por extensión de huecos. Cuando se usa el programa "Gap" o "Bestfit" de CGC, se pueden usar la penalización por defecto de 50 por creación de huecos y la penalización por defecto de 3 por extensión de huecos. En cualquier caso, cuando no se solicitan los parámetros del programa de GCG, en estos programas o en

5 cualquier otro de GCG, se pueden usar los valores por defecto.

El significado de las abreviaturas es el siguiente: "h" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "s" significa segundo(s), "d" significa día(s), "μl" significa microlitro(s), "ml" significa mililitro(s), "l" significa litro(s), "μM" significa micromolar, "mM" significa milimolar, "μg" significa microgramo(s), "mg" significa miligramo(s), "A" significa adenina o

10 adenosina, "T" significa timina o timidina, "G" significa guanina o guanosina, "C" significa citidina o citosina, "x g" significa multiplicado por gravedad, "nt" significa nucleótido(s), "aa" significa aminoácido(s), "pb" significa par(es) de bases, "kb" significa kilobase(s), "k" significa kilo, "μ" significa micro y "ºC" significa grados Celsius.

Ejemplo 1

15 El sistema inducible de modulación de la expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos de los solicitantes es útil en diversas aplicaciones que incluyen el tratamiento génico, la expresión de proteínas de interés en células huésped, la producción de organismos transgénicos y los ensayos basados en células. Los solicitantes han realizado el sorprendente descubrimiento de que un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico puede sustituir

20 a cualquiera de los polipéptidos de RXR originales y funcionar de forma inducible en un sistema de modulación de la expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos tras la unión de ligando. Además, el polipéptido de RXR quimérico también puede funcionar mejor que cualquier dominio de unión a ligando de RXR original/donador. El sorprendente descubrimiento de los solicitantes y los mejores resultados inesperados proporcionan un sistema inducible de expresión génica novedoso para aplicaciones de células bacterianas, fúngicas, de levadura, de animal y de

25 mamífero. Este ejemplo describe la construcción de varios casetes de expresión génica para su uso en el sistema inducible de expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos de la invención.

Los solicitantes construyeron varios casetes de expresión génica basados en EcR basados en el EcR del gusano de las yemas de la pícea Choristoneura fumiferana ("CfEcR"), la proteína ultraespiráculo de C. fumiferana ("CfUSP"), el

30 EcR de Drosophila melanogaster ("DmEcR"), la USP de D. melanogaster ("DmUSP"), el EcR de Tenebrio molitor ("TmEcR"), el EcR de Amblyomma americanum ("AmaEcR"), el homólogo 1 de RXR de A. americanum ("AmaRXR1"), el homólogo 2 de RXR de A. americanum ("AmaRXR2"), la isoforma α del receptor X retinoide del ratón Mus musculus ("MmRXRα"), la isoforma β del receptor X retinoide de ser humano Homo sapiens ("HsRXRβ") y la proteína ultraespiráculo de la langosta Locusta migratoria ("LmUSP").

35 Las construcciones de receptor preparadas comprenden 1) un dominio de unión a ligando (LBD) de EcR, un LBD de RXR de vertebrado (MmRXRα o HsRXRβ), un LBD de USP de invertebrado (CfUSP o DmUSP), un LBD de RXR de invertebrado (LmUSP, AmaRXR1 o AmaRXR2) o un LBD de RXR quimérico que comprende un fragmento de LBD de RXR de vertebrado y un fragmento de LBD de RXR de invertebrado; y 2) un dominio de unión a ADN (DBD) de

40 GAL4 o LexA o un dominio de transactivación (AD) activador ácido B42 o VP16. Las construcciones indicadoras incluyen un gen indicador, luciferasa o LacZ, enlazado de forma funcional a una construcción de promotor sintético que comprende un elemento de respuesta de GAL4 o un elemento de respuesta de LexA a los que unen el DBD de Gal4 o el DBD de LexA, respectivamente. Diversas combinaciones de estas construcciones de receptor e indicadoras se cotransfectaron en células de mamífero como se describe en los ejemplos 2-6 más adelante.

45 Casetes de expresión génica: Se construyeron pares de casetes (interruptores) de expresión génica basados en receptores de ecdisona como sigue, usando métodos estándar de clonación disponibles en la técnica. A continuación figura una breve descripción de la preparación y la composición de cada interruptor usado en los ejemplos descritos en el presente documento.

1.1 GAL4CfEcR-CDEF/VP16MmRXRα-EF: Los dominios C, D, E y F del EcR del gusano de las yemas de la pícea Choristoneura fumiferana ("CfEcR-CDEF"; SEQ ID NO: 59) se fusionaron con un dominio de unión a ADN de GAL4 ("Gal4DNABD" o "Gal4DBD"; SEQ ID NO: 47) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Los dominios EF del RXRα del ratón Mus musculus ("MmRXRα-EF"; SEQ ID NO: 9) se fusionaron con el

55 dominio de transactivación de VP16 ("VP16AD"; SEQ ID NO: 51) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Cinco sitios de unión de elementos de respuesta de GAL4 ("5XGAL4RE"; que comprenden 5 copias de un GAL4RE que comprende la SEQ ID NO: 55) se fusionaron con un promotor mínimo de E1b (SEQ ID NO: 61) y se situaron corriente arriba del gen de la luciferasa (SEQ ID NO: 62).

60 1.2 Gal4CfEcR-CDEF/VP16LmUSP-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.1 anterior, excepto porque MmRXRα-EF se reemplazó con los dominios EF de la proteína ultraespiráculo de Locusta migratoria ("LmUSP-EF"; SEQ ID NO: 21).

1.3 Gal4CfEcR-CDEF/VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP(8-12)-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera 65 que el interruptor 1.1 anterior, excepto porque MmRXRα-EF se reemplazó con las hélices 1 a 7 de MmRXRα-EF y las hélices 8 a 12 de LmUSP-EF (SEQ ID NO: 45).

1.4 Gal4CfEcR-CDBF/VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP(8-12)-EF-MmRXRα-F: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.1 anterior, excepto porque MmRXRα-EF se reemplazó con las hélices 1 a 7 de

5 MmRXRα-EF y las hélices 8 a 12 de LmUSP-EF (SEQ ID NO: 45) y en la que los últimos 18 nucleótidos Cterminales de la SEQ ID NO: 45 (dominio F) se reemplazaron con el dominio F de MmRXRα ("MmRXRα-F", SEQ ID NO: 63).

1.5 Gal4CfEcR-CDEFATP16MmRXRα (1-12)-EF-LmUSP-F: Esta construcción se preparó de la misma manera que

10 el interruptor 1.1 anterior, excepto porque MmRXRα-EF se reemplazó con las hélices 1 a 12 de MmRXRα-EF (SEQ ID NO: 9) y en la que los últimos 18 nucleótidos C-terminales de la SEQ ID NO: 9 (dominio F) se reemplazaron con el dominio F de LmUSP ("LmUSP-F", SEQ ID NO: 64).

1.6 Gal4CfEcR-CDEF/VP16LmUSP(1-12)EF-MmRXRα-F: Esta construcción se preparó de la misma manera que el

15 interruptor 1.1 anterior, excepto porque MmRXRα-EF se reemplazó con las hélices 1 a 12 de LmUSP-EF (SEQ ID NO: 21) y en la que los últimos 18 nucleótidos C-terminales de la SEQ ID NO: 21 (dominio F) se reemplazaron con el dominio F de MmRXRα ("MmRXRα-F", SEQ ID NO: 63).

1.7 GAL4CfEcR-DEF/VP16CfUSP-EF: Los dominios D, E y F del EcR del gusano de las yemas de la pícea

20 Choristoneura fumiferana ("CfEcR-DEF"; SEQ ID NO: 65) se fusionaron con un dominio de unión a ADN de GAL4 ("Gal4DNABD" o "Gal4DBD"; SEQ ID NO: 47) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Los dominios EF de la USP de C. fumiferana ("CfUSP-EF"; SEQ ID NO: 66) se fusionaron con el dominio de transactivación de VP16 ("VP16AD"; SEQ ID NO: 51) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Cinco sitios de unión de elementos de respuesta de GAL4 ("5XGAL4RE"; que comprenden 5 copias de un

25 GAL4RE que comprende la SEQ ID NO: 55) se fusionaron con un promotor mínimo de E1b (SEQ ID NO: 61) y se situaron corriente arriba del gen de la luciferasa (SEQ ID NO: 62).

1.8 GAL4CfEcR-DEF/VP16DmUSP-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.7

anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF correspondientes de la USP de la mosca de 30 la fruta Drosophila melanogaster ("DmUSP-EF", SEQ ID NO: 75).

1.9 Gal4CfEcR-DEF/VP16LmUSP-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.7 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF de la USP de Locusta migratoria ("LmUSP-EF"; SEQ ID NO: 21).

1.10 GAL4CfEcR-DEF/VP16MmRXRα-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.7 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF de MmRXRα de M. musculus ("MmRXRα-EF", SEQ ID NO: 9).

40 1.11 GAL4CfEcR-DEF/VP16AmaRXR1-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.7 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF del homólogo 1 de RXR de la garrapata Amblyomma americanum ("AmaRXR1-EF", SEQ ID NO: 22).

1.12 GAL4CfEcR-DEF/VP16AmaRXR2-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.7

45 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF del homólogo 2 de RXR de la garrapata A. americanum ("AmaRXR2-EF", SEQ ID NO: 23).

1.13 Gal4CfEcR-DEF/VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP(8-12)-EF ("αquimera n.º 7"): Esta construcción se preparó de la

misma manera que el interruptor 1.1 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con las hélices 1 a 7 de 50 MmRXRα-EF y las hélices 8 a 12 de LmUSP-EF (SEQ ID NO 45).

1.14 GAL4DmEcR-DEF/VP16CfUSP-EF: Los dominios D, E y F del EcR de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmEcR-DEF"; SEQ ID NO: 67) se fusionaron con un dominio de unión a ADN de GAL4 ("Gal4DNABD" o "Gal4DBD"; SEQ ID NO: 47) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO:

55 60). Los dominios EF de la USP de C. fumiferana ("CfUSP-EF"; SEQ ID NO: 66) se fusionaron con el dominio de transactivación de VP16 ("VP16AD"; SEQ ID NO: 51) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Cinco sitios de unión de elementos de respuesta de GAL4 ("5XGAL4RE"; que comprenden 5 copias de un GAL4RE que comprende la SEQ ID NO: 55) se fusionaron con un promotor mínimo de E1b (SEQ ID NO: 61) y se situaron corriente arriba del gen de la luciferasa (SEQ ID NO: 62).

1.15 GAL4DmEcR-DEF/VP16DmUSP-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.14 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF correspondientes de la USP de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmUSP-EF", SEQ ID NO: 75).

65 1.16 Gal4DmEcR-DEF/VP16LmUSP-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.14

anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF de la USP de Locusta migratoria ("LmUSP-EF"; SEQ ID NO: 21).

1.17 GAL4DmEcR-DEF/VP16MmRXRα-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor

5 1.14 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF de MmRXRα de Mus musculus ("MmRXRα-EF", SEQ ID NO: 9).

1.18 GAL4DmEcR-DEF/VP16AmaRXR1-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor

1.14 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF del homólogo 1 de RXR de la garrapata 10 ixódida Amblyomma americanum ("AmaRXR1-EF", SEQ ID NO: 22).

1.19 GAL4DmEcR-DEF/VP16AmaRXR2-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor

1.14 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con los dominios EF del homólogo 2 de RXR de la garrapata

ixódida A. americanum ("AmaRXR2-EF", SEQ ID NO: 23). 15

1.20 Gal4DmEcR-DEF/VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP(8-12)-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.14 anterior, excepto porque CfUSP-EF se reemplazó con las hélices 1 a 7 de MmRXRα-EF y las hélices 8 a 12 de LmUSP-EF (SEQ ID NO 45).

20 1.21 GAL4TmEcR-DEF/VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP(8-12)-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.20 anterior, excepto porque DmEcR-DEF se reemplazó con los dominios D, E y F correspondientes del EcR del escarabajo Tenebrio molitor ("TmEcR-DEF", SEQ ID NO: 71), se fusionó con un dominio de unión a ADN de GAL4 ("Gal4DNABD" o "Gal4DBD"; SEQ ID NO: 47) y se situó bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Dominios EF quiméricos que comprenden las hélices 1 a 7 de MmRXRα-EF y

25 las hélices 8 a 12 de LmUSP-EF (SEQ ID NO: 45) se fusionaron con el dominio de transactivación de VP16 ("VP16AD"; SEQ ID NO: 51) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Cinco sitios de unión de elementos de respuesta de GAL4 ("5XGAL4RE"; que comprenden 5 copias de un GAL4RE que comprende la SEQ ID NO: 55) se fusionaron con un promotor mínimo de E1b (SEQ ID NO: 61) y se situaron corriente arriba del gen de la luciferasa (SEQ ID NO: 62).

1.22 Gal4AmaEcR-DEF/VP16MmRXRα (1-7)-LmUSP(8-12)-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.21 anterior, excepto porque TmEcR-DEF se reemplazó con los dominios DEF correspondientes del EcR de la garrapata Amblyomma americanum ("AmaRXR1-EF", SEQ ID NO: 73).

35 1.23 GAL4CfBcR-CDEF/VP16HsRXRβ-EF: Los dominios C, D, E y F del EcR del gusano de las yemas de la pícea Choristoneura fumiferana ("CfEcR-CDEF"; SEQ ID NO: 59) se fusionaron con un dominio de unión a ADN de GAL4 ("Gal4DNABD" o "Gal4DBD"; SEQ ID NO: 47) y se situaron bajo el control de un promotor de SV40e (SEQ ID NO: 60). Los dominios EF del RXRβ de ser humano Homo sapiens ("HsRXRβ-EF"; SEQ ID NO: 13) se fusionaron con el dominio de transactivación de VP16 ("VP16AD"; SEQ ID NO: 51) y se situaron bajo el control de un promotor de

40 SV40e (SEQ ID NO: 60). Cinco sitios de unión de elementos de respuesta de GAL4 ("5XGAL4RE"; que comprenden 5 copias de un GAL4RE que comprende la SEQ ID NO: 55) se fusionaron con un promotor mínimo de E1b (SEQ ID NO: 61) y se situaron corriente arriba del gen de la luciferasa (SEQ ID NO: 62).

1.24 GAL4CfEcR-DEF/VP16HsRXRβ-EF: Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.23

45 anterior, excepto porque CfEcR-CDEF se reemplazó con los dominios DEF de EcR de C. fumiferana ("CfEcR-DEF", SEQ ID NO: 65).

1.25 GAL4CfEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-6)-LmUSP(7-12)-EF ("βquimera n.º 6"): Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.24 anterior, excepto porque HsRXRβ-EF se reemplazó con las hélices 1 a 6 de

50 HsRXRβ-EF (nucleótidos 1-348 de la SEQ ID NO: 13) y las hélices 7 a 12 de LmUSP-EF (nucleótidos 268-630 de la SEQ ID NO: 21).

1.26 GAL4CfEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-7)-LmUSP(8-12)-EF ("βquimera n.º 8"): Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.24 anterior, excepto porque HsRXRβ-EF se reemplazó con las hélices 1 a 7 de

55 HsRXRβ-EF (nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13) y las hélices 8 a 12 de LmUSP-EF (nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21).

1.27 GAL4CfEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-8)-LmUSP(9-12)-EF ("βquimera n.º 9"): Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.24 anterior, excepto porque HsRXRβ-EF se reemplazó con las hélices 1 a 8 de

60 HsRXRβ-EF (nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13) y las hélices 9 a 12 de LmUSP-EF (nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21).

1.28 GAL4CfEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-9)-LmUSP(11-12)-EF ("βquimera n.º 10"): Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.24 anterior, excepto porque HsRXRβ-EF se reemplazó con las hélices 1 a 9 de

HsRXRβ-EF (nucleótidos 1-555 de la SEQ ID NO: 13) y las hélices 10 a 12 de LmUSP-EF (nucleótidos 490-630 de la SEQ ID NO: 21).

1.29 GAL4CfEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-10)-LmUSP(11-12)-EF ("βquimera n.º 11"): Esta construcción se preparó de

5 la misma manera que el interruptor 1.24 anterior, excepto porque HsRXRβ-EF se reemplazó con las hélices 1 a 10 de HsRXRβ-EF (nucleótidos 1-624 de la SEQ ID NO: 13) y las hélices 11 a 12 de LmUSP-EF (nucleótidos 547-630 de la SEQ ID NO: 21).

1.30 GAL4DmEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-6)-LmUSP(7-12)-EF ("βquimera n.º 6"): Esta construcción se preparó de la

10 misma manera que el interruptor 1.25 anterior, excepto porque CfEcR-DEF se reemplazó con DmEcR-DEF (SEQ ID NO: 67).

1.31 GAL4DmEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-7)-LmUSP(8-12)-EF ("βquimera n.º 8"): Esta construcción se preparó de la

misma manera que el interruptor 1.26 anterior, excepto porque CfEcR-DEF se reemplazó con DmEcR-DEF (SEQ ID 15 NO:67).

1.32 GAL4DmEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-8)-LmUSP(9-12)-EF ("βquimera n.º 9"): Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.27 anterior, excepto porque CfEcR-DEF se reemplazó con DmEcR-DEF (SEQ ID NO:67).

1.33 GAL4DmEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-9)-LmUSP(10-12)-EF ("βquimera n.º 10"): Esta construcción se preparó de la misma manera que el interruptor 1.28 anterior, CfEcR-DEF se reemplazó con DmEcR-DEF (SEQ ID NO: 67).

1.34 GAL4DmEcR-DEF/VP16HsRXRβ (1-10)-LmUSP(11-12)-EF ("βquimera n.º 11"): Esta construcción se preparó

25 de la misma manera que el interruptor 1,29 anterior, excepto porque CfEcR-DEF se reemplazó con DmEcR-DEF (SEQ ID NO: 67).

Ejemplo 2

30 Recientemente, los solicitantes han realizado el sorprendente descubrimiento de que los RXR de invertebrado y sus homólogos de RXR que no son ni de díptero ni de lepidóptero pueden funcionar de forma similar a o mejor que los RXR de vertebrado en un sistema inducible de modulación de la expresión génica basado en receptores de ecdisona en células tanto de levadura como de mamífero (en la solicitud de EE. UU. provisional con número de serie 60/294.814). De hecho, los solicitantes han demostrado que LmUSP es un compañero mejor para CfEcR que el

35 RXR de ratón en células de mamífero. Aun así, para la mayoría de las aplicaciones de sistemas de expresión génica, en particular los destinados a células de mamífero, es deseable tener un RXR de vertebrado como compañero. Para identificar una región mínima de LmUSP necesaria para esta mejora, los solicitantes han construido y analizado quimeras de RXR de vertebrado/RXR de invertebrado (denominadas indistintamente en el presente documento "RXR quiméricos" o "quimeras de RXR") en un sistema inducible de modulación de la expresión

40 génica basado en EcR. Brevemente, se estudiaron el potencial de inducción génica (magnitud de la inducción) y la especificidad y sensibilidad a ligando usando un ligando no esteroideo en una inducción dependiente de dosis de la expresión del gen indicador en las células NIH3T3 y las células A549 transfectadas.

En el primer conjunto de quimeras de RXR, las hélices 8 a 12 de MmRXRα-EF se reemplazaron con las hélices 8 a

45 12 de LmUSP-EF (interruptor 1.3 como se preparó en el ejemplo 1). Se tomaron tres clones independientes (quimeras de RXR Q n.º 1, Q n.º 2 y Q n.º 3 en las figuras 1-3) y se compararon con los interruptores originales MmRXRα-EF y LmUSP-EF (interruptores 1.1 y 1.2, respectivamente, como se prepararon en el ejemplo 1). La quimera de RXR y los ADN originales se transfectaron en células NTH3T3 de ratón junto con Gal4/CfEcR-CDEF y el plásmido indicador pFRLuc. Las células transfectadas se hicieron crecer en presencia de 0, 0,2, 1, 5 y 10 μM de

50 ligando no esteroideo N-(2-etil-3-metoxibenzoil)-N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N'-terc-butilhidrazina (ligando GS-E™). Las células se recogieron 48 horas después del tratamiento y se sometió a ensayo la actividad indicadora. Los números de la parte superior de las barras corresponden a la multiplicación máxima de la activación/inducción para ese tratamiento.

55 Transfecciones: Se transfectaron ADN correspondientes a las diversas construcciones de interruptores descritas en el ejemplo 1, específicamente los interruptores del 1.1 al 1.6, en células NIH3T3 de ratón (ATCC) y células A549 humanas (ATCC) como sigue. Las células se recogieron cuando alcanzaron el 50 % de confluencia y se plaquearon en placas de 6, 12 o 24 pocillos a 125.000, 50.000 o 25.000 células, respectivamente, en 2,5, 1,0 o 0,5 ml de medio de crecimiento que contenía suero fetal bovino al 10 % (FBS), respectivamente. Las células NIH3T3 se hicieron

60 crecer en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; LifeTechnologies) y las células A549 se hicieron crecer en mezcla de nutrientes F12K (LifeTechnologies). Al día siguiente, se aclararon las células con medio de crecimiento y se transfectaron durante cuatro horas. Se descubrió que Superfect™ (Qiagen Inc.) era el mejor reactivo de transfección para células 3T3 y para células A549. Para placas de 12 pocillos, se mezclaron 4 μl de Superfect™ con 100 μl de medio de crecimiento. Se añadieron a la mezcla de transfección 1,0 μg de la construcción indicadora y

65 0,25 μg de cada construcción de receptor del par de receptores que se quería analizar. Se añadió una segunda

construcción indicadora [pTKRL (Promega), 0,1 μg/mezcla de transfección] que comprendía un gen de luciferasa de Renilla enlazado de forma funcional y situado bajo el control de un promotor constitutivo de timidina cinasa (TK) y se usó para la normalización. Los contenidos de la mezcla de transfección se mezclaron en un mezclador de vórtex y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 min. Al final de la incubación, se añadió la mezcla de 5 transfección a las células mantenidas en 400 μl de medio de crecimiento. Las células se mantuvieron a 37 ºC y con CO2 al 5 % durante cuatro horas. Al final de la incubación, se añadieron 500 μl de medio de crecimiento que contenía FBS al 20 % y, o bien dimetilsulfóxido (DMSO; control) o una solución de DMSO de 0,2, 1, 5, 10 y 50 μM de ligando no esteroideo N-(2-etil-3-metoxibenzoil)N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N'-terc-butilhidrazina, y las células se mantuvieron a 37 ºC y con CO2 al 5 % durante 48 horas. Se recogieron las células y se sometió a ensayo la

10 actividad indicadora. Para las placas de 6 y 24 pocillos se siguió el mismo procedimiento, excepto porque todos los reactivos se duplicaron para las placas de 6 pocillos y se redujeron a la mitad para las placas de 24 pocillos.

Ligando: El ligando no esteroideo N-(2-etil-3-metoxibenzoil)-N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N'-t-butilhidrazina (ligando no esteroideo GS™-E) es un ligando ecdiesteroide sintético estable sintetizado en Rohm and Haas Company. Los

15 ligandos se disolvieron en DMSO y la concentración final de DMSO se mantuvo al 0,1 % tanto en los controles como en los tratamientos.

Ensayos indicadores: Las células se recogieron 48 horas después de añadir los ligandos. Se añadieron 125, 250 o 500 μl de tampón de lisis pasiva (parte del sistema de ensayo indicador Dual-luciferase™ de Promega Corporation) 20 a cada pocillo de placas de 24 o 12 o 6 pocillos, respectivamente. Las placas se dispusieron en un agitador rotatorio durante 15 minutos. Se sometieron a ensayo veinte μl de lisado. La actividad luciferasa se midió usando el sistema de ensayo indicador Dual-luciferase™ de Promega Corporation siguiendo las instrucciones del fabricante. La βgalactosidasa se midió usando el kit de ensayo Galacto-Star™ de TROPK siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las actividades luciferasa y β-galactosidasa se normalizaron usando la luciferasa de Renilla como estándar.

25 Se calculó la multiplicación de las actividades dividiendo las unidades lumínicas relativas ("RLU") normalizadas en células tratadas con ligando con RLU normalizadas en células tratadas con DMSO (control no tratado).

Resultados: Sorprendentemente, los tres clones independientes de las quimeras de RXR probadas (interruptor 1.3) fueron mejores que cualquiera de los interruptores basados en los originales, MmRXRα-EF (interruptor 1.1) y 30 LmUSP-EF (interruptor 1.2), véase la figura 1. En particular, el RXR quimérico demostró un aumento de la sensibilidad a ligando y un aumento de la magnitud de la inducción. Por tanto, los solicitantes han realizado el sorprendente descubrimiento de que se puede usar un dominio de unión a ligando de RXR quimérico en lugar de un RXR de vertebrado o un RXR de invertebrado en un sistema inducible de modulación de la expresión génica basado en EcR. Este sistema de expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos novedoso proporciona un sistema

35 mejorado caracterizado por un aumento tanto de la sensibilidad a ligando como de la magnitud de la inducción.

Los dos mejores clones de quimeras de RXR del interruptor 1.3 ("Q n.º 1" y "Q n.º 2" de la figura 2) se compararon con los interruptores basados en los originales 1.1 y 1.2 es un experimento repetido ("Quim-1" y "Quim-2" en la figura 2, respectivamente). En este experimento, el interruptor basado en RXR quimérico fue de nuevo más sensible

40 a ligando no esteroideo que cualquiera de los interruptores basados en los originales (véase la figura 2). Sin embargo, en este experimento, el interruptor basado en RXR quimérico fue mejor que el interruptor basado en RXR (MmRXRα-EF) de vertebrado en cuanto a la magnitud de inducción, pero fue similar al interruptor de RXR (LmUSP-EF) de invertebrado.

45 Los mismos interruptores basados en RXR quiméricos y en RXR originales también se estudiaron en un línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 (ATCC) y se observaron resultados similares (figura 3).

Por tanto, los solicitantes han demostrado por primera vez que un dominio de unión a ligando de RXR quimérico puede funcionar de forma eficaz en asociación con un receptor de ecdisona en un sistema inducible de expresión

50 génica en células de mamífero. Sorprendentemente, el sistema inducible de expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos de la presente invención es una mejora con respecto a los sistemas de modulación de la expresión génica basados tanto en EcR/RXR de vertebrado como en EcR/RXR de invertebrado, ya que se requiere menos ligando para la transactivación y se puede lograr un aumento de los niveles de transactivación.

55 Basándose en el descubrimiento de los solicitantes descrito en el presente documento, un experto en la técnica puede predecir que otro dominio de unión a ligando de RXR quimérico que comprende al menos dos fragmentos polipeptídicos de RXR de especies diferentes de un LBD de RXR de vertebrado, un LBD de RXR de invertebrado o un LBD de homólogo de RXR que no es de díptero ni de lepidóptero también funcionará en el sistema inducible de expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos de los solicitantes. Basándose en la invención de los solicitantes,

60 los medios para preparar realizaciones adicionales de LBD de RXR quiméricos dentro del alcance de la presente invención se encuentran en la técnica y no es necesaria ninguna experimentación indebida. De hecho, un experto en la técnica puede clonar y secuenciar de forma rutinaria un polinucleótido que codifica un LBD de RXR de vertebrado

o invertebrado o de un homólogo de RXR, y basándose en análisis de homología de secuencia similares a los

presentados en la figura 4, determinar el polinucleótido y los fragmentos polinucleotídicos correspondientes del LBD 65 del RXR de esa especie en particular que se engloban en el alcance de la presente invención.

Un experto en la técnica también puede predecir que el sistema inducible de expresión génica novedoso de los solicitantes también funcionará para modular la expresión génica en células de levadura. Dado que los sistemas de expresión génica basados de EcR/homólogos de RXR de díptero/y homólogos de RXR de lepidóptero funcionan de

5 forma constitutiva en células de levadura (datos no mostrados), de forma similar a como funcionan en células de mamífero, y que los RXR de invertebrado que no son dípteros ni lepidópteros funcionan de forma inducible en asociación con un EcR en células de mamífero, se predice que el sistema inducible de modulación de la expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos funciona de forma inducible en células de levadura, de forma similar a como funcionan en células de mamífero. Por tanto, el sistema inducible de expresión génica de EcR/RXR quiméricos de la presente invención es útil en aplicaciones en las que se desea la modulación de los niveles de expresión génica en células tanto de levadura como de mamífero. Además, también se contempla que la invención de los solicitantes funcione en otras células, incluidas, entre otras, células bacterianas, células fúngicas y células animales.

Ejemplo 3

15 En el extremo C-terminal del LBD hay seis aminoácidos que son diferentes entre MmRXRα y LmUSP (véanse las alineaciones de secuencia presentadas en la figura 4). Para comprobar si estos seis aminoácidos contribuyen a las diferencias observadas entre las capacidades de transactivación de MmRXRα y LmUSP, los solicitantes construyeron quimeras de RXR en las que los seis aminoácidos C-terminales, denominados en el presente documento dominio F, de un RXR original se sustituyeron por el dominio F del otro RXR original. Se construyeron interruptores génicos que comprendían LmUSP-EF fusionado con MmRXRα-F (VP16/LmUSP-EF-MmRXRα-F, interruptor 1.6), MmRXRα-EF fusionado con LmUSP-F (VP16/MmRXRαEF-LmUSP-F, interruptor 1.5) y MmRXRαEF(1-7)-LmUSP-EF(8-12) fusionado con MmRXRα-F (Quimera/RXR-F, interruptor 1.4) como se describe en el ejemplo 1. Estas construcciones se transfectaron en células NIH3T3 y se sometió a ensayo el potencial de

25 transactivación en presencia de 0, 0,2, 1 y 10 μM de ligando no esteroideo N-(2-etil-3-metoxibenzoil)N'-(3,5dimetilbenzoil)-N'-terc-butilhidrazina. Las quimeras de dominio F (interruptores 1.4-1.6) se compararon con el LBD de RXR quimérico MmRXRα-EF(1-7)-LmUSP-EF(8-12) del interruptor génico 1.3. Se usó el plásmido pFRLUC (Stratagene) que codifica un polipéptido de luciferasa como construcción de gen indicador y se usó pTKRL (Promega) que codifica un polipéptido de luciferasa de Renilla bajo el control del promotor constitutivo TK para normalizar las transfecciones como se describe anteriormente. Se recogieron las células, se lisaron y se midió la actividad indicadora luciferasa en los lisados celulares. Se presentan las unidades lumínicas relativas de luciferasa de mosca totales. El número de la parte superior de cada barra es la multiplicación máxima de la inducción para ese tratamiento. El análisis se realizó por triplicado y se determinaron los recuentos medios de luciferasa [unidades lumínicas relativas (RLU) totales] como se describe anteriormente.

35 Como se muestra en la figura 5, los seis aminoácidos del extremo C-terminal del LBD (dominio F) no parecen contribuir a las diferencias observadas entre las capacidades de transactivación de RXR de vertebrado y RXR de invertebrado, lo que indica que lo más probable es que las hélices 8-12 del dominio EF sean responsables de estas diferencias entre RXR de vertebrado e invertebrado.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la construcción de cuatro interruptores génicos basados en EcR-DEF que comprenden los dominio DEF de Choristoneura fumiferana (lepidóptero), Drosophila melanogaster (díptero), Tenebrio molitor

45 (coleóptero) y Amblyomma americanum (ixódido) fusionados a un dominio de unión a ADN de GAL4. Además, los dominios EF de RXR de vertebrado, RXR de invertebrado o USP de invertebrado de USP de Choristoneura fumiferana, USP de Drosophila melanogaster, USP de Locusta migratoria (ortóptero), RXRα de Mus musculus (vertebrado), una quimera entre MmRXRα y LmUSP (Quimera; del interruptor 1.13), homólogo 1 de RXR de Amblyomma americanum (ixódido), homólogo 2 de RXR de Amblyomma americanum (ixódido) se fusionaron con un dominio de activación VP16. Las combinaciones de receptores se compararon en cuanto a su capacidad para transactivar el plásmido indicador pFRLuc en células NIH3T3 de ratón en presencia de 0, 0,2, 1 o 10 μM de ligando esteroideo PonA (Sigma Chemical Company) o 0, 0,04, 0,2, 1 o 10 μM de ligando no esteroideo N-(2-etil-3metoxibenzoil)N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N'-terc-butilhidrazina como se describe anteriormente. Se recogieron las células, se lisaron y se midió la actividad indicadora luciferasa en los lisados celulares. Se presentan las unidades

55 lumínicas relativas de luciferasa de mosca totales. El número de la parte superior de cada barra es la multiplicación máxima de la inducción para ese tratamiento. El análisis se realizó por triplicado y se determinaron los recuentos medios de luciferasa [unidades lumínicas relativas (RLU) totales] como se describe anteriormente.

Las figuras 6-8 muestran los resultados de estos análisis. La quimera de MmRXR-LmUSP fue el mejor compañero para CfEcR (inducción de 11.000 veces, figura 6), DmEcR (inducción de 1759 veces, figura 7). Para todos los demás EcR probados, la quimera de RXR produjo mayores niveles de fondo en ausencia de ligando (véase la figura 8). El interruptor basado en CfEcR/RXR quimérico (interruptor 1.13) fue más sensible a no esteroide que a PonA, mientras que el interruptor basado en DmEcR/RXR quimérico (interruptor 1.20) fue más sensible a PonA que a no esteroide. Dado que estos dos formatos de interruptor producen niveles de inducción decentes y muestran sensibilidad

65 diferencial a esteroides y no esteroides, se pueden aprovechar para aplicaciones en las que se desean interruptores

de dos o más genes.

Excepto por CfEcR, todos los demás EcR probados en asociación con el RXR quimérico son más sensibles a esteroides que a no esteroides. El interruptor basado en TmEcR/RXR quimérico (interruptor 1.21; figura 8) es más 5 sensible a PonA y menos sensible a no esteroide y funciona mejor asociado con MmRXRα, AmaRXR1 o AmaRXR2. El interruptor basado en AmaEcR/RXR quimérico (interruptor 1.22; figura 8) también es más sensible a PonA y menos sensible a no esteroide y funciona mejor asociado con un casete de expresión génica basado en LmUSP, MmRXR, AmaRXR1 o AmaRXR2. Por tanto, parece que los interruptores génicos basado en TmEcR/ y AmaEcR/RXR quimérico forman un grupo de receptores de ecdisona que es diferente del grupo de interruptores

10 génicos basados en EcR de lepidóptero y díptero/RXR quimérico (CfEcR/RXR quimérico y DmEcR/RXR quimérico, respectivamente). Como se indica anteriormente, las diferentes sensibilidades a ligando de los interruptores génicos basados en EcR/RXR quiméricos de los solicitantes son ventajosos para su uso en aplicaciones en las que se desean interruptores de dos o más genes.

15 Ejemplo 5

Este ejemplo describe el análisis adicional de los solicitantes de casetes de expresión génica que codifican diversos polipéptidos de RXR quiméricos que comprenden un fragmento polipeptídico de isoforma RXRα de ratón o un fragmento polipeptídico de isoforma RXRβ humana y un fragmento polipeptídico de LmUSP en células NIH3T3 de 20 ratón. Estas quimeras de RXR se construyeron en un esfuerzo para identificar la hélice o hélices del dominio EF que contribuyen a las diferencias de transactivación observadas entre RXR de vertebrado e invertebrado. Brevemente, se construyeron cinco casetes de expresión génica diferentes que codifican un dominio de unión a ligando de RXR quimérico como se describe en el ejemplo 1. Los cinco dominios de unión a ligando de RXR quimérico codificados por estos casetes de expresión génica y los correspondientes fragmentos de RXR de vertebrado y de RXR de

25 invertebrado que comprenden se representan en la tabla 1.

Tabla 1 RXR quiméricos de dominio EF de HsRXRβ/LmUSP

Nombre de la quimera

Fragmento(s) polipeptídico(s) de HsRXRβ-EF Fragmento(s) polipeptídico(s) de LmUSP-EF

β Quimera n.º 6

Hélices 1-6 Hélices 7-12

β Quimera n.º 8

Hélices 1-7 Hélices 8-12

β Quimera n.º 9

Hélices 1-8 Hélices 9-12

β Quimera n.º 10

Hélices 1-9 Hélices 10-12

β Quimera n.º 11

Hélices 1-10 Hélices 11-12

Se transfectaron tres clones individuales de cada LBD de RXR quimérico de la tabla 1 en células NIH3T3 de ratón

30 junto con GAL4CfEcR-DEF (interruptores 1.25-1.29 del ejemplo 1; figuras 9 y 10) o GAL4DmEcR-DEF (interruptores 1.30-1.34 del ejemplo 1; figura 11) y el plásmido indicador pFRLuc como se describe anteriormente. Las células transfectadas se cultivaron en presencia de a) 0, 0,2,1 o 10 μM de ligando no esteroideo (figura 9) o b) 0, 0,2, 1 o 10 μM de ligando esteroide PonA o 0, 0,4, 0,2, 1 o 10 μM de ligando no esteroide (figuras 10 y 11) durante 48 horas. Se midió la actividad del gen indicador y se muestran la RLU totales. El número de la parte superior de cada barra es la

35 multiplicación máxima de la inducción para ese tratamiento y es la media de tres repeticiones.

Como se muestra en la figura 9, los mejores resultados se obtuvieron cuando se usó un dominio de unión a ligando de RXR quimérico HsRXRβH1-8 y LmUSP H9-12 (del interruptor 1.27), lo que indica que la hélice 9 de LmUSP puede ser responsable de la sensibilidad y la magnitud de la inducción.

40 Usando CfEcR como compañero, la quimera 9 demostró la inducción máxima (véase la figura 10). Las quimeras 6 y 8 también produjeron una buena inducción y menor fondo, como consecuencia la multiplicación de la inducción fue mayor para estar dos quimeras en comparación con la quimera 9. Las quimeras 10 y 11 produjeron niveles menores de actividad indicadora.

45 Usando DmEcR como compañero, la quimera 8 produjo la actividad indicadora (véase la figura 11). La quimera 9 también tuvo un buen rendimiento, mientras que las quimeras 6, 10 y 11 demostraron niveles menores de actividad indicadora.

50 La selección de un dominio de unión a ligando de RXR quimérico en particular también puede influir en el rendimiento del EcR en respuesta a un ligando en particular. Específicamente, CfEcR en combinación con la quimera 11 respondió bien a no esteroide, pero no a PonA (véase la figura 10). Por el contrario, DmEcR en combinación con la quimera 11 respondió bien a PonA, pero no a no esteroide (véase la figura 11).

55 Ejemplo 6 Este ejemplo demuestra el efecto de la introducción de un segundo ligando en la célula huésped que comprende un sistema inducible de modulación de la expresión génica basado en EcR/RXR quiméricos de la invención. En particular, los solicitantes han determinado el efecto del ácido 9-cis-retinoico sobre el potencial de transactivación del

5 interruptor génico GAL4CfEcR-DEF/VP16HsRXRβ-(1-8)-LmUSP-(9-12)-EF (βquimera 9; interruptor 1.27) junto con pFRLuc en células NIH 3T3 en presencia de no esteroide (GSE) durante 48 horas.

Brevemente, se transfectaron GAL4CfEcR-DEF, pFRLuc y VP16HsRXRβ-(1-8)-LmUSP-(9-12)-EF (quimera n.º 9) en células NIH3T3 y las células transfectadas se trataron con 0, 0,04, 0,2, 1, 5 y 25 μM de ligando no esteroideo (GSE) 10 y 0, 1, 5 y 25 μM de ácido 9-cis-retinoico (Sigma Chemical Company). La actividad indicadora se midió 48 horas después de añadir los ligandos.

Como se muestra en la figura 12, la presencia de ácido retinoico aumentó la sensibilidad del CfEcR-DEF a ligando no esteroideo. A una concentración de ligando no esteroideo de 0,04 μM, hay muy poca inducción en ausencia de 15 ácido 9-cis-retinoico, pero cuando se añade ácido 9-cis-retinoico 1 μM además del no esteroide 0,04 μM, la inducción aumenta enormemente.

Listado de secuencias

20 <110> Rohm and Haas Company Palli, Subba R. Kapitskaya, Marianna Z.

<120> Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso

<130> A01238 30

<150> Documento US 60/294.819

<151> 2001-05:31 35 <160> 75

<170> Patentln versión 3,1

<210> 1 40

<211> 735

<212> ADN 45 <213> Choristoneura fumiferana

<400> 1

<210> 2 5 <211> 1338

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 2

<210> 3 5 <211> 960

<212> ADN

<213> Choristoneura fumiferana

<400> 3

<211> 969 20 <212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 4

<210> 5 5 <211> 244

<212> PRT

<213> Choristoneura fumiferana

<400> 5

<210> 6

<211> 445

<212> PRT 10 <213> Drosophila melanogaster

<400> 6

<210> 7 5 <211> 320

<212> PRT

<213> Choristoneura fumiferana

<400> 7

<210> 8 5 <211> 323

<212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

<400> 8

<210> 9

<211> 714

<212> ADN

<213> Mus musculus 10 <400> 9

<210> 10

<211> 720

<212>

ADN 20 <213> Mus musculus

<400> 10

<210> 11

<211> 705

<212>

ADN 10 <213> Mus musculus

<400> 11

<211> 850 20 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 720

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14 5 <211> 705

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

<211> 237 20 <212> PRT

<213> Mus musculus

<210> 16

<211> 239

<212> PRT 10 <213> Mus musculus

<400> 16

<210> 17

<211> 234

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20 <212> ADN

<213> Locusta migratoria

<400> 21

<210> 22 5 <211> 687

<212> ADN

<213> Amblyomma americanum

<400> 22

15 <210> 23

<211> 693

<212> ADN

<213> Amblyomma americanum

<400> 23

<212> ADN

<213> Celuca pugilator

<400> 24

15 <210> 25

<211> 690

<212> ADN

<213> Tenebrio molitor

<400> 25

<210> 26

<211> 681

<212> ADN

<213>

Apis mellifera 15 <400> 26

<210> 27

<211> 210

<212> PRT

<213> Locusta migratoria

<210> 28

<211> 228

<212> PRT

<213>

Amblyomma americanum 10 <400> 28

5 <211> 230

<212> PRT

<213> Amblyomma americanum

<400> 29

<210> 30

<211> 266

<212>

PRT 10 <213> Celuca pugilator

<400> 30

<210> 31

<211> 229

<212>

PRT 10 <213> Tenebrio molitor

<400> 31

<210> 32

<211> 226

<212>

PRT 10 <213> Apis mellifera

<400> 32

<210> 33

<211> 516

<212> ADN

<213> Locusta migratoria

<400> 33

<210> 34

<211> 528

<212> ADN

<213> Amblyomma americanum 20 <400> 34

<210> 35

<211> 531

<212> ADN 30 <213> Amblyomma americanum

<400> 35

<211> 552 10 <212> ADN

<213> Celuca pugilator

20 <210> 37

<211> 531

<212> ADN

<213> Tenebrio molitor

<400> 37

<210> 38 5 <211> 531

<212> ADN

<213> Apis mellifera

<400> 38

15 <210> 39

<211> 176

<212> PRT

<213> Locusta migratoria

<400> 39

<210> 40 5 <211> 175

<212> PRT

<213> Amblyomma americanum

<400> 40

<210> 41 5 <211> 176

<212> PRT

<213> Amblyomma americanum

<400> 41

<210> 42 5 <211> 183

<212> PRT

<213> Celuca pugilator

<400> 42

5 <210> 43

<211> 176

<212> PRT

<213> Tenebrio molitor

<400> 43

5 <210> 44

<211> 176

<212> PRT

<213> Apis mellifera

<400> 44

5 <210> 45

<211> 711

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Dominio de unión a ligando de RXR quimérico

<400> 45

<210> 46 5 <211> 236

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio de unión a ligando de RXR quimérico 15 <400> 46

<210> 47 5 <211> 441

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 47

<210> 48

<211> 147

<212> PRT 10 <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 48

<211> 606

<212> ADN

<213> Escherichia coli 10 <400> 49

<210> 50

<211> 202

<212> PRT 20 <213> Escherichia coli

<400> 50

5 <210> 51

<211> 271

<212> ADN

<213> Virus herpes simplex 7

<400> 51

<210> 52

<211> 90

<212> PRT 10 <213> Virus herpes simplex 7

<400> 52

<210> 53

<211> 307

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae 25 <400> 53

<210> 54 5 <211> 102

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 54

<210> 55

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25 <220>

<223> Elemento de respuesta de GAL4

<400> 55

<210> 56

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Elemento de respuesta de 2xLexAop

<400> 56

<210> 57

<211> 334

<212> PRT

<213> Choristoneura fumiferana

<400> 57

<210> 58

<211> 549

<212> PRT

<213> Drosophila melanogaster

<210> 59

<211> 1288

<212>

ADN 10 <213> Choristoneura fumiferana

<400> 59

<210> 60

<211> 309

<212>

ADN 10 <213> Virus de simio 40

<400> 60

<211> 24 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> promotor mínimo E1b sintético

<400> 61

<210> 62

<211> 1653

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> gen de luciferasa

<400> 62

<211> 18

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 63

<210> 64

<211> 18

<212> ADN

<213> Locusta migratoria

<400> 64

<210> 65

<211> 1054

<212> ADN

<213> Choristoneura fumiferana

<400> 65

<211> 798

<212> ADN

<213> Choristoneura fumiferana 10 <400> 66

15 <210> 67

<211> 1650

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 67

<210> 68

<211> 1586

<212> ADN

<213> Bamecia argentifoli

<400> 68

<210> 69

<211> 1109

<212> ADN

<213> Nephotetix cincticeps 10 <400> 69

<211> 401 20 <212> PRT

<213> Choristoneura fumiferana

<400> 70

<210> 71

<211> 894

<212> ADN

<213> Tenebrio molitor

<400> 71

<210> 72

<211> 298

<212> PRT 15 <213> Tenebrio molitor

<400> 72

<210> 73

<211> 948

<212> ADN

<213> Amblyomma americanum

<210> 74 15 <211> 316

<212> PRT

<213> Amblyomma americanum

<400> 74

<210> 75 5 <211> 825

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 75

Claims (60)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un sistema de modulación de la expresión génica que comprende:

   a) un primer casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:

   i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y

   ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y

   b) un segundo casete de expresión génica que se puede expresar en la célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:

   i) un dominio de transactivación; y

   ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico que comprende, o bien (A) las hélices 1-7 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un RXR de invertebrado, o bien (B) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un RXR de invertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero.
2. 2. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un casete de expresión que comprende:

   i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;

   ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y

   iii) un gen cuya expresión se quiere modular.

3. 3.

   El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando (LBD) del receptor de ecdisona del polipéptido híbrido es un LBD de EcR de gusano de las yemas de la pícea Choristoneura fumiferana ("CfEcR") o un LBD de EcR de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmEcR").

4. 4.

   El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 59 (CfEcR-CDEF) y SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF).

5. 5.

   El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF).

6. 6.

   El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico del segundo polipéptido híbrido está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en

   a) Los nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, y

   b) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21.
7. 7. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico del segundo polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

   a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, y

   b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21.

8. 8.

   El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer casete de expresión génica comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el primer polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN GAL4 y un dominio de unión a ADN LexA, y un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona.

9. 9.

   El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica el segundo polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación seleccionado del grupo que consiste en un dominio de transactivación VP16 y un dominio de transactivación activador ácido B42, y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico.

10. 10.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica el segundo polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en un AD de VP16 (SEQ ID NO: 51) y un AD de B42 (SEQ ID NO: 53) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los nucleótidos 1-408 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los nucleótidos 1-465 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21.
11. 11. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica el segundo polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un AD de VP16 (SEQ ID NO: 52) y un AD de B42 (SEQ ID NO: 54) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21.
12. 12. Un sistema de modulación de la expresión génica que comprende:

    a) un primer casete de expresión génica que se puede expresar en una célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se

    quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico que comprende (A) las hélices 1-7 de un receptor

    X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un RXR de invertebrado, o bien (B) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un RXR de invertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero; y b) un segundo casete de expresión génica que se puede expresar en la célula huésped que comprende una

    secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona.

13. 13.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además un casete de expresión que comprende: i) un elemento de respuesta que reconoce el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;

    ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular.

14. 14.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico del primer polipéptido híbrido está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los nucleótidos 1-408 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los nucleótidos 1-465 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21.
15. 15. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de

    unión a ligando del receptor X retinoide quimérico del primer polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21.

16. 16.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona del segundo polipéptido híbrido está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 59 (CfEcR-CDEF) y SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF).

17. 17.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona del segundo polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF), SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF).

18. 18.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica el primer polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN GAL4 y un dominio de unión a ADN LexA, y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico.

19. 19.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica el primer polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 47) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 49) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los nucleótidos 1-408 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los nucleótidos 1-465 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21.
20. 20. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica el primer polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 48) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 50) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21.

21. 21.

    El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica el segundo polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación seleccionado del grupo que consiste en un dominio de transactivación VP16 y un dominio de transactivación activador ácido B42, y un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona.

22. 22.

    Un casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende

    a) un dominio de unión a ADN y

    b) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico que comprende, o bien i) las hélices 1-7 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un RXR de invertebrado, o bien ii) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un RXR de invertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero.

23. 23.

    El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el dominio de unión a ADN es un dominio de unión a ADN GAL4 o un dominio de unión a ADN LexA.

24. 24.

    El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 47) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 49) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos

    nucleicos seleccionada del grupo que consiste en a) los nucleótidos 1-408 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, y b) los nucleótidos 1-465 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21.
25. 25. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un DBD de GAL4 (SEQ ID NO: 48) y un DBD de LexA (SEQ ID NO: 50) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21.
26. 26. Un casete de expresión génica que comprende

    a) un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación y

    b) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico que comprende, o bien i) las hélices 1-7 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un RXR de invertebrado, o bien ii) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un RXR de invertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero.

27. 27.

    El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el dominio de transactivación es un dominio de transactivación VP16 o un dominio de transactivación activador ácido B42.

28. 28.

    El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en un AD de VP16 (SEQ ID NO: 51) y un AD de B42 (SEQ ID NO: 53) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los nucleótidos 1-408 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los nucleótidos 1-465 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21.
29. 29. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un AD de VP16 (SEQ ID NO: 52) y un AD de B42 (SEQ ID NO: 54) y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, y

    b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21.

30. 30.

    Un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los nucleótidos 1-408 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 337-630 de la SEQ ID NO: 21, y b) los nucleótidos 1-465 de SEQ ID NO: 13 y los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 21.

31. 31.

    Un polipéptido aislado codificado por el polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 30.

32. 32.

    Un polipéptido del receptor X retinoide quimérico aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

    a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 113-210 de la SEQ ID NO: 21, y b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 13 y los aminoácidos 135-210 de la SEQ ID NO: 21.

33. 33.

    Un método in vitro de modulación de la expresión de un gen en una célula huésped que comprende el gen que

    se quiere modular que comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1; y 5

    b) introducir en la célula huésped un ligando; en el que el gen que se quiere modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular;

    15 de modo que después de la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen de b)iii).
34. 34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en el que el ligando es un compuesto de la fórmula:

    en la que: E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono terciario; 25 R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2; R2

    es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, CI, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3 OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3 CH=CHCN, alilo, azido, OCF3 OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, o se une con R3 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

    R3 es H, Et, o se une con R2 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un 35 anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

    R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, CI, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2O, CN, C=CH, CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.
35. 35. El método de acuerdo con la reivindicación 33, que comprende además introducir en la célula huésped un segundo ligando, en el que el segundo ligando es ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético de un ácido retinoico.
36. 36. Un método in vitro de modulación de la expresión de un gen en una célula huésped que comprende el gen que 45 se quiere modular que comprende las etapas de:

    a) introducir en la célula huésped el sistema de modulación de la expresión génica de la reivindicación 12; y b) introducir en la célula huésped un ligando; en el que el gen que se quiere modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende:

    i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y

    55 iii) un gen cuya expresión se quiere modular; de modo que después de la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen de b)iii).
37. 37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en el que el ligando es un compuesto de la fórmula:

    en la que:

    E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono terciario;

    R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2;

    R2

    es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, CI, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3 OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3 CH=CHCN, alilo, azido, OCF3 OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, o se une con R3 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

    R3 es H, Et, o se une con R2 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

    R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, CI, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.

38. 38.

    El método de acuerdo con la reivindicación 36, que comprende además introducir en la célula huésped un segundo ligando, en el que el segundo ligando es ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético de un ácido retinoico.

39. 39.

    Una célula huésped aislada que comprende el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1.

40. 40.

    La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 39, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula animal y una célula de mamífero.

41. 41.

    La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 40, en la que la célula de mamífero es una célula murina o una célula humana.

42. 42.

    Una célula huésped aislada que comprende el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12.

43. 43.

    La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 42, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula animal y una célula de mamífero.

44. 44.

    La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 43, en la que la célula de mamífero es una célula murina o una célula humana.

45. 45.

    Un organismo no humano que comprende la célula huésped de la reivindicación 39.

46. 46.

    El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 45, en el que el organismo no humano se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, un hongo, una levadura, un animal y un mamífero.

47. 47.

    El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 46, en el que el mamífero se selecciona del grupo que consiste en un ratón, una rata, un conejo, un gato, un perro, un bóvido, una cabra, un cerdo, un caballo, una oveja, un mono y un chimpancé.

48. 48.

    Un organismo no humano que comprende la célula huésped de la reivindicación 42.

49. 49.

    El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 48, en el que el organismo no humano se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, un hongo, una levadura, un animal y un mamífero.

50. 50.

    El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 49, en el que el mamífero se selecciona del grupo que consiste en un ratón, una rata, un conejo, un gato, un perro, un bóvido, una cabra, un cerdo, un caballo, una oveja,

    un mono y un chimpancé.
51. 51. El sistema de modulación de la expresión génica de la reivindicación 1 ó 12, en el que el sistema de modulación de la expresión génica presenta un incremento en la sensibilidad para un ligando no esteroide con respecto a un

    5 sistema de modulación de la expresión génica que contiene un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico.

52. 52.

    El casete de expresión génica de la reivindicación 22 ó 26, en el que el polipéptido presenta un incremento en la sensibilidad para un ligando no esteroide con respecto a un polipéptido que contiene un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico.

53. 53.

    El sistema de modulación de la expresión génica de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 12 ó 51 en el que el sistema presenta un incremento en la magnitud de inducción génica en comparación con un sistema de modulación de la expresión génica que contiene un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico.

54. 54.

    Los casetes de expresión génica de una cualquiera de las reivindicaciones 22, 26 ó 52 en el que el polipéptido presenta un incremento en la magnitud de inducción génica en comparación con un polipéptido que contiene un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico.

55. 55.

    Uso de un ligando en la fabricación de un medicamento para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende el gen que se quiere modular; en el que la célula huésped comprende el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, y en el que el gen que se quiere modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende:

    25 i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;

    ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y

    iii) un gen cuya expresión se quiere modular.
56. 56. Uso de acuerdo con la reivindicación 55, en el que el ligando es un compuesto de la fórmula:

    35 en la que:

    E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono terciario;

    R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2;

    R2 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1

    propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, CI, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3 OCF2CF2H,

    COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, OCF3 OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, o se une

    45 con R3 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

    R3 es H, Et, o se une con R2 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

    R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, CI, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2O, CN, OCH, CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.

57. 57.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 55, en el que dicho medicamento comprende además un segundo ligando, en el que el segundo ligando es un ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético de un ácido retinoico.

58. 58.

    Uso de un ligando en la fabricación de un medicamento para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende el gen que se quiere modular; en el que la célula huésped comprende el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo de la reivindicación 12, y en el que el gen que se quiere modular es

    un componente de un casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido; 5 ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular.
59. 59. Uso de acuerdo con la reivindicación 58, en el que el ligando es un compuesto de la fórmula:

    en la que:

    15 E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono terciario;

    R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2;

    R2

    20 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, CI, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, o se une con R3 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de

    25 fenilo;

    R3 es H, Et, o se une con R2 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

    30 R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, CI, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.
60. 60. Uso de acuerdo con la reivindicación 58, en el que dicho medicamento comprende además un segundo ligando, 35 en el que el segundo ligando es un ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético de un ácido retinoico.