JP4530387B2 - プロテアーゼ活性を測定するために有用な融合タンパク質、ｄｎａ分子、ベクター、および宿主細胞 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、融合タンパク質、その融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにプロテアーゼ活性を測定するためにそれらを使用するための方法およびキットに関する。詳細には、本発明は、プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質に関し、ここで、（１）この融合タンパク質のリガンド結合ドメインとのリガンドの結合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるリガンド応答エレメント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介し；そしてここで、（２）この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここで、この発現モジュレータードメインは、レポーター遺伝子の転写を調節する。本発明はまた、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、適切なリガンド、ならびにプロモーター−レポーター遺伝子構築物およびこの融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインによって認識される少なくとも１つのＬＲＥを含むＤＮＡ分子を含む、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットに関する。これらのキット中のＤＮＡ分枝は、単離されうるか、または宿主細胞中に存在し得る。
【０００２】
（発明の背景）
プロテアーゼは、細菌からウイルスそして哺乳動物までのほとんど全ての生存形態における生物学的プロセスの調節において、重要な役割を果たす。プロテアーゼは、例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫応答の活性化、酵素原活性化、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク質輸送において、重要な機能を果たす。
【０００３】
プロテアーゼは、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、気腫、高血圧、腫瘍の浸潤および転移、ならびにウイルス関連疾患のような、いくつかの疾患の要因または原因として関連付けられている［例えば、Ｋｉｍ，Ｔ．Ｗ．ら、（１９９７）「Ａｌｔｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｅｓｉｎｉｌｉｎｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｔｏｓｉｓ ｂｙ ａ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：３７３−６；Ｌａｃａｎａ，Ｅら、（１９９７）「Ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１ ｂｅｔａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｄ−３ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｙ ＡＬＧ−２ ａｎｄ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｇｅｎｅ ＡＬＧ−３」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８；５１２９−３５；Ｂｉｒｒｅｒ、Ｐ．，（１９９５）「Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｎｓｉｄｅａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ６２：２５−８；Ｐａｔｅｌ，Ｔ．ら、（１９９６）「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１０：５８７−９７］。
【０００４】
いくつかのウイルスゲノムもまた、ウイルス成熟プロセスにおいて重要であるプロテアーゼをコードする。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のウイルスアスパルチルプロテアーゼは、Ｇａｇポリタンパク質およびＰｏｌポリタンパク質を含むＨＩＶポリペプチドを切断する。
【０００５】
別の例において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、長いポリペプチド翻訳産物である、ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨを生成し、これは、切断されて少なくとも１０タンパク質を生成する。Ｃ、Ｅ１およびＥ２は、推定構造タンパク質であり、そして残りは、非構造（ＮＳ）タンパク質として公知である。これらのタンパク質のうちの１つは、セリンプロテアーゼ活性を有する７０キロダルトンのタンパク質である、ＮＳ３である。ＮＳ３のプロテアーゼ活性は、この酵素のＮ末端の１８０アミノ酸中に唯一存在することが示されている。ＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶポリペプチド（３／４Ａ、４Ａ／４Ｂ、４Ｂ／５Ａ、および５Ａ／５Ｂ）の非構造領域における４つの部位で切断する。別のタンパク質であるＮＳ４Ａは、５４アミノ酸を有し、そしてＮＳ３プロテアーゼの補因子として特徴付けられている［Ｃ．Ｆａｉｌｌａら、（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：３７５３−３７６０］。ＮＳ４ＡのＣ末端の３３アミノ酸は、３／４Ａ部位および４Ｂ／５Ａ部位での切断に必要であり、そして５Ａ／５Ｂ部位での切断速度を加速する。いくつかの他のＮＳ３セリンプロテアーゼ依存性切断部位配列は、ＨＣＶの種々の株において同定されている［Ａ．Ｇｒａｋｏｕｉら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−２８４３（本明細書中に参考として援用される）］。
【０００６】
ウイルスプロテアーゼ、細胞性プロテアーゼ、または微生物プロテアーゼの活性を、迅速かつ簡単なアッセイにおいて検出するための能力は、これらのプロテアーゼの生化学的特徴付け、ウイルス感染の検出、ならびに潜在的なインヒビターのスクリーニングおよび同定において重要である。
【０００７】
いくつかのプロテアーゼアッセイは、当該分野で公知である。Ｔ．Ａ．Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５１５９−６２頁（１９９１）；Ｂ．Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４１５９−６２（１９９２）；およびＭ．Ｇ．Ｍｕｒｒａｙら、Ｇｅｎｅ、１３４、１２３−１２８頁（１９９３）の各々は、酵母ＧＡＬ４タンパク質を利用するプロテアーゼアッセイ系を記載する。これらの文献の各々は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を挿入することを記載する。共発現されたプロテアーゼによるこの部異の切断は、ＧＡＬ４を転写不活性化にし、これは、この形質転換された酵母がガラクトースを代謝することを不可能にさせる。
【０００８】
Ｙ．Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２５，１１３−１２０頁（１９９５）は、ＨＣＶプロテアーゼ活性を検出するためのアッセイを記載する。このアッセイにおいて、基質、ＨＣＶプロテアーゼおよびレポーター遺伝子が、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトされる。この基質は、（ＨＣＶ ＮＳ２）−（ＤＨＦＲ）−（ＨＣＶ ＮＳ３切断部位）−Ｔａｘ１からなる融合タンパク質である。このレポーター遺伝子は、ＨＴＬＶ−１長末端反復配列（ＬＴＲ）の制御下のクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であり、発現後にその細胞核に存在する。未切断の基質は、ＨＣＶ ＮＳ２部分に起因する小胞体の表面上の膜結合タンパク質として発現される。切断の際に、放出されるＴａｘ１タンパク質は、核に移行し、そしてＨＴＬＣ−１ ＬＴＲに結合することによってＣＡＴ発現を活性化する。プロテアーゼ活性は、細胞溶解物中のＣＡＴ活性を測定することによって決定される。
【０００９】
上記のアッセイの各々は、（１）活性プロテアーゼおよび基質の発現、ならびに（２）レポーター遺伝子構築物の転写を、同時に必要とする。これらのアッセイの構成的性質はしばしば、制御不可能な、所望しない効果を生じ得る。これらの効果は、このプロテアーゼの活性に関わる、誤誘導されたか、または不適切な結論を生じ得る。従って、誘導性であるか、または使用者によって容易に制御され得る、高感度かつ定量的なプロテアーゼアッセイの必要性が存在する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、プロテアーゼの活性を測定するための融合タンパク質リガンド依存性転写アッセイにおいて有用な、新規な融合タンパク質、その融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞を提供することによって、この必要性を満たす。
【００１１】
この新規な融合タンパク質は、プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインをを含み、ここで、（１）リガンドの、この融合タンパク質のリガンド結合ドメインとの結合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるＬＲＥへの結合を媒介し；そしてここで、（２）この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここで、この発現モジュレータードメインは、このレポーター遺伝子の転写を調節する。
【００１２】
本発明の方法に従って、未切断の融合タンパク質のリガンド結合ドメインへのリガンドの結合は、別々の時点で、このレポーター遺伝子の転写活性化または抑制を開始する。この誘導可能性は、このアッセイをより良好に制御されるものにし、従って、より正確な結果を生じる。
【００１３】
プロテアーゼ切断部位でのこの融合タンパク質の切断は、この発現モジュレータードメインが転写をポジティブまたはネガティブに調節することを妨げることによって、このレポーター遺伝子に転写を調節解除する。切断された融合タンパク質の量は、レポーター遺伝子のトランス活性化における増加または減少をアッセイすることによって定量され、このレポーター遺伝子の発現は、この融合タンパク質の発現調節ドメインによって調節されるプロモーターによって駆動される。
【００１４】
本発明はまた、プロテアーゼに対する化合物の阻害活性を測定するための方法に関し、この方法は、その活性が試験される化合物の存在下または非存在下で融合タンパク質をプロテアーゼとともにインキュベートする工程、そのインキュベーションにリガンドを添加する工程、およびレポーター遺伝子から生成された遺伝子産物を定量する工程を包含する。
【００１５】
本発明のなお別の実施態様は、２つのプロテアーゼまたは同じ切断部位を認識するプロテアーゼの変異体の活性を比較するための方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットに関し、このキットは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含む融合タンパク質または宿主細胞を含み、ここでこのキットは、必要に応じて、プロテアーゼをコードするＤＮＡ分子、その発現がその融合タンパク質によって調節されるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ分子、その融合タンパク質に会合し、その活性を調節するリガンド、およびこのキットを使用するための説明書を備える。好ましくは、キット中のＤＮＡ分子は、その発現を可能にするベクターに操作されている。本発明に従うキットは、以下からなる群から選択される、単一宿主細胞に形質転換される以下のＤＮＡ分子のいずれか１つまたは全てを含み得る：本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、プロテアーゼをコードするＤＮＡ分子、融合タンパク質についてのタンパク質結合パートナーをコードするＤＮＡ分子、およびプロモーター−レポーター遺伝子構築物を含むＤＮＡ分子。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プロテアーゼ活性を測定するための新規なツールおよび方法を提供する。プロテアーゼの活性は、転写アッセイにおいて、基質として新規な融合タンパク質を使用することによって測定され、ここで転写は、プロテアーゼおよび本発明の融合タンパク質がともにインキュベートされた後に、リガンドの添加により、不連続の時点にて活性化または抑制される。
【００１８】
本発明は、以下を含む融合タンパク質を提供する：プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメイン、ここで（１）リガンドとこの融合タンパク質のリガンド結合ドメインとの会合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたリガンド応答エレメント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介する；そしてここで、この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、または発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と会合し、ここでこの発現モジュレータードメインは、レポーター遺伝子の転写を調節する。
【００１９】
本発明に従うプロテアーゼ切断部位（本明細書中以後、「ＰＣＳ」）は、本発明の融合タンパク質の一次配列に組み込まれたペプチドである。この部位は、タンパク質の任意のＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または必要に応じて、発現モジュレータードメイン（存在する場合）に、そして任意の２つのこれらのドメインの間に位置し得る。
【００２０】
タンパク質における切断部位の存在は、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または発現モジュレータードメイン（存在する場合）の活性を実質的に妨害しないべきである。
【００２１】
プロテアーゼ切断部位が、融合タンパク質の上記のドメインの活性を実質的に妨害しないことを確実にするために、ＰＣＳを有する融合タンパク質の活性を、ＰＣＳを有しない同じ融合タンパク質の活性と、ＤＮＡ結合を評価するためのゲルシフトアッセイまたは転写アッセイによって比較し得る（例えば、Ｄ．Ｌａｔｃｈｍａｎ，（１９９５）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００２２】
また、プロテアーゼ切断部位は、切断した場合に、得られる融合タンパク質フラグメントは標的遺伝子の発現もレポーター遺伝子の発現も調節し得ないように、融合タンパク質に操作されるべきである。
【００２３】
好ましくは、融合タンパク質基質内に位置する標的プロテアーゼ切断部位が１つのみ存在する。
【００２４】
好ましい実施態様に従って、プロテアーゼ切断部位は、ＤＮＡ結合ドメインと、融合タンパク質のエフェクターモジュレータードメインとの間に位置する。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＩＶ ｇａｇおよびｇａｇ／ｐｏｌポリタンパク質またはＨＣＶタンパク質タンパク質においてプロセシング／プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を有する。本発明のより好ましい実施態様において、ＨＩＶ ＰＣＳ部位は、配列番号１〜１０からなる群より選択される（Ｓ．Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、（１９８９）「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＩＶ１ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｅｄ ｇａｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３２４−３３７を参考として援用する）。本発明のより好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼまたはＨＩＶアスパルチルプロテアーゼについての切断部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおより好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ５Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおより好ましい実施態様において、５Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断部位は、配列番号１０である。
【００２６】
本発明の融合タンパク質の次の部分は、リガンド結合ドメイン（本明細書中以後、「ＬＢＤ」）である。ＬＢＤは、リガンドに結合するペプチドドメインであり、ここでこのリガンド結合は、この融合タンパク質が、（１）ＬＲＥに結合する（ここで、このエレメントは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される）；および／または（２）ＬＲＥに対する得られる融合タンパク質−タンパク質結合パートナー複合体の結合の前の中間工程として、タンパク質結合パートナーに結合するために必要とされる。従って、融合タンパク質リガンド結合ドメインへのリガンド結合は、このレポーター遺伝子の発現の転写調節に必須である。
【００２７】
本発明における使用に適切なリガンド結合ドメインは、リガンド結合の際に転写を開始または抑制する転写因子のリガンド結合ドメインに由来し得る。このような転写因子としては、以下が挙げられる：ホルモンレセプター（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｌ．Ｐ．，１９９８、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ；Ｔｓａｉ，Ｍ−Ｊ．，１９９４、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ：Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏ．；Ｅｇｇｅｒｔ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１３１−１５６頁；Ｐｉｅｄｒａｆｉｔａ，Ｆ．Ｊ．およびＭ．Ｐｆａｈｌ，「Ｔｈｅ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１５７−１８５頁；Ｋｅａｖｅｎｅｙ Ｍ．およびＨ．Ｇ．Ｓｔｕｎｎｅｂｅｒｇ，「Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１８７−２４２頁（これらの各々を、本明細書中で参考として援用する）；炭水化物応答性転写因子；メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子；オーファンレセプター；テトラサイクリン誘導性転写因子；ＩＰＴＧ誘導性転写因子；ダイオキシンレセプター；およびアリール炭水化物レセプター。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様において、リガンド結合ドメインは、ステロイド／甲状腺ホルモンレセプタースーパーファミリーのリガンド結合ドメインに由来する。ステロイドおよび核レセプターリガンド結合ドメインをコードするアミノ酸配列は、当該分野で周知である（例えば、Ｓ．Ｓｉｍｏｎｓ，（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと）。より好ましい実施態様において、リガンド結合ドメインは、エクジソンレセプターに由来する。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様において、転写因子由来のリガンド結合ドメインは、異なるリガンドに結合するように、本発明の融合タンパク質において改変され得る。例えば、ヒトプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインは、抗プロゲステロン化合物ＲＵ４８６（Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、（１９９７）「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４：４３２−４１（その開示を、本明細書中で参考として援用する））を結合し得るように変異され得る。このようなＲＵ４８６誘導性ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質は、本発明における使用が意図される。
【００３０】
ＤＮＡ結合ドメイン（本明細書中以後、「ＤＢＤ」）とは、特定のヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡエレメントまたはＬＲＥ）を認識し、かつそれに結合する、本発明に従う融合タンパク質におけるペプチド配列をいう。本発明に従って有用なＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）のＤＮＡ結合ドメインに由来し得る。
【００３１】
好ましい実施態様において、これらのＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡを直接結合しかつ転写を開始または抑制する転写因子である。このような転写因子は、当該分野で周知である（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．およびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９２、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，１９９５、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版；Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，１９９３，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｐａｐａｖａｓｓｉｌｉｏｕ，Ａ．，（１９９７）「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ，１９９７，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１１巻、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（これらの開示を、本明細書中で参考として援用する）。
【００３２】
本発明における使用が意図される好ましいＤＮＡ結合ドメインとしては、以下の転写因子のＤＮＡ結合ドメインが挙げられる：ホメオボックスタンパク質、ジンクフィンガータンパク質（Ｓｌｕｙｓｅｒ，Ｍ．，１９９３，Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ：ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ロイシンジッパータンパク質（例えば、Ｈｕｒｓｔ、Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ＧＡＬ４タンパク質、ホルモンレセプター、オーファンレセプター、およびＥ．ｃｏｌｉ転写因子（例えば、ラクトースオペロンリプレッサー）、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター、およびＦａｄＲ。
【００３３】
本発明はまた、メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子の転写を調節する金属結合ＤＮＡ結合タンパク質のＤＢＤの使用を意図する。このような金属結合ＤＮＡ結合タンパク質としては、ＭＴＦ−１、ＡＣＥ１、およびＡＭＴ１が挙げられる（Ｈｅｕｃｈｅｌ，Ｒ．ら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔａｌｓ，Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ Ｇｅｎｅｓ」、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，第１巻（１９９５）Ｂｒｉｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ．Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、２０６−２４０頁）。
【００３４】
本発明の好ましいより実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、レセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーから得られる。レセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーは、リガンド依存性転写因子として機能するホルモン結合タンパク質として当該分野で公知である。そのメンバーとしては、特異的天然のリガンドがまだ同定されていないレセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの同定されたメンバーが挙げられる（本明細書中で「オーファンレセプター」といわれる）（Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１９９８）「Ｏｒｐｈａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｌｉｇａｎｄｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３０５頁）。
【００３５】
本発明における使用に有用なオーファンレセプターのメンバーとしては、ＨＮＦ４、ＣＯＵＰファミリーのレセプターおよびＣＯＵＰ様レセプター、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＲＡＲ）、昆虫に由来するＫｎｉｒｐｓおよびＫｎｉｒｐｓ関連レセプター、ならびにそれらの様々なアイソフォームが挙げられる。
【００３６】
このようなＤＢＤをコードするアミノ酸配列は、当該分野で周知である（Ｆ．Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ，（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００３７】
本発明の融合タンパク質において使用されるＬＢＤと同様に、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、ソース転写因子に存在する配列から、異なるＬＲＥを認識するように改変され得る。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーメンバーのＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインが別のステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーによって認識されるＬＲＥに結合するように改変され得る。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーの「Ｐボックス」アミノ酸配列（すなわち、代表的には、第１のジンクフィンガーとリンカー領域との接合部に位置するＤＮＡ結合ドメインにおける領域）の改変が、本発明によって意図される（Ｕｍｅｓｏｎｏら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：１１３９−１１４６、特に図２および表１；この開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００３８】
好ましい実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターに由来し、ここでアミノ酸配列ＥＧＣＫＧ（配列番号２３）を有するエクジソンレセプターのＰボックスは、アミノ酸配列ＧＳＣＫＶ（配列番号２４）と置換される。新たなＰボックス配列ＧＳＣＫＶは、エクジソンレセプターにＬＲＥ−ＡＧＧＴＣＡ−の代わりにＬＲＥ−ＡＧＡＡＣＡを認識させる。
【００３９】
本発明の融合タンパク質のＬＢＤおよび／またはＤＢＤを提供するに特に有用なレセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーとしては、以下のようなステロイドレセプターが挙げられる：グルココルチロイドレセプター（ＧＲ）、ミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）；エストロゲンレセプター（ＥＲ）；ｈＰＲ−ＡまたはｈＰＲ−Ｂのようなプロゲステロンレセプター（ＰＲ）；アンドロゲンレセプター（ＡＲ）；ビタミンＤ３レセプター（ＶＤＲ）；レチノイン酸レセプター（例えば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、またはＲＡＲγ）およびレチノイドＸレセプター（例えば、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、またはＲＸＲγ）のようなレチノイドレセプター；ＴＲαおよびＴＲβのような甲状腺レセプター（ＴＲ）；エクジソンレセプターのような昆虫に由来するレセプター；ならびにそれらのアイソフォーム。
【００４０】
１つの好ましい実施態様に従って、本発明の融合タンパク質は、リガンド結合ドメインの付近もしくは隣に操作されるＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてこの２つのドメインはいずれもＰＣＳを含まず、この２つのドメイン間に位置するＰＣＳでもない。
【００４１】
本発明の融合タンパク質の任意成分は、発現モジュレータードメインである。上記のように、発現モジュレータードメインが融合タンパク質上に存在しない場合、発現モジュレータードメインは、融合タンパク質と会合するタンパク質上に存在しなければならない。
【００４２】
本発明における使用が意図される発現モジュレータードメイン（融合タンパク質の一部または融合タンパク質と会合する別のタンパク質のいずれかとして）は、代表的には、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）に由来する。これらの配列は、転写に必要な他の転写因子との相互作用を介して、転写を活性化または抑制することが、当該分野で公知である。
【００４３】
発現モジュレータードメインが融合タンパク質に結合する第２のタンパク質内に存在する実施態様において、その第２のタンパク質は、本発明の融合タンパク質およびそのリガンドの非存在下で転写を増加または減少させるべきである。発現モジュレータードメインが融合タンパク質内に存在する実施態様において、発現モジュレータードメインは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインの位置と反対の末端に配置される。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、発現モジュレータードメインは、その活性を抑制するのとは反対に、転写を活性化する。このような活性化ドメインとしては、以下が挙げられる：ステロイド／甲状腺スーパーファミリーのレセプターにおいて活性化ドメインをコードするＮ末端領域、ウイルス転写因子の活性化ドメイン、酵母ＧＣＮ４活性化ドメインまたはＧＡＬ４活性化ドメイン（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ，「Ｙｅａｓｔ ＧＣＮ４ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、８３３−８５９頁；Ａ．Ａ．Ｆ．Ｇａｎｎら、「ＧＡＬ１１，ＧＡＬ１１Ｐ，ａｎｄ ｔｈｅ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＬ４」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、９３１−９４６頁；Ｋ．Ｊ．ＭａｒｔｉｎおよびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｅａｒｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｈｅｍｅ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、６９５−７２５頁；これらの開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００４５】
別の好ましい実施態様では、この発現調節ドメインは、融合タンパク質の一部である。ましてなおさら好ましいのは、発現調節ドメインが、ＶＰ１６タンパク質のＮ末端活性化ドメインである場合である。
【００４６】
リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび発現モジュレータードメインが、同じ転写因子に由来する必要がないことが理解されるべきである。
【００４７】
例えば、レチノイン酸レセプターのＤＮＡ結合ドメイン、およびビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）のリガンド結合ドメインを含むキメラが、作製され得る（Ｐｅｍｒｉｃｋ，Ｓ．，ら、（１９９８）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＡＲα／ＶＤＲ」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：５５４−５６２）か、またはＪｕｎ ＤＮＡ結合ドメインを含むキメラは、エストロゲンレセプターリガンド結合ドメインおよび発現モジュレーター活性化ドメインに融合され得る（Ｋｒｕｓｅ，Ｕ．ら、（１９９７）「Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ Ｊｕｎ−Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｈｉｍｅｒａ」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：１２３９６−１２４００）。
【００４８】
他の例は、ｌａｃＲ ＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６活性化ドメインとの融合を含む。これは、ＬＲＥ、ｌａｃＯに結合するためにＩＰＴＧを必要とする融合タンパク質を作製する［Ｌａｂｏｗ，Ｍ．ら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６］。別の例では、ｔｅｔＲタンパク質とＶＰ１６活性化ドメインとの融合は、細胞中およびトランスジェニック動物中においてテトラサイクリンの存在下で、ＬＲＥ、ｔｅｔＯから放出する融合タンパク質を作製する［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，（１９９２）［Ｔｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、（１９９４）「Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ ｂｙ ａ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：９３０２−９３０６］。本発明に従うｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質は、そのＤＮＡ結合ドメイン中にプロテアーゼ切断部位を含み得る。その結果、ＰＣＳが切断される場合に、ＤＮＡ結合が排除される。従って、テトラサイクリンの添加の際に、未切断融合タンパク質は、ｔｅｔＯからトランス活性化し続け、一方切断された融合タンパク質は、不活化する。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様は、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６活性化ドメインと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーのリガンド結合ドメインと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーのＤＢＤとの融合である。より好ましい実施態様では、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーは、エクジソンレセプターである。
【００５０】
上記のように、本発明はまた、ＤＮＡを結合するために、あるいはそのＬＲＥへの融合タンパク質の結合の特異性または結合の親和性を増加させるために、タンパク質結合パートナー（「ＰＢＰ」）との接触を必要とする融合タンパク質を意図する。従って、本発明に従うタンパク質結合パートナーは、本発明の融合タンパク質に結合し、そして融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの結合の特定のＬＲＥへの親和性または特異性を増加させるタンパク質である。タンパク質結合パートナーは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される特定のＤＮＡエレメントにもまた結合するタンパク質である。本発明の融合タンパク質が、ＤＮＡ結合の親和性または特異性を増加させるためにタンパク質結合パートナーを必要とする場合、それは、融合タンパク質がＰＢＰと相互作用するために二量体化ドメインを含むことを保証することが望ましい。
【００５１】
本発明の融合タンパク質の二量体化ドメインと相互作用するために適切であり得るタンパク質結合パートナーは、当該分野で公知である。「例えば、Ｔ．Ｄ．ＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄおよびＧ．Ｉ．Ｅｖａｎ（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ＨＬＨ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２７−４１頁；Ｈｕｒｓｔ，Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２７−２９頁；およびＬ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．］。
【００５２】
例えば、いくつかの塩基性（ｂａｓｉｃ）−へリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子のヘテロ二量体パートナーは、当該分野で公知である。［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８，Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）３７−４１頁］。より詳細な例では、ｂＨＬＨ転写因子（例えば、リガンド依存性ダイオキシンレセプターおよびアリール炭化水素レセプター（ＡＨＲ））は、ＡＨＲ核トランスロケータータンパク質（ＡＲＮＴ）とへテロ二量体化する。［Ｗｈｉｔｅｌａｗ，Ｍ．Ｌ．ら、（１９９４）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｏｘｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｂａｓｉｃ Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ／ＰＡＳ Ｐａｒｔｎｅｒ Ｆａｃｔｏｒ Ａｒｎｔ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４：８３４３−８３５５］。
【００５３】
別の例は、ステロイド／甲状腺ファミリーのレセプターをお互いに、または他の非ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーと、二量体化する能力を有するステロイド／甲状腺ファミリーのレセプターである（例えば、Ｒｈｅｅら、（１９９５）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ３，５，３’−Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：２６９７−７０４；Ｌｉら、（１９９７）「Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：２２７８−８３）」。
【００５４】
なお別の例は、いくつかの他のタンパク質と二量体化するｂＺＩＰ因子である。［例えば、Ｈ．Ｃ．Ｈｕｒｓｔ，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６），２８頁］。
【００５５】
本発明のタンパク質を含むこのようなヘテロ二量体およびホモ二量体が意図される。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様では、Ｐ−ボックス修飾エクジソンレセプターは、哺乳動物ＲＸＲとヘテロ二量体化する。
【００５７】
細胞転写アッセイにおける使用のための本発明の融合タンパク質は、宿主細胞の核に局在するべきである。本発明の融合タンパク質のドメイン内に既に存在する核局在化シグナルは、核局在化シグナルを提供し得る。あるいは、当該分野で公知の核局在化シグナルは、核局在化を保証するように融合タンパク質へと操作され得る。［例えば、Ｄ．Ｂ．ＤｅＦｒａｎｃｏ，（１９９８）「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ Ａら、（１９９６）、「Ｔｈｅ Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｏｓｔｅｒ Ａｗａｒｄ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：３−９，これらの開示は、本明細書中で参考として援用される］。
【００５８】
本発明の方法の代替的実施態様では、融合タンパク質は、リガンド結合ドメインを欠く。詳細には、この実施態様では、融合タンパク質は、（１）ＤＮＡ結合ドメインおよび（２）プロテアーゼ切断部位を含む。これらの方法では、融合タンパク質の転写活性は、転写環境の温度を変化させることか、または転写事象が生じる細胞にストレスを引き起こすことによって誘導し得る。例えば、熱ショック因子（「ＨＳＦ」）の、その応答エレメントであるＨＳＥに対する高親和性結合は、熱ショック刺激に依存する。［例えば、Ｊ．ＬｉｓおよびＣ．Ｗｕ、「Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｆａｃｔｏｒ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、９０７−９３０頁；Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第２版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，（１９９５）７１−７８頁］。
【００５９】
目的のプロテアーゼ切断部位は、ＨＳＦタンパク質へと操作され得、その結果切断されたＨＳＦ融合タンパク質の転写活性は、熱による刺激後の切断されないＨＳＦ融合タンパク質と比べてより低いかまたは無視できる。
【００６０】
本発明の方法によって意図される本発明の融合タンパク質の使用、ＤＮＡ分子およびベクターは、細胞性転写反応およびインビトロ転写反応を含む。
【００６１】
細胞において転写アッセイを行うための方法は公知である［例えば、Ｒ．ＷｈｉｔｅおよびＭ．Ｐａｒｋｅｒ，「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ（１９９３）１４５−１５２頁；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］。簡単には、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ、レポータープラスミド、プロテアーゼ、および、必要に応じて、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質が細胞へと導入される。次いで、融合タンパク質の転写活性は、リガンドを添加することによってか、または細胞の環境を変化させる（例えば、細胞の環境の温度を変化させる）ことによって誘導される。ｍＲＮＡの量、レポータータンパク質の量、またはレポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定される。プロテアーゼの非存在下での転写は、プロテアーゼの存在下での転写と比較され得る。
【００６２】
インビトロでの転写反応を行うための方法もまた公知である［Ｓｉｅｒｒａ，Ｆ．ら、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ，「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｌｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１２５−１５２頁；Ｓｎｏｅｋ，Ｒ．ら、（１９９６）「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５９：２４３−２５０；Ｄｉｇｎａｍ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９２）「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １２．１．１−１２．１．９頁；Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓ，Ｌ．ら、（１９９０）「Ｔｈｅ Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ」，Ｃｅｌｌ ６０：２４７−２５７］。
【００６３】
簡単には、インビトロでの転写反応を補助することが示されているプロトコルにより調製された細胞抽出物が調製される。精製タンパク質または部分的精製タンパク質は、レポータープラスミドと共に細胞抽出物に添加される。このような精製タンパク質または部分的精製タンパク質（例えば、本発明の融合タンパク質）は、融合タンパク質をコードするＤＮＡを導入された細胞（例えば、バキュロウイルス感染によるＳＦ９細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および細菌細胞）中での過剰発現によって産生され得る。タンパク質（例えば、プロテアーゼ）および、必要に応じて、発現調節ドメインおよび／またはタンパク質結合パートナーを有する第２のタンパク質はまた、これらを精製する当該分野で公知の方法を用いてこれらの本来の供給源から調製され得る。
【００６４】
次いで、融合タンパク質の転写活性は、リガンドを添加することによって誘導される。産生されたｍＲＮＡの量、産生されたレポータータンパク質の量、またはレポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定される。プロテアーゼの存在下での転写は、プロテアーゼの非存在下での転写と比較され得る。
【００６５】
本発明はまた、阻害性のプロテアーゼ活性について化合物をスクリーニングするための方法を提供する。スクリーニングされるべき化合物は、リガンドが添加されるのと同時に添加され得るか、または融合タンパク質とプロテアーゼの最初の発現／インキュベーションの間に添加され得る。このプロテアーゼの最高の阻害を達成するために必要な化合物の最適なレベルは、化合物の滴定によって決定され得る。
【００６６】
本発明はまた、同一のプロテアーゼ切断部位を認識する２つのプロテアーゼの活性を比較するための方法を提供する。この方法は、変異体プロテアーゼの活性と非変異体プロテアーゼ（例えば、患者由来のＨＩＶアスパルチルプロテアーゼ）の活性を比較するために有用である。
【００６７】
本発明はまた、異なるプロテアーゼ切断部位に対するプロテアーゼの活性を比較するための方法を提供する。この方法は、所定のプロテアーゼの基質特異性を決定するために有用である。
【００６８】
本発明はまた、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットを提供する。このキットが、レポーター遺伝子のインビトロでの転写アッセイに用いられる場合、このキットは、インビトロでの転写抽出物、レポーター遺伝子を含む上記のようなベクター、リガンドの供給、および使用説明書を含み得る。必要に応じて、これは本発明の融合タンパク質、発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質、および／または細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および酵母を含む供給源から発現されるプロテアーゼの供給を提供し得る。
【００６９】
このキットが、細胞転写アッセイに用いられる場合、このキットは、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列および上記のようなレポータープラスミドをコードするベクター、そのタンパク質のＤＮＡ配列によりコードされる上記融合タンパク質と会合しかつその活性を調節するリガンド；ならびにプロテアーゼ活性をアッセイするために上記キットを使用するための使用説明書を含み得る。
【００７０】
本発明の方法において特に有用であるプロテアーゼは、症状または疾患の発症に寄与するプロテアーゼである。例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫応答の活性化、チモーゲン活性、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク質輸送に関与するプロテアーゼ。本発明の１つの実施態様では、目的のプロテアーゼは、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、気腫、高血圧症、腫瘍の侵襲および転移ならびにウイルス関連疾患に関与するものである。本発明の好ましい実施態様に従って、このプロテアーゼは、ＨＩＶアスパルチルプロテアーゼおよびＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ、ならびにそれらの活性フラグメントまたは融合タンパク質である。
【００７１】
本発明の１つの実施態様では、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＰＢＰ、プロテアーゼ、および発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質のいずれか１つまたは全ては、タンパク質の精製またはその発現の同定を容易にするための、さらなるポリペプチド配列を提供するように、さらに改変され得る。例えば、このようなポリペプチド配列は、抗体を結合するためのエピトープ、タンパク質Ａビーズを結合するための抗体のＦｃ部分、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、Ｈｉｓ（ｎ）、ＦＬＡＧ、およびＳｔｒｅｐ−タグを含み得る。これらのスクリーニング可能なタグは、当該分野で全て周知であり、そして当業者に完全に利用可能である。
【００７２】
本発明のタンパク質の過剰発現に有用ないくつかのベクターは、酵母、昆虫細胞、細菌、酵母、植物細胞、および哺乳動物細胞における発現について市販されているか、または公知である。
【００７３】
本発明の方法に従って有用な宿主細胞は、当該分野で周知である。外来のプロテアーゼの活性が研究される場合、宿主細胞は、標的とされるプロテアーゼ切断部位を認識する高レベルの内在性のプロテアーゼを発現しないことが望ましい。適切な宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞；ＨｅＬａ細胞；肝臓細胞；ＣＶ−１細胞；Ｐ１９細胞；ＮＴ２／Ｄ１細胞；マウスＬ細胞；アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞または他のＣＯＳ細胞）；ヒト胎児性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３）；ＤＧ４４細胞、ｌｔｋ細胞、マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞および酵母細胞が挙げられ得る。この宿主細胞は、一過性のトランスフェクト細胞株または安定な形質転換細胞株であり得る。本発明の好ましい実施態様では、この宿主細胞は、肝臓細胞株由来のＣＯＳ細胞である。
【００７４】
本発明の方法における使用のために適切なリガンドは、当該分野で周知である。このリガンドは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインが由来する転写因子のリガンド結合ドメイン、または改変されたそれらのリガンド結合ドメイン（上記を参照のこと）に結合すべきである。好ましくは、このリガンドは、融合タンパク質についてのＬＲＥが、プロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクターに、スプライスまたは挿入されない（ここで、ＬＲＥは、プロモーターに、リガンドに機能的に応答するようにプロモーターからの転写活性を作る様式で、連結される）限り、プロモーターからの転写を実質的に増強しないか、または抑制しない。
【００７５】
使用するリガンドの選択は、使用される融合タンパク質のリガンド結合ドメインに必然的に依存する。例えば、金属結合ＤＮＡ融合タンパク質と共に使用するために適切なリガンドとしては、亜鉛、カドミウム、および銅が挙げられ得る。
【００７６】
例えば、ステロイド結合融合タンパク質、または改変されたステロイド結合融合タンパク質と共に使用するために適切なリガンドは、アンドロゲン、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、プロゲストゲン、レチノイン酸、ビタミンＤ３、２０−ヒドロキシ−エクジソン、ポナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ、２６−ヨードポナステロンＡ、ミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａ、イノステロン、２６−メシリノコステロン、ミフェプリストン（ＲＵ ４８６）およびそれらのアナログを含み得る。
【００７７】
本明細書中で用いられる場合、アンドロゲンは、ジヒドロキシテストステロンおよびメチルトリエノロンを含むそれらのアナログを含む。
【００７８】
本明細書中で用いられる場合、糖質コルチコイドホルモンは、コルチゾール、ヒドロコルチゾン、およびコルチコステロン、ならびにデキサメタゾン、デオキシコルチコステロン、およびトリアムシノロンアセトニドを含むそれらのアナログを含む。
【００７９】
本明細書中で用いられる場合、鉱質コルチコイドは、アルドステロン、コリコステロン（ｃｏｒｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）およびデオキシコルチコステロンを含む。
【００８０】
本明細書中で用いられる場合、甲状腺ホルモンは、サイロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）（Ｔ３）を含む。
【００８１】
本明細書中で用いられる場合、エストロゲンは、エストラジオール−１７β、およびジエチルスチルベストロールを含むそれらのアナログを含む。
【００８２】
本明細書中で用いられる場合、プロゲストゲンは、プロメゲストロン（ｐｒｏｍｅｇｅｓｔｒｏｎｅ）を含むプロゲステロンのアナログを含む。
【００８３】
テトラサイクリン誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、テトラサイクリンおよびそれらのアナログを含む。
【００８４】
糖質誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、アラビノース、ラクトース、およびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む。
【００８５】
アリール炭化水素誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、ダイオキシンを含む。
【００８６】
オーファンレセプターに適切なリガンドは、以下を含む：ＲＸＲレセプターについてフィチン酸、９−シスレチノイン酸、およびＬＧ１００２６８；ＰＰＡＲαレセプターについて８Ｓ−ＨＥＴＥおよびＷｙ１４，６４３；ＰＰＡＲγレセプターについて１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ２およびＢＲＬ ４９６５３；ＰＰＡＲδレセプターについてリノール酸およびカルバ−プロスタサイクリン（ｃａｒｂａ−ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ）；ＦＸＲレセプターについてファルネソール；ならびにＬＸＲレセプターについて２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール。［Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１９９８）「ＯｒｐｈａｎＮｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３０５頁］。
【００８７】
本発明におけるＬＲＥおよびＰＢＰ−ＤＮＡエレメントは、それぞれ、融合タンパク質およびタンパク質結合パートナーについてのＤＮＡ結合部位を提供する核酸分子である。両方のエレメントは、レポーター遺伝子の転写の活性化または抑制を制御するために、プロモーターに作動可能に連結されるべきである。句「作動可能に結合される」とは、核酸分子が、宿主細胞へと導入される（例えば、トランスフェクトされるか、形質転換されるか、形質導入されるか、結合体化されるか、または組換えによってか、もしくは感染によって）場合に、発現される得るような様式で、核酸分子（例えば、レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子）を、ＬＲＥエレメントおよびＰＢＰ−ＤＮＡエレメント（ＰＢＰ結合が転写に必要な場合）に、ならびに転写制御配列に連結することをいう。
【００８８】
転写制御配列は、転写の開始、伸長、そして停止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーターのような転写の開始を制御するものである。好ましくは、このプロモーターは、最小プロモーターである。用語「最小プロモーター」は、転写されるべき結合配列についての転写開始部位を定義するが、それ自身では、特定の細胞環境において、あったとしても効率的には転写を開始し得ない、部分的プロモーター配列を記載することを意図する。従って、このような最小プロモーターの活性は、本発明の融合タンパク質の結合に依存する。
【００８９】
好ましい実施態様では、最小プロモーターは、ショウジョウバエの熱ショックプロモーター由来であり、そして融合タンパク質に対する標的ＬＲＥは、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように生成されるＡＧＡＡＣＡである。
【００９０】
本発明に従うＬＲＥは、リガンドに応答性を与えるように作動すべきである。さらなる実施態様では、本発明のＰＢＰに結合するＤＮＡエレメントはまた、用いられるＰＢＰが、リガンド結合タンパク質である場合に、リガンド応答性であり得る。ＬＲＥエレメントおよびＤＮＡエレメント（必要な場合）の選択、ならびにお互いについてのこれらのエレメントの配置は、用いられる融合タンパク質またはＰＢＰに依存する。例えば、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、塩基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質に由来する場合、ＬＲＥは、コンセンサスＤＮＡヘキサマーＣＡＮＮＴＧ（「Ｅボックス」としてもまた公知である）を含むようである（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら、前出、３１頁）。
【００９１】
多くの転写因子についての好ましいＤＮＡ結合部位（すなわち、ＬＲＥおよびＤＮＡエレメント）は公知である。［Ｄ．Ｊ．ＭａｎｇｅｌｓｄｏｒｆおよびＲ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，（１９９２）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、１１３７−１１６７頁、；Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．，１１１−１１３頁；およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（本明細書中で参考として援用される）］。
【００９２】
哺乳動物細胞中で融合タンパク質、ＰＢＰ、およびプロテアーゼの発現を制御するプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターのように構成的であり得る。添加されるコントロールについて、融合タンパク質、ＰＢＰ、およびプロテアーゼは、誘導性プロモーターの制御化にあり得る。誘導性プロモーターは、レポーター遺伝子の転写を駆動するプロモーターと同じではないことが望ましい。
【００９３】
本発明の方法に従って有用であるレポーター遺伝子は、当該分野で周知である。このようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子（ＵＳ ５，４９１，０８４）、β−ガラクトシダーゼ、分泌アルカリホスファターゼ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。また、本発明は、細胞外の分泌のためのシグナル配列を有するマーカータンパク質をコードするレポーター遺伝子（例えば、ＩＬ−１β遺伝子）を意図する。
【００９４】
ＬＲＥエレメントおよびＤＮＡエレメントに作動可能に連結されるレポーター遺伝子を含むベクター（すなわち、レポータープラスミド）は、当該分野で利用可能な材料から調製され得る。このようなレポータープラスミドはまた、好ましくは、例えば、以下を含む：複製起点および選択マーカー。このレポータープラスミドはまた、必要に応じて、細胞株のゲノムへのベクターの挿入を生じるために、長末端反復配列（「ＬＴＲ」）のような他のＤＮＡ配列を含み得る。
【００９５】
細菌または哺乳動物細胞中で融合タンパク質、ＰＢＰ発現モジュレータードメインを有するタンパク質もしくはプロテアーゼの発現のために適切なベクターは、当該分野で周知である。このようなベクターは、例えば、以下を含み得る：複製起点、選択マーカーおよび転写制御配列（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列）。従って、融合タンパク質、ＰＢＰ、発現モジュレータードメインを有するタンパク質およびプロテアーゼは、上記のように、構成性または誘導性プロモーターと作動可能に連結されているはずである。このベクターは、以下のタンパク質の２つ以上が同じベクター中に存在するように構築され得る：融合タンパク質、プロテアーゼ、ならびに必要に応じて、ＰＢＰおよび／または発現モジュレーターを有するタンパク質（融合タンパク質の機能にとって必要であれば）。これらの遺伝子の転写は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって制御され得る。例えば、各遺伝子は、異なる誘導性プロモーターによって制御されてもよいし、各遺伝子は、同じ構成性プロモーターによって制御されてもよい。
【００９６】
融合タンパク質、ＰＢＰ、プロテアーゼおよび発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質を発現するためのレポータープラスミドおよびベクターは、選択マーカーを含み得る−一方は、原核生物細胞（例えば、細菌）における増殖を付与し、そしてもう一方は、特定の化合物の存在下で真核生物細胞（例えば、酵母、哺乳動物細胞または植物細胞）における増殖を付与する。本発明において有用な選択マーカーは、薬物（例えば、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）に対する耐性を付与しうる。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様において、このベクターは、ＤＮＡ配列である配列番号１９を有する融合タンパク質をコードする。本発明のさらに好ましい実施態様において、ＤＮＡ配列である配列番号２１を有する融合タンパク質をコードするベクターは、コントロールとして使用される。本発明の好ましい実施態様において、レポータープラスミドは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＩＮＤに由来する。
【００９８】
このベクターおよびレポータープラスミドが細胞における転写アッセイにおいて使用されるべき場合、それらは、当該分野で公知の技術（例えば、トランスフェクション、リポフェクチン、サイトフェクチン、粒子ビーズボンバードメント、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはウイルス感染）により宿主細胞へ導入され得る（例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。
【００９９】
ウイルス感染の場合において、目的のＤＮＡは、レトロウイルスを生成するために使用される２つのレトロウイルスＬＴＲの間のウイルスベクターへクローニングされ得、そしてウイルスで細胞を感染させ得る。本発明に従う有用な他のウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびワクシニアウイルスが挙げられる。
【０１００】
レポーター遺伝子産物の存在をアッセイするための方法は、当該分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子の転写から得られるｍＲＮＡをアッセイするための方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．），第２版；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第５版）。レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質をアッセイするための方法もまた公知であり、そしてこのタンパク質を測定するためのキットが会社から市販される（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１０１】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはそのバリエーション「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（含んでいる）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた完全なもの（ｉｎｔｅｇｅｒ）または完全なものの群の包含を暗に含むが、任意の他の完全なものまたは完全なものの群の排除が暗示されないことが理解される。
【０１０２】
本明細書中に記載される本発明は、より十分に理解され得るために、以下の実施例が記載される。これらの実施例は、例示目的にすぎず、そしていずれの様式においても本発明を制限すると見なされるべきではない。
【０１０３】
（実施例１：ＤＮＡベクターの構築）
（Ａ．材料）
（１）ベクター
プラスミドｐＶｇＲＸＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ｐＶｇＲＸＲは、改変エクジソンレセプター（ＶｇＥｃＲ）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）の両方を発現して、ヘテロダイマー核レセプターを形成する、８７２８ｋｂのベクターである（図１）。ＶｇＥｃＲ遺伝子の転写は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターにより駆動される。ＲＸＲ遺伝子の転写は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターにより駆動される。これらの遺伝子を発現する安定な細胞株は抗生物質ＺｅｏｃｉｎTMでの選択により作製され得る。ｐＶｇＲＸＲベクターおよびエクジソンシステムキットの特徴および維持管理に関する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用される。
【０１０４】
プラスミドｐＩＮＤは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た（図３）。プラスミドｐＩＮＤは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに基づいた５０２４ｂｐのベクターである。このベクターは、５つのハイブリッドＬＲＥ（すなわち、５つのエクジソン／グルココルチコイド応答エレメント（Ｅ／ＧＲＥ））および熱ショック最小プロモーターを有する。このＥ／ＧＲＥは、ｐＶｇＲＸＲから発現される改変エクジソンレセプターにより認識され得る。プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、別のプラスミドからのルシフェラーゼ遺伝子（コザック配列およびメチオニン開始部位を含む）を消化し、そしてｐＩＮＤのポリリンカー（すなわち、最小熱ショックプロモーターの下流）にこれをクローニングすることにより作製した（図３）。両方のプラスミドは、選択目的でネオマイシンおよびアンピシリンの耐性遺伝子を有する。ｐＩＮＤおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃベクターの特徴および維持管理に関する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用される。
【０１０５】
哺乳動物発現プラスミドｐＳＲαは、当該分野で記載されている（本明細書中に参考として援用される、Ｙ．Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，４６６−７２頁（１９８８））。このプラスミドは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターならびにヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）のＲセグメントおよび長末端反復のＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）の一部から構成されるプロモーター系を含む。プラスミドはまた、１６Ｓ スプライス接合部、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。ＨＴＬＶ ＬＴＲエンハンサー／プロモーター配列は、下流にクローニングされた遺伝子の高レベル発現を駆動する。目的の遺伝子を、１６Ｓ スプライス接合部に対して３’に位置づけされるＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし得る。
【０１０６】
（２）プライマー
ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２）は、ｐＶｇＲＸＲプラスミドのＶＰ１６コード領域の上流にあるＸｂａＩ部位にハイブリダイズするように設計された２８マーである。
【０１０７】
ＶＰ１６／５Ａ５ＢＲプライマー（配列番号１３）は、ｐＶｇＲＸＲプラスミドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖に一部ハイブリダイズするように設計された８６マーである。
このプライマーはまた、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部位およびＸｂａＩ部位についてのコード配列に相補的なヌクレオチドを含む。
【０１０８】
ＶＰ１６／５Ａ**５ＢＲプライマー（配列番号１４）はｐＶｇＲＸＲプラスミドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖に一部ハイブリダイズするように設計された９２マーである。このプライマーはまた、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部位についてのコード配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。しかし、５Ａ／５Ｂ切断部位をコードするＤＮＡはさらに、システインおよびセリンコドンをコードするＤＮＡ配列の間に６つのヌクレオチド挿入を有する。この６つのヌクレオチド挿入は、２つの停止コドンをコードする。
【０１０９】
ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）は、ＮＳ３コード領域（ＨＣＶポリペプチドにおけるアミノ酸番号１０２７〜１０３２に対応する）の開始部位に一部結合するように設計された４７マーである。このオリゴヌクレオチドの残余部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
【０１１０】
ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）は、ＮＳ４Ａコード領域（ＨＣＶポリペプチドにおけるアミノ酸番号１７０５〜１７１１に対応する）の３’末端に一部結合するように設計された４４マーである。このオリゴヌクレオチドの残余部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
【０１１１】
各プライマーを、オリゴヌクレオチド合成機を用いて、当該分野で公知の標準的条件下で合成した。
【０１１２】
Ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびクローニングストラテジー
ＰＣＲ反応を、標準の条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）で行った。
【０１１３】
（１）ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢベクターおよびｐＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ａベクター
ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（配列番号１９）をコードする発現ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２）、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＲプライマー（配列番号１３）およびｐＶｇＲＸＲプラスミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣＲ産物を、ＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、ＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消化したＰＣＲ挿入物を、この骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、この挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために配列決定することによりスクリーニングした。
【０１１４】
ＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ｂ（配列番号２１）をコードする発現ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２）、ＶＰ１６／５Ａ**５ＢＲプライマー（配列番号１４）およびｐＶｇＲＸＲプラスミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、ＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消化したＰＣＲ挿入物をこの骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、この挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために配列決定することによりスクリーニングした。
【０１１５】
（２）ｐＳＲα−ＮＳ３−４ＡおよびｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）
ＮＳ３−４Ａ切断部位をコードするｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａベクター（配列番号１０）を調製することに関する最初の工程は、ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）および全長ＨＣＶ Ｈ株ｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲ反応を包含した（本明細書中に参考として援用されるＩｎｃｈａｕｓｐｅら，（１９９１），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０２９２−１０２９６）。次いで、このＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲ１で消化することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そしてこのＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に連結した。
【０１１６】
ＮＳ３−４Ａ変異プロテアーゼをコードするｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）（Ｓ１１６５Ａ）ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）およびＮＳ３活性部位変異Ｓ１１６５ＡのｃＤＮＡを用いるＰＣＲ反応を包含した（本明細書中に参考として援用されるＡ．Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−４３）。次いで、このＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化することにより、ＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そしてＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に連結した。ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）は、アミノ酸番号１１６５でセリンからアラニンへの置換（これは、このプロテアーゼを不活性にする）を有する。配列番号１０と配列番号１１とを比較のこと。
【０１１７】
（実施例２：ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ エクジソン−誘導性ルシフェラーゼアッセイ）
ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ エクジソン−誘導性ルシフェラーゼアッセイを、一般に、以下に記載の通り行った。
【０１１８】
ＣＯＳアフリカミドリザル腎臓細胞を、約１５０，０００細胞／ウェルで、６ウェルプレート中にプレートした。翌日、約３．６μｇのプラスミドＤＮＡを、２９μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）と合わせたダルベッコ改変イーグル培地−Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＤＭＥＭ）１００μｌ中に溶解し、次いで、ピペッティングして混合した。この混合物を、室温で１０分間インキュベートした。
【０１１９】
各実験で代表的に使用されたＤＮＡの量は、以下のとおりである：０．６μｇのｐＩＮＤ−Ｌｕｃ、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢもしくはｐＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ｂ、および０〜２．４μｇのｐＳＲα−ＮＳ３−４ＡもしくはｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）もしくはｐＳＲα。
【０１２０】
次いで、ｖ／ｖ １０％ ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）６００μｌを、ＤＮＡ混合物に添加し、そしてピペッティングして混合した。６ウェルプレート中の細胞を、２．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。このＰＢＳを細胞から取り除き、そしてＤＮＡ混合物と置き換えた。この細胞を、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、ＤＮＡ混合物中、３７℃で３時間インキュベートした。
【０１２１】
インキュベーション後、この細胞をＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを取り除き、そして細胞に１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを添加した。この細胞を、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１２２】
その翌日、外因性リガンドをこの細胞に添加して、レポーター遺伝子の転写を誘導した。具体的には、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを細胞から吸引し、そして１〜１０μＭ ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａまたは１〜１０μＭ ポナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の濃度を含む１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ溶液と置き換えた。いくつかの場合には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解したプロテアーゼインヒビターもまた１〜４０μＭの終濃度で細胞に添加した。細胞をムリステロンＡまたはポナステロンＡとともに、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１２３】
翌日、細胞をＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼタンパク質の活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。具体的には、細胞を２５０μｌの細胞培養物溶解試薬で溶解した。これらの細胞をプレートから掻き取り、そして微量遠心チューブに移した。抽出物を、１２，０００×ｇで５秒間遠心分離した。２０μｌの各サンプルを、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬に添加した。ルシフェラーゼと試薬との反応によって生じた光を、ルミノメーターで測定し、そして相対的光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ；ＲＬＵ）として報告した。
【０１２４】
実験のほとんどを、三連で数回行った。データ点の標準偏差を反映するエラーバーは、図面に中に含まれている。
【０１２５】
（実施例３：活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間の５Ａ／５Ｂ接合部の挿入は、ムリステロンＡ誘導トランス活性化を妨げない）
融合タンパク質（ＶｇＲＸＲ、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢまたはＶｇＲＸＲ−５Ａ（Ｓｔｏｐ）５Ｂ）ならびにｐＩＮＤ−Ｌｕｃをコードするベクターを、上記（実施例２）に記載されるように、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。翌日に、これらの細胞のいくつかを、１μＭのムリステロンとともに２４時間インキュベートした。この細胞を溶解し、そして以前に記載されたようにルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図４に示す。
【０１２６】
ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（Ｓｔｏｐ）５Ｂ（これは、エクジソンＤＮＡ結合ドメインを欠く）によって発現されたコントロール融合タンパク質は、ごくわずかな活性を示す。ＶｇＲＸＲおよびＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ発現融合タンパク質の活性の間には、ほとんどまたは全く差異がなかった。これらの結果は、ＶｇＲＸＲ発現タンパク質における５Ａ／５Ｂ接合部の挿入が、ムリステロンＡが誘導した活性を妨げないことを示す。
【０１２７】
（実施例４：漸増量のｐＳＲαＮＳ３−４ＡとｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂとの同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス活性化の用量依存減少を導く）
レポータープラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、図５に示されるように、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢまたはｐＶｇＲＸＲのいずれかと、プロテアーゼＮＳ３−４ＡをコードするＤＮＡの漸増量（μｇ）とともに同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を、１μＭ ムリステロンＡとともにインキュベートした。次いで、細胞を溶解し、以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図５に示す。
【０１２８】
哺乳動物ＲＸＲおよびエクジソンレセプター／ＶＰ１６融合タンパク質をコードするＶｇＲＸＲ構築物で同時トランスフェクトした場合のルシフェラーゼレポーター構築物の転写は、プロテアーゼＮＳ３−４Ａで同時発現させた場合と、ほとんどまたは全く変化しないことを示した。対照的に、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂコードタンパク質は、ＮＳ３−４Ａタンパク質で同時発現させた場合、ルシフェラーゼ活性の用量依存的減少を生じた。これらの結果は、プロテアーゼＮＳ３−４Ａが、５Ａ／５Ｂ接合部を切断するが、活性に必要な融合タンパク質の他の領域を切断しないことを示唆する。
【０１２９】
（実施例５：漸増量のｐＳＲαＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）とｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂとの同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス活性化に影響を及ぼさない）
本発明者らは、図６に示すように、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂおよび０．６μｇのｐＩＮＤ−Ｌｕｃを用いて、ＮＳ３プロテアーゼまたはそれらの不活性変異体をコードする可変量（μｇ）のベクターで同時トランスフェクトした。各トランスフェクションに使用したＤＮＡの総量は、ｐＳＲαと足して３．６μｇであった。翌日に、細胞を１μＭのムリステロンＡ中でインキュベートした。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図６に示す。
【０１３０】
前の結果においてみられるように（実施例４）、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂによってコードされるこの融合タンパク質は、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの非存在下で高レベルの活性を示した。ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ媒介ルシフェラーゼ活性の活性は、変異型プロテアーゼＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）をコードするＤＮＡではなく、ＮＳ３−４ＡプロテアーゼをコードするＤＮＡでの同時トランスフェクションに伴う用量依存性様式で減少した。これは、おそらく、変異体ＮＳ３−４Ａプロテアーゼがエクジソン／ＶＰ１６融合タンパク質を切断できないことに起因する。
【０１３１】
実施例４および５のような用量依存研究は、融合タンパク質をコードするＤＮＡと、将来のアッセイにおいて使用するためのプロテアーゼをコードするＤＮＡとの最適比を決定するために有用であった。
【０１３２】
（実施例６：ポナステロンＡ用量応答）
プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３−４Ａの非存在下または存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）とともに同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を可変量のポナステロンＡ、エクジソンレセプターと哺乳動物レチノイン酸レセプター（ＲＸＲ）とのヘテロダイマー化を誘導するリガンドとともにインキュベートした。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図７に示す。
【０１３３】
この結果は、ポナステロンＡが、プロテアーゼＮＳ３−４Ａの非存在下で融合タンパク質ＥｄＲ５Ａ／５Ｂ（すなわち、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂによってコードされるタンパク質）を活性化するにおいて有効であることを示す。これらの実験の目的については、ポナステロンＡが３．３〜１０μＭの間の濃度で存在した場合に、融合タンパク質の最も大きな活性化が生じた。一般には、ポナステロンＡは、これらのアッセイにおいて転写を誘導するにおいてムリステロンＡと等しく有効であることが分かった。
【０１３４】
（実施例７：ポナステロンＡ誘導および％ＤＭＳＯ制御）
プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３−４Ａの存在下または非存在下で、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と同時トランスフェクトした。翌日、細胞を５μＭ ポナステロンＡとともにインキュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、０〜１％ ＤＭＳＯの終濃度（ｖ／ｖ）まで細胞に添加した。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図８に示す。
【０１３５】
このコントロール実験において、ＤＭＳＯを細胞に加えて、その存在が、ポナステロンＡによる融合タンパク質の活性化を妨げるか否かを決定した。ＤＭＳＯは、これらのアッセイに添加する前に、プロテアーゼインヒビター化合物を溶解するためにときおり使用された溶媒である。大部分の実験で、細胞培養物中のＤＭＳＯ濃度は、０．１％を超えなかった。これらの結果は、１％までのＤＭＳＯ濃度が、このアッセイにおいてポナステロンＡ誘導ルシフェラーゼ活性に対する影響をほとんどまたは全く有さないことを示す。
【０１３６】
以下の実施例は、プロテアーゼのインヒビターとして潜在的に有用な化合物をスクリーニングするために、このアッセイがどの程度有用であり得るかを示す。
【０１３７】
（実施例８：ＶＲＴ−２５，５３１によるＮＳ３−４Ａ活性の用量依存的阻害）
プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３−４Ａ（１：３の比）の存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を、図９に記載されるように、５μＭ ポナステロンＡおよび可変量の化合物ＶＨ−２５５３１とともにインキュベートした。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図９に示す。
【０１３８】
この結果は、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの非存在下でのＶＨ−２５５３１が融合タンパク質の活性を有意には増加も減少もさせないことを示す（図９のレーン１および３を比較のこと）。しかし、ＶＨ−２５５３１は、特に２０μＭでＮＳ３−４Ａプロテアーゼの活性を阻害しない。（請求項２に伴うレーン４〜１１（図９）を比較のこと）。事実、これらの結果は、ＶＨ−２５５３１が、２０μＭ濃度で、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼを５５．５％ほど阻害し得ることを示す。２０μＭ ＶＨ−２５５３１でのプロテアーゼ活性の阻害％を、レーン３の値からレーン２の値を差し引くこと（１９９００−５１７７＝１４７３２）、レーン４の値からレーン２の値を差し引くこと（１３３５６−５１７７＝８１７９）、次いで、２つの値を用いて除算すること（８１７９／１４７２３＝０．５５５）により概算した。
【０１３９】
本発明者らは、本明細書中前記に本発明の多くの実施態様を提示したが、本発明者らの基本的な構築物が、本発明の方法を利用する他の実施態様を提供するように改変され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲が、本明細書中で例示される特定の実施態様ではなく、むしろ特許請求の範囲および明細書により規定されるべきことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ベクターｐＶｇＲＸＲ、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ、およびｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂの構造を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂにコードされるタンパク質のシステインとセリンとの間に位置するバックスラッシュは、切断が生じる場所を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂにコードされるタンパク質の切断部位付近の２つのアスタリスクは、２つの停止コドンの位置を示す。
【図２】 図２は、ＨＣＶ ＮＳ３−４ＡプロテアーゼをコードするＤＮＡベクターであるｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａの構造を示す。
【図３】 図３は、コントロールベクターｐＩＮＤおよびエクジソン誘導性ルシフェラーゼ発現のためのレポーターベクターであるｐＩＮＤ−ｌｕｃの構造を示す。用語「５ＸＥ／ＧＲＥ」とは、エクジソン／グルココルチコイド応答エレメントをいう。用語「ＰΔＨＳＰ」とは、熱ショック最小プロモーターをいう。用語「ＢＧＨ ｐＡ」とは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをいう。
【図４】 図４は、以下のいずれか１つを用いるＣＯＳ細胞へのトランスフェクション実験の結果をグラフで示す：（１）哺乳動物ＲＸＲレセプタータンパク質、および単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ）の活性化ドメインに融合されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター；（２）ＲＸＲレセプタータンパク質、およびＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ）の活性化ドメインに融合されたＨＣＶの５Ａ／５Ｂタンパク質分解性切断部位に融合されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター；ならびに（３）ＲＸＲレセプタータンパク質、および上記の融合タンパク質（５Ａ／５Ｂ切断部位をコードするＤＮＡが、その切断部位におけるタンデム停止コドンを含むように改変されていることを除く）をコードするＤＮＡベクター（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂ）。ルシフェラーゼレセプター遺伝子を含むプラスミドを、各トランスフェクションにおいて含ませた（ｐＩＮＤ−ｌｕｃ）。トランスフェクション後、レポーター遺伝子の転写を、１μＭのミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（エクジソンアナログ）をトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。このデータを、実施例１に記載のように、トランスフェクトした細胞からの溶解物に存在するルシフェラーゼ活性を測定することによって得た。
【図５】 図５は、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする漸増量のプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）または漸増量のコントロールプラスミド（ｐＳＲα）を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果を示す。トランスフェクション後、レポータープラスミドの転写を、１μＭのミュリステロンＡをトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。
【図６】 図６は、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする漸増量のプラスミドまたは漸増量のその不活性変異体（それぞれ、ｐＳＲαＮｓ３−４ＡまたはｐＳＲα３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ））を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果をグラフで示す。トランスフェクション後、レポーター遺伝子の転写を、１μＭのミュリステロンＡをトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。
【図７】 図７は、１、３．３、１０、３３または１００μＭのいずれかのポナステロンＡ（エクジソンアナログ）を、ＨＣＶ−ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードするプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）の存在下または非存在下でプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃで同時トランスフェクトした後のＣＯＳ細胞に投与した結果をグラフで示す。
【図８】 図８は、ＤＭＳＯ寛容性を実証するコントロール実験の結果をグラフで示す。プラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、ＨＣＶ−ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードするプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）ありまたはなしで、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、レポータープラスミドの転写を、漸増濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で５μＭのポナステロンＡを投与することによって誘導した。
【図９】 図９は、プラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ、ｐＩＮＤ−ＬｕｃおよびｐＳＲαＮＳ３−４ＡをＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトし、次いで５μＭのポナステロンＡおよび変動量のプロテアーゼインヒビター（ＶＨ−２５５３１）を投与した結果をグラフで示す。
【配列表】
（発明の分野）
本発明は、融合タンパク質、その融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにプロテアーゼ活性を測定するためにそれらを使用するための方法およびキットに関する。詳細には、本発明は、プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質に関し、ここで、（１）この融合タンパク質のリガンド結合ドメインとのリガンドの結合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるリガンド応答エレメント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介し；そしてここで、（２）この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここで、この発現モジュレータードメインは、レポーター遺伝子の転写を調節する。本発明はまた、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、適切なリガンド、ならびにプロモーター−レポーター遺伝子構築物およびこの融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインによって認識される少なくとも１つのＬＲＥを含むＤＮＡ分子を含む、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットに関する。これらのキット中のＤＮＡ分枝は、単離されうるか、または宿主細胞中に存在し得る。
【０００２】
（発明の背景）
プロテアーゼは、細菌からウイルスそして哺乳動物までのほとんど全ての生存形態における生物学的プロセスの調節において、重要な役割を果たす。プロテアーゼは、例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫応答の活性化、酵素原活性化、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク質輸送において、重要な機能を果たす。
【０００３】
プロテアーゼは、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、気腫、高血圧、腫瘍の浸潤および転移、ならびにウイルス関連疾患のような、いくつかの疾患の要因または原因として関連付けられている［例えば、Ｋｉｍ，Ｔ．Ｗ．ら、（１９９７）「Ａｌｔｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｅｓｉｎｉｌｉｎｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｔｏｓｉｓ ｂｙ ａ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：３７３−６；Ｌａｃａｎａ，Ｅら、（１９９７）「Ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１ ｂｅｔａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｄ−３ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｙ ＡＬＧ−２ ａｎｄ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｇｅｎｅ ＡＬＧ−３」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８；５１２９−３５；Ｂｉｒｒｅｒ、Ｐ．，（１９９５）「Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｎｓｉｄｅａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ６２：２５−８；Ｐａｔｅｌ，Ｔ．ら、（１９９６）「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１０：５８７−９７］。
【０００４】
いくつかのウイルスゲノムもまた、ウイルス成熟プロセスにおいて重要であるプロテアーゼをコードする。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のウイルスアスパルチルプロテアーゼは、Ｇａｇポリタンパク質およびＰｏｌポリタンパク質を含むＨＩＶポリペプチドを切断する。
【０００５】
別の例において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、長いポリペプチド翻訳産物である、ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨを生成し、これは、切断されて少なくとも１０タンパク質を生成する。Ｃ、Ｅ１およびＥ２は、推定構造タンパク質であり、そして残りは、非構造（ＮＳ）タンパク質として公知である。これらのタンパク質のうちの１つは、セリンプロテアーゼ活性を有する７０キロダルトンのタンパク質である、ＮＳ３である。ＮＳ３のプロテアーゼ活性は、この酵素のＮ末端の１８０アミノ酸中に唯一存在することが示されている。ＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶポリペプチド（３／４Ａ、４Ａ／４Ｂ、４Ｂ／５Ａ、および５Ａ／５Ｂ）の非構造領域における４つの部位で切断する。別のタンパク質であるＮＳ４Ａは、５４アミノ酸を有し、そしてＮＳ３プロテアーゼの補因子として特徴付けられている［Ｃ．Ｆａｉｌｌａら、（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：３７５３−３７６０］。ＮＳ４ＡのＣ末端の３３アミノ酸は、３／４Ａ部位および４Ｂ／５Ａ部位での切断に必要であり、そして５Ａ／５Ｂ部位での切断速度を加速する。いくつかの他のＮＳ３セリンプロテアーゼ依存性切断部位配列は、ＨＣＶの種々の株において同定されている［Ａ．Ｇｒａｋｏｕｉら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−２８４３（本明細書中に参考として援用される）］。
【０００６】
ウイルスプロテアーゼ、細胞性プロテアーゼ、または微生物プロテアーゼの活性を、迅速かつ簡単なアッセイにおいて検出するための能力は、これらのプロテアーゼの生化学的特徴付け、ウイルス感染の検出、ならびに潜在的なインヒビターのスクリーニングおよび同定において重要である。
【０００７】
いくつかのプロテアーゼアッセイは、当該分野で公知である。Ｔ．Ａ．Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５１５９−６２頁（１９９１）；Ｂ．Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４１５９−６２（１９９２）；およびＭ．Ｇ．Ｍｕｒｒａｙら、Ｇｅｎｅ、１３４、１２３−１２８頁（１９９３）の各々は、酵母ＧＡＬ４タンパク質を利用するプロテアーゼアッセイ系を記載する。これらの文献の各々は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を挿入することを記載する。共発現されたプロテアーゼによるこの部異の切断は、ＧＡＬ４を転写不活性化にし、これは、この形質転換された酵母がガラクトースを代謝することを不可能にさせる。
【０００８】
Ｙ．Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２５，１１３−１２０頁（１９９５）は、ＨＣＶプロテアーゼ活性を検出するためのアッセイを記載する。このアッセイにおいて、基質、ＨＣＶプロテアーゼおよびレポーター遺伝子が、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトされる。この基質は、（ＨＣＶ ＮＳ２）−（ＤＨＦＲ）−（ＨＣＶ ＮＳ３切断部位）−Ｔａｘ１からなる融合タンパク質である。このレポーター遺伝子は、ＨＴＬＶ−１長末端反復配列（ＬＴＲ）の制御下のクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であり、発現後にその細胞核に存在する。未切断の基質は、ＨＣＶ ＮＳ２部分に起因する小胞体の表面上の膜結合タンパク質として発現される。切断の際に、放出されるＴａｘ１タンパク質は、核に移行し、そしてＨＴＬＣ−１ ＬＴＲに結合することによってＣＡＴ発現を活性化する。プロテアーゼ活性は、細胞溶解物中のＣＡＴ活性を測定することによって決定される。
【０００９】
上記のアッセイの各々は、（１）活性プロテアーゼおよび基質の発現、ならびに（２）レポーター遺伝子構築物の転写を、同時に必要とする。これらのアッセイの構成的性質はしばしば、制御不可能な、所望しない効果を生じ得る。これらの効果は、このプロテアーゼの活性に関わる、誤誘導されたか、または不適切な結論を生じ得る。従って、誘導性であるか、または使用者によって容易に制御され得る、高感度かつ定量的なプロテアーゼアッセイの必要性が存在する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、プロテアーゼの活性を測定するための融合タンパク質リガンド依存性転写アッセイにおいて有用な、新規な融合タンパク質、その融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞を提供することによって、この必要性を満たす。
【００１１】
この新規な融合タンパク質は、プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインをを含み、ここで、（１）リガンドの、この融合タンパク質のリガンド結合ドメインとの結合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるＬＲＥへの結合を媒介し；そしてここで、（２）この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と結合し、ここで、この発現モジュレータードメインは、このレポーター遺伝子の転写を調節する。
【００１２】
本発明の方法に従って、未切断の融合タンパク質のリガンド結合ドメインへのリガンドの結合は、別々の時点で、このレポーター遺伝子の転写活性化または抑制を開始する。この誘導可能性は、このアッセイをより良好に制御されるものにし、従って、より正確な結果を生じる。
【００１３】
プロテアーゼ切断部位でのこの融合タンパク質の切断は、この発現モジュレータードメインが転写をポジティブまたはネガティブに調節することを妨げることによって、このレポーター遺伝子に転写を調節解除する。切断された融合タンパク質の量は、レポーター遺伝子のトランス活性化における増加または減少をアッセイすることによって定量され、このレポーター遺伝子の発現は、この融合タンパク質の発現調節ドメインによって調節されるプロモーターによって駆動される。
【００１４】
本発明はまた、プロテアーゼに対する化合物の阻害活性を測定するための方法に関し、この方法は、その活性が試験される化合物の存在下または非存在下で融合タンパク質をプロテアーゼとともにインキュベートする工程、そのインキュベーションにリガンドを添加する工程、およびレポーター遺伝子から生成された遺伝子産物を定量する工程を包含する。
【００１５】
本発明のなお別の実施態様は、２つのプロテアーゼまたは同じ切断部位を認識するプロテアーゼの変異体の活性を比較するための方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットに関し、このキットは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、そのＤＮＡ分子を含む融合タンパク質または宿主細胞を含み、ここでこのキットは、必要に応じて、プロテアーゼをコードするＤＮＡ分子、その発現がその融合タンパク質によって調節されるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ分子、その融合タンパク質に会合し、その活性を調節するリガンド、およびこのキットを使用するための説明書を備える。好ましくは、キット中のＤＮＡ分子は、その発現を可能にするベクターに操作されている。本発明に従うキットは、以下からなる群から選択される、単一宿主細胞に形質転換される以下のＤＮＡ分子のいずれか１つまたは全てを含み得る：本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、プロテアーゼをコードするＤＮＡ分子、融合タンパク質についてのタンパク質結合パートナーをコードするＤＮＡ分子、およびプロモーター−レポーター遺伝子構築物を含むＤＮＡ分子。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プロテアーゼ活性を測定するための新規なツールおよび方法を提供する。プロテアーゼの活性は、転写アッセイにおいて、基質として新規な融合タンパク質を使用することによって測定され、ここで転写は、プロテアーゼおよび本発明の融合タンパク質がともにインキュベートされた後に、リガンドの添加により、不連続の時点にて活性化または抑制される。
【００１８】
本発明は、以下を含む融合タンパク質を提供する：プロテアーゼ切断部位、リガンド結合ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメイン、ここで（１）リガンドとこの融合タンパク質のリガンド結合ドメインとの会合は、この融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたリガンド応答エレメント（「ＬＲＥ」）への結合を媒介する；そしてここで、この融合タンパク質は、発現モジュレータードメインを含むか、または発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質と会合し、ここでこの発現モジュレータードメインは、レポーター遺伝子の転写を調節する。
【００１９】
本発明に従うプロテアーゼ切断部位（本明細書中以後、「ＰＣＳ」）は、本発明の融合タンパク質の一次配列に組み込まれたペプチドである。この部位は、タンパク質の任意のＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または必要に応じて、発現モジュレータードメイン（存在する場合）に、そして任意の２つのこれらのドメインの間に位置し得る。
【００２０】
タンパク質における切断部位の存在は、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、または発現モジュレータードメイン（存在する場合）の活性を実質的に妨害しないべきである。
【００２１】
プロテアーゼ切断部位が、融合タンパク質の上記のドメインの活性を実質的に妨害しないことを確実にするために、ＰＣＳを有する融合タンパク質の活性を、ＰＣＳを有しない同じ融合タンパク質の活性と、ＤＮＡ結合を評価するためのゲルシフトアッセイまたは転写アッセイによって比較し得る（例えば、Ｄ．Ｌａｔｃｈｍａｎ，（１９９５）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００２２】
また、プロテアーゼ切断部位は、切断した場合に、得られる融合タンパク質フラグメントは標的遺伝子の発現もレポーター遺伝子の発現も調節し得ないように、融合タンパク質に操作されるべきである。
【００２３】
好ましくは、融合タンパク質基質内に位置する標的プロテアーゼ切断部位が１つのみ存在する。
【００２４】
好ましい実施態様に従って、プロテアーゼ切断部位は、ＤＮＡ結合ドメインと、融合タンパク質のエフェクターモジュレータードメインとの間に位置する。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＩＶ ｇａｇおよびｇａｇ／ｐｏｌポリタンパク質またはＨＣＶタンパク質タンパク質においてプロセシング／プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を有する。本発明のより好ましい実施態様において、ＨＩＶ ＰＣＳ部位は、配列番号１〜１０からなる群より選択される（Ｓ．Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら、（１９８９）「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＩＶ１ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ｍｙｒｉｓｔｙｌａｔｅｄ ｇａｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３２４−３３７を参考として援用する）。本発明のより好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼまたはＨＩＶアスパルチルプロテアーゼについての切断部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおより好ましい実施態様において、ＰＣＳは、ＨＣＶ ５Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を有する。本発明のなおより好ましい実施態様において、５Ａ／５Ｂプロテアーゼ切断部位は、配列番号１０である。
【００２６】
本発明の融合タンパク質の次の部分は、リガンド結合ドメイン（本明細書中以後、「ＬＢＤ」）である。ＬＢＤは、リガンドに結合するペプチドドメインであり、ここでこのリガンド結合は、この融合タンパク質が、（１）ＬＲＥに結合する（ここで、このエレメントは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される）；および／または（２）ＬＲＥに対する得られる融合タンパク質−タンパク質結合パートナー複合体の結合の前の中間工程として、タンパク質結合パートナーに結合するために必要とされる。従って、融合タンパク質リガンド結合ドメインへのリガンド結合は、このレポーター遺伝子の発現の転写調節に必須である。
【００２７】
本発明における使用に適切なリガンド結合ドメインは、リガンド結合の際に転写を開始または抑制する転写因子のリガンド結合ドメインに由来し得る。このような転写因子としては、以下が挙げられる：ホルモンレセプター（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｌ．Ｐ．，１９９８、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ；Ｔｓａｉ，Ｍ−Ｊ．，１９９４、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ａｕｓｔｉｎ：Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏ．；Ｅｇｇｅｒｔ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１３１−１５６頁；Ｐｉｅｄｒａｆｉｔａ，Ｆ．Ｊ．およびＭ．Ｐｆａｈｌ，「Ｔｈｅ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１５７−１８５頁；Ｋｅａｖｅｎｅｙ Ｍ．およびＨ．Ｇ．Ｓｔｕｎｎｅｂｅｒｇ，「Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、第２巻（１９９５）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、１８７−２４２頁（これらの各々を、本明細書中で参考として援用する）；炭水化物応答性転写因子；メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子；オーファンレセプター；テトラサイクリン誘導性転写因子；ＩＰＴＧ誘導性転写因子；ダイオキシンレセプター；およびアリール炭水化物レセプター。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様において、リガンド結合ドメインは、ステロイド／甲状腺ホルモンレセプタースーパーファミリーのリガンド結合ドメインに由来する。ステロイドおよび核レセプターリガンド結合ドメインをコードするアミノ酸配列は、当該分野で周知である（例えば、Ｓ．Ｓｉｍｏｎｓ，（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書中で参考として援用する）を参照のこと）。より好ましい実施態様において、リガンド結合ドメインは、エクジソンレセプターに由来する。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様において、転写因子由来のリガンド結合ドメインは、異なるリガンドに結合するように、本発明の融合タンパク質において改変され得る。例えば、ヒトプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインは、抗プロゲステロン化合物ＲＵ４８６（Ｗａｎｇ，Ｙ．ら、（１９９７）「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４：４３２−４１（その開示を、本明細書中で参考として援用する））を結合し得るように変異され得る。このようなＲＵ４８６誘導性ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質は、本発明における使用が意図される。
【００３０】
ＤＮＡ結合ドメイン（本明細書中以後、「ＤＢＤ」）とは、特定のヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡエレメントまたはＬＲＥ）を認識し、かつそれに結合する、本発明に従う融合タンパク質におけるペプチド配列をいう。本発明に従って有用なＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）のＤＮＡ結合ドメインに由来し得る。
【００３１】
好ましい実施態様において、これらのＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡを直接結合しかつ転写を開始または抑制する転写因子である。このような転写因子は、当該分野で周知である（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．およびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９２、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，１９９５、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版；Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．，１９９３，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｐａｐａｖａｓｓｉｌｉｏｕ，Ａ．，（１９９７）「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ，１９９７，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１１巻、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（これらの開示を、本明細書中で参考として援用する）。
【００３２】
本発明における使用が意図される好ましいＤＮＡ結合ドメインとしては、以下の転写因子のＤＮＡ結合ドメインが挙げられる：ホメオボックスタンパク質、ジンクフィンガータンパク質（Ｓｌｕｙｓｅｒ，Ｍ．，１９９３，Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ：ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ロイシンジッパータンパク質（例えば、Ｈｕｒｓｔ、Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，第３版、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ＧＡＬ４タンパク質、ホルモンレセプター、オーファンレセプター、およびＥ．ｃｏｌｉ転写因子（例えば、ラクトースオペロンリプレッサー）、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター、およびＦａｄＲ。
【００３３】
本発明はまた、メタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子の転写を調節する金属結合ＤＮＡ結合タンパク質のＤＢＤの使用を意図する。このような金属結合ＤＮＡ結合タンパク質としては、ＭＴＦ−１、ＡＣＥ１、およびＡＭＴ１が挙げられる（Ｈｅｕｃｈｅｌ，Ｒ．ら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔａｌｓ，Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ Ｇｅｎｅｓ」、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，第１巻（１９９５）Ｂｒｉｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ．Ｐ．Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ編、２０６−２４０頁）。
【００３４】
本発明の好ましいより実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、レセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーから得られる。レセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーは、リガンド依存性転写因子として機能するホルモン結合タンパク質として当該分野で公知である。そのメンバーとしては、特異的天然のリガンドがまだ同定されていないレセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーの同定されたメンバーが挙げられる（本明細書中で「オーファンレセプター」といわれる）（Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１９９８）「Ｏｒｐｈａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｌｉｇａｎｄｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３０５頁）。
【００３５】
本発明における使用に有用なオーファンレセプターのメンバーとしては、ＨＮＦ４、ＣＯＵＰファミリーのレセプターおよびＣＯＵＰ様レセプター、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＲＡＲ）、昆虫に由来するＫｎｉｒｐｓおよびＫｎｉｒｐｓ関連レセプター、ならびにそれらの様々なアイソフォームが挙げられる。
【００３６】
このようなＤＢＤをコードするアミノ酸配列は、当該分野で周知である（Ｆ．Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ，（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．（この開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００３７】
本発明の融合タンパク質において使用されるＬＢＤと同様に、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、ソース転写因子に存在する配列から、異なるＬＲＥを認識するように改変され得る。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーメンバーのＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインが別のステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーによって認識されるＬＲＥに結合するように改変され得る。例えば、ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーの「Ｐボックス」アミノ酸配列（すなわち、代表的には、第１のジンクフィンガーとリンカー領域との接合部に位置するＤＮＡ結合ドメインにおける領域）の改変が、本発明によって意図される（Ｕｍｅｓｏｎｏら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７：１１３９−１１４６、特に図２および表１；この開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００３８】
好ましい実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターに由来し、ここでアミノ酸配列ＥＧＣＫＧ（配列番号２３）を有するエクジソンレセプターのＰボックスは、アミノ酸配列ＧＳＣＫＶ（配列番号２４）と置換される。新たなＰボックス配列ＧＳＣＫＶは、エクジソンレセプターにＬＲＥ−ＡＧＧＴＣＡ−の代わりにＬＲＥ−ＡＧＡＡＣＡを認識させる。
【００３９】
本発明の融合タンパク質のＬＢＤおよび／またはＤＢＤを提供するに特に有用なレセプターのステロイド／甲状腺スーパーファミリーのメンバーとしては、以下のようなステロイドレセプターが挙げられる：グルココルチロイドレセプター（ＧＲ）、ミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）；エストロゲンレセプター（ＥＲ）；ｈＰＲ−ＡまたはｈＰＲ−Ｂのようなプロゲステロンレセプター（ＰＲ）；アンドロゲンレセプター（ＡＲ）；ビタミンＤ３レセプター（ＶＤＲ）；レチノイン酸レセプター（例えば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、またはＲＡＲγ）およびレチノイドＸレセプター（例えば、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、またはＲＸＲγ）のようなレチノイドレセプター；ＴＲαおよびＴＲβのような甲状腺レセプター（ＴＲ）；エクジソンレセプターのような昆虫に由来するレセプター；ならびにそれらのアイソフォーム。
【００４０】
１つの好ましい実施態様に従って、本発明の融合タンパク質は、リガンド結合ドメインの付近もしくは隣に操作されるＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてこの２つのドメインはいずれもＰＣＳを含まず、この２つのドメイン間に位置するＰＣＳでもない。
【００４１】
本発明の融合タンパク質の任意成分は、発現モジュレータードメインである。上記のように、発現モジュレータードメインが融合タンパク質上に存在しない場合、発現モジュレータードメインは、融合タンパク質と会合するタンパク質上に存在しなければならない。
【００４２】
本発明における使用が意図される発現モジュレータードメイン（融合タンパク質の一部または融合タンパク質と会合する別のタンパク質のいずれかとして）は、代表的には、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）に由来する。これらの配列は、転写に必要な他の転写因子との相互作用を介して、転写を活性化または抑制することが、当該分野で公知である。
【００４３】
発現モジュレータードメインが融合タンパク質に結合する第２のタンパク質内に存在する実施態様において、その第２のタンパク質は、本発明の融合タンパク質およびそのリガンドの非存在下で転写を増加または減少させるべきである。発現モジュレータードメインが融合タンパク質内に存在する実施態様において、発現モジュレータードメインは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインの位置と反対の末端に配置される。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、発現モジュレータードメインは、その活性を抑制するのとは反対に、転写を活性化する。このような活性化ドメインとしては、以下が挙げられる：ステロイド／甲状腺スーパーファミリーのレセプターにおいて活性化ドメインをコードするＮ末端領域、ウイルス転写因子の活性化ドメイン、酵母ＧＣＮ４活性化ドメインまたはＧＡＬ４活性化ドメイン（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ，「Ｙｅａｓｔ ＧＣＮ４ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、８３３−８５９頁；Ａ．Ａ．Ｆ．Ｇａｎｎら、「ＧＡＬ１１，ＧＡＬ１１Ｐ，ａｎｄ ｔｈｅ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＬ４」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、９３１−９４６頁；Ｋ．Ｊ．ＭａｒｔｉｎおよびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｅａｒｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｈｅｍｅ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、６９５−７２５頁；これらの開示を本明細書中で参考として援用する）。
【００４５】
別の好ましい実施態様では、この発現調節ドメインは、融合タンパク質の一部である。ましてなおさら好ましいのは、発現調節ドメインが、ＶＰ１６タンパク質のＮ末端活性化ドメインである場合である。
【００４６】
リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび発現モジュレータードメインが、同じ転写因子に由来する必要がないことが理解されるべきである。
【００４７】
例えば、レチノイン酸レセプターのＤＮＡ結合ドメイン、およびビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）のリガンド結合ドメインを含むキメラが、作製され得る（Ｐｅｍｒｉｃｋ，Ｓ．，ら、（１９９８）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＡＲα／ＶＤＲ」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：５５４−５６２）か、またはＪｕｎ ＤＮＡ結合ドメインを含むキメラは、エストロゲンレセプターリガンド結合ドメインおよび発現モジュレーター活性化ドメインに融合され得る（Ｋｒｕｓｅ，Ｕ．ら、（１９９７）「Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ Ｊｕｎ−Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｈｉｍｅｒａ」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：１２３９６−１２４００）。
【００４８】
他の例は、ｌａｃＲ ＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６活性化ドメインとの融合を含む。これは、ＬＲＥ、ｌａｃＯに結合するためにＩＰＴＧを必要とする融合タンパク質を作製する［Ｌａｂｏｗ，Ｍ．ら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６］。別の例では、ｔｅｔＲタンパク質とＶＰ１６活性化ドメインとの融合は、細胞中およびトランスジェニック動物中においてテトラサイクリンの存在下で、ＬＲＥ、ｔｅｔＯから放出する融合タンパク質を作製する［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，（１９９２）［Ｔｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、（１９９４）「Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ ｂｙ ａ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：９３０２−９３０６］。本発明に従うｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質は、そのＤＮＡ結合ドメイン中にプロテアーゼ切断部位を含み得る。その結果、ＰＣＳが切断される場合に、ＤＮＡ結合が排除される。従って、テトラサイクリンの添加の際に、未切断融合タンパク質は、ｔｅｔＯからトランス活性化し続け、一方切断された融合タンパク質は、不活化する。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様は、単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６活性化ドメインと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーのリガンド結合ドメインと、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーのＤＢＤとの融合である。より好ましい実施態様では、ステロイド／甲状腺レセプタースーパーファミリーのメンバーは、エクジソンレセプターである。
【００５０】
上記のように、本発明はまた、ＤＮＡを結合するために、あるいはそのＬＲＥへの融合タンパク質の結合の特異性または結合の親和性を増加させるために、タンパク質結合パートナー（「ＰＢＰ」）との接触を必要とする融合タンパク質を意図する。従って、本発明に従うタンパク質結合パートナーは、本発明の融合タンパク質に結合し、そして融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインの結合の特定のＬＲＥへの親和性または特異性を増加させるタンパク質である。タンパク質結合パートナーは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される特定のＤＮＡエレメントにもまた結合するタンパク質である。本発明の融合タンパク質が、ＤＮＡ結合の親和性または特異性を増加させるためにタンパク質結合パートナーを必要とする場合、それは、融合タンパク質がＰＢＰと相互作用するために二量体化ドメインを含むことを保証することが望ましい。
【００５１】
本発明の融合タンパク質の二量体化ドメインと相互作用するために適切であり得るタンパク質結合パートナーは、当該分野で公知である。「例えば、Ｔ．Ｄ．ＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄおよびＧ．Ｉ．Ｅｖａｎ（１９９８）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ＨＬＨ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２７−４１頁；Ｈｕｒｓｔ，Ｈ．Ｃ．，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２７−２９頁；およびＬ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．］。
【００５２】
例えば、いくつかの塩基性（ｂａｓｉｃ）−へリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子のヘテロ二量体パートナーは、当該分野で公知である。［Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｔｒｅｖｏｒ Ｄ．，１９９８，Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）３７−４１頁］。より詳細な例では、ｂＨＬＨ転写因子（例えば、リガンド依存性ダイオキシンレセプターおよびアリール炭化水素レセプター（ＡＨＲ））は、ＡＨＲ核トランスロケータータンパク質（ＡＲＮＴ）とへテロ二量体化する。［Ｗｈｉｔｅｌａｗ，Ｍ．Ｌ．ら、（１９９４）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｏｘｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｂａｓｉｃ Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ／ＰＡＳ Ｐａｒｔｎｅｒ Ｆａｃｔｏｒ Ａｒｎｔ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４：８３４３−８３５５］。
【００５３】
別の例は、ステロイド／甲状腺ファミリーのレセプターをお互いに、または他の非ステロイド／甲状腺ファミリーのメンバーと、二量体化する能力を有するステロイド／甲状腺ファミリーのレセプターである（例えば、Ｒｈｅｅら、（１９９５）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ １ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ３，５，３’−Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：２６９７−７０４；Ｌｉら、（１９９７）「Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：２２７８−８３）」。
【００５４】
なお別の例は、いくつかの他のタンパク質と二量体化するｂＺＩＰ因子である。［例えば、Ｈ．Ｃ．Ｈｕｒｓｔ，Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第３版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６），２８頁］。
【００５５】
本発明のタンパク質を含むこのようなヘテロ二量体およびホモ二量体が意図される。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様では、Ｐ−ボックス修飾エクジソンレセプターは、哺乳動物ＲＸＲとヘテロ二量体化する。
【００５７】
細胞転写アッセイにおける使用のための本発明の融合タンパク質は、宿主細胞の核に局在するべきである。本発明の融合タンパク質のドメイン内に既に存在する核局在化シグナルは、核局在化シグナルを提供し得る。あるいは、当該分野で公知の核局在化シグナルは、核局在化を保証するように融合タンパク質へと操作され得る。［例えば、Ｄ．Ｂ．ＤｅＦｒａｎｃｏ，（１９９８）「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｕｂｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ Ａら、（１９９６）、「Ｔｈｅ Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｏｓｔｅｒ Ａｗａｒｄ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：３−９，これらの開示は、本明細書中で参考として援用される］。
【００５８】
本発明の方法の代替的実施態様では、融合タンパク質は、リガンド結合ドメインを欠く。詳細には、この実施態様では、融合タンパク質は、（１）ＤＮＡ結合ドメインおよび（２）プロテアーゼ切断部位を含む。これらの方法では、融合タンパク質の転写活性は、転写環境の温度を変化させることか、または転写事象が生じる細胞にストレスを引き起こすことによって誘導し得る。例えば、熱ショック因子（「ＨＳＦ」）の、その応答エレメントであるＨＳＥに対する高親和性結合は、熱ショック刺激に依存する。［例えば、Ｊ．ＬｉｓおよびＣ．Ｗｕ、「Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｆａｃｔｏｒ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、９０７−９３０頁；Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、第２版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，（１９９５）７１−７８頁］。
【００５９】
目的のプロテアーゼ切断部位は、ＨＳＦタンパク質へと操作され得、その結果切断されたＨＳＦ融合タンパク質の転写活性は、熱による刺激後の切断されないＨＳＦ融合タンパク質と比べてより低いかまたは無視できる。
【００６０】
本発明の方法によって意図される本発明の融合タンパク質の使用、ＤＮＡ分子およびベクターは、細胞性転写反応およびインビトロ転写反応を含む。
【００６１】
細胞において転写アッセイを行うための方法は公知である［例えば、Ｒ．ＷｈｉｔｅおよびＭ．Ｐａｒｋｅｒ，「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ（１９９３）１４５−１５２頁；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］。簡単には、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ、レポータープラスミド、プロテアーゼ、および、必要に応じて、発現モジュレータードメインを有する第２のタンパク質が細胞へと導入される。次いで、融合タンパク質の転写活性は、リガンドを添加することによってか、または細胞の環境を変化させる（例えば、細胞の環境の温度を変化させる）ことによって誘導される。ｍＲＮＡの量、レポータータンパク質の量、またはレポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定される。プロテアーゼの非存在下での転写は、プロテアーゼの存在下での転写と比較され得る。
【００６２】
インビトロでの転写反応を行うための方法もまた公知である［Ｓｉｅｒｒａ，Ｆ．ら、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ，「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｌｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１２５−１５２頁；Ｓｎｏｅｋ，Ｒ．ら、（１９９６）「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５９：２４３−２５０；Ｄｉｇｎａｍ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９２）「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １２．１．１−１２．１．９頁；Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓ，Ｌ．ら、（１９９０）「Ｔｈｅ Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ」，Ｃｅｌｌ ６０：２４７−２５７］。
【００６３】
簡単には、インビトロでの転写反応を補助することが示されているプロトコルにより調製された細胞抽出物が調製される。精製タンパク質または部分的精製タンパク質は、レポータープラスミドと共に細胞抽出物に添加される。このような精製タンパク質または部分的精製タンパク質（例えば、本発明の融合タンパク質）は、融合タンパク質をコードするＤＮＡを導入された細胞（例えば、バキュロウイルス感染によるＳＦ９細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および細菌細胞）中での過剰発現によって産生され得る。タンパク質（例えば、プロテアーゼ）および、必要に応じて、発現調節ドメインおよび／またはタンパク質結合パートナーを有する第２のタンパク質はまた、これらを精製する当該分野で公知の方法を用いてこれらの本来の供給源から調製され得る。
【００６４】
次いで、融合タンパク質の転写活性は、リガンドを添加することによって誘導される。産生されたｍＲＮＡの量、産生されたレポータータンパク質の量、またはレポータータンパク質の活性は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定される。プロテアーゼの存在下での転写は、プロテアーゼの非存在下での転写と比較され得る。
【００６５】
本発明はまた、阻害性のプロテアーゼ活性について化合物をスクリーニングするための方法を提供する。スクリーニングされるべき化合物は、リガンドが添加されるのと同時に添加され得るか、または融合タンパク質とプロテアーゼの最初の発現／インキュベーションの間に添加され得る。このプロテアーゼの最高の阻害を達成するために必要な化合物の最適なレベルは、化合物の滴定によって決定され得る。
【００６６】
本発明はまた、同一のプロテアーゼ切断部位を認識する２つのプロテアーゼの活性を比較するための方法を提供する。この方法は、変異体プロテアーゼの活性と非変異体プロテアーゼ（例えば、患者由来のＨＩＶアスパルチルプロテアーゼ）の活性を比較するために有用である。
【００６７】
本発明はまた、異なるプロテアーゼ切断部位に対するプロテアーゼの活性を比較するための方法を提供する。この方法は、所定のプロテアーゼの基質特異性を決定するために有用である。
【００６８】
本発明はまた、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキットを提供する。このキットが、レポーター遺伝子のインビトロでの転写アッセイに用いられる場合、このキットは、インビトロでの転写抽出物、レポーター遺伝子を含む上記のようなベクター、リガンドの供給、および使用説明書を含み得る。必要に応じて、これは本発明の融合タンパク質、発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質、および／または細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および酵母を含む供給源から発現されるプロテアーゼの供給を提供し得る。
【００６９】
このキットが、細胞転写アッセイに用いられる場合、このキットは、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列および上記のようなレポータープラスミドをコードするベクター、そのタンパク質のＤＮＡ配列によりコードされる上記融合タンパク質と会合しかつその活性を調節するリガンド；ならびにプロテアーゼ活性をアッセイするために上記キットを使用するための使用説明書を含み得る。
【００７０】
本発明の方法において特に有用であるプロテアーゼは、症状または疾患の発症に寄与するプロテアーゼである。例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫応答の活性化、チモーゲン活性、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク質輸送に関与するプロテアーゼ。本発明の１つの実施態様では、目的のプロテアーゼは、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、気腫、高血圧症、腫瘍の侵襲および転移ならびにウイルス関連疾患に関与するものである。本発明の好ましい実施態様に従って、このプロテアーゼは、ＨＩＶアスパルチルプロテアーゼおよびＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ、ならびにそれらの活性フラグメントまたは融合タンパク質である。
【００７１】
本発明の１つの実施態様では、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＰＢＰ、プロテアーゼ、および発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質のいずれか１つまたは全ては、タンパク質の精製またはその発現の同定を容易にするための、さらなるポリペプチド配列を提供するように、さらに改変され得る。例えば、このようなポリペプチド配列は、抗体を結合するためのエピトープ、タンパク質Ａビーズを結合するための抗体のＦｃ部分、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、Ｈｉｓ（ｎ）、ＦＬＡＧ、およびＳｔｒｅｐ−タグを含み得る。これらのスクリーニング可能なタグは、当該分野で全て周知であり、そして当業者に完全に利用可能である。
【００７２】
本発明のタンパク質の過剰発現に有用ないくつかのベクターは、酵母、昆虫細胞、細菌、酵母、植物細胞、および哺乳動物細胞における発現について市販されているか、または公知である。
【００７３】
本発明の方法に従って有用な宿主細胞は、当該分野で周知である。外来のプロテアーゼの活性が研究される場合、宿主細胞は、標的とされるプロテアーゼ切断部位を認識する高レベルの内在性のプロテアーゼを発現しないことが望ましい。適切な宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞；ＨｅＬａ細胞；肝臓細胞；ＣＶ−１細胞；Ｐ１９細胞；ＮＴ２／Ｄ１細胞；マウスＬ細胞；アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞または他のＣＯＳ細胞）；ヒト胎児性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３）；ＤＧ４４細胞、ｌｔｋ細胞、マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞および酵母細胞が挙げられ得る。この宿主細胞は、一過性のトランスフェクト細胞株または安定な形質転換細胞株であり得る。本発明の好ましい実施態様では、この宿主細胞は、肝臓細胞株由来のＣＯＳ細胞である。
【００７４】
本発明の方法における使用のために適切なリガンドは、当該分野で周知である。このリガンドは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインが由来する転写因子のリガンド結合ドメイン、または改変されたそれらのリガンド結合ドメイン（上記を参照のこと）に結合すべきである。好ましくは、このリガンドは、融合タンパク質についてのＬＲＥが、プロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクターに、スプライスまたは挿入されない（ここで、ＬＲＥは、プロモーターに、リガンドに機能的に応答するようにプロモーターからの転写活性を作る様式で、連結される）限り、プロモーターからの転写を実質的に増強しないか、または抑制しない。
【００７５】
使用するリガンドの選択は、使用される融合タンパク質のリガンド結合ドメインに必然的に依存する。例えば、金属結合ＤＮＡ融合タンパク質と共に使用するために適切なリガンドとしては、亜鉛、カドミウム、および銅が挙げられ得る。
【００７６】
例えば、ステロイド結合融合タンパク質、または改変されたステロイド結合融合タンパク質と共に使用するために適切なリガンドは、アンドロゲン、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、プロゲストゲン、レチノイン酸、ビタミンＤ３、２０−ヒドロキシ−エクジソン、ポナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ、２６−ヨードポナステロンＡ、ミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａ、イノステロン、２６−メシリノコステロン、ミフェプリストン（ＲＵ ４８６）およびそれらのアナログを含み得る。
【００７７】
本明細書中で用いられる場合、アンドロゲンは、ジヒドロキシテストステロンおよびメチルトリエノロンを含むそれらのアナログを含む。
【００７８】
本明細書中で用いられる場合、糖質コルチコイドホルモンは、コルチゾール、ヒドロコルチゾン、およびコルチコステロン、ならびにデキサメタゾン、デオキシコルチコステロン、およびトリアムシノロンアセトニドを含むそれらのアナログを含む。
【００７９】
本明細書中で用いられる場合、鉱質コルチコイドは、アルドステロン、コリコステロン（ｃｏｒｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）およびデオキシコルチコステロンを含む。
【００８０】
本明細書中で用いられる場合、甲状腺ホルモンは、サイロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）（Ｔ３）を含む。
【００８１】
本明細書中で用いられる場合、エストロゲンは、エストラジオール−１７β、およびジエチルスチルベストロールを含むそれらのアナログを含む。
【００８２】
本明細書中で用いられる場合、プロゲストゲンは、プロメゲストロン（ｐｒｏｍｅｇｅｓｔｒｏｎｅ）を含むプロゲステロンのアナログを含む。
【００８３】
テトラサイクリン誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、テトラサイクリンおよびそれらのアナログを含む。
【００８４】
糖質誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、アラビノース、ラクトース、およびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む。
【００８５】
アリール炭化水素誘導性融合タンパク質に適切なリガンドは、ダイオキシンを含む。
【００８６】
オーファンレセプターに適切なリガンドは、以下を含む：ＲＸＲレセプターについてフィチン酸、９−シスレチノイン酸、およびＬＧ１００２６８；ＰＰＡＲαレセプターについて８Ｓ−ＨＥＴＥおよびＷｙ１４，６４３；ＰＰＡＲγレセプターについて１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ２およびＢＲＬ ４９６５３；ＰＰＡＲδレセプターについてリノール酸およびカルバ−プロスタサイクリン（ｃａｒｂａ−ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ）；ＦＸＲレセプターについてファルネソール；ならびにＬＸＲレセプターについて２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロール。［Ｂ．Ｍ．Ｆｏｒｍａｎ，（１９９８）「ＯｒｐｈａｎＮｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、Ｂｉｒｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，２８１−３０５頁］。
【００８７】
本発明におけるＬＲＥおよびＰＢＰ−ＤＮＡエレメントは、それぞれ、融合タンパク質およびタンパク質結合パートナーについてのＤＮＡ結合部位を提供する核酸分子である。両方のエレメントは、レポーター遺伝子の転写の活性化または抑制を制御するために、プロモーターに作動可能に連結されるべきである。句「作動可能に結合される」とは、核酸分子が、宿主細胞へと導入される（例えば、トランスフェクトされるか、形質転換されるか、形質導入されるか、結合体化されるか、または組換えによってか、もしくは感染によって）場合に、発現される得るような様式で、核酸分子（例えば、レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子）を、ＬＲＥエレメントおよびＰＢＰ−ＤＮＡエレメント（ＰＢＰ結合が転写に必要な場合）に、ならびに転写制御配列に連結することをいう。
【００８８】
転写制御配列は、転写の開始、伸長、そして停止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーターのような転写の開始を制御するものである。好ましくは、このプロモーターは、最小プロモーターである。用語「最小プロモーター」は、転写されるべき結合配列についての転写開始部位を定義するが、それ自身では、特定の細胞環境において、あったとしても効率的には転写を開始し得ない、部分的プロモーター配列を記載することを意図する。従って、このような最小プロモーターの活性は、本発明の融合タンパク質の結合に依存する。
【００８９】
好ましい実施態様では、最小プロモーターは、ショウジョウバエの熱ショックプロモーター由来であり、そして融合タンパク質に対する標的ＬＲＥは、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように生成されるＡＧＡＡＣＡである。
【００９０】
本発明に従うＬＲＥは、リガンドに応答性を与えるように作動すべきである。さらなる実施態様では、本発明のＰＢＰに結合するＤＮＡエレメントはまた、用いられるＰＢＰが、リガンド結合タンパク質である場合に、リガンド応答性であり得る。ＬＲＥエレメントおよびＤＮＡエレメント（必要な場合）の選択、ならびにお互いについてのこれらのエレメントの配置は、用いられる融合タンパク質またはＰＢＰに依存する。例えば、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、塩基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質に由来する場合、ＬＲＥは、コンセンサスＤＮＡヘキサマーＣＡＮＮＴＧ（「Ｅボックス」としてもまた公知である）を含むようである（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら、前出、３１頁）。
【００９１】
多くの転写因子についての好ましいＤＮＡ結合部位（すなわち、ＬＲＥおよびＤＮＡエレメント）は公知である。［Ｄ．Ｊ．ＭａｎｇｅｌｓｄｏｒｆおよびＲ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，（１９９２）「Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｌ．ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＫ．Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ編、１１３７−１１６７頁、；Ｌ．Ｐ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ編、（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．，１１１−１１３頁；およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０（本明細書中で参考として援用される）］。
【００９２】
哺乳動物細胞中で融合タンパク質、ＰＢＰ、およびプロテアーゼの発現を制御するプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターのように構成的であり得る。添加されるコントロールについて、融合タンパク質、ＰＢＰ、およびプロテアーゼは、誘導性プロモーターの制御化にあり得る。誘導性プロモーターは、レポーター遺伝子の転写を駆動するプロモーターと同じではないことが望ましい。
【００９３】
本発明の方法に従って有用であるレポーター遺伝子は、当該分野で周知である。このようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子（ＵＳ ５，４９１，０８４）、β−ガラクトシダーゼ、分泌アルカリホスファターゼ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。また、本発明は、細胞外の分泌のためのシグナル配列を有するマーカータンパク質をコードするレポーター遺伝子（例えば、ＩＬ−１β遺伝子）を意図する。
【００９４】
ＬＲＥエレメントおよびＤＮＡエレメントに作動可能に連結されるレポーター遺伝子を含むベクター（すなわち、レポータープラスミド）は、当該分野で利用可能な材料から調製され得る。このようなレポータープラスミドはまた、好ましくは、例えば、以下を含む：複製起点および選択マーカー。このレポータープラスミドはまた、必要に応じて、細胞株のゲノムへのベクターの挿入を生じるために、長末端反復配列（「ＬＴＲ」）のような他のＤＮＡ配列を含み得る。
【００９５】
細菌または哺乳動物細胞中で融合タンパク質、ＰＢＰ発現モジュレータードメインを有するタンパク質もしくはプロテアーゼの発現のために適切なベクターは、当該分野で周知である。このようなベクターは、例えば、以下を含み得る：複製起点、選択マーカーおよび転写制御配列（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列）。従って、融合タンパク質、ＰＢＰ、発現モジュレータードメインを有するタンパク質およびプロテアーゼは、上記のように、構成性または誘導性プロモーターと作動可能に連結されているはずである。このベクターは、以下のタンパク質の２つ以上が同じベクター中に存在するように構築され得る：融合タンパク質、プロテアーゼ、ならびに必要に応じて、ＰＢＰおよび／または発現モジュレーターを有するタンパク質（融合タンパク質の機能にとって必要であれば）。これらの遺伝子の転写は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって制御され得る。例えば、各遺伝子は、異なる誘導性プロモーターによって制御されてもよいし、各遺伝子は、同じ構成性プロモーターによって制御されてもよい。
【００９６】
融合タンパク質、ＰＢＰ、プロテアーゼおよび発現モジュレータードメインを含む第２のタンパク質を発現するためのレポータープラスミドおよびベクターは、選択マーカーを含み得る−一方は、原核生物細胞（例えば、細菌）における増殖を付与し、そしてもう一方は、特定の化合物の存在下で真核生物細胞（例えば、酵母、哺乳動物細胞または植物細胞）における増殖を付与する。本発明において有用な選択マーカーは、薬物（例えば、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）に対する耐性を付与しうる。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様において、このベクターは、ＤＮＡ配列である配列番号１９を有する融合タンパク質をコードする。本発明のさらに好ましい実施態様において、ＤＮＡ配列である配列番号２１を有する融合タンパク質をコードするベクターは、コントロールとして使用される。本発明の好ましい実施態様において、レポータープラスミドは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＩＮＤに由来する。
【００９８】
このベクターおよびレポータープラスミドが細胞における転写アッセイにおいて使用されるべき場合、それらは、当該分野で公知の技術（例えば、トランスフェクション、リポフェクチン、サイトフェクチン、粒子ビーズボンバードメント、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはウイルス感染）により宿主細胞へ導入され得る（例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。
【００９９】
ウイルス感染の場合において、目的のＤＮＡは、レトロウイルスを生成するために使用される２つのレトロウイルスＬＴＲの間のウイルスベクターへクローニングされ得、そしてウイルスで細胞を感染させ得る。本発明に従う有用な他のウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびワクシニアウイルスが挙げられる。
【０１００】
レポーター遺伝子産物の存在をアッセイするための方法は、当該分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子の転写から得られるｍＲＮＡをアッセイするための方法は公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．），第２版；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第５版）。レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質をアッセイするための方法もまた公知であり、そしてこのタンパク質を測定するためのキットが会社から市販される（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１０１】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはそのバリエーション「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（含んでいる）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた完全なもの（ｉｎｔｅｇｅｒ）または完全なものの群の包含を暗に含むが、任意の他の完全なものまたは完全なものの群の排除が暗示されないことが理解される。
【０１０２】
本明細書中に記載される本発明は、より十分に理解され得るために、以下の実施例が記載される。これらの実施例は、例示目的にすぎず、そしていずれの様式においても本発明を制限すると見なされるべきではない。
【０１０３】
（実施例１：ＤＮＡベクターの構築）
（Ａ．材料）
（１）ベクター
プラスミドｐＶｇＲＸＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ｐＶｇＲＸＲは、改変エクジソンレセプター（ＶｇＥｃＲ）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）の両方を発現して、ヘテロダイマー核レセプターを形成する、８７２８ｋｂのベクターである（図１）。ＶｇＥｃＲ遺伝子の転写は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターにより駆動される。ＲＸＲ遺伝子の転写は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターにより駆動される。これらの遺伝子を発現する安定な細胞株は抗生物質ＺｅｏｃｉｎTMでの選択により作製され得る。ｐＶｇＲＸＲベクターおよびエクジソンシステムキットの特徴および維持管理に関する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用される。
【０１０４】
プラスミドｐＩＮＤは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た（図３）。プラスミドｐＩＮＤは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに基づいた５０２４ｂｐのベクターである。このベクターは、５つのハイブリッドＬＲＥ（すなわち、５つのエクジソン／グルココルチコイド応答エレメント（Ｅ／ＧＲＥ））および熱ショック最小プロモーターを有する。このＥ／ＧＲＥは、ｐＶｇＲＸＲから発現される改変エクジソンレセプターにより認識され得る。プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、別のプラスミドからのルシフェラーゼ遺伝子（コザック配列およびメチオニン開始部位を含む）を消化し、そしてｐＩＮＤのポリリンカー（すなわち、最小熱ショックプロモーターの下流）にこれをクローニングすることにより作製した（図３）。両方のプラスミドは、選択目的でネオマイシンおよびアンピシリンの耐性遺伝子を有する。ｐＩＮＤおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃベクターの特徴および維持管理に関する製品情報は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術マニュアルからの参考として援用される。
【０１０５】
哺乳動物発現プラスミドｐＳＲαは、当該分野で記載されている（本明細書中に参考として援用される、Ｙ．Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，４６６−７２頁（１９８８））。このプラスミドは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターならびにヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）のＲセグメントおよび長末端反復のＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）の一部から構成されるプロモーター系を含む。プラスミドはまた、１６Ｓ スプライス接合部、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。ＨＴＬＶ ＬＴＲエンハンサー／プロモーター配列は、下流にクローニングされた遺伝子の高レベル発現を駆動する。目的の遺伝子を、１６Ｓ スプライス接合部に対して３’に位置づけされるＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし得る。
【０１０６】
（２）プライマー
ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２）は、ｐＶｇＲＸＲプラスミドのＶＰ１６コード領域の上流にあるＸｂａＩ部位にハイブリダイズするように設計された２８マーである。
【０１０７】
ＶＰ１６／５Ａ５ＢＲプライマー（配列番号１３）は、ｐＶｇＲＸＲプラスミドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖に一部ハイブリダイズするように設計された８６マーである。
このプライマーはまた、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部位およびＸｂａＩ部位についてのコード配列に相補的なヌクレオチドを含む。
【０１０８】
ＶＰ１６／５Ａ**５ＢＲプライマー（配列番号１４）はｐＶｇＲＸＲプラスミドのＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡの３’領域中のアンチセンス鎖に一部ハイブリダイズするように設計された９２マーである。このプライマーはまた、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの５Ａ／５Ｂ切断部位についてのコード配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。しかし、５Ａ／５Ｂ切断部位をコードするＤＮＡはさらに、システインおよびセリンコドンをコードするＤＮＡ配列の間に６つのヌクレオチド挿入を有する。この６つのヌクレオチド挿入は、２つの停止コドンをコードする。
【０１０９】
ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）は、ＮＳ３コード領域（ＨＣＶポリペプチドにおけるアミノ酸番号１０２７〜１０３２に対応する）の開始部位に一部結合するように設計された４７マーである。このオリゴヌクレオチドの残余部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
【０１１０】
ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）は、ＮＳ４Ａコード領域（ＨＣＶポリペプチドにおけるアミノ酸番号１７０５〜１７１１に対応する）の３’末端に一部結合するように設計された４４マーである。このオリゴヌクレオチドの残余部分は、クローニングを容易にするための複数の制限部位を含む。
【０１１１】
各プライマーを、オリゴヌクレオチド合成機を用いて、当該分野で公知の標準的条件下で合成した。
【０１１２】
Ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびクローニングストラテジー
ＰＣＲ反応を、標準の条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）で行った。
【０１１３】
（１）ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢベクターおよびｐＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ａベクター
ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（配列番号１９）をコードする発現ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２）、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＲプライマー（配列番号１３）およびｐＶｇＲＸＲプラスミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣＲ産物を、ＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、ＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消化したＰＣＲ挿入物を、この骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、この挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために配列決定することによりスクリーニングした。
【０１１４】
ＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ｂ（配列番号２１）をコードする発現ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＶＰ１６／５Ａ５ＢＦプライマー（配列番号１２）、ＶＰ１６／５Ａ**５ＢＲプライマー（配列番号１４）およびｐＶｇＲＸＲプラスミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ反応を包含した。次いで、このＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化した。ｐＶｇＲＸＲベクターをＸｂａＩで消化して、ＶＰ１６活性化ドメインをコードするＤＮＡを除去することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そして消化したＰＣＲ挿入物をこの骨格のＸｂａＩ部位に連結した。この連結物を、この挿入物の適切な配向およびそのヌクレオチド配列の正確さを確実にするために配列決定することによりスクリーニングした。
【０１１５】
（２）ｐＳＲα−ＮＳ３−４ＡおよびｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）
ＮＳ３−４Ａ切断部位をコードするｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａベクター（配列番号１０）を調製することに関する最初の工程は、ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）および全長ＨＣＶ Ｈ株ｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲ反応を包含した（本明細書中に参考として援用されるＩｎｃｈａｕｓｐｅら，（１９９１），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０２９２−１０２９６）。次いで、このＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲ１で消化することにより、このＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そしてこのＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に連結した。
【０１１６】
ＮＳ３−４Ａ変異プロテアーゼをコードするｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）（Ｓ１１６５Ａ）ベクターを調製することに関する最初の工程は、ＮＳ３−４ＡＦプライマー（配列番号１５）、ＮＳ３−４ＡＢプライマー（配列番号１６）およびＮＳ３活性部位変異Ｓ１１６５ＡのｃＤＮＡを用いるＰＣＲ反応を包含した（本明細書中に参考として援用されるＡ．Ｇｒａｋｏｕｉら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２８３２−４３）。次いで、このＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＲαベクターをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化することにより、ＰＣＲ産物と連結するためのベクターを調製した。このベクター骨格を単離し、そしてＰＣＲ挿入物をこの骨格のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に連結した。ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）は、アミノ酸番号１１６５でセリンからアラニンへの置換（これは、このプロテアーゼを不活性にする）を有する。配列番号１０と配列番号１１とを比較のこと。
【０１１７】
（実施例２：ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ エクジソン−誘導性ルシフェラーゼアッセイ）
ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼ エクジソン−誘導性ルシフェラーゼアッセイを、一般に、以下に記載の通り行った。
【０１１８】
ＣＯＳアフリカミドリザル腎臓細胞を、約１５０，０００細胞／ウェルで、６ウェルプレート中にプレートした。翌日、約３．６μｇのプラスミドＤＮＡを、２９μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）と合わせたダルベッコ改変イーグル培地−Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＤＭＥＭ）１００μｌ中に溶解し、次いで、ピペッティングして混合した。この混合物を、室温で１０分間インキュベートした。
【０１１９】
各実験で代表的に使用されたＤＮＡの量は、以下のとおりである：０．６μｇのｐＩＮＤ−Ｌｕｃ、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢもしくはｐＶｇＲＸＲ−５Ａ**５Ｂ、および０〜２．４μｇのｐＳＲα−ＮＳ３−４ＡもしくはｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）もしくはｐＳＲα。
【０１２０】
次いで、ｖ／ｖ １０％ ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）６００μｌを、ＤＮＡ混合物に添加し、そしてピペッティングして混合した。６ウェルプレート中の細胞を、２．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。このＰＢＳを細胞から取り除き、そしてＤＮＡ混合物と置き換えた。この細胞を、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、ＤＮＡ混合物中、３７℃で３時間インキュベートした。
【０１２１】
インキュベーション後、この細胞をＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを取り除き、そして細胞に１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを添加した。この細胞を、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１２２】
その翌日、外因性リガンドをこの細胞に添加して、レポーター遺伝子の転写を誘導した。具体的には、１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを細胞から吸引し、そして１〜１０μＭ ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａまたは１〜１０μＭ ポナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の濃度を含む１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭ溶液と置き換えた。いくつかの場合には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解したプロテアーゼインヒビターもまた１〜４０μＭの終濃度で細胞に添加した。細胞をムリステロンＡまたはポナステロンＡとともに、５％ ＣＯ2インキュベーターの中で、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１２３】
翌日、細胞をＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼタンパク質の活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。具体的には、細胞を２５０μｌの細胞培養物溶解試薬で溶解した。これらの細胞をプレートから掻き取り、そして微量遠心チューブに移した。抽出物を、１２，０００×ｇで５秒間遠心分離した。２０μｌの各サンプルを、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬に添加した。ルシフェラーゼと試薬との反応によって生じた光を、ルミノメーターで測定し、そして相対的光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ；ＲＬＵ）として報告した。
【０１２４】
実験のほとんどを、三連で数回行った。データ点の標準偏差を反映するエラーバーは、図面に中に含まれている。
【０１２５】
（実施例３：活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間の５Ａ／５Ｂ接合部の挿入は、ムリステロンＡ誘導トランス活性化を妨げない）
融合タンパク質（ＶｇＲＸＲ、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢまたはＶｇＲＸＲ−５Ａ（Ｓｔｏｐ）５Ｂ）ならびにｐＩＮＤ−Ｌｕｃをコードするベクターを、上記（実施例２）に記載されるように、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。翌日に、これらの細胞のいくつかを、１μＭのムリステロンとともに２４時間インキュベートした。この細胞を溶解し、そして以前に記載されたようにルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図４に示す。
【０１２６】
ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（Ｓｔｏｐ）５Ｂ（これは、エクジソンＤＮＡ結合ドメインを欠く）によって発現されたコントロール融合タンパク質は、ごくわずかな活性を示す。ＶｇＲＸＲおよびＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ発現融合タンパク質の活性の間には、ほとんどまたは全く差異がなかった。これらの結果は、ＶｇＲＸＲ発現タンパク質における５Ａ／５Ｂ接合部の挿入が、ムリステロンＡが誘導した活性を妨げないことを示す。
【０１２７】
（実施例４：漸増量のｐＳＲαＮＳ３−４ＡとｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂとの同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス活性化の用量依存減少を導く）
レポータープラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、図５に示されるように、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢまたはｐＶｇＲＸＲのいずれかと、プロテアーゼＮＳ３−４ＡをコードするＤＮＡの漸増量（μｇ）とともに同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を、１μＭ ムリステロンＡとともにインキュベートした。次いで、細胞を溶解し、以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図５に示す。
【０１２８】
哺乳動物ＲＸＲおよびエクジソンレセプター／ＶＰ１６融合タンパク質をコードするＶｇＲＸＲ構築物で同時トランスフェクトした場合のルシフェラーゼレポーター構築物の転写は、プロテアーゼＮＳ３−４Ａで同時発現させた場合と、ほとんどまたは全く変化しないことを示した。対照的に、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂコードタンパク質は、ＮＳ３−４Ａタンパク質で同時発現させた場合、ルシフェラーゼ活性の用量依存的減少を生じた。これらの結果は、プロテアーゼＮＳ３−４Ａが、５Ａ／５Ｂ接合部を切断するが、活性に必要な融合タンパク質の他の領域を切断しないことを示唆する。
【０１２９】
（実施例５：漸増量のｐＳＲαＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）とｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂとの同時トランスフェクションは、ムリステロンＡ誘導性トランス活性化に影響を及ぼさない）
本発明者らは、図６に示すように、０．６μｇのｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂおよび０．６μｇのｐＩＮＤ−Ｌｕｃを用いて、ＮＳ３プロテアーゼまたはそれらの不活性変異体をコードする可変量（μｇ）のベクターで同時トランスフェクトした。各トランスフェクションに使用したＤＮＡの総量は、ｐＳＲαと足して３．６μｇであった。翌日に、細胞を１μＭのムリステロンＡ中でインキュベートした。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図６に示す。
【０１３０】
前の結果においてみられるように（実施例４）、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂによってコードされるこの融合タンパク質は、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの非存在下で高レベルの活性を示した。ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ媒介ルシフェラーゼ活性の活性は、変異型プロテアーゼＮＳ３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ）をコードするＤＮＡではなく、ＮＳ３−４ＡプロテアーゼをコードするＤＮＡでの同時トランスフェクションに伴う用量依存性様式で減少した。これは、おそらく、変異体ＮＳ３−４Ａプロテアーゼがエクジソン／ＶＰ１６融合タンパク質を切断できないことに起因する。
【０１３１】
実施例４および５のような用量依存研究は、融合タンパク質をコードするＤＮＡと、将来のアッセイにおいて使用するためのプロテアーゼをコードするＤＮＡとの最適比を決定するために有用であった。
【０１３２】
（実施例６：ポナステロンＡ用量応答）
プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３−４Ａの非存在下または存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）とともに同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を可変量のポナステロンＡ、エクジソンレセプターと哺乳動物レチノイン酸レセプター（ＲＸＲ）とのヘテロダイマー化を誘導するリガンドとともにインキュベートした。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図７に示す。
【０１３３】
この結果は、ポナステロンＡが、プロテアーゼＮＳ３−４Ａの非存在下で融合タンパク質ＥｄＲ５Ａ／５Ｂ（すなわち、ＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂによってコードされるタンパク質）を活性化するにおいて有効であることを示す。これらの実験の目的については、ポナステロンＡが３．３〜１０μＭの間の濃度で存在した場合に、融合タンパク質の最も大きな活性化が生じた。一般には、ポナステロンＡは、これらのアッセイにおいて転写を誘導するにおいてムリステロンＡと等しく有効であることが分かった。
【０１３４】
（実施例７：ポナステロンＡ誘導および％ＤＭＳＯ制御）
プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３−４Ａの存在下または非存在下で、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と同時トランスフェクトした。翌日、細胞を５μＭ ポナステロンＡとともにインキュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、０〜１％ ＤＭＳＯの終濃度（ｖ／ｖ）まで細胞に添加した。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図８に示す。
【０１３５】
このコントロール実験において、ＤＭＳＯを細胞に加えて、その存在が、ポナステロンＡによる融合タンパク質の活性化を妨げるか否かを決定した。ＤＭＳＯは、これらのアッセイに添加する前に、プロテアーゼインヒビター化合物を溶解するためにときおり使用された溶媒である。大部分の実験で、細胞培養物中のＤＭＳＯ濃度は、０．１％を超えなかった。これらの結果は、１％までのＤＭＳＯ濃度が、このアッセイにおいてポナステロンＡ誘導ルシフェラーゼ活性に対する影響をほとんどまたは全く有さないことを示す。
【０１３６】
以下の実施例は、プロテアーゼのインヒビターとして潜在的に有用な化合物をスクリーニングするために、このアッセイがどの程度有用であり得るかを示す。
【０１３７】
（実施例８：ＶＲＴ−２５，５３１によるＮＳ３−４Ａ活性の用量依存的阻害）
プラスミドｐＩＮＤ−Ｌｕｃ（０．６μｇ）を、１．８μｇのｐＳＲαＮＳ３−４Ａ（１：３の比）の存在下でｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ（０．６μｇ）と同時トランスフェクトした。翌日に、細胞を、図９に記載されるように、５μＭ ポナステロンＡおよび可変量の化合物ＶＨ−２５５３１とともにインキュベートした。細胞を溶解し、そして以前に記載したように、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果を図９に示す。
【０１３８】
この結果は、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼの非存在下でのＶＨ−２５５３１が融合タンパク質の活性を有意には増加も減少もさせないことを示す（図９のレーン１および３を比較のこと）。しかし、ＶＨ−２５５３１は、特に２０μＭでＮＳ３−４Ａプロテアーゼの活性を阻害しない。（請求項２に伴うレーン４〜１１（図９）を比較のこと）。事実、これらの結果は、ＶＨ−２５５３１が、２０μＭ濃度で、ＮＳ３−４Ａプロテアーゼを５５．５％ほど阻害し得ることを示す。２０μＭ ＶＨ−２５５３１でのプロテアーゼ活性の阻害％を、レーン３の値からレーン２の値を差し引くこと（１９９００−５１７７＝１４７３２）、レーン４の値からレーン２の値を差し引くこと（１３３５６−５１７７＝８１７９）、次いで、２つの値を用いて除算すること（８１７９／１４７２３＝０．５５５）により概算した。
【０１３９】
本発明者らは、本明細書中前記に本発明の多くの実施態様を提示したが、本発明者らの基本的な構築物が、本発明の方法を利用する他の実施態様を提供するように改変され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲が、本明細書中で例示される特定の実施態様ではなく、むしろ特許請求の範囲および明細書により規定されるべきことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ベクターｐＶｇＲＸＲ、ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ、およびｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂの構造を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂにコードされるタンパク質のシステインとセリンとの間に位置するバックスラッシュは、切断が生じる場所を示す。ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂにコードされるタンパク質の切断部位付近の２つのアスタリスクは、２つの停止コドンの位置を示す。
【図２】 図２は、ＨＣＶ ＮＳ３−４ＡプロテアーゼをコードするＤＮＡベクターであるｐＳＲα−ＮＳ３−４Ａの構造を示す。
【図３】 図３は、コントロールベクターｐＩＮＤおよびエクジソン誘導性ルシフェラーゼ発現のためのレポーターベクターであるｐＩＮＤ−ｌｕｃの構造を示す。用語「５ＸＥ／ＧＲＥ」とは、エクジソン／グルココルチコイド応答エレメントをいう。用語「ＰΔＨＳＰ」とは、熱ショック最小プロモーターをいう。用語「ＢＧＨ ｐＡ」とは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをいう。
【図４】 図４は、以下のいずれか１つを用いるＣＯＳ細胞へのトランスフェクション実験の結果をグラフで示す：（１）哺乳動物ＲＸＲレセプタータンパク質、および単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ）の活性化ドメインに融合されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター；（２）ＲＸＲレセプタータンパク質、およびＶＰ１６タンパク質（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ）の活性化ドメインに融合されたＨＣＶの５Ａ／５Ｂタンパク質分解性切断部位に融合されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａエクジソンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター；ならびに（３）ＲＸＲレセプタータンパク質、および上記の融合タンパク質（５Ａ／５Ｂ切断部位をコードするＤＮＡが、その切断部位におけるタンデム停止コドンを含むように改変されていることを除く）をコードするＤＮＡベクター（ｐＶｇＲＸＲ−５Ａ（停止）５Ｂ）。ルシフェラーゼレセプター遺伝子を含むプラスミドを、各トランスフェクションにおいて含ませた（ｐＩＮＤ−ｌｕｃ）。トランスフェクション後、レポーター遺伝子の転写を、１μＭのミュリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ（エクジソンアナログ）をトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。このデータを、実施例１に記載のように、トランスフェクトした細胞からの溶解物に存在するルシフェラーゼ活性を測定することによって得た。
【図５】 図５は、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする漸増量のプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）または漸増量のコントロールプラスミド（ｐＳＲα）を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果を示す。トランスフェクション後、レポータープラスミドの転写を、１μＭのミュリステロンＡをトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。
【図６】 図６は、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードする漸増量のプラスミドまたは漸増量のその不活性変異体（それぞれ、ｐＳＲαＮｓ３−４ＡまたはｐＳＲα３−４Ａ（Ｓ１１６５Ａ））を用いた、ＣＯＳ細胞へのプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−ｌｕｃの同時トランスフェクトの結果をグラフで示す。トランスフェクション後、レポーター遺伝子の転写を、１μＭのミュリステロンＡをトランスフェクトした細胞に投与することによって誘導した。
【図７】 図７は、１、３．３、１０、３３または１００μＭのいずれかのポナステロンＡ（エクジソンアナログ）を、ＨＣＶ−ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードするプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）の存在下または非存在下でプラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃで同時トランスフェクトした後のＣＯＳ細胞に投与した結果をグラフで示す。
【図８】 図８は、ＤＭＳＯ寛容性を実証するコントロール実験の結果をグラフで示す。プラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５ＢおよびｐＩＮＤ−Ｌｕｃを、ＨＣＶ−ＮＳ３−４Ａプロテアーゼをコードするプラスミド（ｐＳＲαＮｓ３−４Ａ）ありまたはなしで、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、レポータープラスミドの転写を、漸増濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で５μＭのポナステロンＡを投与することによって誘導した。
【図９】 図９は、プラスミドｐＶｇＲＸＲ−５Ａ／５Ｂ、ｐＩＮＤ−ＬｕｃおよびｐＳＲαＮＳ３−４ＡをＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトし、次いで５μＭのポナステロンＡおよび変動量のプロテアーゼインヒビター（ＶＨ−２５５３１）を投与した結果をグラフで示す。
【配列表】
Claims (25)
- 以下を含む、融合タンパク質であって：
ａ．プロテアーゼ切断部位；
ｂ．リガンド結合ドメイン；および
ｃ．ＤＮＡ結合ドメイン；
ここで、該融合タンパク質とのリガンドの結合は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたリガンド応答性エレメント（「ＬＲＥ」）への該融合タンパク質の結合を媒介し；そして
ここで、該融合タンパク質はまた、該レポーター遺伝子の転写を調節する発現モジュレータードメインを含み、ここで、該プロテアーゼ切断部位は、該発現モジュレータードメインと該ＤＮＡ結合ドメインとの間にあり、そして、該プロテアーゼ切断部位は、切断した場合に、得られる融合タンパク質のいずれもが、該レポーター遺伝子の発現を調節し得ないように切断され得る、
融合タンパク質。 - 前記プロテアーゼ切断部位が、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼによって認識される、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼ切断部位が、ＨＩＶアスパルチルプロテアーゼによって認識される、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ステロイド／甲状腺スーパーファミリーレセプターのＤＮＡ結合ドメインから選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記ＤＮＡ結合ドメインが、エクジソンレセプター由来であり、そしてここで、該エクジソンレセプターは、ＤＮＡに結合し得るためにタンパク質結合パートナーとの結合を必要とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記ＤＮＡ結合ドメインが、そのＰ−ｂｏｘ領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を有するように改変される、請求項５に記載の融合タンパク質。
- 前記発現モジュレータードメインは、ＶＰ１６タンパク質の活性化ドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列が、配列番号１〜１０からなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ分子。
- 請求項９に記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。
- 請求項１０に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞を該融合タンパク質の発現を引き起こす条件下で培養する工程を包含する、方法。
- 請求項１１に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、以下：
ａ．前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメインに結合するＬＲＥであって、ここで、該結合は、リガンドの存在によって調節され、そして該融合タンパク質のタンパク質結合パートナーの存在によって必要に応じて調節される、ＬＲＥ；
ｂ．該融合タンパク質の前記発現調節ドメインによって調節される、プロモーター；および
ｃ．その発現が該プロモーターによって制御される、レポーター遺伝子
を含むＤＮＡ分子をさらに含む、宿主細胞。 - 前記プロモーターが、哺乳動物熱ショックプロモーターである、請求項１３に記載の宿主細胞。
- 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１３に記載の宿主細胞。
- 請求項１３に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメインを活性化するために必要なタンパク質結合パートナーをコードするＤＮＡ分子をさらに含む、宿主細胞。
- インビトロでプロテアーゼ活性をアッセイするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．インビトロ転写抽出物中の請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、該融合タンパク質を前記プロテアーゼ切断部位で切断し得るプロテアーゼ、およびＤＮＡ分子と共にインキュベートする工程であって、ここで、該ＤＮＡ分子は、（ｉ）該融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメインに結合するＬＲＥ；（ｉｉ）該融合タンパク質の前記発現調節ドメインによって調節されるプロモーター；および（ｉｉｉ）その発現が該プロモーターによって制御される、レポーター遺伝子を含み、ここで、該融合タンパク質の該プロテアーゼ切断部位は、該プロテアーゼによって切断され得、該プロテアーゼの活性がアッセイされる、工程；
ｂ．該インキュベーションに該融合タンパク質と結合するリガンドを添加する工程であって、ここで、該リガンドは、（ｉ）該ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉｉ）該レポーター遺伝子の転写を調節するために、該融合タンパク質に必要とされる、工程；ならびに
ｃ．該レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物を定量する工程、
を包含する、方法。 - 細胞中のプロテアーゼ活性をアッセイするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク質、および存在する場合には、前記タンパク質結合パートナーの発現を引き起こす条件下で培養する工程であって、ここで、該宿主細胞は、該アッセイされるプロテアーゼを発現し、そしてここで、該融合タンパク質の前記プロテアーゼ切断部位は、該プロテアーゼによって切断され得る、工程；
ｂ．該宿主細胞培養物に、該融合タンパク質に結合し、そして該融合タンパク質の活性を調節するリガンドを添加する工程であって、ここで、該リガンドは、（ｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結される前記ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉｉ）該レポーター遺伝子の転写を調節するために、該融合タンパク質に必要とされる、工程；ならびに
ｃ．該レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物を定量する工程、
を包含する、方法。 - プロテアーゼに対する、化合物の阻害活性を測定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現を引き起こす条件下で、該化合物の非存在下の第１の培養物中で培養する工程であって、ここで、該宿主細胞は、該アッセイされるプロテアーゼを発現し、そしてここで、該融合タンパク質の前記プロテアーゼ切断部位は、該プロテアーゼによって切断され得る、工程；
ｂ．工程ａで用いた該宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現を引き起こす条件下、該化合物の存在下の第２の培養物中で培養する工程；
ｃ．該第１および第２の宿主細胞培養物に、リガンドを添加する工程であって、ここで、該リガンドは、（ｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結される前記ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉｉ）該融合タンパク質に結合する該レポーター遺伝子の転写を調節するために、該融合タンパク質に必要とされる、工程；ならびに
ｄ．該第１の宿主細胞培養物および該第２の宿主細胞培養物中の該レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物の量を比較する工程、
を包含する、方法。 - 請求項１９に記載の方法であって、該方法は、以下のさらなる工程：
ａ．請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現を引き起こす条件下で、第３の培養物中で培養する工程であって、そしてここで、該宿主細胞は、該融合タンパク質における前記プロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼを発現しない、工程；および、工程ｄの一部として、
該宿主細胞培養物中の前記レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物の量を、前記第１の宿主細胞培養物および前記第２の宿主細胞培養物中の前記レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物の量と比較する工程、
を包含する、方法。 - 同じ切断部位を認識する２つのプロテアーゼの活性を比較する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の第１の宿主細胞を、前記融合タンパク質、および存在する場合には、前記タンパク質結合パートナーの発現を引き起こす条件下で培養する工程であって、ここで、該第１の宿主細胞は、該融合タンパク質の該プロテアーゼ切断部位を切断し得る第１のプロテアーゼを発現する、工程；
ｂ．請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の第２の宿主細胞を、前記融合タンパク質、および存在する場合には、前記タンパク質結合パートナーの発現を引き起こす条件下で培養する工程であって、ここで、該第２の宿主細胞は、該融合タンパク質の該プロテアーゼ切断部位を切断し得る第２のプロテアーゼを発現する、工程；
ｃ．該第１および第２の宿主細胞培養物に、リガンドを添加する工程であって、ここで、該リガンドは、（ｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結される前記ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉｉ）該レポーター遺伝子の転写を調節するために、該融合タンパク質に必要とされる、工程；ならびに
ｄ．該第１の宿主細胞培養物および該第２の宿主細胞培養物中の該レポーター遺伝子から生成される遺伝子産物の量を比較する工程、
を包含する、方法。 - 前記第１のプロテアーゼおよび前記第２のプロテアーゼが、ＨＩＶプロテアーゼの形態である、請求項２１に記載の方法。
- 以下を含む、プロテアーゼ活性をアッセイするためのキット：
ａ．請求項９に記載のＤＮＡ分子、あるいは請求項１０に記載のベクター；
ｂ．以下を含む、ＤＮＡ分子：
ｉ．ａのＤＮＡ分子によってコードされる前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメインに結合され得る、ＬＲＥ；
ｉｉ．ａのＤＮＡ分子によってコードされる該融合タンパク質の前記発現調節ドメインによって調節され得る、プロモーター；および
ｉｉｉ．その発現が該プロモーターによって制御される、レポーター遺伝子；
ｃ．リガンドであって、ここで、該リガンドは、（ｉ）レポーター遺伝子に作動可能に連結される該ＬＲＥに結合するか、またはタンパク質結合パートナーに結合して；そして（ｉｉ）該レポーター遺伝子の転写を調節するために、該融合タンパク質に必要とされる、リガンド；ならびに
ｄ．プロテアーゼ活性をアッセイするための該キットを使用するための説明書。 - 前記ａ．のＤＮＡ分子および前記ｂ．のＤＮＡ分子の両方が、宿主細胞中に存在する、請求項２３に記載のキット。
- 前記融合タンパク質のタンパク質結合パートナーをコードするＤＮＡ分子または該ＤＮＡ分子を含むベクターをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL194025B1 (pl) | 1996-10-18 | 2007-04-30 | Vertex Pharma | Inhibitory proteaz serynowych, a zwłaszcza proteazy wirusa NS3 zapalenia wątroby C, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie inhibitorów proteaz serynowych |
| US7749498B2 (en) * | 1997-03-10 | 2010-07-06 | Genentech, Inc. | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| US20060235209A9 (en) * | 1997-03-10 | 2006-10-19 | Jin-An Jiao | Use of anti-tissue factor antibodies for treating thromboses |
| US5986065A (en) * | 1997-03-10 | 1999-11-16 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| US20030109680A1 (en) * | 2001-11-21 | 2003-06-12 | Sunol Molecular Corporation | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof |
| WO1999005292A1 (fr) * | 1997-07-22 | 1999-02-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de criblage de genes utilisant les recepteurs nucleaires |
| US6884870B2 (en) * | 1998-03-20 | 2005-04-26 | California Institute Of Technology | Fusion proteins for identifying proteases, protease target sites and regulators of protease activity in living cells |
| EP1177211B1 (en) * | 1999-05-04 | 2008-02-20 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Surrogate cell-based system and method for assaying the activity of hepatitis c virus ns3 protease |
| US20040033600A1 (en) * | 2001-03-21 | 2004-02-19 | Palli Subba Reddy | Ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
| SV2003000617A (es) * | 2000-08-31 | 2003-01-13 | Lilly Co Eli | Inhibidores de la proteasa peptidomimetica ref. x-14912m |
| US8105825B2 (en) * | 2000-10-03 | 2012-01-31 | Intrexon Corporation | Multiple inducible gene regulation system |
| US9493540B2 (en) | 2001-02-20 | 2016-11-15 | Intrexon Corporation | Ecdysone receptor/invertebrate retinoid X receptor-based inducible gene expression system |
| JP4955905B2 (ja) * | 2001-02-20 | 2012-06-20 | イントレキソン コーポレーション | キメラレチノイドｘ受容体および新規エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるそれらの使用 |
| US8715959B2 (en) | 2001-02-20 | 2014-05-06 | Intrexon Corporation | Substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
| US9249207B2 (en) | 2001-02-20 | 2016-02-02 | Intrexon Corporation | Substitution mutant receptors and their use in an ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
| US20030049712A1 (en) * | 2001-07-31 | 2003-03-13 | Michael Haugwitz | Method of detecting protease activity in a cell |
| CN101684161A (zh) * | 2001-08-10 | 2010-03-31 | 阿赫姆生物系统公司 | 蛋白酶检测系统 |
| EP1436394A4 (en) * | 2001-09-26 | 2004-12-29 | Rheo Gene Holdings Inc | CICADA ECDYSON RECEPTOR NUCLEIC ACIDS, POLYPEPTIDES AND THEIR USE |
| US20030190705A1 (en) * | 2001-10-29 | 2003-10-09 | Sunol Molecular Corporation | Method of humanizing immune system molecules |
| JP2003180393A (ja) * | 2001-12-13 | 2003-07-02 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | レポータージーンアッセイ法 |
| AU2003230710A1 (en) * | 2002-03-25 | 2003-11-10 | Applera Corporation | Systems and methods for detection of nuclear receptor function using reporter enzyme mutant complementation |
| WO2004043916A1 (en) | 2002-11-12 | 2004-05-27 | Merck & Co., Inc. | Phenylcarboxamide beta-secretase inhibitors for the treatment of alzheimer's disease |
| US7304161B2 (en) | 2003-02-10 | 2007-12-04 | Intrexon Corporation | Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex |
| US7456315B2 (en) | 2003-02-28 | 2008-11-25 | Intrexon Corporation | Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
| WO2004085611A2 (en) * | 2003-03-21 | 2004-10-07 | The Research Foundation Of State University Of New York | Model for mutually exclusive domain folding molecular switch |
| CN1863556B (zh) * | 2003-06-19 | 2012-05-16 | 吉宁特有限公司 | 用于治疗凝血相关紊乱的组合物和方法 |
| CN1894581B (zh) * | 2003-07-09 | 2012-02-01 | 生命技术公司 | 检测蛋白-蛋白相互作用的方法 |
| US20070224615A1 (en) * | 2003-07-09 | 2007-09-27 | Invitrogen Corporation | Methods for assaying protein-protein interactions |
| MY148123A (en) | 2003-09-05 | 2013-02-28 | Vertex Pharma | Inhibitors of serine proteases, particularly hcv ns3-ns4a protease |
| CA2538843A1 (en) * | 2003-09-12 | 2005-03-24 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Animal model for protease activity and liver damage |
| WO2005040212A2 (en) * | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Orthogonal gene switches |
| US20050214890A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-09-29 | Zhiqun Tan | Novel "Cleave-N-Read" system for protease activity assay and methods of use thereof |
| US7935510B2 (en) | 2004-04-30 | 2011-05-03 | Intrexon Corporation | Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
| EA011879B1 (ru) | 2004-09-24 | 2009-06-30 | Эмджин Инк. | МОЛЕКУЛЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ Fc ФРАГМЕНТОМ |
| JP2009505966A (ja) * | 2005-08-02 | 2009-02-12 | バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | セリンプロテアーゼのインヒビター |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| US8399615B2 (en) | 2005-08-19 | 2013-03-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Processes and intermediates |
| US7964624B1 (en) | 2005-08-26 | 2011-06-21 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of serine proteases |
| AR055395A1 (es) | 2005-08-26 | 2007-08-22 | Vertex Pharma | Compuestos inhibidores de la actividad de la serina proteasa ns3-ns4a del virus de la hepatitis c |
| EP1991229A2 (en) | 2006-02-27 | 2008-11-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same |
| CA2646229A1 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-27 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Deuterated hepatitis c protease inhibitors |
| AP2009004960A0 (en) | 2007-02-27 | 2009-08-31 | Vertex Pharma | Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same |
| CA2679426A1 (en) | 2007-02-27 | 2008-09-04 | Luc Farmer | Inhibitors of serine proteases |
| EP2137213A4 (en) * | 2007-03-27 | 2010-06-09 | Christopher M Hovens | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PROSTATE CANCER |
| EP2436682A1 (en) * | 2007-08-30 | 2012-04-04 | Vertex Pharmceuticals Incorporated | Co-crystals and pharmaceutical compositions comprising the same |
| AU2014227571B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-02 | Intrexon Corporation | Boron-containing diacylhydrazines |
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| KR20200080749A (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 n-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0421109A3 (en) * | 1989-09-11 | 1992-01-08 | American Cyanamid Company | Screening methods for protease inhibitors |
| US5599906A (en) * | 1990-04-13 | 1997-02-04 | Schering Corporation | Protease assays |
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| US5413914A (en) * | 1993-07-07 | 1995-05-09 | The Regents Of The University Of Colorado | Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases |
| US5861267A (en) * | 1995-05-01 | 1999-01-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity |
| TR200003861T2 (tr) * | 1995-05-26 | 2001-04-20 | Zeneca Limited | Bir ekdison reseptörünü içeren bir gen anahtarı. |
| EP0910652B1 (en) * | 1996-04-05 | 2014-10-08 | The Salk Institute For Biological Studies | Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
| WO1998041866A1 (en) * | 1997-03-14 | 1998-09-24 | Merck & Co., Inc. | A high throughput assay using fusion proteins |
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