ES2303380T3 - Regiones de la helicasa e1 del virus del papiloma implicadas en la oligomerizacion de e1. - Google Patents
Regiones de la helicasa e1 del virus del papiloma implicadas en la oligomerizacion de e1. Download PDFInfo
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Abstract
Un péptido de una proteína E1 definido por la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO. 2.
Description
Regiones de la helicasa E1 del virus del
papiloma implicadas en la oligomerización de E1.
La presente invención se refiere a una secuencia
de aminoácidos comprendida en la proteína E1 del virus del
papiloma, necesaria para la homo-oligomerización de
la proteína E1. Esta oligomerización es una etapa esencial en la
iniciación de la replicación del DNA vírico. Además, la invención
describe un método de rastreo y un sistema de rastreo capaces de
seleccionar agentes capaces de interferir con esta interacción
proteína-proteína. Más aún, la invención se refiere
además a un sistema para la selección de agentes capaces de modular
esta interacción de proteína-proteína para uso en
el tratamiento y control de infecciones PV (producidas por el virus
del papiloma) en animales.
Los papilomavirus (PV) son
virus-DNA que carecen de envolvente, que inducen
lesiones hiperproliferativas de los epitelios. Los papilomavirus
están extendidos en la naturaleza y se han reconocido en los
vertebrados superiores. Los virus han sido caracterizados, entre
otros, en seres humanos, animales de ganado, conejos, caballos y
perros. El primer papilomavirus se describió en 1933 como el
papilomavirus del conejo "cola de algodón" (CRPV, del inglés
cottontail rabbit papillomavirus). Desde
entonces, el conejo cola de algodón así como el papilomavirus
bovino de tipo I (BPV-1) han servido como prototipos
experimentales en estudios sobre papilomavirus. La mayoría de los
papilomavirus animales están asociados con lesiones proliferativas
puramente epiteliales, y la mayoría de las lesiones en animales son
cutáneas. En los seres humanos, hay más de 75 tipos de
papilomavirus (HPV) que han sido identificados y se han catalogado
por el sitio de infección: epitelio cutáneo y epitelio mucosal
(mucosa oral y genital). Las enfermedades clasificadas como cutáneas
incluyen verrugas planas, verrugas plantares, etc. Las enfermedades
clasificadas como mucosales incluyen los papilomas de laringe y las
enfermedades anogenitales que comprenden carcinomas cervicales
(Fields, 1996, Virology, 3ª ed. Lippincott - Raven Pub.,
Philadelphia, N.Y.).
Hay más de 25 tipos de HPV que están implicados
en las enfermedades anogenitales, clasificándose éstos en tipos de
"bajo riesgo" y de "alto riesgo". Los tipos de bajo riesgo
incluyen HPV tipo 6, tipo 11 y tipo 13 e inducen principalmente
lesiones benignas tales como condyloma acuminata (verrugas
genitales) y lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo
(SIL). En los Estados Unidos hay aproximadamente 5 millones de
personas con verrugas genitales de las cuales el 90% se atribuyen a
HPV-6 y HPV-11. Aproximadamente el
90% de SIL también está causado por los tipos 6 y 11 de bajo
riesgo. El 10% restante de SIL está causado por HPVs de alto
riesgo.
Los tipos de alto riesgo están asociados con SIL
de grado alto y cáncer cervical e incluyen con la mayor frecuencia
los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 y 58 de HPV. La progresión de
SIL de grado bajo a SIL de grado alto es mucho más frecuente para
lesiones que contienen HPV-16 y 18 de alto riesgo,
en comparación con las que contienen los tipos HPV de bajo riesgo.
Además, sólo se detectan frecuentemente cuatro tipos de HPV en
cáncer cervical (tipos 16, 18, 31 y 45). Anualmente se diagnostican
aproximadamente 500.000 nuevos casos de cáncer invasivo de cuello
de útero en todo el mundo (Fields, 1996, supra).
Los tratamientos para las verrugas genitales
incluyen la extirpación física tal como crioterapia, CO_{2},
láser, electrocirugía o extirpación quirúrgica. También se pueden
utilizar agentes citotóxicos tales como ácido tricloroacético
(TCA), podofilina o podofilox. También están disponibles los agentes
inmunomoduladores tales como el Interferón o el Imiquimod. Estos
tratamientos no son completamente eficaces en la eliminación de
todas las partículas virales y, o bien se incurre en un alto coste
o bien produce efectos secundarios desagradables. De hecho,
actualmente no hay ningún tratamiento antiviral eficaz para la
infección HPV. Con todas la terapias actuales las verrugas
recurrentes son habituales (Beutner & Ferenczy, 1997, Amer. J.
Med., 102(5A):28-37).
La ineficacia de los métodos actuales para
tratar infecciones HPV ha demostrado la necesidad de identificar
nuevos medios para controlar o eliminar tales infecciones. En los
últimos años, se han dirigido esfuerzos a la búsqueda de compuestos
antivirales, y especialmente compuestos capaces de interferir con la
replicación viral (Hughes y Romanos, 1993, Nucleic Acids Res.
21:5817-5823; Clark y col., Antiviral
Res., 1998, 37(2):97-106; Hajduk y
col., 1997, J. Med. Chem.,
49(20):3144-3150 y Cowsert y
col., 1993, Antimicrob. Agents. Chemother.,
37(2):171-177). Para este fin, ha sido
importante por lo tanto estudiar la genética de los HPV con el fin
de identificar dianas quimioterapéuticas potenciales para contener y
posiblemente eliminar todas las enfermedades causadas por
infecciones HPV.
El ciclo vital del PV está estrechamente
acoplado a la diferenciación de los queratinocitos. Se cree que la
infección ocurre en un sitio de rotura de tejido en el epitelio
basal. A diferencia de las células normales, la división celular
continúa mientras que la célula experimenta una diferenciación
vertical. Como las células infectadas experimentan una
diferenciación progresiva, se mantiene la maquinaria celular que
permite que se incremente la expresión génica viral, terminando con
la expresión génica tardía y el empalme de los viriones en
queratinocitos finalmente diferenciados y con la liberación de
partículas virales (Fields, supra).
La cadena codificante para cada uno de los
papilomavirus contiene aproximadamente diez marcos de lectura
abiertos (ORF, del inglés open reading frames)
traduccionales designados que han sido clasificados como, o bien ORF
precoces u ORF tardíos. Los genes E1 a E8 se expresan precozmente
en el ciclo de replicación viral. Los dos genes tardíos (L1 y L2)
codifican las proteínas mayoritaria y minoritaria de la envolvente,
respectivamente. Los productos génicos E1 y E2 funcionan en la
replicación de DNA viral, mientras que E5, E6 y E7 modulan la
proliferación en la célula hospedante. L1 y L2 están implicados en
la estructura del virión. Las funciones de los productos génicos
E3, E4 y E8 está por esclarecer actualmente.
Estudios de HPV han demostrado que las proteínas
E1 y E2 son las únicas proteínas virales requeridas para la
replicación de DNA viral in vitro (Kuo y col., 1994, J. Biol.
Chem. 30: 24058-24065). Este requisito es similar
al del papilomavirus bovino de tipo 1 (BPV-1). En
realidad, hay un alto grado de similitud entre las proteínas E1 y
E2 y las secuencias ori de todos los papilomavirus (PV)
independientemente de la especie viral y el tipo (Kuo y col., 1994,
supra). En particular, E1 es la proteína más altamente
conservada en PV y se presume que su actividad enzimática será
similar para todos los tipos de PV (Jenkins, 1996, J. Gen. Virol.
77:1805-1809). Por lo tanto, cabe esperar que todos
los productos génicos E1 de diferente PV tengan estructura y
función similares. Además, la proteína E1 de PV presenta similitudes
de secuencia y estructura con la proteína T larga de poliomavirus y
virus 40 de simio (Clertant y Seif, 1984, Nature
311:276-279 y Mansley y col., 1997, J. Virology
71:7600-7608).
La proteína E2 es un activador transcripcional
que se une a la proteína E1, y estas dos proteínas y la secuencia
ori forman un complejo ternario (Mohr y col., 1990, Science
250:1694-1699). Se cree que E2 intensifica la unión
de E1 al origen de replicación de BPV (Seo y col., 1993b, Proc.
Natl. Acad. Sci., 90:2865-2869). En HPV, Lui y col.
sugirieron que E2 estabiliza la unión de E1 al ori (1995, J. Biol.
Chem. 270(45):27283-27291 y McBride y col.,
1991, J. Biol. Chem 266:18411-18414).
La evidencia que emana de los estudios de
BPV-1 ha demostrado que E1 posee actividades de
ATPasa y helicasa que son necesarias en la iniciación de la
replicación del DNA viral (Seo y col., 1993a, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:702-706; Yang y col., 1993, Proc. Natl.
Acad. Sci. 90:5086-5090; y MacPherson y col., 1994,
Virology 204:403-408).
La proteína E1 de BPV es una proteína nuclear
fosforilada que tiene funciones relacionadas con la replicación.
Éstas incluyen la unión al DNA y al ATP y actividades de ATPasa y
helicasa. Los estudios de los mapas de deleción han identificado
los aminoácidos 121-311 como la región necesaria
para la unión al DNA. Las mutaciones dentro de esta región obvian
la unión al DNA por la proteína E1 de longitud completa (Leng y
col., 1997, J. Virol. 71:848-852 y
Thorner y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:898-902). La segunda función, unión al ATP y
actividad de ATPasa, es esencial para la replicación del DNA. Las
mutaciones en un punto dentro de regiones conservadas en el dominio
de unión al ATP inactivan la capacidad que muestra E1 para unirse al
ATP o para hidrolizarlo, con la pérdida consiguiente de replicación
del DNA (MacPherson y col., 1994, Virology
204:403-408; Raj y Stanley, 1995, J. Gen.
Virol. 76:2949-2956 y Sun y col.,
1990, J. Virol 64:5093-5105). La tercera
actividad poseída por la proteína E1, es la actividad de helicasa o
el desenrollamiento del DNA por delante del tenedor de replicación.
Hay estudios que predicen que la actividad de helicasa reside en el
dominio de unión al DNA, aminoácido 121 a través de la región de
unión a ATPasa/nucleótido, aproximadamente aminoácido 530 (Sverdrup
y Myers, Human Papillomaviruses, 1997, Published by Theoretical
Biology and Biophysics).
Cuando la replicación del DNA viral transcurre
in vitro, y cuando está presente un exceso de proteína E1,
la replicación transcurre en ausencia de E2. In vivo, en
presencia de una gran cantidad de DNA celular, la replicación
requiere la presencia tanto de E1 como de E2. E2 actúa como un
factor de especificidad dirigiendo E1 al origen de replicación
(Sedman y Stenlund, 1995, Embo. J.
14:6218-6228). El mecanismo para iniciar la
replicación in vivo se cree que implica la unión cooperante
de E1 y E2 al origen, con lo que E1 y E2 forman un complejo. Estas
interacciones de DNA-proteína y
proteína-proteína ocurren en el origen de
replicación del DNA (Sverdrup y Myers, supra).
La comprensión de los mecanismos de la proteína
E1 como helicasa, presumiblemente capaz de desenrollar el DNA en el
origen y por delante del tenedor de replicación, es una de las
ventajas de esta invención. En base a los estudios de PV y a la
replicación de DNA de SV40, se ha propuesto un modelo bifásico para
la iniciación de la replicación para PV (Sverdrup y Myers,
supra). En una primera etapa, E1 y E2 se unen cooperantemente
al origen de replicación, garantizando así la especificidad de
unión hacia el origen de replicación. En una segunda etapa,
monómeros E1 adicionales son reclutados en el origen con la pérdida
consiguiente de E2. Se piensa que la formación del complejo
homo-oligomérico de E1 en el origen es necesario
para la actividad de replicación del DNA y el reclutamiento de la
maquinaria de replicación celular en la iniciación de la síntesis
del DNA (Sverdrup y Myers, supra).
Como todavía no hay ningún agente terapéutico
eficaz para prevenir, controlar, disminuir o eliminar la infección
PV, ha llegado a ser importante estudiar el ciclo vital de PV con
mayor detalle y desarrollar específicamente un mejor entendimiento
de la replicación del DNA viral. Sorprendentemente hay pocos
conocimientos en cuanto al mecanismo de oligomerización de E1 in
vivo o in vitro. La técnica anterior no se manifiesta en
cuanto a la localización de la región a lo largo de la proteína E1
que es necesaria para esta interacción
proteína-proteína, en la formación del complejo
oligomérico de E1.
Así pues, persiste una necesidad de proporcionar
un entendimiento del mecanismo y el o los elemento(s)
implica-
do(s) en esta oligomerización. El conocimiento de este procedimiento proporciona una diana terapéutica potencialmente nueva contra PV.
do(s) en esta oligomerización. El conocimiento de este procedimiento proporciona una diana terapéutica potencialmente nueva contra PV.
Por lo tanto, una de las ventajas de la presente
invención es identificar una región de aminoácidos en la proteína
E1 necesaria para esta autoasociación aparente.
Además, la localización de esta región por la
solicitante proporciona una nueva diana terapéutica potencial en el
tratamiento de infecciones PV. Por lo tanto, una ventaja adicional
de la invención es proporcionar un método de rastreo para
identificar agentes capaces de modular esta nueva diana y un sistema
para seleccionar al menos un agente de esta clase capaz de
interferir con la replicación del DNA de PV.
La presente invención se refiere a la
elucidación de algunas de la etapas necesarias para iniciar la
replicación del DNA del papilomavirus. Más particularmente, el
papel de la proteína E1 (a.a. 1-649) (SEQ ID No. 1)
en la replicación del DNA viral. Lo más particularmente, la
necesidad de oligomerización de la proteína E1 de PV como una etapa
que precede al desenrollamiento del DNA viral y a la replicación del
DNA.
Por lo tanto, de acuerdo con la primera
realización de la presente invención, se proporciona una secuencia
de aminoácidos comprendida dentro de la región A de la proteína E1
de PV, delineada por los aminoácidos 352 y 439, y cualquier
derivado, variante o fragmento de la misma, necesaria para la
oligomerización de la proteína E1. Esta secuencia de aminoácidos es
capaz de autoasociarse y de asociarse con la proteína E1 de longitud
completa y cualquier derivado, variante o fragmento de la misma,
que comprende la secuencia de esta invención.
De acuerdo con esta primera realización, se
proporciona una secuencia de aminoácidos necesaria para la
oligomerización de la proteína E1 de PV. Esta región o dominio de
aminoácidos, numerada a partir de la secuencia de aminoácidos del
virus del papiloma humano (HPV) tipo 11, esta delineada por los
aminoácidos 352 y 439. En un aspecto particular de esta primera
realización, la secuencia de aminoácidos está delineada además por
los aminoácidos 352 y 432. En un aspecto más particular de esta
primera realización, la secuencia de aminoácidos está delineada
además por los aminoácidos 352 y 417. La solicitante fue la primera
en identificar este dominio comprendido dentro de la proteína E1 de
PV como la secuencia de aminoácidos necesaria para la
oligomerización de la proteína E1, que es una etapa previa esencial
en la iniciación de la replicación del DNA viral. Por lo tanto, un
aspecto específico de esta primera realización es el dominio de
aminoácidos de esta invención delimitado por los aminoácidos 353 a
438 de la proteína
E1 de PV. Más particularmente, el dominio de aminoácidos de esta invención es el que se define por SEQ ID NO. 2.
E1 de PV. Más particularmente, el dominio de aminoácidos de esta invención es el que se define por SEQ ID NO. 2.
La solicitante también fue la primera en
reconocer que la elucidación de esta secuencia de aminoácidos
proporciona una nueva diana terapéutica para el control, la
prevención, la eliminación y el tratamiento de infecciones por PV
en mamíferos.
Por lo tanto, de acuerdo con una segunda
realización de esta invención, se proporciona un ensayo de rastreo
para evaluar la unión E1/DNA (y de aquí la oligomerización de la
proteína E1) por detección y/o medición de la cantidad de DNA
co-precipitado con la proteína E1.
Sin pretender vincularse a ninguna teoría, la
solicitante ha lanzado la hipótesis de que la medición de la
auto-oligomerización de E1 puede correlacionarse
indirectamente por medición del DNA
co-inmunoprecipitado con esta proteína E1. Por
analogía con E1 de BPV, la solicitante anticipó que la
oligomerización de E1 ocurriría tras unirse al origen de modo que
la medición de la cantidad de ori unido a E1 sería una medida
indirecta de la proteína E1 oligomerizada.
La solicitante ha probado ahora que esta
hipótesis es correcta mediante el diseño de un ensayo de
reticulación y mostrando la correlación entre este ensayo de
reticulación y el ensayo de oligomerización de acuerdo con las
primeras realizaciones de esta invención.
Por lo tanto, de acuerdo con una tercera
realización de esta invención, se proporciona un ensayo de
reticulación para medir directamente el nivel de oligomerización (o
inhibición de la misma) de la proteína E1.
De acuerdo con una cuarta realización de esta
invención, se proporciona una proteína E1 truncada en su región
N-terminal. De modo más particular, un aspecto de
esta cuarta realización abarca la proteína E1 delimitada por los
aminoácidos 72 a 649 (SEQ ID No. 78).
Otros objetos, ventajas y aspectos de la
presente invención llegarán a ser más evidentes tras la lectura de
la siguiente descripción no restrictiva de las realizaciones
preferidas con referencia a los dibujos anejos, que es ilustrativa
y no debe considerarse como limitante del alcance de la presente
invención.
Habiendo descrito así la invención de un modo
general, ahora se hará referencia a los dibujos anejos, que
muestran a modo de ilustración una realización preferida de la
misma, y en la que:
La Figura 1A muestra los resultados de la
interacción E1-E1 en el sistema de dos híbridos de
levadura utilizado para representar la región de la proteína E1 que
es necesaria para la interacción proteína-proteína.
En este sistema, un producto de fusión del dominio activante de
GAL4 (AD) y una proteína E1 de longitud completa (aminoácidos
1-649; SEQ ID No. 1) se
co-transfecta con productos de fusión constituidos
por una serie de deleciones en el extremo
N-terminal de la proteína E1 de
HPV-11 y el dominio de unión al DNA (BD) de GAL4. La
alta actividad transcripcional está presente solamente cuando la
interacción de las dos proteínas en las moléculas híbridas
interaccionan suficientemente para poner el AD y el BD de GAL4 y
en estrecha proximidad con objeto de permitir la actividad
transcripcional de GAL4. En la parte superior de la Figura se
muestra un diagrama de la proteína E1. Las cajas de color gris
marcadas A, B, C y D representan regiones de E1 que tienen un gran
similitud de secuencia con antígenos T grandes de SV40 y
poliomavirus. Las cajas negras indican la posición de los dominios
de unión al DNA y al ATP en E1. Las porciones de E1 comprendidas en
estas proteínas de fusión están indicadas. Los niveles de actividad
de \beta-galactosidasa se miden en células de
levadura co-transformadas con los dos plásmidos,
una proteína de fusión con el BD de GAL4 y una proteína de fusión
con el AD de GAL4. Como se puede observar, los 71 primeros
aminoácidos del extremo N-terminal de E1 en la
molécula híbrida del BD, han sido eliminados para evitar la
transcripción del gen informador Lac Z debido a la presencia de un
dominio de activación dentro de esta región de aminoácidos de
E1.
La Figura 1B muestra un diagrama de la proteína
E1 en el extremo C-terminal, que indica la posición
de las regiones conservadas A a D. Las moléculas E1 truncadas del
extremo N-terminal, que tienen una serie de
deleciones C-terminales son fusionadas al AD de
GAL4 y co-transfectadas con una E1
N-terminal truncada (330-649 de SEQ
ID No. 1) fusionada al BD de GAL4. Las porciones de E1 comprendidas
en estos productos de fusión están indicadas, al igual que los
niveles de actividad de \beta-galactosidasa. En
este experimento, se demuestra que el producto de fusión formado
por el fragmento de proteína (353-416; SEQ ID No. 4)
conduce a actividad de \beta-galactosidasa
medible.
La Figura 1C muestra la
auto-asociación de fragmentos de E1 en levadura. Se
ensayan tres fragmentos diferentes de E1 que tienen truncaciones N
y C-terminales en el sistema de dos híbridos de
levadura. Para comparar, también se ensayó cada fusión
E1-AD en cuanto a la interacción con E1
(330-649 de SEQ ID No. 1) fusionada al BD de GAL4 o
con el BD de GAL4 a solas. Los niveles de actividad de
\beta-galactosidasa obtenidos muestran que la
región de E1 (aminoácidos 353-416; SEQ ID No. 4) es
suficiente para auto-asociación así como interacción
con una región mayor de la proteína E1 (330-649 de
SEQ ID No. 1).
La Figura 2 muestra el efecto de las
sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión al ATP
conservado sobre la interacción E1-E1. Utilizando
el sistema de dos híbridos de levadura, se midió la actividad de
\beta-galactosidasa en células de levadura
co-transfectadas con E1 de tipo salvaje (WT)
(330-649) fusionada al AD de GAL4 y una E1 de tipo
salvaje (353-649; SEQ ID No. 5) o un derivado
mutante [P479S (SEQ ID No. 6), K484E (SEQ ID No. 7) y K484Q (SEQ ID
No. 8)] fusionado al BD de GAL4. Como controles, se utilizaron
plásmidos con el AD de GAL4 y con el BD de GAL4 a solas. Se indica
que las sustituciones en la agrupación Walker A (bucle P) de E1,
disminuyen la cantidad de actividad de
\beta-galactosidasa, demostrando que estas
sustituciones comprometen la capacidad de E1 para
auto-asociarse.
La Figura 3A muestra los resultados de un ensayo
para vigilar la unión de E1 al origen de replicación de DNA de HPV.
Se formaron complejos de proteína-DNA, o bien con E1
de tipo salvaje (aminoácidos 1-649; SEQ ID No. 1),
o una E1 truncada en su extremo N-terminal (E1*
=aminoácidos 72-649, SEQ ID No. 78), o en ausencia
de E1 (-E1). Los complejos E1-DNA se
inmunoprecipitaron con un anticuerpo dirigido contra E1, y el DNA
co-precipitado, junto con 0,5% de la cantidad de
sonda utilizada en la reacción de unión, se visualizaron por
electroforesis y autorradiografía. La autorradiografía indica que
la proteína E1 truncada en su extremo N-terminal
(SEQ ID No. 78) tiene mayor afinidad por el origen que la proteína
E1 de longitud completa. Una flecha indica el fragmento de la sonda
que contiene el origen.
La Figura 3B muestra el efecto de sustituciones
de aminoácidos en el dominio de unión al DNA de E1 sobre la unión
de E1 al origen utilizando el ensayo de
co-inmunoprecipitación de DNA. La posición de las
dos diferentes sustituciones dobles de aminoácidos en E1 se indican
junto con la secuencia principal de E1 entre los aminoácidos 280 y
300. Las reacciones de unión se llevaron a cabo como se describe
para la Figura 3A. Los resultados de la autorradiografía demuestran
que esta sustituciones abolieron la unión de E1 al origen.
La Figura 3C muestra el efecto de una triple
mutación de nucleótidos en el origen de HPV-11 sobre
la unión de E1 al origen. El origen de HPV-11 está
representado esquemáticamente con los tres sitios de unión l E2
(cajas negras marcadas "E2"), el sitio de unión a E1 (caja
gris) y una región rica en AT (caja abierta). La secuencia de una
porción del sitio de unión a E1 se indica junto con la posición de
tres cambios de nucleótidos en el origen mutante. Las reacciones de
unión se llevaron a cabo como se describe para la Figura 3A. La
autorradiografía demuestra que la presencia de una mutación triple
en el origen de replicación de HPV inhibía la unión de la proteína
E1 al origen.
La Figura 4A muestra una representación
esquemática de la serie de deleciones generadas para representar el
dominio de E1 requerido para la unión al origen viral de replicación
de DNA in vitro. Se produjeron proteínas E1 truncadas in
vitro y se ensayaron para evaluar la unión al origen viral como
se describe para la Figura 3A. Las proteínas truncadas en su
extremo N-terminal se inmunoprecipitaron utilizando
un anticuerpo policlonal dirigido contra el extremo C de E1. Las
proteínas truncadas en el extremo C-terminal se
marcaron en su extremo N con el epítopo FLAG y se
inmunoprecipitaron utilizando un anticuerpo monoclonal
anti-FLAG.
La Figura 4B muestra los resultados de las
deleciones indicadas en 4A. La autorradiografía demuestra que la
región de E1 necesaria para la unión al origen comprende los
aminoácidos 191-649 que incluye la secuencia de
aminoácidos de esta invención necesaria para la oligomerización de
E1-E1. Las deleciones en el extremo C abolen la
unión al origen.
La Figura 5A muestra una
SDS-PAGE teñida con azul Coomassie de las proteínas
de fusión tiorredoxina (TRX) que contienen la porción indicada de
E1 expresada en E. coli y purificada por cromatografía de
afinidad en níquel. La región de aminoácidos de cada fragmento se
indica en la parte superior de las calles. Para cada proteína de
fusión, se analizaron dos preparaciones independientes.
La Figura 5B muestra el efecto del exceso de
productos de fusión TRX-E1 sobre la unión de E1
(72-649 de SEQ ID No. 1) al origen viral. Las
reacciones de unión se llevaron a cabo como se ha descrito en la
Figura 4A. A las reacciones de unión, se añadieron proteínas de
fusión de TRX, o TRX a solas, a una concentración de
aproximadamente 8 \muM, que corresponde a un exceso molar de 300
veces en relación con E1 (72-649). La molécula de
fusión TRX-E1 (353-431; SEQ ID No.
3) indicó el efecto inhibidor máximo y el fragmento
TRX-E1 (353-416; SEQ ID No. 4) no
demostró ninguna inhibición aparente. TRX a solas no mostró ninguna
unión medible al origen.
La Figura 5C muestra el efecto de una
concentración diferente de la molécula de fusión
TRX-E1 (353-431; SEQ ID No. 3)
sobre la unión de E1 al origen. Se utilizaron concentraciones
decrecientes de TRX-E1 (353-649; SEQ
ID No. 5) para estimar la CI50 a la que esta proteína de fusión
inhibe la unión de E1 al origen viral. A partir de estos datos se
estimó la CI50 a aproximadamente 3 \muM.
La Figura 6A muestra el efecto de la temperatura
y de los nucleótidos sobre la unión de E1* al origen viral. La
unión de E1* (SEQ ID No. 78) al origen viral se realizó a tres
temperaturas diferentes (4º, 23º y 37ºC) y en presencia de (+
ATP/Mg) o ausencia (- ATP/Mg) de ATP/Mg a una concentración de 5 y 3
mM, respectivamente. En ausencia de ATP/Mg la unión de E1 al origen
parece ser parcialmente inhibida a 4ºC, inalterada a 23ºC y
drásticamente diminuida a 37ºC. La adición de ATP/Mg a 37ºC invierte
este efecto relacionado con la temperatura.
La Figura 6B muestra que solamente ADP y ATP en
combinación con magnesio son capaces de estimular la unión de E1 al
origen. La unión de E1 al origen se realizó en ausencia de
nucleótido (- nuc) o en presencia del trifosfato de nucleósido
indicado a una concentración de 5 mM. "Adeno." indica adenosina
y "cAMP" indica AMP cíclico.
La Figura 6C muestra el efecto de la unión de E1
al origen en ausencia de nucleótido (-nuc) y en presencia de los
nucleótidos (CTP, GTP y UTP) y los desoxinucleótidos (dATP, dCTP,
dGTP y dTTP). Los resultados de la autorradiografía indican que los
nucleótidos y desoxinucleótidos son capaces de estimular la unión de
E1 al origen. Los análogos no hidrolizables
(ATP-\gamma-S y
GTP-\gamma-S) también son
estimuladores, lo que indica que es necesaria la unión del
substrato, pero no su hidrólisis, para la unión de E1 al origen.
La Figura 7A indica una representación
esquemática de la proteína E1. Las cajas grises indican las
posiciones de la región A, B, C y D que tienen gran similitud de
secuencias con antígenos T grandes de SV40 y poliomavirus, y del
dominio de unión al DNA. Se indican las posiciones de las
agrupaciones conservadas A y C que están presentes en miembros de
la superfamilia 3 de las proteínas que se unen a NTP junto con una
alineación de estas secuencias a partir del antígeno T de SV40,
BPV-1 y HPV-11 y
HPV-6b. Se indica la secuencia de aminoácidos en
consenso de cada agrupación. Los restos que se mutaron se indican
por una flecha.
La Figura 7B muestra los resultados de E1* (SEQ
ID No. 78), o los derivados mutantes indicados, ensayados en cuanto
a la unión al origen viral como se describe en la Figura 4A. Los
resultados indican que las sustituciones en los restos conservados
en la agrupación A, reducían la capacidad de E1 para unirse al
origen, indicando que la unión de ATP a E1 es importante en la
unión de E1 al origen. Las sustituciones en la agrupación C no
parecían afectar a la unión de E1 al origen.
La Figura 8A muestra el efecto de sustituciones
en la región A conservada de E1 sobre la unión de E1 al origen
viral. Una representación esquemática de la proteína E1 en la que
las cajas grises indican las posiciones de las regiones A, B, C y D
que tienen alta similitud de secuencia con antígenos T grandes
procedentes de poliomavirus, y del dominio de unión al DNA. Se
muestra una alineación de la región A conservada a partir de
antígeno T de SV40, BPV-1 y HPV-11.
Los restos altamente conservados de esta región figuran en cajas
grises. Los restos que fueron mutados también están indicados.
La Figura 8B muestra el efecto de seis
sustituciones independientes en la región A, sobre la unión de E1 al
origen. E1* (SEQ ID No. 78), o los derivados mutantes indicados, se
ensayaron en cuanto a la unión al origen viral esencialmente como
se describe en la Figura 4A. Las reacciones de unión se llevaron a
cabo o bien a 23ºC en ausencia de ATP/Mg con suplemento, o 37ºC en
reacciones complementadas con ATP/Mg a concentraciones de 5 y 3 mM,
respectivamente. Todas las sustituciones ensayadas disminuyeron la
unión, indicando que la región A conservada es importante para que
E1 se una al origen.
La Figura 9A muestra el efecto de sustituciones
en la región A conservada de E1 sobre la formación del complejo
E1-E2 ori in vitro, y sobre una replicación
temporal del DNA de HPV en las células. Efecto sobre la formación
del complejo E1-E2-ori in
vitro. Se forman complejos de DNA-proteína sin
E1 (-E1), o bien con E1 de tipo salvaje E1 (1-649;
SEQ ID No.1) o con el E1 mutante indicado se llevan las
sustituciones en la región A conservada. Los complejos se
inmunoprecipitaron con un anticuerpo dirigido contra E1, y el DNA
unido se visualizó por electroforesis y autorradiografía. Tres de
las sustituciones Y389A (SEQ ID No. 9); F393A (SEQ ID No. 10) y
N389A (SEQ ID No. 11) muestran una reducción sustancial en la
formación del complejo. Dos sustituciones A390G (SEQ ID No. 12) y
Q399A (SEQ ID No. 13) muestran un efecto poco pronunciado y la
sustitución F378A (SEQ ID No. 14) parece mostrar un efecto modesto.
Estos resultados indican que esta región A conservada desempeña una
función en la formación del complejo
E1-E2-ori.
La Figura 9B muestra el efecto de las seis
sustituciones sobre la replicación temporal de HPV. La cantidad de
plásmido que contiene el origen replicado (ori), o de plásmido
testigo interno (plásmido que expresa E1, E1), fue detectada por
análisis PCR cuantitativo. La amplificación PCR se realizó sobre DNA
genómico aislado a partir de células transfectadas con un plásmido
que expresa E1 (-E2), o transfectado con una combinación de
plásmidos que expresan E2 y E1 (ya sea las proteínas E1 de tipo
salvaje o mutantes indicadas). También se transfectaron todas las
células con el plásmido pN9 que contiene el origen. Los productos de
PCR se visualizaron por electroforesis y autorradiografía. Las
proteínas E1 mutantes con sustituciones F378A (SEQ ID No. 14),
A390G (SEQ ID No. 12) y Q399A (SEQ ID No. 13) indican niveles
reducidos de replicación, los otros tres mutantes no mostraron
ninguna actividad
de replicación. Estos resultados indican que la región A es importante para la replicación temporal de DNA de HPV.
de replicación. Estos resultados indican que la región A es importante para la replicación temporal de DNA de HPV.
Figura 10. Reticulación de E1* radiomarcada que
demuestra la formación de oligómeros, que corresponden en tamaño al
monómero (1), dímero (2), trímero (3), tetrámero (4), pentámero (5)
y hexámero (6) de E1*. La formación de oligómeros de E1* se
estimula cuando se añade (+) DNA monocatenario a la reacción. Los
oligómeros se detectan solamente en presencia (+) del agente
reticulante BMH.
Figura 11. Reticulación de proteínas E1
radiomarcadas truncadas. Las diversas proteínas truncadas utilizadas
en este ensayo se representan esquemáticamente en el panel A. Los
resultados de los experimentos de reticulación se indican en el
panel B. La reticulación se realizó como se describe en el Ejemplo
12, en presencia (+) o ausencia (-) de ss DNA.
Figura 12. Efecto de las sustituciones de
aminoácidos en el dominio de unión al ATP de E1* sobre la
oligomerización. La posición de las diversas sustituciones de
aminoácidos hechas en el dominio de unión al ATP de E1* se resumen
en el panel A. Los resultados obtenidos a partir de la reticulación
de estas proteínas E1* mutantes (72-649) en
presencia de ss DNA se indican en el panel B.
Figura 13. Efecto de las sustituciones de
aminoácidos en la región A conservada de E1* sobre la
oligomerización. Seis proteínas E1* diferentes, cada una de ellas
portadora de una sola sustitución de aminoácidos en la región A
conservada (indicada encima de cada calle del gel), se ensayaron por
reticulación en cuanto a su actividad de oligomerizarse en
presencia de ss DNA como se describe en el Ejemplo 12.
Salvo indicación en contrario, los términos
científicos y tecnológicos y la nomenclatura utilizada aquí tienen
el mismo significado que el entendido normalmente por un experto en
la técnica a la que se refiere esta invención. Generalmente, los
procedimientos para cultivo de células, infección, los métodos de
biología molecular y similares son métodos corrientes utilizados en
la técnica. Tales técnicas clásicas pueden encontrarse en manuales
de referencia tales como por ejemplo Sambrook y col. (1989,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratories) y Ausubel y col. (1994, Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley, New York).
Las secuencias nucleotídicas se presentan aquí
por monocadenas, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha,
utilizando los símbolos de una letra para los nucleótidos, como se
utilizan normalmente en la técnica y de acuerdo con las
recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica
IUPAC-IUB (Biochemistry, 1972,
11:1726-1732).
La presente descripción hace referencia a cierto
número de términos de tecnología de DNA recombinante (rDNA)
utilizado rutinariamente. No obstante, se proporcionan definiciones
de ejemplos seleccionados de tales términos rDNA por motivos de
claridad y uniformidad.
La expresión "DNA recombinante" o
"plásmido recombinante" como se conoce en la técnica se refiere
a una molécula de DNA resultante de la unión de los segmentos de
DNA. A menudo esto se refiere como ingeniería genética.
La expresión "segmento o molécula o secuencia
de DNA", se utiliza aquí para referirse a moléculas constituidas
por los desoxirribonucleótidos adenina (A), guanina (G), timina (T)
y/o citosina (C). Estos segmentos, moléculas o secuencias pueden
encontrarse en la naturaleza u obtenerse por procedimientos
sintéticos. Cuando se leen de acuerdo con el código genético, estas
secuencias pueden codificar un tramo o secuencia lineal de
aminoácidos que pueden designarse polipéptido, proteína, fragmento
de proteína y similares.
Tal como se utiliza aquí, el término "gen"
es bien conocido en la técnica y se refiere a una secuencia de
ácido nucleico que define una sola proteína o polipéptido. El
polipéptido puede ser codificado por una secuencia de longitud
completa o por cualquier porción de la secuencia codificante, con
tal que la actividad funcional de la proteína esté conservada.
Un "gen estructural" define una secuencia
de DNA que se transcribe en RNA y se traduce en una proteína que
tiene una secuencia de aminoácidos específicos, por lo que da lugar
a un polipéptido o una proteína específicos.
"Endonucleasa de restricción o enzima de
restricción" es una enzima que tiene la capacidad de reconocer
una secuencia específica de bases (habitualmente de 4, 5 ó 6 pares
de bases de longitud) en una molécula de DNA, y que corta la
molécula de DNA en cualquier sitio en que aparezca esta secuencia.
Un ejemplo de dicha enzima es EcoRI, que reconoce la secuencia de
bases GAATTC/CTTAAG y corta una molécula de DNA en este sitio de
reconocimiento.
"Fragmentos de restricción" son moléculas
de DNA producidas por la digestión de DNA con una endonucleasa de
restricción. Cualquier genoma o segmento de DNA dado puede ser
digerido por una endonucleasa de restricción particular formando al
menos dos moléculas discretas o fragmentos de restricción.
"Electroforesis en gel de agarosa" es un
método analítico para fraccionar moléculas de DNA bicatenario
basándose en el tamaño. El método se fundamenta en que las
moléculas de DNA migran a través de un gel como si se tratara de un
tamiz, por lo que la molécula más pequeña de DNA tiene la mayor
movilidad y se desplaza a través del gel hasta el punto más
alejado. Las características de tamiz del gel retardan las moléculas
de DNA más grandes de modo que éstas tienen la menor movilidad. El
DNA fraccionado se puede visualizar por tinción del gel utilizando
métodos bien conocidos en la técnica, hibridación de ácidos
nucleicos o por marcación de las moléculas de DNA fraccionadas con
un marcador detectable. Todos estos métodos son bien conocidos en la
técnica, y se pueden encontrar métodos específicos en Ausubel y
col. (supra).
"Oligonucleótido" es una molécula
constituida por dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos,
preferiblemente más de tres. El tamaño exacto de la molécula
dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función o
uso final del oligonucleótido. Un oligonucleótido puede producirse
por síntesis, por clonación o por amplificación.
"Amplificación de una secuencia" es un
método para generar grandes cantidades de una secuencia diana. En
general, uno o más cebadores de amplificación son reasociados con
una secuencia de ácido nucleico. Utilizando enzimas apropiadas, se
amplifican secuencias que se encuentran en posición adyacente o
entre los cebadores. Un método de amplificación utilizado aquí es
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
"Cebador de amplificación" se refiere a un
oligonucleótido, capaz de reasociarse con una región de DNA
adyacente a una secuencia diana y que sirve como cebador de
iniciación para la síntesis de DNA en condiciones adecuadas bien
conocidas en la técnica. El producto de extensión del cebador
sintetizado es complementario a la secuencia diana.
El término "dominio" o "región" se
refiere a la secuencia específica de aminoácidos que define, o bien
una función específica o una estructura específica dentro de una
proteína. Un ejemplo dado aquí es el dominio de oligomerización de
esta invención que está comprendido dentro de la proteína E1 del
papilomavirus.
El término "delineado" como se utiliza aquí
se refiere a un segmento de proteína o péptido que está comprendido
entre los aminoácidos referidos excluyendo los aminoácidos
delineantes. Por ejemplo, una proteína delineada por los
aminoácidos 30 a 100 se refiere a cualquier segmento de proteína o
péptido de cualquier longitud que estaría localizado entre el
aminoácido 33 (exclusive) y el aminoácido (exclusive) o cualquier
variante, derivado o fragmento del mismo.
El término "delimitado" como se utiliza
aquí significa un segmento de proteína o péptido que está
constituido por los aminoácidos referidos incluyendo los
aminoácidos delimitantes. Por ejemplo, una proteína delimitada por
los aminoácidos 31 a 99 se refiere a un fragmento de proteína o
péptido que comprende los aminoácidos 33 a 99 o cualquier variante
o derivado del mismo.
La expresión "proteína de fusión" como se
define aquí se refiere a al menos dos segmentos polipeptídicos que
no están unidos entre sí en la naturaleza. Ejemplos no limitantes de
tales proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención
incluyen la proteína E1 y cualquier variante, fragmento o derivado
de la misma, fusionada a tiorredoxina. Para los fines de esta
invención, el uso de tiorredoxina permite que la proteína E1
fusionada o cualquier fragmento, variante o derivado de la misma sea
purificada en forma soluble. Por lo tanto, cualquier proteína capaz
de solubilizar la proteína E1 puede ser utilizada para los fines de
esta invención. Otro ejemplo de proteínas de fusión para los fines
de la presente invención es la fusión de la proteína E1 y cualquier
variante, derivado o fragmento de la misma a la proteína GAL4. Estos
polipéptidos fusionados pueden fusionarse además a un polipéptido
de un "marcador de afinidad". En algunas realizaciones, puede
ser beneficioso introducir un sitio de corte adicional entre las
dos secuencias polipeptídicas que han sido fusionadas. Tales sitios
de corte entre dos o más proteínas heterólogamente fusionadas son
bien conocidos en la técnica.
Los términos "vector" o "construcción de
DNA" son normalmente conocidos en la técnica y se refieren a
cualquier elemento genético, incluido pero sin limitarse a ellos,
DNA plasmídico, DNA de fago, DNA viral y similares que pueden
incorporar las secuencias oligonucleotídicas, o secuencias de la
presente invención y servir como vehículo de DNA en el que se puede
clonar el DNA de la presente invención. Existen numerosos tipos de
vectores y son bien conocidos en la técnica.
El término "expresión" define el
procedimiento por el que un gen estructural se transcribe en mRNA
(transcripción), siendo traducido después el mRNA (traducción) en
un polipéptido (o proteína) o más de uno.
La terminología "vector de expresión"
define un vector o vehículo como se ha descrito anteriormente pero
diseñado para permitir la expresión de una secuencia insertada
después de su transformación dentro de una célula hospedante. El
gen clonado (secuencia insertada) se pone habitualmente bajo el
control de secuencias de elementos de control tales como las
secuencias promotoras. Tales secuencias de control de la expresión
variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar el
gen operablemente unido en un agente hospedante procariótico o
eucariótico o ambos (vectores transportadores) y pueden contener
adicionalmente elementos transcripcionales tales como elementos
intensificadores, secuencias de terminación, elementos de
especificidad por tejidos y/o sitios de iniciación y terminación de
la traducción.
Por "sistema de expresión eucariótica" se
entiende la combinación de un vector de expresión apropiado y de
una línea celular eucariótica que se puede utilizar para expresar
una proteína de interés. En algunos sistemas el gen para la
proteína se puede insertar en el genoma de un virus que puede
infectar el tipo de célula que se está utilizando. También se
pueden utilizar vectores plasmídicos que contienen el gen deseado.
En todos los casos el vector contendrá elementos de control
apropiados (promotores) para expresar la proteína en el tipo de
célula de interés. En ciertos sistemas de expresión también pueden
ser necesarios componentes adicionales, por ejemplo un vector o
genoma viral que codifica polimerasa de T7. Los tipos de células
eucarióticas típicamente utilizados son levadura (p.ej.
Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris) transfectada con
un vector plasmídico; células de insecto (p.ej. SF9, SF21)
infectadas con baculovirus (Autographa californica o
Bombyx mori) (Luckow, Curr. Op. Biotech., 1993,
4:564-572; Griffiths y Page, 1994, Methods in Molec.
biol. 75:427-440; y Merrington y col., 1997, Molec.
Biotech. 8(3):283-297); células de mamífero
infectadas con adenovirus, virus vaccinia, virus Sindbis o virus
'semliki forest'; y células de mamíferos transfectadas con vectores
de DNA para expresión temporal o constitutiva. Aquí se prefiere en
particular el sistema de levadura Saccharomyces cerevisiae y
las células de mamífero procedentes de células de ovario de hámster
chino (CHO).
Se ha "transfectado" una célula hospedante
o una célula indicadora por DNA exógeno o heterólogo (p.ej. una
construcción de DNA) cuando dicho DNA ha sido introducido dentro de
la célula. El DNA transfectante puede estar o no estar integrado
(unido covalentemente) en el DNA cromosómico constituyendo el genoma
de la célula. En procariotas, levaduras y células de mamíferos, por
ejemplo, el DNA transfectante/transformante puede ser mantenido
sobre un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a las
células eucarióticas, un ejemplo de una célula establemente
transfectada es una en la que el DNA transfectado ha sido integrado
en un cromosoma y es heredado por las células hijas a través de la
replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la
capacidad de la célula eucariótica de establecer líneas de células o
clones que comprenden una población de células hijas que contienen
el DNA transfectado. Los métodos de transfección son bien conocidos
en la técnica (Sambrook y col., 1989, supra; Ausubel y col.,
1994, supra).
La expresión "marcador de afinidad" o
"etiqueta de afinidad" como se utiliza aquí se refiere a un
marcador que es atrapado específicamente por un ligando
complementario. Ejemplos de pares de marcador de afinidad/ligando
de afinidad incluyen pero sin limitarse a ellos: proteína que se une
a maltosa (MBP)/maltosa; glutationa S transferasa (GST)/glutationa;
poli-histidina (His)/metal. El metal utilizado como
ligando de afinidad se puede seleccionar del grupo constituido por
cobalto, zinc, cobre, hierro y níquel (Wong y col., 1991, Separation
and Purification Methods, 20(1), 49-106).
Preferiblemente, el metal seleccionado es níquel. El ligando de
afinidad se puede aplicar a columnas para facilitar la separación
por cromatografía de afinidad.
El marcador de afinidad se puede colocar en el
extremo N o C-terminal de la proteína, pero
preferiblemente en el extremo N de la proteína.
Las secuencias de nucleótidos y los polipéptidos
descritos incluyen, sin limitación, mutantes, homólogos, subtipos,
alelos y similares. Se entenderá que por lo general, las secuencias
de la presente invención codifican un dominio de interacción. Será
claro para una persona experta en la materia que el dominio de
interacción de la presente invención y cualquier variante, derivado
o fragmento del mismo, se puede determinar fácilmente utilizando
las técnicas y los ensayos de la presente invención y la técnica en
general.
Como se utiliza aquí, la designación
"variante" denota en el contexto de esta invención una
secuencia ya sea de ácido nucleico o de aminoácidos, una molécula
que retiene una actividad biológica (ya sea funcional o estructural)
que es sustancialmente similar a la de la secuencia original. Esta
variante o equivalente puede ser de la misma especie o de una
especie diferente y puede ser una variante natural o prepararse
sintéticamente. Estas variantes incluyen secuencias de aminoácidos
que tienen sustituciones, deleciones o adiciones de uno o más
aminoácidos, siempre que se conserve la actividad biológica de la
proteína. Lo mismo se aplica a variantes de secuencias de ácidos
nucleicos que pueden tener sustituciones, deleciones o adiciones de
uno o más nucleótidos, siempre que la actividad biológica de la
secuencia o su proteína traducida sea generalmente mantenida.
El término "derivado" pretende incluir
cualquiera de las variantes descritas anteriormente cuando
comprenden un resto químico adicional que normalmente no forma
parte de estas moléculas. Estos restos químicos pueden tener
diversos fines entre ellos mejorar la solubilidad de una molécula,
la absorción, la semi-vida biológica, disminuir la
toxicidad y eliminar o disminuir efectos secundarios indeseables.
Más aún, estos restos pueden utilizarse con el fin de marcación,
unión, o pueden estar comprendidos en producto(s) de fusión.
Se pueden encontrar diferentes restos capaces de mediar los efectos
descritos anteriormente en Remington's The Science and Practice of
Pharmacy (1995). Las metodologías para acoplar tales restos a una
molécula son bien conocidos en la técnica.
El término "fragmento" se refiere a
cualquier segmento de una secuencia de DNA, RNA o aminoácidos
identificados y/o cualquier segmento de cualquiera de las variantes
o derivados descritos aquí anteriormente.
Los términos "variante", "derivado" y
"fragmento" de la presente invención se refieren aquí a
proteínas o moléculas de ácidos nucleicos que pueden ser
aisladas/purificadas, sintetizadas químicamente o producidas a
través de la tecnología del DNA recombinante. Todos estos métodos
son bien conocidos en la técnica.
Como se ilustra aquí más adelante, las
secuencias de nucleótidos y los polipéptidos utilizados en la
presente invención pueden modificarse, por ejemplo por mutagénesis
in vitro, para segregar la relación entre la función
catalítica y la estructural de los mismos y permitir un mejor diseño
e identificación de las proteínas resultantes.
"Oligomerización" se refiere a una
interacción entre al menos dos moléculas. Las moléculas pueden ser
iguales o diferentes. En la presente invención el termino
auto-oligomerización se refiere a la interacción
entre la proteína E1 y cualquier derivado, variante o fragmento de
la misma.
"Secuencia de rastreo" se define aquí como
una secuencia de aminoácidos que es capaz de oligomerizarse consigo
misma o con una proteína E1 de PV (incluyendo un derivado, fragmento
o variante de la misma). Esta secuencia comprende un componente de
un método de rastreo para agentes seleccionados que modulan la
oligomerización.
"Ensayo de
co-inmunoprecipitación de DNA" es un ensayo para
la detección de la interacción proteína-DNA. El
complejo proteína-DNA se inmunoprecipita con un
anticuerpo contra la proteína comprendida en el complejo. El
producto inmunoprecipitado que comprende el DNA puede ser
detectado/medido o visualizado por métodos bien conocidos en la
técnica, tales como electroforesis en gel de agarosa seguida de
técnicas radiológicas o colorimétricas.
En una realización particularmente preferida se
proporciona una secuencia de aminoácidos, comprendida dentro de la
región A de la proteína E1 de PV, necesaria para la oligomerización
de E1.
La oligomerización de la proteína E1 se
demuestra en esta solicitud utilizando fragmentos de aminoácidos de
diversos tamaños de la región A de la proteína E1. Estos fragmentos
están todos dentro del alcance de la presente invención.
De acuerdo con esta primera realización, se
proporciona una secuencia de aminoácidos necesaria para la
oligomerización de la proteína E1 de PV delineada por los
aminoácidos 352 y 439, según la numeración de
HPV-11. Alternativamente, la secuencia de
aminoácidos está delimitada por los aminoácidos 353 a 438 de acuerdo
con la numeración de HPV-11. Es más,
alternativamente, la secuencia de aminoácidos se define según SEQ ID
No. 2.
En un aspecto preferido de esta primera
realización, la secuencia de aminoácidos está delineada además por
los aminoácidos 352 y 432. Alternativamente, la secuencia de
aminoácidos está delimitada por los aminoácidos 353 a 431 de
acuerdo con la numeración de HPV-11. Es más,
alternativamente, la secuencia de aminoácidos se define según SEQ
ID No. 3.
En un aspecto más particular de la primera
realización, la secuencia de aminoácidos está delineada además por
los aminoácidos 352 y 417. Alternativamente, la secuencia de
aminoácidos está delimitada por los aminoácidos 353 a 416 según la
numeración de HPV-11. Es más, alternativamente, la
secuencia de aminoácidos se define según SEQ ID No. 4.
De acuerdo con la realización anterior de las
secuencias de aminoácidos, están descritas todas las variantes,
derivados y fragmentos de las mismas funcionalmente equivalentes a
las secuencias en esta memoria.
Una realización adicional de esta invención es
que las secuencias de aminoácidos de esta invención pueden
auto-asociarse. Además estas secuencias son capaces
de formar oligómeros con la proteína E1 de longitud completa y
cualquier derivado, variante o fragmento de la misma, que comprende
la secuencia de esta invención.
Por lo tanto, de acuerdo con una segunda
realización de este invención, se proporciona un ensayo de rastreo
para evaluar la unión E1/DNA (y de aquí la oligomerización de la
proteína E1) por detección y/o medición de la cantidad de DNA
co-precipitado con la proteína E1.
De acuerdo con un aspecto específico de esta
segunda realización, se proporciona un ensayo para rastrear un
agente capaz de inhibir la oligomerización de E1 por medición de la
disminución de DNA co-inmunoprecipitado con la
proteína E1.
Más particularmente, esta segunda realización
proporciona un ensayo de oligomerización que comprende las etapas
de:
- a.
- combinar proteína E1 con un fragmento de DNA, e incubar durante un período de tiempo para permitir que la proteína E1 y el DNA formen un complejo,
- b.
- aislar el complejo proteína E1/DNA del DNA no complejado,
- c.
- detectar el DNA, donde la presencia de DNA es una indicación de la unión de proteína E1 al DNA, y por lo tanto está co-relacionada con la oligomerización de E1.
La E1 utilizada para este ensayo puede
seleccionarse a partir de: las secuencias de aminoácidos de esta
invención, la proteína E1 de longitud completa, la proteína E1
truncada N-terminalmente (E1*) y cualquier derivado,
variante o fragmento de la misma.
Preferiblemente, el fragmento de DNA utilizado
en esta realización particular contiene un origen de replicación
para intensificar la especificidad de la unión de E1. Más
preferiblemente, la E1 se combina con una mezcla de dos fragmentos
de DNA, uno de los cuales contiene un origen de replicación y el
segundo está constituido por un DNA de longitud diferente tal que
sea distinguible del DNA que contiene ori y que la cantidad de E1
unida al DNA que contiene ori pueda compararse con la cantidad de
unión no específica.
Particularmente, el complejo
E1-DNA se aísla de DNA libre por cromatografía en
columna, centrifugación, extracción, filtración o
inmunoprecipitación. Más preferiblemente, el complejo
E1-DNA se aísla por inmovilización del anticuerpo
en un medio sólido tal como una perla de SPA o el fondo de un
pocillo de una placa de ensayo de modo que cuando se separe el
medio, lo haga también el DNA libre.
Particularmente, la E1 se inmunoprecipita o
inmoviliza utilizando un anticuerpo policlonal. Más particularmente,
el anticuerpo policlonal es K71 o K72.
Preferiblemente, antes de que se detecte el DNA
complejado, el DNA es liberado del complejo E1/DNA. Esta liberación
puede llevarse a cabo, por ejemplo, por extracción orgánica.
En un aspecto específico de esta segunda
realización, el DNA puede detectarse por métodos que incluyen
electroforesis en gel, espectrofotometría y obtención de imágenes
radiológicas. De acuerdo con ello, dependiendo de los medios de
detección elegidos, el DNA se marca por cualquier medio apropiado
conocido en la técnica, incluídos los tintes fluorescentes o los
isótopos radiactivos. Preferiblemente, el DNA se radiomarca y
detecta por electroforesis en gel seguido por la obtención de
imágenes radiológicas. Alternativamente, el DNA se marca con un
material colorimétrico y se detecta espectrofotométricamente, o el
DNA se marca con un material fluorescente y se detecta por la
tecnología de proximidad de centelleo (SPA).
Particularmente, el DNA se marca antes de la
formación del complejo, después de la inmunoprecipitación o después
de que el DNA se separa del complejo de inmunoprecipitación.
En un aspecto particular de esta segunda
realización, se proporciona el ensayo como se describe anteriormente
adaptado para rastrear un agente capaz de inhibir la
oligemerización de E1, comprendiendo además este ensayo las etapas
de:
- a.
- poner en contacto un agente con la proteína E1 antes de combinarla con el fragmento de DNA e incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que la proteína E1/DNA formen un complejo, y
- e.
- comparar los resultados con una muestra testigo, donde la muestra testigo se trata de manera similar pero sin la adición de dicho agente.
Más particularmente, tal agente seleccionado es
capaz de interferir con la oligomerización y más particularmente
tal agente es inhibidor frente a la oligomerización de la proteína
E1 y cualquier derivado, variante o fragmento del mismo como se ha
descrito anteriormente.
De acuerdo con la tercera realización de esta
invención, se proporciona un ensayo de reticulación para medir
directamente el nivel de oligomerización (o inhibición del mismo) de
la proteína E1. En particular, este ensayo de oligomerización
comprende las etapas de:
- a.
- combinar la proteína E1 marcada con un fragmento de DNA e incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que la proteína E1 y el DNA formen un complejo,
- b.
- reticular la proteína E1 y el DNA en el complejo con un agente reticulante,
- c.
- separar la proteína E1 electroforéticamente de modo que la migración de E1 es una indicación del nivel de oligomerización de E1.
Preferiblemente, el complejo E1/DNA se aísla del
DNA libre antes de llevar a cabo la separación.
Particularmente, la proteína E1 utilizada en
este ensayo de oligomerización es una proteína E1 truncada en su
extremo N-terminal. Más preferiblemente, tiene
delecionados sus primeros 70 aminoácidos
N-terminales. Más preferiblemente, esta proteína E1
está delimitada por los aminoácidos 72-649.
Preferiblemente, la proteína E1 se marca con un
radioisótopo. Más preferiblemente, se marca con ^{35}S y se
detecta en el gel por técnicas de obtención de imágenes
radiológicas, bien conocidas en la técnica.
Preferiblemente, el agente reticulante es
bismaleimidohexano (BMH).
De acuerdo con una cuarta realización de esta
invención, se proporciona una proteína E1 truncada en su extremo
N-terminal. Más particularmente, un aspecto de esta
cuarta realización abarca la proteína E1 delimitada por los
aminoácidos 72 a 649 (SEQ ID No. 78).
Ya que se ha demostrado que la proteína E1 tiene
similitudes con otros papilomavirus y con los antígenos T de SV40 y
del poliomavirus, la invención abarca cualquier secuencia de
aminoácidos necesaria para la oligomerización de una proteína que
es necesaria para iniciar la replicación del DNA viral, que tiene
similitudes funcionales y/o estructurales con la secuencia de
aminoácidos de la presente invención.
En una realización preferida adicional de esta
invención, una región en la proteína E1 necesaria para su
oligomerización que tiene función y/o estructura similar está
presente en el papilomavirus bovino, en el papilomavirus del conejo
cola de algodón o en el papilomavirus humano. En un aspecto
específico de las realizaciones de esta invención, el DNA de PV es
de HPV.
En una realización más preferida, la región de
la proteína E1 se selecciona a partir de HPV del tipo bajo riesgo o
alto riesgo; los tipos de alto riesgo están constituidos por los
tipos 16, 18, 31, 35, 45, 52 y 52; y los tipos de bajo riesgo están
constituidos por los tipos 6, 11 y 13.
En una realización más preferida de esta
invención, la secuencia de aminoácidos de esta invención es de un
virus de papiloma humano de bajo riesgo de tipo 11.
En un aspecto específico de las realizaciones de
esta invención, la proteína E1 puede ser obtenida por medios
diferentes. En un ejemplo no limitante la proteína se sintetiza por
transcripción/traducción acopladas en un producto de lisis de
reticulocitos de conejo o se prepara por tecnología
recombinante.
De acuerdo con una aplicación de esta invención,
el método de rastreo y el sistema de rastreo se llevan a cabo a
bajas temperaturas en presencia o ausencia de ATP/Mg o a altas
temperaturas en presencia de ATP/Mg. Más preferiblemente, a
temperaturas bajas de aproximadamente 4º y 23ºC, y a una temperatura
alta de aproximadamente 37ºC. Además, la proteína E1 puede
prepararse por transcripción/traducción in vitro o por
tecnología recombinante y comprende los aminoácidos
72-649 (SEQ ID NO. 78), aunque se pueden utilizar
otros medios conocidos en la técnica para proporcionar la secuencia
de aminoácidos para rastreo.
En una aplicación de esta invención, la
secuencia de aminoácidos de esta invención y cualquier variante,
derivado o fragmento de la misma, pueden utilizarse en una columna
de afinidad para la selección de cualquier proteína o molécula
capaz de unirse a ella. Ejemplos no limitantes son los anticuerpos,
polipéptidos, las secuencias de ácidos nucleicos y los compuestos
químicos.
Preferiblemente, el agente seleccionado
utilizando las realizaciones de esta invención afecta a la
replicación de DNA viral, específicamente a la replicación de DNA
de papilomavirus y más particularmente HPV. En una aplicación
particular de esta invención se contempla que uno o más de los
agentes seleccionados pueden utilizarse en una composición
farmacéutica para el tratamiento de la infección por
papilomavirus.
Se utilizó la cepa Y153 de Saccharomyces
cerevisiae (MATa leu2-3,112
ura3-52 trp1-901
his3-\Delta200 ade2-101
gal4\Delta gal80\Delta URA3::GAL-lacZ
LYS::GAL-HIS3) para el análisis de dos híbridos
de levadura (Durfee y col., 1993, Genes. Dev.
7:555-569). La transformación de la cepa Y153
de levadura se efectuó utilizando el método del LiAc esencialmente
como se describe en el Matchmaker Library Protocol de
Clontech. Células que se co-transformaban con una
combinación de dos plásmidos se seleccionaron a 30ºC durante 3 a 5
días en medio SD (descrito por Sherman y col. 1979, Methods in
Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.) que carecía de leucina y
triptófano pero estaba complementado con los demás aminoácidos
requeridos.
Las células de levadura transformadas se
hicieron crecer previamente en medio SD que carecía de leucina y
triptófano y después se utilizaron para inocular cultivos YPD
(Sherman y col. Supra). Estos cultivos se hicieron crecer a
30ºC hasta que alcanzaron una densidad óptica de aproximadamente 0,6
a 600 nm (DO_{600}). Después las células se recogieron, se
lavaron y se permeabilizaron por dos ciclos de congelación
(nitrógeno líquido) y descongelación. Luego se midió
espectrofotométricamente la actividad de
\beta-galactosidasa (a 578 nm) utilizando el
substrato rojo de
clorofenilo-\beta-D-galactopiranósido
(CRPG, Boehringer Mannheim) como se describe en el Matchmaker
Library Protocol de Clontech. La actividad enzimática se calculó
utilizando la ecuación: Unidades Miller = (1.000 x
DO_{578})/(minutos transcurridos x 1,5 ml de cultivo x
DO_{600}).
Las construcciones y los cebadores para la
amplificación se resumen en la Tabla 1.
Los plásmidos utilizados para la síntesis de E1
y E2 de HPV-11 in vitro se obtuvieron a
partir de, o bien pCR3 (Invitrogen, CA) o pTM1 (obtenido a partir
de Bernard Moss, NIH). En estos plásmidos, la proteína codificada
se puede expresar in vitro a partir del promotor T7
localizado curso arriba del marco de lectura abierto (ORF). Cuando
se utilizó en un sistema de transcripción/traducción acoplado
(TNT Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega), los
plásmidos obtenidos a partir de pTM1 dirigían la síntesis de niveles
más altos de proteínas. Presumiblemente, esto ocurre porque este
plásmido codifica el EMCV IRES (sitio de entrada en ribosoma
interno del virus de la encefalomiocarditis) que estimula la
traducción (no se indican los datos).
Para construir pCR3-E1 y
pCR3-E2, los ORFs enteros de E1 y E2 de
HPV-11 se amplificaron separadamente por reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), aunque es adecuado cualquier
método capaz de amplificar DNA para los fines de esta invención. Se
utilizaron los siguientes pares de oligonucleótidos en la reacción
de amplificación:
Los moldes de DNA utilizados para PCR fueron las
construcciones de baculovirus Ac11E1 ó Ac11E2 (obtenidas a partir
de R. Rose, U. de Rochester). Los productos PCR de E1 y E2 se
clonaron cada uno de ellos bajo el control del promotor precoz
inmediato de citomegalovirus en el plásmido PCR3, utilizando el
estuche de clonación TA (Invitrogen) para generar
pCR3-E1 y pCR3-E2.
El plásmido
pCR3-FLAG-E1 (el epítopo FLAG es de
Eastman Kodak Co.) que expresa E1 (aminoácidos
2-649) fusionado en su extremo N al epítopo FLAG
(Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys) se construyó por amplificación
PCR del ORF de E1 con los dos oligonucleótidos siguientes:
El producto PCR resultante se clonó en el
plásmido pCR3 (Invitrogen) utilizando el estuche de clonación TA
(Invitrogen).
Para construir el plásmido
pTM-1-E1, el ORF de E1 se amplificó
por PCR utilizando los dos oligonucleótidos siguientes:
El producto PCR resultante se digirió con las
enzimas de restricción NcoI y BamHI (los sitios de restricción son
codificados por los dos oligonucleótidos) y se insertó entre los
sitios NcoI y BamHI del plásmido pTM1.
El plásmido
pTM1-FLAG-E1 que expresa E1
(aminoácidos 2-649) fusionados en su extremo N al
epítopo FLAG (Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys) se construyó por
amplificación PCR del ORF de E1 con los dos oligonucleótidos
siguientes:
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El producto PCR resultante se digirió con NcoI y
BamHI (codificado por los dos oligonucleótidos) y se insertó entre
los sitios NcoI y BamHI del plásmido pTM1.
Los plásmidos que expresan las proteínas E1
truncadas en su extremo N-terminal in vitro
se construyeron por amplificación de la porción deseada del ORF de
E1 con cebadores específicos portadores de un sitio NcoI (cebador
directo) y un sitio BamHI (cebador inverso). Los productos PCR se
digirieron con NcoI y BamHI y se insertaron entre los sitios NcoI y
BamHI de los plásmidos pTM1. Las secuencias de los diferentes
cebadores directos E1 que se utilizaron, y las del cebador inverso
común, se describen más abajo. Lo indicado entre paréntesis es el
primer aminoácido de E1 que está codificado por cada uno de estos
oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido
pTM1-FLAG-E1
(72-649) que codifica una proteína E1 de
HPV-11 truncada que carece de los 71 aminoácidos
N-terminales, pero que está marcada en su extremo N
con el epítopo FLAG, se construyó por amplificación PCR utilizando
un oligonucleótido que codifica el epítopo FLAG:
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron plásmidos similares a
pTM1-FLAG-E1
(72-649) pero que codifican proteínas E1 con un
extremo C truncado por amplificación PCR de la porción deseada del
ORF de E1 con cebadores específicos portadores de un sitio NcoI
(cebador directo) y un sitio BamHI (cebador inverso). Los productos
PCR se digirieron con NcoI y BamHI y se insertaron, en marco, entre
los sitios NcoI y BamHI de plásmidos pTM1. La secuencia del cebador
directo de E1 común (que codifica el epítopo FLAG) se describe más
abajo. También se describen las secuencias de los diferentes
cebadores inversos de E1 que se utilizaron. Lo indicado entre
paréntesis es el último aminoácido de E1 que está codificado por
cada uno de estos cebadores inversos.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las construcciones y los cebadores utilizados
para amplificación se resumen en las Tablas 2 y 3.
Salvo indicación en contrario, los fragmentos de
DNA de E1 HPV-11 se amplificaron por PCR con
cebadores específicos portadores de un sitio NcoI (cebador directo)
y un sitio BamHI (cebador inverso). Los productos PCR se digirieron
con NcoI y BamHI y se insertaron, en marco, entre los sitios NcoI y
BamHI de los vectores de dos híbridos de levadura pAS1 (dominio de
unión al DNA GAL4) y pACT2 (dominio de activación GAL4) (Durfee y
col., 1993, Genes. Dev 7:555-569). Se
construyeron dos plásmidos híbridos que codifican la proteína E1
completa (aminoácidos 1-649) de un modo similar con
la excepción de que el cebador directo contenía un sitio BamHI en
lugar de un sitio NcoI. En este caso, el producto PCR se cortó con
BamHI y se insertó, en marco, en los sitios BamHI de pAS1 y pACT2.
De un modo similar, pero utilizando un gen E1 mutado como molde para
PCR (véase más abajo la descripción de las mutaciones en E1) se
generaron plásmidos de dos híbridos portadores de un ORF de E1
mutado (P479S, K484E ó K484Q). Los diversos cebadores directos e
inversos que se utilizaron se describen más abajo.
Utilizando una estrategia diferente se
construyeron en dos etapas plásmidos derivados de pAS1 y pACT2 que
codificaban las secuencias 353-572,
353-536 y 353-458 de E1. En la
primera etapa, las secuencias de E1 se amplificaron por PCR
utilizando los dos cebadores siguientes:
Los moldes para PCR fueron plásmidos derivados
de PCR3 que expresaban un ORF de E1 truncado: los aminoácidos de E1
1-572, 1-536 ó
1-458. Uno de los dos oligonucleótidos utilizados
para la amplificación por PCR se hibrida sobre el codón 353 de E1.
El otro oligonucleótido se hibrida en la región polienlazadora de
PCR3, curso abajo del ORF de E1 truncada. Los productos PCR se
digirieron con NcoI y BamHI y se clonaron entre los sitios NcoI y
BamHI de pAS1 y pACT2. Los plásmidos que se utilizaron como moldes
en estas tres reacciones PCR se construyeron por amplificación del
ORF de E1 con el siguiente oligonucleótido:
CAAGGATGGCGGACGATTCA (SEQ ID NO. 15) (el ATG de
E1 está subrayado) y uno de tres oligonucleótidos que se hibridan
sobre el codón 572, 536 y 458, respectivamente, de E1. Las
secuencias de estos oligonucleótidos se dan a continuación:
Los productos PCR resultantes se clonaron en
PCR3, utilizando el estuche de clonación TA (Invitrogen).
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos que se utilizaron en los ensayos
de replicación temporal del DNA de HPV para expresar E1 y E2 en
células transfectadas se obtuvieron todos ellos a partir de pCR3:
pCR3-E1,
pCR3-FLAG-E1 (E1 de tipo salvaje
(WT) y mutante) y pCR3-E2. Estos plásmidos se han
descrito anteriormente.
El plásmido pN9 (Lu y col., 1993, J. of Virol.
67: 7131-7139) se obtuvo a partir de D.
McCance (U. De Rochester) y contiene el origen completo de
replicación de HPV-11 (nucleótidos 7884 a 61)
clonados en pBluescriptII SK+ (Stratagene).
\vskip1.000000\baselineskip
Se expresaron tres fragmentos de E1 (a.a.
353-416 / 353-431 /
353-438) en E. coli como proteínas de fusión
con tiorredoxina (TRX). Los plásmidos para expresar estas proteínas
de fusión se construyeron por amplificación PCR de la porción
relevante del ORF de E1 utilizando un subconjunto de los
oligonucleótidos directos e inversos descritos anteriormente. Los
productos PCR se digirieron con NcoI y BamHI y se subclonaron entre
los sitios NcoI y BamHI de los plásmidos
pET-32a-c(+) (Novagen) que codifica
la TRX.
La mutagénesis dirigida en un sitio de E1 se
realizó con el estuche de mutagénesis dirigida en un sitio Quick
Change (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones
suministradas por el fabricante. Para cada mutagénesis, se utilizó
un par de oligonucleótidos complementarios. Para cada par la
secuencia del oligonucleótido correspondiente a la cadena
codificante se describe a continuación. La sustitución de los
aminoácidos resultantes también está indicada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La mutación puntual triple en el origen de
HPV-11 se introdujo en el plásmido pN9 utilizando el
siguiente oligonucleótido:
Se utilizó el sistema de producto de lisis de
reticulocitos acoplados TNT (Promega) para producir la
proteína E1 por transcripción/traducción asociadas in vitro.
El producto de lisis se programó con 2 \mug del plásmido
apropiado por 50 \mul de producto de lisis de reticulocitos TNT, y
siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. Cuando se
hizo necesario, la proteína E1 se radiomarcó por incorporación de
^{35}S-metionina. Las reacciones de unión se
hicieron mezclando 30 \mul del producto de lisis que contenía E1,
200 a 400 ng de una sonda de DNA radiomarcada con ^{33}P y 7,5
\mul de un tampón de unión al DNA x 10 (Tris-HCl
200 mM, pH 7,6, NaCl 1 M, EDTA 10 mM, DTT 10 mM) en un volumen
final de 75 \mul. Se dejaron transcurrir las reacciones de unión
a la temperatura indicada durante 90 min. Cuando estuvo indicado, se
añadieron ATP (o un nucleótido similar) y MgCl_{2} como
suplementos a las reacciones de unión a una concentración final de 5
mM y 3 mM, respectivamente. Los complejos de
DNA-proteína se inmunoprecipitaron o bien con el
anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Eastman Kodak)
cuando se utilizaba E1 marcada con FLAG, o bien con el anticuerpo
policlonal K72 que se preparó en conejos contra un péptido obtenido
a partir de los 14 aminoácidos de C-terminales de E1
de HPV11. La secuencia de aminoácidos de este péptido es
QAFRCVPGSVVRTL (SEQ ID No. 79). Antes de su uso en
inmunoprecipitación, los anticuerpos se unieron previamente o bien
a perlas de proteína G sefarosa (cuando se utilizaba
anti-FLAG) o bien a perlas de proteína
A-sefarosa (para K72). La inmunoprecipitación de los
complejos proteína- DNA se llevó a cabo durante 1 h a la
temperatura de la reacción de unión. Los complejos se lavaron 3
veces con 200 \mul de tampón de lavado (Tris 50 mM, pH 7,6; NaCl
100 mM; Triton X-100 0,1%). El DNA presente en estos
complejos se extrajo con fenol-cloroformo y se
precipitó con etanol en presencia de tRNa de levadura como
vehículo. Los fragmentos de DNA radiomarcado precipitados se
resolvieron en un gel de TBE con 5% de poliacrilamida y se
visualizaron por autorradiografía.
La sonda radiomarcada que se utilizó en estos
experimentos consta de dos fragmentos de DNA y se preparó en dos
etapas. En la primera etapa, el plásmido pN9 se linearizó por
digestión con XmaI y los extremos se marcaron con el fragmento
Klenow de DNA polimerasa I en presencia de 5 \muCi de
\alpha^{32}P-dCTP y una concentración 0,1 mM de
cada uno de: dTTP, dATP, dGTP. El DNA marcado se purificó en
columnas de purificación QIAquick PCR (QIAGEN). En la segunda
etapa, el pN9 radiomarcado lineal se digirió con PvuII para generar
dos fragmentos marcados: un fragmento de 370 pares de bases (bp)
que contiene el origen de replicación de HPV-11 y un
fragmento control de 186 bp que carece del origen.
Las condiciones para la formación del complejo
ternario E1-E2-ori fueron
esencialmente las mismas que las descritas anteriormente para el
ensayo de unión del origen a E1. Las únicas diferencias principales
fueron que se añadieron 7,5 \mul de la proteína E2 traducida
in vitro a la reacción de unión y que se utilizó proteína E1
de longitud completa (a.a. 1-649) en estos
experimentos. Las proteínas E1 de tipo salvaje y mutantes
utilizadas en estos experimentos fueron producidas a partir de
plásmidos obtenidos a partir de pCR3. Unas modificaciones mínimas
incluyeron el hecho de que las traducciones in vitro fueron
programadas con dos veces la cantidad de DNA (2 \mug/25 \mul de
reacción) y que sólo se utilizaron 100 ng de sonda por ensayo.
Células E. coli (BL21::DE3 [pLysS]) que
contenían un plásmido que codificaba una de las tres proteínas de
fusión TRX-E1 (véase más arriba) o que codificaba
sólo TRX [pET32a-c(+), Novagen], se hicieron crecer
durante una noche en medio LB que contenía ampicilina (100
\mug/ml) y cloranfenicol (34 \mug/ml). 3 ml de estos cultivos
de una noche se diluyeron 40 veces con medio reciente (120 ml) y se
incubaron a 30ºC hasta una D.O._{600} \equiv\beta0,5. Después
se indujo la expresión de la proteína con IPTG 1 mM durante 3 horas
a 30ºC (hasta que los cultivos alcanzaron una D.O._{600} \equiv
2,0). Las células bacterianas se recogieron por centrifugación a
5.000 g durante 10 min. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron
en 1 \mul de tampón de lisis (Tris 60 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM;
imidazol 10 mM) y se sonicó. Los productos de lisis resultantes se
centrifugaron a 16.000 g para desprender el residuo celular y el
material insoluble. Los sobrenadantes se cargaron en columnas
giratorias de Ni-NTA previamente equilibradas
(QIAGEN) y se purificaron de acuerdo con el protocolo del
fabricante para la purificación de proteína nativa. Brevemente,
después de cargarlas, cada columna se lavó con 2 x 600 \mul de
tampón de lavado (Tris 60 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; imidazol 20 mM)
y las proteínas unidas se eluyeron 2 veces con 200 \mul de tampón
de elución (Tris 60 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; imidazol 250 mM).
Luego se analizaron las proteínas purificadas por electroforesis en
gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sodio
(SDS-PAGE) al 10%. A continuación todas las
proteínas de fusión se diluyeron con tampón de elución a una
concentración final de 500 ng/\mul.
Células CHO-K1 (obtenidas a
partir de la American Type Culture Collection) se hicieron crecer a
40%-60% de confluencia en placas de cultivo de tejidos de 35 mm en
medio Ham F12 que contenía suero bovino fetal al 10% y sulfato de
gentamicina. Las células se transfectaron con 250 ng de
pCR3-E1 (o
pCR3-FLAG-E1 mutante), 25 ng de
pCR3-E2 y 250 ng de plásmidos pN9 utilizando
lipofectamina (Gibco BRL). La presencia del epítopo FLAG en el
extremo N de E1 no afecta a su capacidad para soportar la
replicación temporal de DNA de HPV (datos no indicados). Se
recogieron las células 72 h después de la transfección y se aisló
DNA total utilizando el estuche de sangre QIAmp (Qiagen). El
DNA de plásmido pN9 replicado se detectó por amplificación PCR de
un fragmento que contenía el origen utilizando DNA total digerido
con Dpn1 como molde y los siguientes pares de cebadores:
CTGCAACCGGTTTCGGTTACCCACACCCT (SEQ ID NO. 74)
(correspondiente a los nucleótidos 7885-7913 del
genoma de HPV-11) y
CGTTCCACTGAGCGTAGACCCCGTAGAA (SEQ ID NO. 75)
(correspondiente a los nucleótidos 1848-1820 de
pSK+). Como testigo, un fragmento del plásmido
pCR3-E1 se amplificó en la misma reacción PCR con el
siguiente par de cebadores que se hibridan dentro del ORF de E1
GCTTTGGGCTGTCATTTG (SEQ ID NO. 76) y TGTCAGGTGGCCCTACAA (SEQ ID NO.
77) (correspondientes a los nucleótidos 1475-1492 y
2275-2258, respectivamente, del genoma de
HPV-11). Las condiciones de la PCR consistieron en
una etapa inicial de desnaturalización a 95ºC durante 1 min, seguida
por 20 rondas de: desnaturalización a 94ºC durante 30 s,
reasociación a 51ºC durante 1 min y extensión a 72ºC durante 1 min
30 s, terminando con una extensión final a 72ºC durante 3 min. Los
productos PCR se hicieron radiactivos por adición de
[\alpha^{33}P]dCTP a las reacciones PCR y se visualizaron
por electroforesis en gel de agarosa y autorradiografía.
En una placa de fondo en U de 96 pocillos y de
polipropileno, se añaden 5 \mul de compuesto (o mezcla) a una
concentración de 150 \mug/ml en DMSO a 60 \mul de mezcla maestra
de unión (Tris 20 mM, pH:7,4; NaCl 100 mM; ATP 5 mM; MgCl_{2} 3
mM; EDTA 1 mM; DTT 1 mM; 5 ng HPV11 ori+sonda). Las reacciones
comienzan con la adición de 10 \mul de E1 de HPV11 traducida
in vitro (72-649). La placa se sella y
después se agita durante 5 min y se incuba a 37ºC durante 1 h.
Para cada pocillo de ensayo, se añade 1 \mul
de anticuerpo policlonal anti-E1 a 10 \mul de
suspensión al 10% de proteína A-sefarosa (Tris 20
mM, pH 7,0). La suspensión se agita a temperatura ambiente durante
1 hora. Las perlas se sedimentan por centrifugación rápida, se lavan
con 10 \mul de 1 x tampón de unión y después se resuspenden en 50
\mul de 1 x tampón de unión (+ ATP 5 mM + DTT 1mM).
En una segunda placa de polipropileno de fondo
en U y 96 pocillos, se depositan 50 \mul de anticuerpo K71 o
K72-proteína A-sefarosa previamente
unidos en cada pocillo. Una vez que la reacción de unión es
completa, la reacción de unión entera se transfiere a la placa que
contiene las perlas de anticuerpo-proteína
A-sefarosa. Después la placa se sella, se incuba a
37ºC y se agita durante 1 h.
Los anticuerpos policlonales
anti-E1 utilizados para los fines de esta invención,
se refieren aquí como K71 y K72. Éstos son el antisuero producido
en conejos contra un péptido que corresponde a los últimos 14
aminoácidos (extremo C-terminal) de E1 de
HPV-11.
Primero, una placa de filtración de 96 pocillos
MHVB N45 de Millipore, se equilibra filtrando 100 \mul de 1 x
tampón de unión. Después los complejos se transfieren, se filtran y
se lavan tres veces con 200 \mul de 1 x tampón de unión. El
líquido residual se separa secando la placa con una toalla de papel.
Finalmente, se añaden 150 \mul de MicroScint 20 a cada pocillo y
se detectan los recuentos por TopCount utilizando un protocolo con
^{33}P.
Se utilizó el sistema de dos híbridos (Fields y
Song, 1989, Nature, 340(6230):245-246 y
Durfee, supra) para ensayar si E1 de HPV puede
auto-asociarse en levadura y para representar un
dominio de E1 implicado en esta interacción (Figura 1). Como se
puede ver en la Figura 1A, una proteína de fusión constituida por la
molécula E1 entera (aminoácidos 1-649) fusionada el
dominio de unión al DNA (BD) de GAL4 es adecuada para activar la
transcripción del gen informador LacZ conducido por UAS_{Gal} en
la cepa Y153 de levadura. Las proteínas de fusión más cortas que
carecen de los 71 aminoácidos N-terminales de E1 no
activaron la transcripción, lo que indica que el extremo N de E1
puede contener un dominio de activación de la transcripción. Estas
proteínas de fusión más cortas se pudieron utilizar para ensayar
una interacción con la proteína E1 entera fusionada al dominio de
activación de GAL4 (AD) (Figura 1A). La interacción de estas
proteínas de fusión más cortas con la molécula E1 entera dio lugar
a tan sólo bajos niveles de \beta-galactosidasa,
aunque reproduciblemente más altos que el fondo (Figura 1A y datos
no indicados) lo que indica que E1 puede
auto-asociarse en levadura. Se utilizaron una serie
de deleciones para representar el dominio de interacción hasta la
región C terminal de E1 (aminoácidos 353-649). La
auto-asociación de E1 fue más fácilmente detectable
entre proteínas de fusión que contenían solamente la porción
C-terminal de E1 (aminoácidos
330-649 y 353-649) (Figura 1B). Se
utilizó una serie de deleciones para refinar la posición del
dominio de interacción de E1 (Figura 1B). De este modo, se
identificó un dominio de interacción de E1, largo, de 64
aminoácidos, entre los aminoácidos 353-416 (Figura
1B). Un fragmento de E1 C-terminal (aminoácidos
435-649) que carecía de este dominio de 64
aminoácidos fue incapaz de asociarse con E1
(330-649) (Figura 1B) aunque retenía la capacidad de
interaccionar con E2. El dominio de interacción
E1-E1 pequeño (353-416) fue capaz no
sólo de interaccionar con el fragmento más largo de E1
(330-649), sino consigo mismo (Figura 1C). Este
último resultado indicaba que los restos 353-416 son
necesarios y suficientes para la interacción homotípica de E1. La
interacción de este pequeño dominio con E1
(330-649), o consigo mismo, dio lugar a niveles más
bajos de actividad de \beta-galactosidasa que la
interacción entre fragmentos E1 más largos (353-649
y 330-649) (Figura 1C). Este resultado concordaba
con la noción de que los restos entre los aminoácidos
435-649, aunque no suficiente para la interacción
con E1, puede contribuir a la fuerza de la interacción.
Los resultados presentados anteriormente creaban
la posibilidad de que los restos 435-649 de E1, que
están localizados en posición C-terminal respecto
del dominio de interacción E1-E1
(353-416), también puedan contribuir a la
resistencia de la interacción E1-E1 en levadura.
Como los restos 435-649 abarcan el dominio de unión
al ATP de E1, la compañía solicitante mutó tres aminoácidos
altamente conservados implicados en la unión al ATP y ensayó el
efecto de estas sustituciones de aminoácidos sobre la
auto-asociación de E1 en levadura. Estas
sustituciones intercambiaron dos restos de la agrupación Walker A
(bucle P) de E1: la prolina 479 se cambió por serina y la lisina
484 se intercambió por ácido glutámico y glutamina. Como se puede
ver en la Figura 2, estas tres sustituciones disminuyeron la
interacción E1-E1 en levadura. Estos resultados
indican que la integridad del dominio de unión al ATP es importante
para la auto-asociación de la proteína E1.
Los estudios anteriores en levaduras sugirieron
que al menos dos regiones de E1 participan en la
auto-asociación: un dominio de
auto-asociación (aminoácidos
435-416) y un dominio de unión al ATP. Para
investigar el papel de estas dos regiones en la oligomerización de
E1 in vitro, la compañía solicitante utilizó un ensayo que
detecta la unión de E1 al origen de HPV. Por analogía con E1 de BPV,
la compañía solicitante anticipó que la oligomerización de E1
ocurriría tras unirse al origen. En este ensayo, la proteína E1 de
HPV11 que se sintetiza por transcripción/traducción acoplada en un
producto de lisis de reticulocitos de conejos se incuba con una
mezcla de dos fragmentos de DNA radiactivos, uno de los cuales
contiene el origen de HPV11. Los complejos proteína
E1-DNA que se forman en esta reacción se
inmunoprecipitan después con un anticuerpo contra E1 y el DNA
co-precipitado se visualiza por electroforesis en
gel y autorradiografía. En estos experimentos, se utilizaron una
serie de proteínas E1 truncadas además de la proteína de tipo
salvaje, con el fin de definir el dominio mínimo capaz de formar un
complejo con el origen. Todas las proteínas E1 se expresaron a
niveles similares (datos no indicados). Se hicieron tres
observaciones. Primero, utilizando la E1 de tipo salvaje, solamente
una pequeña cantidad de complejos E1-ori pudieron
formarse en las condiciones del ensayo (Figura 3A). Probablemente
esto sea debido al gran exceso de DNA competidor presente en estas
reacciones (en forma de plásmidos utilizados para programar los
productos de lisis) y a la especificidad de secuencia baja de E1
por el origen. Segundo, se observó que una proteína E1 mutante que
carecía de los 71 restos N-terminales había
aumentado su afinidad (aproximadamente 5 veces) por el origen en
comparación con la proteína de tipo salvaje (Figura 3A) (denominada
aquí en lo sucesivo E1*). Todavía se está investigando el mecanismo
por el que la deleción del extremo N incrementa la afinidad de E1
por el origen. La unión de la molécula E1 truncada al origen fue
específica ya que resultaba afectada por dos sustituciones de
aminoácidos dobles en la superficie de unión de
E1-DNA (Figura 3B). Estas dos sustituciones de
aminoácidos son similares a las de E1 de BPV-1 que
abolen la unión de E1 de BPV al origen (Thorner y col.. 1988,
J. Virol. 62:2474-2482). También se demostró
especificidad por la observación de que una mutación triple en el
origen disminuía la unión de E1 (Figura 3C). Previamente se
demostró que, utilizando el análisis de huellas con DNasa I, que
esta mutación puntual triple caía en el sitio de unión a E1 del
origen y afectaba a la unión de E1 (Sun y col., 1995,
Virology 216:219-222). La tercera observación
que se hizo fue que el dominio más pequeño de E1 que podía unirse
al origen estaba constituido por los aminoácidos
191-649 (Figura 4). La deleción adicional de este
dominio en el extremo N ó C abolía la unión al origen (Figura 4).
La interpretación más simple de estos resultados es que la unión y
oligomerización de E1 al origen requiere una superficie de unión al
DNA (localizada entre los restos 191 y 300) y un dominio de
oligomerización (aminoácidos 353-649).
Si los aminoácidos 353-431 de E1
codifican un dominio de interacción E1-E1 que se
requiere para la oligomerización en el origen, entonces habría que
anticipar que este dominio, una variante, un derivado o fragmento
del mismo, a solas, cuando se proporciona en exceso, inhibiría en
trans la unión de E1* (72-649) al origen.
Para ensayar esta hipótesis, se expresaron en E. coli fragmentos de
E1: 353-416, 353-431 y
353-438 y se purificaron en forma soluble como
fusiones con tiorredoxina. En ausencia de tiorredoxina como
co-partícipe de fusión, estos tres fragmentos E1
fueron insolubles (datos no indicados). Las proteínas de fusión
contenían una secuencia de polihistidina que permitía su
purificación por cromatografía de afinidad con níquel (Figura 5A).
Las tres proteínas de fusión fueron ensayadas seguidamente en
cuanto a su capacidad para inhibir la unión de E1*
(72-649) al origen, a una concentración de 8 mM (un
exceso molar de 300 veces aproximadamente respecto de E1). Como
puede verse en la Figura 5B,
TRX-E1(353-431) y
TRX-E1(353-438) inhibían la
unión de E1 al origen. TRX-E1
(353-416) no era inhibidora a una concentración de
8 \muM, quizás porque esta proteína de fusión es densamente
proteolizada o debido a que tiene una menor afinidad por E1 como lo
sugería los estudios con dos híbridos (véase la Figura 2B). En las
mismas condiciones, TRX a solas no tenía ningún efecto (Figura 5B).
En estos experimentos, se ensayaron dos preparaciones
independientes de cada proteína de fusión con resultados similares
(Figura 1A y datos no indicados). La concentración inhibidora del
50% para TRX-E1(353-431)
según se midió era aproximadamente 3 \muM (Figura 5C). Estos
resultados refuerzan las nociones de que la región A es necesaria
para la oligomerización de E1 en el origen y de que
E1(353-431) codifica un dominio de
interacción E1-E1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ya que la auto-asociación de E1
en levadura requiere un dominio de unión al ATP intacto (véase lo
anterior), se investigó el papel de ATP/Mg en la formación del
complejo E1-ori in vitro. Esto se hizo
complementando las reacciones de unión con un ATP/Mg a
concentraciones de 5 y 3 mM, respectivamente. Las reacciones se
realizaron a tres temperaturas diferentes (4, 23 y 37ºC). Como se
puede ver en la Figura 6A, en ausencia de ATP/Mg, la unión de E1 al
origen disminuía drásticamente a alta temperatura (37ºC). Esta
inhibición por la temperatura elevada podía ser aliviada por
adición de ATP/Mg (Figura 6A). A temperaturas más bajas (23 y 4ºC)
ATP/Mg tenía sólo un efecto modesto. Se ensayaron diferentes tipos
de nucleótidos, combinados con magnesio, en cuanto a su capacidad
para estimular la unión de E1 al origen. En vez de ATP podía
utilizarse ADP, pero no AMP o adenosina (Figura 6B). De modo
similar, los otros tres nucleótidos (CTP, GTP, UTP) así como los
cuatro desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) podían estimular
la unión al origen (Figura 6C). Dos análogos no hidrolizables,
ATP-\gamma-S y
GTP-\gamma-S, también eran
estimuladores indicando que la unión del substrato, pero no su
hidrólisis, es necesaria para que E1 se una al origen (Figura
6C).
Las sustituciones de aminoácidos en el dominio
de unión al ATP de E1 se ensayaron en cuanto a su efecto sobre la
unión de E1 al origen (Figura 7). Algunas sustituciones afectan a
restos altamente conservados de la agrupación Walker A (Figura 7A),
que probablemente está implicado en la unión de la cola de
trifosfato del nucleótido substrato (Gorbalenya y Koonin, 1993,
Current Opinion in Structural Biology 3:419-429).
Como se puede ver en la Figura 7, estas sustituciones, incluidas
aquellas que evitan la auto-asociación de E1 en
levadura (P479S, K484Q y K484E), disminuían la unión de E1 al
origen. Junto con los resultados presentados anteriormente, estos
hallazgos indican que la unión al ATP es necesaria para que E1 se
una al origen.
En estos experimentos, se ensayó también el
efecto de cambiar restos altamente conservados en la agrupación C
así como fenilalanina 509 de E1. Estos restos están conservados
entre miembros de la superfamilia 3 pero su función es desconocida.
Como se puede ver en la Figura 7B, la sustitución de estos
aminoácidos por alanina no abolían la unión de E1 al origen,
indicando que no son esenciales para este proceso ni para la unión
al ATP.
\vskip1.000000\baselineskip
El dominio de interacción E1-E1
que fue representado en levadura estaba constituido por los
aminoácidos 353-416. Esta región de E1 abarca la
región A conservada, una de cuatro regiones de alta similitud de
frecuencia entre E1 de diversos virus de papiloma y los antígenos T
grandes de los virus SV40 y poliomavirus (Clertant y Seif, 1984).
Para determinar si esta región es esencial para que E1 se una al
origen, se crearon seis sustituciones de aminoácidos independientes
en este dominio (F378A, Y380A, N389A, A390G, F393A, Q399A) (Figura
8A) y se ensayaron en cuanto a su efecto sobre la formación del
complejo E1-ori. Cuatro de las seis sustituciones
afectan a los restos que son invariables entre papiloma y
poliomavirus (N389A, A390G, F393A, Q399A) (Figura 8A). Las otras
dos sustituciones (F378A e Y380A) afectan a los restos hidrofóbicos
que forman parte de una agrupación que se une a zinc en un antígeno
T grande (Figura 8A), lo cual es necesario para la oligomerización
(Loeber y col., 1991, J. Virology,
65(6):3167-3174). Aunque esta
agrupación del dedo de zinc no se conserva en los papilomavirus,
F378 e Y380 caen en una región de E1 que, como en la región análoga
en T grande, se predice que se pliega formando una hélice alfa
(datos no indicados). La unión de estas proteínas E1 mutantes al
origen se ensayó tanto a 23ºC en ausencia de ATP/Mg complementado,
como a 37ºC en reacciones complementadas con ATP/Mg (5 y 3 mM,
respectivamente). Bajo ambos conjuntos de condiciones, los
resultados fueron muy similares. Tres de las sustituciones, Y380A,
N389A y F393A, disminuían drásticamente la unión de E1 al origen
(Figura 8B). Otras dos sustituciones, A390G y Q399A, también fueron
perjudiciales y dieron como resultado sólo una cantidad modesta de
unión de E1 al origen. Sólo una sustitución, F378A, tuvo poco efecto
de unión de E1 al origen. Estos resultados indicaron que la
integridad estructural de la región A conservada de E1 es necesaria
para que E1 se una al origen.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar si la región A conservada de E1 es
necesaria para la unión dependiente de E2 de E1 al origen, se
utilizó un ensayo similar al ensayo de unión del origen a E1
descrito anteriormente, con los siguientes cambios: en la reacción
se incluye E2, preparada por traducción in vitro, y se
utiliza la proteína E1 de longitud completa
(1-649). Como se puede ver en la Figura 9A, tres de
las sustituciones (Y380A, N389A, F393A) disminuyeron drásticamente
la formación de complejo. Otras dos sustituciones (A390G y Q399A)
tuvieron un efecto menos pronunciado. Una sustitución, F378A, tenía
sólo un efecto modesto sobre la formación del complejo
E1-E2-ori. Estos resultados indican
que la integridad estructural de la región A conservada es necesaria
en la formación del complejo ternario
E1-E2-ori.
Las proteínas E1 mutantes que son portadoras de
sustituciones en la región A conservada, junto con E2, se ensayaron
en cuanto a su capacidad para soportar la replicación de un plásmido
que contiene el origen en células transfectadas temporalmente. Como
se puede ver en la Figura 9B, tres de los mutantes de E1, F378A,
A390G y Q399A, fueron capaces de soportar la replicación de DNA de
HPV, aunque a niveles reducidos comparados con la E1 de tipo
salvaje en el caso de A390G y Q399A. Tres de los mutantes E1, Y380A,
N389A y F393A, fueron incapaces de soportar la replicación. Estos
resultados indicaron que la región A conservada de E1 es necesaria
para la replicación temporal del DNA de HPV. La capacidad de los
mutantes de E1 para soportar la replicación temporal de DNA de HPV
estaba bien co-relacionada con su capacidad de
unirse al origen o bien en ausencia o en presencia de E2 (véase más
arriba). Una advertencia potencial en estos experimentos es que la
estabilidad de diversas proteínas mutantes E1, en comparación con
la de E1 de tipo salvaje, no pudo ser evaluada debido a los bajos
niveles de expresión de E1 (datos no indicados). Por lo tanto, es
posible que el bajo nivel de replicación observada con algunas
proteínas mutantes pueda también estar relacionada con un efecto
sobre la acumulación de proteínas.
El ensayo es el mismo que el presentado en el
Ejemplo 9 pero se realizó con 75 ng de E1* de HPV11
(72-649) marcada con His purificada, recombinante,
producida en células de insecto Sf21 infectadas con baculovirus y
200 ng de DNA plasmídico como competidor. También se añadió CHAPS en
la mezcla de unión a una concentración final de 0,15%.
Se produjo E1* en células de insecto Sf21 por
infección con baculovirus recombinante que expresan una E1*
(72-649) marcada con histidina (6 histidinas). Las
células infectadas se recogieron por centrifugación 48 h después de
la infección y después se midió el volumen de sedimento de células.
El sedimento de células se congeló sobre hielo seco y se almacenó a
-80ºC.
Para la purificación, el sedimento de células se
descongeló y se resuspendió en un volumen (en relación con el
volumen del sedimiento) de tampón A hipotónico
(Tris-HCl 20 mM, pH 8,0;
\beta-mercaptoetanol 5 mM; KCl 5 mM; MgCl_{2} 1
mM; antipaína, leupeptina, pepstatina a 1 \mug/ml y Pefabloc a 1
mM). Después de incubar sobre hielo durante 15 min, la suspensión
de células se sometió a 20 golpes de mano de almirez B en un
homogeneizador Dounce. Después se recogieron los núcleos por
centrifugación a 2.500 g durante 20 min a 4ºC y se resuspendieron a
1,4 volúmenes (respecto del volumen inicial del sedimento de
células) en tampón B (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0;
\beta-mercaptoetanol 5 mM; antipaína, leupeptina,
pepstatina a 2 \mug/ml y Pefabloc a 2 mM). Después se añadieron
1,4 volúmenes de tampón C (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0;
\beta-mercaptoetanol 5 mM; NaCl 900 mM) y la
suspensión se mezcló y se incubó con balanceo durante 30 min a 4ºC.
Después, el extracto se centrifugó a 148.000 g durante 45 min a 4ºC
para sedimentar el residuo. El sobrenadante se recogió y se le
añadió glicerol a una concentración final de 10% antes de
congelarlo sobre nieve carbónica y almacenarlo a -80ºC hasta la
cromatografía.
Para la cromatografía, el extracto de células se
descongeló y se cargó en una columna Hi-Trap de 5 ml
(Pharmacia Biotech) cargada con níquel y equilibrada con
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0;
\beta-mercaptoetanol 5 mM; NaCl 500 mM; 10% de
glicerol. Después de cargar el extracto, la columna se lavó con
7-8 volúmenes de tampón de equilibración que
contenía imidazol 150 mM. La proteína E1* unida se eluyó
seguidamente con tampón de equilibración que contenía imidazol 250
mM.
Para detectar la oligomerización de E1 in
vitro, se utilizó reticulación con el agente reticulante
bismaleimidohexano (Agente reticulante, Pierce), que reacciona con
sulfhidrilo. La proteína E1* marcada con ^{35}S
(72-649) preparada por transcripción/traducción
in vitro (sistema de producto de lisis de reticulocitos
acoplado TNT, Promega), se incubó en presencia o ausencia de 50
ng/ml de DNA monocatenario (ss, del inglés
single-stranded) (60 meros, correspondiente a los
nucleótidos 7902 a 34 del origen de HPV-11) durante
1 h a dos temperaturas diferentes, 23º y 37ºC (condiciones finales
de unión: 12,5 \mul de E1 traducida en un volumen final de 37,5
\mul que contiene Tris 20 mM, pH 7,6, NaCl 100 mM, DTT 1 mM, ATP 5
mM, MgCl_{2} 3 mM). La reticulación se realizó diluyendo las
reacciones de unión 13 veces con tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0) que
contenía BMH 100 \muM. Las reacciones de reticulación se
detuvieron después de 1 min por adición de DTT a una concentración
final de 2,5 mM. Después, las proteínas E1 se inmunoprecipitaron
con un anticuerpo policlonal dirigido contra los 14 aminoácidos C
terminales de HPV-11 y se analizaron por
electroforesis en gel (gel de poliacrilamida
Weber-Osborn al 3% [Weber y Osborn, 1969]) y
autorradiografía. En estas condiciones, el DNA monocatenario
estimuló en gran medida la reticulación de E1 formando oligómeros
(Figura 10). Además de la E1 monomérica, se observaron cinco bandas
diferentes de proteínas que correspondían a oligómeros de E1. Estas
especies E1 oligoméricas, cuando se comparan con patrones de peso
molecular, migran a las posiciones esperadas para dímeros, trímeros,
tetrámeros, pentámeros y hexámeros (datos no indicados). Lo mismo
ocurrió también cuando los experimentos de reticulación se
efectuaron con proteínas E1 truncadas (véase más abajo) rompiendo la
norma de que las proteínas procedentes del producto de lisis de
reticulocitos constituyen parte de estos complejos. En conjunto,
estos resultados indican que E1 de HPV-11 tiene la
capacidad de formar hexámeros tras unirse al DNA monocatenario.
Finalmente, se ha observado que la oligomerización de E1 podía
estimularse por oligonucleótidos de DNA ss que no se obtenían a
partir del origen de HPV, indicando que la unión de E1 a DNA ss es,
en gran parte, independiente de la secuencia (datos no
indicados).
Después se utilizó un conjunto de proteínas E1
truncadas (Figura 11) preparadas por traducción in vitro,
para representar el dominio mínimo de E1 capaz de oligomerizarse.
Los restos 353-649 de E1 resultaron ser suficientes
para formar oligómeros in vitro. De forma muy interesante,
los niveles de oligomerización de E1 (330-649) y E1
(353-649) fueron sustanciales incluso en ausencia de
DNA monocatenario y no aumentaron por adición de ss DNA. El hecho
de que el extremo C de E1 se oligomerice "constitutivamente"
proporciona una explicación plausible de porqué este dominio, a
diferencia de la proteína completa, podía
auto-asociarse fácilmente en el sistema de dos
híbridos de levadura. La proteína E1 más pequeña cuya
oligomerización era dependiente de ss DNA estaba constituida por
los aminoácidos 191-649. Por lo tanto, la región
entre los restos 191-330 parece desempeñar una
función crítica inhibiendo la oligomerización del dominio
C-terminal (330-649) y confiriendo
respuesta del ss DNA.
La región de E1 que es suficiente para la
oligomerización (restos 353-649) abarca el dominio
de unión al ATP. Se ha investigado el papel del dominio de unión al
ATP sobre la oligomerización de E1 ensayando el efecto de
mutaciones que cambian restos altamente conservados implicados en la
unión al ATP. Estas proteínas E1* mutantes
(72-649), que se sintetizaron por traducción in
vitro, llevan sustituciones de aminoácidos en uno de tres
restos, llamados A, B y C, que caracterizan el dominio de unión al
ATP de la E1 y de otros miembros de la superfamilia 3 de proteínas
que se unen a NTP (Figura 12A). Las agrupaciones A y B corresponden
a las agrupaciones A y B Walker clásicas, que juntos se unen al ATP
como quelato de magnesio. Los restos en la agrupación A, también
conocido como bucle que se une a fosfato (bucle P), interaccionan
con la cola de trifosfato de ATP. La agrupación B está implicado en
la coordinación del ion magnesio asociado con el nucleótido
substrato. La función exacta de la agrupación C conservado es
desconocida pero se ha sugerido que también puede participar en la
unión al ATP. También se ensayó otra proteína E1* mutante en la que
un resto altamente conservado, F509, que cae entre las agrupaciones
B y C y cuya función es desconocida, había sido mutado. Con la
excepción de la sustitución F509A, todas las demás sustituciones
disminuían la oligomerización de E1 en un grado variable (Figura
12B). Las sustituciones en la agrupación A tenían el mayor efecto,
lo que indica que la integridad estructural del bucle P es esencial
para la oligomerización. Las sustituciones en las agrupaciones B o C
disminuyeron la formación de oligómeros pero no la abolieron
completamente. En conjunto, estos resultados indican que la
integridad estructural del dominio de unión al ATP de E1 es esencial
para la oligomerización. El dominio de unión al ATP podía ser
necesario para unirse a ATP, lo cual podría regular alostéricamente
la oligomerización. Alternativamente, o adicionalmente, la
integridad del dominio de unión al ATP podía ser necesaria para el
plegado/estabilidad adecuados del dominio C-terminal
completo. Sin embargo, el hecho de que todas las sustituciones que
afectan a la oligomerización, con la excepción de K484E y K484Q, no
afecten a la unión de E2 (Titolo y col., 1999), sugieren que estas
sustituciones no alteran drásticamente la estructura global del
dominio C-terminal.
A continuación se ensayó el efecto de
aminoácidos en la región A conservada de E1 en cuanto a su efecto
sobre la oligomerización de la proteína utilizando el ensayo de
reticulación. Se sintetizaron seis proteínas E1* mutantes por
traducción in vitro y se ensayaron en cuanto a su
oligomerización en presencia de ss DNA como se ha descrito
anteriormente. Tres de las seis proteínas mutantes ensayadas, Y380A,
N389A y F393A, fueron seriamente defectuosas en este ensayo (Figura
13). Como era de esperar, éstas son las tres mismas proteínas
mutantes que también eran seriamente defectuosas en la
unión/oligomerización en el origen de HPV (Figura 9). Estos
resultados refuerzan la noción de que la región A conservada de E1
es necesaria para la oligomerización.
Sin pretender estar vinculados a ninguna teoría,
la compañía solicitante cree que los resultados proporcionados
aquí, indican que la región definida por SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3
o SEQ ID NO. 4, es la región que es necesaria para la
oligomerización de E1. Por lo tanto, esta región puede servir como
diana para inhibir la replicación de DNA de PV para el tratamiento
de infección PV.
<110> Boehringer Ingelheim (Canadá)
Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Regiones de la helicasa E1 del Virus
del Papiloma implicados en la oligomerización de E1
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Solicitud PCT para EPO
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/093,626
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-07-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 649
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E1 de HPV-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E1 de HPV-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E1 de HPV-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> E1 de HPV-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E1 de HPV-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 317
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 649
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 649
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 649
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 649
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 649
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 649
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: E1 de HPV-11 mutada
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<400> 64
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 76
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<212> DNA
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<400> 77
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<210> 78
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<211> 578
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<212> PRT
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<213> E1 truncada
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<400> 78
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<210> 79
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> E1 C-terminal
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<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm106
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Un péptido de una proteína E1 definido por la
secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO. 2.
2. Un péptido de una proteína E1 definido por la
secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO. 3.
3. Un péptido de una proteína E1 definido por la
secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO. 4.
4. Un péptido de una proteína E1 definido por la
secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO. 78.
5. Un ensayo de oligomerización, que comprende
las etapas de:
- a.
- combinar una proteína E1, seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 4; y SEQ ID NO. 78 con un fragmento de DNA, e incubarlos durante un período de tiempo para permitir que la proteína E1 y el DNA formen un complejo,
- b.
- aislar dicho complejo de proteína E1/DNA del DNA no complejado,
- c.
- detectar dicho DNA, donde la presencia de DNA es una indicación de la unión de proteína E1 al origen de PV, y por lo tanto se co-relaciona con la oligomerización de E1.
6. Un ensayo de oligomerización según la
reivindicación 5, en donde la proteína E1 tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO. 78.
7. Un ensayo para rastrear un agente capaz de
inhibir la oligomerización de E1, comprendiendo este ensayo la
etapas de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 y comprendiendo además
las etapas de:
- a.
- poner en contacto un agente con dicha E1 según se define en la reivindicación 5 ó 6 antes de combinarla con el fragmento de DNA e incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que la proteína E1/DNA formen un complejo, y
- b.
- comparar los resultados con una muestra testigo, donde la muestra testigo se trata de manera similar pero sin la adición de dicho agente.
8. El ensayo de la reivindicación 5 ó 6, en el
que dicho DNA contiene un origen de replicación.
9. El ensayo de la reivindicación 8, en el que
dicha E1 se combina con una mezcla de dos fragmentos de DNA, uno de
los cuales contiene un origen de replicación y el segundo contiene
un DNA de diferente longitud de cadena de manera que es
distinguible del DNA que contiene ori y la cantidad de E1 unida al
DNA que contiene ori puede compararse con la cantidad de unión no
específica.
10. El ensayo de la reivindicación 5 ó 6, en el
que dicho complejo E1-DNA se aísla del DNA libre por
cromatografía en columna, centrifugación, extracción, filtración,
inmunoprecipitación o se inmoviliza sobre un soporte sólido
utilizando un anticuerpo dirigido contra la proteína E1.
11. El ensayo de la reivindicación 10, en el que
dicho E1-DNA se aísla por inmovilización del
anticuerpo en un medio sólido tal como una perla o el fondo de un
pocillo de una placa de ensayo de manera que cuando se separa el
medio, lo haga el DNA libre.
12. El ensayo de la reivindicación 10, en el que
dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
13. El ensayo de la reivindicación 5 ó 6, en el
que dicho DNA complejado es liberado de dicho complejo E1/DNA antes
de que se detecte dicho DNA.
14. El ensayo de la reivindicación 13, donde
dicho DNA se marca con un radioisótopo y se detecta por
electroforesis en gel seguida de obtención de imagen
radiactiva.
15. El ensayo de la reivindicación 13, en el que
dicho DNA se marca con un colorante colorimétrico y se detecta
espectrofotométricamente.
16. Un ensayo de reticulación para evaluar el
nivel de oligomerización de la proteína E1, comprendiendo dicho
ensayo las etapas de:
- a.
- combinar la proteína E1 marcada, seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 4; y SEQ ID NO. 78, con un fragmento de DNA e incubar durante un período de tiempo, para permitir que la proteína E1 y el DNA formen un complejo,
- b.
- reticular dicha E1 y el DNA en el complejo con un agente reticulante,
- c.
- aislar el complejo E1/DNA del DNA no complejado,
- d.
- separar E1 electroforéticamente de modo que la migración de E1 en un gel es una indicación del nivel de oligomerización de E1.
17. Un ensayo de reticulación de acyerdo con la
reivindicación 16, en donde la proteína E1 tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO. 78.
18. El ensayo de la reivindicación 16 ó 17, en
el que dicho fragmento de DNA es un DNA monocatenario.
19. El ensayo de la reivindicación 16 ó 17, en
el que dicho complejo E1-DNA se aísla del DNA libre
por cromatografía en columna, centrifugación, extracción,
filtración, inmunoprecipitación o se inmoviliza sobre un soporte
sólido utilizando un anticuerpo dirigido contra la proteína E1.
20. El ensayo de la reivindicación 19, en el que
dicha E1 se inmunoprecipita utilizando un anticuerpo policlonal.
21. El ensayo según la reivindicación 16 ó 17,
en el que dicha proteína E1 se marca con un radioisótopo.
22. El ensayo según la reivindicación 21, en el
que dicha E1 se marca con ^{35}S y se detecta sobre dicho gel por
técnicas de obtención de imágenes radiológicas.
23. El ensayo según la reivindicación 16 ó 17,
en el que dicho agente reticulante utilizado es bismaleimidohexano
(BMH).
24. El ensayo de la reivindicación 5 ó 6 ó 16 ó
17, en el que dicha proteína E1 se obtiene por: síntesis por
transcripción/traducción acopladas en un producto de lisis de
reticulocitos de conejo o se prepara por tecnología
recombinante.
25. El ensayo de la reivindicación 5 ó 6 ó 7, en
el que dicho ensayo se lleva a cabo a baja temperatura en presencia
o ausencia de ATP/Mg.
26. El ensayo de la reivindicación 5 ó 6 ó 7, en
el que dicho ensayo se lleva a cabo a alta temperatura en presencia
de ATP/Mg.
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