JP4430821B2 - Ｅ１オリゴマー化に関係するパピローマウイルスｅ１ヘリカーゼの領域 - Google Patents
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Description
【０００１】
（技術分野）
本発明はE1タンパク質のホモ重合に必要な、パピローマウイルスE1タンパク質に含まれるアミノ酸配列に関する。このオリゴマー化は、ウイルスDNA複製の開始における必須の工程である。更に、本発明はこのタンパク質間相互作用に干渉することができる薬剤を選択することができるスクリーニング方法及びスクリーニング系を開示する。更に、本発明は動物のPV感染症の治療及び防除に使用するためのこのタンパク質間相互作用をモジュレートすることができる薬剤の選択のための系に関する。
【０００２】
（背景技術）
パピローマウイルス(PV)は上皮の異常増殖性病変を誘発する非外膜DNAウイルスである。パピローマウイルスはその性質上広範囲に広まっており、高等脊椎動物に認められていた。ウイルスは、中でも、ヒト、ウシ、ウサギ、ウマ、及びイヌから特性決定された。最初のパピローマウイルスがワタオウサギパピローマウイルス(CRPV)として1933年に記載された。それ以来、ワタオウサギだけでなくウシのパピローマウイルス型１(BPV-1)がパピローマウイルスに関する研究のための実験プロトタイプとして利用することができた。殆どの動物パピローマウイルスが純粋に上皮の増殖性病変と関連しており、動物の殆どの病変が皮膚である。ヒトには、同定された75以上の型のパピローマウイルス(HPV)があり、それらが感染の部位：皮膚上皮及び粘膜上皮（口及び生殖の粘膜）によりカタログに入れられていた。皮膚関連疾患として、扁平いぼ、足底いぼ等が挙げられる。粘膜関連疾患として、喉頭パピローマ及び子宮頸癌を含む肛門性器の疾患が挙げられる(Fields, 1996, Virology,第３編 Lippincott-Raven Pub.,フィラデルフィア, N.Y.)。
【０００３】
肛門性器の疾患に示された25以上のHPV型があり、これらが“低リスク”型及び“高リスク”型に分類される。低リスク型はHPV型６、型11及び型13を含み、殆ど良性の病変、例えば、尖圭コンジローム（性器いぼ）及び低グレードの扁平上皮内病変(SIL)を誘発する。米国では、性器いぼを有する約５百万の人がおり、その内の90％がHPV-6及びHPV-11に起因している。また、SILの約90％が低リスク型６及び11により引き起こされる。SILのその他の10％が高リスクHPVにより引き起こされる。
高リスク型は高グレードのSIL及び子宮頸癌と関連しており、殆ど頻繁にHPV型16、18、31、33、35、45、52、及び58を含む。低グレードSILから高グレードSILへの進行は低リスクHPV型を含む病変と較べて高リスクHPV-16及び18を含む病変について極めて頻繁である。加えて、四つのHPV型（型16、18、31及び45）のみが子宮頸癌中に頻繁に検出される。頸部の侵食癌の約500,000の新しい症例が１年間に世界中で診断される(Fields, 1996,上記文献)。
【０００４】
性器いぼの治療として、物理的除去、例えば、低温療法、CO2レーザー、電気手術、又は外科切除が挙げられる。細胞毒性薬、例えば、トリクロロ酢酸(TCA)、ポドフィリン又はポドフィロックスがまた使用し得る。免疫調節剤、例えば、インターフェロン又はイミキモドがまた利用可能である。これらの治療は全てのウイルス粒子を排除するのに完全には有効ではなく、高コストがかかり、又はそれに関連する不快な副作用がある。実際に、HPV感染症について現在有効な抗ウイルス治療がない。全ての現在の療法では、再発いぼが普通である(Beutner＆Ferenczy, 1997, Amer. J. Med., 102(5A), 28-37)。
【０００５】
HPV感染症を治療する現在の方法の無効がこのような感染症を防除又は排除する新しい手段を同定する必要を証明した。近年、努力が抗ウイルス化合物、特にウイルス複製に干渉することができる化合物を見出すことについて向けられていた(Hughes及びRomanos, 1993, Nucleic Acids Res. 21:5817-5823; Clarkら, Antiviral Res., 1998, 37(2):97-106; Hajdukら, 1997, J. Med. Chem., 49(20):3144-3150及びCowsertら, 1993, Antimicrob. Agents. Chemother., 37(2):171-177)。その目的のために、それ故、HPV感染により引き起こされる疾患を含み、そしておそらく排除する潜在的化学療法的標的を同定するためにHPVの遺伝子学を研究することが重要になってきた。
PVの生活環はケラチノサイト分化に密接に結びつけられる。感染は基底上皮中の組織破壊の部位で生じるものと考えられる。正常な細胞と違って、細胞は垂直分化を受けるにつれて細胞分裂が続く。感染された細胞が進行性分化を受けるにつれて、細胞組織が維持され、これがウイルス遺伝子発現を増大させ、最終的に末端分化ケラチノサイト中のその後の遺伝子発現及びビリオン集合並びにウイルス粒子の放出を伴う(Fields,上記文献)。
【０００６】
パピローマウイルスの夫々に関するコーディングストランドは早期ORF又は後期ORFとして分類された約10の指定された翻訳読み取り枠（ORF）を含む。E1〜E8遺伝子はウイルス複製サイクルで早期に発現される。二つの後期遺伝子（L1及びL2）は夫々主要キャプシドタンパク質及び非主要キャプシドタンパク質をコードする。E1遺伝子産物及びE2遺伝子産物はウイルスDNA複製に機能し、一方、E5、E6及びE7は宿主細胞増殖をモジュレートする。L1及びL2はビリオン構造に関係する。E3、E4及びE8遺伝子産物の機能は現在では確かではない。
HPVの研究はタンパク質E1及びE2がin vitroウイルスDNA複製に必要とされる唯一のウイルスタンパク質であることを示した(Kuoら, 1994, J. Biol. Chem. 30: 24058-24065)。この要件はウシパピローマウイルス型１(BPV-1)の要件と同様である。実際に、ウイルスの種及び型にかかわらずE1及びE2タンパク質と全てのパピローマウイルス(PV)のori-配列の間には高度の類似性がある(Kuoら, 1994,上記文献)。重要なことに、E1はPV中に最も高度に保存されたタンパク質であり、その酵素活性は全てのPV型について同様であると推定される(Jenkins, 1996, J. Gen. Virol., 77:1805-1809)。それ故、異なるPVからの全てのE1遺伝子産物は同様の構造及び機能を有することが予想される。加えて、PV E1タンパク質はシミアンウイルス40及びポリオーマウイルスラージＴタンパク質に対し配列類似性及び構造類似性を示す（Clertant及びSeif, 1984, Nature 311:276-279及びMansleyら, 1997, J. Virology 71:7600-7608）。
【０００７】
E2タンパク質はE1タンパク質に結合する転写アクチベーターであり、これらの２種のタンパク質及びori配列が３成分複合体を形成する(Mohrら, 1990, Science 250:1694-1699)。E2はBPV複製起点へのE1の結合を促進するものと考えられている(Seoら, 1993b, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2865-2869)。HPVでは、LuiらはE2がoriへのE1結合を安定化することを示唆した(1995, J. Biol. Chem., 270(45):27283-27291及びMcBrideら, 1991, J. Biol. Chem 266:18411-18414)。
BPV-1の研究から生じる証拠はE1がウイルスDNA複製の開始に必要とされるATPase活性及びヘリカーゼ活性を有することを示した（Seoら, 1993a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:702-706; Yangら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5086-5090;及びMacPhersonら, 1994, Virology 204:403-408）。
【０００８】
BPVからのE1タンパク質は複製関連機能を有するリン酸化核タンパク質である。これらとして、DNA及びATP結合、並びに、ATPase活性及びヘリカーゼ活性が挙げられる。欠失マッピング研究がDNA結合に必要とされる領域としてアミノ酸121-311を同定した。この領域内の突然変異が完全長E1タンパク質によるDNA結合を排除する（Lengら, 1997, J. Virol. 71:848-852及びThornerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:898-902）。第二の機能、ATP結合及びATPase活性がウイルスDNA複製に必須である。ATP結合ドメイン中の保存領域内の点突然変異が、ATPを結合し、又は加水分解するE1の能力を不活性化すると同時にDNA複製の損失をもたらす（MacPhersonら, 1994, Virology 204:403-408; Raj及びStanley, 1995, J. Gen. Virol. 76:2949-2956及びSunら, 1990, J. Virol 64:5093-5105）。E1タンパク質により有される第三の活性は、ヘリカーゼ活性又は複製フォークに先立つDNAの巻き戻しである。研究はヘリカーゼ活性がDNA結合ドメイン、ATPase／ヌクレオチド結合領域中のアミノ酸121、およそのアミノ酸530にあることを予測した（Sverdrup及びMeyers, Human Papillomaviruses, 1997, Theoretical Biology and Biophysicsにより発行）。
【０００９】
ウイルスDNA複製がin vitroで進行する時、E1タンパク質が過剰に存在する場合には、複製がE2の不在下で進行する。in vivoでは、多量の細胞DNAの存在下で、複製がE1及びE2の両方の存在を必要とする。E2はE1を複製起点に誘導する際に特異性因子として作用する（Sedman及びStenlund, 1995, Embo. J. 14:6218-6228）。in vivoの複製を開始するメカニズムは、起点へのE1及びE2の協力的結合を伴うと考えられ、それによりE1及びE2が複合体を形成する。DNA-タンパク質及びタンパク質間のこれらの相互作用はDNA複製起点で生じる（Sverdrup及びMyersの上記文献）。
おそらく起点で、複製フォークに先立ってDNAを巻き戻すことができる、ヘリカーゼとしてのE1タンパク質のメカニズムの理解は、本発明の利点の一つである。PV研究及びSV40 DNA複製に基づいて、PVに関する複製開始の２相モデルが提案されていた（Sverdrup及びMeyersの上記文献）。第一工程において、E1及びE2が複製起点に協力的に結合し、こうして複製起点に対する結合特異性を確実にする。第二工程において、付加的なE1モノマーがE2の同時の損失を伴って起点に動員される。起点におけるE1ホモ-オリゴマー複合体の形成がDNA複製活性及びDNA合成を開始する際の細胞複製組織の動員に必要とされると考えられる（Sverdrup及びMeyersの上記文献）。
【００１０】
PV感染症を予防し、防除し、減少し、又は排除するのに有効な治療薬が未だないので、PVの生活環を大いに詳しく研究し、ウイルスDNA複製の更に良い理解を特別に生じることが重要になりつつある。in-vivo又はin-vitroのE1オリゴマー化のメカニズムについての知識が驚く程少ない。従来技術はE1オリゴマー複合体の形成における、このタンパク質間相互作用に必要であるE1タンパク質に沿ってのその領域の配置について言及していない。
こうして、このオリゴマー化に関係するメカニズム及び要素の理解を与えることについての要望が存する。このプロセスの知識がPVに対する潜在的に新しい治療標的を与える。
それ故、本発明の利点の一つはこの明らかな自己会合に必要なE1タンパク質中のアミノ酸領域を同定することである。
更に、本件出願人によるこの領域の局在化がPV感染症の治療において潜在的に新しい治療標的を与える。それ故、本発明の更なる利点はこの新しい標的をモジュレートすることができる薬剤を同定するためのスクリーニング方法及びPV DNA複製に干渉することができる少なくとも一種のこのような薬剤を選択するための系を提供することである。
本発明は幾つかの文献に言及しており、これらの内容が参考として本明細書に含まれる。
【００１１】
（発明の開示）
本発明はパピローマウイルスDNA複製を開始するのに必要な工程の幾つかの解明に関する。更に特別には、本発明はウイルスDNA複製におけるE1タンパク質(a.a. 1-649)（配列番号１）の役割の解明に関する。最も特別には、本発明はウイルスDNA巻き戻し及びDNA複製に先行する工程としての、PV E1タンパク質オリゴマー化の要件の解明に関する。
【００１２】
それ故、本発明の第一の実施態様によれば、E1タンパク質のオリゴマー化に必要な、アミノ酸352-439により表されるPV E1タンパク質領域Ａ内に含まれるアミノ酸配列、及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントが提供される。このアミノ酸配列は自己会合することができ、また本発明の配列を含む完全長E1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントと会合することができる。
この第一の実施態様によれば、PV E1タンパク質のオリゴマー化に必要なアミノ酸配列が提供される。このアミノ酸領域又はドメインは、ヒトパピローマウイルスウイルス(HPV)型11のアミノ酸配列からナンバリングして、アミノ酸352-439により表される。同じ構造活性及び機能活性を示すことができるこのアミノ酸領域のあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントが本発明の範囲内にある。この第一の実施態様の特別な局面において、アミノ酸配列はアミノ酸352-432により更に表される。この第一の実施態様の更に特別な実施態様において、アミノ酸配列はアミノ酸352-417により更に表される。本件出願人はPV E1タンパク質内に含まれるこのドメインをE1タンパク質オリゴマー化（これはウイルスDNA複製の開始に必須の不可欠な工程である）に必要なアミノ酸配列として同定した最初の者であった。それ故、この第一の実施態様の特別な局面において、本発明のアミノ酸ドメインはPV E1タンパク質のアミノ酸353-438により境界を定められる。更に特別には、本発明のアミノ酸ドメインは配列番号２により特定されたとおりである。
【００１３】
また、本件出願人はこのアミノ酸配列の解明が哺乳類のPV感染症の防除、予防、排除及び治療に新しい治療標的を与えることを認めた最初の者であった。
それ故、本発明の第二の実施態様によれば、E1タンパク質と共沈されたDNAの量を検出し、かつ／又は測定することによりE1/DNA結合（それ故、E1タンパク質のオリゴマー化）を評価するためのスクリーニングアッセイが提供される。
理論により束縛されたくないが、本件出願人はE1自己オリゴマー化の測定がこのE1タンパク質と共沈されたDNAの測定により間接的に相関関係付けられると仮定した。BPV E1との相似性により、本件出願人はE1のオリゴマー化が起点への結合後に起こるであろうと予測し、その結果、E1に結合された起点の量の測定がオリゴマー化されたE1タンパク質の間接的な測定であろう。
【００１４】
今、本件出願人はこの仮定が架橋アッセイの設計及びこの架橋アッセイと本発明の先の実施態様によるオリゴマー化アッセイとの相関関係を示すことにより正しいことを判明した。
それ故、本発明の第三の実施態様によれば、E1タンパク質のオリゴマー化（又はその抑制）のレベルを直接測定する架橋アッセイが提供される。
本発明の第四の実施態様によれば、Ｎ末端切断型E1タンパク質が提供される。更に特別には、この第四の実施態様の一つの局面はアミノ酸72-649（配列番号78）により境界を定められたE1タンパク質を含む。
本発明のその他の目的、利点及び特徴は添付図面を参照する好ましい実施態様の下記の非限定の記載（これは例示であり、本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない）を読んだ後に更に明らかになるであろう。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
定義
特に特定しない限り、本明細書に使用される科学用語及び技術用語並びに命名法は本発明が関係する当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学的方法等に関する操作は当業界で使用される普通の方法である。このような標準の技術が参考マニュアル、例えば、Sambrookら(1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories)及びAusubelら(1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York)に見られる。
ヌクレオチド配列は当業界で普通に使用される１文字ヌクレオチド記号を使用して、かつIUPAC-IUB生化学命名委員会の推奨(Biochemistry, 1972, 11:1726-1732)に従って、左から右に、5'から3'方向に、単一ストランドにより本明細書中に示される。
【００１６】
本記載は幾つかのルーチンで使用される組換えDNA (rDNA)技術用語について言及している。それにもかかわらず、このようなrDNA用語の選ばれた例の定義が明瞭化及び一貫性のために示される。
当業界で知られている“組換えDNA”又は“組換えプラスミド”という用語はDNAセグメントの結合から得られるDNA分子を表す。これはしばしば遺伝子操作と称される。
“DNAセグメントもしくは分子又は配列”という用語はデオキシリボヌクレオチドアデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)及び／又はシトシン(C)を含む分子を表すのに本明細書に使用される。これらのセグメント、分子又は配列は自然に見られ、又は合成により誘導し得る。遺伝子コードに従って解読される時に、これらの配列はポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント等と称されるアミノ酸の線状ストレッチ又は配列をコードし得る。
本明細書に使用される“遺伝子”という用語は当業界で公知であり、単一タンパク質又はポリペプチドを特定する核酸配列に関する。ポリペプチドは、そのタンパク質の機能活性が保持される限り、完全長配列又はコーディング配列の部分によりコードされる。
【００１７】
“構造遺伝子”はRNAに転写され、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳され、それにより特定のポリペプチド又はタンパク質を生じるDNA配列を特定する。
“制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素”はDNA分子中の特定の塩基配列（通常、長さ４、５又は６塩基対）を認識する能力、及びこの配列が現れるあらゆる場所でDNA分子を開裂する能力を有する酵素である。このような酵素の例はEcoRIであり、これは塩基配列GAATTC/CTTAAGを認識し、この認識部位でDNA分子を開裂する。
【００１８】
“制限フラグメント”は制限エンドヌクレアーゼによるDNAの消化により生成されたDNA分子である。あらゆる所定のゲノム又はDNAセグメントが特別な制限エンドヌクレアーゼにより少なくとも二つの別個の分子又は制限フラグメントに消化し得る。
“アガロースゲル電気泳動”はサイズに基づいて二本鎖DNA分子を分別するための分析方法である。その方法はDNA分子が篩中のようなゲル中を移動し、それにより最小のDNA分子が最大の移動度を有し、ゲル中を最も遠くに移動することに基づいている。ゲルの篩特性が最大のDNA分子を遅延し、その結果、これらが最小の移動度を有する。分別されたDNAは当業界で公知の方法を使用してゲルを染色すること、核酸ハイブリダイゼーション又は分別されたDNA分子を検出可能な標識で標識することにより視覚化し得る。全てのこれらの方法が当業界で公知であり、特別な方法がAusubelらの上記文献に見られる。
【００１９】
“オリゴヌクレオチド”は２種以上、好ましくは３種より多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子である。その分子の正確なサイズは多くの因子に依存し、これらが順にオリゴヌクレオチドの最終の機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは合成、クローニング又は増幅により誘導し得る。
“配列増幅”は多量の標的配列を生成する方法である。一般に、一種以上のプライマーが核酸配列にアニールされる。適当な酵素を使用して、プライマーに隣接し、又はプライマー間にある配列が増幅される。本明細書に使用される増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。
“増幅プライマー”は標的配列に隣接するDNA領域にアニールし、当業界で公知の好適な条件下でDNA合成の開始プライマーとして利用することができるオリゴヌクレオチドを表す。合成されたプライマー延長生成物は標的配列に相補性である。
【００２０】
“ドメイン”又は“領域”という用語はタンパク質内の特定の機能又は構造を特定する特定のアミノ酸配列を表す。本明細書の例として、パピローマウイルスE1タンパク質内に含まれる本発明のオリゴマー化ドメインがある。
本明細書に使用される“表される”という用語は表しているアミノ酸を除くと称されるアミノ酸の間に含まれるタンパク質又はペプチドセグメントを意味する。例えば、アミノ酸30-100により表されるタンパク質はアミノ酸30（除かれる）とアミノ酸100（除かれる）の間に位置されるあらゆる長さのあらゆるタンパク質もしくはペプチドセグメント又はそのあらゆる変異体、誘導体もしくはフラグメントを表す。
本明細書に使用される“境界を定められた”という用語は境界を定めるアミノ酸を入れると称されるアミノ酸からなるタンパク質又はペプチドセグメントを意味する。例えば、アミノ酸31-99により境界を定められたタンパク質はアミノ酸31-99を含むタンパク質もしくはペプチドフラグメント又はそのあらゆる変異体もしくは誘導体を表す。
【００２１】
本明細書に使用される“融合タンパク質”という用語は自然では一緒に結合されない少なくとも２種のポリペプチドセグメントを表す。本発明のこのような“融合タンパク質”の非限定例として、チオレドキシンに融合されたE1タンパク質及びその変異体、フラグメント又は変異体が挙げられる。本発明の目的のために、チオレドキシンの使用は融合されたE1タンパク質又はそのあらゆるフラグメント、変異体又は誘導体が可溶性形態で精製されることを可能にする。それ故、E1タンパク質を可溶化することができるあらゆるタンパク質が本発明の目的のために使用し得る。本発明の目的のための融合タンパク質の別の例はGAL4タンパク質へのE1タンパク質及びそのあらゆる変異体、誘導体又はフラグメントの融合である。これらの融合されたポリペプチドは“アフィニティー標識”のポリペプチドに更に融合されてもよい。或る実施態様において、付加的な開裂部位を融合された二つのポリペプチド配列の間に導入することが有益であるかもしれない。二つ以上の異種融合タンパク質の間のこのような開裂部位が当業界で公知である。
【００２２】
“ベクター”又は“DNA構築物”という用語は当業界で普通に使用され、オリゴヌクレオチド配列、又は本発明の配列を含むことができ、本発明のDNAがクローン化し得るDNAビヒクルとして利用できるプラスミドDNA、ファージDNA、ウイルスDNA等を含むが、これらに限定されないあらゆる遺伝子要素を表す。多数の型のベクターが存在し、当業界で公知である。
“発現”という用語は構造遺伝子がmRNAに転写され（転写）、次いでmRNAが一種以上のポリペプチド（又はタンパク質）に翻訳される（翻訳）プロセスを特定する。
【００２３】
“発現ベクター”という技術用語は上記のとおりであるが、宿主への形質転換後に挿入配列の発現を可能にするように設計されたベクター又はビヒクルを特定する。クローン化遺伝子（挿入配列）は調節要素配列、例えば、プロモーター配列の制御下に通常置かれる。このような発現調節配列はベクターが原核生物宿主もしくは真核生物宿主又はその両方（シャトルベクター）中で機能し得る形で連結された遺伝子を発現するように設計され、更に転写要素、例えば、エンハンサー要素、終結配列、組織特異性要素、及び／又は翻訳開始部位及び終止部位を含むことができるか否かに応じて変化するであろう。
“真核生物発現系”は適当な発現ベクターと関係するタンパク質を発現するのに使用し得る真核生物細胞系との組み合わせを意味する。幾つかの系において、タンパク質の遺伝子が使用される細胞型を感染し得るウイルスのゲノムに挿入し得る。また、所望の遺伝子を含むプラスミドベクターが使用し得る。全ての場合、ベクターはタンパク質を関係する細胞型中で発現するのに適した調節要素（プロモーター）を含むであろう。また、付加的な成分、例えば、T7ポリメラーゼをコードするベクター又はウイルスゲノムが或る発現系で必要であるかもしれない。典型的に使用される真核生物細胞型はプラスミドベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ、ピシア・パストリス）；バキュロウイルス（オートグラファ・カリフォルニカ又はボムビックス・モリ）で感染された昆虫細胞（例えば、SF9、SF21）(Luckow, Curr. Op. Biotech., 1993, 4:564-572; Griffiths及びPage, 1994, Methods in Molec. Biol. 75:427-440;及びMerringtonら, 1997, Molec. Biotech. 8(3):283-297)；アデノウイルス、ワクチニアウイルス、シンドビスウイルス、又はセムリキ森林ウイルスで感染された哺乳類細胞；及び一時的又は構成的発現のためのDNAベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞である。酵母サッカロミセス・セレビジエ系及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞からの哺乳類細胞がここで特に好ましい。
【００２４】
宿主細胞又はインジケーター細胞はこのようなDNAが細胞内に導入された時に外因性又は異種DNA（例えば、DNA構築物）により“トランスフェクト”された。トランスフェクトDNAは細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み込まれて（共有結合されて）もよく、またそうでなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳類の細胞中で、トランスフェクティング／形質転換DNAはプラスミドの如きエピソーム要素に維持されてもよい。真核生物細胞に関して、安定にトランスフェクトされた細胞の例はトランスフェクトされたDNAが染色体に組み込まれるようになり、染色体複製により娘細胞により遺伝される細胞である。この安定性はトランスフェクトされたDNAを含む娘細胞の集団を含む細胞系又はクローンを樹立する真核生物細胞の能力により実証される。トランスフェクション方法は当業界で公知である(Sambrookら, 1989,上記文献；Ausubelら, 1994,上記文献)。
【００２５】
本明細書に使用される“アフィニティー標識”という用語は相補性リガンドにより特異的に捕捉される標識を表す。アフィニティーマーカー／アフィニティーリガンドの対の例として、マルトース結合タンパク質(MBP)／マルトース；グルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)／グルタチオン；ポリ-ヒスチジン(His)／金属が挙げられるが、これらに限定されない。アフィニティーリガンドとして使用される金属はコバルト、亜鉛、銅、鉄、及びニッケルからなる群から選ばれてもよい(Wongら, 1991, Separation and Purification Methods, 20(1), 49-106)。選ばれる金属はニッケルであることが好ましい。アフィニティーリガンドはアフィニティークロマトグラフィーによる分離を促進するためにカラム中に固定し得る。
【００２６】
アフィニティー標識はタンパク質のＮ末端又はＣ末端、好ましくはタンパク質のＮ末端に配置し得る。
本発明を実施するのに有益なヌクレオチド配列及びポリペプチドとして、突然変異体、同族体、サブタイプ、対立遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、本発明の配列は相互作用ドメインをコードすることが理解されるべきである。本発明の相互作用ドメイン及びそのあらゆる変異体、誘導体又はフラグメントは本発明の教示及びアッセイ並びに一般技術を使用して容易に決定し得ることが当業者に明らかであろう。
本明細書に使用される“変異体”という名称は本発明の状況において初期の配列の生物活性に実質的に似ている生物活性（機能又は構造の）を保持する分子の配列（核酸又はアミノ酸を問わない）を表す。この変異体又は均等物は同じ種又は異なる種からのものであってもよく、天然変異体であってもよく、又は合成により調製されてもよい。このような変異体として、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列があげられるが、但し、タンパク質の生物活性が保存されることを条件とする。同じことが一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を有し得る核酸配列の変異体に適用されるが、但し、その配列又はその翻訳タンパク質の生物活性が一般に維持されることを条件とする。
“誘導体”という用語は通常これらの分子の一部ではない付加的な化学部分を含む場合の上記変異体のいずれをも含むことが意図されている。これらの化学部分は分子の溶解性、吸収、生物学的半減期を改良し、毒性を低下し、また望ましくない副作用を排除又は低下することを含む種々の目的を有し得る。更に、これらの部分は標識、結合の目的に使用でき、又はそれらは融合生成物中に含まれてもよい。上記効果を媒介することができる異なる部分がRemington's The Science and Practice of Pharmacy (1995)に見られる。このような部分を分子に結合する方法は当業界で公知である。
【００２７】
“フラグメント”という用語は同定されたDNA、RNA又はアミノ酸配列のあらゆるセグメント及び／又は本明細書に上記された変異体もしくは誘導体のいずれかのあらゆるセグメントを表す。
本発明の“変異体”、“誘導体”、及び“フラグメント”という用語は本明細書中単離／精製され、化学的に合成され、又は組換えDNA技術により生成されるタンパク質分子又は核酸分子を表す。全てのこれらの方法が当業界で公知である。
本明細書に以下に例示されるように、本発明に使用されるヌクレオチド配列及びポリペプチドは、その触媒及び構造-機能関係を分析し、得られるタンパク質の良好な設計及び同定を可能にするために、例えば、in vitro突然変異誘発により修飾し得る。
【００２８】
“オリゴマー化”は少なくとも二つの分子間の相互作用を表す。これらの分子は同じであってもよく、また異なっていてもよい。本発明において、自己オリゴマー化という用語はE1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントの間の相互作用を表す。
“スクリーニング配列”は本明細書中でそれ自体又はPV E1タンパク質（その誘導体、フラグメント又は変異体を含む）にオリゴマー化することができるアミノ酸配列と定義される。この配列はオリゴマー化をモジュレートする薬剤を選択するためのスクリーニング方法の成分を含む。
“DNA同時免疫沈澱アッセイ”はタンパク質-DNA相互作用の検出のためのアッセイである。タンパク質-DNA複合体は複合体中に含まれるタンパク質の抗体で免疫沈澱される。DNAを含む免疫沈澱した生成物は当業界で公知の方法、例えば、アガロースゲル電気泳動、続いて放射能像形成又は比色技術により検出／測定され、又は視覚化し得る。
【００２９】
好ましい実施態様
特に好ましい実施態様において、E1オリゴマー化に必要なPV E1タンパク質領域Ａ内に含まれる、アミノ酸配列及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントが提供される。
E1タンパク質のオリゴマー化はE1タンパク質領域Ａの種々のサイズのアミノ酸フラグメントを使用することによりこの出願において実証される。これらのフラグメントが全て本発明の範囲内にある。
この第一の実施態様によれば、HPV-11に従ってナンバリングしてアミノ酸352-439により表されるPV E1タンパク質のオリゴマー化に必要なアミノ酸配列が提供される。また、アミノ酸配列はHPV-11ナンバリングに従ってアミノ酸353-438により境界を定められる。更にまた、アミノ酸配列は配列番号２により特定される。
【００３０】
この第一の実施態様の好ましい局面において、アミノ酸配列はアミノ酸352-432により表される。また、アミノ酸配列はHPV-11ナンバリングに従ってアミノ酸353-431により境界を定められる。更にまた、アミノ酸配列は配列番号３により特定される。
この第一の実施態様の更に特別な局面において、アミノ酸配列はアミノ酸352-417により表される。また、アミノ酸配列はHPV-11ナンバリングに従ってアミノ酸353-416により境界を定められる。更にまた、アミノ酸配列は配列番号４により特定される。
アミノ酸配列の上記実施態様によれば、本明細書中の配列に機能上均等であるその全ての変異体、誘導体及びフラグメントが本発明の範囲内にある。
本発明の付加的な実施態様によれば、本発明のアミノ酸配列は自己会合し得る。更に、これらの配列は本発明の配列を含む、完全長E1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントとオリゴマーを形成し得る。
それ故、本発明の第二の実施態様によれば、E1タンパク質と共沈されたDNAの量を検出し、かつ／又は測定することによりE1/DNA結合（ひいてはE1タンパク質のオリゴマー化）を評価するためのスクリーニングアッセイが提供される。
【００３１】
この第二の実施態様の特別な局面によれば、E1タンパク質と同時免疫沈殿されたDNAの減少を測定することによりE1オリゴマー化を抑制することができる薬剤をスクリーニングするためのアッセイが提供される。
更に特別には、この第二の実施態様は
a.E1タンパク質をDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートしてE1タンパク質及びDNAに複合体を形成させる工程、
b.E1タンパク質/DNA複合体を複合体形成しなかったDNAから単離する工程、
c.DNAを検出する工程（DNAの存在はE1タンパク質のDNAへの結合を示し、従ってE1オリゴマー化と相関関係がある）
を含むことを特徴とするオリゴマー化アッセイを提供する。
【００３２】
このアッセイに使用されるE1は本発明のアミノ酸配列、完全長E1タンパク質、Ｎ末端切断型E1タンパク質（e1*）及びこれらのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントから選ばれてもよい。
この特別な実施態様に使用されるDNAフラグメントはE1結合の特異性を増進するために複製起点を含むことが好ましい。E1は２種のDNAフラグメントの混合物と合わされることが更に好ましく、その一種は複製起点を含み、また第二のフラグメントは異なる長さのDNAからなり、その結果、それがoriを含むDNAから区別でき、またoriを含むDNAに結合されたE1の量が非特異的結合の量と比較し得る。
特に、E1-DNA複合体はカラムクロマトグラフィー、遠心分離、抽出、濾過、又は免疫沈澱により遊離DNAから単離される。E1-DNAは抗体をSPAビードの如き固体担体又は試験プレートからのウェルの下部に固定することにより単離されることが更に好ましく、その結果、培養培地が除去される時、遊離DNAも共に除去される。
特に、E1はポリクローナル抗体を使用して免疫沈澱又は固定される。更に特別には、ポリクローナル抗体がK71又はK72である。
複合体形成されたDNAが検出される前に、DNAがE1/DNA複合体から放出されることが好ましい。このような放出は、例えば、有機抽出により行なわれてもよい。
【００３３】
この第二の実施態様の特別な局面において、DNAはゲル電気泳動、分光光度分析及び放射性像形成を含む方法により検出し得る。それ故、選ばれた検出手段に応じて、DNAが蛍光色素又は放射性同位元素を含む当業界で知られているあらゆる適当な手段により標識される。DNAは放射能標識され、ゲル電気泳動、続いて放射性像形成により検出されることが好ましい。また、DNAは比色色素で標識され、分光光度により検出され、又はDNAは蛍光色素で標識され、シンチレーション接近技術(SPA)により検出される。
特に、DNAは複合体形成の前、免疫沈澱の後又はDNAが免疫沈澱複合体から放出された後に標識される。
【００３４】
この第二の実施態様の特別な局面において、E1オリゴマー化を抑制することができる薬剤のスクリーニングに適した上記アッセイが提供され、このアッセイは
a.薬剤をE1タンパク質と接触させ、その後にDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートしてE1タンパク質/DNAに複合体を形成させる工程、及び
b.これらの結果を対照サンプルと比較する工程（対照サンプルは同様に処理されるが、前記薬剤が添加されない）
を更に含む。
更に特別には、このような選ばれた薬剤はオリゴマー化に干渉することができ、最も特別には、このような薬剤は上記のE1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントのオリゴマー化に抑制性である。
【００３５】
本発明の第三の実施態様によれば、E1タンパク質のオリゴマー化（又はその抑制）のレベルを直接測定する架橋アッセイが提供される。特に、このオリゴマー化アッセイは
a.標識E1タンパク質をDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートして、E1タンパク質及びDNAに複合体を形成させる工程、
b.複合体中のE1タンパク質及びDNAを架橋剤で架橋する工程、
c.E1タンパク質を電気泳動で分離する工程（その結果、E1の移動がE1のオリゴマー化のレベルの指示である）
を含む。
E1/DNA複合体は分離を行なう前に遊離DNAから単離されることが好ましい。
特に、このオリゴマー化アッセイに使用されるE1タンパク質はＮ末端切断型E1タンパク質である。それはその最初の約70Ｎ末端アミノ酸が欠失されていることが更に好ましい。このE1タンパク質はアミノ酸72-649により境界を定められることが更に好ましい。
E1タンパク質は放射性同位元素で標識されることが好ましい。それは35Sで標識され、ゲル上で当業界で公知の放射性像形成技術により検出されることが更に好ましい。
架橋剤はビスマレイミドヘキサン(BMH)であることが好ましい。
【００３６】
本発明の第四の実施態様によれば、Ｎ末端切断型E1タンパク質が提供される。特に、最初の約70Ｎ末端アミノ酸がe1タンパク質から欠失されている。更に特別には、この第四の一局面はアミノ酸72-649（配列番号78）により境界を定められたE1タンパク質を含む。
E1タンパク質がその他のパピローマウイルス並びにSV40及びポリオーマウイルスＴ抗原との類似性を有することが示されたので、本発明は本発明のアミノ酸配列に対し機能類似性及び／又は構造類似性を有する、ウイルスDNA複製を開始するのに必要とされるタンパク質のオリゴマー化に必要なあらゆるアミノ酸配列を含む。
本発明の付加的な好ましい実施態様において、同様の機能及び／又は構造を有するオリゴマー化に必要なE1タンパク質中の領域がウシパピローマウイルス、ワタオパピローマウイルス又はヒトパピローマウイルス中に存在する。本発明の実施態様の特別な局面において、PV DNAはHPVからのものである。
更に好ましい実施態様において、E1タンパク質の領域はHPV低リスク型又は高リスク型から選ばれる。高リスク型は型16、18、31、35、45、52及び52からなり、また低リスク型は型６、11及び13からなる。
本発明の最も好ましい実施態様において、本発明のアミノ酸配列は低リスクヒトパピローマウイルス型11からのものである。
【００３７】
本発明の実施態様の特別な局面において、E1タンパク質は異なる手段により得られる。非限定例において、タンパク質がウサギ網状赤血球溶解産物中で対になった転写／翻訳により合成され、又は組換え技術によりつくられる。
本発明の適用によれば、スクリーニング方法及びスクリーニング系は低温でATP/Mgの存在下もしくは不在下で、又は高温でATP/Mgの存在下で行なわれる。約４℃〜23℃の低温、また約37℃の高温で行なわれることが更に好ましい。更に、E1タンパク質はin-vitro転写／翻訳、又は組換え技術によりつくられてもよく、アミノ酸72-649（配列番号78）を含むが、当業界で知られているその他の手段がスクリーニングのためのアミノ酸配列を得るのに使用し得る。
本発明の適用において、本発明のアミノ酸配列及びそのあらゆる変異体、誘導体又はフラグメントは、それに結合することができるあらゆるタンパク質又は分子の選択のためのアフィニティーカラム中に使用し得る。非限定例は抗体、ポリペプチド、核酸配列及び化学化合物である。
本発明の実施態様を使用して選ばれた薬剤はウイルスDNA複製、特にパピローマウイルスDNA複製、更に特別にはHPVに作用することが好ましい。本発明の特別な適用において、一種以上の選ばれた薬剤はパピローマウイルス感染症の治療用の医薬組成物中に使用し得ることが意図されている。
特別な技術手段が本明細書に例示されているが、本発明の目的のために当業者に知られているあらゆる手段が本発明の範囲にあることが意図されている。
【００３８】
（実施例）
実施例１：酵母株、培地、及び遺伝的方法
サッカロミセス・セレビジエ株Y153（MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-901 his3-Δ200 ade2-101 gal4Δ gal80Δ URA3::GAL-lacZ LYS::GAL-HIS3）を酵母２ハイブリッド分析（Durfeeら, 1993, Genes. Dev. 7:555-569）に使用した。Clontech Matchmaker Library Protocolに実質的に記載されたLiAc方法を使用して、酵母株Y153の形質転換を行なった。２種のプラスミドの組み合わせで同時形質転換された細胞を、ロイシン及びトリプトファンを欠いているが、その他の必要とされるアミノ酸を補給したSD培地（Shermanら, 1979, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載された）で30℃で３〜５日にわたって選択した。
【００３９】
実施例２：β-ガラクトシダーゼアッセイ
形質転換酵母細胞を、ロイシン及びトリプトファンを欠いている液体SD培地中で前増殖させ、次いでYPD（Shermanらの上記文献）培養物に接種するのに使用した。これらの培養物が600nmで約0.6の光学密度（OD600）に達するまで、それらを30℃で増殖させた。次いで細胞を回収し、洗浄し、凍結（液体窒素）及び解凍の２サイクルにより透過性にした。次いでClontech Matchmaker Library Protocolに記載された基質クロロフェニルレッド-β-D-ガラクトピラノシド（CRPG、ベーリンガー・マンハイム）を使用して、β-ガラクトシダーゼ活性を分光光度（578nmにおける）により測定した。式：ミラー単位=(1000xOD578)/（経過時間x1.5mlの培養液xOD600）を使用して、酵素活性を計算した。
【００４０】
実施例３：プラスミド構築物
A. in-vitro 転写 / 翻訳用のプラスミド
増幅用の構築物及びプライマーを表１に要約する。
HPV-11 E1及びE2のin vitro合成に使用したプラスミドをpCR3（インビトロゲン、CA）又はpTM1（バーナード・モス、NIHから入手した）から誘導した。これらのプラスミド中で、コードされたタンパク質が読み取り枠(ORF)の上流に位置されたT7プロモーターからin vitroで発現し得る。対にされた転写/翻訳系（TNT結合型網状赤血球溶解産物系、プロメガ）中で使用した場合、pTM1から誘導されたプラスミドはタンパク質の高レベルの合成を誘導した。おそらく、このプラスミドがEMCV IRES（脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位）（これは翻訳を刺激する（データは示されていない））をコードするからである。
【００４１】
pCR3-E1及びpCR3-E2を構築するために、完全HPV-11 E1及びE2 ORFをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により別々に増幅したが、DNAを増幅することができるあらゆる方法が本発明の目的に適している。下記のオリゴヌクレオチドの対を増幅反応に使用した。
E1 : CAAGGATGGCGGACGATTCA （配列番号15）、及び
TCTTCATAAAGTTCTAACAAC（配列番号16）
E2: GAAGATGGAAGCAATAGCCAA （配列番号17）、及び
ATGGTTACAATAAATGTAATGAC （配列番号18）
（E1及びE2のATG及び停止コドンが下線を施されている）
PCRに使用したDNA鋳型はバキュロウイルス構築物Ac11E1又はAc11E2（ロチェスター大学のR. Roseから入手した）であった。TAクローニングキット（インビトロゲン）を使用して、E1及びE2のPCR産物を夫々プラスミドpCR3中でサイトメガロウイルス即時型プロモーターの調節下でクローン化してpCR3-E1及びpCR3-E2を生成した。
FLAGエピトープ（Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）にＮ末端で融合されたE1（アミノ酸2-649）を発現するプラスミドpCR3-FLAG-E1（FLAGエピトープはイーストマン・コダック社からのものである）を下記の２種のオリゴヌクレオチドによるE1 ORFのPCR増幅により構築した。
【００４２】
CATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCGGACGATTCAGGTACAGAAAAT （配列番号19）、及び
GGGATCCTTATTATAAAGTTCTAACAACTGATCCTGGCAC （配列番号20）
（FLAGエピトープをコードする部分が下線を施されている） TAクローニングキット（インビトロゲン）を使用して、得られるPCR産物をプラスミドpCR3（インビトロゲン）にクローン化した。プラスミドpTM1-E1を構築するために、下記の２種のオリゴヌクレオチドを使用してE1 ORFをPCRにより増幅した。
GTACGATCCCATGGCGGACGATTCAGGTACAGAAAAT （配列番号21）、及び
GTACGATGGGATCCTTATTATAAAGTTCTAACAACTGATCCTGGCAC（配列番号22）
【００４３】
得られるPCR産物を制限酵素NcoI及びBamHI（制限部位は２種のオリゴヌクレオチドによりコードされる）で消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位及びBamHI部位の間に挿入した。
FLAGエピトープ（Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）にＮ末端で融合されたE1（アミノ酸2-649）を発現するプラスミドpTM1-FLAG-E1を下記の２種のオリゴヌクレオチドによるE1 ORFのPCR増幅により構築した。
CCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCGGACGATTCAGGTACAGAAAAT （配列番号23）、及び
GGGATCCTTATTATAAAGTTCTAACAACTGATCCTGGCAC （配列番号24）
（FLAGエピトープをコードする部分が下線を施されている） 得られるPCR産物を制限酵素NcoI及びBamHI（２種のオリゴヌクレオチドによりコードされる）で消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位及びBamHI部位の間に挿入した。
【００４４】
in vitroでＮ末端切断型E1タンパク質を発現するプラスミドを、NcoI部位（フォワードプライマー）及びBamHI部位（リバースプライマー）を有する特定のプライマーによるE1 ORFの所望の部分の増幅により構築した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位及びBamHI部位の間に挿入した。使用した異なるE1フォワードプライマー及び共通のリバースプライマーの配列を以下に記載する。これらのオリゴヌクレオチドの夫々によりコードされるE1の最初のアミノ酸が括弧中に示される。
フォワードプライマー：
CCCGGATCCTAATGGCGGACGATTCAGGT(a.a. 1)（配列番号25）
GGCTGGATCCATGGCGGATGCTCATTATGCG(a.a. 72) （配列番号26）
GGCTGGATCCATGGCCATTAAACTTACAACACAG(a.a. 112)（配列番号27）
GGCTGGATCCATGGGCTATTCTGAAGTGGAAG(a.a. 138)（配列番号28）
GGCTGGATCCATGGGGAGGGACATAGAGGGT(a.a. 166)（配列番号29）
GGCTGGATCCATGGACACATCAGGAATATTAGAA (a.a. 191) （配列番号30）
GGCTGGATCCATGGACAGTCAATTTAAATTAACT (a.a. 353) （配列番号31）
GGCTGGATCCATGGACAGTGTAGGTAACTGG (a.a. 435) （配列番号32）
【００４５】
リバースプライマー：
CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT(a.a. 649) （配列番号33）
Ｎ末端71アミノ酸を欠いている切断型HPV-11E1タンパク質をコードするが、そのＮ末端でFLAGエピトープで標識されているプラスミドpTM1-FLAG-E1(72-649)を、FLAG-エピトープをコードするオリゴヌクレオチドを使用してPCR増幅により構築した。
GGGGGCCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGGCGGATGCTCATTATGACTG（配列番号34）（FLAGエピトープの配列が下線を施されている） また、下記のリバースプライマーを使用した。
CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT（配列番号33）
【００４６】
pTM1-FLAG-E1(72-649)と同様であるが、Ｃ末端切断型のE1タンパク質をコードするプラスミドを、NcoI部位（フォワードプライマー）及びBamHI部位（リバースプライマー）を有する特定のプライマーによるE1 ORFの所望の部分のPCR増幅により構築した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位とBamHI部位の間にインフレームで挿入した。共通のフォワードプライマー（FLAGエピトープをコードする）の配列を以下に記載する。また、使用した異なるE1リバースプライマーの配列を記載する。これらのリバースプライマーの夫々によりコードされるE1の最後のアミノ酸が括弧中に示される。
【００４７】
フォワードプライマー：
GGGGGCCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGGCGGATGCTCATTATGACTG（配列番号34）（FLAGエピトープの配列が下線を施されている）
リバースプライマー：CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT（配列番号33）
CCCGGATCCTCATGCATCTGATAGTTCATATACTG (a.a. 608) （配列番号35）
CCCGGATCCTCAGCTAATGTCTATATTTGATGTAACC (a.a. 572) （配列番号36）
CCCGGATCCTCATAAAAATGGAATAAATTCTATGTTTTGATG (a.a. 458)（配列番号37）
CCCGGATCCTCACTGGCGCGTTATCCATTCCGGC (a.a. 344) （配列番号38）
CCCGGATCCTCAAATGCCTGTCCTAAACCAATAC (a.a. 327)（配列番号39）
【００４８】
B. 酵母２ハイブリッドプラスミド
増幅に使用した構築物及びプライマーを表２及び３に要約する。
特に記載されない限り、HPV-11 E1 DNAフラグメントを、NcoI部位（フォワードプライマー）及びBamHI部位（リバースプライマー）を有する特定のプライマーによるPCR増幅により増幅した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、酵母２ハイブリッドベクターpAS1(GAL4 DNA結合ドメイン)及びpACT2(GAL4活性化ドメイン)（Durfeeら, 1993, Genes. Dev. 7:555-569）のNcoI部位とBamHI部位の間にインフレームで挿入した。完全E1タンパク質（アミノ酸1-649）をコードする２ハイブリッドプラスミドを、フォワードプライマーがNcoI部位に代えてBamHI部位を含む以外は、同様の方法で構築した。この場合、PCR産物をBamHIで切断し、pAS1及びpACT2のBamHI部位にインフレームで挿入した。突然変異したE1 ORF (P479S, K484E又はK484Q)を有する２ハイブリッドプラスミドを、PCRの鋳型として突然変異したE1遺伝子を使用する以外は同様の方法で生成した（E1突然変異の記載について以下を参照のこと）。使用した種々のフォワードプライマー及びリバースプライマーを以下に記載する。
【００４９】
フォワードプライマー：
CCCGGATCCTAATGGCGGACGATTCAGGT(a.a.1)（配列番号25）
GGCTGGATCCATGGCGGATGCTCATTATGCG(a.a.72)（配列番号26）
GGCTGGATCCATGGGCTATTCTGAAGTGGAAG(a.a.138)（配列番号28）
GGCTGGATCCATGGACACATCAGGAATATTAGAA(a.a.191)（配列番号30）
GGCTGGATCCATGGCAAGTACAGTTATAGGGG(a.a.330)（配列番号31）
GGCTGGATCCATGGACAGTCAATTTAAATTAACT(a.a.353)（配列番号40）
GGCTGGATCCATGGCATATGATAATGATATTTGTG(a.a.365)（配列番号41）
GGCTGGATCCATGGCATTTGAATATGCACAGCG(a.a.377)（配列番号42）
GGCTGGATCCATGGGAGACTTTGACTCCAATGC(a.a.384)（配列番号43）
GGCTGGATCCATGGACTCCAATGCAAGGGCC(a.a.387)（配列番号44）
GGCTGGATCCATGGATTGTGCAATTATGTGCAG(a.a.405)（配列番号45）
GGCTGGATCCATGGCAGAAATGAAAAAGATGTC(a.a.416)（配列番号46）
GGCTGGATCCATGGACAGTGTAGGTAACTGG(a.a.435)（配列番号32）
【００５０】
リバースプライマー：
CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT(a.a.649)（配列番号33）
CCCGGATCCTCAGCTAATGTCTATATTTGATGTAACC(a.a.572)（配列番号36）
CCCGGATCCTCAATATGTATCCATATATGTCCAAC(a.a.536)（配列番号32）
CCCGGATCCTCATAAAAATGGAATAAATTCTATGTTTTGATG(a.a.458)（配列番号47）
CCCGGATCCTATCACACAATTGGCTTCCAGTTACC(a.a.444)（配列番号48）
CCCGGATCCTATCAACCTACACTGTCAACTTTAG(a.a.438)（配列番号49）
CCCGGATCCTATCAACCCCTATACTTAATCCATTG(a.a.431)（配列番号50）
CCCGGATCCTATCATGCATGTTTATAATGTCTGCAC(a.a.416)（配列番号51）
【００５１】
異なるアプローチを使用して、E1配列353-572、353-536及び353-458をコードするpAS1誘導プラスミド及びpACT2誘導プラスミドを２工程で構築した。最初の工程において、下記の２種のプライマーを使用してE1配列をPCRにより増幅した。
GGCTGGATCCATGGACAGTCAATTTAAATTAACT(a.a.353)（配列番号40）及び
CCCGGATCCAGTGTGATGGATATCTGCAG（配列番号52）(pCR3)
PCRの鋳型は切断型E1 ORF: E1アミノ酸1-572、1-536、又は1-458を発現するpCR3誘導プラスミドであった。PCRに使用した２種のオリゴヌクレオチドの一種はE1のコドンにハイブリダイズする。別のオリゴヌクレオチドは切断型E1 ORFの下流のpCR3のポリリンカー領域にハイブリダイズする。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、pAS1及びpACT2のNcoI部位及びBamHI部位の間にクローン化した。これらの三つのPCR反応に鋳型として使用したプラスミドを下記のオリゴヌクレオチドによるE1 ORFの増幅により構築した。
CAAGGATGGCGGACGATTCA （配列番号15）（E1のATGが下線を施されている）及びE1のコドン572、536及び458の夫々にハイブリダイズする３種のオリゴヌクレオチドの一種。これらのオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
GGATCCTCATTAGCTAATGTCTATATTTGATGT(a.a.572)（配列番号53）
GGATCCTCATTAATATGTATCCATATA(a.a.536)（配列番号54）
GGATCCTCATTATAAAAATGGAATAAATTCTATG(a.a.458)（配列番号55）
TAクローニングキット（インビトロゲン）を使用して、得られるPCR産物をpCR3にクローン化した。
【００５２】
C. 一時的 HPV 複製のためのプラスミド
トランスフェクトされた細胞中でE1及びE2を発現するための一時的HPV DNA複製アッセイに使用したプラスミドをpCR3: pCR3-E1、pCR3-FLAG-E1 (wt及び突然変異体E1)及びpCR3-E2から全て誘導した。これらのプラスミドが先に記載されている。
プラスミドpN9 (Luら, 1993, J. of Virol. 67:7131-7139)はD. McCance （ロチェスター大学）から入手され、ｐブルースクリプトIISK+（ストラタゲン）にクローン化されたHPV-11（ヌクレオチド7884-61）の完全な複製起点を含む。
D. チオレドキシン融合タンパク質の発現のためのプラスミド
E1の３種のフラグメント（a.a.353-416/353-431/353-438）をチオレドキシン(TRX)との融合タンパク質としてE. coli中で発現した。これらの融合タンパク質を発現するためのプラスミドを、上記のフォワードオリゴヌクレオチド及びリバースオリゴヌクレオチドのサブセットを使用してE1 ORFの妥当な部分のPCR増幅により構築した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、TRXをコードするプラスミドpET-32a-c(+)（ノバゲン）のNcoI部位とBamHI部位の間にサブクローン化した。
【００５３】
実施例４：部位誘導突然変異誘発
クイックチェンジ部位誘導突然変異誘発キット（ストラタゲン）を用いて、その製造業者により供給された指示に従って、E1の部位誘導突然変異誘発を行なった。夫々の突然変異誘発について、相補オリゴヌクレオチドの対を使用した。夫々の対について、センスストランドに相当するオリゴヌクレオチドの配列を以下に記載する。また、得られるアミノ酸置換を示す。
E1 F378A GTGAGATAGCAGCTGAATATGCACAGCG（配列番号56）
E1 Y380A GAGATAGCATTTGAAGCTGCGCAGCGTGGAG（配列番号57）
E1 N389A GACTTTGACTCCGCGGCAAGGGCC（配列番号58）
E1 A390G GGAGACTTTGACTCCAACGGCCGGGCCTTTTTAAATAG（配列番号59）
【００５４】
E1 F393A GCAAGGGCCGCGTTAAATAGTAATATGC（配列番号60）
E1 Q399A CCTTTTTAAATAGTAATATGGCGGCTAAATATGTAAAAG（配列番号61）
E1 P479S CCATTGTAGGGTCACCTGACACTGG（配列番号62）
E1 K484E CTGACACTGGGGAGTCGTGCTTTTG（配列番号63）
E1 K484Q CTGACACTGGGCAGTCGTGCTTTTG（配列番号64）
E1 K484H CCTGACACTGGGCACTCGTGCTTTTGC（配列番号65）
E1 K484I CCTGACACTGGGATCTCGTGCTTTTGC（配列番号66）
E1 K484R CCTGACACTGGGCGGTCGTGCTTTTGC（配列番号67）
【００５５】
E1 F509A CCTGCAGCCACGCGTGGCTACAGCC（配列番号68）
E1 T566A CCGCTACTGGTTGCTAGCAATATAGACATTAGC（配列番号69）
E1 N568A CTACTGGTTACATCAGCAATTGACATTAGCAAAG（配列番号70）
E1 K286A/R288A GGTTTAAAGTAAATGCTAGCGCATGTACCGTGGCACG（配列番号71）
E1 A292L/R293E CAGATGTACCGTGCTCGAGACATTAGGTACG（配列番号72）
HPV-11起点中の三重点突然変異を、下記のオリゴヌクレオチドを使用してプラスミドpN9に導入した。
CATATTTCCTTCTTATACTGCAGAACAATCTTAGTTTAAAAAAGAGG（配列番号73）及びその相補オリゴヌクレオチド（突然変異体ヌクレオチドが下線を施されている）
【００５６】
実施例５：E1-起点結合アッセイ
TNT結合型網状赤血球溶解産物系（プロメガ）を使用してin vitroで対にされた転写/翻訳によりE1タンパク質を生成した。TNT網状赤血球溶解産物50μl当り２μgの適当なプラスミドを用いて、製造業者により提供されたプロトコルに従って溶解産物をプログラムした。必要な場合、E1タンパク質を35S-メチオニンのとり込みにより放射能標識した。75μlの最終容積中でE1を含む溶解産物30μl、33P標識DNAプローブ200-400ng、及び10xDNA結合緩衝液（200mM トリス-HCl pH 7.6、1M NaCl、10mM EDTA、10mM DTT）7.5μlを混合することにより、結合反応を行った。結合反応を示された温度で90分間進行させた。示される場合、ATP（又は関連ヌクレオチド）及びMgCl2を夫々5mM及び3mMの最終濃度で結合反応に補給した。DNA-タンパク質を抗FLAG M2モノクローナル抗体（イーストマン・コダック）（FLAG標識E1を使用する場合）、又はHPV11 E1のＣ末端14アミノ酸から誘導されたペプチドに対しウサギ中で産生されたK72ポリクローナル抗体で免疫沈殿させた。このペプチドのアミノ酸配列はQAFRCVPGSVVRTL（配列番号79）である。免疫沈殿中の使用の前に、抗体をプロテインＧセファロースビーズ（抗FLAGを使用する場合）又はプロテインＡセファロースビーズ(K72)に前結合した。タンパク質-DNA複合体の免疫沈殿を結合反応温度で１時間行なった。複合体をウォッシュ緩衝液（50mMトリスpH 7.6; 100mM NaCl; 0.1％トリトンX-100）200μlで３回洗浄した。これらの複合体中に存在するDNAをフェノール/クロロホルムで抽出し、キャリヤー酵母tRNAの存在下でエタノールで沈殿させた。沈殿した放射能標識DNAフラグメントを５％ポリアクリルアミドTBEゲルで分割し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。
【００５７】
これらの実験に使用した放射能標識プローブは２種のDNAフラグメントからなり、２工程で調製した。第一の工程で、プラスミドpN9をXmaIによる消化により線状にし、末端を5μCiのα32P-dCTP及び夫々0.1mMのdTTP、dATP、dGTPの存在下でDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメントで標識した。標識DNAをQIAクイックPCR精製カラム（キアゲン）で精製した。第二の工程で、線状放射能標識pN9をPvuIIで消化して２種の標識フラグメント：HPV-11複製起点を含む370bpフラグメント及び起点を欠いている186bp対照フラグメントを生成した。
【００５８】
実施例６：E2依存性E1起点結合アッセイ
E1-E2-ori３成分複合体の生成に関する条件はE1起点結合アッセイについて上記した条件と実質的に同じであった。唯一の重要な相違はin-vitro翻訳E2タンパク質7.5μlを結合反応に添加し、かつ完全長E1タンパク質（a.a.1-649）をこれらの実験に使用したことであった。これらの実験に使用した野生型及び突然変異体E1タンパク質をpCR3から誘導されたプラスミドから生成した。小さな改良はin-vitro翻訳を２倍量（２μg/25μlの反応）のDNAでプログラムし、プローブ100ngのみをアッセイ当り使用したという事実を含んでいた。
【００５９】
実施例７：E.coliからのTrx-E1融合タンパク質の精製
３種のTRX-E1融合タンパク質（上記を参照のこと）の一種をコードし、又はTRX〔pET32a-c(+)、ノバゲン〕のみをコードするプラスミドを含んだE.coli細胞（BL21::DE3〔pLysS〕）を、アンピシリン（100μg/ml）及びクロラムフェニコール（34μg/ml）を含むLB培地中で一夜増殖させた。これらの一夜培養液3mlを新しい培地（120ml）で40倍に希釈し、O.D.600約0.5まで30℃でインキュベートした。次いでタンパク質発現を30℃で３時間にわたって1mM IPTGで誘発した（培養物がO.D.600約2.0に達するまで）。細菌細胞を10分間にわたって5000xgで遠心分離により回収した。細菌ペレットを1mlの溶解緩衝液（60mMトリスpH 7.6; 300mM NaCl; 10mMイミダゾール）中で再度懸濁させ、音波処理した。得られる溶解産物を16000xgで遠心分離して細胞デブリ及び不溶性物質の除去を得た。上澄みを前平衡したNi-NTAスピンカラム（キアゲン）に装填し、天然タンパク質の精製に関する製造業者のプロトコルに従って精製した。簡単に言えば、装填後に、夫々のカラムを洗浄緩衝液（60mMトリスpH 7.6; 300mM NaCl; 20mM イミダゾール）2x600μlで洗浄し、結合タンパク質を溶離緩衝液（60mMトリスpH 7.6; 300mM NaCl; 250mM イミダゾール）2x200μlで溶離した。次いで精製タンパク質を10％SDS-PAGEにより分析した。次いで全ての融合タンパク質を溶離緩衝液で500ng/μlの最終濃度に希釈した。
【００６０】
実施例８：一時的HPV DNA複製アッセイ
CHO-K1（ATCCから入手した）を、10％ウシ胎児血清及びゲンタマイシンスルフェートを含むハムF12培地中で35mmの組織培養皿中で40%-60％集密まで増殖させた。リポフェクタミン（ギブコBRL）を使用して、細胞をpCR3-E1（又はpCR3-FLAG-E1突然変異体）250ng、pCR3-E2 25ng及びpN9プラスミド250ngでトランスフェクトした。E1のＮ末端におけるFLAGエピトープの存在は一時的HPV DNA複製を支持するその能力に影響しない（データは示されていない）。細胞をトランスフェクションの72時間後に回収し、QIAmpブラッド・キット（キアゲン）を使用して、全DNAを単離した。複製されたpN9プラスミドDNAを、鋳型としてのDpn1消化全DNA及び下記のプライマーの対を使用して起点を含むフラグメントのPCR増幅により検出した。
【００６１】
CTGCAACCGGTTTCGGTTACCCACACCCT（配列番号74）（HPV-11ゲノムのヌクレオチド7885-7913に相当する）及び
CGTTCCACTGAGCGTAGACCCCGTAGAA（配列番号75）（pSK+のヌクレオチド1848-1820に相当する）
対照として、pCR3-E1プラスミドのフラグメントを、E1 ORF内にハイブリダイズする下記のプライマーの対を用いる同じPCR反応で増幅した：GCTTTGGGCTGTCATTTG（配列番号76）及びTGTCAGGTGGCCCTACAA（配列番号77）（HPV-11ゲノムの夫々ヌクレオチド1475-1492及び2275-2258に相当する）。PCR条件は95℃で１分間の初期変性工程、続いて94℃で30秒の変性、51℃で１分間のアニーリング及び72℃で１分30秒の延長の20ラウンドからなり、72℃で３分の最終延長で終了した。PCR産物をPCR反応への〔α33P〕dCTPの添加により放射性にし、アガロースゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化した。
【００６２】
実施例９：E1/DNA同時免疫沈殿アッセイ
1. 結合
ポリプロピレン96ウェルＵ字形下部プレート中で、DMSO中150μg/mlの化合物（又は混合物）５μlを結合マスター混合物（20mMトリスpH 7.4; 100mM NaCl; 5mM ATP; 3mM MgCl2; 1mM EDTA; 1mM DTT; 5ngのHPV11 ori+プローブ）60μlに添加する。結合反応が10μlのin-vitro翻訳HPV11 E1 (72-649)の添加により開始する。プレートをシールし、次いで５分間撹拌し、37℃で１時間インキュベートする。
2. 免疫捕獲
プロテインＡセファロースへの抗体の前結合
夫々のアッセイウェルについて、抗E1ポリクローナル抗体１μlを10％プロテインＡセファローススラリー（20mMトリスpH 7.0）10μlに添加する。そのスラリーを室温で１時間撹拌する。ビーズを迅速遠心分離によりペレットにし、10μlの1x結合緩衝液で洗浄し、次いで50μlの1x結合緩衝液（＋5mM ATP＋1mM DTT）中で再度懸濁させる。
【００６３】
捕獲
第二の96ウェルＵ字形下部ポリプロピレンプレート中で、50μlの前結合されたK71又はK72抗体-プロテインＡセファロースを夫々のウェルに付着する。結合反応が完結した後、全結合反応液を抗体-プロテインＡセファロースビーズを含むプレートに移す。次いでプレートをシールし、37℃でインキュベートし、１時間撹拌する。
本発明の目的に使用した抗E1ポリクローナル抗体を本明細書中K71及びK72と称する。これらはHPV11 E1の最後（Ｃ末端）の14a.a.に相当するペプチドに対しウサギ中で産生された抗血清である。
3. 濾過による複合体の単離
最初に、ミリポアMHVB N45 96ウェル濾過プレートを100μlの1x結合緩衝液の濾過により平衡にする。次いで複合体を移し、濾過し、200μlの1x結合緩衝液で３回洗浄する。プレートを紙タオルでふくことにより、残留液を除去する。最後に、150μlのマイクロシント20を夫々のウェルに添加し、33Pプロトコルを使用してカウントをトップカウントにより検出する。
【００６４】
結果
酵母中の E1-E1 相互作用（図１）
２ハイブリッド系（Fields及びSong, 1989, Nature, 340(6230):245-246及びDurfeeらの上記文献）を使用して、HPV11 E1が酵母中で自己会合し得るか否かを試験し、この相互作用に関係するE1のドメインをマッピングした（図１）。図1Aに見られるように、GAL4のDNA結合ドメイン(BD)に融合された全E1分子（アミノ酸1-649）からなる融合タンパク質は酵母株Y153中でUASGal誘導LacZリポーター遺伝子の転写を活性化することができる。E1のＮ末端71アミノ酸を欠いている更に短い融合タンパク質は転写を活性化せず、E1のＮ末端が転写活性化ドメインを含み得ることを示した。これらの短い融合タンパク質はGAL4活性化ドメイン(AD)に融合された全E1融合タンパク質との相互作用について試験するのに使用し得る（図1A）。全E1分子とのこれらの短い融合タンパク質の相互作用はほんの低く生じたが、バックグラウンド、β-ガラクトシダーゼのレベルより再現性良く高く（図1A及び示されていないデータ）、E1が酵母中で自己会合し得ることを示した。
【００６５】
一連の欠失を使用して相互作用ドメインをE1のＣ末端（アミノ酸353-649）にマッピングした。E1の自己会合をE1のＣ末端部分（アミノ酸330-649及び353-649）のみを含む融合タンパク質間で容易に検出することができた（図1B）。一連の欠失を使用してE1相互作用ドメインの位置の精度を高めた（図1B）。この方法で、64アミノ酸の長いE1相互作用ドメインをアミノ酸353-416の間で同定した（図1B）。この64アミノ酸ドメインを欠いたＣ末端E1フラグメント（アミノ酸435-649）はE1（330-649）と会合することができなかったが（図1B）、それはE2と相互作用する能力を保持した。小さいE1-E1相互作用ドメイン（353-416）は更に大きいE1フラグメント（330-649）と相互作用することができるだけでなく、それ自体と相互作用することができた（図1C）。この最後の結果は残基353-416がE1のホモタイプの相互作用に必要かつ十分であることを示した。E1（330-649）、又はそれ自体とのこの小さいドメインの相互作用は更に大きいE1フラグメント（353-649及び330-649）の間の相互作用よりも低いレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じた（図1C）。この結果はアミノ酸435-649の間の残基がE1との相互作用に十分ではないが、相互作用の強さに寄与し得るという概念と一致した。
【００６６】
自己会合における E1 の ATP 結合ドメインの役割（図２）
先に示した結果はE1の残基435-649（これらはE1-E1相互作用ドメインのＣ末端（353-416）に配置される）がまた酵母中でE1-E1相互作用の強さに寄与し得るという可能性を生じた。残基435-649はE1のATP結合ドメインを含むので、本発明者らはATP結合に関係する３種の高度に保存されたアミノ酸を突然変異させ、酵母中のE1の自己会合に関するこれらのアミノ酸置換の効果を試験した。これらの置換はE1のウォーカーＡモチーフ（P-ループ）の二つの残基を置換した。プロリン479をセリンにより交換し、リシン484をグルタミン酸及びグルタミンにより置換した。図２に見られるように、全ての３種の置換が酵母中のE1-E1相互作用を減少した。これらの結果はATP結合ドメインの保全性がE1タンパク質の自己会合に重要であることを示す。
【００６７】
in vitro のウイルス起点への結合に必要とされる E1 のドメイン（図３及び４）
酵母における先の研究はE1の少なくとも二つの領域が自己会合に関与することを示唆した：自己会合ドメイン（アミノ酸435-416）及びATP結合ドメイン。in vitroのE1オリゴマー化におけるこれらの二つの領域の役割を調べるために、本発明者らはHPV起点へのE1の結合を検出するアッセイを使用した。BPV E1との相似性により、本発明者らはE1のオリゴマー化が起点への結合後に起こると予想した。このアッセイでは、ウサギ網状赤血球溶解産物中の対にされた転写/翻訳により合成されるHPV11 E1タンパク質を２種の放射性DNAフラグメント（その一種がHPV11起点を含む）の混合物と共にインキュベートする。次いでこの反応で生成されるE1タンパク質-DNA複合体をE1の抗体で免疫沈殿させ、共沈したDNAをゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化する。これらの実験において、起点と複合体を形成することができる最小ドメインを特定するために、一連の切断型E1タンパク質を野生型タンパク質に加えて使用した。全てのE1タンパク質を同様のレベルで発現させた（データは示されていない）。
【００６８】
三つの観察を行なった。最初に、野生型E1を使用して、ごく少量のE1-ori複合体をアッセイの条件下で形成することができた（図3A）。これはおそらくこれらの反応液中に存在する大過剰の競合物質DNA（溶解産物をプログラムするのに使用されたプラスミドの形態）及び起点に関するE1の低い配列特異性のためである。第二に、本発明者らはＮ末端71残基を欠いている突然変異体E1タンパク質が野生型タンパク質と較べて起点に対する増大されたアフィニティー（約５倍）を有することを観察した（図3A）（本明細書中、以下E1*と称する）。Ｎ末端の欠失が起点に関するE1のアフィニティーを増大するメカニズムは依然として調べられている。起点への切断型E1分子の結合は特異性であった。何とならば、それがE1-DNA結合表面における二つの二重アミノ酸置換により影響されたからである（図3B）。これらの二つのアミノ酸置換は起点へのBPV-E1の結合を無効にするBPV-1 E1中のアミノ酸置換と同様であった（Thornerら, 1988, J. Virol. 62:2474-2482）。また、特異性が起点の三重突然変異がE1結合を減少することを示すことにより実証された（図3C）。この三重点突然変異は、DNase Iフットプリンティング分析により、起点のE1結合部位にあり、E1の結合に影響することが既に示されていた（Sunら, 1995, Virology 216:219-222）。行なった第三の観察は、起点に結合することができるE1の小さいドメインがアミノ酸191-649を含むことであった（図４）。Ｎ末端又はＣ末端におけるこのドメインの更なる欠失が起点結合を無効にした（図４）。これらの結果の最も簡単な解釈は起点へのE1の結合及びオリゴマー化がDNA結合表面（残基191と300の間に位置される）及びオリゴマー化ドメイン（アミノ酸353-649）を必要とすることである。
【００６９】
E1-E1 相互作用ドメインを含む融合タンパク質は起点への E1 の結合を抑制する（図５）
E1のアミノ酸353-431が起点におけるオリゴマー化に必要とされるE1-E1相互作用ドメインをコードする場合、このドメイン、その変異体、誘導体又はフラグメント単独が、過剰に与えられる時に、起点へのE1*（72-649）の結合をin transで抑制すると予想されるであろう。この仮定を試験するために、E1のフラグメント：353-416、353-431及び353-438をE.coli中で発現させ、チオレドキシンとの融合として可溶性形態で精製した。融合パートナーとしてのチオレドキシンの不在下で、全ての３種のE1フラグメントは不溶性であった（データは示されていない）。融合タンパク質はニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるそれらの精製を可能にするポリヒスチジン配列を含んでいた（図5A）。次いで３種の融合タンパク質を８μM（E1に対して約300倍のモル過剰）の濃度で起点へのE1*（72-649）の結合を抑制する能力について試験した。図5Bに見られるように、TRX-E1（353-431）及びTRX-E1（353-438）は起点への結合を抑制した。TRX-E1（353-416）は８μMの濃度で抑制性ではなかった。何とならば、おそらくこの融合タンパク質が重度に加水分解されるからであり、又はそれが２ハイブリッド研究により示唆されるようにE1に対する低いアフィニティーを有するからである（図2Bを参照のこと）。同じ条件下で、TRX単独は効果を有していなかった（図5B）。これらの実験において、夫々の融合タンパク質の２種の独立の製剤を同様の結果で試験した（図1A及び示されていないデータ）。TRX-E1（353-431）に関する50％抑制濃度を測定して、約３μMであった（図5C）。これらの結果は領域Ａが起点におけるE1オリゴマー化に必要とされ、かつE1（353-431）がE1-E1相互作用ドメインをコードするという概念を強化した。
【００７０】
起点結合における ATP 及び E1 ATP 結合ドメインの役割（図６及び７）
酵母中のE1の自己会合は無傷のATP結合ドメインを必要とするので（上記を参照のこと）、本発明者らはin vitroのE1-Ori複合体形成におけるATP/Mgの役割を調べた。結合反応に夫々5mM及び3mMの濃度のATP/Mgを補給することにより、これを行なった。反応を三つの異なる温度（４、23及び37℃）で行なった。図6Aに見られるように、ATP/Mgの不在下で、起点へのE1の結合が高温（37℃）で著しく減少された。高温によるこの抑制はATP/Mgの添加により軽減できた（図6A）。低温（23℃及び４℃）で、ATP/Mgは適度の効果を有しているにすぎなかった。マグネシウムと組み合わせてのヌクレオチドの異なる型を、起点へのE1の結合を刺激するそれらの能力について試験した。AMP又はアデノシンではなく、ADPがATPに置換し得る（図6B）。同様に、３種のその他のヌクレオチド（CTP、GTP、UTP）並びに全ての４種のデオキシヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、TTP）が起点への結合を刺激することができた（図6C）。２種の非加水分解性同族体、ATP-γ-S及びGTP-γ-Sがまた刺激性であり、その加水分解ではなく、基質の結合がE1が起点に結合するのに必要であることを示した（図6C）。
【００７１】
E1のATP結合ドメイン中のアミノ酸置換を、起点へのE1結合に関するそれらの効果について試験した（図７）。或る種の置換がウォーカーＡモチーフの高度に保存された残基に影響し（図7A）、これはおそらく基質ヌクレオチドのトリホスフェートテール（Gorbalenya及びKoonin, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:419-429）の結合に関係している。図7Bに見られるように、酵母中のE1自己会合を阻止したもの（P479S、K484Q及びK484E）を含む、これらの置換が起点へのE1結合を減少した。先に示された結果と一緒になって、これらの知見はATP結合がE1が起点に結合するのに必要であることを示す。
これらの実験において、本発明者らはまたモチーフＣ中の高度に保存された残基並びにE1のフェニルアラニンを交換する効果を試験した。これらの残基はスーパーファミリー３の員間で保存されるが、それらの機能は知られていない。図7Bに示されるように、アラニンによるこれらのアミノ酸の置換は起点へのE1の結合を無効にせず、それらがこのプロセス及びATP結合に必須ではないことを示した。
【００７２】
E1 の保存領域Ａは E1 が起点に結合するのに必要とされる（図８）
酵母中でマッピングされたE1-E1相互作用ドメインはアミノ酸353-416を含んでいた。E1のこの領域は種々のパピローマウイルスのE1とSV40及びポリオーマウイルスの大きいＴ抗原（Clertant及びSeif, 1984）の間の高い配列類似性の４つの領域の一つである保存領域Ａを含む。この領域がE1が起点に結合するのに必須であることを測定するために、６つの独立のアミノ酸置換をこのドメイン中で生じ（F378A、Y380A、N389A、A390G、F393A、Q399A）（図8A）、E1-Ori複合体形成に関するそれらの効果について試験した。６種の置換のうちの４種がパピローマウイルスとポリオーマウイルスの間で不変である残基に影響する（N389A、A390G、F393A、Q399A）（図8A）。その他の２種の置換（F378A及びY380A）が大きいＴ抗原中の亜鉛結合モチーフの部分を形成する疎水性残基に影響し（図8A）、これがオリゴマー化に必要とされる（Loeberら, 1991, J. Virology, 65(6):3167-3174）。この亜鉛フィンガーモチーフはパピローマウイルス中に保存されないが、F378及びY380は、大きいＴ中の類似の領域のように、αらせんに折り畳むと予想されるE1の領域にある（データは示されていない）。起点へのこれらの突然変異体E1の結合を補給ATP/Mgの不在下で23℃で、またATP/Mg（夫々、5mM及び3mM）を補給した反応液中で37℃で両方でアッセイした。条件の両方の組のもとで、結果は非常に似ていた。置換の３種、Y380A、N389A、及びF393Aが起点へのE1の結合を著しく減少した（図8B）。２種のその他の置換、A390G及びQ399Aがまた有害であり、起点へのE1の結合のわずかに適度の量をもたらした。唯一の置換、F378Aが起点へのE1結合に殆ど効果を有していなかった。これらの結果はE1の保存領域Ａの構造保全性がE1が起点に結合するのに必要とされることを示した。
【００７３】
E1 の保存領域Ａが E1-E2-Ori ３成分複合体の形成に必要とされる（図 9A ）
E1の保存領域Ａが起点へのE1のE2依存性結合に必要とされるか否かを試験するために、上記のE1起点結合アッセイと同様のアッセイを下記の変化とともに使用した。in-vitro翻訳によりつくられたE2を反応に入れ、完全長E1（1-649）を使用する。図9Aに見られるように、
置換の３種（Y380A、N389A、F393A）が複合体形成を著しく減少した。２種のその他の置換（A390G及びQ399A）はそれ程顕著ではない効果を有していた。一種の置換、F378AのみがE1-E2-Ori複合体形成に適度の効果を有していた。これらの結果は保存領域Ａの構造保全性がE1-E2-Ori３成分複合体の形成に必要であることを示す。
【００７４】
一時的 HPV DNA 複製に関する E1 の保存領域Ａ中の置換の効果（図 9B ）
保存領域Ａ中に置換を有する突然変異体E1タンパク質を、E2と一緒に、一時的にトランスフェクトされた細胞中で起点を含むプラスミドの複製を支持するそれらの能力について試験した。図9Bに見られるように、E1突然変異体の３種、F378A、A390G、及びQ399Aは、A390G及びQ399Aの場合に野生型E1と較べて低下されたレベルであるがHPV DNA複製を支持することができた。E1突然変異体の３種、Y380A、N389A、及びF393Aは複製を支持することができなかった。これらの結果はE1の保存領域Ａが一時的HPV DNA複製に必要とされることを示した。一時的HPV DNA複製を支持するE1突然変異体の能力はE2の不在下又は存在下で起点に結合するそれらの能力と良い相関関係があった（上記を参照のこと）。これらの実験における潜在的な注意は、種々のE1突然変異体タンパク質の安定性が、野生型のそれと比較して、E1の発現の低レベルのために評価し得なかったことである（データは示されていない）。それ故、幾つかの突然変異体タンパク質で観察された複製の低レベルはまたタンパク質蓄積に関する効果に関係し得ることが可能である。
【００７５】
実施例 10 ：組換え E1 タンパク質を使用する E1 オリゴマー化アッセイ
そのアッセイは実施例９に示されたものと同じであるが、バキュロウイルス感染Sf21昆虫細胞中で生成された組換え精製His標識HPV11 E1*（72-649）75ng及び競合物質としてのプラスミドDNA200ngを用いて行なった。また、CHAPSを0.15％の最終濃度まで結合混合物に添加した。
【００７６】
実施例11：組換えE1*（72-649）の精製
E1*をヒスチジン標識（６ヒスチジン）E1*（72-649）を発現する組換えバキュロウイルスによる感染によりSf21昆虫細胞中で生成した。感染細胞を感染の48時間後に遠心分離により回収し、次いで細胞ペレットの体積を測定した。細胞ペレットをドライアイスで凍結し、-80℃で貯蔵した。
精製のために、細胞ペレットを解凍し、１倍容積の（ペレットの体積に対し）低張緩衝液Ａ（20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 5mM KCl; 1mM MgCl2;鎮痛薬、ロイペプチン、１μg/mlのペプスタチン及び1mMのペファブロック）中で再度懸濁させた。氷の上で15分のインキュベーション後に、細胞懸濁液を乳棒Ｂで20ストロークのドウンスホモジナイザーにかけた。次いで核を20分間にわたって４℃で2500gで遠心分離により回収し、1.4倍容積（初期の細胞ペレット体積に対し）の緩衝液Ｂ（20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 鎮痛薬、ロイペプチン、２μg/mlのペプスタチン及び2mMのペファブロック）中で再度懸濁させた。次いで1.4倍容積の緩衝液Ｃ（20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 900mM NaCl）を添加し、懸濁液を混合し、ゆすりながら４℃で30分間インキュベートした。次いで抽出物を45分間にわたって４℃で148000gで遠心分離してデブリをペレットにした。上澄みを回収し、グリセロールを10％の最終濃度までそれに添加し、その後それをドライアイスで凍結し、クロマトグラフィーまでそれを-80℃で貯蔵した。
クロマトグラフィーのために、細胞抽出物を解凍し、ニッケルを仕込み、20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 500mM NaCl; 10％のグリセロールで平衡にした5mlのハイ-トラップカラム（ファーマシア・バイオテク）に装填した。抽出物の装填後に、カラムを7-8倍容積の150mMイミダゾールを含む平衡緩衝液で洗浄した。次いで結合されたE1*タンパク質を250mMイミダゾールを含む平衡緩衝液で溶離した。
【００７７】
実施例12：in vitroのE1のオリゴマー化
in vitroのE1オリゴマー化を検出するために、本発明者らはスルフヒドリル反応架橋剤ビスマレイミドヘキサン（BMH、ピアス）による架橋を使用した。in-vitro転写/翻訳（TNT結合型網状赤血球溶解産物系、プロメガ）によりつくられた35S標識E1*タンパク質（72-649）を１時間にわたって二つの異なる温度、23℃及び37℃で50ng/mlの一本鎖(ss)DNA（60mer、HPV-11起点のヌクレオチド7902-34に相当する）の存在下又は不在下でインキュベートした（最終結合条件：20mMトリスpH 7.6、100mM NaCl、1mM DTT、5mM ATP、3mM MgCl2を含む37.5μlの最終容積中12.5μlの翻訳E1）。結合反応液を100μMのBMHを含むリン酸塩緩衝液（0.1M pH 7.0）で13倍に希釈することにより、架橋を行なった。架橋反応を１分後に2.5mMの最終濃度までのDTTの添加により停止した。次いでE1タンパク質をHPV-11のＣ末端14アミノ酸に対し誘導されたポリクローナル抗体で免疫沈殿させ、ゲル電気泳動（３％ウェーバー-オズボーンポリアクリルアミドゲル〔Weber及びOsborn, 1969〕）及びオートラジオグラフィーにより分析した。これらの条件下で、一本鎖DNAはオリゴマーへのE1の架橋を大いに刺激した（図10）。E1のオリゴマーに相当する５種の異なるタンパク質バンドをモノマーE1の他に観察した。これらのE1オリゴマー種は、分子量標準物質と比較した場合に、２量体、３量体、４量体、５量体及び６量体について予想された位置に移動した（データは示されていない）。架橋実験を切断型E1タンパク質（以下を参照のこと）を用いて行い、それ故、網状赤血球からのタンパク質がこれらの複合体の部分であることを除外した場合に、同じことがまた真実であった。一緒になって、これらの結果はHPV-11 E1が一本鎖DNAを結合した後に６量体を形成する能力を有することを示す。最後に、本発明者らはE1のオリゴマー化がHPV起点から誘導されないss DNAオリゴヌクレオチドにより刺激されることを示し、ss DNAへのE1の結合が大いに配列非依存性であることを示した（データは示されていない）。
【００７８】
E1 のＣ末端がオリゴマー化に十分である
次いで本発明者らはin-vitro翻訳によりつくられた切断型E1タンパク質（図11）の組を使用してオリゴマー化できるE1の最小ドメインをマッピングした。E1の残基353-649がin vitroでオリゴマーを形成するのに十分であることがわかった。重要なことに、E1（330-649）及びE1（353-649）のオリゴマー化のレベルは一本鎖DNAの不在下でさえもかなりであり、ss DNAの添加により増大されなかった。E1のＣ末端が“構成的に”オリゴマー化するという事実は、このドメインが、完全タンパク質とは対照的に、酵母２ハイブリッド系中で容易に自己会合し得る理由についての一見信頼できそうな説明を与える。オリゴマー化がss DNAに依存性である最小E1タンパク質はアミノ酸191-649を含んでいた。それ故、残基191-330の間の領域がＣ末端ドメイン（330-649）のオリゴマー化を抑制し、ss DNA応答性を与えるのに重要な役割を果たすことが明らかである。
【００７９】
オリゴマー化に関する E1 の ATP 結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果
オリゴマー化に十分であるE1の領域（残基353-649）はATP結合ドメインを含む。本発明者らはATP結合に関係する高度に保存された残基を変化する突然変異の効果を試験することによりE1のオリゴマー化に関するATP結合ドメインの役割を調べた。in vitro翻訳により合成された、これらの突然変異体E1*タンパク質（72-649）は、E1及びNTP結合タンパク質のスーパーファミリー３のその他の員のATP結合ドメインを特性決定する三つのモチーフ（Ａ、Ｂ及びＣと称される）の一つ中にアミノ酸置換を有する（図12A）。モチーフＡ及びＢは古典的ウォーカーＡモチーフ及びＢモチーフに相当し、これらは一緒にATPをマグネシウムキレートとして結合する。ホスフェート結合ループ（P-ループ）としても知られている、モチーフＡ中の残基はATPのトリホスフェートテールと相互作用する。モチーフＢは基質ヌクレオチドと会合したマグネシウムイオンに配位するのに関係する。保存モチーフＣの正確な機能は知られていないが、それはまたATPを結合するのに関与し得ることが示唆された。高度に保存された残基、F509（これはモチーフＢとＣの間にあり、その機能が知られていない）が突然変異された別の突然変異体E1*タンパク質をまた試験した。F509A置換を除いて、全てのその他の置換がE1オリゴマー化を種々の程度に減少した（図12B）。
【００８０】
モチーフＡ中の置換は更に大きい効果を有し、P-ループの構造保全性がオリゴマー化に必須であることを示した。モチーフＢ又はＣ中の置換はオリゴマー形成を減少したが、それを完全には無効にしなかった。一緒になって、これらの結果はE1のATP結合ドメインの構造保全性がオリゴマー化に必須であることを示す。ATP結合ドメインはATPを結合するのに必要とされ、これがオリゴマー化をアロステリック調節することができた。また、又は加えて、ATP結合ドメインの保全性は完全Ｃ末端ドメインの適当な折り畳み／安定性に必要とされた。しかしながら、K484E及びK484Qを除いて、オリゴマー化に影響する置換の全てがE2への結合に影響しないという事実（Titoloら, 1999）は、これらの置換がＣ末端ドメインの全構造を著しく変化させないことを示唆する。
【００８１】
E1 オリゴマー化の保存領域Ａ中のアミノ酸置換の効果
次に本発明者らは架橋アッセイを使用してタンパク質のオリゴマー化に関するそれらの効果についてE1の保存領域Ａ中のアミノ酸の効果を試験した。６種の突然変異体E1*タンパク質をin vitro翻訳により合成し、上記のようにss DNAの存在下でオリゴマー化について試験した。試験した６種の突然変異体のうちの３種、Y380A、N389A及びF393Aがこのアッセイで重度に欠陥であった（図13）。予想されたように、これらはまたHPV起点における結合／オリゴマー化に重度に欠陥である同じ３種の突然変異体タンパク質である（図９）。これらの結果はE1の保存領域Ａがオリゴマー化に必要とされるという概念を強化する。
結論
理論により束縛されたくないが、本件出願人は本明細書に示された結果は配列番号２、配列番号３、又は配列番号４により特定された領域がE1オリゴマー化に必要である領域であることを示すものと考える。それ故、この領域はPV感染症の治療のためにPV DNA複製を抑制するための標的として利用し得る。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 タンパク質間相互作用に必要なE1タンパク質領域をマッピングするのに使用した酵母２ハイブリッド系中のE1-E1相互作用の結果を示す。この系では、GAL4活性化ドメイン（AD）と完全長E1タンパク質（アミノ酸1-649；配列番号１）の融合生成物がHPV11 E1タンパク質のＮ末端にある一連の欠失及びGAL4のDNA結合ドメイン（BD）を含む融合タンパク質と同時トランスフェクトされる。高転写活性はGAL4転写活性を可能にするようにハイブリッド分子中の２種のタンパク質の相互作用がGAL4 AD及びBDを接近させるのに十分に相互作用する場合にのみ存在する。E1タンパク質のダイヤグラムが図の上部に示される。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと標識された灰色ボックスはSV40及びポリオーマウイルスからの大きいＴ抗原との高い配列類似性を有するE1の領域を示す。黒色ボックスはE1のDNA結合ドメイン及びATP結合ドメインの位置を示す。これらの融合タンパク質中に含まれるE1の部分が示される。β-ガラクトシダーゼ活性のレベルが２種のプラスミド、GAL4 BD融合タンパク質及びGAL4 AD融合タンパク質で同時トランスフェクトされた酵母細胞中で測定される。注目されるように、BDハイブリッド分子中のE1Ｎ末端の最初の71アミノ酸が除去されてこのE1アミノ酸領域内の活性化ドメインの存在によるLacZリポーター遺伝子の転写を回避した。
【図１Ｂ】 保存領域Ａ〜Ｄの位置を示すＣ末端E1タンパク質のダイヤグラムを示す。一連のＣ末端欠失を有するＮ末端切断型E1分子がGAL4 ADに
融合され、GAL4 BDに融合されたＮ末端切断型E1（配列番号１の330-649）と同時トランスフェクトされる。これらの融合タンパク質中に含まれるE1の部分、並びにβ-ガラクトシダーゼ活性のレベルが示される。この実験では、タンパク質フラグメント（353-416；配列番号４）を含む融合生成物が測定できるβ-ガラクトシダーゼ活性をもたらすことが示される。
【図１Ｃ】 酵母中のE1フラグメントの自己会合を示す。Ｎ末端切断及びＣ末端切断を有する３種の異なるE1フラグメントが酵母２ハイブリッド系中で試験される。比較のために、夫々のE1-AD融合がまたGAL4-BDに融合されたE1（配列番号１の330-649）又はGAL4-BD単独との相互作用について試験された。得られたβ-ガラクトシダーゼ活性のレベルはE1領域（アミノ酸353-416；配列番号４）が自己会合並びに更に大きいE1タンパク質領域（配列番号１の330-649）との相互作用に十分であることを示す。
【図２】 E1-E1相互作用に関する保存ATP結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果を示す。酵母２ハイブリッド系を使用して、β-ガラクトシダーゼ活性がGAL4-ADに融合された野生型E1（330-649）及び野生型E1（353-649；配列番号５）又はGAL4-BDに融合された突然変異体誘導体〔P479S（配列番号６）、K484E（配列番号７）及びK484Q（配列番号８）〕で同時トランスフェクトされた酵母中で測定された。GAL4-AD及びGAL4-BD単独を含むプラスミドが対照のために使用された。E1のウォーカーＡモチーフ（P-ループ）中の置換がβ-ガラクトシダーゼ活性の量を減少することが示され、これらの置換はE1が自己会合する能力を悪化することを実証する。
【図３Ａ】 HPVのDNA複製起点へのE1の結合を監視するアッセイの結果を示す。タンパク質-DNA複合体が野生型E1（アミノ酸1-649；配列番号１）、もしくはＮ末端切断型E1（E1*＝アミノ酸72-649、配列番号78）で形成され、又はE1の不在下（-E1）で形成された。E1-DNA複合体がE1に対し誘導された抗体で免疫沈殿され、結合反応に使用されたプローブの量の0.5％と一緒に、共沈したDNAが電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化された。オートラジオグラフィーはＮ末端切断型E1（配列番号78）タンパク質が完全長E1タンパク質よりも起点に対する高いアフィニティーを有することを示す。矢印は起点を含むプローブのフラグメントを示す。
【図３Ｂ】 DNA同時免疫沈殿アッセイを使用して起点へのE1の結合に関するE1のDNA結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果を示す。E1中の二つの異なる二重アミノ酸置換の位置がアミノ酸280と300の間のE1の一次配列と一緒に示される。結合反応が図3Aについて記載されたようにして行われた。オートラジオグラフの結果はこれらの置換が起点へのE1の結合を無効にしたことを示す。
【図３Ｃ】 起点へのE1の結合に関するHPV-11中の三重ヌクレオチド突然変異の効果を示す。HPV-11起点が三つのE2結合部位（“E2”と標識された黒色ボックス）、E1結合部位（灰色ボックス）及びATに富む領域（開いたボックス）とともに図示される。E1結合部位の一部の配列が突然変異体起点中の三つのヌクレオチド変化の位置とともに示される。結合反応が図3Aについて記載されたようにして行われた。オートラジオグラフはHPV複製起点中の三重突然変異の存在が起点へのE1タンパク質の結合を抑制したことを示す。
【図４Ａ】 in vitroのウイルスDNA複製起点への結合に必要とされるE1のドメインをマッピングするために生じた一連の欠失の略図を示す。切断型E1タンパク質がin vitroで生成され、図3Aに記載されたようにしてウイルス起点への結合についてアッセイされた。E1のＣ末端に対し誘導されたポリクローナル抗体を使用して、Ｎ末端切断型タンパク質が免疫沈殿された。Ｃ末端切断型タンパク質がそれらのＮ末端でFLAGエピトープで標識され、抗FLAGモノクローナル抗体を使用して免疫沈殿された。
【図４Ｂ】 4Aに示された欠失の結果を示す。オートラジオグラフは起点への結合に必要なE1の領域がE1-E1オリゴマー化に必要な本発明のアミノ酸を含むアミノ酸191-649を含むことを示す。Ｃ末端における欠失が起点結合を無効にする。
【図５Ａ】 E.coli中で発現され、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたE1の示された部分を含むチオレドキシン（TRX）融合タンパク質のクーマシーブルーで染色されたSDS-PAGEを示す。夫々のフラグメントのアミノ酸領域がレーンの上部に示される。夫々の融合タンパク質について、２種の独立の製剤が分析された。
【図５Ｂ】 ウイルス起点へのE1（配列番号１の72-649）の結合に関する過剰のTRX-E1融合生成物の効果を示す。結合反応が図4Aに記載されたようにして行われた。TRX融合タンパク質、又はTRX単独が約８μMの濃度（これはE1（72-649）に対し300倍のモル過剰に相当する）で結合反応液に添加された。融合分子TRX-E1（353-431；配列番号３）は最高の抑制効果を示し、フラグメントTRX-E1（353-416；配列番号４）は明らかな抑制を示さなかった。TRX単独は起点への測定できる結合を示さなかった。
【図５Ｃ】 起点へのE1の結合に関するTRX-E1（353-431；配列番号３）融合分子の異なる濃度の効果を示す。次第に減少する濃度のTRX-E1（353-649；配列番号５）が使用されて、この融合タンパク質がウイルス起点へのE1の結合を抑制するIC50を推定した。このデータから、IC50が約３μMと推定された。
【図６Ａ】 ウイルス起点へのE1*の結合に関する温度及びヌクレオチドの効果を示す。ウイルス起点へのE1*（配列番号78）の結合が３種の異なる温度（４℃、23℃及び37℃）で、また夫々5mM及び3mMの濃度のATP/Mgの存在下（+ATP/Mg）又は不在下（-ATP/Mg）で行われた。ATP/Mgの不在下で、起点へのE1の結合は４℃で部分的に抑制され、23℃で変化されず、また37℃で著しく減少された。37℃におけるATP/Mgの添加がこの温度関連効果を反転する。
【図６Ｂ】 マグネシウムと組み合わせてのADP及びATPのみが起点へのE1の結合を刺激することができることを示す。起点へのE1の結合がヌクレオチドの不在下（-nuc）又は5mMの濃度の示されたヌクレオシドトリホスフェートの存在下で行なわれた。“Adeno”はアデノシンを示し、また“cAMP”は環状AMPを示す。
【図６Ｃ】 ヌクレオチドの不在下（-nuc）及びヌクレオチド（CTP、GTP及びUTP）及びデオキシヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP及びdTTP）の存在下における起点へのE1の結合の効果を示す。オートラジオグラフの結果はヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドが起点へのE1の結合を刺激することができることを示す。非加水分解性類似体（ATP-γ-S及びGTP-γ-S）がまた刺激性であり、その加水分解ではなく基質の結合が起点へのE1結合に必要であることを示す。
【図７Ａ】 E1タンパク質の略図を示す。灰色ボックスはSV40及びポリオーマウイルスからの大きいＴ抗原との高い配列類似性を有する領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ、並びにDNA結合ドメインの位置を示す。NTP結合タンパク質のスーパーファミリー３の員中に存在する保存モチーフＡ及びＣの位置がSV40Ｔ抗原、BPV-1及びHPV-11並びにHPV-6bからのこれらのモチーフの配列とともに示される。夫々のモチーフのコンセンサスアミノ酸配列が示される。突然変異された残基が矢印により示される。
【図７Ｂ】 図4Aに記載されたようにしてウイルス起点への結合について試験された、E1*（配列番号78）、又は示された突然変異体誘導体の結果を示す。結果はＡモチーフ中の保存残基中の置換が起点に結合するE1の能力を低下したことを示し、E1へのATP結合が起点へのE1結合に重要であることを示す。モチーフＣ中の置換は起点へのE1の結合に影響しないことが明らかであった。
【図８Ａ】 ウイルス起点へのE1の結合に関するE1の保存領域Ａ中の置換の効果を示す。灰色ボックスはポリオーマウイルスからの大きいＴ抗原との高い配列類似性を有する領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ、並びにDNA結合ドメインの位置を示すE1タンパク質の略図。SV40Ｔ抗原、BPV-1及びHPV-11からの保存領域Ａの配列が示される。この領域の高度に保存された残基が灰色でボックスにされる。突然変異された残基がまた示される。
【図８Ｂ】 起点へのE1の結合に関する、領域Ａ中の６種の独立の置換の効果を示す。E1*（配列番号78）、又は示された突然変異体誘導体が図4Aに実質的に記載されたようにしてウイルス起点への結合について試験された。結合反応が23℃で補給ATP/Mgの不在下で、又は37℃で夫々5mM及び3mMの濃度のATP/Mgで補給された反応液中で行なわれた。試験した全ての６種の置換が結合を減少し、保存領域ＡがE1が起点に結合するのに重要であることを示す。
【図９Ａ】 in vitroのE1-E2-Ori複合体の形成、及び細胞中の一時的HPV DNA複製に関するE1の保存領域Ａ中の置換の効果を示す。in vitroのE1-E2-Ori複合体の形成に関する効果。DNA-タンパク質複合体がE1なしに（-E1）、又は野生型E1（1-649；配列番号１）もしくは保存領域Ａ中に置換を有する示された突然変異体E1とともに構築された。複合体がE1に対し誘導された抗体で免疫沈殿され、結合DNAが電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化された。置換のうちの３種、Y389A（配列番号９）、F393A（配列番号10）及びN389A（配列番号11）が複合体形成のかなりの減少を示す。２種の置換A390G（配列番号12）及びQ399A（配列番号13）がそれ程顕著ではない効果を示し、また置換F378A（配列番号14）が適度の効果を示すことが明らかである。これらの結果はこの保存Ａ領域がE1-E2-ori複合体の形成に役割を果たすことを示す。
【図９Ｂ】 一時的HPV複製に関する６種の置換の効果を示す。複製された起点を含むプラスミド（ori）、又は内部対照プラスミド（E1発現プラスミド、E1）の量が定量PCR分析により検出された。PCR増幅がE1を発現するプラスミド（-E2）でトランスフェクトされた細胞、又はE2及びE1（野生型もしくは示された突然変異体E1タンパク質）を発現するプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞から単離されたゲノムDNAについて行なわれた。全ての細胞がまた起点を含むプラスミドpN9でトランスフェクトされた。PCR産物が電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化された。置換F378A（配列番号14）、A390G（配列番号12）及びQ399A（配列番号13）を含む突然変異体E1タンパク質が複製の低下されたレベルを示し、３種のその他の突然変異体が証明できる複製活性を示さなかった。これらの結果は領域Ａが一時的HPV DNA複製に重要であることを示す。
【図１０】 E1*の単量体(1)、２量体(2)、３量体(3)、４量体(4)、５量体(5)及び６量体(6)にサイズが相当するオリゴマーの形成を示す放射能標識E1*の架橋。一本鎖DNAが反応に添加される場合（＋）、E1*オリゴマーの形成が刺激される。オリゴマーは架橋剤BMHの存在下（＋）でのみ検出される。
【図１１】 切断型放射能標識E1タンパク質の架橋。このアッセイに使用した種々の切断型タンパク質がパネルＡに図示される。架橋実験の結果がパネルＢに示される。架橋がss DNAの存在下（＋）又は不在下（−）で実施例12に記載されたようにして行なわれた。
【図１２】 オリゴマー化に関するE1*のATP結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果。E1*ATP結合ドメイン中でつくられた種々のアミノ酸置換の位置がパネルＡに要約される。ss DNAの存在下のこれらの突然変異体E1*タンパク質（72-649）の架橋から得られた結果がパネルＢに示される。
【図１３】 オリゴマー化に関するE1*の保存領域Ａ中のアミノ酸置換の効果。夫々が保存領域Ａ中に単一アミノ酸置換を有する、６種の異なるE1*タンパク質（ゲルの夫々のレーンの上に示される）が実施例12に記載されたようにしてss DNAの存在下でオリゴマー化するそれらの能力について架橋により試験された。
【配列表】
（技術分野）
本発明はE1タンパク質のホモ重合に必要な、パピローマウイルスE1タンパク質に含まれるアミノ酸配列に関する。このオリゴマー化は、ウイルスDNA複製の開始における必須の工程である。更に、本発明はこのタンパク質間相互作用に干渉することができる薬剤を選択することができるスクリーニング方法及びスクリーニング系を開示する。更に、本発明は動物のPV感染症の治療及び防除に使用するためのこのタンパク質間相互作用をモジュレートすることができる薬剤の選択のための系に関する。
【０００２】
（背景技術）
パピローマウイルス(PV)は上皮の異常増殖性病変を誘発する非外膜DNAウイルスである。パピローマウイルスはその性質上広範囲に広まっており、高等脊椎動物に認められていた。ウイルスは、中でも、ヒト、ウシ、ウサギ、ウマ、及びイヌから特性決定された。最初のパピローマウイルスがワタオウサギパピローマウイルス(CRPV)として1933年に記載された。それ以来、ワタオウサギだけでなくウシのパピローマウイルス型１(BPV-1)がパピローマウイルスに関する研究のための実験プロトタイプとして利用することができた。殆どの動物パピローマウイルスが純粋に上皮の増殖性病変と関連しており、動物の殆どの病変が皮膚である。ヒトには、同定された75以上の型のパピローマウイルス(HPV)があり、それらが感染の部位：皮膚上皮及び粘膜上皮（口及び生殖の粘膜）によりカタログに入れられていた。皮膚関連疾患として、扁平いぼ、足底いぼ等が挙げられる。粘膜関連疾患として、喉頭パピローマ及び子宮頸癌を含む肛門性器の疾患が挙げられる(Fields, 1996, Virology,第３編 Lippincott-Raven Pub.,フィラデルフィア, N.Y.)。
【０００３】
肛門性器の疾患に示された25以上のHPV型があり、これらが“低リスク”型及び“高リスク”型に分類される。低リスク型はHPV型６、型11及び型13を含み、殆ど良性の病変、例えば、尖圭コンジローム（性器いぼ）及び低グレードの扁平上皮内病変(SIL)を誘発する。米国では、性器いぼを有する約５百万の人がおり、その内の90％がHPV-6及びHPV-11に起因している。また、SILの約90％が低リスク型６及び11により引き起こされる。SILのその他の10％が高リスクHPVにより引き起こされる。
高リスク型は高グレードのSIL及び子宮頸癌と関連しており、殆ど頻繁にHPV型16、18、31、33、35、45、52、及び58を含む。低グレードSILから高グレードSILへの進行は低リスクHPV型を含む病変と較べて高リスクHPV-16及び18を含む病変について極めて頻繁である。加えて、四つのHPV型（型16、18、31及び45）のみが子宮頸癌中に頻繁に検出される。頸部の侵食癌の約500,000の新しい症例が１年間に世界中で診断される(Fields, 1996,上記文献)。
【０００４】
性器いぼの治療として、物理的除去、例えば、低温療法、CO2レーザー、電気手術、又は外科切除が挙げられる。細胞毒性薬、例えば、トリクロロ酢酸(TCA)、ポドフィリン又はポドフィロックスがまた使用し得る。免疫調節剤、例えば、インターフェロン又はイミキモドがまた利用可能である。これらの治療は全てのウイルス粒子を排除するのに完全には有効ではなく、高コストがかかり、又はそれに関連する不快な副作用がある。実際に、HPV感染症について現在有効な抗ウイルス治療がない。全ての現在の療法では、再発いぼが普通である(Beutner＆Ferenczy, 1997, Amer. J. Med., 102(5A), 28-37)。
【０００５】
HPV感染症を治療する現在の方法の無効がこのような感染症を防除又は排除する新しい手段を同定する必要を証明した。近年、努力が抗ウイルス化合物、特にウイルス複製に干渉することができる化合物を見出すことについて向けられていた(Hughes及びRomanos, 1993, Nucleic Acids Res. 21:5817-5823; Clarkら, Antiviral Res., 1998, 37(2):97-106; Hajdukら, 1997, J. Med. Chem., 49(20):3144-3150及びCowsertら, 1993, Antimicrob. Agents. Chemother., 37(2):171-177)。その目的のために、それ故、HPV感染により引き起こされる疾患を含み、そしておそらく排除する潜在的化学療法的標的を同定するためにHPVの遺伝子学を研究することが重要になってきた。
PVの生活環はケラチノサイト分化に密接に結びつけられる。感染は基底上皮中の組織破壊の部位で生じるものと考えられる。正常な細胞と違って、細胞は垂直分化を受けるにつれて細胞分裂が続く。感染された細胞が進行性分化を受けるにつれて、細胞組織が維持され、これがウイルス遺伝子発現を増大させ、最終的に末端分化ケラチノサイト中のその後の遺伝子発現及びビリオン集合並びにウイルス粒子の放出を伴う(Fields,上記文献)。
【０００６】
パピローマウイルスの夫々に関するコーディングストランドは早期ORF又は後期ORFとして分類された約10の指定された翻訳読み取り枠（ORF）を含む。E1〜E8遺伝子はウイルス複製サイクルで早期に発現される。二つの後期遺伝子（L1及びL2）は夫々主要キャプシドタンパク質及び非主要キャプシドタンパク質をコードする。E1遺伝子産物及びE2遺伝子産物はウイルスDNA複製に機能し、一方、E5、E6及びE7は宿主細胞増殖をモジュレートする。L1及びL2はビリオン構造に関係する。E3、E4及びE8遺伝子産物の機能は現在では確かではない。
HPVの研究はタンパク質E1及びE2がin vitroウイルスDNA複製に必要とされる唯一のウイルスタンパク質であることを示した(Kuoら, 1994, J. Biol. Chem. 30: 24058-24065)。この要件はウシパピローマウイルス型１(BPV-1)の要件と同様である。実際に、ウイルスの種及び型にかかわらずE1及びE2タンパク質と全てのパピローマウイルス(PV)のori-配列の間には高度の類似性がある(Kuoら, 1994,上記文献)。重要なことに、E1はPV中に最も高度に保存されたタンパク質であり、その酵素活性は全てのPV型について同様であると推定される(Jenkins, 1996, J. Gen. Virol., 77:1805-1809)。それ故、異なるPVからの全てのE1遺伝子産物は同様の構造及び機能を有することが予想される。加えて、PV E1タンパク質はシミアンウイルス40及びポリオーマウイルスラージＴタンパク質に対し配列類似性及び構造類似性を示す（Clertant及びSeif, 1984, Nature 311:276-279及びMansleyら, 1997, J. Virology 71:7600-7608）。
【０００７】
E2タンパク質はE1タンパク質に結合する転写アクチベーターであり、これらの２種のタンパク質及びori配列が３成分複合体を形成する(Mohrら, 1990, Science 250:1694-1699)。E2はBPV複製起点へのE1の結合を促進するものと考えられている(Seoら, 1993b, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2865-2869)。HPVでは、LuiらはE2がoriへのE1結合を安定化することを示唆した(1995, J. Biol. Chem., 270(45):27283-27291及びMcBrideら, 1991, J. Biol. Chem 266:18411-18414)。
BPV-1の研究から生じる証拠はE1がウイルスDNA複製の開始に必要とされるATPase活性及びヘリカーゼ活性を有することを示した（Seoら, 1993a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:702-706; Yangら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5086-5090;及びMacPhersonら, 1994, Virology 204:403-408）。
【０００８】
BPVからのE1タンパク質は複製関連機能を有するリン酸化核タンパク質である。これらとして、DNA及びATP結合、並びに、ATPase活性及びヘリカーゼ活性が挙げられる。欠失マッピング研究がDNA結合に必要とされる領域としてアミノ酸121-311を同定した。この領域内の突然変異が完全長E1タンパク質によるDNA結合を排除する（Lengら, 1997, J. Virol. 71:848-852及びThornerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:898-902）。第二の機能、ATP結合及びATPase活性がウイルスDNA複製に必須である。ATP結合ドメイン中の保存領域内の点突然変異が、ATPを結合し、又は加水分解するE1の能力を不活性化すると同時にDNA複製の損失をもたらす（MacPhersonら, 1994, Virology 204:403-408; Raj及びStanley, 1995, J. Gen. Virol. 76:2949-2956及びSunら, 1990, J. Virol 64:5093-5105）。E1タンパク質により有される第三の活性は、ヘリカーゼ活性又は複製フォークに先立つDNAの巻き戻しである。研究はヘリカーゼ活性がDNA結合ドメイン、ATPase／ヌクレオチド結合領域中のアミノ酸121、およそのアミノ酸530にあることを予測した（Sverdrup及びMeyers, Human Papillomaviruses, 1997, Theoretical Biology and Biophysicsにより発行）。
【０００９】
ウイルスDNA複製がin vitroで進行する時、E1タンパク質が過剰に存在する場合には、複製がE2の不在下で進行する。in vivoでは、多量の細胞DNAの存在下で、複製がE1及びE2の両方の存在を必要とする。E2はE1を複製起点に誘導する際に特異性因子として作用する（Sedman及びStenlund, 1995, Embo. J. 14:6218-6228）。in vivoの複製を開始するメカニズムは、起点へのE1及びE2の協力的結合を伴うと考えられ、それによりE1及びE2が複合体を形成する。DNA-タンパク質及びタンパク質間のこれらの相互作用はDNA複製起点で生じる（Sverdrup及びMyersの上記文献）。
おそらく起点で、複製フォークに先立ってDNAを巻き戻すことができる、ヘリカーゼとしてのE1タンパク質のメカニズムの理解は、本発明の利点の一つである。PV研究及びSV40 DNA複製に基づいて、PVに関する複製開始の２相モデルが提案されていた（Sverdrup及びMeyersの上記文献）。第一工程において、E1及びE2が複製起点に協力的に結合し、こうして複製起点に対する結合特異性を確実にする。第二工程において、付加的なE1モノマーがE2の同時の損失を伴って起点に動員される。起点におけるE1ホモ-オリゴマー複合体の形成がDNA複製活性及びDNA合成を開始する際の細胞複製組織の動員に必要とされると考えられる（Sverdrup及びMeyersの上記文献）。
【００１０】
PV感染症を予防し、防除し、減少し、又は排除するのに有効な治療薬が未だないので、PVの生活環を大いに詳しく研究し、ウイルスDNA複製の更に良い理解を特別に生じることが重要になりつつある。in-vivo又はin-vitroのE1オリゴマー化のメカニズムについての知識が驚く程少ない。従来技術はE1オリゴマー複合体の形成における、このタンパク質間相互作用に必要であるE1タンパク質に沿ってのその領域の配置について言及していない。
こうして、このオリゴマー化に関係するメカニズム及び要素の理解を与えることについての要望が存する。このプロセスの知識がPVに対する潜在的に新しい治療標的を与える。
それ故、本発明の利点の一つはこの明らかな自己会合に必要なE1タンパク質中のアミノ酸領域を同定することである。
更に、本件出願人によるこの領域の局在化がPV感染症の治療において潜在的に新しい治療標的を与える。それ故、本発明の更なる利点はこの新しい標的をモジュレートすることができる薬剤を同定するためのスクリーニング方法及びPV DNA複製に干渉することができる少なくとも一種のこのような薬剤を選択するための系を提供することである。
本発明は幾つかの文献に言及しており、これらの内容が参考として本明細書に含まれる。
【００１１】
（発明の開示）
本発明はパピローマウイルスDNA複製を開始するのに必要な工程の幾つかの解明に関する。更に特別には、本発明はウイルスDNA複製におけるE1タンパク質(a.a. 1-649)（配列番号１）の役割の解明に関する。最も特別には、本発明はウイルスDNA巻き戻し及びDNA複製に先行する工程としての、PV E1タンパク質オリゴマー化の要件の解明に関する。
【００１２】
それ故、本発明の第一の実施態様によれば、E1タンパク質のオリゴマー化に必要な、アミノ酸352-439により表されるPV E1タンパク質領域Ａ内に含まれるアミノ酸配列、及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントが提供される。このアミノ酸配列は自己会合することができ、また本発明の配列を含む完全長E1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントと会合することができる。
この第一の実施態様によれば、PV E1タンパク質のオリゴマー化に必要なアミノ酸配列が提供される。このアミノ酸領域又はドメインは、ヒトパピローマウイルスウイルス(HPV)型11のアミノ酸配列からナンバリングして、アミノ酸352-439により表される。同じ構造活性及び機能活性を示すことができるこのアミノ酸領域のあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントが本発明の範囲内にある。この第一の実施態様の特別な局面において、アミノ酸配列はアミノ酸352-432により更に表される。この第一の実施態様の更に特別な実施態様において、アミノ酸配列はアミノ酸352-417により更に表される。本件出願人はPV E1タンパク質内に含まれるこのドメインをE1タンパク質オリゴマー化（これはウイルスDNA複製の開始に必須の不可欠な工程である）に必要なアミノ酸配列として同定した最初の者であった。それ故、この第一の実施態様の特別な局面において、本発明のアミノ酸ドメインはPV E1タンパク質のアミノ酸353-438により境界を定められる。更に特別には、本発明のアミノ酸ドメインは配列番号２により特定されたとおりである。
【００１３】
また、本件出願人はこのアミノ酸配列の解明が哺乳類のPV感染症の防除、予防、排除及び治療に新しい治療標的を与えることを認めた最初の者であった。
それ故、本発明の第二の実施態様によれば、E1タンパク質と共沈されたDNAの量を検出し、かつ／又は測定することによりE1/DNA結合（それ故、E1タンパク質のオリゴマー化）を評価するためのスクリーニングアッセイが提供される。
理論により束縛されたくないが、本件出願人はE1自己オリゴマー化の測定がこのE1タンパク質と共沈されたDNAの測定により間接的に相関関係付けられると仮定した。BPV E1との相似性により、本件出願人はE1のオリゴマー化が起点への結合後に起こるであろうと予測し、その結果、E1に結合された起点の量の測定がオリゴマー化されたE1タンパク質の間接的な測定であろう。
【００１４】
今、本件出願人はこの仮定が架橋アッセイの設計及びこの架橋アッセイと本発明の先の実施態様によるオリゴマー化アッセイとの相関関係を示すことにより正しいことを判明した。
それ故、本発明の第三の実施態様によれば、E1タンパク質のオリゴマー化（又はその抑制）のレベルを直接測定する架橋アッセイが提供される。
本発明の第四の実施態様によれば、Ｎ末端切断型E1タンパク質が提供される。更に特別には、この第四の実施態様の一つの局面はアミノ酸72-649（配列番号78）により境界を定められたE1タンパク質を含む。
本発明のその他の目的、利点及び特徴は添付図面を参照する好ましい実施態様の下記の非限定の記載（これは例示であり、本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない）を読んだ後に更に明らかになるであろう。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
定義
特に特定しない限り、本明細書に使用される科学用語及び技術用語並びに命名法は本発明が関係する当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学的方法等に関する操作は当業界で使用される普通の方法である。このような標準の技術が参考マニュアル、例えば、Sambrookら(1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories)及びAusubelら(1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York)に見られる。
ヌクレオチド配列は当業界で普通に使用される１文字ヌクレオチド記号を使用して、かつIUPAC-IUB生化学命名委員会の推奨(Biochemistry, 1972, 11:1726-1732)に従って、左から右に、5'から3'方向に、単一ストランドにより本明細書中に示される。
【００１６】
本記載は幾つかのルーチンで使用される組換えDNA (rDNA)技術用語について言及している。それにもかかわらず、このようなrDNA用語の選ばれた例の定義が明瞭化及び一貫性のために示される。
当業界で知られている“組換えDNA”又は“組換えプラスミド”という用語はDNAセグメントの結合から得られるDNA分子を表す。これはしばしば遺伝子操作と称される。
“DNAセグメントもしくは分子又は配列”という用語はデオキシリボヌクレオチドアデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)及び／又はシトシン(C)を含む分子を表すのに本明細書に使用される。これらのセグメント、分子又は配列は自然に見られ、又は合成により誘導し得る。遺伝子コードに従って解読される時に、これらの配列はポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント等と称されるアミノ酸の線状ストレッチ又は配列をコードし得る。
本明細書に使用される“遺伝子”という用語は当業界で公知であり、単一タンパク質又はポリペプチドを特定する核酸配列に関する。ポリペプチドは、そのタンパク質の機能活性が保持される限り、完全長配列又はコーディング配列の部分によりコードされる。
【００１７】
“構造遺伝子”はRNAに転写され、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳され、それにより特定のポリペプチド又はタンパク質を生じるDNA配列を特定する。
“制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素”はDNA分子中の特定の塩基配列（通常、長さ４、５又は６塩基対）を認識する能力、及びこの配列が現れるあらゆる場所でDNA分子を開裂する能力を有する酵素である。このような酵素の例はEcoRIであり、これは塩基配列GAATTC/CTTAAGを認識し、この認識部位でDNA分子を開裂する。
【００１８】
“制限フラグメント”は制限エンドヌクレアーゼによるDNAの消化により生成されたDNA分子である。あらゆる所定のゲノム又はDNAセグメントが特別な制限エンドヌクレアーゼにより少なくとも二つの別個の分子又は制限フラグメントに消化し得る。
“アガロースゲル電気泳動”はサイズに基づいて二本鎖DNA分子を分別するための分析方法である。その方法はDNA分子が篩中のようなゲル中を移動し、それにより最小のDNA分子が最大の移動度を有し、ゲル中を最も遠くに移動することに基づいている。ゲルの篩特性が最大のDNA分子を遅延し、その結果、これらが最小の移動度を有する。分別されたDNAは当業界で公知の方法を使用してゲルを染色すること、核酸ハイブリダイゼーション又は分別されたDNA分子を検出可能な標識で標識することにより視覚化し得る。全てのこれらの方法が当業界で公知であり、特別な方法がAusubelらの上記文献に見られる。
【００１９】
“オリゴヌクレオチド”は２種以上、好ましくは３種より多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子である。その分子の正確なサイズは多くの因子に依存し、これらが順にオリゴヌクレオチドの最終の機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは合成、クローニング又は増幅により誘導し得る。
“配列増幅”は多量の標的配列を生成する方法である。一般に、一種以上のプライマーが核酸配列にアニールされる。適当な酵素を使用して、プライマーに隣接し、又はプライマー間にある配列が増幅される。本明細書に使用される増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。
“増幅プライマー”は標的配列に隣接するDNA領域にアニールし、当業界で公知の好適な条件下でDNA合成の開始プライマーとして利用することができるオリゴヌクレオチドを表す。合成されたプライマー延長生成物は標的配列に相補性である。
【００２０】
“ドメイン”又は“領域”という用語はタンパク質内の特定の機能又は構造を特定する特定のアミノ酸配列を表す。本明細書の例として、パピローマウイルスE1タンパク質内に含まれる本発明のオリゴマー化ドメインがある。
本明細書に使用される“表される”という用語は表しているアミノ酸を除くと称されるアミノ酸の間に含まれるタンパク質又はペプチドセグメントを意味する。例えば、アミノ酸30-100により表されるタンパク質はアミノ酸30（除かれる）とアミノ酸100（除かれる）の間に位置されるあらゆる長さのあらゆるタンパク質もしくはペプチドセグメント又はそのあらゆる変異体、誘導体もしくはフラグメントを表す。
本明細書に使用される“境界を定められた”という用語は境界を定めるアミノ酸を入れると称されるアミノ酸からなるタンパク質又はペプチドセグメントを意味する。例えば、アミノ酸31-99により境界を定められたタンパク質はアミノ酸31-99を含むタンパク質もしくはペプチドフラグメント又はそのあらゆる変異体もしくは誘導体を表す。
【００２１】
本明細書に使用される“融合タンパク質”という用語は自然では一緒に結合されない少なくとも２種のポリペプチドセグメントを表す。本発明のこのような“融合タンパク質”の非限定例として、チオレドキシンに融合されたE1タンパク質及びその変異体、フラグメント又は変異体が挙げられる。本発明の目的のために、チオレドキシンの使用は融合されたE1タンパク質又はそのあらゆるフラグメント、変異体又は誘導体が可溶性形態で精製されることを可能にする。それ故、E1タンパク質を可溶化することができるあらゆるタンパク質が本発明の目的のために使用し得る。本発明の目的のための融合タンパク質の別の例はGAL4タンパク質へのE1タンパク質及びそのあらゆる変異体、誘導体又はフラグメントの融合である。これらの融合されたポリペプチドは“アフィニティー標識”のポリペプチドに更に融合されてもよい。或る実施態様において、付加的な開裂部位を融合された二つのポリペプチド配列の間に導入することが有益であるかもしれない。二つ以上の異種融合タンパク質の間のこのような開裂部位が当業界で公知である。
【００２２】
“ベクター”又は“DNA構築物”という用語は当業界で普通に使用され、オリゴヌクレオチド配列、又は本発明の配列を含むことができ、本発明のDNAがクローン化し得るDNAビヒクルとして利用できるプラスミドDNA、ファージDNA、ウイルスDNA等を含むが、これらに限定されないあらゆる遺伝子要素を表す。多数の型のベクターが存在し、当業界で公知である。
“発現”という用語は構造遺伝子がmRNAに転写され（転写）、次いでmRNAが一種以上のポリペプチド（又はタンパク質）に翻訳される（翻訳）プロセスを特定する。
【００２３】
“発現ベクター”という技術用語は上記のとおりであるが、宿主への形質転換後に挿入配列の発現を可能にするように設計されたベクター又はビヒクルを特定する。クローン化遺伝子（挿入配列）は調節要素配列、例えば、プロモーター配列の制御下に通常置かれる。このような発現調節配列はベクターが原核生物宿主もしくは真核生物宿主又はその両方（シャトルベクター）中で機能し得る形で連結された遺伝子を発現するように設計され、更に転写要素、例えば、エンハンサー要素、終結配列、組織特異性要素、及び／又は翻訳開始部位及び終止部位を含むことができるか否かに応じて変化するであろう。
“真核生物発現系”は適当な発現ベクターと関係するタンパク質を発現するのに使用し得る真核生物細胞系との組み合わせを意味する。幾つかの系において、タンパク質の遺伝子が使用される細胞型を感染し得るウイルスのゲノムに挿入し得る。また、所望の遺伝子を含むプラスミドベクターが使用し得る。全ての場合、ベクターはタンパク質を関係する細胞型中で発現するのに適した調節要素（プロモーター）を含むであろう。また、付加的な成分、例えば、T7ポリメラーゼをコードするベクター又はウイルスゲノムが或る発現系で必要であるかもしれない。典型的に使用される真核生物細胞型はプラスミドベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ、ピシア・パストリス）；バキュロウイルス（オートグラファ・カリフォルニカ又はボムビックス・モリ）で感染された昆虫細胞（例えば、SF9、SF21）(Luckow, Curr. Op. Biotech., 1993, 4:564-572; Griffiths及びPage, 1994, Methods in Molec. Biol. 75:427-440;及びMerringtonら, 1997, Molec. Biotech. 8(3):283-297)；アデノウイルス、ワクチニアウイルス、シンドビスウイルス、又はセムリキ森林ウイルスで感染された哺乳類細胞；及び一時的又は構成的発現のためのDNAベクターでトランスフェクトされた哺乳類細胞である。酵母サッカロミセス・セレビジエ系及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞からの哺乳類細胞がここで特に好ましい。
【００２４】
宿主細胞又はインジケーター細胞はこのようなDNAが細胞内に導入された時に外因性又は異種DNA（例えば、DNA構築物）により“トランスフェクト”された。トランスフェクトDNAは細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み込まれて（共有結合されて）もよく、またそうでなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳類の細胞中で、トランスフェクティング／形質転換DNAはプラスミドの如きエピソーム要素に維持されてもよい。真核生物細胞に関して、安定にトランスフェクトされた細胞の例はトランスフェクトされたDNAが染色体に組み込まれるようになり、染色体複製により娘細胞により遺伝される細胞である。この安定性はトランスフェクトされたDNAを含む娘細胞の集団を含む細胞系又はクローンを樹立する真核生物細胞の能力により実証される。トランスフェクション方法は当業界で公知である(Sambrookら, 1989,上記文献；Ausubelら, 1994,上記文献)。
【００２５】
本明細書に使用される“アフィニティー標識”という用語は相補性リガンドにより特異的に捕捉される標識を表す。アフィニティーマーカー／アフィニティーリガンドの対の例として、マルトース結合タンパク質(MBP)／マルトース；グルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)／グルタチオン；ポリ-ヒスチジン(His)／金属が挙げられるが、これらに限定されない。アフィニティーリガンドとして使用される金属はコバルト、亜鉛、銅、鉄、及びニッケルからなる群から選ばれてもよい(Wongら, 1991, Separation and Purification Methods, 20(1), 49-106)。選ばれる金属はニッケルであることが好ましい。アフィニティーリガンドはアフィニティークロマトグラフィーによる分離を促進するためにカラム中に固定し得る。
【００２６】
アフィニティー標識はタンパク質のＮ末端又はＣ末端、好ましくはタンパク質のＮ末端に配置し得る。
本発明を実施するのに有益なヌクレオチド配列及びポリペプチドとして、突然変異体、同族体、サブタイプ、対立遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、本発明の配列は相互作用ドメインをコードすることが理解されるべきである。本発明の相互作用ドメイン及びそのあらゆる変異体、誘導体又はフラグメントは本発明の教示及びアッセイ並びに一般技術を使用して容易に決定し得ることが当業者に明らかであろう。
本明細書に使用される“変異体”という名称は本発明の状況において初期の配列の生物活性に実質的に似ている生物活性（機能又は構造の）を保持する分子の配列（核酸又はアミノ酸を問わない）を表す。この変異体又は均等物は同じ種又は異なる種からのものであってもよく、天然変異体であってもよく、又は合成により調製されてもよい。このような変異体として、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列があげられるが、但し、タンパク質の生物活性が保存されることを条件とする。同じことが一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を有し得る核酸配列の変異体に適用されるが、但し、その配列又はその翻訳タンパク質の生物活性が一般に維持されることを条件とする。
“誘導体”という用語は通常これらの分子の一部ではない付加的な化学部分を含む場合の上記変異体のいずれをも含むことが意図されている。これらの化学部分は分子の溶解性、吸収、生物学的半減期を改良し、毒性を低下し、また望ましくない副作用を排除又は低下することを含む種々の目的を有し得る。更に、これらの部分は標識、結合の目的に使用でき、又はそれらは融合生成物中に含まれてもよい。上記効果を媒介することができる異なる部分がRemington's The Science and Practice of Pharmacy (1995)に見られる。このような部分を分子に結合する方法は当業界で公知である。
【００２７】
“フラグメント”という用語は同定されたDNA、RNA又はアミノ酸配列のあらゆるセグメント及び／又は本明細書に上記された変異体もしくは誘導体のいずれかのあらゆるセグメントを表す。
本発明の“変異体”、“誘導体”、及び“フラグメント”という用語は本明細書中単離／精製され、化学的に合成され、又は組換えDNA技術により生成されるタンパク質分子又は核酸分子を表す。全てのこれらの方法が当業界で公知である。
本明細書に以下に例示されるように、本発明に使用されるヌクレオチド配列及びポリペプチドは、その触媒及び構造-機能関係を分析し、得られるタンパク質の良好な設計及び同定を可能にするために、例えば、in vitro突然変異誘発により修飾し得る。
【００２８】
“オリゴマー化”は少なくとも二つの分子間の相互作用を表す。これらの分子は同じであってもよく、また異なっていてもよい。本発明において、自己オリゴマー化という用語はE1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントの間の相互作用を表す。
“スクリーニング配列”は本明細書中でそれ自体又はPV E1タンパク質（その誘導体、フラグメント又は変異体を含む）にオリゴマー化することができるアミノ酸配列と定義される。この配列はオリゴマー化をモジュレートする薬剤を選択するためのスクリーニング方法の成分を含む。
“DNA同時免疫沈澱アッセイ”はタンパク質-DNA相互作用の検出のためのアッセイである。タンパク質-DNA複合体は複合体中に含まれるタンパク質の抗体で免疫沈澱される。DNAを含む免疫沈澱した生成物は当業界で公知の方法、例えば、アガロースゲル電気泳動、続いて放射能像形成又は比色技術により検出／測定され、又は視覚化し得る。
【００２９】
好ましい実施態様
特に好ましい実施態様において、E1オリゴマー化に必要なPV E1タンパク質領域Ａ内に含まれる、アミノ酸配列及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントが提供される。
E1タンパク質のオリゴマー化はE1タンパク質領域Ａの種々のサイズのアミノ酸フラグメントを使用することによりこの出願において実証される。これらのフラグメントが全て本発明の範囲内にある。
この第一の実施態様によれば、HPV-11に従ってナンバリングしてアミノ酸352-439により表されるPV E1タンパク質のオリゴマー化に必要なアミノ酸配列が提供される。また、アミノ酸配列はHPV-11ナンバリングに従ってアミノ酸353-438により境界を定められる。更にまた、アミノ酸配列は配列番号２により特定される。
【００３０】
この第一の実施態様の好ましい局面において、アミノ酸配列はアミノ酸352-432により表される。また、アミノ酸配列はHPV-11ナンバリングに従ってアミノ酸353-431により境界を定められる。更にまた、アミノ酸配列は配列番号３により特定される。
この第一の実施態様の更に特別な局面において、アミノ酸配列はアミノ酸352-417により表される。また、アミノ酸配列はHPV-11ナンバリングに従ってアミノ酸353-416により境界を定められる。更にまた、アミノ酸配列は配列番号４により特定される。
アミノ酸配列の上記実施態様によれば、本明細書中の配列に機能上均等であるその全ての変異体、誘導体及びフラグメントが本発明の範囲内にある。
本発明の付加的な実施態様によれば、本発明のアミノ酸配列は自己会合し得る。更に、これらの配列は本発明の配列を含む、完全長E1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントとオリゴマーを形成し得る。
それ故、本発明の第二の実施態様によれば、E1タンパク質と共沈されたDNAの量を検出し、かつ／又は測定することによりE1/DNA結合（ひいてはE1タンパク質のオリゴマー化）を評価するためのスクリーニングアッセイが提供される。
【００３１】
この第二の実施態様の特別な局面によれば、E1タンパク質と同時免疫沈殿されたDNAの減少を測定することによりE1オリゴマー化を抑制することができる薬剤をスクリーニングするためのアッセイが提供される。
更に特別には、この第二の実施態様は
a.E1タンパク質をDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートしてE1タンパク質及びDNAに複合体を形成させる工程、
b.E1タンパク質/DNA複合体を複合体形成しなかったDNAから単離する工程、
c.DNAを検出する工程（DNAの存在はE1タンパク質のDNAへの結合を示し、従ってE1オリゴマー化と相関関係がある）
を含むことを特徴とするオリゴマー化アッセイを提供する。
【００３２】
このアッセイに使用されるE1は本発明のアミノ酸配列、完全長E1タンパク質、Ｎ末端切断型E1タンパク質（e1*）及びこれらのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントから選ばれてもよい。
この特別な実施態様に使用されるDNAフラグメントはE1結合の特異性を増進するために複製起点を含むことが好ましい。E1は２種のDNAフラグメントの混合物と合わされることが更に好ましく、その一種は複製起点を含み、また第二のフラグメントは異なる長さのDNAからなり、その結果、それがoriを含むDNAから区別でき、またoriを含むDNAに結合されたE1の量が非特異的結合の量と比較し得る。
特に、E1-DNA複合体はカラムクロマトグラフィー、遠心分離、抽出、濾過、又は免疫沈澱により遊離DNAから単離される。E1-DNAは抗体をSPAビードの如き固体担体又は試験プレートからのウェルの下部に固定することにより単離されることが更に好ましく、その結果、培養培地が除去される時、遊離DNAも共に除去される。
特に、E1はポリクローナル抗体を使用して免疫沈澱又は固定される。更に特別には、ポリクローナル抗体がK71又はK72である。
複合体形成されたDNAが検出される前に、DNAがE1/DNA複合体から放出されることが好ましい。このような放出は、例えば、有機抽出により行なわれてもよい。
【００３３】
この第二の実施態様の特別な局面において、DNAはゲル電気泳動、分光光度分析及び放射性像形成を含む方法により検出し得る。それ故、選ばれた検出手段に応じて、DNAが蛍光色素又は放射性同位元素を含む当業界で知られているあらゆる適当な手段により標識される。DNAは放射能標識され、ゲル電気泳動、続いて放射性像形成により検出されることが好ましい。また、DNAは比色色素で標識され、分光光度により検出され、又はDNAは蛍光色素で標識され、シンチレーション接近技術(SPA)により検出される。
特に、DNAは複合体形成の前、免疫沈澱の後又はDNAが免疫沈澱複合体から放出された後に標識される。
【００３４】
この第二の実施態様の特別な局面において、E1オリゴマー化を抑制することができる薬剤のスクリーニングに適した上記アッセイが提供され、このアッセイは
a.薬剤をE1タンパク質と接触させ、その後にDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートしてE1タンパク質/DNAに複合体を形成させる工程、及び
b.これらの結果を対照サンプルと比較する工程（対照サンプルは同様に処理されるが、前記薬剤が添加されない）
を更に含む。
更に特別には、このような選ばれた薬剤はオリゴマー化に干渉することができ、最も特別には、このような薬剤は上記のE1タンパク質及びそのあらゆる誘導体、変異体又はフラグメントのオリゴマー化に抑制性である。
【００３５】
本発明の第三の実施態様によれば、E1タンパク質のオリゴマー化（又はその抑制）のレベルを直接測定する架橋アッセイが提供される。特に、このオリゴマー化アッセイは
a.標識E1タンパク質をDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートして、E1タンパク質及びDNAに複合体を形成させる工程、
b.複合体中のE1タンパク質及びDNAを架橋剤で架橋する工程、
c.E1タンパク質を電気泳動で分離する工程（その結果、E1の移動がE1のオリゴマー化のレベルの指示である）
を含む。
E1/DNA複合体は分離を行なう前に遊離DNAから単離されることが好ましい。
特に、このオリゴマー化アッセイに使用されるE1タンパク質はＮ末端切断型E1タンパク質である。それはその最初の約70Ｎ末端アミノ酸が欠失されていることが更に好ましい。このE1タンパク質はアミノ酸72-649により境界を定められることが更に好ましい。
E1タンパク質は放射性同位元素で標識されることが好ましい。それは35Sで標識され、ゲル上で当業界で公知の放射性像形成技術により検出されることが更に好ましい。
架橋剤はビスマレイミドヘキサン(BMH)であることが好ましい。
【００３６】
本発明の第四の実施態様によれば、Ｎ末端切断型E1タンパク質が提供される。特に、最初の約70Ｎ末端アミノ酸がe1タンパク質から欠失されている。更に特別には、この第四の一局面はアミノ酸72-649（配列番号78）により境界を定められたE1タンパク質を含む。
E1タンパク質がその他のパピローマウイルス並びにSV40及びポリオーマウイルスＴ抗原との類似性を有することが示されたので、本発明は本発明のアミノ酸配列に対し機能類似性及び／又は構造類似性を有する、ウイルスDNA複製を開始するのに必要とされるタンパク質のオリゴマー化に必要なあらゆるアミノ酸配列を含む。
本発明の付加的な好ましい実施態様において、同様の機能及び／又は構造を有するオリゴマー化に必要なE1タンパク質中の領域がウシパピローマウイルス、ワタオパピローマウイルス又はヒトパピローマウイルス中に存在する。本発明の実施態様の特別な局面において、PV DNAはHPVからのものである。
更に好ましい実施態様において、E1タンパク質の領域はHPV低リスク型又は高リスク型から選ばれる。高リスク型は型16、18、31、35、45、52及び52からなり、また低リスク型は型６、11及び13からなる。
本発明の最も好ましい実施態様において、本発明のアミノ酸配列は低リスクヒトパピローマウイルス型11からのものである。
【００３７】
本発明の実施態様の特別な局面において、E1タンパク質は異なる手段により得られる。非限定例において、タンパク質がウサギ網状赤血球溶解産物中で対になった転写／翻訳により合成され、又は組換え技術によりつくられる。
本発明の適用によれば、スクリーニング方法及びスクリーニング系は低温でATP/Mgの存在下もしくは不在下で、又は高温でATP/Mgの存在下で行なわれる。約４℃〜23℃の低温、また約37℃の高温で行なわれることが更に好ましい。更に、E1タンパク質はin-vitro転写／翻訳、又は組換え技術によりつくられてもよく、アミノ酸72-649（配列番号78）を含むが、当業界で知られているその他の手段がスクリーニングのためのアミノ酸配列を得るのに使用し得る。
本発明の適用において、本発明のアミノ酸配列及びそのあらゆる変異体、誘導体又はフラグメントは、それに結合することができるあらゆるタンパク質又は分子の選択のためのアフィニティーカラム中に使用し得る。非限定例は抗体、ポリペプチド、核酸配列及び化学化合物である。
本発明の実施態様を使用して選ばれた薬剤はウイルスDNA複製、特にパピローマウイルスDNA複製、更に特別にはHPVに作用することが好ましい。本発明の特別な適用において、一種以上の選ばれた薬剤はパピローマウイルス感染症の治療用の医薬組成物中に使用し得ることが意図されている。
特別な技術手段が本明細書に例示されているが、本発明の目的のために当業者に知られているあらゆる手段が本発明の範囲にあることが意図されている。
【００３８】
（実施例）
実施例１：酵母株、培地、及び遺伝的方法
サッカロミセス・セレビジエ株Y153（MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-901 his3-Δ200 ade2-101 gal4Δ gal80Δ URA3::GAL-lacZ LYS::GAL-HIS3）を酵母２ハイブリッド分析（Durfeeら, 1993, Genes. Dev. 7:555-569）に使用した。Clontech Matchmaker Library Protocolに実質的に記載されたLiAc方法を使用して、酵母株Y153の形質転換を行なった。２種のプラスミドの組み合わせで同時形質転換された細胞を、ロイシン及びトリプトファンを欠いているが、その他の必要とされるアミノ酸を補給したSD培地（Shermanら, 1979, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載された）で30℃で３〜５日にわたって選択した。
【００３９】
実施例２：β-ガラクトシダーゼアッセイ
形質転換酵母細胞を、ロイシン及びトリプトファンを欠いている液体SD培地中で前増殖させ、次いでYPD（Shermanらの上記文献）培養物に接種するのに使用した。これらの培養物が600nmで約0.6の光学密度（OD600）に達するまで、それらを30℃で増殖させた。次いで細胞を回収し、洗浄し、凍結（液体窒素）及び解凍の２サイクルにより透過性にした。次いでClontech Matchmaker Library Protocolに記載された基質クロロフェニルレッド-β-D-ガラクトピラノシド（CRPG、ベーリンガー・マンハイム）を使用して、β-ガラクトシダーゼ活性を分光光度（578nmにおける）により測定した。式：ミラー単位=(1000xOD578)/（経過時間x1.5mlの培養液xOD600）を使用して、酵素活性を計算した。
【００４０】
実施例３：プラスミド構築物
A. in-vitro 転写 / 翻訳用のプラスミド
増幅用の構築物及びプライマーを表１に要約する。
HPV-11 E1及びE2のin vitro合成に使用したプラスミドをpCR3（インビトロゲン、CA）又はpTM1（バーナード・モス、NIHから入手した）から誘導した。これらのプラスミド中で、コードされたタンパク質が読み取り枠(ORF)の上流に位置されたT7プロモーターからin vitroで発現し得る。対にされた転写/翻訳系（TNT結合型網状赤血球溶解産物系、プロメガ）中で使用した場合、pTM1から誘導されたプラスミドはタンパク質の高レベルの合成を誘導した。おそらく、このプラスミドがEMCV IRES（脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位）（これは翻訳を刺激する（データは示されていない））をコードするからである。
【００４１】
pCR3-E1及びpCR3-E2を構築するために、完全HPV-11 E1及びE2 ORFをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により別々に増幅したが、DNAを増幅することができるあらゆる方法が本発明の目的に適している。下記のオリゴヌクレオチドの対を増幅反応に使用した。
E1 : CAAGGATGGCGGACGATTCA （配列番号15）、及び
TCTTCATAAAGTTCTAACAAC（配列番号16）
E2: GAAGATGGAAGCAATAGCCAA （配列番号17）、及び
ATGGTTACAATAAATGTAATGAC （配列番号18）
（E1及びE2のATG及び停止コドンが下線を施されている）
PCRに使用したDNA鋳型はバキュロウイルス構築物Ac11E1又はAc11E2（ロチェスター大学のR. Roseから入手した）であった。TAクローニングキット（インビトロゲン）を使用して、E1及びE2のPCR産物を夫々プラスミドpCR3中でサイトメガロウイルス即時型プロモーターの調節下でクローン化してpCR3-E1及びpCR3-E2を生成した。
FLAGエピトープ（Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）にＮ末端で融合されたE1（アミノ酸2-649）を発現するプラスミドpCR3-FLAG-E1（FLAGエピトープはイーストマン・コダック社からのものである）を下記の２種のオリゴヌクレオチドによるE1 ORFのPCR増幅により構築した。
【００４２】
CATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCGGACGATTCAGGTACAGAAAAT （配列番号19）、及び
GGGATCCTTATTATAAAGTTCTAACAACTGATCCTGGCAC （配列番号20）
（FLAGエピトープをコードする部分が下線を施されている） TAクローニングキット（インビトロゲン）を使用して、得られるPCR産物をプラスミドpCR3（インビトロゲン）にクローン化した。プラスミドpTM1-E1を構築するために、下記の２種のオリゴヌクレオチドを使用してE1 ORFをPCRにより増幅した。
GTACGATCCCATGGCGGACGATTCAGGTACAGAAAAT （配列番号21）、及び
GTACGATGGGATCCTTATTATAAAGTTCTAACAACTGATCCTGGCAC（配列番号22）
【００４３】
得られるPCR産物を制限酵素NcoI及びBamHI（制限部位は２種のオリゴヌクレオチドによりコードされる）で消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位及びBamHI部位の間に挿入した。
FLAGエピトープ（Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）にＮ末端で融合されたE1（アミノ酸2-649）を発現するプラスミドpTM1-FLAG-E1を下記の２種のオリゴヌクレオチドによるE1 ORFのPCR増幅により構築した。
CCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCGGACGATTCAGGTACAGAAAAT （配列番号23）、及び
GGGATCCTTATTATAAAGTTCTAACAACTGATCCTGGCAC （配列番号24）
（FLAGエピトープをコードする部分が下線を施されている） 得られるPCR産物を制限酵素NcoI及びBamHI（２種のオリゴヌクレオチドによりコードされる）で消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位及びBamHI部位の間に挿入した。
【００４４】
in vitroでＮ末端切断型E1タンパク質を発現するプラスミドを、NcoI部位（フォワードプライマー）及びBamHI部位（リバースプライマー）を有する特定のプライマーによるE1 ORFの所望の部分の増幅により構築した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位及びBamHI部位の間に挿入した。使用した異なるE1フォワードプライマー及び共通のリバースプライマーの配列を以下に記載する。これらのオリゴヌクレオチドの夫々によりコードされるE1の最初のアミノ酸が括弧中に示される。
フォワードプライマー：
CCCGGATCCTAATGGCGGACGATTCAGGT(a.a. 1)（配列番号25）
GGCTGGATCCATGGCGGATGCTCATTATGCG(a.a. 72) （配列番号26）
GGCTGGATCCATGGCCATTAAACTTACAACACAG(a.a. 112)（配列番号27）
GGCTGGATCCATGGGCTATTCTGAAGTGGAAG(a.a. 138)（配列番号28）
GGCTGGATCCATGGGGAGGGACATAGAGGGT(a.a. 166)（配列番号29）
GGCTGGATCCATGGACACATCAGGAATATTAGAA (a.a. 191) （配列番号30）
GGCTGGATCCATGGACAGTCAATTTAAATTAACT (a.a. 353) （配列番号31）
GGCTGGATCCATGGACAGTGTAGGTAACTGG (a.a. 435) （配列番号32）
【００４５】
リバースプライマー：
CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT(a.a. 649) （配列番号33）
Ｎ末端71アミノ酸を欠いている切断型HPV-11E1タンパク質をコードするが、そのＮ末端でFLAGエピトープで標識されているプラスミドpTM1-FLAG-E1(72-649)を、FLAG-エピトープをコードするオリゴヌクレオチドを使用してPCR増幅により構築した。
GGGGGCCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGGCGGATGCTCATTATGACTG（配列番号34）（FLAGエピトープの配列が下線を施されている） また、下記のリバースプライマーを使用した。
CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT（配列番号33）
【００４６】
pTM1-FLAG-E1(72-649)と同様であるが、Ｃ末端切断型のE1タンパク質をコードするプラスミドを、NcoI部位（フォワードプライマー）及びBamHI部位（リバースプライマー）を有する特定のプライマーによるE1 ORFの所望の部分のPCR増幅により構築した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、プラスミドpTM1のNcoI部位とBamHI部位の間にインフレームで挿入した。共通のフォワードプライマー（FLAGエピトープをコードする）の配列を以下に記載する。また、使用した異なるE1リバースプライマーの配列を記載する。これらのリバースプライマーの夫々によりコードされるE1の最後のアミノ酸が括弧中に示される。
【００４７】
フォワードプライマー：
GGGGGCCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGGCGGATGCTCATTATGACTG（配列番号34）（FLAGエピトープの配列が下線を施されている）
リバースプライマー：CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT（配列番号33）
CCCGGATCCTCATGCATCTGATAGTTCATATACTG (a.a. 608) （配列番号35）
CCCGGATCCTCAGCTAATGTCTATATTTGATGTAACC (a.a. 572) （配列番号36）
CCCGGATCCTCATAAAAATGGAATAAATTCTATGTTTTGATG (a.a. 458)（配列番号37）
CCCGGATCCTCACTGGCGCGTTATCCATTCCGGC (a.a. 344) （配列番号38）
CCCGGATCCTCAAATGCCTGTCCTAAACCAATAC (a.a. 327)（配列番号39）
【００４８】
B. 酵母２ハイブリッドプラスミド
増幅に使用した構築物及びプライマーを表２及び３に要約する。
特に記載されない限り、HPV-11 E1 DNAフラグメントを、NcoI部位（フォワードプライマー）及びBamHI部位（リバースプライマー）を有する特定のプライマーによるPCR増幅により増幅した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、酵母２ハイブリッドベクターpAS1(GAL4 DNA結合ドメイン)及びpACT2(GAL4活性化ドメイン)（Durfeeら, 1993, Genes. Dev. 7:555-569）のNcoI部位とBamHI部位の間にインフレームで挿入した。完全E1タンパク質（アミノ酸1-649）をコードする２ハイブリッドプラスミドを、フォワードプライマーがNcoI部位に代えてBamHI部位を含む以外は、同様の方法で構築した。この場合、PCR産物をBamHIで切断し、pAS1及びpACT2のBamHI部位にインフレームで挿入した。突然変異したE1 ORF (P479S, K484E又はK484Q)を有する２ハイブリッドプラスミドを、PCRの鋳型として突然変異したE1遺伝子を使用する以外は同様の方法で生成した（E1突然変異の記載について以下を参照のこと）。使用した種々のフォワードプライマー及びリバースプライマーを以下に記載する。
【００４９】
フォワードプライマー：
CCCGGATCCTAATGGCGGACGATTCAGGT(a.a.1)（配列番号25）
GGCTGGATCCATGGCGGATGCTCATTATGCG(a.a.72)（配列番号26）
GGCTGGATCCATGGGCTATTCTGAAGTGGAAG(a.a.138)（配列番号28）
GGCTGGATCCATGGACACATCAGGAATATTAGAA(a.a.191)（配列番号30）
GGCTGGATCCATGGCAAGTACAGTTATAGGGG(a.a.330)（配列番号31）
GGCTGGATCCATGGACAGTCAATTTAAATTAACT(a.a.353)（配列番号40）
GGCTGGATCCATGGCATATGATAATGATATTTGTG(a.a.365)（配列番号41）
GGCTGGATCCATGGCATTTGAATATGCACAGCG(a.a.377)（配列番号42）
GGCTGGATCCATGGGAGACTTTGACTCCAATGC(a.a.384)（配列番号43）
GGCTGGATCCATGGACTCCAATGCAAGGGCC(a.a.387)（配列番号44）
GGCTGGATCCATGGATTGTGCAATTATGTGCAG(a.a.405)（配列番号45）
GGCTGGATCCATGGCAGAAATGAAAAAGATGTC(a.a.416)（配列番号46）
GGCTGGATCCATGGACAGTGTAGGTAACTGG(a.a.435)（配列番号32）
【００５０】
リバースプライマー：
CCCGGATCCTCATAAAGTTCTAACAACT(a.a.649)（配列番号33）
CCCGGATCCTCAGCTAATGTCTATATTTGATGTAACC(a.a.572)（配列番号36）
CCCGGATCCTCAATATGTATCCATATATGTCCAAC(a.a.536)（配列番号32）
CCCGGATCCTCATAAAAATGGAATAAATTCTATGTTTTGATG(a.a.458)（配列番号47）
CCCGGATCCTATCACACAATTGGCTTCCAGTTACC(a.a.444)（配列番号48）
CCCGGATCCTATCAACCTACACTGTCAACTTTAG(a.a.438)（配列番号49）
CCCGGATCCTATCAACCCCTATACTTAATCCATTG(a.a.431)（配列番号50）
CCCGGATCCTATCATGCATGTTTATAATGTCTGCAC(a.a.416)（配列番号51）
【００５１】
異なるアプローチを使用して、E1配列353-572、353-536及び353-458をコードするpAS1誘導プラスミド及びpACT2誘導プラスミドを２工程で構築した。最初の工程において、下記の２種のプライマーを使用してE1配列をPCRにより増幅した。
GGCTGGATCCATGGACAGTCAATTTAAATTAACT(a.a.353)（配列番号40）及び
CCCGGATCCAGTGTGATGGATATCTGCAG（配列番号52）(pCR3)
PCRの鋳型は切断型E1 ORF: E1アミノ酸1-572、1-536、又は1-458を発現するpCR3誘導プラスミドであった。PCRに使用した２種のオリゴヌクレオチドの一種はE1のコドンにハイブリダイズする。別のオリゴヌクレオチドは切断型E1 ORFの下流のpCR3のポリリンカー領域にハイブリダイズする。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、pAS1及びpACT2のNcoI部位及びBamHI部位の間にクローン化した。これらの三つのPCR反応に鋳型として使用したプラスミドを下記のオリゴヌクレオチドによるE1 ORFの増幅により構築した。
CAAGGATGGCGGACGATTCA （配列番号15）（E1のATGが下線を施されている）及びE1のコドン572、536及び458の夫々にハイブリダイズする３種のオリゴヌクレオチドの一種。これらのオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
GGATCCTCATTAGCTAATGTCTATATTTGATGT(a.a.572)（配列番号53）
GGATCCTCATTAATATGTATCCATATA(a.a.536)（配列番号54）
GGATCCTCATTATAAAAATGGAATAAATTCTATG(a.a.458)（配列番号55）
TAクローニングキット（インビトロゲン）を使用して、得られるPCR産物をpCR3にクローン化した。
【００５２】
C. 一時的 HPV 複製のためのプラスミド
トランスフェクトされた細胞中でE1及びE2を発現するための一時的HPV DNA複製アッセイに使用したプラスミドをpCR3: pCR3-E1、pCR3-FLAG-E1 (wt及び突然変異体E1)及びpCR3-E2から全て誘導した。これらのプラスミドが先に記載されている。
プラスミドpN9 (Luら, 1993, J. of Virol. 67:7131-7139)はD. McCance （ロチェスター大学）から入手され、ｐブルースクリプトIISK+（ストラタゲン）にクローン化されたHPV-11（ヌクレオチド7884-61）の完全な複製起点を含む。
D. チオレドキシン融合タンパク質の発現のためのプラスミド
E1の３種のフラグメント（a.a.353-416/353-431/353-438）をチオレドキシン(TRX)との融合タンパク質としてE. coli中で発現した。これらの融合タンパク質を発現するためのプラスミドを、上記のフォワードオリゴヌクレオチド及びリバースオリゴヌクレオチドのサブセットを使用してE1 ORFの妥当な部分のPCR増幅により構築した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、TRXをコードするプラスミドpET-32a-c(+)（ノバゲン）のNcoI部位とBamHI部位の間にサブクローン化した。
【００５３】
実施例４：部位誘導突然変異誘発
クイックチェンジ部位誘導突然変異誘発キット（ストラタゲン）を用いて、その製造業者により供給された指示に従って、E1の部位誘導突然変異誘発を行なった。夫々の突然変異誘発について、相補オリゴヌクレオチドの対を使用した。夫々の対について、センスストランドに相当するオリゴヌクレオチドの配列を以下に記載する。また、得られるアミノ酸置換を示す。
E1 F378A GTGAGATAGCAGCTGAATATGCACAGCG（配列番号56）
E1 Y380A GAGATAGCATTTGAAGCTGCGCAGCGTGGAG（配列番号57）
E1 N389A GACTTTGACTCCGCGGCAAGGGCC（配列番号58）
E1 A390G GGAGACTTTGACTCCAACGGCCGGGCCTTTTTAAATAG（配列番号59）
【００５４】
E1 F393A GCAAGGGCCGCGTTAAATAGTAATATGC（配列番号60）
E1 Q399A CCTTTTTAAATAGTAATATGGCGGCTAAATATGTAAAAG（配列番号61）
E1 P479S CCATTGTAGGGTCACCTGACACTGG（配列番号62）
E1 K484E CTGACACTGGGGAGTCGTGCTTTTG（配列番号63）
E1 K484Q CTGACACTGGGCAGTCGTGCTTTTG（配列番号64）
E1 K484H CCTGACACTGGGCACTCGTGCTTTTGC（配列番号65）
E1 K484I CCTGACACTGGGATCTCGTGCTTTTGC（配列番号66）
E1 K484R CCTGACACTGGGCGGTCGTGCTTTTGC（配列番号67）
【００５５】
E1 F509A CCTGCAGCCACGCGTGGCTACAGCC（配列番号68）
E1 T566A CCGCTACTGGTTGCTAGCAATATAGACATTAGC（配列番号69）
E1 N568A CTACTGGTTACATCAGCAATTGACATTAGCAAAG（配列番号70）
E1 K286A/R288A GGTTTAAAGTAAATGCTAGCGCATGTACCGTGGCACG（配列番号71）
E1 A292L/R293E CAGATGTACCGTGCTCGAGACATTAGGTACG（配列番号72）
HPV-11起点中の三重点突然変異を、下記のオリゴヌクレオチドを使用してプラスミドpN9に導入した。
CATATTTCCTTCTTATACTGCAGAACAATCTTAGTTTAAAAAAGAGG（配列番号73）及びその相補オリゴヌクレオチド（突然変異体ヌクレオチドが下線を施されている）
【００５６】
実施例５：E1-起点結合アッセイ
TNT結合型網状赤血球溶解産物系（プロメガ）を使用してin vitroで対にされた転写/翻訳によりE1タンパク質を生成した。TNT網状赤血球溶解産物50μl当り２μgの適当なプラスミドを用いて、製造業者により提供されたプロトコルに従って溶解産物をプログラムした。必要な場合、E1タンパク質を35S-メチオニンのとり込みにより放射能標識した。75μlの最終容積中でE1を含む溶解産物30μl、33P標識DNAプローブ200-400ng、及び10xDNA結合緩衝液（200mM トリス-HCl pH 7.6、1M NaCl、10mM EDTA、10mM DTT）7.5μlを混合することにより、結合反応を行った。結合反応を示された温度で90分間進行させた。示される場合、ATP（又は関連ヌクレオチド）及びMgCl2を夫々5mM及び3mMの最終濃度で結合反応に補給した。DNA-タンパク質を抗FLAG M2モノクローナル抗体（イーストマン・コダック）（FLAG標識E1を使用する場合）、又はHPV11 E1のＣ末端14アミノ酸から誘導されたペプチドに対しウサギ中で産生されたK72ポリクローナル抗体で免疫沈殿させた。このペプチドのアミノ酸配列はQAFRCVPGSVVRTL（配列番号79）である。免疫沈殿中の使用の前に、抗体をプロテインＧセファロースビーズ（抗FLAGを使用する場合）又はプロテインＡセファロースビーズ(K72)に前結合した。タンパク質-DNA複合体の免疫沈殿を結合反応温度で１時間行なった。複合体をウォッシュ緩衝液（50mMトリスpH 7.6; 100mM NaCl; 0.1％トリトンX-100）200μlで３回洗浄した。これらの複合体中に存在するDNAをフェノール/クロロホルムで抽出し、キャリヤー酵母tRNAの存在下でエタノールで沈殿させた。沈殿した放射能標識DNAフラグメントを５％ポリアクリルアミドTBEゲルで分割し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。
【００５７】
これらの実験に使用した放射能標識プローブは２種のDNAフラグメントからなり、２工程で調製した。第一の工程で、プラスミドpN9をXmaIによる消化により線状にし、末端を5μCiのα32P-dCTP及び夫々0.1mMのdTTP、dATP、dGTPの存在下でDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメントで標識した。標識DNAをQIAクイックPCR精製カラム（キアゲン）で精製した。第二の工程で、線状放射能標識pN9をPvuIIで消化して２種の標識フラグメント：HPV-11複製起点を含む370bpフラグメント及び起点を欠いている186bp対照フラグメントを生成した。
【００５８】
実施例６：E2依存性E1起点結合アッセイ
E1-E2-ori３成分複合体の生成に関する条件はE1起点結合アッセイについて上記した条件と実質的に同じであった。唯一の重要な相違はin-vitro翻訳E2タンパク質7.5μlを結合反応に添加し、かつ完全長E1タンパク質（a.a.1-649）をこれらの実験に使用したことであった。これらの実験に使用した野生型及び突然変異体E1タンパク質をpCR3から誘導されたプラスミドから生成した。小さな改良はin-vitro翻訳を２倍量（２μg/25μlの反応）のDNAでプログラムし、プローブ100ngのみをアッセイ当り使用したという事実を含んでいた。
【００５９】
実施例７：E.coliからのTrx-E1融合タンパク質の精製
３種のTRX-E1融合タンパク質（上記を参照のこと）の一種をコードし、又はTRX〔pET32a-c(+)、ノバゲン〕のみをコードするプラスミドを含んだE.coli細胞（BL21::DE3〔pLysS〕）を、アンピシリン（100μg/ml）及びクロラムフェニコール（34μg/ml）を含むLB培地中で一夜増殖させた。これらの一夜培養液3mlを新しい培地（120ml）で40倍に希釈し、O.D.600約0.5まで30℃でインキュベートした。次いでタンパク質発現を30℃で３時間にわたって1mM IPTGで誘発した（培養物がO.D.600約2.0に達するまで）。細菌細胞を10分間にわたって5000xgで遠心分離により回収した。細菌ペレットを1mlの溶解緩衝液（60mMトリスpH 7.6; 300mM NaCl; 10mMイミダゾール）中で再度懸濁させ、音波処理した。得られる溶解産物を16000xgで遠心分離して細胞デブリ及び不溶性物質の除去を得た。上澄みを前平衡したNi-NTAスピンカラム（キアゲン）に装填し、天然タンパク質の精製に関する製造業者のプロトコルに従って精製した。簡単に言えば、装填後に、夫々のカラムを洗浄緩衝液（60mMトリスpH 7.6; 300mM NaCl; 20mM イミダゾール）2x600μlで洗浄し、結合タンパク質を溶離緩衝液（60mMトリスpH 7.6; 300mM NaCl; 250mM イミダゾール）2x200μlで溶離した。次いで精製タンパク質を10％SDS-PAGEにより分析した。次いで全ての融合タンパク質を溶離緩衝液で500ng/μlの最終濃度に希釈した。
【００６０】
実施例８：一時的HPV DNA複製アッセイ
CHO-K1（ATCCから入手した）を、10％ウシ胎児血清及びゲンタマイシンスルフェートを含むハムF12培地中で35mmの組織培養皿中で40%-60％集密まで増殖させた。リポフェクタミン（ギブコBRL）を使用して、細胞をpCR3-E1（又はpCR3-FLAG-E1突然変異体）250ng、pCR3-E2 25ng及びpN9プラスミド250ngでトランスフェクトした。E1のＮ末端におけるFLAGエピトープの存在は一時的HPV DNA複製を支持するその能力に影響しない（データは示されていない）。細胞をトランスフェクションの72時間後に回収し、QIAmpブラッド・キット（キアゲン）を使用して、全DNAを単離した。複製されたpN9プラスミドDNAを、鋳型としてのDpn1消化全DNA及び下記のプライマーの対を使用して起点を含むフラグメントのPCR増幅により検出した。
【００６１】
CTGCAACCGGTTTCGGTTACCCACACCCT（配列番号74）（HPV-11ゲノムのヌクレオチド7885-7913に相当する）及び
CGTTCCACTGAGCGTAGACCCCGTAGAA（配列番号75）（pSK+のヌクレオチド1848-1820に相当する）
対照として、pCR3-E1プラスミドのフラグメントを、E1 ORF内にハイブリダイズする下記のプライマーの対を用いる同じPCR反応で増幅した：GCTTTGGGCTGTCATTTG（配列番号76）及びTGTCAGGTGGCCCTACAA（配列番号77）（HPV-11ゲノムの夫々ヌクレオチド1475-1492及び2275-2258に相当する）。PCR条件は95℃で１分間の初期変性工程、続いて94℃で30秒の変性、51℃で１分間のアニーリング及び72℃で１分30秒の延長の20ラウンドからなり、72℃で３分の最終延長で終了した。PCR産物をPCR反応への〔α33P〕dCTPの添加により放射性にし、アガロースゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化した。
【００６２】
実施例９：E1/DNA同時免疫沈殿アッセイ
1. 結合
ポリプロピレン96ウェルＵ字形下部プレート中で、DMSO中150μg/mlの化合物（又は混合物）５μlを結合マスター混合物（20mMトリスpH 7.4; 100mM NaCl; 5mM ATP; 3mM MgCl2; 1mM EDTA; 1mM DTT; 5ngのHPV11 ori+プローブ）60μlに添加する。結合反応が10μlのin-vitro翻訳HPV11 E1 (72-649)の添加により開始する。プレートをシールし、次いで５分間撹拌し、37℃で１時間インキュベートする。
2. 免疫捕獲
プロテインＡセファロースへの抗体の前結合
夫々のアッセイウェルについて、抗E1ポリクローナル抗体１μlを10％プロテインＡセファローススラリー（20mMトリスpH 7.0）10μlに添加する。そのスラリーを室温で１時間撹拌する。ビーズを迅速遠心分離によりペレットにし、10μlの1x結合緩衝液で洗浄し、次いで50μlの1x結合緩衝液（＋5mM ATP＋1mM DTT）中で再度懸濁させる。
【００６３】
捕獲
第二の96ウェルＵ字形下部ポリプロピレンプレート中で、50μlの前結合されたK71又はK72抗体-プロテインＡセファロースを夫々のウェルに付着する。結合反応が完結した後、全結合反応液を抗体-プロテインＡセファロースビーズを含むプレートに移す。次いでプレートをシールし、37℃でインキュベートし、１時間撹拌する。
本発明の目的に使用した抗E1ポリクローナル抗体を本明細書中K71及びK72と称する。これらはHPV11 E1の最後（Ｃ末端）の14a.a.に相当するペプチドに対しウサギ中で産生された抗血清である。
3. 濾過による複合体の単離
最初に、ミリポアMHVB N45 96ウェル濾過プレートを100μlの1x結合緩衝液の濾過により平衡にする。次いで複合体を移し、濾過し、200μlの1x結合緩衝液で３回洗浄する。プレートを紙タオルでふくことにより、残留液を除去する。最後に、150μlのマイクロシント20を夫々のウェルに添加し、33Pプロトコルを使用してカウントをトップカウントにより検出する。
【００６４】
結果
酵母中の E1-E1 相互作用（図１）
２ハイブリッド系（Fields及びSong, 1989, Nature, 340(6230):245-246及びDurfeeらの上記文献）を使用して、HPV11 E1が酵母中で自己会合し得るか否かを試験し、この相互作用に関係するE1のドメインをマッピングした（図１）。図1Aに見られるように、GAL4のDNA結合ドメイン(BD)に融合された全E1分子（アミノ酸1-649）からなる融合タンパク質は酵母株Y153中でUASGal誘導LacZリポーター遺伝子の転写を活性化することができる。E1のＮ末端71アミノ酸を欠いている更に短い融合タンパク質は転写を活性化せず、E1のＮ末端が転写活性化ドメインを含み得ることを示した。これらの短い融合タンパク質はGAL4活性化ドメイン(AD)に融合された全E1融合タンパク質との相互作用について試験するのに使用し得る（図1A）。全E1分子とのこれらの短い融合タンパク質の相互作用はほんの低く生じたが、バックグラウンド、β-ガラクトシダーゼのレベルより再現性良く高く（図1A及び示されていないデータ）、E1が酵母中で自己会合し得ることを示した。
【００６５】
一連の欠失を使用して相互作用ドメインをE1のＣ末端（アミノ酸353-649）にマッピングした。E1の自己会合をE1のＣ末端部分（アミノ酸330-649及び353-649）のみを含む融合タンパク質間で容易に検出することができた（図1B）。一連の欠失を使用してE1相互作用ドメインの位置の精度を高めた（図1B）。この方法で、64アミノ酸の長いE1相互作用ドメインをアミノ酸353-416の間で同定した（図1B）。この64アミノ酸ドメインを欠いたＣ末端E1フラグメント（アミノ酸435-649）はE1（330-649）と会合することができなかったが（図1B）、それはE2と相互作用する能力を保持した。小さいE1-E1相互作用ドメイン（353-416）は更に大きいE1フラグメント（330-649）と相互作用することができるだけでなく、それ自体と相互作用することができた（図1C）。この最後の結果は残基353-416がE1のホモタイプの相互作用に必要かつ十分であることを示した。E1（330-649）、又はそれ自体とのこの小さいドメインの相互作用は更に大きいE1フラグメント（353-649及び330-649）の間の相互作用よりも低いレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じた（図1C）。この結果はアミノ酸435-649の間の残基がE1との相互作用に十分ではないが、相互作用の強さに寄与し得るという概念と一致した。
【００６６】
自己会合における E1 の ATP 結合ドメインの役割（図２）
先に示した結果はE1の残基435-649（これらはE1-E1相互作用ドメインのＣ末端（353-416）に配置される）がまた酵母中でE1-E1相互作用の強さに寄与し得るという可能性を生じた。残基435-649はE1のATP結合ドメインを含むので、本発明者らはATP結合に関係する３種の高度に保存されたアミノ酸を突然変異させ、酵母中のE1の自己会合に関するこれらのアミノ酸置換の効果を試験した。これらの置換はE1のウォーカーＡモチーフ（P-ループ）の二つの残基を置換した。プロリン479をセリンにより交換し、リシン484をグルタミン酸及びグルタミンにより置換した。図２に見られるように、全ての３種の置換が酵母中のE1-E1相互作用を減少した。これらの結果はATP結合ドメインの保全性がE1タンパク質の自己会合に重要であることを示す。
【００６７】
in vitro のウイルス起点への結合に必要とされる E1 のドメイン（図３及び４）
酵母における先の研究はE1の少なくとも二つの領域が自己会合に関与することを示唆した：自己会合ドメイン（アミノ酸435-416）及びATP結合ドメイン。in vitroのE1オリゴマー化におけるこれらの二つの領域の役割を調べるために、本発明者らはHPV起点へのE1の結合を検出するアッセイを使用した。BPV E1との相似性により、本発明者らはE1のオリゴマー化が起点への結合後に起こると予想した。このアッセイでは、ウサギ網状赤血球溶解産物中の対にされた転写/翻訳により合成されるHPV11 E1タンパク質を２種の放射性DNAフラグメント（その一種がHPV11起点を含む）の混合物と共にインキュベートする。次いでこの反応で生成されるE1タンパク質-DNA複合体をE1の抗体で免疫沈殿させ、共沈したDNAをゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化する。これらの実験において、起点と複合体を形成することができる最小ドメインを特定するために、一連の切断型E1タンパク質を野生型タンパク質に加えて使用した。全てのE1タンパク質を同様のレベルで発現させた（データは示されていない）。
【００６８】
三つの観察を行なった。最初に、野生型E1を使用して、ごく少量のE1-ori複合体をアッセイの条件下で形成することができた（図3A）。これはおそらくこれらの反応液中に存在する大過剰の競合物質DNA（溶解産物をプログラムするのに使用されたプラスミドの形態）及び起点に関するE1の低い配列特異性のためである。第二に、本発明者らはＮ末端71残基を欠いている突然変異体E1タンパク質が野生型タンパク質と較べて起点に対する増大されたアフィニティー（約５倍）を有することを観察した（図3A）（本明細書中、以下E1*と称する）。Ｎ末端の欠失が起点に関するE1のアフィニティーを増大するメカニズムは依然として調べられている。起点への切断型E1分子の結合は特異性であった。何とならば、それがE1-DNA結合表面における二つの二重アミノ酸置換により影響されたからである（図3B）。これらの二つのアミノ酸置換は起点へのBPV-E1の結合を無効にするBPV-1 E1中のアミノ酸置換と同様であった（Thornerら, 1988, J. Virol. 62:2474-2482）。また、特異性が起点の三重突然変異がE1結合を減少することを示すことにより実証された（図3C）。この三重点突然変異は、DNase Iフットプリンティング分析により、起点のE1結合部位にあり、E1の結合に影響することが既に示されていた（Sunら, 1995, Virology 216:219-222）。行なった第三の観察は、起点に結合することができるE1の小さいドメインがアミノ酸191-649を含むことであった（図４）。Ｎ末端又はＣ末端におけるこのドメインの更なる欠失が起点結合を無効にした（図４）。これらの結果の最も簡単な解釈は起点へのE1の結合及びオリゴマー化がDNA結合表面（残基191と300の間に位置される）及びオリゴマー化ドメイン（アミノ酸353-649）を必要とすることである。
【００６９】
E1-E1 相互作用ドメインを含む融合タンパク質は起点への E1 の結合を抑制する（図５）
E1のアミノ酸353-431が起点におけるオリゴマー化に必要とされるE1-E1相互作用ドメインをコードする場合、このドメイン、その変異体、誘導体又はフラグメント単独が、過剰に与えられる時に、起点へのE1*（72-649）の結合をin transで抑制すると予想されるであろう。この仮定を試験するために、E1のフラグメント：353-416、353-431及び353-438をE.coli中で発現させ、チオレドキシンとの融合として可溶性形態で精製した。融合パートナーとしてのチオレドキシンの不在下で、全ての３種のE1フラグメントは不溶性であった（データは示されていない）。融合タンパク質はニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるそれらの精製を可能にするポリヒスチジン配列を含んでいた（図5A）。次いで３種の融合タンパク質を８μM（E1に対して約300倍のモル過剰）の濃度で起点へのE1*（72-649）の結合を抑制する能力について試験した。図5Bに見られるように、TRX-E1（353-431）及びTRX-E1（353-438）は起点への結合を抑制した。TRX-E1（353-416）は８μMの濃度で抑制性ではなかった。何とならば、おそらくこの融合タンパク質が重度に加水分解されるからであり、又はそれが２ハイブリッド研究により示唆されるようにE1に対する低いアフィニティーを有するからである（図2Bを参照のこと）。同じ条件下で、TRX単独は効果を有していなかった（図5B）。これらの実験において、夫々の融合タンパク質の２種の独立の製剤を同様の結果で試験した（図1A及び示されていないデータ）。TRX-E1（353-431）に関する50％抑制濃度を測定して、約３μMであった（図5C）。これらの結果は領域Ａが起点におけるE1オリゴマー化に必要とされ、かつE1（353-431）がE1-E1相互作用ドメインをコードするという概念を強化した。
【００７０】
起点結合における ATP 及び E1 ATP 結合ドメインの役割（図６及び７）
酵母中のE1の自己会合は無傷のATP結合ドメインを必要とするので（上記を参照のこと）、本発明者らはin vitroのE1-Ori複合体形成におけるATP/Mgの役割を調べた。結合反応に夫々5mM及び3mMの濃度のATP/Mgを補給することにより、これを行なった。反応を三つの異なる温度（４、23及び37℃）で行なった。図6Aに見られるように、ATP/Mgの不在下で、起点へのE1の結合が高温（37℃）で著しく減少された。高温によるこの抑制はATP/Mgの添加により軽減できた（図6A）。低温（23℃及び４℃）で、ATP/Mgは適度の効果を有しているにすぎなかった。マグネシウムと組み合わせてのヌクレオチドの異なる型を、起点へのE1の結合を刺激するそれらの能力について試験した。AMP又はアデノシンではなく、ADPがATPに置換し得る（図6B）。同様に、３種のその他のヌクレオチド（CTP、GTP、UTP）並びに全ての４種のデオキシヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、TTP）が起点への結合を刺激することができた（図6C）。２種の非加水分解性同族体、ATP-γ-S及びGTP-γ-Sがまた刺激性であり、その加水分解ではなく、基質の結合がE1が起点に結合するのに必要であることを示した（図6C）。
【００７１】
E1のATP結合ドメイン中のアミノ酸置換を、起点へのE1結合に関するそれらの効果について試験した（図７）。或る種の置換がウォーカーＡモチーフの高度に保存された残基に影響し（図7A）、これはおそらく基質ヌクレオチドのトリホスフェートテール（Gorbalenya及びKoonin, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:419-429）の結合に関係している。図7Bに見られるように、酵母中のE1自己会合を阻止したもの（P479S、K484Q及びK484E）を含む、これらの置換が起点へのE1結合を減少した。先に示された結果と一緒になって、これらの知見はATP結合がE1が起点に結合するのに必要であることを示す。
これらの実験において、本発明者らはまたモチーフＣ中の高度に保存された残基並びにE1のフェニルアラニンを交換する効果を試験した。これらの残基はスーパーファミリー３の員間で保存されるが、それらの機能は知られていない。図7Bに示されるように、アラニンによるこれらのアミノ酸の置換は起点へのE1の結合を無効にせず、それらがこのプロセス及びATP結合に必須ではないことを示した。
【００７２】
E1 の保存領域Ａは E1 が起点に結合するのに必要とされる（図８）
酵母中でマッピングされたE1-E1相互作用ドメインはアミノ酸353-416を含んでいた。E1のこの領域は種々のパピローマウイルスのE1とSV40及びポリオーマウイルスの大きいＴ抗原（Clertant及びSeif, 1984）の間の高い配列類似性の４つの領域の一つである保存領域Ａを含む。この領域がE1が起点に結合するのに必須であることを測定するために、６つの独立のアミノ酸置換をこのドメイン中で生じ（F378A、Y380A、N389A、A390G、F393A、Q399A）（図8A）、E1-Ori複合体形成に関するそれらの効果について試験した。６種の置換のうちの４種がパピローマウイルスとポリオーマウイルスの間で不変である残基に影響する（N389A、A390G、F393A、Q399A）（図8A）。その他の２種の置換（F378A及びY380A）が大きいＴ抗原中の亜鉛結合モチーフの部分を形成する疎水性残基に影響し（図8A）、これがオリゴマー化に必要とされる（Loeberら, 1991, J. Virology, 65(6):3167-3174）。この亜鉛フィンガーモチーフはパピローマウイルス中に保存されないが、F378及びY380は、大きいＴ中の類似の領域のように、αらせんに折り畳むと予想されるE1の領域にある（データは示されていない）。起点へのこれらの突然変異体E1の結合を補給ATP/Mgの不在下で23℃で、またATP/Mg（夫々、5mM及び3mM）を補給した反応液中で37℃で両方でアッセイした。条件の両方の組のもとで、結果は非常に似ていた。置換の３種、Y380A、N389A、及びF393Aが起点へのE1の結合を著しく減少した（図8B）。２種のその他の置換、A390G及びQ399Aがまた有害であり、起点へのE1の結合のわずかに適度の量をもたらした。唯一の置換、F378Aが起点へのE1結合に殆ど効果を有していなかった。これらの結果はE1の保存領域Ａの構造保全性がE1が起点に結合するのに必要とされることを示した。
【００７３】
E1 の保存領域Ａが E1-E2-Ori ３成分複合体の形成に必要とされる（図 9A ）
E1の保存領域Ａが起点へのE1のE2依存性結合に必要とされるか否かを試験するために、上記のE1起点結合アッセイと同様のアッセイを下記の変化とともに使用した。in-vitro翻訳によりつくられたE2を反応に入れ、完全長E1（1-649）を使用する。図9Aに見られるように、
置換の３種（Y380A、N389A、F393A）が複合体形成を著しく減少した。２種のその他の置換（A390G及びQ399A）はそれ程顕著ではない効果を有していた。一種の置換、F378AのみがE1-E2-Ori複合体形成に適度の効果を有していた。これらの結果は保存領域Ａの構造保全性がE1-E2-Ori３成分複合体の形成に必要であることを示す。
【００７４】
一時的 HPV DNA 複製に関する E1 の保存領域Ａ中の置換の効果（図 9B ）
保存領域Ａ中に置換を有する突然変異体E1タンパク質を、E2と一緒に、一時的にトランスフェクトされた細胞中で起点を含むプラスミドの複製を支持するそれらの能力について試験した。図9Bに見られるように、E1突然変異体の３種、F378A、A390G、及びQ399Aは、A390G及びQ399Aの場合に野生型E1と較べて低下されたレベルであるがHPV DNA複製を支持することができた。E1突然変異体の３種、Y380A、N389A、及びF393Aは複製を支持することができなかった。これらの結果はE1の保存領域Ａが一時的HPV DNA複製に必要とされることを示した。一時的HPV DNA複製を支持するE1突然変異体の能力はE2の不在下又は存在下で起点に結合するそれらの能力と良い相関関係があった（上記を参照のこと）。これらの実験における潜在的な注意は、種々のE1突然変異体タンパク質の安定性が、野生型のそれと比較して、E1の発現の低レベルのために評価し得なかったことである（データは示されていない）。それ故、幾つかの突然変異体タンパク質で観察された複製の低レベルはまたタンパク質蓄積に関する効果に関係し得ることが可能である。
【００７５】
実施例 10 ：組換え E1 タンパク質を使用する E1 オリゴマー化アッセイ
そのアッセイは実施例９に示されたものと同じであるが、バキュロウイルス感染Sf21昆虫細胞中で生成された組換え精製His標識HPV11 E1*（72-649）75ng及び競合物質としてのプラスミドDNA200ngを用いて行なった。また、CHAPSを0.15％の最終濃度まで結合混合物に添加した。
【００７６】
実施例11：組換えE1*（72-649）の精製
E1*をヒスチジン標識（６ヒスチジン）E1*（72-649）を発現する組換えバキュロウイルスによる感染によりSf21昆虫細胞中で生成した。感染細胞を感染の48時間後に遠心分離により回収し、次いで細胞ペレットの体積を測定した。細胞ペレットをドライアイスで凍結し、-80℃で貯蔵した。
精製のために、細胞ペレットを解凍し、１倍容積の（ペレットの体積に対し）低張緩衝液Ａ（20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 5mM KCl; 1mM MgCl2;鎮痛薬、ロイペプチン、１μg/mlのペプスタチン及び1mMのペファブロック）中で再度懸濁させた。氷の上で15分のインキュベーション後に、細胞懸濁液を乳棒Ｂで20ストロークのドウンスホモジナイザーにかけた。次いで核を20分間にわたって４℃で2500gで遠心分離により回収し、1.4倍容積（初期の細胞ペレット体積に対し）の緩衝液Ｂ（20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 鎮痛薬、ロイペプチン、２μg/mlのペプスタチン及び2mMのペファブロック）中で再度懸濁させた。次いで1.4倍容積の緩衝液Ｃ（20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 900mM NaCl）を添加し、懸濁液を混合し、ゆすりながら４℃で30分間インキュベートした。次いで抽出物を45分間にわたって４℃で148000gで遠心分離してデブリをペレットにした。上澄みを回収し、グリセロールを10％の最終濃度までそれに添加し、その後それをドライアイスで凍結し、クロマトグラフィーまでそれを-80℃で貯蔵した。
クロマトグラフィーのために、細胞抽出物を解凍し、ニッケルを仕込み、20mMトリス-HCl pH 8.0; 5mMβ-メルカプトエタノール; 500mM NaCl; 10％のグリセロールで平衡にした5mlのハイ-トラップカラム（ファーマシア・バイオテク）に装填した。抽出物の装填後に、カラムを7-8倍容積の150mMイミダゾールを含む平衡緩衝液で洗浄した。次いで結合されたE1*タンパク質を250mMイミダゾールを含む平衡緩衝液で溶離した。
【００７７】
実施例12：in vitroのE1のオリゴマー化
in vitroのE1オリゴマー化を検出するために、本発明者らはスルフヒドリル反応架橋剤ビスマレイミドヘキサン（BMH、ピアス）による架橋を使用した。in-vitro転写/翻訳（TNT結合型網状赤血球溶解産物系、プロメガ）によりつくられた35S標識E1*タンパク質（72-649）を１時間にわたって二つの異なる温度、23℃及び37℃で50ng/mlの一本鎖(ss)DNA（60mer、HPV-11起点のヌクレオチド7902-34に相当する）の存在下又は不在下でインキュベートした（最終結合条件：20mMトリスpH 7.6、100mM NaCl、1mM DTT、5mM ATP、3mM MgCl2を含む37.5μlの最終容積中12.5μlの翻訳E1）。結合反応液を100μMのBMHを含むリン酸塩緩衝液（0.1M pH 7.0）で13倍に希釈することにより、架橋を行なった。架橋反応を１分後に2.5mMの最終濃度までのDTTの添加により停止した。次いでE1タンパク質をHPV-11のＣ末端14アミノ酸に対し誘導されたポリクローナル抗体で免疫沈殿させ、ゲル電気泳動（３％ウェーバー-オズボーンポリアクリルアミドゲル〔Weber及びOsborn, 1969〕）及びオートラジオグラフィーにより分析した。これらの条件下で、一本鎖DNAはオリゴマーへのE1の架橋を大いに刺激した（図10）。E1のオリゴマーに相当する５種の異なるタンパク質バンドをモノマーE1の他に観察した。これらのE1オリゴマー種は、分子量標準物質と比較した場合に、２量体、３量体、４量体、５量体及び６量体について予想された位置に移動した（データは示されていない）。架橋実験を切断型E1タンパク質（以下を参照のこと）を用いて行い、それ故、網状赤血球からのタンパク質がこれらの複合体の部分であることを除外した場合に、同じことがまた真実であった。一緒になって、これらの結果はHPV-11 E1が一本鎖DNAを結合した後に６量体を形成する能力を有することを示す。最後に、本発明者らはE1のオリゴマー化がHPV起点から誘導されないss DNAオリゴヌクレオチドにより刺激されることを示し、ss DNAへのE1の結合が大いに配列非依存性であることを示した（データは示されていない）。
【００７８】
E1 のＣ末端がオリゴマー化に十分である
次いで本発明者らはin-vitro翻訳によりつくられた切断型E1タンパク質（図11）の組を使用してオリゴマー化できるE1の最小ドメインをマッピングした。E1の残基353-649がin vitroでオリゴマーを形成するのに十分であることがわかった。重要なことに、E1（330-649）及びE1（353-649）のオリゴマー化のレベルは一本鎖DNAの不在下でさえもかなりであり、ss DNAの添加により増大されなかった。E1のＣ末端が“構成的に”オリゴマー化するという事実は、このドメインが、完全タンパク質とは対照的に、酵母２ハイブリッド系中で容易に自己会合し得る理由についての一見信頼できそうな説明を与える。オリゴマー化がss DNAに依存性である最小E1タンパク質はアミノ酸191-649を含んでいた。それ故、残基191-330の間の領域がＣ末端ドメイン（330-649）のオリゴマー化を抑制し、ss DNA応答性を与えるのに重要な役割を果たすことが明らかである。
【００７９】
オリゴマー化に関する E1 の ATP 結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果
オリゴマー化に十分であるE1の領域（残基353-649）はATP結合ドメインを含む。本発明者らはATP結合に関係する高度に保存された残基を変化する突然変異の効果を試験することによりE1のオリゴマー化に関するATP結合ドメインの役割を調べた。in vitro翻訳により合成された、これらの突然変異体E1*タンパク質（72-649）は、E1及びNTP結合タンパク質のスーパーファミリー３のその他の員のATP結合ドメインを特性決定する三つのモチーフ（Ａ、Ｂ及びＣと称される）の一つ中にアミノ酸置換を有する（図12A）。モチーフＡ及びＢは古典的ウォーカーＡモチーフ及びＢモチーフに相当し、これらは一緒にATPをマグネシウムキレートとして結合する。ホスフェート結合ループ（P-ループ）としても知られている、モチーフＡ中の残基はATPのトリホスフェートテールと相互作用する。モチーフＢは基質ヌクレオチドと会合したマグネシウムイオンに配位するのに関係する。保存モチーフＣの正確な機能は知られていないが、それはまたATPを結合するのに関与し得ることが示唆された。高度に保存された残基、F509（これはモチーフＢとＣの間にあり、その機能が知られていない）が突然変異された別の突然変異体E1*タンパク質をまた試験した。F509A置換を除いて、全てのその他の置換がE1オリゴマー化を種々の程度に減少した（図12B）。
【００８０】
モチーフＡ中の置換は更に大きい効果を有し、P-ループの構造保全性がオリゴマー化に必須であることを示した。モチーフＢ又はＣ中の置換はオリゴマー形成を減少したが、それを完全には無効にしなかった。一緒になって、これらの結果はE1のATP結合ドメインの構造保全性がオリゴマー化に必須であることを示す。ATP結合ドメインはATPを結合するのに必要とされ、これがオリゴマー化をアロステリック調節することができた。また、又は加えて、ATP結合ドメインの保全性は完全Ｃ末端ドメインの適当な折り畳み／安定性に必要とされた。しかしながら、K484E及びK484Qを除いて、オリゴマー化に影響する置換の全てがE2への結合に影響しないという事実（Titoloら, 1999）は、これらの置換がＣ末端ドメインの全構造を著しく変化させないことを示唆する。
【００８１】
E1 オリゴマー化の保存領域Ａ中のアミノ酸置換の効果
次に本発明者らは架橋アッセイを使用してタンパク質のオリゴマー化に関するそれらの効果についてE1の保存領域Ａ中のアミノ酸の効果を試験した。６種の突然変異体E1*タンパク質をin vitro翻訳により合成し、上記のようにss DNAの存在下でオリゴマー化について試験した。試験した６種の突然変異体のうちの３種、Y380A、N389A及びF393Aがこのアッセイで重度に欠陥であった（図13）。予想されたように、これらはまたHPV起点における結合／オリゴマー化に重度に欠陥である同じ３種の突然変異体タンパク質である（図９）。これらの結果はE1の保存領域Ａがオリゴマー化に必要とされるという概念を強化する。
結論
理論により束縛されたくないが、本件出願人は本明細書に示された結果は配列番号２、配列番号３、又は配列番号４により特定された領域がE1オリゴマー化に必要である領域であることを示すものと考える。それ故、この領域はPV感染症の治療のためにPV DNA複製を抑制するための標的として利用し得る。
【００８２】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 タンパク質間相互作用に必要なE1タンパク質領域をマッピングするのに使用した酵母２ハイブリッド系中のE1-E1相互作用の結果を示す。この系では、GAL4活性化ドメイン（AD）と完全長E1タンパク質（アミノ酸1-649；配列番号１）の融合生成物がHPV11 E1タンパク質のＮ末端にある一連の欠失及びGAL4のDNA結合ドメイン（BD）を含む融合タンパク質と同時トランスフェクトされる。高転写活性はGAL4転写活性を可能にするようにハイブリッド分子中の２種のタンパク質の相互作用がGAL4 AD及びBDを接近させるのに十分に相互作用する場合にのみ存在する。E1タンパク質のダイヤグラムが図の上部に示される。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと標識された灰色ボックスはSV40及びポリオーマウイルスからの大きいＴ抗原との高い配列類似性を有するE1の領域を示す。黒色ボックスはE1のDNA結合ドメイン及びATP結合ドメインの位置を示す。これらの融合タンパク質中に含まれるE1の部分が示される。β-ガラクトシダーゼ活性のレベルが２種のプラスミド、GAL4 BD融合タンパク質及びGAL4 AD融合タンパク質で同時トランスフェクトされた酵母細胞中で測定される。注目されるように、BDハイブリッド分子中のE1Ｎ末端の最初の71アミノ酸が除去されてこのE1アミノ酸領域内の活性化ドメインの存在によるLacZリポーター遺伝子の転写を回避した。
【図１Ｂ】 保存領域Ａ〜Ｄの位置を示すＣ末端E1タンパク質のダイヤグラムを示す。一連のＣ末端欠失を有するＮ末端切断型E1分子がGAL4 ADに
融合され、GAL4 BDに融合されたＮ末端切断型E1（配列番号１の330-649）と同時トランスフェクトされる。これらの融合タンパク質中に含まれるE1の部分、並びにβ-ガラクトシダーゼ活性のレベルが示される。この実験では、タンパク質フラグメント（353-416；配列番号４）を含む融合生成物が測定できるβ-ガラクトシダーゼ活性をもたらすことが示される。
【図１Ｃ】 酵母中のE1フラグメントの自己会合を示す。Ｎ末端切断及びＣ末端切断を有する３種の異なるE1フラグメントが酵母２ハイブリッド系中で試験される。比較のために、夫々のE1-AD融合がまたGAL4-BDに融合されたE1（配列番号１の330-649）又はGAL4-BD単独との相互作用について試験された。得られたβ-ガラクトシダーゼ活性のレベルはE1領域（アミノ酸353-416；配列番号４）が自己会合並びに更に大きいE1タンパク質領域（配列番号１の330-649）との相互作用に十分であることを示す。
【図２】 E1-E1相互作用に関する保存ATP結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果を示す。酵母２ハイブリッド系を使用して、β-ガラクトシダーゼ活性がGAL4-ADに融合された野生型E1（330-649）及び野生型E1（353-649；配列番号５）又はGAL4-BDに融合された突然変異体誘導体〔P479S（配列番号６）、K484E（配列番号７）及びK484Q（配列番号８）〕で同時トランスフェクトされた酵母中で測定された。GAL4-AD及びGAL4-BD単独を含むプラスミドが対照のために使用された。E1のウォーカーＡモチーフ（P-ループ）中の置換がβ-ガラクトシダーゼ活性の量を減少することが示され、これらの置換はE1が自己会合する能力を悪化することを実証する。
【図３Ａ】 HPVのDNA複製起点へのE1の結合を監視するアッセイの結果を示す。タンパク質-DNA複合体が野生型E1（アミノ酸1-649；配列番号１）、もしくはＮ末端切断型E1（E1*＝アミノ酸72-649、配列番号78）で形成され、又はE1の不在下（-E1）で形成された。E1-DNA複合体がE1に対し誘導された抗体で免疫沈殿され、結合反応に使用されたプローブの量の0.5％と一緒に、共沈したDNAが電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化された。オートラジオグラフィーはＮ末端切断型E1（配列番号78）タンパク質が完全長E1タンパク質よりも起点に対する高いアフィニティーを有することを示す。矢印は起点を含むプローブのフラグメントを示す。
【図３Ｂ】 DNA同時免疫沈殿アッセイを使用して起点へのE1の結合に関するE1のDNA結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果を示す。E1中の二つの異なる二重アミノ酸置換の位置がアミノ酸280と300の間のE1の一次配列と一緒に示される。結合反応が図3Aについて記載されたようにして行われた。オートラジオグラフの結果はこれらの置換が起点へのE1の結合を無効にしたことを示す。
【図３Ｃ】 起点へのE1の結合に関するHPV-11中の三重ヌクレオチド突然変異の効果を示す。HPV-11起点が三つのE2結合部位（“E2”と標識された黒色ボックス）、E1結合部位（灰色ボックス）及びATに富む領域（開いたボックス）とともに図示される。E1結合部位の一部の配列が突然変異体起点中の三つのヌクレオチド変化の位置とともに示される。結合反応が図3Aについて記載されたようにして行われた。オートラジオグラフはHPV複製起点中の三重突然変異の存在が起点へのE1タンパク質の結合を抑制したことを示す。
【図４Ａ】 in vitroのウイルスDNA複製起点への結合に必要とされるE1のドメインをマッピングするために生じた一連の欠失の略図を示す。切断型E1タンパク質がin vitroで生成され、図3Aに記載されたようにしてウイルス起点への結合についてアッセイされた。E1のＣ末端に対し誘導されたポリクローナル抗体を使用して、Ｎ末端切断型タンパク質が免疫沈殿された。Ｃ末端切断型タンパク質がそれらのＮ末端でFLAGエピトープで標識され、抗FLAGモノクローナル抗体を使用して免疫沈殿された。
【図４Ｂ】 4Aに示された欠失の結果を示す。オートラジオグラフは起点への結合に必要なE1の領域がE1-E1オリゴマー化に必要な本発明のアミノ酸を含むアミノ酸191-649を含むことを示す。Ｃ末端における欠失が起点結合を無効にする。
【図５Ａ】 E.coli中で発現され、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたE1の示された部分を含むチオレドキシン（TRX）融合タンパク質のクーマシーブルーで染色されたSDS-PAGEを示す。夫々のフラグメントのアミノ酸領域がレーンの上部に示される。夫々の融合タンパク質について、２種の独立の製剤が分析された。
【図５Ｂ】 ウイルス起点へのE1（配列番号１の72-649）の結合に関する過剰のTRX-E1融合生成物の効果を示す。結合反応が図4Aに記載されたようにして行われた。TRX融合タンパク質、又はTRX単独が約８μMの濃度（これはE1（72-649）に対し300倍のモル過剰に相当する）で結合反応液に添加された。融合分子TRX-E1（353-431；配列番号３）は最高の抑制効果を示し、フラグメントTRX-E1（353-416；配列番号４）は明らかな抑制を示さなかった。TRX単独は起点への測定できる結合を示さなかった。
【図５Ｃ】 起点へのE1の結合に関するTRX-E1（353-431；配列番号３）融合分子の異なる濃度の効果を示す。次第に減少する濃度のTRX-E1（353-649；配列番号５）が使用されて、この融合タンパク質がウイルス起点へのE1の結合を抑制するIC50を推定した。このデータから、IC50が約３μMと推定された。
【図６Ａ】 ウイルス起点へのE1*の結合に関する温度及びヌクレオチドの効果を示す。ウイルス起点へのE1*（配列番号78）の結合が３種の異なる温度（４℃、23℃及び37℃）で、また夫々5mM及び3mMの濃度のATP/Mgの存在下（+ATP/Mg）又は不在下（-ATP/Mg）で行われた。ATP/Mgの不在下で、起点へのE1の結合は４℃で部分的に抑制され、23℃で変化されず、また37℃で著しく減少された。37℃におけるATP/Mgの添加がこの温度関連効果を反転する。
【図６Ｂ】 マグネシウムと組み合わせてのADP及びATPのみが起点へのE1の結合を刺激することができることを示す。起点へのE1の結合がヌクレオチドの不在下（-nuc）又は5mMの濃度の示されたヌクレオシドトリホスフェートの存在下で行なわれた。“Adeno”はアデノシンを示し、また“cAMP”は環状AMPを示す。
【図６Ｃ】 ヌクレオチドの不在下（-nuc）及びヌクレオチド（CTP、GTP及びUTP）及びデオキシヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP及びdTTP）の存在下における起点へのE1の結合の効果を示す。オートラジオグラフの結果はヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドが起点へのE1の結合を刺激することができることを示す。非加水分解性類似体（ATP-γ-S及びGTP-γ-S）がまた刺激性であり、その加水分解ではなく基質の結合が起点へのE1結合に必要であることを示す。
【図７Ａ】 E1タンパク質の略図を示す。灰色ボックスはSV40及びポリオーマウイルスからの大きいＴ抗原との高い配列類似性を有する領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ、並びにDNA結合ドメインの位置を示す。NTP結合タンパク質のスーパーファミリー３の員中に存在する保存モチーフＡ及びＣの位置がSV40Ｔ抗原、BPV-1及びHPV-11並びにHPV-6bからのこれらのモチーフの配列とともに示される。夫々のモチーフのコンセンサスアミノ酸配列が示される。突然変異された残基が矢印により示される。
【図７Ｂ】 図4Aに記載されたようにしてウイルス起点への結合について試験された、E1*（配列番号78）、又は示された突然変異体誘導体の結果を示す。結果はＡモチーフ中の保存残基中の置換が起点に結合するE1の能力を低下したことを示し、E1へのATP結合が起点へのE1結合に重要であることを示す。モチーフＣ中の置換は起点へのE1の結合に影響しないことが明らかであった。
【図８Ａ】 ウイルス起点へのE1の結合に関するE1の保存領域Ａ中の置換の効果を示す。灰色ボックスはポリオーマウイルスからの大きいＴ抗原との高い配列類似性を有する領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ、並びにDNA結合ドメインの位置を示すE1タンパク質の略図。SV40Ｔ抗原、BPV-1及びHPV-11からの保存領域Ａの配列が示される。この領域の高度に保存された残基が灰色でボックスにされる。突然変異された残基がまた示される。
【図８Ｂ】 起点へのE1の結合に関する、領域Ａ中の６種の独立の置換の効果を示す。E1*（配列番号78）、又は示された突然変異体誘導体が図4Aに実質的に記載されたようにしてウイルス起点への結合について試験された。結合反応が23℃で補給ATP/Mgの不在下で、又は37℃で夫々5mM及び3mMの濃度のATP/Mgで補給された反応液中で行なわれた。試験した全ての６種の置換が結合を減少し、保存領域ＡがE1が起点に結合するのに重要であることを示す。
【図９Ａ】 in vitroのE1-E2-Ori複合体の形成、及び細胞中の一時的HPV DNA複製に関するE1の保存領域Ａ中の置換の効果を示す。in vitroのE1-E2-Ori複合体の形成に関する効果。DNA-タンパク質複合体がE1なしに（-E1）、又は野生型E1（1-649；配列番号１）もしくは保存領域Ａ中に置換を有する示された突然変異体E1とともに構築された。複合体がE1に対し誘導された抗体で免疫沈殿され、結合DNAが電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化された。置換のうちの３種、Y389A（配列番号９）、F393A（配列番号10）及びN389A（配列番号11）が複合体形成のかなりの減少を示す。２種の置換A390G（配列番号12）及びQ399A（配列番号13）がそれ程顕著ではない効果を示し、また置換F378A（配列番号14）が適度の効果を示すことが明らかである。これらの結果はこの保存Ａ領域がE1-E2-ori複合体の形成に役割を果たすことを示す。
【図９Ｂ】 一時的HPV複製に関する６種の置換の効果を示す。複製された起点を含むプラスミド（ori）、又は内部対照プラスミド（E1発現プラスミド、E1）の量が定量PCR分析により検出された。PCR増幅がE1を発現するプラスミド（-E2）でトランスフェクトされた細胞、又はE2及びE1（野生型もしくは示された突然変異体E1タンパク質）を発現するプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞から単離されたゲノムDNAについて行なわれた。全ての細胞がまた起点を含むプラスミドpN9でトランスフェクトされた。PCR産物が電気泳動及びオートラジオグラフィーにより視覚化された。置換F378A（配列番号14）、A390G（配列番号12）及びQ399A（配列番号13）を含む突然変異体E1タンパク質が複製の低下されたレベルを示し、３種のその他の突然変異体が証明できる複製活性を示さなかった。これらの結果は領域Ａが一時的HPV DNA複製に重要であることを示す。
【図１０】 E1*の単量体(1)、２量体(2)、３量体(3)、４量体(4)、５量体(5)及び６量体(6)にサイズが相当するオリゴマーの形成を示す放射能標識E1*の架橋。一本鎖DNAが反応に添加される場合（＋）、E1*オリゴマーの形成が刺激される。オリゴマーは架橋剤BMHの存在下（＋）でのみ検出される。
【図１１】 切断型放射能標識E1タンパク質の架橋。このアッセイに使用した種々の切断型タンパク質がパネルＡに図示される。架橋実験の結果がパネルＢに示される。架橋がss DNAの存在下（＋）又は不在下（−）で実施例12に記載されたようにして行なわれた。
【図１２】 オリゴマー化に関するE1*のATP結合ドメイン中のアミノ酸置換の効果。E1*ATP結合ドメイン中でつくられた種々のアミノ酸置換の位置がパネルＡに要約される。ss DNAの存在下のこれらの突然変異体E1*タンパク質（72-649）の架橋から得られた結果がパネルＢに示される。
【図１３】 オリゴマー化に関するE1*の保存領域Ａ中のアミノ酸置換の効果。夫々が保存領域Ａ中に単一アミノ酸置換を有する、６種の異なるE1*タンパク質（ゲルの夫々のレーンの上に示される）が実施例12に記載されたようにしてss DNAの存在下でオリゴマー化するそれらの能力について架橋により試験された。
【配列表】
Claims (15)
- HPV-11からのE1タンパク質のアミノ酸配列に従ってナンバリングしてアミノ酸353-438からなるポリペプチド。
- HPV-11からのE1タンパク質のアミノ酸配列に従ってナンバリングしてアミノ酸72-649からなるポリペプチド。
- 配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号78に示されるアミノ酸配列により特定されるポリペプチド。
- a.配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号78からなる群から選ばれるE1タンパク質をDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートしてE1タンパク質及びDNAに複合体を形成させる工程、
b.前記E1タンパク質/DNA複合体を複合体形成しなかったDNAから単離する工程、
c.前記DNAを検出する工程（DNAの存在はE1タンパク質のPV起点への結合を示し、従ってE1オリゴマー化と相関関係がある）
を含むことを特徴とするオリゴマー化アッセイ。 - E1オリゴマー化を抑制することができる薬剤のスクリーニング用のアッセイであって、このアッセイが請求の範囲第４項記載の工程を含み、更に
a.薬剤を請求の範囲第４項において特定される前記E1と接触させ、その後にDNAフラグメントと合わせ、所定の時間の期間にわたってインキュベートしてE1タンパク質/DNAに複合体を形成させる工程、及び
b.これらの結果を対照サンプルと比較する工程（対照サンプルは同様に処理されるが、前記薬剤が添加されない）
を含むことを特徴とするアッセイ。 - 前記DNAがE1結合の特異性を増進する複製起点を含む請求の範囲第４項記載のアッセイ。
- 前記E1を２種のDNAフラグメントの混合物と合わせる請求の範囲第６項記載のアッセイであって、前記DNAフラグメントの一種は複製起点を含み、また第二のフラグメントは異なる長さのDNAからなるため前記起点を含むDNAから区別でき、かつ前記起点を含むDNAに結合されたE1の量が非特異的結合の量と比較し得るアッセイ。
- 前記E1-DNA複合体が、カラムクロマトグラフィー、遠心分離、抽出、濾過、免疫沈澱により、又はE1タンパク質に対して誘導された抗体を使用して固体担体に固定することにより遊離DNAから単離される請求の範囲第４項記載のアッセイ。
- 前記抗体を前記固体担体に固定して遊離DNAが培養培地と共に除去されるようにすることにより前記E1-DNAが単離される請求の範囲第８項記載のアッセイ。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第８項記載のアッセイ。
- 前記複合体形成したDNAを前記E1/DNA複合体から放出し、その後に前記DNAを検出する請求の範囲第４項記載のアッセイ。
- 前記DNAを放射性同位元素で標識し、ゲル電気泳動、続いて放射性像形成により検出する請求の範囲第１１項記載のアッセイ。
- 前記DNAを比色色素で標識し、分光光度で検出する請求の範囲第１１項記載のアッセイ。
- 前記アッセイをATP/Mgの存在下又は不在下で低温で行う請求の範囲第４項又は第５項記載のアッセイ。
- 前記アッセイをATP/Mgの存在下で高温で行う請求の範囲第４項又は第５項記載のアッセイ。
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