ES2345053T3 - Ensayo cuantitativo para la deteccion de arn recientemente sintetizado en un sistema libre de celulas e identificacion de inhibidores de la sintesis de arn. - Google Patents
Ensayo cuantitativo para la deteccion de arn recientemente sintetizado en un sistema libre de celulas e identificacion de inhibidores de la sintesis de arn. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para determinar si un compuesto de ensayo inhibe la síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva, que comprende: poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado; detectar la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marca- do; cuantificar la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo; comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de una población de ARN recientemente sintetizado de control que comprende el análogo nucleotídico marcado producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad del ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
Description
Ensayo cuantitativo para la detección de ARN
recientemente sintetizado en un sistema libre de células e
identificación de inhibidores de la síntesis de ARN.
Esta Solicitud reivindica la prioridad de la
Solicitud provisional U.S. 60/555.765 presentada el 6 de enero de
2003.
El HCV es una de las causas más diagnosticadas
de enfermedad hepática crónica de los Estados Unidos de América,
que da cuenta de alrededor de 15 por ciento de hepatitis vírica
aguda, 60 a 70 por ciento de hepatitis crónica, y hasta 50 por
ciento de cirrosis, enfermedad hepática de etapa terminal, y cáncer
de hígado. Casi 4 millones de norteamericanos, o 1,8 por ciento de
la población de los Estados Unidos de América, tiene anticuerpos
frente a HCV (es decir, anticuerpos anti-HCV),
indicando una infección en curso o previa con el virus. La hepatitis
B provoca 8.000 a 10.000 muertes anualmente en los Estados Unidos
de América. Mientras que la fase aguda de la infección por HCV se
asocia habitualmente con síntomas leves, algunas pruebas sugieren
que sólo alrededor de 15% a alrededor de 20% de las personas
infectadas evitará HCV.
HCV es un virus de ARN pequeño, con cubierta,
monocatenario de cadena positiva en la familia del Flaviviridae. El
genoma incluye aproximadamente 10.000 nucleótidos y codifica una
única poliproteína de alrededor de 3.000 aminoácidos. Todos los
productos proteicos de HCV son producidos mediante escisión
proteolítica de la poliproteína, llevada a cabo por una de tres
proteasas: la peptidasa señal del hospedante, la metaloproteinasa
vírica que se autoescinde (NS2), y la serina proteasa vírica
(NS3/4A). La acción combinada de estas enzimas produce las
proteínas estructurales (C, E1 y E2) y proteínas no estructurales
(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, y NS5B) que se requieren para la
replicación y empaquetamiento del ARN genómico vírico. NS5B es la
ARN polimerasa dependiente de ARN (RDRP) que es responsable de la
conversión del ARN genómico de entrada en una copia de hebra
negativa (ARN complementario, o ARNc); el ARNc sirve entonces como
mueble para la transcripción mediante NS5B del ARN
genómico/mensajero de sentido positivo. La HCV replicasa es el
complejo de proteínas que son necesarias para la síntesis exacta y
eficaz de ARN de replicón vírico.
Actualmente, la única terapia eficaz frente a
HCV es alfa-interferón, que reduce la cantidad de
virus en el hígado y en la sangre (por ejemplo, carga viral) en
sólo una pequeña proporción de pacientes infectados. Sin embargo,
ahora las formas estándar de interferón están siendo sustituidas por
interferones pegilados (peginterferones), alfa interferones que se
han modificado químicamente por adición de una gran molécula inerte
de polietilenglicol. Actualmente, el régimen óptimo que incluye
interferón parece ser un uso de 24 ó 48 semanas de una combinación
de alfa interferón pegilado y el nucleósido ribavirina, un agente
antiviral oral que tiene actividad frente a un amplio intervalo de
virus. No obstante, las tasas de respuesta a la terapia de
combinación de interferón/ribavirina pueden ser moderadas para
ciertos genotipos de HCV, es decir, una tasa de respuesta de
alrededor de 50% a alrededor de 60%, aunque típicamente las tasas
de respuesta para genotipos seleccionados de HCV (principalmente
genotipos 2 y 3) son mayores. Otro inconveniente de la terapia
actual es que a menudo hay efectos secundarios adversos
significativos asociados con cada uno de estos agentes, que
incluyen, por ejemplo, síntomas parecidos a la gripe; efectos
supresores de la médula ósea; efectos neuropsiquiátricos tales como
irritabilidad acentuada, ansiedad, cambios de personalidad,
depresión, e incluso suicidio o psicosis aguda; efectos secundarios
similares a la histamina; y anemia.
Tomados juntos, los hechos anteriores indican
una necesidad significativa de inhibidores eficaces de pequeñas
moléculas de la replicación de HCV que no sufran los inconvenientes
mencionados anteriormente. Una clase particularmente útil de
inhibidores de HCV, así como de otros virus de ARN de hebra
positiva, son los inhibidores de la síntesis de ARN vírico.
Aunque los ensayos exactos y eficaces para
identificar inhibidores de la síntesis de ARN del HCV pueden ser
herramientas útiles para identificar tratamientos eficaces de HCV de
pequeñas moléculas, no se ha desarrollado tal sistema. Se ha dado a
conocer un ensayo de replicación in vitro que usa NS5B
polimerasa recombinante. Sin embargo, en este sistema, la forma
purificada de NS5B polimerasa careció de especificidad por el molde
y produjo diversas longitudes de productos de ARN. Estos fenómenos
son muy diferentes de la replicación de ARN de HCV in vivo.
Para reflejar mejor el proceso de replicación del ARN de HCV en la
célula, se creó un sistema de replicación del HCV libre de células
usando lisados de células completas o fracciones membránicas de
células que expresan el replicón del HCV. En este sistema libre de
células, se usó P^{32}-UTP o
P^{32}-CTP radioactivo para marcar el ARN del HCV
recientemente sintetizado, y después los productos de la reacción se
resolvieron mediante electroforesis en gel, seguido de
autorradiografía. Debido a que estos ensayos requieren
electroforesis en gel para separar el ARN de HCV de longitud
completa de las otras moléculas de ARN, los resultados son
difíciles de cuantificar, a menudo inexactos, y malamente
reproducibles. Adicionalmente, aunque parece que está claro que el
alargamiento del ARN se produce en este sistema libre de células, no
hay pruebas convincentes de que en este sistema se produce el
inicio del ARN de novo.
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Se proporciona aquí un método para determinar si
un compuesto de ensayo inhibe la síntesis de ARN de un virus de ARN
de hebra positiva. El método comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- detectar la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- cuantificar la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo;
- comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de una población de ARN recientemente sintetizado de control que comprende el análogo nucleotídico marcado producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad del ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y
en el que la etapa de puesta en contacto incluye
poner en contacto con
2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
Se proporciona adicionalmente aquí un método
para cuantificar ARN recientemente iniciado de un virus de ARN de
hebra positiva, que comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, y un análogo nucleotídico marcado, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- hibridar una sonda y la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la transcripción de la población de ARN recientemente sintetizado;
- digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- detectar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado; y
- cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
También se proporciona un método para determinar
si un compuesto de ensayo es un inhibidor de la iniciación de la
síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva, que
comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro del ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- hibridar una sonda y la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la población de ARN recientemente sintetizado;
- digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido;
- detectar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo; y
- comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado pero producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad del ARN de ensayo en comparación con la cantidad de ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe el inicio de la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva;
- y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
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La Figura 1 muestra una representación
esquemática de la inhibición de la replicación del replicón del HCV
por inhibidores del inicio de la transcripción y del
alargamiento.
La Figura 2 muestra un autorradiograma que
ilustra el uso de un inhibidor de la síntesis de ARN para demostrar
el inicio de novo de la síntesis de ARN en complejos de
replicación aislados.
Antes de exponer la invención con detalle, puede
ser de ayuda proporcionar definiciones de ciertos términos a usar
aquí. Excepto que se defina de otro modo, todos los términos
técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que
el que es comprendido habitualmente por un experto en la técnica a
la que pertenece esta invención.
Un "replicón", como se usa aquí, incluye un
elemento genético, por ejemplo un plásmido, cósmido, bácmido, fago
o virus que es capaz de replicarse principalmente bajo su propio
control. Un "ARN de replicón" incluye ARN producido mediante
transcripción de un replicón, por ejemplo un replicón de ADN
bicatenario. Un replicón puede ser ARN o ADN, y puede ser mono- o
bicatenario. Un replicón adecuado es un replicón procedente de un
virus de ARN de cadena positiva monocatenario tal como un virus de
la familia Picornaviridae, la familia Calciviridae, la familia
Togaviridae, la familia Coronaviridae, o la familia Flaviviridae.
Los virus de la familia Flaviviridae incluyen, por ejemplo, el
virus de la hepatitis C, el virus del Nilo Oeste, el virus del
dengue, el virus de Kunjuin, el virus de la fiebre amarilla, el
virus de la diarrea vírica bovina, el virus de la encefalitis
portado por garrapatas, el virus de la encefalitis japonesa, y el
virus de la encefalitis equina venezolana. En una realización, el
replicón es un replicón del virus de la hepatitis C.
En los virus de ARN de hebra positiva, la
replicación se lleva a cabo mediante un complejo de
multiproteínas-ARN denominado un "complejo de
replicasa". Como se usa aquí, un "complejo de replicasa" es
un complejo activo de polipéptidos y ARN que es capaz de una
síntesis completa y exacta del ARN del replicón vírico en
condiciones libres de células adecuadas para la replicación de ARN
vírico. Por síntesis completa y exacta del ARN del replicón vírico,
se quiere decir que el complejo de replicasa es capaz de producir
los ARN del replicón vírico de longitud completa. Además, el
complejo de replicasa aislado debería mostrar especificidad por la
replicación del ARN de replicasa del virus de ARN de hebra positiva
correspondiente. En una realización, un complejo de replicasa
aislado comprende un ARN molde del replicón vírico para el virus de
ARN de hebra positiva. Un "complejo de replicasa aislado" es
un complejo de replicasa que se ha retirado de su entorno celular
natural, tal como una célula que expresa un ARN del replicón
vírico. "Complejo de replicasa aislado" incluye la fracción de
membrana de una célula que expresa el ARN de replicasa vírico. El
complejo de replicasa aislado se puede separar del núcleo celular,
ADN cromosómico, y materiales citoplásmicos, por ejemplo. Además, un
complejo de replicasa aislado puede comprender uno o más
polipéptidos expresados a partir de un sistema de expresión
recombinante, en tanto que el complejo sea capaz de la síntesis
completa y exacta del ARN del replicón vírico. El complejo de
replicasa de HCV, por ejemplo, incluye la proteína NS5B que tiene
actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN, y otros factores
proteicos.
"Ácido nucleico" o una "molécula de ácido
nucleico" se refiere a una molécula de ADN o ARN, ya sea mono- o
bicatenaria, y, si es monocatenaria, la molécula de su secuencia
complementaria en forma lineal o circular. Una secuencia o
estructura de una molécula de ácido nucleico particular se puede
describir según la convención normal de proporcionar la secuencia
en la dirección 5' a 3'.
La expresión "molécula de ácido nucleico
aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que se separan de un
entorno celular intacto. Una "molécula de ácido nucleico
aislada" puede ser, por ejemplo, un ARN molde que se separa del
núcleo celular, ADN cromosómico, y otros materiales celulares que no
están asociados con la membrana. Además, una molécula de ácido
nucleico "aislada", tal como una molécula de ARN molde del
replicón vírico, puede estar sustancialmente libre de otro material
celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas
recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u
otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. En
algunas realizaciones, un ARN molde del replicón vírico aislado se
puede purificar como una porción de una fracción de membrana de una
célula que expresa un ARN del replicón vírico. Tal fracción de
membrana también puede comprender complejos de replicasa aislados.
Sustancialmente libre de otro material celular incluye, por
ejemplo, una fracción celular tal como, por ejemplo, una fracción
unida a membrana. Por sustancialmente libre de otro material
celular, se quiere decir que una molécula de ácido nucleico aislada
puede ser mayor o igual a alrededor de 70%, alrededor de 75%,
alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de
95% o alrededor de 99% libre de materiales celulares indeseados,
tales como, por ejemplo, componentes de fracciones celulares
distintas de la fracción unida a membrana.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico
"aislado" puede estar libre de secuencias que flanquean de
forma natural al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas
en los extremos 5' y/o 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico o
ARN del organismo a partir del cual deriva el ácido nucleico. Por
ejemplo, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos
de alrededor de 5 kb, alrededor de 4 kb, alrededor de 3 kb,
alrededor de 2 kb, alrededor de 1 kb, alrededor de 0,5 kb o
alrededor de 0,1 kb de secuencias nucleotídicas en 5' y/o en 3' que
flanquean de forma natural a la molécula de ácido nucleico en ADN
genómico de la célula a partir de la cual deriva el ácido nucleico.
En este sentido, un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo,
un vector de ADN que codifica un ARN del replicón vírico que se ha
purificado mediante métodos de purificación de ADN estándar.
"Variantes alélicas naturales",
"mutantes" y "derivados" de secuencias particulares de
ácidos nucleicos se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que
están estrechamente relacionadas con una secuencia particular pero
que pueden poseer, ya sea de forma natural o por diseño, cambios en
la secuencia o estructura. Por estrechamente relacionadas se quiere
decir que más de o igual a alrededor de 75%, pero a menudo más de o
igual a alrededor de 90%, de los nucleotídicos de la secuencia
coinciden a lo largo de la longitud definida de la secuencia de
ácido nucleico. Cambios o diferentes en la secuencia nucleotídica
entre secuencias de ácidos nucleicos estrechamente relacionadas
pueden representar cambios nucleotídicos en la secuencia que surgen
durante el transcurso de la replicación o duplicación normal en la
naturaleza de la secuencia de ácido nucleico particular. Otros
cambios se pueden diseñar específicamente e introducir en la
secuencia para fines específicos, tales como cambiar un codón o
secuencia de aminoácidos en una región reguladora del ácido
nucleico. Tales cambios específicos se pueden hacer in vitro
usando una variedad de técnicas de mutagénesis o producidos en un
organismo hospedante colocado bajo condiciones de selección
particulares que inducen o seleccionan los cambios. Tales variantes
de secuencias generadas específicamente se pueden denominar como
"mutantes" o "derivados" de la secuencia original.
Existen en la naturaleza "variantes"
diferentes que incluyen "variantes alélicas naturales" de, por
ejemplo, el genoma del HCV. Estas variantes pueden ser alelos
caracterizados por diferencias en las secuencias nucleotídicas del
gen que codifica una proteína, o pueden implicar un procesamiento
del ARN diferente o modificaciones
post-traduccionales. La persona experta puede
producir variantes que tienen sustituciones, supresiones, adiciones
o reemplazos de aminoácidos individuales o múltiples. Estas
variantes pueden incluir, entre otras: a) variantes en las que uno
o más restos de aminoácidos están sustituidos por aminoácidos
conservativos o no conservativos, b) variantes en las que se añaden
uno o más aminoácidos, y c) variantes en las que uno o más
aminoácidos incluyen un grupo sustituyente.
"Enlazado operativamente" se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una
relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una
secuencia de control de la expresión enlazada operativamente a una
secuencia codificante se liga de forma que la expresión de la
secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las
secuencias de control de la expresión. Como se usa aquí, la
expresión "secuencias de control de la expresión" se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos que regulan la expresión de una
secuencia de ácido nucleico a la que está enlazada operativamente.
Las secuencias de control de la expresión están enlazadas
operativamente a una secuencia de ácido nucleico cuando las
secuencias de control de la expresión controlan y regulan la
transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia
de ácido nucleico. De este modo, las secuencias de control de la
expresión pueden incluir promotores, potenciadores, terminadores de
la transcripción, un codón de partida (es decir, atg) delante de un
gen que codifica una proteína, señales de corte y empalme para
intrones (si están presentes intrones), mantenimiento del marco de
lectura correcto de ese gen para permitir la traducción apropiada
del ARNm, y codones de parada, apropiados. La expresión
"secuencias de control" pretende incluir, como mínimo,
componentes cuya presencia puede influir la expresión, y también
puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa,
por ejemplo secuencias líder y secuencias de compañeros de fusión.
Las secuencias de control de la expresión pueden incluir un
promotor. Por "promotor" se quiere decir una secuencia mínima
suficiente para dirigir la transcripción. También están incluidos
aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer que la
expresión génica dependiente del promotor sea controlable por
agentes específicos de tipo celular, específicos de tejidos, o
inducible mediante señales o agentes externos; tales elementos
pueden estar localizados en las regiones 5' o 3' del gen. Se
incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles. Un replicón
puede incluir secuencias de control de la expresión operablemente
enlazadas.
El término "sonda", como se usa aquí, se
refiere a un oligonucleótido o polinucleótido que comprende ARN o
ADN, ya sea de origen natural como en una digestión de enzima de
restricción purificada o producida sintéticamente, que es capaz de
hibridarse con o hibridarse específicamente a un ácido nucleico con
secuencias complementarias a la sonda. Una sonda puede ser, por
ejemplo, un ARN monocatenario transcrito in vitro a partir de
un molde de ADN. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria, y
en una realización es monocatenaria. La longitud exacta de la sonda
dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, la fuente
de la sonda, y uso. Las sondas se seleccionan para ser
"sustancialmente" complementarias a una hebra de una secuencia
de ácido nucleico diana particular. Esto significa que las sondas
son suficientemente complementarias para ser capaces de
"hibridarse específicamente" o hibridarse con sus hebras diana
respectivas bajo un conjunto de condiciones predeterminadas. La
expresión hibridarse específicamente significa que la sonda tiene
una mayor probabilidad de hibridarse a su secuencia diana que a
otras secuencias no dianas.
Por lo tanto, la secuencia de la sonda no
necesita reflejar la secuencia complementaria exacta de la diana.
Por ejemplo, se puede unir un fragmento nucleotídico no
complementario al extremo 5' o 3' de la sonda, siendo el resto de
la secuencia de la sonda complementaria a la hebra diana. También se
puede permitir un pequeño desemparejamiento (por ejemplo, menor o
igual a alrededor de 10%) de nucleotídicos en el cebador y la
secuencia diana.
El término "oligonucleótido" se define como
una molécula de ácido nucleico que comprende dos o más
ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, preferiblemente más de
tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de diversos
factores y de la aplicación y uso particulares del oligonucleótido.
En una realización, un oligonucleótido comprende menos de 100
nucleótidos, más específicamente menos o igual a alrededor de 50
nucleótidos, y muy específicamente menos o igual a alrededor de 30
nucleótidos.
Una sonda o cebador "polinucleotídico"
comprende específicamente menos de o igual a alrededor de 1000
nucleótidos, más preferiblemente menos de o igual a alrededor de
800 nucleótidos, y muy específicamente menos de o igual a alrededor
de 500 nucleótidos. Un cebador polinucleotídico también comprende
específicamente más de o igual a alrededor de 100 nucleótidos, más
específicamente más de o igual a alrededor de 150 nucleótidos, y muy
específicamente más de o igual a alrededor de 200 nucleótidos.
"Condición de restricción" para la
hibridación es una expresión de la técnica que se refiere a las
condiciones de incubación y lavado, por ejemplo condiciones de
temperatura y concentración del tampón, que permiten la hibridación
de un primer ácido nucleico a un segundo ácido nucleico; el primer
ácido nucleico puede ser perfectamente (es decir, 100%)
complementario al segundo, o el primero y el segundo pueden
compartir algún grado de complementariedad que es algo menos que
perfecta (por ejemplo, 70%, 75%, 85%, 95%, 98%). Por ejemplo, se
pueden usar ciertas condiciones de elevada restricción que
distinguen ácidos nucleicos perfectamente complementarias de
aquellos con una menor complementariedad.
Las "condiciones de restricción elevada",
"condiciones de restricción moderada" y "condiciones de baja
restricción" para las hibridaciones de ácidos nucleicos se
explican en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.
et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John
Wiley & Sons, (1998)). Las condiciones exactas que determinan
la restricción de la hibridación dependen no sólo de la fuerza
iónica (por ejemplo, 0,2 X SSC, 0,1 X SSC), temperatura (por
ejemplo, temperatura ambiente, 42ºC, 68ºC) y de la concentración de
agentes desestabilizantes tales como formamida o agentes
desnaturalizantes tales como SDS, sino también de factores tales
como la longitud de la secuencia de ácido nucleico, la composición
base, el porcentaje de desemparejamiento entre secuencias que se
hibridan y la frecuencia de aparición de subconjuntos de esa
secuencia dentro de otras secuencias no idénticas. El tampón SSC es
150 mM de cloruro de sodio y 15 mM de citrato de sodio, pH 7,0. Las
condiciones de restricción elevada, moderada o baja se pueden
determinar empíricamente.
Variando las condiciones de restricción para la
hibridación desde un nivel de restricción en el que no se produce
hibridación hasta un nivel en el que se observa por primera vez
hibridación, se pueden determinar condiciones que permitirán que
una secuencia dada se hibride (por ejemplo, selectivamente) con las
secuencias más similares en la muestra.
En Krause, M.H. y S.A. Aaronson, Methods in
Enzymology, 200:546-556 (1991) se describen
condiciones ejemplares. También en Ausubel, et al.,
"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &
Sons, (1998), que describe la determinación de las condiciones de
lavado para condiciones de restricción moderada o baja. El lavado es
la etapa en la que las condiciones se ajustan habitualmente para
determinar un nivel mínimo de complementariedad de los híbridos.
Partiendo desde la temperatura más baja a la que sólo se produce la
hibridación homóloga, cada ºC mediante el cual se reduce la
temperatura final de lavado (manteniendo constante la concentración
de SSC) permite un incremento de alrededor de 1% en el grado máximo
de desemparejamiento entre las secuencias que se hibridan.
Generalmente, duplicar la concentración de SSC da como resultado un
incremento en T_{m} de alrededor de 17ºC. Usando estas pautas, la
temperatura de lavado se puede determinar empíricamente para una
restricción elevada, moderada o baja, dependiendo del nivel de
desemparejamiento que se busque.
Por ejemplo, un lavado de baja restricción puede
comprender lavar en una disolución que contiene 0,2 X SSC/0,1% de
dodecilsulfato de sodio (SDS) durante 10 minutos a temperatura
ambiente; un lavado de restricción moderada puede comprender lavar
en una disolución previamente calentada (42ºC) que contiene 0,2 X
SSC/0,1% de SDS durante 15 minutos a 42ºC; y un lavado de
restricción elevada puede comprender lavar en disolución previamente
calentada (68ºC) que contiene 0,1 X SSC/0,1% de SDS durante 15
minutos a 68ºC. Además, los lavados se pueden llevar a cabo
repetida o secuencialmente para obtener un resultado deseado como se
sabe en la técnica. Se pueden determinar condiciones equivalentes
variando uno o más de los parámetros dados como ejemplo, como se
sabe en la técnica, mientras se man-
tiene un grado similar de identidad o similitud entre la molécula de ácido nucleico diana y el cebador o sonda usado.
tiene un grado similar de identidad o similitud entre la molécula de ácido nucleico diana y el cebador o sonda usado.
Un "compuesto de ensayo", como se define
aquí, se refiere a un compuesto químico, de ácido nucleico,
polipeptídico, de aminoácidos, u otro compuesto que se va a
ensayar. Los ejemplos de compuestos de ensayo incluyen, pero no se
limitan a, candidatos farmacéuticos, tales como derivados de
conjuntos de pequeñas moléculas generadas a través de química
combinatoria general, así como cualesquiera otras sustancias que se
piensa que tienen actividad biológica potencial.
Se proporciona aquí un método para determinar si
un compuesto de ensayo inhibe la síntesis de ARN de un virus de ARN
de hebra positiva. El método comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- detectar la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- cuantificar la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo;
- comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de una población de ARN recientemente sintetizado de control que comprende el análogo nucleotídico marcado producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad del ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y
en el que la etapa de puesta en contacto incluye
poner en contacto con
2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
Se proporciona adicionalmente aquí un método
para cuantificar ARN recientemente iniciado de un virus de ADN de
hebra positiva, que comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, y un análogo nucleotídico marcado, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- hibridar una sonda y la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la transcripción de la nueva población de ARN recientemente sintetizado;
- digerir ARN no hibridado, monocatenario con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- detectar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado; y
- cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
También se proporciona un método para determinar
si un compuesto de ensayo es un inhibidor de la iniciación de la
síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra positiva, que
comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro del ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- hibridar una sonda y la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la población de ARN recientemente sintetizado;
- digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido;
- detectar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo; y
- comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado pero producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad del ARN de ensayo en comparación con la cantidad de ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe el inicio de la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
En algunas realizaciones de los métodos
anteriores, los complejos de replicasa vírica aislados y el ARN
molde del replicón vírico aislado se proporcionan transfectando una
estirpe celular con un molde de ADN aislado para un replicón vírico
o un ARN vírico aislado, para proporcionar una estirpe celular
transfectada, transfectando la estirpe celular transfectada en
condiciones adecuadas para la replicación vírica, y aislando
complejos de replicasa y ARN molde del replicón vírico a partir de
la fracción de membrana celular de la estirpe celular
transfectada.
En otras realizaciones de los métodos
anteriores, los complejos de replicasa vírica aislados y los ARN
moldes del replicón vírico aislados se pueden proporcionar mediante
hepatocitos primarios, linfocitos u otras estirpes celulares
infectados de forma aguda o infectados persistentes, incubando la
estirpe celular infectada en condiciones adecuadas para la
replicación vírica, y aislando los complejos de replicasa que
comprenden ARN del replicón vírico procedente de la fracción de
membrana celular. Los complejos de replicasa se pueden aislar a
partir de células o estirpes celulares primarias infectadas.
En ciertas realizaciones de los métodos
descritos aquí, el virus de ARN de hebra positivo es el virus de la
hepatitis C, y un molde de ADN adecuado para el replicón vírico de
HCV es, por ejemplo, SEC ID NO: 1, que también se puede describir
como número de acceso GenBank AJ242652. Otros AND moldes del
replicón adecuados incluyen, por ejemplo, AB 114136, AJ242654,
AJ242653, y AJ242651 (SEC ID NOs. 2-5).
En ciertas realizaciones de los métodos, el
análogo nucleotídico marcado es un análogo capaz de ser reconocido
por un anticuerpo específico, un análogo que se puede reconocer vía
una reacción de unión de especificidad derivada, o un análogo
detectable directamente como resultado de una propiedad física del
análogo. En algunas realizaciones, el análogo nucleotídico marcado
es un análogo capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico,
tal como 5'-bromouridin
5'-trifosfato (Br-UTP). En otras
realizaciones, el análogo nucleotídico marcado es un nucleótido
marcado radiactivamente.
En los métodos descritos aquí, la detección de
una población de ARN recientemente sintetizado se puede lograr
poniendo en contacto una población de ARN recientemente sintetizado
con un anticuerpo específico para el análogo nucleotídico marcado,
e inmunoprecipitando la población de ARN recientemente sintetizado
que comprende el análogo nucleotídico marcado para formar una
población de ARN inmunoprecipitado. En algunas realizaciones, el
análogo nucleotídico es Br-UTP, y el anticuerpo
específico es un anticuerpo anti-BrdU. Los métodos
descritos aquí incluyen cuantificar la población de ARN
recientemente sintetizado llevando a cabo una PCR en tiempo real
sobre la población de ARN inmunoprecipitado. En otras realizaciones,
la detección de una población de ARN recientemente sintetizado se
puede lograr detectando un nucleótido marcado radiactivamente, por
ejemplo, mediante electroforesis en gel no desnaturalizante seguido
de autorradiografía.
A fin de formar una población de ARN
recientemente sintetizado, se emplea un complejo de replicasa
aislado y un molde de ARN de replicasa vírica aislado. El ARN molde
del replicón vírico aislado comprende una región de inicio de la
transcripción. El ARN molde puede ser aislado, por ejemplo, como un
componente del complejo de replicasa. En algunas realizaciones, se
puede añadir un ARN molde vírico aislado al complejo de
replicasa.
Un vector de ARN o ADN de replicón vírico que
codifica el ARN del replicón vírico se puede transfectar en una
estirpe celular adecuada para la expresión del ARN del replicón
vírico. Las estirpes celulares adecuadas incluyen, por ejemplo,
estirpes de células de mamíferos tales como células Vero, células
HeLa, células CHO, células COS, células WI38, células
N1H-3T3 (y otras células de fibroblastos, tales como
células MRC-5), MDCK, células KB, células
SW-13, células MCF7, células BHK, células
HEK-293, células HepG2, estirpes celulares de
melanoma de Bowes; y estirpes celulares de fibroblastos embriónicos
de pollo (CEF). En una realización, la estirpe celular es una
estirpe celular humana, tal como, por ejemplo, una estirpe celular
de hepatoma humano tal como Huh-7. Los medios
adecuados de transfección incluyen, por ejemplo, coprecipitados con
fosfato de calcio, procedimientos mecánicos tales como
microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado
en liposomas, así como otras técnicas conocidas en la técnica.
Un vector de ADN adecuado para la producción de
un ARN de replicón del HCV comprende, por ejemplo,
5'-3', el HCV-IRES, el gen de
neomicin fosfotransferasa (neo), el IRES del virus de
encefalomiocarditis, que dirige la producción de las secuencias NS3
a NS5B del HCV, y la 3'-NTR. La secuencia de un
vector de ADN adecuado para la producción del ARN del replicón del
HCV se ha depositado en GenBank (número de acceso AJ242652) (SEC ID
NO:1). El vector de ADN del replicón de HCV se puede transfectar en
células Huh-7 mediante electroporación. El ARN del
replicón del HCV se puede transcribir in vitro usando ARN
polimerasa de SP6 o ARN polimerasa de T7, por ejemplo a partir de
un ADN plasmídico que comprende el promotor apropiado con el ADNc
que codifica el ARN del replicón en dirección 3' del promotor. El
molde de ADN para la producción de un ARN de replicasa vírico se
puede producir mediante amplificación por PCR usando un molde de ADN
que codifica el replicón vírico y cebadores específicos, uno de los
cuales comprende un promotor de ARN polimerasa de SP6 o T7. Como
alternativa, el molde de ADN para la producción de un ARN de
replicasa vírico se puede producir mediante transcripción inversa
del ARN de replicasa vírico usando cebadores, uno de los cuales
comprende un promotor de ARN polimerasa de SP6 o T7.
Una vez que el vector de ARN o ADN del replicón
vírico que codifica el ARN del replicón vírico se transfecta en una
célula, el cultivo celular se puede hacer crecer hasta confluencia.
Las células en el cultivo producen complejos de replicasa que
comprenden los ARN molde del replicón vírico, que entonces se pueden
aislar de las células. El ARN del replicón vírico incluye ARN molde
del replicón vírico de hebra negativa, y opcionalmente ARN de hebra
positivo.
Como alternativa, se pueden emplear células
infectadas, tales como hepatocitos primarios, linfocitos u otras
estirpes celulares infectados de forma aguda o persistente, para
aislar ARN del replicón vírico. Se pueden emplear células o
estirpes celulares primarias infectadas. La estirpe celular
infectada se incuba en condiciones adecuadas para la replicación
vírica, y los complejos de replicasa que comprenden ARN del replicón
vírico se aíslan de la fracción de membrana celular.
\newpage
A fin de aislar los complejos de replicación y
el ARN molde del replicón vírico, las células (es decir,
transfectadas o infectadas con un replicón vírico) se pueden lisar
y centrifugar a baja velocidad (por ejemplo, alrededor de 900 X a
alrededor de 1000 X g) para eliminar el desecho celular. El
sobrenadante se puede centrifugar entonces a mayor velocidad (por
ejemplo, alrededor de 15000 X g) para obtener la fracción de
membrana, que comprende complejos del replicón vírico aislados y
opcionalmente comprende ARN molde del replicón vírico. Se ha
demostrado que la replicación del ARN del HCV se produce en un
complejo de replicación unido a la membrana. De este modo, los
complejos del replicón de HCV y el ARN molde del replicón se pueden
aislar aislando la fracción de membrana de las células que expresan
el ARN del replicón del HCV.
La fracción de membrana aislada que contiene
complejos de replicasa (por ejemplo, una parte alícuota de la
fracción de membrana de una estirpe celular que expresa un replicón
de ARN vírico) y el ARN molde del replicón aislado se usan para
realizar la replicación del ARN in vitro en un sistema libre
de células. Los complejos de replicasa aislados y el ARN molde del
replicón vírico aislado se ponen en contacto con un análogo
nucleotídico marcado, en condiciones suficientes para promover la
síntesis in vitro del ARN. Las condiciones suficientes para
promover la síntesis in vitro del ARN incluyen tampones
adecuados, y trifosfatos de nucleósidos (es decir, ATP, UTP, CTP, y
GTP). El análogo nucleotídico marcado se incorpora en una población
de ARN recientemente sintetizado, y proporciona un medio para
detectar sólo el ARN recientemente sintetizado, y no el ARN molde.
En una realización, las condiciones adecuadas para la replicación
incluyen, por ejemplo, la incubación en 50 \mul (volumen total)
de 50 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de KCl, 10 mM de MgCl_{2}, 50
unidades de ARNsin, 10 \mug/ml de actinomicina D, 2,5 mM de ATP,
0,5 mM de cada uno de CTP, GTP, UTP marcado, y una parte alícuota
de una fracción de membrana de una estirpe celular que expresa el
ARN del replicón vírico, por ejemplo complejos de replicasa
aislados y ARN molde del replicón vírico aislado. En otra
realización, las condiciones de replicación adecuadas incluyen 50
mM de HEPES (pH 7,3); 10 mM de KCl; 10 mM de MgCl_{2}; 0,3 mM de
MnCl_{2}; 20 unidades de inhibidor de ARNasa, 10 \mug/ml de
actinomicina D por ml; 0,5 mM de ATP, GTP, y UTP; 10 \muCi de
[\alpha-P^{32}]CTP; y 6 \mul de la
fracción de membrana de una estirpe celular que expresa el ARN del
replicón vírico en un volumen total de 60 \mul. La reacción de
replicación se continúa durante un tiempo suficiente para producir
una cantidad deseada de ARN recientemente
sintetizado.
sintetizado.
Las condiciones de replicación incluyen añadir
2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
Esto incrementa la eficiencia del complejo de replicación, dando
como resultado un incremento en la cantidad de producto marcado
obtenido en ausencia del
2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
Sin estar atados a una teoría particular, se cree que
2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato
incrementa la eficiencia del complejo de replicasa cuando se añade a
la reacción, en concentraciones bajas, un nucleótido radiomarcado
tal como, por ejemplo, P^{32}-CTP.
Los análogos nucleotídicos marcados adecuados
incluyen, por ejemplo, análogos que son capaces de ser reconocidos
por anticuerpos específicos (por ejemplo, Br-UTP),
análogos tales como nucleotídico marcado con biotina (por ejemplo,
biotin-CTP) que puede ser reconocido vía una
reacción de unión de especificidad elevada (es decir, unión a
biotina/avidina o biotina/estreptavidina), y análogos que son
directamente detectables como resultado de una propiedad física del
análogo, tal como radioactividad (por ejemplo, un nucleótido marcado
con P^{32}), fluorescencia, luminiscencia, etc., por ejemplo un
nucleótido con fluoresceína (por ejemplo,
fluorescein-UTP). En una realización, el análogo
nucleotídico marcado es
5'-bromouridin-5'-trifosfato
(Br-UTP). El ARN que contiene
Br-UTP se puede aislar mediante inmunoprecipitación
y/o detección con un anticuerpo anti-BrdU. El
anticuerpo anti-BrdU se puede marcar opcionalmente
con una etiqueta adecuada para la detección directa del anticuerpo,
tal como, por ejemplo, fluoresceína, u otros colorantes tales como
los disponibles de Molecular Probes. En otros casos, el anticuerpo
se puede detectar vía unión a un anticuerpo secundario marcado, tal
como, por ejemplo, una IgG de conejo o de ratón marcada con
fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
El análogo nucleotídico marcado se añade a la
mezcla de replicación de forma que el análogo nucleotídico marcado
se incorpore en el ARN recientemente sintetizado (por ejemplo, ARN
del replicón vírico recientemente sintetizado) en lugar de al menos
una porción del nucleótido no marcado correspondiente. Por ejemplo,
se puede usar Br-UTP en lugar de al menos una
porción del UTP. En ciertos casos, todo el nucleótido
correspondiente se puede sustituir por el análogo nucleotídico
marcado. Tras la replicación, hay dos poblaciones de ARN (por
ejemplo, ARN del replicón vírico): una población de ARN no marcado
(es decir, la población de ARN presente antes de la replicación) y
una población de ARN marcado (por ejemplo, la población de ARN
recientemente sintetizado). La población de ARN recientemente
sintetizado, que contiene el análogo nucleotídico marcado, se puede
distinguir de la población de ARN que estaba presente antes de la
etapa de replicación debido a que la población de ARN que estaba
presente antes de la replicación no contendrá el análogo
nucleotídico marcado. Debido a que el ARN recientemente sintetizado
se puede distinguir del ARN presente antes de la replicación, la
cantidad de ARN recientemente sintetizado (por ejemplo, ARN del
replicón vírico) se puede detectar y/o cuantificar empleando un
medio de detección y/o cuantificación del ARN. Los medios para la
detección y cuantificación del ARN pueden ser iguales o
diferentes.
Tras la replicación, el ARN en la mezcla de
replicación se puede purificar opcionalmente usando, por ejemplo,
un kit de purificación de ARN comercialmente disponible. El ARN
recientemente sintetizado se detecta entonces usando un medio para
detectar el ARN. La detección comprende preferiblemente la detección
cuantitativa. El método para detectar el ARN se selecciona
basándose en el análogo nucleotídico marcado empleado. Por ejemplo,
en el caso de un análogo capaz de ser reconocido por anticuerpos
específicos, se puede emplear un anticuerpo específico para
inmunoprecipitar el ARN marcado. El ARN inmunoprecipitado se puede
detectar, por ejemplo, detectando directamente una etiqueta
fluorescente presente en el anticuerpo. Como alternativa, el ARN
inmunoprecipitado se puede detectar con un anticuerpo secundario
marcado. En otra alternativa, el ARN marcado inmunoprecipitado se
puede amplificar y detectar usando PCR en tiempo real.
Por ejemplo, una población de ARN recientemente
sintetizado que contiene Br-UTP como el análogo
nucleotídico marcado se puede inmunoprecipitar usando un anticuerpo
monoclonal anti-BrdU. El ARN molde sin marcar no
precipitará, mientras que el ARN recientemente sintetizado marcado
con Br-UTP precipitará específicamente. El ARN
marcado inmunoprecipitado se puede cuantificar entonces usando PCR
en tiempo real. De este modo, en caso de, por ejemplo, un ARN de
replicón vírico marcado con Br-UTP precipitado con
un anticuerpo anti-BrdU, el método de detección
comprende poner en contacto la población de los ARN del replicón
víricos con un anticuerpo anti-BrdU, precipitar los
ARN del replicón víricos, y detectar y cuantificar los ARN del
replicón víricos marcados usando un método adecuado, tal como, por
ejemplo, PCR en tiempo real.
La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en
tiempo real es una reacción de PCR de transcripción inversa
cuantitativa (RT-PCR). Al principio en la
RT-PCR, los reactivos están en exceso, el molde y el
producto están en concentraciones suficientemente bajas de forma
que la hibridación del producto no compite con la unión al cebador,
y la amplificación transcurre a una velocidad sustancialmente
constante y exponencial. En algún punto variable durante la
reacción, la velocidad de reacción deja de ser exponencial y entra
una fase lineal de la amplificación. Más tarde en el ciclo de
amplificación, se obtiene poco producto. La PCR en tiempo real
permite la recogida de datos durante la fase exponencial de
amplificación, y de este modo permite la cuantificación exacta de
la cantidad de producto amplificado. La detección y cuantificación
del ADN bicatenario producido en la reacción de PCR se realiza
usando un informador fluorescente, cuya señal aumenta en proporción
directa a la cantidad de producto de PCR de ADN bicatenario en una
reacción. Se pueden usar las sondas Taqman® marcadas con un
colorante fluorescente tal como FAM
(6-carboxi-fluoresceína). Otro
informador adecuado es el colorante específico del ADN bicatenario
SYBR® Green (Molecular Probes). SYBR® Green se une a AND
bicatenario, y al excitarlo emite luz. De este modo, a medida que
se acumula un producto de PCR, aumenta la fluorescencia. Otros
informadores alternativos incluyen sondas de hibridación que usan
transferencia de energía de fluorescencia (FRET) para la
detección.
Cuando el análogo nucleotídico marcado es un
nucleótido radioactivo tal como P^{32}-CTP, los
ARN marcados se pueden detectar mediante electroforesis en gel no
desnaturalizante seguida de la autorradiografía, detección
radioactiva directa tal como Phosphorimaging, y similar.
En el caso de un análogo nucleotídico marcado
que puede ser reconocido vía una reacción de unión de especificidad
elevada, los ARN marcados se pueden aislar empleando la reacción de
unión de especificidad elevada. Por ejemplo, un nucleótido marcado
con biotina se puede reconocer mediante avidina o estreptavidina.
Una vez que los ARN marcados se han aislado, los ARN marcados se
pueden amplificar y detectar usando PCR en tiempo real. En el caso
de un análogo nucleotídico directamente detectable, el análogo
nucleotídico marcado se puede detectar directamente usando
fluorescencia, luminiscencia, y similar.
Los controles adecuados para la cuantificación
de la población de ARN recientemente sintetizado son los siguientes.
Los ARN moldes aislados de células no transfectadas con un vector
de ADN o un ARN vírico y sometidos a replicación no tienen cantidad
detectable de ARN recientemente sintetizado. Los ARN moldes aislados
de células transfectadas con un vector de ADN molde o un ARN
vírico, pero replicados sin el análogo nucleotídico marcado, sólo
tienen niveles de fondo de ARN recientemente sintetizado. Los ARN
moldes procedentes de células transfectadas con un vector de ADN
molde o con un ARN vírico, replicados en presencia de un análogo
nucleotídico marcado, que no se detectan con los medios para
detección, muestran sólo niveles de fondo de ARN recientemente
sintetizado. Los ARN moldes procedentes de células transfectadas
con un vector de ADN molde o con un ARN vírico, replicados en
presencia de análogo nucleotídico marcado y detectados con los
medios de detección deberían, sin embargo, mostrar en este ensayo
una señal potente de ARN recientemente sintetizado.
El ensayo se puede emplear para cuantificar una
población de ARN recientemente iniciado. En el caso de HCV, por
ejemplo, la mayoría (por ejemplo, alrededor de 90%) de los ARN
víricos recientemente sintetizados son los productos de
alargamiento de los ARN moldes previamente iniciados (es decir,
iniciados). En un ARN molde iniciado, una porción del ARN
recientemente sintetizado se obtiene previamente usando un molde de
hebra negativa. Con la adición de los factores apropiados (por
ejemplo, tampones y trifosfatos de nucleósidos), el alargamiento
del ARN iniciado puede transcurrir para formar el ARN de longitud
completa. Sólo una pequeña fracción (por ejemplo, menos de
alrededor de 10%) de los ARN recientemente sintetizados representa
productos recientemente iniciados formados a partir de ARN moldes
no iniciados (es decir, pre-iniciación). Tanto los
ARN previamente iniciados como los recientemente iniciados
comprenderán el análogo nucleotídico marcado en la región de
alargamiento del ARN. Sin embargo, sólo los ARN recientemente
iniciados comprenderán el análogo nucleotídico marcado en la región
de iniciación de la transcripción. Un método para seleccionar y
cuantificar ARN recientemente iniciados comprende emplear la
protección del ARN a la población de ARN recientemente sintetizado
que puede comprender una población de ARN previamente iniciado así
como los ARN recientemente iniciados.
En el ensayo de protección de ARNasa, se añade
una sonda de ácido nucleico a la nueva población de ARN del
replicón vírico recientemente sintetizado que puede comprender los
ARN previamente iniciados así como ARN recientemente iniciados. La
sonda de ácido nucleico comprende una región complementaria a al
menos una porción de la región de iniciación de la transcripción de
los ARN del replicón víricos (por ejemplo, la población de ARN
recientemente sintetizado). Cuando la sonda se hibrida a la
población de ARN del replicón vírico recientemente sintetizado, una
porción de la región de iniciación de la transcripción se convierte
en bicatenaria, siendo el resto del ARN monocatenario. El ARN
monocatenario se puede eliminar entonces, por ejemplo, mediante
digestión con una ribonucleasa específica monocatenaria específica
para ARN monocatenario. Las ribonucleasas específicas
monocatenarias adecuadas incluyen, por ejemplo, ribonucleasa T1,
ribonucleasa A, nucleasa S1, y combinaciones que comprenden una o
más de las ribonucleasas específicas monocatenarias anteriores. Tras
la digestión, el ARN que queda será así una población de ARN
bicatenario (es decir, protegido) en la que los ARN previamente
iniciados comprenderán un análogo nucleotídico no marcado, y los ARN
recientemente iniciados comprenderán el análogo nucleotídico
marcado. Los ARN recientemente iniciados protegidos se pueden
detectar entonces y/o cuantificar como se describe
anteriormente.
La hibridación de la sonda se puede llevar a
cabo en condiciones que son suficientes para permitir la hibridación
específica de la sonda de ácido nucleico al ARN de la replicasa
vírico. La hibridación específica se puede llevar a cabo en
condiciones de restricción elevada o condiciones de restricción
moderada, por ejemplo.
En una realización particularmente preferida,
las condiciones de hibridación para la hibridación específica son
altamente restrictivas.
El ensayo descrito aquí se puede emplear para
identificar compuestos de ensayo para la inhibición de la síntesis
del ARN del replicón vírico. Tales compuestos incluyen inhibidores
de la actividad del complejo de replicasa, así como inhibidores de
inicio y alargamiento de la síntesis del ARN. El método se puede
emplear para distinguir inhibidores de la iniciación de los
inhibidores del alargamiento. Si se añade a la mezcla de replicación
un inhibidor de la síntesis del ARN del replicón vírico, se debería
sintetizar menos ARN del replicón vírico, y la cantidad de ARN del
replicón vírico marcado detectada disminuirá (por ejemplo, cantidad
de ARN de ensayo) con relación a la cantidad de ARN del replicón
vírico en una muestra de control (es decir, cantidad de ARN del
control) sin inhibidor añadido. La cantidad de ARN del replicón
vírico marcado detectada disminuirá, por ejemplo, si el inhibidor
de la síntesis del ARN del replicón vírico es un inhibidor del
alargamiento del ARN del replicón vírico. Los inhibidores del
alargamiento del ARN del replicón vírico bloquearán la síntesis de
productos del alargamiento del ARN del replicón vírico recientemente
sintetizado y también productos del alargamiento del ARN del
replicón vírico previamente iniciado. Sin embargo, si el inhibidor
de la síntesis del ARN del replicón vírico es un inhibidor de la
iniciación, la potencia de la señal sólo se verá afectada de forma
modesta. La mayoría (por ejemplo, aproximadamente 90%) de los ARN
víricos recientemente sintetizados de HCV son los productos del
alargamiento del ARN del replicón víricos previamente iniciados. De
este modo, sólo una pequeña fracción (por ejemplo, menos de
alrededor de 10%) de los ARN del replicón recientemente sintetizados
se verán afectados por un inhibidor de la iniciación. La FIGURA 1
proporciona una representación esquemática de la inhibición de la
síntesis del ARN del HCV por inhibidores de la iniciación y del
alargamiento.
Se puede añadir un ensayo de protección de
ARNasa, como se describe aquí, tras la formación de la población de
ARN recientemente sintetizado para identificar los inhibidores de la
iniciación. En este ensayo, se emplea una sonda de ácido nucleico
que es complementaria a al menos una porción de la región de inicio
del replicón vírico recientemente sintetizado. La sonda se hibrida
al ARN del replicón vírico de forma que la región del ARN del
replicón vírico complementaria a la sonda es bicatenario (es decir,
se replica), y el resto del ARN del replicón vírico es
monocatenario. La hibridación se lleva a cabo preferiblemente en
condiciones restrictivas. La porción monocatenaria del ARN del
replicón vírico se digiere entonces con una ribonucleasa específica
para ARN monocatenario tal como, por ejemplo, ribonucleasa A,
ribonucleasa T1, nucleasa S1, o una combinación que comprende una o
más de las siguientes ribonucleasas. La población restante de ARN
del replicón bicatenario contendrá entonces dos fracciones: una
fracción de los ARN del replicón víricos previamente iniciados que
no comprende análogo nucleotídico marcado, y una fracción de los ARN
del replicón víricos iniciada tras la adición del análogo
nucleotídico marcado que comprende el análogo nucleotídico marcado.
Los ARN del replicón víricos protegidos que contienen el análogo
nucleotídico marcado se pueden detectar y/o cuantificar entonces
específicamente como se describe anteriormente.
En el caso de HCV, una sonda ejemplar es un ARN
complementario a los nucleótidos 15 a 433 del ARN del replicón de
HCV (SEC ID NO:6), que se hibrida con el nuevo ARN de la replicasa
vírico recientemente sintetizado cerca del codón de iniciación. El
ARN no hibridado a la sonda se digiere con una ribonucleasa
monocatenaria, dejando sólo nucleótidos 15 a 433 del ARN del
replicón. El ARN digerido tendrá dos poblaciones de ARN bicatenario:
una población de ARN del replicón previamente iniciados que no
contienen el análogo nucleotídico marcado, y una población de ARN
del replicón recientemente iniciados que contienen el análogo
nucleotídico marcado. De este modo, los productos del alargamiento
del ARN del HCV previamente iniciado no se detectarán, mientras que
se detectarán los ARN nuevamente sintetizados. En este ensayo que
incluye la protección de ARN, cuando se añade un inhibidor de la
iniciación a la mezcla de replicación, se incorpora una cantidad
reducida de análogo nucleotídico marcado en el sitio de iniciación,
y la señal medida por los medios de detección disminuirá.
En virus de ARN de hebras positivas, el complejo
de replicasa es un complejo de múltiples proteínas que replica ARN
del replicón vírico a partir de un ARN molde del replicón vírico.
Los complejos de replicasa que incluyen los ARN moldes del replicón
víricos además de proteínas de replicación se pueden aislar como una
fracción unida a membrana a partir de células que expresan el ARN
del replicón vírico. Los complejos de replicasa aislados pueden
incluir ARN moldes del replicón víricos previamente iniciados y no
iniciados. Con la adición de trifosfatos nucleotídicos y otros
componentes suficientes para la síntesis del ARN, se produce el
alargamiento de los ARN moldes previamente iniciados para producir
ARN de replicasa víricos de longitud completa. Sin embargo, no se
ha demostrado que la iniciación de novo de ARN moldes del
replicón víricos no iniciados se produce en complejos de replicasa
aislados. Usando un inhibidor de la iniciación de la síntesis del
ARN del replicón vírico, se puede demostrar que la iniciación de
novo de la síntesis del ARN de la replicasa vírico se produce
en complejos de replicasa aislados. Debido a que la iniciación de
novo de la síntesis del ARN tiene lugar y los complejos de
replicasa aislados, los métodos se pueden usar para cuantificar ARN
recientemente iniciado y también identificar inhibidores del inicio
de la síntesis de ARN.
De este modo, los métodos descritos son
adecuados para detectar inhibidores de la síntesis de ARN de virus
de ARN de hebra positiva tales como inhibidores de la iniciación y
alargamiento del ARN.
También se proporciona aquí un kit para
identificar un compuesto de ensayo para la inhibición de la síntesis
del ARN y un virus de ARN de hebra positiva. El kit comprende un
complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra
positiva, y ARN molde del replicón vírico aislado para el virus de
ARN de hebra positiva, instrucciones para uso del kit, y tampones y
trifosfatos nucleosídicos que son suficientes para la síntesis del
ARN del replicón vírico. Las instrucciones pueden incluir, por
ejemplo, instrucciones para cuantificar una población de ARN
recientemente sintetizado, instrucciones para determinar si un
compuesto es un inhibidor de la síntesis del ARN, y similares. Las
instrucciones pueden ser instrucciones escritas, aunque también son
aceptables medios de almacenamiento electrónicos (por ejemplo,
disquete magnético o disco óptico) que contienen instrucciones, que
se refieren al uso de componentes de los métodos. Las instrucciones
incluidas con el kit pueden incluir información en cuanto a los
reactivos (por ejemplo, si están incluidos o no en el kit)
necesarios para poner en práctica los métodos, instrucciones sobre
cómo usar el kit, y/o condiciones de reacción apropiadas.
Los tampones adecuados incluyen aquellos
descritos previamente como adecuados para llevar a cabo la
replicación con complejos de replicación aislados.
Los kits pueden comprender además opcionalmente,
por ejemplo, un análogo nucleotídico marcado, un medio para
detectar y/o cuantificar un análogo nucleotídico marcado, un
cebador, una ribonucleasa específica monocatenaria, e instrucciones
para llevar a cabo un ensayo de protección de ARNasa.
El componente o componentes del kit se pueden
envasar en un envase conveniente, apropiado. Los componentes se
pueden envasar separadamente, o en una o múltiples
combinaciones.
La invención se ilustra adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos no limitantes.
Moléculas de ARN que codifican el replicón de
HCV (es decir, ARN del replicón víricos) se transfectan en células
Huh-7 usando electroporación.
El equipo y los materiales para el mantenimiento
celular incluyen, pero no se limitan a, células
Huh-7 que contienen el replicón del HCV, medio de
mantenimiento (DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco)
suplementado con 10% de FBS (suero fetal bovino),
L-glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina
(100 unidades/ml), estreptomicina (100 microgramos/ml), y 500
microgramos/ml de geneticina (G418), medios de cribado (DMEM
suplementado con 10% de FBS, L-glutamina, y
aminoácidos no esenciales, penicilina (100 unidades/ml) y
estreptomicina (100 microgramos/ml)), placas de cultivo de tejidos
de 96 pocillos (fondo plano), placas de 96 pocillos (fondo en U
para dilución del fármaco), interferón alfa para control positivo,
reactivo de fijación (tal como metanol:acetona), anticuerpo
primario (anti-NPTII de conejo), anticuerpo
secundario: Eu-N11, y disolución de
potenciación.
Las células que contienen el replicón de HCV
soportan niveles elevados de replicación del ARN vírico cuando su
densidad es adecuada. La sobreconfluencia puede provocar una
replicación disminuida del ARN vírico. Por lo tanto, las células se
deberían de hacer crecer en fase logarítmica en presencia de 500
microgramos/ml de G418. Generalmente, las células se deberían de
hacer pasar dos veces a la semana a una dilución
1:4-6. El mantenimiento de las células se lleva a
cabo según lo siguiente:
Las células que contienen el vector del ADN del
replicón de HCV se examinan bajo un microscopio para asegurarse de
que las células están creciendo bien. Las células se enjuagan una
vez con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), y se añaden
2 ml de tripsina. La mezcla célula/tripsina se incuba a 37ºC en una
incubadora de CO_{2} durante 3-5 minutos. Tras la
incubación, se añaden 10 ml de medio completo para detener la
reacción de tripsinización. Las células se soplan suavemente, se
ponen en un tubo de 15 ml, y se hacen girar a 1200 rpm durante 4
minutos. La disolución de tripsina/medio se elimina y se recuperan
las células peletizadas.
Se purifican fracciones de membrana a partir de
células Huh-7 transfectadas con el ARN del replicón
de HCV según el procedimiento dado por Hardy, et al. (J.
Virol. (2003) 77:2029-2037). De forma breve, las
células que contienen el replicón de HCV se lavan con 1 X PBS, se
resuspenden en tampón hipotónico frío (10 mM de
Tri-HCl, pH 7,8, 10 mM de NaCl), y se colocan en
hielo durante 20 minutos. Las células hinchadas se destruyen usando
un homogeneizador Dounce. La mezcla se centrifuga a 900 X g durante
5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se transfiere a un tubo reciente y
se centrifuga a 15000 X g durante 25 minutos a 4ºC. El pelete, que
contiene la fracción de membrana, se resuspende en tampón de
almacenamiento (tampón hipotónico con 15% de glicerol), y se puede
almacenar a -80ºC.
La replicación in vitro del ARN se lleva
a cabo según el procedimiento de Lai (J. Virol. (2003)
77:2295-2300) con algunas modificaciones. El
compuesto de ensayo (1 \muM a 100 \muM en 0,5 \mul de DMSO) se
preincuba con la fracción de membrana (complejos de replicasa
aislados y ARN molde del replicón vírico aislado) (10 \mul)
durante 10 minutos a 30ºC antes de que se añada la mezcla de
replicación. La mezcla de replicación (volumen total de 50 \mul)
contiene 50 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de KCl, 10 mM de MgCl_{2}
50 U de ARNsin, 10 \mug/ml de actinomicina D, 2,5 mM de ATP, 0,5
mM de cada uno de CTP, GTP, Br-UTP y la fracción de
membrana preincubada (es decir, el complejo de replicasa y el ARN
molde del replicón vírico). La mezcla de replicación se incuba a
30ºC durante 2 horas, seguido de la purificación usando TRIZOL
(Invitrogen, Carlsbad, CA) o RNA EASY (Qiagen, Valencia, CA) según
las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se
inmunoprecipitan entonces usando anticuerpo monoclonal
anti-BrdU (Molecular Probes, Eugene, OR) y proteína
A agarosa (Invitrogen) en 200 \mul a 400 \mul de tampón de
precipitación que contiene 1 X PBS, 0,05% de NP 40, 0,1
\mug/\mul de ARNt, 5 U/\mul de ARNsin, y 0,3 M de
uridina.
Cuando el segmento recientemente sintetizado
cerca del sitio de iniciación es de interés, se usa un ensayo de
protección de ARN tras marcar con Br-UTP y purificar
el ARN. La sonda de ARN para el segmento de 15 a 433 nt (SEC ID
NO:6) se sintetiza usando un kit de transcripción in vitro
(MAXIscript, Ambion). El molde de ADN para la transcripción in
vitro se obtuvo mediante PCR usando el cebador directo 5'
GGGGGCGACACTCCACCATAGAT (15-37) (SEC ID NO: 7) y el
cebador inverso 5' ATTTAGGTGACACTATAGAAACCCAAGCGGCCGGAGAACCT
(413-433, secuencia central SP6 plus) (SEC ID NO:8)
sobre el vector de ADN para ARN de HCV del replicón o ADNc obtenido
a partir de ARN de HCV del replicón mediante transcriptasa inversa.
El ARN se protege usando un kit de ensayo de protección de ARN (por
ejemplo RPA III, Ambion, Austin, TX). De forma breve, en el ensayo
de protección de ARN, los ARN del replicón recientemente
sintetizados se hibridan a la sonda de ARN. Los ARN hibridados se
tratan entonces con una mezcla de ribonucleasa A y ribonucleasa T1
para digerir el ARN monocatenario. El ARN bicatenario que queda se
puede precipitar entonces antes de la detección.
El ARN del HCV recientemente sintetizado
producido en el sistema libre de células se detecta
cuantitativamente usando PCR en tiempo real. La Tabla 1 muestra los
datos para varios experimentos de control. Se usó una sonda Taqman®
marcada con el colorante fluorescente FAM.
Como se observa a partir de la Tabla 1, para ARN
molde aislado de células Huh-7 que expresan el
replicón de HCV con Br-UTP en la mezcla de
replicación, se observa un número elevado de copias del ARN del
replicón tanto con como sin la precipitación con un anticuerpo
anti-BrdUTP. Si no se usa anticuerpo
anti-BrdUTP, la muestra sin precipitación tiene un
número elevado de copias del ARN del replicón de HCV, mientras que
la población precipitada tiene sólo una cantidad de fondo. Si las
células Huh-7 no se transfectan con el replicón del
HCV (es decir, sin ARN molde), se observa una cantidad de fondo del
ARN del replicón con o sin precipitación con un anticuerpo
anti-BrdU. Si no hay Br-UTP en la
mezcla de replicación con ARN molde aislado de células
Huh-7 que expresan el replicón de HCV, la muestra
sin precipitación tiene un número elevado de copias de ARN del
replicón de HCV, mientras que la población precipitada sólo tiene
una cantidad de fondo. De este modo, los experimentos de control
dieron los resultados esperados.
Como se muestra en la Tabla 2, el número de
copias del ARN de HCV medido mediante PCR cuantitativo depende de
la cantidad de ARN molde añadida a la mezcla de replicación. En la
Tabla 2, HCV es una mezcla de replicación con ARN molde aislado de
células Huh-7 que expresan el replicón de HCV. HCV
(1/2) y HCV (1/8) son mezclas de replicación que contienen ½ y 1/8
de la cantidad del ARN molde, respectivamente. Huh-7
(sin HCV) es un control sin molde de HCV como se describe
anteriormente. Sin Br-UTP es un control en el que se
añade a la mezcla de replicación ARN molde aislado de células
Huh-7 que expresan el replicón de HCV, pero no
Br-UTP.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 2, el número de
copias de los replicones de HCV medido en el ensayo, tanto con como
sin precipitación con un anticuerpo anti-BrdUTP, es
directamente proporcional a la cantidad de ARN del replicón molde
añadida a la mezcla de reacción.
La Tabla 3 muestra los datos para un inhibidor
conocido de la replicación del ARN del HCV que se ensaya usando el
ensayo descrito, a una concentración de 10 \muM. El compuesto de
ensayo es un compuesto publicado (Dhanak et al., J. Biol.
Chem. (2002) 41):38322-7. Más abajo se muestra la
estructura del compuesto de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 3, aunque el tratamiento con el
compuesto de ensayo da como resultado una reducción menor de la
mitad en la síntesis del ARN vírico total sin protección de ARNasa,
provoca una reducción próxima a 10 veces en la cantidad de síntesis
de ARN vírico recientemente iniciado tras llevar a cabo la
protección de ARNasa. De este modo, el compuesto de ensayo inhibe
la síntesis de ARN de HCV en la etapa de iniciación.
Los resultados dados a conocer en este ejemplo
validan este ensayo para la identificación y obtención de un perfil
del compuesto. El ensayo tiene la ventaja de detectar
cuantitativamente ARN de HCV recientemente sintetizado, y permitir
también el segmento específico de nuestra elección.
Se usó un ensayo de replicación de ARN para
determinar si los complejos de replicación aislados de una fracción
de membrana fueron enzimáticamente activos. Para determinar si los
complejos de replicación aislados fueron capaces de la iniciación
de novo de ARN recientemente sintetizado, se empleó el
compuesto de ensayo (un inhibidor de la iniciación). Las mezclas de
replicación estándar contenían 50 mM de HEPES (pH 7,3); 10 mM de
KCl; 10 mM de MgCl_{2}; 0,3 mM de MnCl_{2}; 20 unidades de
inhibidor de ARNasa; 10 \mug de actinimicina D por ml; 0,5 mM de
ATP, GTP, y UTP; 10 \muCi de [\alpha-P^{32}]
CTP; y 6 \mul de la fracción de membrana en un volumen total de
60 \mul. Las mezclas de reacción se incubaron a 30ºC durante 2
horas. Los productos de ARN se extrajeron con fenolcloroformo, se
precipitaron con etanol y se separaron en un gel de agarosa al 1%
no desnaturalizante. Tras la electroforesis, el gel se fijó con
ácido acético glacial al 10% y después en etanol, y se secó antes
de la autorradiografía.
La Figura 2 muestra un autorradiograma de los
resultados experimentales. La línea 4 es una línea de control sin
inhibidor añadido. Las líneas 1-3 muestran los
resultados con concentraciones de inhibidor de la iniciación de
100, 20 y 4 \muM, respectivamente. Como se muestra claramente en
el autorradiograma, la adición del inhibidor de la iniciación
reduce la cantidad de ARN monocatenario producido por el complejo de
replicación. En el ensayo, el ARN bicatenario se produce
principalmente a partir del alargamiento de ARN previamente
iniciados, mientras que el ARN monocatenario se produce a partir de
ARN recientemente iniciados. La presencia de una banda de ARN
monocatenario en la línea 4 del control muestra que los ARN
recientemente iniciados se forman durante la replicación. Cuando el
compuesto de ensayo, un inhibidor de la iniciación de la síntesis de
ARN conocido, se añade durante la replicación, la banda de ARN
monocatenario desaparece, mientras que continúa la banda de ARN
bicatenario. De este modo, empleando un inhibidor de la iniciación
de la síntesis de ARN, se confirma que la iniciación de la síntesis
de ARN de novo se produce en complejos de replicasa
aislados.
Se ha descrito un método para identificar
inhibidores de la síntesis de ARN del replicón vírico usando la
detección y/o cuantificación de una población de ARN recientemente
sintetizado. Una disminución en la cantidad de ARN recientemente
sintetizado obtenido en presencia de un compuesto de ensayo en
comparación con un control sin compuesto de ensayo indica que el
compuesto de ensayo es un inhibidor de la síntesis de ARN del
replicón vírico. El método es particularmente útil para identificar
inhibidores del alargamiento del ARN. Además, se puede emplear un
ensayo de protección de ARNasa sobre el ARN recientemente
sintetizado para identificar inhibidores de la iniciación del ARN.
Se ha demostrado claramente que los complejos de replicación
aislados son capaces de la iniciación de novo además del
alargamiento del ARN previamente iniciado. Una ventaja del método
es que los inhibidores de la iniciación se pueden distinguir de los
inhibidores del alargamiento. Otra ventaja es que la cuantificación
de la población de ARN recientemente sintetizado se emplea para
identificar inhibidores de la síntesis del ARN del replicón vírico.
Otra ventaja es que se puede usar un nucleótido
2'-O-metilado para incrementar el
rendimiento de ARN recientemente sintetizado producido durante la
replicación.
A partir de lo anterior se apreciará que, aunque
se han descrito aquí con fines ilustrativos realizaciones
específicas de la invención, se pueden realizar diversas
modificaciones sin desviarse del alcance de la invención.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Achillion Pharmaceuticals
\hskip1cmHuang, Mingjun
\hskip1cmSun, Yongnian
\hskip1cmYang, Wengang
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ENSAYO CUANTITATIVO PARA LA
DETECCIÓN DE ARN RECIENTEMENTE SINTETIZADO EN UN SISTEMA LIBRE DE
CÉLULAS E IDENTIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> API-0005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/555.765
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-04-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7989
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8024
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8001
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8649
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8637
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggggcgaca ctccaccata gat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttaggtga cactatagaa acccaagcgg ccggagaacc t
\hfill41
Claims (18)
1. Un método para determinar si un compuesto de
ensayo inhibe la síntesis de ARN de un virus de ARN de hebra
positiva, que comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- detectar la nueva población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marca- do;
- cuantificar la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo;
- comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de una población de ARN recientemente sintetizado de control que comprende el análogo nucleotídico marcado producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad del ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y
en el que la etapa de puesta en contacto incluye
poner en contacto con
2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método para cuantificar ARN recientemente
iniciado de un virus de ARN de hebra positiva, que com-
prende:
prende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de un replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, y un análogo nucleotídico marcado, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro de ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- hibridar una sonda y la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la transcripción de la población de ARN recientemente sinteti- zado;
- digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- detectar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado; y
- cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado; y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método para determinar si un compuesto de
ensayo es un inhibidor de la iniciación de la síntesis de ARN de un
virus de ARN de hebra positiva, que comprende:
- poner en contacto un complejo de replicasa aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un ARN molde de replicón vírico aislado para el virus de ARN de hebra positiva, un análogo nucleotídico marcado, y el compuesto de ensayo, en condiciones suficientes para la síntesis in vitro del ARN, para formar una población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- hibridar una sonda y la población de ARN recientemente sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado, en condiciones de hibridación restrictivas, en el que la sonda es complementaria a al menos una porción de una región de iniciación de la población de ARN recientemente sintetizado;
- digerir ARN no hibridado, monocatenario, con una ribonucleasa específica monocatenaria para formar una población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- detectar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado;
- cuantificar la población de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado para proporcionar una cantidad de ARN de ensayo; y
- comparar la cantidad de ARN de ensayo con una cantidad de ARN de control de ARN protegido que comprende el análogo nucleotídico marcado pero producido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una disminución en la cantidad de ARN de ensayo en comparación con la cantidad de ARN de control indica que el compuesto de ensayo inhibe el inicio de la síntesis del ARN del virus de ARN de hebra positiva; y en el que la etapa de puesta en contacto incluye poner en contacto con 2'-O-metil-5-metiluridin-5-trifosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El método de la reivindicación 1 ó 3, que
comprende además proporcionar el complejo de replicasa aislado y el
ARN molde del replicón vírico aislado:
- transfectando una estirpe celular con un ARN del replicón vírico o un molde de ADN para un replicón vírico para proporcionar una estirpe celular transfectada,
- incubando la estirpe celular transfectada en condiciones adecuadas para la producción de complejos de replicasa víricos, y
- aislando los complejos de replicasa y el ARN molde del replicón vírico a partir de la fracción de membrana celular de las células transfectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
5. El método de la reivindicación 4, en el que
el virus de ARN de hebra positiva es el virus de la hepatitis C y
el molde de ADN para el replicón vírico es SEC ID NO: 1, SEC ID NO:
2, SEC ID NO:3, SEC ID NO: 4, o SEC ID NO: 5.
6. El método de la reivindicación 2, que
comprende además proporcionar el complejo de replicasa aislado y el
ARN molde del replicón vírico aislado:
- transfectando una estirpe celular de hepatoma humano con un ARN de replicón vírico o un molde de ADN para un replicón vírico para proporcionar una estirpe celular transfectada,
- incubando la estirpe celular transfectada en condiciones adecuadas para la producción de complejos de replicasa víricos, y
- aislando los complejos de replicasa que comprenden el ARN molde del replicón vírico procedente de la fracción de membrana celular de las células transfectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método de la reivindicación 6, en el que
el molde de ADN para el replicón vírico es SEC ID NO: 1, SEC ID NO:
2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, o SEC ID NO: 5.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además proporcionar el
complejo de replicasa aislado que comprende el ARN molde del
replicón vírico
- incubando una célula primaria o estirpe celular infectada con un virus de ARN de hebra positiva en condiciones adecuadas para la producción de complejos de replicasa víricos, y
- aislando los complejos de replicasa que comprenden el ARN molde del replicón vírico a partir de la fracción de membrana celular de las células infectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El método de la reivindicación 1 ó 3, en el
que el virus de ARN de hebra positiva es el virus de la hepatitis
C.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el análogo nucleotídico marcado
es un análogo capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico,
un análogo que se puede reconocer vía una reacción de unión de
especificidad elevada, o un análogo detectable directamente como
resultado de una propiedad física del análogo.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
el análogo nucleotídico marcado es un análogo capaz de ser
reconocido por un anticuerpo específico.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
el análogo nucleotídico marcado es Br-UTP.
13. El método de la reivindicación 11, en el que
la detección comprende poner en contacto el ARN recientemente
sintetizado con un anticuerpo específico para el análogo
nucleotídico marcado, e inmunoprecipitar el ARN recientemente
sintetizado que comprende el análogo nucleotídico marcado para
formar ARN inmunoprecipitado.
14. El método de la reivindicación 13, en el que
el análogo nucleotídico marcado es Br-UTP, y el
anticuerpo específico es un anticuerpo
anti-BrdU.
15. El método de la reivindicación 14, en el que
la cuantificación del ARN recientemente sintetizado comprende
llevar a cabo una PCR en tiempo real sobre el ARN
inmunoprecipitado.
16. El método de la reivindicación 10, en el que
el análogo directamente detectable como resultado de una propiedad
física del análogo es un nucleótido radioactivo.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
la detección comprende electroforesis en gel.
18. El método de la reivindicación 1, en el que
el compuesto de ensayo es un inhibidor del alargamiento del ARN, un
inhibidor de la iniciación de la síntesis del ARN o un inhibidor de
la actividad del complejo de replicasa.
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT281862B (de) * | 1968-07-11 | 1970-06-10 | Robugen Gmbh | Verfahren zur Herstellung von neuen 2'-Desoxyuridinen |
| US5614403A (en) * | 1994-06-01 | 1997-03-25 | Baylor College Of Medicine | In vitro replication system capable of rescuing cloned and manipulated rotavirus genes |
| JPH08154687A (ja) * | 1994-12-12 | 1996-06-18 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | アンチセンスオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤 |
| IT1278077B1 (it) * | 1995-05-25 | 1997-11-17 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Metodologia per riprodurre in vitro le attivita' di rna polimerasi rna-dipendente e di nucleotidiltransferasi terminale codificate dal |
| US5770370A (en) * | 1996-06-14 | 1998-06-23 | David Sarnoff Research Center, Inc. | Nuclease protection assays |
| US20030004122A1 (en) * | 1997-11-05 | 2003-01-02 | Leonid Beigelman | Nucleotide triphosphates and their incorporation into oligonucleotides |
| US6004754A (en) * | 1998-01-21 | 1999-12-21 | Becton Dickinson And Company | DNA sequence, related probes and primers for the detection of Streptococcus agalactiae |
| WO2000033635A2 (en) * | 1998-12-10 | 2000-06-15 | Eli Lilly And Company | Primer-independent rna synthesis catalyzed by hcv polymerase |
| AU2405300A (en) * | 1999-01-05 | 2000-07-24 | Advanced Research And Technology Institute, Inc. | Uses of flavivirus rna-dependent rna polymerases |
| DE19915178A1 (de) * | 1999-04-03 | 2000-10-05 | Univ Mainz Johannes Gutenberg | Hepatitis C Virus Zellkultursystem |
| EP1111040A1 (en) * | 1999-12-10 | 2001-06-27 | Daniel Favre | Infection of eukaryotic cells with viruses in vitro |
| US6447994B1 (en) * | 2000-06-20 | 2002-09-10 | The General Hospital Corporation | Production of replicative hepatitis C virus |
-
2005
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