JPH10511556A

JPH10511556A - Ｈｃｖｎｓ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリぺプチドを製造し、精製し、分析する方法

Info

Publication number: JPH10511556A
Application number: JP9510082A
Authority: JP
Inventors: シュタインキュラー，クリスチャン; ペッシ，アントネロ; ビアンチ，エリザベッタ; タリアニ，マリナ; トメイ，リシア; ウルバニ，アンドレア; フランセスコ，ラファエルデ; ナルイェス，フランク
Original assignee: イスチチュートデイリセルシュデイバイオロジアモレコラレピー．アンジェレッティソシエタペルアチオニ
Priority date: 1995-08-22
Filing date: 1996-08-20
Publication date: 1998-11-10
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: DE69634406D1; EP0846164B1; AU716379B2; DE69634406T2; ES2236743T3; WO1997008304A3; DK0846164T3; PT846164E; US6197536B1; WO1997008304A2; AU6668696A; JP3310298B2; ITRM950573A1; CA2228265C; ATE290070T1; CA2228265A1; CN1193997A; EP0846164A2; ITRM950573A0; IT1277914B1

Abstract

(57)【要約】本発明による方法は、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリペプチドの純粋な触媒活性形でかつＮＳ３プロテアーゼ阻害剤を発見し、ＮＳ３プロテアーゼの三次元構造を評価するために充分である量で発現させ、単離することを可能にする。本発明の他の課題は、上記ポリペプチドのタンパク質分解活性を完全にするために必要な化学的かつ物理的条件を定義する方法である。本発明はさらに、培養細胞中に上記ポリペプチドを発現させることができるヌクレオチド配列を含有する新規な組成物（発現ベクター）を含む。最後に、上記タンパク質分解活性を測定するために適し、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤を開発するために、それ故ＨＣＶに対して用いるための治療剤を開発するために有用な、新規な化合物を定義する。図はＳ３デプシペプチド基質（配列番号：４５）を用いて、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの動力学パラメーターを示す。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリペプチドを製造し、精製し、分析する方法本発明は分子生物学と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ウイルス学とに関する。さらに詳しくは、本発明はその課題として、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリペプチドを純粋な形でかつ多量に製造する方法と、ＮＳ３に付随する酵素活性を阻害する化合物を治療目的のために選択することができる酵素分析法を定義するために、これらのペプチドのタンパク質分解活性を in vitroで有効に再現する方法とを有する。知られているように、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ）の主要な病原体である。ＨＣＶが輸血後ＮＡＮＢウイルス性肝炎の少なくとも９０％と、散発性ＮＡＮＢ肝炎の５０％との病因であると推定される。血液ドナーの選択と、輸血に用いられる血液の免疫学的特徴付けとには大きな進歩がなされているが、輸血のレシピエントにはまだ非常に多くのＨＣＶ感染が生じている（世界中で毎年１００万件以上の感染）。ＨＣＶ感染者の約５０％が５〜４０年間の範囲でありうる期間内に肝硬変を発症する。さらに、最近の臨床研究は、慢性的ＨＣＶ感染症と肝細胞癌の発症との間に相互関係があることを示唆する。ＨＣＶは約９．４kbのＲＮＡポジティブゲノムを含有する被覆ウイルス(envel oped virus)である。このウイルスはフラビウイルス科のメンバーであり、この科の他のメンバーはフラビウイルスとペスチウイルスである。ＨＣＶのＲＮＡゲノムは最近マッピングされている。世界の様々な領域において単離されたＨＣＶゲノムからの配列の比較は、これらの配列が極めてヘテロでありうることを実証している。ＨＣＶゲノムの大部分は９０３０〜９０９９ヌクレオチドの間で変化しうるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）によって占められている。このＯＲＦは、その長さが３０１０〜３０３３アミノ酸の範囲で変化しうる単ウイルスポリプロテインをコードする。ウイルス感染サイクル中に、ポリプロテインはタンパク質分解的にプロセシングされて、ウイルスの複製に必要な個々の遺伝子産物になる。ＨＣＶ構造タンパク質をコードする遺伝子はＯＲＦの５’末端に配置され、非構造タンパク質をコードする領域がＯＲＦの残部を占める。構造タンパク質はＣ（コア、２１kDa）と、Ｅ１（エンベロープ、ｇｐ３７）と、Ｅ２（ＮＳ１、ｇｐ６１）とから成る。Ｃは２１kDa の非グリコシル化タンパク質であり、ウイルス・ヌクレオキャプシドをおそらく形成すると思われる。タンパク質Ｅ１は約３７kDa の糖タンパク質であり、外部ウイルスエンベロープの構造タンパク質であると考えられる。６１kDa の別の膜糖タンパク質であるＥ２は、おそらくウイルスの外部エンベロープ中の第２構造タンパク質であると思われる。非構造領域は、その機能が未知である２４kDa の疎水性タンパク質である、ＮＳ２（ｐ２４）から開始する。ポリプロテイン中でＮＳ２の次にくる６８kDa のタンパク質であるＮＳ３は、２つの機能的ドメイン、最初の２００アミノ末端アミノ酸内のセリンプロテアーゼ・ドメインと、カルボキシ末端におけるＲＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ・ドメインとを有すると予想される。ＮＳ４遺伝子領域は、それぞれ、６kDa 及び２６kDa の疎水性タンパク質である、ＮＳ４（ｐ６）及びＮＳ４Ｂ（ｐ２６）をコードする、これらのタンパク質の機能はまだ完全には解明されていない。ＮＳ５遺伝子領域も、それぞれ、５６kDa 及び６５kDa のＮＳ５Ａ（ｐ５６）とＮＳ５Ｂ（ｐ６５）の２種類のタンパク質をコードする。全てのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ中に存在するアミノ酸配列をＮＳ５領域内に認めることができる。このことは、ＮＳ５領域がウイルス複製機構の成分を含有することを示唆する。様々な分子生物学研究は、シグナルペプチダーゼ、宿主細胞の小胞体に付随するプロテアーゼが非構造領域、即ち、部位Ｃ／Ｅ１、Ｅ１／Ｅ２及びＥ２／ＮＳ２におけるタンパク質分解プロセシングの要因であることを示している。ＮＳ３におけるセリンプロテアーゼは、ＮＳ３とＮＳ４Ａとの間、ＮＳ４ＡとＮＳ４Ｂとの間、ＮＳ４ＢとＮＳ５Ａとの間及びＮＳ５ＡとＮＳ５Ｂとの間の結合における切断の要因である。特に、このセリンプロテアーゼによってなされた切断が、切断部位のアミノ末端側（位置Ｐ１）にシステイン残基又はトレオニン残基を残し、カルボキシ末端側（位置Ｐ１’）にアラニン残基又はセリン残基を残すことが判明している。ＮＳ３中に含有されるプロテアーゼがタンパク質ＮＳ４Ａと複合体を形成する、in vivo のヘテロダイマータンパク質であることが実証されている。この複合体の形成は部位ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂにおけるタンパク質分解活性を高め、部位ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａのタンパク質分解プロセシングのための必要な要件である。ＨＣＶの第２プロテアーゼ活性はＮＳ２とＮＳ３との間の切断の要因であると思われる。このプロテアーゼ活性はＮＳ２の部分と、セリンプロテアーゼ・ドメインを含有するＮＳ３の部分との両方を含む領域に含有されるが、後者と同じ触媒機構を用いない。タンパク質ＮＳ３に関連したタンパク質分解活性を妨害することができる物質は新規な治療剤を構成することができると考えられる。実際に、このプロテアーゼ活性の阻害はＨＣＶポリプロテインの非構造領域のタンパク質分解プロセシングの中断を含み、その結果として、感染した細胞のウイルス複製を防止すると考えられる。この一連のイベントが、ＨＣＶとは異なり、細胞系培養物を感染させる相同性（homologous）フラビウイルスに関して実証されている。この場合に、その触媒活性をもはや行使することができないプロテアーゼの作製を含む遺伝子操作はウイルスが複製する能力を完全に破壊することが判明している（１）。さらに、ＨＩＶプロテアーゼ活性を妨害することができる化合物がこのウイルスの複製を阻害することができることが、in vitroと臨床研究の両方で広範囲に示されている（２）。治療能力を有する分子の作製に用いられる方法は、この分野で活動する人々に知られている。一般的にいえば、分子的多様性（high molecular diversity）を有する多数の単独化学的エンティティ（single chemical entity）を含有する化合物群を作成し、次に、単独の活性剤を同定するために自動化分析を受けさせ、次に、これらの活性剤の治療能力を改良するためにさらに化学的修飾を受けさせる。他のアプローチは、審査中のタンパク質の生物学的活性を変化させるか又は破壊することができる高結合アフィニティ化合物を開発する目的で、特定のターゲットタンパク質の基質又はリガンドを合理的に修飾することを包含しうる。Ｘ線結晶学又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）として当該分野で公知の方法によって、ターゲットタンパク質の三次元構造を測定することは、タンパク質に特異的に結合し、この結果として、同タンパク質の生物学的活性を妨害する能力を有する分子の合理的な設計を可能にする。Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質に含有されるプロテアーゼの生物学的活性に干渉することができる化合物に関する研究は、不変の触媒性を有する精製タンパク質を充分な量で製造することの困難さと、in vitroにおける酵素活性を強化するために補因子を用いる必要性とによって妨げられる。それ故、特定の分野では、ＮＳ３又は同様な製品を今までに可能であったよりも多量に、かつ阻害剤を選択するために充分な in vitro 活性を有するように製造する方法が必要とされている。本発明は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３のタンパク質分解活性を有する、単離精製されたポリペプチドであって、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５の配列から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチドから成る。本発明はまた、ＨＣＶＮＳ３のタンパク質分解活性を有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５の配列によって表されるポリペプチドを製造するための発現ベクターであって、前記ポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチドと、前記ポリペプチドの１つをコードする前記ポリヌクレオチドに機能的に結合した、前記宿主細胞中の機能的調節配列、転写配列及び翻訳配列と、任意の選択可能なマーカーとを含む発現ベクターをも含む。本発明はまた、宿主細胞に特定のコードされたポリペプチドを選択された配列に発現させるような方法で、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて形質転換させた、真核細胞又は原核細胞に拘わらず、宿主細胞にも及ぶ。本発明はさらに、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５を含む群から選択された配列を有するポリペプチドの製造方法であって、下記操作：上記発現ベクターの１つを用いて、真核細胞又は原核細胞のいずれかの宿主細胞を形質転換させる工程；選択されたポリペプチドを製造するために望ましいヌクレオチド配列を発現させる工程；及び再可溶化プロトコールを避けて、このようにして得られたポリペプチドを精製する工程を組合せて含むことを特徴とする方法を含む。本発明はまた、その目的として、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を in vitro で再現する方法であって、ＮＳ３に類似した、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５から成る群から選択された配列を有する精製ポリペプチドの活性を３０〜７０mM Tris pH６．５〜８．５と、３〜３０mM ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と、０．５〜３％３−［（３−コラミド−プロピル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）と、３０〜７０％グリセロールとを含有する溶液中で２０〜２５℃の温度において再現することと、これらの条件下で、上記ポリペプチドの活性を補因子の不存在下でもペプチド基質上で動力学的に測定し、定量することができることを特徴とする方法を有する。ポリペプチド、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５のプロテアーゼ活性の分析は、検出可能な生成物を生じる基質を切断することによって行うことができる。この切断は好ましくは放射能シグナル、比色シグナル又は蛍光測定シグナルに基づく方法を用いて検出する。例えばＨＰＬＣ等のような方法も適する。本発明によると、用いる基質はＨＣＶポリプロテインＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ結合に相当する合成ペプチドである。必要な場合には、配列番号：６のアミノ酸配列又はその一部を含有するペプチドを、ＮＳ３プロテアーゼの補因子として用いることもできる。基質として用いるために適したペプチドは、配列番号：７の配列と、Ｎ及び／又はＣ末端欠失を有するその誘導体（配列番号：８〜１２、１４、１８〜２０）によって表されるペプチドと、配列番号：４７の配列によって表されるペプチドである。配列番号：１８〜２０、特に配列番号：１８の配列によって表されるデカペプチドと、それらから誘導される配列番号：２９〜３２、３５の配列とが特に適する。これらのペプチドは１００〜２００nMの後者の濃度におけるＮＳ３プロテアーゼ活性の高スループット分析に用いることができる。本発明によると、デカペプチド基質（配列中に少なくとも１つのエステル結合を有するペプチド）も、ＮＳ３プロテアーゼ活性の高スループット分析に有利に用いることができる。充分な基質転化に適合する最低に可能な酵素濃度において分析を行うことが望ましいということが実際に知られている。このことは阻害に対する感度を最大にし、化合物混合物又は組合せライブラリー中に非常に低い濃度で存在する阻害剤のスクリーニングを可能にする。残基Ｐ１とＰ１’間の切断しやすい結合に標準アミドを有するＮＳ３プロテアーゼの基質は、３０〜１００Ｍ^-1ｓ^-1のＫ_cat／Ｋ_m値を有する。これは１００〜２００nMの高スループット分析の酵素濃度の実際の範囲を設定する。この濃度を減ずるためには、さらに高いＫ_cat／Ｋ_m値を有する基質を用いることが必要である。Ｐ１とＰ１’間のエステル結合を含有する基質がこのために理想的に適する、というのは、アシル−酵素中間体の形成が熱力学的に一層有利なエステル交換反応のために非常に容易に達成されるからである（８）。本発明によるデプシペプチド基質は非常に高いＫ_ca _t ／Ｋ_m値を有し、これは高スループット分析におけるＮＳ３濃度の有効範囲を０．５〜２nMにする。これらの基質は標準の化学的方法によって固相で高収率において合成することができる。慣用的な分析法は高スループット・スクリーニングに適するが、これらの分析法は、生成物を便利に検出することができるまでに、基質の少なくとも１０％を加水分解することを必要とする。このことは、正確な動力学的研究のために重要な真の初期速度の決定を妨げる。これらの困難さを克服するために、プロテアーゼ活性の連続的モニターリングを可能にする分析法が開発されている。この分析法は、基質の加水分解の程度に正比例する直接の連続的なシグナル発生を可能にし、それ故に反応生成物から基質を分離する必要性を回避することのできる、特別仕立ての合成基質に依存する。用いるデプシペプチド（配列番号：４５と４６）（これらの化学式は図１２に記載する）は、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）に基づく内部的に消光される蛍光発生基質（internally quenched fluorogenic su bstrate)である。これらはペプチドの一方の末端近くの蛍光ドナー、５−［（２ ’−アミノエチル）アミノ］ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）と、他方の末端近くのアクセプター基、４−［［４’−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）とを含有する。この種の基質の蛍光はドナーとアクセプターとの間の分子内ＲＥＴによって最初に消光されるが、酵素が基質を切断すると、蛍光が増大する。ＥＤＡＮＳとＤＡＢＣＹＬとは、前者の蛍光発光と後者の吸光との間の良好なスペクトル・オーバーラップのために、ドナー／アクセプター対として選択された（１３〜１７）。ＲＥＴ効率はドナーとアクセプターとの間の距離に依存する、即ち、両者が接近すればするほど、消光は高度になる。ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ組合せに関して、５０％エネルギー転移のためのFoer ster距離(Ｒ₀)は３３Åである。基質中の報告されたＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ間の最大距離は１１アミノ酸であり（１９）、これはペプチドの伸長された構造を推定すると、Ｒ＝３９．８Åに相当し、算出ＲＥＴ効率は２４．５％である。これは基質切断時の蛍光の１０倍増大に相当する。これまでは、本発明を一般的に説明した。次には、本発明の目的、特徴、利点及び操作方法をさらに良好に理解するために、下記実施例によって、本発明の特定の実施態様をさらに詳細に説明する。図１は、Spodoptera frugiperdaクローン９細胞に配列番号：１によって表されるポリペプチドの転移と発現のために用いられるプラスミドベクターを示す。図２Ａと２Ｂは、それぞれ、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５の配列によって表されるポリペプチドのE．coliにおける転移と発現のためのプラスミド・ベクターを示す。図３は、グリセロールの濃度の関数としてのＮＳ３活性を示す。図４は、ＣＨＡＰＳ、３−「（３−コラミド−プロピル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホネートの濃度の関数としてのＮＳ３活性を示す。図５は、pHの関数としてのＮＳ３活性を示す。図６は、イオン強度の関数としてのＮＳ３活性を示す。図７は、基質としてペプチドＡｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ε− （３^H）−Ａｃ（配列番号：４７）を用いるＮＳ３活性を測定するための酵素分析のダイヤグラムを示す。図８は、配列番号：４２の配列によって表されるデプシペプチド基質Ｓ１を合成するための反応ダイヤグラムを示す。図９は、配列番号：４３の配列によって表されるデプシペプチド基質Ｓ２を合成するための反応ダイヤグラムを示す。図１０は、配列番号：４４の配列によって表される放射性デプシペプチド基質Ｓ１を合成するための反応ダイヤグラムを示す。図１１は、ＮＳ３プロテアーゼ活性を測定するための、放射能シグナルに基づいた高スループット分析法を示す。図１２は、ＲＥＴ分子内蛍光消光に基づいてＮＳ３活性を連続的に分析するためのデプシペプチド基質（配列番号：４５と配列番号：４６）の化学式を示す。図１３は、デプシペプチド基質Ｓ３（配列番号：４５）を合成するための反応ダイヤグラムを示す。図１４Ａと図１４Ｂは、それぞれ、関連分析法における基質Ｓ３（配列番号：４５）によるＮＳ３プロテアーゼの動力学パラメーターと、時間の関数としての蛍光とを示す。実施例１ Spodoptera frugiperda クローン９培養細胞におけるＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの発現方法バキュロウイルスベクターに感染した、例えばSpodoptera frugiperdaクローン９（Ｓｆ９）細胞のような昆虫培養細胞中の外来遺伝子の発現系は、技術上公知である（３）。異種遺伝子は通常、Autographa california核多角体病ウイルス又はBombix mori核多角体病ウイルスの強度なポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。相同的組換えによるバキュロウイルスベクターの所望の部位への異種ＤＮＡの導入方法も技術上周知である（４）。プラスミドベクターｐＢａｃＮＳ３（１０３９〜１２２６）はｐＢｌｕｅＢａｃIII(Invitrogen)の誘導体であり、ＮＳ３の活性を有するポリペプチド（１０３９〜１２２６）をコードする遺伝子を転移させるために構築した。この目的のために、配列番号：１に表されたこのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列の５’にＡＴＧコドンを、３’にＴＡＧ停止コドンを挿入するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって得られた。この方法によって得られたフラグメントを、Klenow ＤＮＡポリメラーゼフラグメントによる処理に続いて、ベクターｐＢｌｕｅＢａｃIII のＢａｍＨｌ部位に挿入した。このプラスミドは図１に示す。 Spodoptera frugiperdaクローン９（Ｓｆ９）細胞とバキュロウイルス組換えキットとは、Invitrogenから購入した。細胞は１０％ウシ胎児血清(Gibco)を含有する完全 Grace昆虫培地(Gibco)に含めて２７℃においてディッシュ上で又は懸濁液中で増殖させた。バキュロウイルス構築体のトランスフェクション、組換え及び選択を製造者の指示に従って行った。タンパク質発現のために、約５ウイルス粒子／細胞の比で２ｘ１０⁶細胞／ml の密度において、Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスによって感染させた。細胞を懸濁液中で２３℃において７２時間培養した。通常の最適増殖温度に相当する２７℃から２３℃に温度を低下させることが、可溶性で活性なタンパク質を得るために重要である。遠心分離によって細胞を回収し、それらをＰＢＳ（２０mM リン酸ナトリウム pH７．４、１４０mM ＮａＣｌ）によって洗浄した後に、ペレットを２５mM リン酸ナトリウムpH６．５、２０％グリセロール、０．５％３−［（３−コラミド −プロピル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、１０mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１mMエチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。Branson ２５０機器を用いた、それぞれ３０秒間の持続期間による４サイクルの１０Ｗにおける超音波処理によって、細胞を４℃ において破壊した。この方法で得られたホモジネートを１２０，０００ｘｇにおける遠心分離によって１時間ペレット化し、上清を２ml／分の流速で、２５mM リン酸ナトリウムpH６．５、１０％グリセロール、２mM ＤＴＴ、１mM ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳと平衡させたＨＲ２６／１０Ｓ−Sepharose カラム(Pha rmacia)にかけた。カラムの２倍量によって洗浄した後に、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配によって溶出させた。プロテアーゼを含有する画分をウェスターンブロッティング法を用いてＮＳ３特異性ポリクローナル抗体によって同定し、Ｙｍ１０膜を装備した Amicon 限外濾過セルを用いて 3mlに濃縮してから、５０mMリン酸ナトリウムpH７．５、１０％グリセロール、２mM ＤＴＴ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１mM ＥＤＴＡと平衡させた Superdex ７５ＨＲ２６／６０カラム(Pharmacia )上で、１ml／分の流速度でクロマトグラフィーした。プロテアーゼを含有する画分をプールし、前記カラムに用いた同じ緩衝剤と平衡させたMono−ＳＨＲ５／５カラム(Pharmacia)上でさらにクロマトグラフィーを受けさせた。このカラムから、０〜０．５Ｍの線状ＮａＣｌ勾配を適用して、プロテアーゼを溶出した。プロテアーゼを−８０℃において５０％グリセロール、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０mM ＤＴＴ及び５０mMリン酸ナトリウムpH７．５中に保存した。このプロセスの収率は０．５mg／ｌ細胞である。精製タンパク質は、５０mM Tris（pH７．５）、５０％グリセロール、２％ＣＨＡＰＳ、３０mM ＤＴＴ中で２３℃において、ＮＳ４ＡとＮＳ４Ｂとの間のポリプロテイン切断部位から誘導されたペプチド基質Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ −Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号：７）を用いて測定して、触媒活性Ｋ_cat／Ｋ_m＝２０〜２００Ｍ^-1ｓ^-1を有する。この反応から生ずる切断生成物をＨＰＬＣを用いて分離し、単離し、質量分光測定によって同定し、システインとアラニンとの間でタンパク質分解切断が行われたことを確認した。活性を測定するために必要なプロテアーゼ濃度は１００nM〜１．６μMの範囲であった。実施例２ E ．coli におけるＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの発現方法それぞれ、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５に表示されるポリペプチドのE ．coli における発現を可能にするために、図２Ａと２Ｂに示すプラスミドｐＴ７−７（ＮＳ３１０３９〜１２２６）、ｐＴ７−７（ＮＳ３１０３９〜１２０６）、ｐＴ７−７（ＮＳ３１０２７〜１２０６）及びｐＴ７−７（ＮＳ３１０３３〜１２０６）を構築した。これらのタンパク質フラグメントはＨＣＶＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインの変異体(variant)を含有する。ＨＣＶｃＤＮＡの各フラグメントをバクテリオファージＴ７φ１０プロモーターの下流、ファージＴ７遺伝子１０タンパク質の第１ＡＴＧコドンによるフレーム内に、実際に知られた方法を用いてクローン化した。ＮＳ３配列を含有するｐＴ７−７プラスミドは、これらのプラスミドによって形質転換したE．coli細胞を選択するマーカーとして用いることができるβ−ラクタマーゼ酵素の遺伝子をも含有する。これらのプラスミドを次にE．coli菌株ＢＬ２１（ＤＥ５３）に形質転換する、これは通常Ｔ７プロモーターを含有する発現ベクターにクローン化した遺伝子の高レベル発現のために用いられる。E ．coli のこの菌株では、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は、ＢＬ２１細胞の染色体中に取り込まれるバクテリオファージλＤＥ５３上で運ばれる（５）。問題の遺伝子からの発現は、今までに開示された方法に従って増殖培地にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導される（５）。上記プラスミドの１つを用いて発現されるタンパク質の９０％以上が封入体中に不溶性形で見い出され、これらから当該分野に公知のリフォールディング方法に従っで可溶性で活性なタンパク質を得ることが可能である（例えば（６）を参照のこと）。リフォールディング・プロトコールはしばしば、触媒活性タンパク質の可変な収率を有し、これらのプロトコールは極めて制御された条件を必要とし、さもなくば、タンパク質の不可逆的な修飾（例えば、尿素の存在下でのカルバミル化）を生じるか、又は例えば非常に希釈されたタンパク質溶液の使用若しくは非常に多量のサンプルの透析のような、実際的でない操作を必要とする。これらの問題を避けるために、可溶な活性形でＨＣＶプロテアーゼを製造して、再可溶化プロトコールを回避するために、以下で述べる方法が開発されている：即ち、上記プラスミドの１つを用いて形質転換したE．coli ＢＬ２１（ＤＥ５３）を６００nmにおいて０．８ＯＤ（ＯＤは光学密度を意味する）の吸光度を生じる細胞密度に達するまで３７℃において増殖させた。この時点において、温度を１５〜２０分間内に３０℃に下げて、４００μM ＩＰＴＧを加えて、タンパク質の発現を誘導した。次に、温度をさらに２０〜３０分間に２２〜２４℃に下げた。培養物をこの温度においてさらに４時間撹拌した。この時点において、細胞を遠心分離によって回収して、ＰＢＳを用いて洗浄した。精製方法上記操作から得られたペレットを氷上で５分間インキュベートしてから、４℃ に予め冷却した２５mMリン酸ナトリウムpH６．５、５０％グリセロール、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０mM ＤＴＴ、１mM ＥＤＴＡ（緩衝剤Ａ）中に再懸濁した。この緩衝剤の１０mlを細菌培養物の１リットルに対して用いた。さらに５〜１０分間氷上でインキュベートした後に、細胞懸濁液を French プレスを用いてホモジナイズした。得られたホモジネートを１２０，０００ｘｇにおいて遠心分離した。この遠心分離からの上清を氷上に保存し、ペレットを緩衝剤Ａ（細胞培養物の１リットルにつき１ml）に再懸濁した。１mM ＭｇＣｌ₂とＤＮアーゼＩとを加えた後に、懸濁液を２０℃において１０分間インキュベートし、１２０，０００ｘｇにおいて１時間、再遠心分離した。この第２遠心分離からの上清を第１上清と共にプールし、得られたタンパク質溶液を、２５mMリン酸ナトリウムpH６．５、１０％グリセロール、０．５％ＣＨＡＰＳ、３mM ＤＴＴ、１mM ＥＤＴＡ（緩衝剤Ｂ）と平衡させたＳ−セファロース(Sepharose)(又はＳＰ−Sepharose) 樹脂(Pharmacia)に吸着させた。５mlの緩衝剤Ｂ中に懸濁させた１０mlの樹脂を細胞培養物の１リットルにつき用いた。樹脂を４℃において１時間撹拌し、濾過によって回収し、緩衝剤Ｂによって洗浄し、適当なクロマトグラフィーカラムに注入した。０〜１ＭのＮａＣｌ勾配によってプロテアーゼを溶出した。プロテアーゼを含有する画分をウェスターン・ブロッティングを用いて同定し、プールし、Centriprep １０濃縮機（Amicon）を用いて、ＢＩＯＲＡＤ法によって測定してタンパク質中で６〜１０mg／mlの濃度に達するまで濃縮した。３mlまでのこの溶液をＨＲ２６／６０ Superdex ７５に負荷した、又は２０mlまでをＨＲ６０／６００ Superdex ７５（両方ともPharmacia）に負荷した、樹脂は５０mMリン酸ナトリウムpH７．５、１０％グリセロール、３mM ＤＴＴ、０．５％ＣＨＡＰＳ（緩衝剤Ｃ）と平衡させたものである、クロマトグラフィーは１ml／分（ＨＲ２６／６０）又は５ml／分（ＨＲ６０／６００）で行った。プロテアーゼ含有画分をプールし、緩衝剤Ｃと平衡させたＨＲ５／５ Mono Ｓ(Pharmacia)上でのクロマトグラフィーによってさらに精製した。プロテアーゼをこのカラムから０〜０. ５ＭのＮａＣｌ勾配によって溶出した。次の改良によって均質になるまでの精製も可能であった：即ち、Ｓ−Sepharose からの溶出後に、プロテアーゼ含有画分を緩衝剤Ｃ中で１：４に希釈し、ヘパリン−セファロース(Heparin-Sepharose) 上に負荷した。この樹脂からの溶出は０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配によって行った。次に、タンパク質をヒドロキシアパタイト又は Superdex ７５上で上述したようにクロマトグラフィーした。収量は細菌培養物１リットルにつき精製タンパク質１〜２mgである。精製タンパク質の特徴付け精製タンパク質をゲル濾過、逆相ＨＰＬＣ、質量分光測定及びＮ−末端配列分析によって特徴付けた。ゲル濾過分析実験は、このタンパク質がモノマーであることを示した。ｐＴ７ −７（ＮＳ３１０２７〜１２０６）を用いて発現させたタンパク質は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによると３ピークを示す。質量分光測定分析とＮ−末端配列の測定とは、分子のＮ−末端部分の不均一性を示した。下記Ｎ−末端配列を有する３形態が発見された： Met-Ala-Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr（形態１） Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr（形態２） Ser-Gln-Gln-Thr（形態３）この問題を回避するために、２つの実験方法を採用した：１．１００μｇ／mlのキモスタチンプロテアーゼ阻害剤の存在下でのホモジナイゼーション。この阻害剤はＨＣＶプロテアーゼ活性を阻害しないが、フェニルアラニン及びチロシンのような芳香族残基に特異的な、キモトリプシン型プロテアーゼを阻害する。この方法で、９５％を越える形態２を含む単分子種を精製することが可能であった。２．プラスミドｐＴ７−７（ＮＳ３１０３３〜１２０６）による形態３に相当するプロテアーゼの産生。この方法では、９５％を越える形態３を含むタンパク質が精製された。実施例３ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの活性を in vitro で再現する方法活性の再現のための化学的及び物理的条件の定義ペプチドＦｍｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号：７）の切断を触媒する精製プロテアーゼの能力を用いて、活性のための最適条件を定義した。切断は加水分解生成物から基質を逆相ＨＰＬＣによって分離することによって検出した。この目的のために、緩衝剤と、プロテアーゼと共にインキュベートしたペプチドとを含有する混合物を逆相 Lichrospher ＲＰ−１８カラム(Merck)に注入して、０. １％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル勾配によって溶出した。切断生成物は適当な標準の同時注入と、質量分光測定とによって同定した。これらの実験のために、実施例１と２に述べた方法の１つによって得られたタンパク質を用いた。グリセロール濃度への活性の依存性を５０mM Tris（pH７．５）、２％ＣＨＡＰＳ、３０mM ＤＴＴを含有する緩衝剤中で評価した。濃度を高めながら、グリセロールをこの緩衝剤に加えて、相対的プロテアーゼ活性を測定した。図３はこの実験の結果を示し、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールが最適レベルであることを実証する。次の実験では、この濃度を５０％に一定に維持して、ＣＨＡＰＳの濃度を変化させた（図４）。この方法では、２％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）のレベルが最適濃度であることが判明した。ＣＨＡＰＳの代わりに、本発明によるポリペプチドに触媒活性を維持することの必要性に適合した、他の界面活性剤を用いることも可能であった。これらの界面活性剤の一部は、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−グルコマルトシド、ノニル−β−Ｄ−グルコビラノシド、Ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−チオ−グルコピラノシド、Nonidet Ｐ−４０、Tween−２０である。最適のＣＨＡＰＳ及びグリセロール濃度では、プロテアーゼはpH８．５において最適活性を示す（図５）。しかし、このpHにおいては、経時的安定性がpH７．５において観察される安定性よりも低い。活性に対するイオン強度の影響を測定するために、ＮａＣｌを用いて滴定を行った。この実験は、高いイオン強度ではプロテアーゼ活性が阻害されることを示した（図９）。データの動力学的分析は、１００mMまでの濃度において塩化物イオンが競合阻害剤であることを示した。したがって、精製ＨＣＶプロテアーゼ活性のin vitro分析のための最適条件：５０mM Tris（pH７．５）、３〜３０mM ＤＴＴ、２％ＣＨＡＰＳ、５０％グリセロールを定義することも可能であった。温度への活性の依存性を、動力学的定数Ｋ_catの対数が温度の逆関数として与えられるアレニウスプロットを用いて分析した。このグラフは２５℃を超える温度における不連続性を示し、このことは活性の低下と同時に形態の変化が生ずることを実証する。したがって、最適温度は約２２〜２３℃であると判定された。上述したように、タンパク質ＮＳ４ＡはＨＣＶプロテアーゼの補因子である。Ｎ及びＣの末端欠失実験は配列番号：６に表示した配列を有するペプチドＰｅｐ４Ａを、最適活性化をまだ誘導することができる最小ドメインとして定義している。トランスフェクション又は in vitro 翻訳実験では、最小ＮＳ４Ａ配列を含有するポリペプチドの添加が有効に切断するために重要である。Ｐｅｐ４Ａの添加は、上述した分析条件において精製プロテアーゼの活性を顕著に増大させることができる。この活性化の動力学的特徴は以下で述べる。滴定実験を用いて、プロテアーゼの３００nMの濃度におけるこの相互作用に関して１：１の化学量論が判明し、ｋｄ＜３００nMが示された。活性分析のための最適基質の定義上述したＨＰＬＣ法を用いてその切断がまだ検出されることができる最小基質を定義するために、上述したペプチドＦｍｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号：７）の誘導体を、Ｎ−及び／又はＣ−末端欠失によって合成した。これらのペプチドを上記章で定義した条件下、１００nM〜１．６μMのプロテアーゼの存在下でインキュベートした。基質として用いたペプチドのアミノ酸残基の、以下で採用する命名法は、Schechter と Berger が（７）において指定したものである。残基はＰｎ・・・・Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’，Ｐ３’・・・・・Ｐｎ ’として定義され、加水分解された結合はＰ１−Ｐ１’（ＣｙｓとＡｌａとの間の結合）である。表１はこの実験の動力学的データを示し、Ｐ６とＰ３’又はＰ４’をまだ有効に切断される基質の極限として定義する。Ｐ６又はＰ３’を越えた欠失は、それによって各ペプチドがまだ基質として作用しうるｋ_cat／Ｋ_mとして測定される効力を顕著に低下させる。Ｐ４’の欠失はｋ_cat／Ｋ_mをあまり顕著でなく低下させるが、ＨＰＬＣによる基質と切断点との分離はノナペプチドＰ６ −Ｐ３’に関するよりもデカペプチドＰ６−Ｐ４’に関する方が良好であるので、デカペプチドＰ６−Ｐ４’が最適基質として定義されている。動力学パラメーターＫ_m、ｋ_cat、ｋ_cat／ｋ_mは、他の２つの分子間切断部位ＮＳ４Ｂ／５ＡとＮＳ５Ａ／５Ｂに相当するデカペプチドＰ６−Ｐ４’に関して測定したものであり、このデータを部位ＮＳ４Ａ／４Ｂに相当するペプチドＰ６−Ｐ４’を用いて得られたデータと比較した（表２）。これらの動力学は化学量論濃度のＰｅｐ４Ａの不存在下と存在下の両方で得た。この方法で得られた動力学的データの分析は、Ｐｅｐ４Ａが主としてｋ_catに影響を与えることを実証する。単一基質のＫ_m値を比較すると、Ｐ５とＰ６における２つの負の電荷の存在がペプチド基質の結合力(bonding effectiveness)を決定するということが明らかになる。実際に、位置Ｐ６とＰ５にＡｓｐ又はＧｌｕ残基を有する、部位ＮＳ４Ａ／４ＢとＮＳ５Ａ／５Ｂに相当するデカペプチドは、位置Ｐ６に単一電荷を有する部位ＮＳ４Ｂ／５Ａに相当するペプチドに比べて同様の、有意に低いＫ_m を有する。切断部位ＮＳ４Ａ／４Ｂに相当する配列Ｐ６−Ｐ４’内の単一残基の相対的重要性に関して、各アミノ酸を単独にアラニンに突然変異させ、次にこのようにして得られた突然変異体ペプチドの動力学パラメーターを測定することによって、さらに研究を行った。結果は表３に示す。この実験は、有効な切断に関する単一残基の重要性の下記スケール：Ｐ１＞＞Ｐ３＝Ｐ５＝Ｐ６＞Ｐ２＝Ｐ４を同定する。Ｐ’部分の修飾は切断速度に有意な影響を及ぼさない。この情報を用いて、阻害剤の同定のために有用なプロテアーゼ活性分析法を開発した。これらの方法は以下に述べる。Ｐ６とＰ１’における残基の重要性のさらに詳細な評価に関しては、一連のペプチドＰ６−Ｐ４’を合成し、これらのペプチドに修飾を導入した。これらの実験の結果は表４に示す。これらの実験の結果は位置Ｐ６における負の電荷の重要性を強調する。実際に、この位置におけるＡｓｐ又はＧｌｕは、区別がつかないＫ_mによって受容される。Ａｓｎの導入による電荷の中和はＫ_mを有意に増加させるが、Ｌｙｓ残基の導入による電荷の逆転はＫ_mを極めて顕著に増加させる。Ｓｅｒによる位置Ｐ１’のＡｌａの置換は有意な影響を与えないが、Ｐｈｅによる置換はｋ_cat／Ｋ_mとして測定される、生成基質の切断速度を低下させる。表５に記載する位置Ｐ１の一連の突然変異に関して分析をおこなった。スレオニン、アリルグリシン、α−アミノ酪酸、ノルバリン及びバリンによる、この位置のシステインの置換は、生成基質が非修飾基質に比べて有意に低い、ｋ_cat／Ｋ_mとして表現される効率によって切断されるとしても、受容される。基質特異性に関する情報は、酵素分析法の開発と、修飾基質配列に基づく阻害剤の合成との両方のために用いることができる。例えば、修飾されたＰ１残基を有する基質ペプチドは３５０〜９０μMの阻害定数を有するプロテアーゼの競合阻害剤である（表６）。アルデヒド、トリフルオロメチルケトン、ジフルオロメチルケトン、ジケトン、ケトエステル、ケトアミド又はα−ケト複素環、ボロン酸（boronic acid）及びモノアロメチルケトン基を導入することによって、これらのペプチドをさらに修飾して、それらの阻害力を高めることができる。特異性に関する情報は、例えばハロ−エノールアセトン類、イソクマリン類、β−ラクタム類、スクシンイミド類、ピロン類、ベゾキシアジノン類（bezoxyazynones）、ベゾイソ−チアゾリン類(bezoiso-thiazolines)又は潜在（latent）イソシアネート類のような、ペプチドに基づかない阻害剤の合成をも可能にすることができる。実施例４阻害剤探索のための in vitro プロテアーゼ活性の利用方法アミド基質を用いた自動分析法切断部位ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂから誘導されたペプチドＡｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ −Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ε−(³Ｈ)Ａｃ（配列番号：４７）を下記動力学パラメーター：Ｋ_m＝７９μM、ｋ_cat＝０．７９分¹及びｋ_cat／Ｋ_m＝１０３Ｍ^-1ｓ^-1を有するＮＳ３プロテアーゼによって切断する。２〜１０Ci／mmolの比活性を有する標識ペプチド４００，０００cpmを４０μM（Ｋ_m／２）の非標識ペプチドと共に、５０mM Tris（pH７．５）、５０％グリセロール、３％ＣＨＡＰＳ、１０mM ＤＴＴ中で、２００nMプロテアーゼと１μM Ｐｅｐ４Ａの存在下で２３℃において３時間インキュベートした。この期間中に、ペプチド基質の２０％が切断された。切断生成物は以下に述べ、図７に要約する方法に従って定量することができる。この図から知ることができるように、混合物をＴＳＫ−ＤＥＡＥアニオン交換体と接触させて配置する。この交換体から流出する画分を濾過し、沈降させ、遠心分離する。透明な画分に関して放射能を測定する、アミド基質と左側フラグメントとがアニオン交換体に結合した状態で留まると仮定して、この放射能量は排他的に右側フラグメント（Ｃ−末端）に関するものである。阻害剤の添加は標識された切断フラグメントの脱離速度（release rate）を低下させる。阻害剤が有効であればあるほど、アニオン交換体から流出する画分に測定される放射能は減少する。実施例５デプシペプチド基質Ｓ１：Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ψ［ＣＯＯ］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ａｃ）−ＮＨ₂（配列番号：８）の合成この合成は連続フローＦｍｏｃ−ポリアミド方法（９）を用いて完全に固相でおこなった。保護基組合せは、α−アミノ基のための塩基−不安定性Ｎα−Ｆｍｏｃと、側鎖のための酸−不安定性保護：Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）、Ｇｌｕ（Ｏｔ −Ｂｕ）、Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）及びＨｉｓ（ｔｒｔ）とであった。用いたポリマーは修飾 Rink アミドリンカー（１０）によって誘導体化された複合ケイソウ土 −ポリアミド（９）、ｐ−［（Ｒ，Ｓ）−ａ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９− イル）−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（１１）(NovaSyn（登録商標）ＫＲ１２５，０．１mmol／ｇ)であった。樹脂、アミノ酸誘導体、活性剤及び他の全ての試薬は商業的ソースからの入手可能な最高等級であった。この合成は図８に示したスキームに従って行った。カップリングは、Ｆｍｏｃ−アミノ酸／ＤＩＰＣ／ＨＯＢｔ（１：１：１：１）活性化を用いたＬ−（＋）−乳酸以外は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸／ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（１：１：１：２）活性化を用いて、樹脂遊離アミノ基に比べて５倍過剰な活性化アミノ酸によっておこなった。乳酸の遊離ヒドロキシルに対するＡｂｕのエステル化を、触媒量（０．１当量）のＤＭＡＰの存在下で対称的無水物（Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ）２０を用いて、室温において３０分間行った（１２）：この反応を２回繰り返して、９０％収率を得た;触媒の不存在下では、残留する遊離ヒドロキシルはその後の合成操作において不反応性である。アセンブリの終了時に、樹脂をＤＭＦ、メタノール及びＣＨ₂Ｃｌ₂によって洗浄して、１６時間真空乾燥させた。乾燥ペプチド−樹脂をＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９２．５：５：２．５）によって室温において１．５時間処理した；樹脂を濾別し、ペプチドを冷メチルｔ−Ｂｕエーテルによって沈殿させ；沈殿を０．１％ＴＦＡ含有５０％水／アセトニトリル中に再溶解して、凍結乾燥した。溶離剤として（Ａ）水と（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルとを、５分間にわたって２２％Ｂ、次に２５分間にわたって２２〜２７％Ｂのステップ勾配で、流速度１２ml／分において用いた、Nucleosy１Ｃ−１８カラム（２５０ｘ２１mm、７μM）上での分取ＨＰＬＣによって、＞９８均質性までの精製が達成された。これらの条件下で、ペプチドは２１．９分間目に溶出する。純粋な物質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した：収率３５％。実施例６デプシペプチド基質Ｓ２：Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ψ−［ＣＯＯ］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ａｃ）−ＮＨ₂（配列番号：４３）の合成この合成は上記実施例に述べたように行った。乳酸へのＴｈrのエステル化は７０％収率を得るために３回の反復を必要とし、Ｔｈｒ残基の３％ラセミ化をも付随した。しかし、Ｄ−ＴｈｒジアステレオマーはクロマトグラフィーによってＬ−異性体から良好に分割され、分取ＨＰＬＣによって容易に分割された。用いた勾配は５分間にわたって２１％Ｂ、次に２０分間にわたって２１〜２２％Ｂであり、所望のペプチドは１９．７分間目に溶出した：収率２４％。実施例７デプシペプチド基質Ｓ１：Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ψ−［ＣＯＯ］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｎ^ε−[³Ｈ]−ＣＨ₃ＣＯ）−ＮＨ₂（配列番号：４４）の合成ペプチドＳｌをＣ−末端リシンのＮ^ε−アミノ基において選択的に標識するために、保護された先駆体Ａｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ） −Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−Ａｂｕ−Ψ−［ＣＯＯ］−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ₂を図１０のスキームに従って樹脂上にアセンブルした。（Ｎ^ε−Ａｃ）−Ｓ１の合成に比べた唯一の変化はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎε−Ａｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨを用いたことであった。Ａｌｌｏｃ保護はＦｍｏｃとｔ−Ｂｕに基づく保護基に対して直角（orthogonal）であり、５％酢酸と２．５％Ｎ−メチルモルホリンとを含有するＣＨ₃Ｃｌ溶液中での（０）ＰｄＰ［（Ｐｈ₃）］による２時間処理によって脱離される。乾燥ペプチド−樹脂（０．０７mmol／ｇ、６０mg）を[³Ｈ]無水酢酸（２５mCi 、５．７mCi／mmol）と、室温において１６時間反応させた。次に、１０倍過剰な非放射性無水酢酸を用いて、反応を完成させた。次に、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、上述したように処理した。分取ＨＰＬＣ後に、＞９８％純粋なペプチドＡｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ψ−［ＣＯＯ］− Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｎ^ε−[³Ｈ]−ＣＨ₃ＣＯ）−ＮＨ₂が０．９８mCi／mmolの比活性を有して得られた。ＨＰＬＣに基づく分析法を用いて、放射性デプシペプチド基質Ｓｌ（配列番号：４４）に関して下記動力学パラメーターが得られた：同じ分析法を用いて、放射性基質Ｓ２に関して下記動力学パラメーターが得られる：放射性デプシペプチド基質の合成は、図１１に概略的に説明したＮＳ３プロテアーゼ活性の測定のための高スループット分析の設定を可能にする。原理は次の通りである：完全な基質と、酵素切断に由来するＮ−末端フラグメント（Ａｃ− Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＯＨ）とは極度に酸性であるが、Ｃ−末端フラグメント［ＨＯ−ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＯ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｎ^ε−[³Ｈ]−ＣＨ₃ＣＯ）−ＮＨ₂］は、pHによると、中性又は塩基性である。それ故、アニオン交換樹脂上で２つの酸性種を捕捉し、Ｃ−末端フラグメントを溶液中に残すことが可能である。Ｃ−末端フラグメントが放射性マーカー（この場合には、Ｃ−末端リシンのε−アミノ基に共有結合したトリチウム化アセテート）を含有する場合には、樹脂は処理基質を非処理基質から識別することができるので、酵素と共にインキュベーションし、イオン交換体によって処理した後に溶液中に残留する放射能量を測定することによってタンパク質分解活性を定量することを可能にすると考えられる。全体のプロセスは実施例４のアミド基質に基づく高スループット分析に用いたプロセスと本質的に同じであるが、この場合に用いるpHは７．５ではなく７．０であり、エステル結合の自然加水分解を最小にする（２３℃において０．６％／時）。実施例８デプシペプチド基質Ｓ３とＳ４：Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−（ＥＤＡＮＳ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ψ ［ＣＯＯ］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（ＤＡＢＣＹＬ）ＮＨ₂（配列番号：４５）ａｎｄＡｃ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−（ＥＤＡＮＳ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −Ａｂｕ−Ψ［ＣＯＯ］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）ＮＨ₂（配列番号：４６）の合成２つの基質Ｓ３とＳ４の化学式を図１１に示す。合成は、公知方法（１６〜１７）に従って製造した２種類の特定の誘導体：Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−ＯＨとＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）−ＯＨを用いて、Ｓ３（配列番号：４５）に関して図１３のスキームに詳述した通りに固相で行った。Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）とＬｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）とを含めて、カップリングの全ては、Ｆｍｏｃ−アミノ酸／ＤＩＰＣ／ＨＯＢｔ（１：１：１：１）活性化を用いたＬ−（＋）−乳酸を例外として、Ｆｍｏｃ−アミノ酸／ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（１：１：１：２）活性化を用いて、樹脂遊離アミノ基に比べて５倍過剰な活性化アミノ酸によって行った。乳酸の遊離ヒドロキシルに対するＡｂｕのエステル化を、触媒量（０．１当量）のＤＭＡＰの存在下で対称的無水物（Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ）₂０を用いて、室温において３０分間行った（１２）：この反応を２回繰り返して、９２％収率を得た。アセンブリの終了時に、ペプチド−樹脂を洗浄して、基質Ｓ１に関して述べた通りにペプチドを切断した。溶離剤として（Ａ）５０mM 酢酸アンモニウム（pH６）と（Ｂ）アセトニトリルとを用いて、NucleosyｌＣ−１８カラム（２５０ｘ２１mm、７μm）上での分取ＨＰＬＣによって、＞９８均質性までの精製が達成された。Ｓ３とＳ４の両方に対して用いた勾配は、５分間にわたって２０％Ｂ、次に２０分間にわたって２０〜４０％Ｂ、流速度２０ml／分であった；純粋な物質を含有する画分をプールし、凍結乾燥した：Ｓ３とＳ４に関してそれぞれ収率４５％と３５％。ＨＰＬＣに基づく分析（図１４Ａ参照）によって評価した、この基質の動力学パラメーターは次の通りであった：この分析に用いた緩衝剤は次の通りである：３３mM ＤＴＴ、５０mM Tris（ pH７）、５０％グリセロール、２％ＣＨＡＰＳ。エステル結合の自然加水分解を最小にするために、インキュベーションはpH７．０において実施する。この分析はキュベット又は（９６ウェル）マイクロタイタープレートにおいて蛍光を時間の関数としてモニターしながら行うことができる（励起波長３５５nM、発光波長４９５nM）。基質切断時の蛍光増加は１３倍である。反応は図１４Ｂに示すように直線的である（固定基質濃度＝２μM）。検出限界は高スループットマイクロタイタープレート分析に関して１nM、ＨＰＬＣに基づく分析に関しては５２０ｐＭと判定された。酵素反応の初期速度を確認するために連続（キュベット）分析をおこなう場合には、酵素濃度の下限は、１０μM よりも高い基質濃度では切断基質の蛍光が消光するために、８０nMである。寄託配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５のアミノ酸配列をを有するポリペプチドをそれぞれコードするプラスミドｐＢａｃ（１０３９〜１２２６）、ｐＴ７−７（１０３９〜１２２６）、ｐＴ７−７（１０３９〜１２０６）、ｐＴ７−７（１０２７〜１２０６）及びｐＴ７−７（１０３３〜１２０６）を用いて形質転換したE. coli ＤＨＩの菌株は１９９５年８月１４日に、Notional Collections of Industrial and Marine Bacteria L td．（ＮＣＩＭＢ）、英国、スコットランド、アバーディーンによって、受託番号：ＮＣＩＭＢ４０７６１、ＮＣＩＭＢ４０７６２、ＮＣＩＭＢ４０７６３、ＮＣＩＭＢ４０７６４及びＮＣＩＭＢ４０７６５で寄託された。明細書に用いた略号と記号Ａｂｕ＝２−アミノ酪酸；ＣＨＡＰＳ＝３−［（３−コラミド−プロピル）− ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホネート；ＤＡＢＣＹＬ＝４−［［４’−（ジメチルアミノフェニル］アゾ］安息香酸；デプシペプチド＝少なくとも１つのペプチド結合が対応エステル結合によって置換されたペプチド（分子内のエステル結合（単数又は複数）の位置（単数又は複数）は関与するアミノ酸残基間のΨ［ＣＯＯ］−として通常表示される）；ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＩＰＣ＝Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン；ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＴＴ＝ジチオトレイトール；ＥＤＡＮＳ＝５−［（２’−アミノエチル）アミノ］ナフタレンスルホン酸；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミノ四酢酸；ＨＯＢｔ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＰｙＢＯＰ＝ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；ＲＥＴ＝共鳴エネルギー転移；ｔ−Ｂｕ＝tert−ブチル；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；Ｔｒｔ（トリチル）＝トリフェニルメチル。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ビアンチ，エリザベッタイタリア国アイ − 00195 ローマ, ビアサボッティノ，31 (72)発明者タリアニ，マリナイタリア国アイ − 00174 ローマ, ビアクルジオルフォ，15 (72)発明者トメイ，リシアイタリア国アイ − 00143 ローマ, ビアガッダ，173 (72)発明者ウルバニ，アンドレアイタリア国アイ − 00187 ローマ, ビアピアベ，41 (72)発明者デフランセスコ，ラファエルイタリア国アイ − 00040 マリノアールエム，ビアアピアヌオバケイエム．21 エヌ．133 (72)発明者ナルイェス，フランクイタリア国アイ − 00040 アリシア, ビアラモドロ，53

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたポリペプチドであって、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５から成る群から選択されたアミノ酸配列から成り、ＨＣＶウイルスＮＳ３タンパク質のタンパク質分解活性を有することを特徴とする単離されたポリペプチド。２．宿主生物において請求項１記載のポリペプチドのいずれか１種を産生するための発現ベクターであって、前記ポリペプチドの１種をコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに機能的に結合した、前記宿主生物内の機能的調節、転写及び翻訳配列と、任意の選択マーカーとを含む発現ベクター。３．選択されたポリヌクレオヂド配列中にコードされた特定のポリペプチドを発現することができる請求項２記載の発現ベクターを用いて形質転換した、真核細胞又は原核細胞のいずれかの宿主細胞。４．請求項１記載のポリペプチドの１種の製造方法であって、下記操作：配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５に表示された配列から成る群から選択されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて、真核細胞又は原核細胞のいずれかの宿主細胞を形質転換する操作；選択されたポリペプチドを製造するために望ましいヌクレオチド配列を発現させる操作；及び再可溶化プロトコールを避けて、このようにして得られたポリペプチドを精製する操作を組合せて含むことを特徴とする方法。５．配列番号：７〜１２、１４、１８〜２０、２９〜３２、３５及び４７に表示された配列から成る群から選択されたアミノ酸配列から成ることと、ＨＣＶＮＳ３タンパク質分解活性を有するポリペプチドの in vitro 活性の高スループット分析に基質として用いることができることを特徴とするペプチド。６．配列番号：４２〜４６に表示された配列から成る群から選択されたアミノ酸配列から成ることと、ＨＣＶＮＳ３タンパク質分解活性を有するポリペプチドの in vitro 活性の高スループット分析に基質として用いることができることを特徴とするデプシペプチド。７．ＨＣＶＮＳ３タンパク質のタンパク質分解活性を in vitro で再現し、効果的に分析する方法であって、請求項１記載のポリペプチドの活性が再現され、３０〜７０mM Tris pH６．５〜８．５と、３〜３０mM ジチオトレイトールと、０．５〜３％３−［（３−コラミド−プロピル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホネートと、３０〜７０％グリセロールとを含有する溶液中で、２０〜２５℃の温度において、高スループット分析で請求項５記載のペプチド又は請求項６記載のデプシペプチドを基質として用いて試験されることを特徴とする方法。８．請求項７記載のＨＣＶＮＳ３のタンパク質分解活性を in vitro で再現し、効果的に分析する方法であって、請求項５記載のペプチドを１００〜２００ nMの請求項１記載のポリペプチドの濃度において高スループット分析に用いる方法。９．請求項７記載のＨＣＶＮＳ３のタンパク質分解活性を in vitro で再現し、効果的に分析する方法であって、請求項６記載のデプシペプチドを０．５〜２nMの請求項１記載のポリペプチドの濃度において高スループット分析に用いる方法。 10．請求項９記載の、ＨＣＶＮＳ３のタンパク質分解活性を in vitro で再現し、効果的に分析する方法であって、請求項１記載のポリペプチドのタンパク質分解活性の連続モニターリングを、基質として配列番号：４５と配列番号：４６によって表示される配列から成る群から選択されたデプシペプチドを用いて、デプシペプチドの一方の末端に接近した蛍光ドナー、５−［（２’−アミノエチル）アミノ］ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）と、デプシペプチドの他方の末端に接近したアクセプター基、４−［［４’−（ジメチルアミノフェニル）アゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）との間の“共鳴エネルギー転移”による蛍光発光の内部消光によって行う前記方法。