CN103012565A - 一种曲普瑞林及其固相合成制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种优良的曲普瑞林及其固相合成制备方法。本发明曲普瑞林氨基酸光学纯度高，残余溶剂量少，其制法包括步骤：向树脂中加入Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱进行偶联反应，形成Fmoc-Gly-树脂；加入脱帽试剂进行反应；接着加入保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，进行偶联反应形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用曲另外9个氨基酸以替换Fmoc-Pro-OH；向所得十肽树脂中加入切割液进行切肽，使十肽切离树脂，任选地对曲普瑞林进行纯化。本发明可得到符合国家药典标准的曲普瑞林原料药产品。生产工艺稳定，原料来源方便，收率高，产品质量稳定，生产成本低，操作简单，适合大生产。
Description
技术领域
本发明涉及曲普瑞林原料药的生产工艺，尤其是固相合成工艺以及纯化方法。本发明还涉及一种曲普瑞林。
背景技术：
曲普瑞林，已以其醋酸盐或者巴莫酸盐的形式应用于临床，临床适应症包括前列腺癌、性早熟、辅助生殖技术(ART)例如体外受精术(IVF)、子宫内膜异位症和子宫肌瘤等，已上市产品例如有达菲
曲普瑞林英文名为：Triptorelin，别名有：垂普托雷林、色氨瑞林、Decapeptyl等，其CAS登记号为57773-63-4，分子式，C64H82N18O13，分子量1311.45。曲普瑞林的肽序为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
曲普瑞林系合成的促性腺激素释放激素(GnRH)的类似物。其结构的改良是将天然分子结构中的第六个左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代以使其促效作用更为显著。曲普瑞林作用与GnRH相同，但其血浆半衰期延长且对GnRH受体的亲和力更强，因此曲普瑞林成为GnRH受体的强力激动剂。曲普瑞林注射后，最初会刺激垂体分泌促性腺激素(Gn)，即黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。当垂体经过长期的刺激后会进入不应期，促性腺激素的释放会减少，因而使性类固醇(睾丸酮或雌激素)降低至去势水平。上述作用是可逆转的。
1974年日本武天化工的Fujino Masahiko等人首先发明促黄体急速释放激素的十肽酰胺类似物的合成工艺。并在日本，德国，美国等国家申请专利，专利号分别为：JP19740027442、DE2446005、US4008209(液相法)。
此后，美国US4010125公开了曲普瑞林及其中间体以及它们的制备方法。该文献所记载的方法包括使用Boc--保护氨基酸为原料，使用二苯甲基胺(Benzhydrylamine)树脂进行固相合成。在每一轮脱帽须用三氟醋酸，并且在最终将十肽从树脂上切除时使用氢氟酸和苯甲醚。
以Fmoc-保护氨基酸为原料制备曲普瑞林亦有相关报道。例如孙永强等(孙永强、钱明霞、严益民、冯晓晖、蒋伟，曲普瑞林的液相合成，中国医药工业杂志，2012，43(7)：532)公开了使用Fmoc-保护氨基酸为原料通过液相合成法来制备曲普瑞林，在该方法中使用HBTU为偶联剂，据报道该工艺中每一次肽链延长步骤的收率仅在77%~86%之间，纯化收率为74%，总收率仅为12.4%。
因此提高产品收率以及获得具有良好品质的产品，仍然是本领域技术人员极其期待的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备曲普瑞林的方法，期待该方法可以得到高收率的曲普瑞林，并且期待所得曲普瑞林具有良好的品质。本发明人令人惊奇地发现，使用特定的工艺条件制备曲普瑞林，不但产率高，而且产品品质优良。本发明因此而得以完成。
为此，根据本发明的第一方面，提供了一种固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步骤：
(1)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Gly-树脂；
(2)向上一步骤所得的肽偶合树脂(即步骤(1)所得Fmoc-Gly-树脂)中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽(即脱除Fmoc-保护基)；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；
(3)循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸Fmoc-Pro-OH：Fmoc-L-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp(boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-trp(boc)-OH、Fmoc-L-His(trt)-OH和H-Pyr-OH，以最终形成十肽树脂：H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
(4)向步骤(3)所得十肽树脂中加入切割液进行切肽反应，以使十肽从树脂上切割下来，得到曲普瑞林。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂选自：rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂、knorr树脂、或其组合。这类树脂是可以从商业途径获得的，例如可以从阿拉丁试剂公司(http://www.aladdin-reagent.com)商业公司购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：取树脂置于反应器中，加入溶剂(例如二氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合)振荡并充分浸泡(例如浸泡10~200min)，抽除溶剂(必要时，可再用上述溶剂重复清洗，并除去溶剂)。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：称取一定量树脂于反应器中，然后加入二氯甲烷，振荡并浸泡60分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照CN101357936A说明书第8页第2-3行所述方式进行的。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照US4010125说明书第10栏第35-43行所述方式进行的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂在经浸泡处理后、进行偶联反应之前，还包括对该树脂进行脱帽处理的步骤。增加该脱帽处理步骤，使树脂得以进一步地活化，有助于增加Fmoc-Gly-树脂的收率。该脱帽处理的步骤可以参照步骤(2)中的方式进行。此外，在该脱帽处理期间或者脱帽处理后，可以使用茚三酮检测法检测脱帽完全程度，如果脱帽不完全，可重得进行脱帽处理。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述肽偶联剂例如但不限于：DCC(N,N′-二环己基碳二亚胺，N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide)、DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺，N,N'-Diisopropylcarbodiimide)、HATU(英文全称2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium)、HBTU(英文全称O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)、HCTU(英文全称1H-Benzotriazolium1-[bis(dimethylamino)methylene]-5chloro-,hexafluorophosphate(1-),3-oxide)、TATU(英文全称O-(7-Azabenzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)、TBTU(英文全称O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)、或其组合。肽偶联剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化科技有限公司等商业途径购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述酰胺键形成促进剂例如但不限于：HOAT、HOBT、6-Cl-HOBt、或其组合。这些试剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化科技有限公司等商业途径购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述有机碱例如但不限于：NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其组合。这些试剂可以容易地从一般的商业途径获得特别是一般的化学试剂公司购得，例如可以从北京化学试剂公司购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，用于进行偶联反应的所述溶剂例如但不限于：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剂；或者，例如在步骤(1)中进行偶联反应时，通常可以是每摩尔树脂使用5-25L溶剂，例如可以是每摩尔树脂使用10-20L溶剂。在其它偶联反应步骤中亦可使用此比率范围。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂与所述Fmoc-Gly-OH的投料比为1：2.5~5(摩尔比)，优选1：3~5。进一步地，在后续的各个肽偶联反应中，添加的该步骤的氨基酸(Fmoc保护的或未保护的)的量为步骤(1)中树脂量的2~7倍(摩尔倍)，优选3~6倍。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱四者的投料比为1：1-3：1-3：2-6(摩尔比)，例如四者的投料比为1：1-2：1-2：2-4。需要说明的是，当某类物料(例如酰胺键形成促进剂)以两种或两种以上组合使用时，其在上述投料比中的用量是以投入的全部该类物料计的，例如使用两种酰胺键形成促进剂时，它们的总摩尔数是Fmoc-Gly-OH摩尔数的1-3倍，优选1-2倍；其它物料种表示它们的量时，亦有同样含义，除非另有说明。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，还包括在偶联反应期间或者反应后采用茚三酮检测法检测偶联反应进行程度。如果发现偶联反应不够完全，可以重复进行偶联反应。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，还包括在完成偶联反应后对获得的Fmoc-Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1~3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽试剂选自哌啶(亦称为六氢吡啶，PIP)、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在选自下列的溶剂中进行的：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，优选二甲基甲酰胺。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在15~25%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的，优选是在20%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在10~30°C温度下进行的，反应时间为10~200min，例如30~90min，例如约60min。在一个实施方案中，所述脱帽反应是在室温下进行的。在一个实施方案中，所述脱帽反应是在室温下进行的反应时间为10~200min，例如30~90min，例如约60min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，还包括在完成脱帽反应后对获得的Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1~3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，还包括在脱帽反应期间或者脱帽反应后采用茚三酮检测法检测脱帽反应进行程度。如果发现脱帽反应不够完全，可以重复进行脱帽反应。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述偶联反应是参照步骤(1)中的偶联反应进行的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸，得到H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第二循环操作使用Fmoc-L-Leu-OH作为保护氨基酸，得到H-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第三循环操作使用Fmoc-D-trp(boc)-OH作为保护氨基酸，得到H-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第四循环操作使用Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到H-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第五循环操作使用Fmoc-L-Ser(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第六循环操作使用Fmoc-L-trp(boc)-OH作为保护氨基酸，得到H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第七循环操作使用Fmoc-L-His(trt)-OH作为保护氨基酸，得到H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第八循环操作使用H-Pyr-OH作为保护氨基酸，得到H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中进行偶联反应时，酰胺键形成促进剂是HOAT和HOBT两者组合使用。在一个实施方案中，HOAT和HOBT二者的用量比为1：1-4(摩尔比)，优选1：2-3(摩尔比)。发明人已经出人意料地发现，组合使用酰胺键形成促进剂对于提高第一步骤偶联率进而提高产品品质是非常有益的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)和步骤(3)中进行偶联反应时，使用的酰胺键形成促进剂是HOAT。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，在第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-L-Arg(pbf)-OH一起加入适量乳酸进行反应。在一个实施方案中，所述Fmoc-L-Arg(pbf)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.1-0.5，优选1：0.2-0.3。所述的乳酸例如是符合2010年版二部480页收载的“乳酸”的标准的产品。发明人已经出人意料地发现，在该步骤中加入适量乳酸时，所得曲普瑞林氨基酸光学纯检测时D-Arg的含量低于约0.10%，这对于提高产品品质是非常有益的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)、步骤(2)、和步骤(3)中的所述偶联反应是在10~30°C温度下进行的，反应时间为10~200min，例如30~90min，例如约60min。在一个实施方案中，所述偶联反应是在室温下进行的。在一个实施方案中，所述偶联反应是在室温下进行的反应时间为10~200min，例如30~90min，例如约60min。
根据本发明第一方面的方法，其中在各步骤中进行脱帽反应和/或偶联反应时，是在室温进行的，优选是在20±5°C下进行的，虽然本发明描述了一些优选的反应时间，然而反应时间可根据茚三酮检测结果而随时作适当调整，例如如果经检测发现反应尚不完全的情况下可适当延长反应，这些操作是本领域技术人员容易控制的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H2O。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=50-98:1-10:1-10:0.1-5。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=90-98:1-5:1-5:0.5-2。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=95:2:2:1。在一个实施方案中，所述切割液是预先冷却到-20°C至10°C，优选预先冷却至0°C至10°C，优选预先冷却至约5°C。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述切肽反应是在室温进行的，优选是在20±5°C下进行的。反应时间为1-10小时，优选1-5小时，优选2-3小时。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述切肽反应是将氨基酸的侧链保护基及十肽从树脂上同时切割下来从而获得十肽曲普瑞林。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，在完成切肽反应后，除去切割液(例如通过减压的方式)，然后加入乙醚进行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤数次，真空干燥，获得曲普瑞林。
根据本发明第一方面的方法，在经步骤(4)切肽反应获得曲普瑞林干燥品后，还进一步包括对该曲普瑞林干燥品进行纯化的步骤。该纯化步骤在本发明中亦可称为步骤(5)，纯化前的曲普瑞林干燥品可以称为曲普瑞林粗品。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的纯化步骤是照如下方式进行的：将曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，过滤，滤液过离子交换柱并用该醋酸水溶液洗脱，收集流出主峰，然后再经过C18柱纯化，收集主峰流出液，冷冻干燥，即得曲普瑞林精制品，其可以作为曲普瑞林的原料药。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述的离子交换柱为阳离子交换柱(例如但不限于Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N、Shodex Asahipak ES-502C7C)或阴离子交换柱(例如国产D201、D231、DK251、731、或290型阴离子交换树脂，美国Amberlite IRA-900型阴离子交换树脂，德国LewatitMP-500型阴离子交换树脂，日本Diaion PA308型阴离子交换树脂，TOSOH TSK-GEL DEAE-5PW、Chrompack IonoSpher A)或其组合使用；优选的离子交换柱为阴离子交换柱。优选的离子交换柱是基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交换柱，例如Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，它们可以容易地从商业途径获得，例如得自北京谱朋科技有限公司。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述的醋酸水溶液浓度为：2%-20%(v/v)，例如5%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所说的反向柱纯化所用流动相为：含有与含有15%-50%乙腈或甲醇的水溶液；在一个实施方案中，所说的反向柱纯化所用流动相为含20%乙腈的水溶液。在一个实施方案中，所述反向柱是Lichrospher RP-18色谱柱(德国产)。在一个实施方案中，所述反向柱纯化的流速为10ml/min。在一个实施方案中，由于最终纯化步骤中使用到乙腈，因此本发明终产物中可能残余有微量的乙腈，控制乙腈的量是有必要的，通过减压干燥或真空干燥或者冷冻干燥是可以容易地除去乙腈的，或者可以容易地除去乙腈以使乙腈量降低到0.04%以下(可照气相色谱法测定)。本发明后文各实施例所得精制醋酸曲普瑞林中中，乙腈含量均低于0.03%。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种曲普瑞林，其中乙腈含量低于0.03%。
进一步地，本发明第二方面提供了本发明第一方面任一项所述方法获得的曲普瑞林。
在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.2%。在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%。在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，其中D-Arg相对于全部精氨酸而言均小于0.2%，优选小于0.15。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种曲普瑞林，其中乙腈含量低于0.03%。
下面对本发明作进一步的描述。
在本发明中，使用的氨基酸如未特别标示其构型时，均指-L型氨基酸。
在本发明中，使用到如下的一些Fmoc保护或未保护的氨基酸作为起始原料：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp(boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-trp(boc)-OH、Fmoc-L-His(trt)-OH、H-Pyr-OH。在本发明中还使用到Rink-amide MBHA树脂作为载体，其取代量为0.84mmol/g，在标示树脂投料量时均有类似含义；如果直接以摩尔量标示树脂投料量，表示所加入的树脂的取代量，以摩尔(mol)或者毫摩尔(mmol)计。
固相多肽合成中一般需要将α-氨基以及侧链活性基团保护起来。目前使用比较多的α-氨基保护基为：叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)两种。Boc基团需要反复采用50%的三氟乙酸(TFA)来脱除，肽树脂切割一般采用氢氟酸(HF)，对环境以及实验设备都有较高的要求，而Fmoc基团可以使用哌啶轻易地脱除，切割采用TFA，与Boc法相比，具有反应条件温和、合成效率高以及切割条件温和等优点，逐渐取代了Boc基团而成为目前固相多肽合成的首选α-氨基保护基。在本发明中使用经Fmoc保护的氨基酸。
酰胺键形成促进剂例如但不限于：HOAT(CAS No.39968-33-7)、HOBT(1-Hydroxybenzotriazole)、6-Cl-HOBt(6-Chloro-1-Hydroxy-1H-Benzotriazole)、或其组合。
有机碱例如但不限于：NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其组合。
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相合成曲普瑞林的合成方法以及纯化工艺，解决目前现有的技术存在的上述缺陷。
本发明固相合成曲普瑞林的方法大体上包括如下步骤：
(1)以rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂或knorr树脂(这些树脂是容易从商业途径购得的)为起始原料，用固相合成的方法按照曲普瑞林氨基酸序列依次连接保护氨基酸，最后得到氨基酸侧链被保护的多肽；
(2)用切割液将氨基酸的侧链保护基及多肽从树脂上同时切割下来，用乙醚沉淀洗涤后，获得粗品；
(3)将粗品用醋酸水溶液溶解，依次经过离子交换柱和C18反相柱，冻干后，得到曲普瑞林(其为符合国家药典标准的曲普瑞林原料药产品)。
在本发明的上下文中，对脱帽反应或者肽偶联反应进行反应程度检测时，如未另外说明，均是采用如下方式的茚三酮检测法进行：
1、脱帽反应程度检测法：每次用小试管取大约0.5-1mg树脂，用乙醇洗涤后，往试管中依次加入4滴缓冲液(20mg苯酚溶于50m1乙醇+25ml吡啶)，1滴Vc-乙醇溶液(4×10-5mol/L)，2滴茚三酮溶液(500mg茚三酮溶于10m1乙醇，50g/L)，用超声波进行脱氨处理。然后在沸水浴中加热5min，观察树脂及试管中溶液的颜色，进而判断反应的进行程度；若显蓝色则反应完全，若不显蓝色则反应不完全需重新进行此步。
2、肽偶联反应程度检测试剂：(1)1g茚三酮，溶于10-50ml无水乙醇；(2)3.2g苯酚，溶于1-20ml无水乙醇；(3)0.4ml KCN储液(0.01M KCN)，溶于19.6ml吡啶。
3、肽偶联反应程度检测方法：在待检测的经肽偶联反应的树脂中，将上述三种试剂按1：1：1比例依次各滴加2滴，通过颜色观察来判断反应是否完全，此法灵敏度达到99%以上。若溶液及树脂为黄色，则表明树脂上无残留－NH2；若溶液及树脂为紫色、淡蓝色或蓝色，则表明树脂上仍有残留的－NH2，颜色越深，表明残留的-NH2越多，肽的耦联反应越不完全，需延长反应时间。
按照本发明，所说的依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法，包括如下步骤：Fmoc-Gly-树脂的制备、Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Tyr(Tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Gly-树脂的制备包括以下步骤：称取一定量树脂(0.3-1.2mmol/g)于反应柱中，然后加入二氯甲烷，振荡并浸泡20-90分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。加入脱帽试剂室温下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Gly-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。上述DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU表示一种或者多种组合使用作为肽偶联剂；HOBT/HOAT表示一种或者两种作为酰胺键形成促进剂，即其中“/”如未另外特别说明，表示“和或者或”的关系。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Pro-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Leu-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-D-Trp(Boc)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Tyr(Tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Tyr(Tbu)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Ser(Tbu)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Trp(Boc)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-His(Trt)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取H-Pyr-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5~5：1，优选3~5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。
在本发明方法的一个实施方案中，用切割液将氨基酸的侧链保护基及十肽从树脂上同时切割下来包括如下步骤：将上述步骤中获得的H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂加入预冷的切割液(零下20℃至零上10℃)，在一定温度下反应1-10小时(例如1-5小时，例如约3小时)。减压除去切割液，加入大量乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤数次(例如4-10次)，真空干燥，获得曲普瑞林粗品。所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H2O。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=50-98:1-10:1-10:0.1-5。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=90-98:1-5:1-5:0.5-2。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=95:2:2:1。
在本发明方法的一个实施方案中，对获得的曲普瑞林粗品进行纯化的过程包括如下步骤：将切肽步骤中得到的干燥的曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，过滤，滤液经过离子交换柱，收集流出主峰，然后再经过C18(例如5μm)反相柱纯化，收集主峰，合并合格溶液，冻干。获得曲普瑞林精制品，可作为曲普瑞林的原料药。纯化的工艺细节如本发明上、下文所述。
在本发明中，测定氨基酸与树脂之间的偶联率可以采用重量法和比色法两种方法测定。特别是，如未另外说明，本发明上下文中测定氨基酸(特别是第一个氨基酸甘氨酸)与树脂之间的偶联率采用如下步骤所示比色法进行：
采用比色法的根据是脱保护的氨基酸暴露出来的氨基基团可以和专门的检测试剂发生颜色反应，这个反应是定量的，颜色的深浅和氨基基团的数量成正比。颜色的深浅可以用分光光度计测量，据此可以计算出来偶联率的数值。
准确称取2-4毫克的连接了第一个氨基酸的树脂，放入EP管中，加入2-3滴冰乙酸和1毫升甲醇，洗涤后用1毫升甲醇洗涤3次。然后冻干，准确称重。加入偶联率检验专用试剂250微升，同时制空白。沸水浴反应5min，其间振荡2-3次。取出来后立即加入2.8毫升乙醇至总体积为3毫升。充分摇匀，然后用乙醇扫基线，在570nm处测定样品和空白的吸光度。按照下列公式计算：
(-NH2mmol/g)＝[(样品-空白)×体积(ml)×106]/(15000×样品重量)
偶联率＝1-[(-NH2mmol/g)/(1000×理论交换当量)]
在本发明中，可以通过测定曲普瑞林的氨基酸光学纯来考察产品的品质。曲普瑞林肽链中的十个肽中，有两个Trp氨基酸，其中一个是D-构型，而另一个Trp以及其它8个氨基酸均为L-型。在本发明中，如未另外说明，曲普瑞林氨基酸光学纯检测方法如下：对经纯化的曲普瑞林水解后，经CAT GmbH&Co.Chromatographie Und Analysentechnik KG光学纯检测各手性氨基酸的光学纯。测定本发明实施例1所得曲普瑞林精制品，结果显示除Trp外，其它8个L-氨基酸光学纯度均大于99.5%，这8个氨基酸的D-型对映体的比例均小于0.2%(D-Pro和D-His在0.14~0.18%之间，其它6个氨基酸的D-型对映体的比例均小于0.13%)%；并且对于精氨酸而言，其中D-型对映体的比例小于0.1%。
本发明设计的技术路线具有以下特点：操作简单化，适合大规模生产，原料得到方便，收率高，成本低，生产周期短，质量稳定，所得样品符合国家药典中规定的曲普瑞林原料药的各项检测标准。极具有市场竞争力。
在本发明中，使用到的一些试剂或原材料，它们的名称、来源等信息列举如下：
实施例与前述过程中所采用的原料列表如下：
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。在下面的例子中。下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明主张的保护范围。
实施例1：制备曲普瑞林
步骤1：Fmoc-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
10g的Rink AmidMBHA树脂(0.84mmol/g)，9.51g的Fmoc-Gly-OH；
氨基酸(在本步骤中为Fmoc-Gly-OH)：肽偶联剂HBTU：酰胺键形成促进剂(HOAT和HOBT以摩尔比1：2混合使用)：有机碱DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。溶剂用量根据经验和具体操作掌握，例如10g树脂中清洗、脱帽反应、偶联反应中溶剂用量为50~150ml，特别是在清洗时每次尽量用尽量少的溶剂，后面的步骤亦可参考本步骤1的溶剂用量进行。
(2)操作：准确称取10g Rink AmidMBHA树脂(0.84mmol/g)于反应器中，然后加入二氯甲烷100ml，振荡并浸泡60分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml)室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂(1~3mg)利用茚三酮反应检测，显蓝色；若不显蓝色，则需重新进行此步。
称取9.51g的Fmoc-Gly-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
本步骤1所得Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.89。该Fmoc-Gly-树脂用于后续的反应步骤。
在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：3混合使用，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.92。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：1混合使用，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.77。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：4混合使用，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.79。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.71。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOBT，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.74。在一个补充的试验步骤中，参照CN101357936A说明书第8页第1-7行记载的方法制备Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.78。可见，在本步骤1中，使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：2-3混合使用时，产物的偶联率明显高于单独用一种偶联剂。
步骤2：Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
在本实施例的本步骤2以及后续的各步骤中，上一步骤所得树脂全部投料到下一步骤；并且使用的肽偶联剂为HBTU，酰胺键形成促进剂为HOBT：有机碱为DIEA。
本步骤中，氨基酸(Fmoc-Pro-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测(在本发明中亦称为KT检测)，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取10.8g的Fmoc-Pro-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应2小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
步骤3：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取20.76g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、乳酸(相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.2倍)、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应2小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。本操作步骤获得的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续的步骤。本实施例1最终所得精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%，特别是结果显示D-Arg相对于全部精氨酸的量而言的含量为0.07%。
在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是加入相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.3倍的乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.09%。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是加入相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.5倍的乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.23%。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是加入相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.1倍的乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.21%。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是不加乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.34%。在一个补充的试验步骤中，参照CN101357936A说明书第8页第15-21行记载的方法制备Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂，其继续用于本实施例后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.31%。可见，在本步骤3中，在肽偶联反应中添加适量乳酸有助于更好品质的曲普瑞林。
步骤4：Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(Fmoc-Leu-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取11.31g的Fmoc-Leu-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
步骤5：Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(Fmoc-D-Trp(Boc)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取16.85g的Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应3小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
步骤6：Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取17.4g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应3小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
步骤7：Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取12.27g的Fmoc-Ser(tBu)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应4小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
步骤8：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂
的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(Fmoc-Trp(Boc)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取16.85g的Fmoc-Trp(Boc)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
步骤9：Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-
Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(Fmoc-His(Trt)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取19.83g的Fmoc-His(Trt)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。
步骤10：H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-A rg(Pbf)-Pr
o-Gly-树脂的制备
(1)原辅料配比
本步骤中，氨基酸(H-Pyr-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。
(2)操作：加入20%六氢吡啶二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取4.14g的H-Pyr-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应6小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间，接肽反应结束后，放入真空干燥器内干燥过夜，称重，得保护的十肽树脂。
步骤11：、肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移到500ml圆底烧瓶中，加入100ml预冷切割液(95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水)，室温搅拌反应3小时。抽滤以将树脂与滤液分离，用20ml三氟乙酸洗涤树脂2次，然后将滤液与洗涤液合并。然后加入冰冻乙醚1000ml，离心将沉淀与乙醚分离，将沉淀用5%醋酸溶解冷冻干燥后得醋酸曲普瑞林粗品。
步骤12：精制纯化
将上一步骤所得冻干的醋酸曲普瑞林粗品溶于5%醋酸(可缩写为HAc)，用离子交换色谱系统(Shodex IEC SP-420N，北京谱朋公司)，经5%HAc洗脱分离后，收集醋酸曲普瑞林主峰流分。然后将主峰流分通过反向色谱柱用等度洗脱。
反向色谱洗脱条件如下：
色谱仪：岛津-高效液相色谱仪
色谱柱：Lichrospher RP-18色谱柱
流动相：20%CH3CN/H2O；流速：10ml/min
紫外检测波长：280nm
将收集所得主峰流动相浓缩后，用冷冻干燥机冻干，冷冻干燥后得醋酸曲普瑞林精制品。以上12个步骤经计算总收率达27.6%(以步骤1中10g树脂投料量计)。
本实施例获得的醋酸曲普瑞林精制品，其经现行上市醋酸曲普瑞林原料药的药品标准测定，完全符合该标准的规定。例如其按无水、无醋酸物计，含C64H82N18O13为99.92%；按无水、无醋酸物计，比旋度为-69.2°；测定甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸八种氨基酸组成，以各氨基酸总摩尔数的八分之一作为1，计算各氨基酸的相对比值，甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸均在0.90~1.10之间，丝氨酸为1.02。
实施例2：制备曲普瑞林
照实施例1的方法进行，不同的仅是使用rink amide am树脂。
结果显示，在步骤1中偶联率为0.89；12个步骤总收率达26.9%；按无水、无醋酸物计，含C64H82N18O13为99.87%；按无水、无醋酸物计，比旋度为-70.1°；测定甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸八种氨基酸组成，以各氨基酸总摩尔数的八分之一作为1，计算各氨基酸的相对比值，甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸均在0.95~1.05之间，丝氨酸为0.97。
精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%。
实施例3：制备曲普瑞林
照实施例1的方法进行，不同的仅是将其中的HBTU替换为HATU，将其中的DIEA替换为NMM。
结果显示，在步骤1中偶联率为0.90；12个步骤总收率达27.5%；精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.13%；各项检测项目符合质量标准规定。
发明人在补充的试验中，参照CN101357936A说明书第8页第1行至说明书第10页第6行详细记载的方法制备曲普瑞林。结果显示，在第一步骤进行偶联反应制备Fmoc-Gly-树脂中，所得Fmoc-Gly-树脂偶联率仅0.78；总收率达25.3%；精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try和Arg以外，其它6个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均在0.13%~0.22%之间，而D-Arg相对于全部Arg而言的含量达0.34%。
实施例4：制备曲普瑞林
照实施例1的方法进行，不同的仅是将其中的HBTU替换为HCTU。
结果显示，在步骤1中偶联率为0.91；12个步骤总收率达26.6%；
精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.14%；
各项检测项目符合质量标准规定。
实施例5：制备曲普瑞林
照实施例1的方法进行，不同的仅是在各肽偶联反应步骤中，氨基酸：肽偶联剂：酰胺键形成促进剂：有机碱=1：2：2：2(摩尔比)。
结果显示，在步骤1中偶联率为0.89；12个步骤总收率达26.5%；
精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%；
各项检测项目符合质量标准规定。
实施例6：制备曲普瑞林
照实施例1的方法进行，不同的仅是在步骤1中改变Fmoc-Gly-OH的投料，使树脂与Fmoc-Gly-OH二者的摩尔比为1：2.5或者1：5，得到两批试样。
结果显示，在步骤1中偶联率为0.89或0.92；12个步骤总收率达27.6%或27.2%；
精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%；
各项检测项目符合质量标准规定。
Claims (10)
1.固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步骤：
(1)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Gly-树脂；
(2)向上一步骤所得的肽偶合树脂中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；
(3)循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸Fmoc-Pro-OH：Fmoc-L-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp(boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-trp(boc)-OH、Fmoc-L-His(trt)-OH和H-Pyr-OH，以最终形成十肽树脂：H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
(4)向步骤(3)所得十肽树脂中加入切割液进行切肽反应，以使十肽从树脂上切割下来，得到曲普瑞林。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤(1)中：
所述树脂选自：rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂、knorr树脂、或其组合；
所述肽偶联剂选自：DCC、DIC、HATU、HBTU、HCTU、TATU、TBTU、或其组合；
所述酰胺键形成促进剂选自：HOAT、HOBT、6-Cl-HOBt、或其组合；
所述有机碱选自：NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其组合；
用于进行偶联反应的所述溶剂选自：二氯甲烷、二甲基甲酰胺；
所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：取树脂置于反应器中，加入溶剂振荡并充分浸泡，抽除溶剂；
所述树脂在经浸泡处理后、进行偶联反应之前，还包括对该树脂进行脱帽处理的步骤；
所述树脂与所述Fmoc-Gly-OH的投料比为1：2.5~5(摩尔比)；进一步地，在后续的各个肽偶联反应中，添加的该步骤的氨基酸(Fmoc保护的或未保护的)的量为步骤(1)中树脂量的2~7倍(摩尔倍)；
所述Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱四者的投料比为1：1-3：1-3：2-6(摩尔比)；和/或
步骤(1)中，还包括在完成偶联反应后对获得的Fmoc-Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1~3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤(2)中：
所述脱帽试剂选自哌啶、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。
所述脱帽反应是在选自下列的溶剂中进行的：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，优选二甲基甲酰胺；
所述脱帽反应是在15~25%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的，优选是在20%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的；
步骤(2)中，还包括在完成脱帽反应后对获得的Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1~3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次；和/或
所述偶联反应是参照步骤(1)中的偶联反应进行的。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤(3)中：
第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸，得到H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
第二循环操作使用Fmoc-L-Leu-OH作为保护氨基酸，得到H-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
第三循环操作使用Fmoc-D-trp(boc)-OH作为保护氨基酸，得到H-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
第四循环操作使用Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到H-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
第五循环操作使用Fmoc-L-Ser(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到H-Ser(tBu)-Tyyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
第六循环操作使用Fmoc-L-trp(boc)-OH作为保护氨基酸，得到H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
第七循环操作使用Fmoc-L-His(trt)-OH作为保护氨基酸，得到H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；
第八循环操作使用H-Pyr-OH作为保护氨基酸，得到H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，
步骤(1)中进行偶联反应时，酰胺键形成促进剂是HOAT和HOBT两者组合使用；优选地，HOAT和HOBT二者的用量比为1：1-4(摩尔比)，优选1：2-3(摩尔比)；和/或
步骤(2)和步骤(3)中进行偶联反应时，使用的酰胺键形成促进剂是HOAT。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，在第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-L-Arg(pbf)-OH一起加入适量乳酸进行反应；在一个实施方案中，所述Fmoc-L-Arg(pbf)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.1-0.5，优选1：0.2-0.3。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)、步骤(2)、和步骤(3)中的所述偶联反应是在10~30°C温度下进行的，反应时间为10~200min，例如30~90min，例如约60min。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中步骤(4)中：
所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H2O；在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=50-98:1-10:1-10:0.1-5；
所述切肽反应是在室温进行的，优选是在20±5°C下进行的；反应时间为1-10小时；
所述切肽反应是将氨基酸的侧链保护基及十肽从树脂上同时切割下来从而获得十肽曲普瑞林；和/或
在完成切肽反应后，除去切割液(例如通过减压的方式)，然后加入乙醚进行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤数次，真空干燥，获得曲普瑞林。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于，
在经步骤(4)切肽反应获得曲普瑞林干燥品后，还进一步包括对该曲普瑞林干燥品进行纯化的步骤；
所述纯化步骤是照如下方式进行的：将曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，过滤，滤液过离子交换柱并用该醋酸水溶液洗脱，收集流出主峰，然后再经过C18柱纯化，收集主峰流出液，冷冻干燥，即得曲普瑞林精制品；
所述过离子交换柱并用该醋酸水溶液洗脱，所述的醋酸水溶液浓度为2%-20%(v/v)；
所说的反向C18柱纯化所用流动相为含0.3%乙酸和18%乙腈的水溶液。
10.一种曲普瑞林，其特征在于：
其经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.2%；
其经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%；
其经氨基酸光学纯检测，其中D-Arg相对于全部精氨酸而言均小于0.2%，优选小于0.15；
其中乙腈含量低于0.03%；和/或
其是通过权利要求1-9任一项所述方法制备得到的。
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