JP2012163560A - 直接的凝固因子阻害剤を決定するためのへパリン非感受性方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料中の凝固因子の直接的阻害剤を決定するための方法であって、以下の各工程:a)試料と酸化剤とを混合して反応混合物を形成する工程;b)前記反応混合物をインキュベートする工程;c)前記反応混合物と、前記酸化剤を中和する薬剤とを、混合する工程;d)定義された量の活性化凝固因子を前記反応混合物に添加する工程;及びe)添加された前記活性化凝固因子の阻害を決定する工程;を備える方法。
【選択図】図1
Description
a)試料と酸化剤とを混合して反応混合物を形成する工程;
b)前記反応混合物をインキュベートする工程;
c)前記反応混合物と、前記酸化剤を中和する薬剤とを、混合する工程;
d)定義された量の活性化凝固因子を前記反応混合物に添加する工程;及び
e)添加された前記活性化凝固因子の阻害を決定する工程;
を備える方法を提供する。
(実施例1)
本発明に従って前処理された試料における直接的第Xa因子阻害剤の決定
種々の量の直接的凝固因子阻害剤(直接的第Xa因子阻害剤としてのリバロキサバン、直接的トロンビン阻害剤としてのアルガトロバン)又は間接的凝固因子阻害剤(フォンダパリヌクス五糖化物[アリクストラ(登録商標)]及び高分子量ヘパリン[HMWH])を、正常ヒト血清に添加した。
本発明に従って前処理された試料における直接トロンビン阻害剤の決定
血清試料20μLを酸化剤としての0.1%力価次亜塩素酸(次亜塩素酸ナトリウム)10μLと混合して、反応混合物を+37℃で30秒間インキュベートした。続いて、0.1%力価塩酸溶液10μLを反応混合物に添加して酸化剤を中和し、反応混合物を+37℃で30秒間インキュベートした。続いて、トロンビン試薬140μL(ウシトロンビン、6U/mL)を反応混合物に添加して、反応混合物を+37℃で30秒間インキュベートした。続いて、発色性トロンビン基質50μL(Tos−L−Gly−Pro−Arg−ANBA−イソプロピルアミド、4ミリモル/L)を反応混合物に添加して、基質の変換率(ΔA/時間)を、自動化凝固測定機器(BCS(登録商標)System、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティックス社製)を用いて、405nmの波長で決定した。
ヘパリン含有試料における直接的第Xa因子阻害剤リバロキサバンの特異的決定
種々の量の直接的第Xa因子阻害剤リバロキサバン、又は、種々の量の直接的第Xa因子阻害剤リバロキサバンと種々の量の第Xa因子間接的阻害剤ヘパリン(HMWH)とを、正常ヒト血漿に添加した(表3を参照)。
Claims (11)
- 試料中の凝固因子の直接的阻害剤を決定するための方法であって、以下の各工程:
a)試料と酸化剤とを混合して反応混合物を形成する工程;
b)前記反応混合物をインキュベートする工程;
c)前記反応混合物と、前記酸化剤を中和する薬剤とを、混合する工程;
d)定義された量の活性化凝固因子を前記反応混合物に添加する工程;及び
e)添加された前記活性化凝固因子の阻害を決定する工程;
を備える方法。 - 工程a)において、前記試料が、次亜塩素酸、次亜塩素酸の塩、特に次亜塩素酸ナトリウム及びカリウム、反応性ハロゲン、過酸化水素、ペルオキソ一硫酸、ペルオキソ二硫酸、クロラミンB、クロラミンT、次亜塩素酸及びN−クロロスクシンイミド並びにこれらの塩から成る群から選ばれる酸化剤と、混合される、請求項1に記載の方法。
- 工程c)において、前記反応混合物が、ハロゲン酸、好ましくは塩素酸の低モル水溶液、特に好ましくは塩酸;フルクトース;ポリオール;並びにフルーツ酸及びその塩から成る群から選ばれる中和剤と、混合される、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程b)のインキュベーションの持続時間が、少なくとも約30秒、好ましくは約30から180秒、特に好ましくは約90から120秒、である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程d)において、定義された量の活性化凝固因子トロンビンが前記反応混合物に添加される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- ヒルジン、ダビガトラン、メラガトラン、アルガトロバン、キシメラガトラン、ビバリルジン、レピルジン、MCC−977、SSR−182289、TGN−255、TGN−167、ARC−183及びオジパルシルから成る群から直接的トロンビン阻害剤を決定するための、請求項5に記載の方法。
- 工程d)において、定義された量の活性化凝固因子第Xa因子が前記反応混合物に添加される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- リバロキサバン、アピキサバン、オタミキサバン、LY 517717、YM 153、DU−176b、DX−9065a及びKFA−1982から成る群から直接的第Xa因子阻害剤を決定するための、請求項7に記載の方法。
- 工程c)の後に、前記活性化凝固因子によって特異的に切断される発色基質、蛍光発生基質又は異なる標識を付された基質が、更に、前記反応混合物に添加され、放出されたシグナル生成切断生成物の量が測定される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも酸化剤、好ましくは次亜塩素酸ナトリウム、を含有する第1の試薬、及び、酸化剤を中和する薬剤、好ましくは塩酸、を含有する第2の試薬を含有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法を行なうためのアッセイキット。
- 活性化凝固因子、好ましくはトロンビン若しくは第Xa因子、を含有する試薬、及び/又は、検出可能なシグナル基を有する、前記活性化凝固因子のための基質を含有する試薬を、更に、含有する、請求項10に記載のアッセイキット。
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