JPS6137100A - プロテアーゼインヒビターの一工程分析方法、該分析用試験具及びその製造方法 - Google Patents

プロテアーゼインヒビターの一工程分析方法、該分析用試験具及びその製造方法

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JPS6137100A
JPS6137100A JP15848085A JP15848085A JPS6137100A JP S6137100 A JPS6137100 A JP S6137100A JP 15848085 A JP15848085 A JP 15848085A JP 15848085 A JP15848085 A JP 15848085A JP S6137100 A JPS6137100 A JP S6137100A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光肌夏分■ 本発明は、一般に診断分析及び酵素インヒビター分析に
関する。詳述すれば、本発明は、インヒビターを羊の対
応するプロテアーゼと共に予め保温する必要のない、プ
ロテアーゼインヒビターの一工程分析法に関する。
利］Ｊ髪 プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターの臨床上の
重要性は、それらが診断上、有用であるため、増大しつ
つある。プロテアーゼは、凝固、フィブリン溶解、ホル
モン産生、受精及び免疫防御のような多様な生理学的機
能に関与する。プロテアーゼインヒビターは、これらの
現象に関与する酵素を抑制する。
例えば、アンチトロンビン■は血液凝固系の一次インヒ
ビターであり、従って、止血バランス及びコントロール
を維持するのに極めて重要な役割を果たす。アンチトロ
ンビン■の濃度は、個人の血栓症に対する素質と良く相
関する。従って、これらの濃度は、血栓症の前駆状態を
評価する手段を医師に与える。血漿中のアンチトロンビ
ン■の濃度低下は、遺伝的過凝固性状態、深部血栓性静
脈炎又は経口避妊薬で誘発された、止血機能における変
化と関係する。肝臓疾患、ネフローゼ症候群及びＬ−ア
スパラギナーゼでの治療では、更に低い濃度が認められ
る。
従沫且ｊ佇 本発明によるプロテアーゼインヒビターの分析は、対応
するプロテアーゼ酵素（Ｅ）に対する適当なペプチド基
質（Ｓ）を、水性環境中で基質にプロテアーゼが作用し
て検出可能な応答を生ずるように選択することに基づく
。反応系にプロテアーゼインヒビター〇）を添加すると
、この応答は減少する。
１＋（過剰の）Ｅ−−ＨＩ　Ｅ＋Ｅ 従来、インヒビター濃度と検出可能な応答との間の所望
の関係を達成するには、インヒビターと対応するプロテ
アーゼとの反応は、基質の添加前に完了させなければな
らないと考えられていた。
例えば、スカリイ　（Ｍ、　Ｓ、５ｃｕｔｌｙ）らは、
クリニカ・ヒミカ・アクタ（ｃ１ｉｎｉｃａ、　Ｃｈｉ
ｍｉｃａ　Ａｃｔａ　）７９巻（１９７７年）５９５〜
６０２頁に、トロンビン特異性色素産生性ペプチド基質
、即ちＩ（−Ｄ−Ｐｈｅ−ｐｉｐ−ａｒｇ−ｐ−ニトロ
アナリドを使用して血漿アンチトロンビンを測定する方
法を開示した。このアンチトロンビン分析は、自緊試料
を３７℃の緩衝液中でトロンビンと共に予め保温するこ
とを必要とした。予め保温した溶液を次いで基質−緩衝
液混合物に添加し、その混合物を３７℃で再び保温して
から、氷酢酸を添加して反応を停止させた。
放出されたｐ−ニトロアナリンの量を分光光度計で測定
した。合成基質の存在で、ヘパリンで向上させたアンチ
トロンビンＩ［／）ロンビン反応速度の測定の動力学的
研究は、グリフイス（Ｍ、Ｊ。
Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　）によってトロンボシス・リサーチ
（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　２５
巻２４５〜２５３頁（１９８２年）に発表された。この
研究は、ヘパリンに関する反応メカニズムの動力学的モ
デルの有効性の測定に関する。
米国特許出願第４１８２８５号明細書には、血漿を過剰
のヘパリン及び３層試薬ストリップと接触させることか
らなる、哺乳動物の血漿におけるアンチトロンビン■の
測定方法が開示されている。プロテアーゼインヒビター
に関する公知分析法のすべてにおいて、残留プロテアー
ゼを分析するだめの合成ペプチド基質の添加に先立つ、
プロテアーゼインヒビターとプロテアーゼの反応の後に
時間の遅延がある。ところで、意外にも、プロテアーゼ
インヒビターの有効な測定に、インヒビターとプロテア
ーゼの反応に時間の遅延を必要としないことが判明した
。
発凱勿要旨 本発明は、インヒビターと対応するプロテアーゼとの予
備保温工程を必要としないプロテアーゼインヒビター又
はその活性剤の一工程分析方法、このような分析に有用
な単一の固体試験具、その製造方法及びその用途を提供
するものである。試験具は、プロテアーゼインヒビター
又はプロテアーゼインヒビターの活性剤（例えばヘパリ
ン）の一工程分析に使用することができる。本発明の方
法は、（ａ）試験試料、前記プロテアーゼインヒビター
によって阻害されうるプロテアーゼ及びプロテアーゼに
よって分解されて検出可能な応答を生じうる基質を実質
的に同時に混合して水性反応混合物を形成させ、（ｂ）
検出可能な応答を観察する工程からなる。プロテアーゼ
とその基質との反応による分解生成物は直接検出可能で
あるか、又は組成物に添加される結合成分との反応の後
に検出することができる。試験具は、担体マトリックス
にプロテアーゼ及びその基質を実質的に未反応の形で保
持するように、プロテアーゼ及びその基質を組み込むこ
とによって製造される。試験具は水性試験試料と接触さ
せて検出可能な応答を観察できるような形で組成物を含
む。本発明は、プロテアーゼとインヒビターとの予備保
温を必要としない一工程溶液分析方法又はプロテアーゼ
インヒビター若しくはインヒビターの活性剤用の単一の
固体試験具を提供するが、従来の方法は、恐らく観察可
能な応答とプロテアーゼインヒビターの濃度との間に直
線関係を確保するため、プロテアーゼ及びインヒビター
の予備保温をして試薬のその後の添加を必要とする。
因百包詳扁崖戎泗− なお、本発明を更に詳細に説明するに先立って添付の図
面について説明する。
第１図 第１図のグラフは、実施例１により準備した一工程溶液
分析における合成色素産生性基質、Ｓ−２２３８に対す
るトロンビンの反応性（時間、秒で）に対する０、５．
１０．１５．２０，２５及び５０ナノモルのアンチトロ
ンビンＩＩＩ　（ＡＴＩＩＩ）の添加の影響を示すこと
によって、アンチトロンビン■によるトロンビン阻害速
度を示す。溶液の吸光変人を１２０秒間連続的に監視し
、各時間Ｔ（秒）における図中に示したＡＴＩ［［の濃
度（数値はＡＴＩＩＩのナノモル数である）についてプ
ロットした。
第２図 第２図には、時間Ｔに対して反応速度のｌｏｇ　ｖを半
対数グラフにプロットしてアンチトロンビン■によるト
ロンビン阻害に対するデータを示す。
反応速度（即ち、吸光度の変化の速度）の対数ｌｏｇ　
ｖを、実施例１により製造した一工程液体分析組成物に
添加したＡＴＩＩＩの各濃度（図面には、０．５．１０
．１５．２０，２５及び５０ナノモル濃度で示した）に
関して、Ｔ（時間、秒）に対してプロットした。
第３図 第３図には、実施例１により製造した一工程溶液分析組
成物に関して、アンチトロンビン■濃度ｎＭに対して観
察された速度定数ｋｏｂｓ　　（単位：ｍ１ｎ−１）を
プロットすることによってＡＴＩによるトロンビンの阻
害速度を示す。
第４図 第４図には、アンチトロンビン■の分析用の単一の固体
試験具の反応率を示す。実施例２により製造された試験
具を、０．２５．５０．７５．１００及び１２５％の正
常ヒト血漿を含むＡＴＩＩＩ標準品を１：３に希釈して
接触させた。５秒毎に１分間反射率を測定した。データ
をに／Ｓ値に変換し、時間Ｔ（秒）に対してプロットし
た。第４図のグラフは、゛トロンビン、Ｓ−２２３８及
びヘパリンを含む試験具の反応性に対するアンチトロン
ビン■の添加の影響を示す。
第５図 第４図のグラフから測定された単位時間（Ｔ。
秒）当たりのストリップの反応性に／Ｓの対数をアンチ
トロンビン■の種々の濃度について時間（Ｔ、秒）に対
してプロットした（試験試料として使用した各パーセン
トの正常ヒト血漿中のアンチトロンビン■濃度を図面に
示した。ＡＴＩ［は、正常なヒト血漿の成分であるから
、このような血漿を使用して、標準試験試料を調製した
。）。こうして示したデータを使用して、阻害反応の半
減期ｔ　（７□を測定し、ｋ　ｏｂｓを計算した。
第６図 トロンビン及びＳ−２２３８を混入した担体マトリソク
スからなる単一の試験具で測定されるＡＴＩ［Ｉによる
トロンビン阻害速度を第６図に示す。
ｋ　ｏｂｓを試験試料として使用した種々のパーセント
の正常ヒ１〜血漿に対してプロットした。この図は、本
明細書に記載したように処理すると検出可能な応答及び
試料中のアンチトロンビン■の濃度の良好な直線関係を
示す。
発所Ω其藤狛崖殺割− 従来のプロテアーゼインヒビター分析法は、プロテアー
ゼ基質の添加前にプロテアーゼインヒビターと対応する
プロテアーゼとを反応させるため遅延時間を必要とする
。この遅延時間は、通禽、予備保温とその後の試薬添加
によって達成される。
ところで、本発明によれば、プロテアーゼ及び基質を試
験組成物中に、組成物が水性試料と接触されるのと実質
的に同時に混合することによってプロテアーゼインヒビ
ターの定量的分析を達成しうろことが判明した。分析成
分のその後の添加又は予備保温は必要ではない。
一工程分析方法が、インヒビターと対応するプロテアー
ゼとの予備保温なしに可能であり、プロテアーゼインヒ
ビター濃度と検出可能な応答との間に良好な相関関係を
示すことが判明した。この方法は、溶液分析のために用
いることができ、本方法における組成物は、水性試料に
よって湿潤する際、試験組成物の成分同士の反応が早す
ぎることなく、更にプロテアーゼと基質相互及び試験試
料とが必然的に同時に接触するように担体マトリックス
を組み込むことによって単一の固体試験具として提供す
ることができる。プロテアーゼインヒビターを含む任意
の水性試験試料を分析することができるが、問題となる
試料は主として血液、特に血漿である。
１、試験成分 多数のプロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター系が知
られている。例えば、アンチトロンビン■は凝固系のす
べての活性血清プロテアーゼ：ファクターＸ］Ｉａ、、
ＸＩａ１■ａ、、Ｘａ及びトロンビンを阻害する。更に
、問題となるプロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター
系は、エラスターゼ／α１−アンチトリプシン；Ｃ１−
エステラーゼ／　Ｃ＋　−エステラーゼインヒビター；
プラスミン／α２−アンチプラスミン及びキモトリプシ
ン／α、−アンチキモトリプシンを含む。
トロンビン／アンチトロンビン■系の場合には、インヒ
ビターの活性剤であるヘパリンを反応混合物に添加して
トロンビンへのアンチトロンビン■の結合を増加するの
が有利である。トロンビン／アンチトロンビン■／ヘパ
リン系を使用する場合には、使用する分析組成物の成分
に応じてヘパリン又はアンチトロンビンＩＩＩを定量的
に分析することができる。
下記の２つの基準に留意して基質を選択すべきである。
第一に、基質は分析に使用されるプロテアーゼに対して
できるだけ特異性であるべきである。第二に、基質が検
出可能な応答の特徴を決定する。基質にプロテアーゼが
作用すると、基質を分解する。分解生成物自体が比色分
析又は螢光測定の応答を生ずるか、又は結合成分と反応
して検出可能な応答を生ずることができる。
分解生成物が着色しているか又は螢光を発する多数の合
成基質が種々のプロテアーゼに対して開発された。下記
の第１表には、若干の市販の基質と共にプロテアーゼ／
プロテアーゼインヒビター系を示す。°Ｓ“を先頭に付
けた基質は、スウェーデン国ストックホルムのカビ・ダ
イアグツステイカ（Ｋａｂｉ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ
）によって製造されたものである。語尾に“ＭＣＡ　”
を付けた基質は、カリフォルニア州ベルモントのベニン
スラ・ラボラトリイーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手しうる螢光性メチルクマ
リンアミドエステルである。
語尾の１１ｐＮ＾”は、分解したときに黄色のｐ−ニト
ロアニリンを生成するｐ−ニトロアニリド誘導体を示す
。
第１表 ｇｌｙ−ａｒｇ−ｎしハ Ｂｚ−ａｒｇ−ｐＮ八 他の基質は、分解したときに直接検出可能な応答を生じ
ないが、付加的に添加された結合成分と分解生成物が反
応する場合に検出することができる。蛋白分解酵素用の
基質としてチオールエステル類が記載されている〔例え
ば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ　）等著、アナル・ビオヘム
（八ｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　９３巻２２３頁（１９７９年）参
照〕。
例えば、エステルであるＮ−α−ベンジルオキシカルボ
ニル−し−リジンチオベンジルエステル塩酸塩をトロン
ビン、プラスミン又はトリプシンの基質として使用する
ことができる。試験組成物に結合成分、例えば５，５゛
−ジチオビス（２−二トロ）安息香酸（エルマン試薬）
を添加すると、検出可能な発色応答がある。他の結合成
分をチオベンジルエステル基質と組合せて使用すること
ができる。これらは、２．２′−ジチオピリジン及び４
．４１−ジチオピリジンを含む。更に、トリペプチドチ
オールエステル基質を、米国特許第４．４３４，０９６
号明細書に記載されているような蛋白分解酵素の定量的
測定に使用することができる。
酵素反応の間に放出される遊離チオール基は、前記のよ
うな結合成分と反応した後、光度測定により測定される
。
本発明の分析方法は、プロテアーゼインヒビター又はそ
の活性剤の一工程分析を実施するのに必要な必須化学成
分をすべて試験試料と実質的に同時に接触させることか
らなる。プロテアーゼ及びその基質を含む試験組成物の
成分を商業的に包装した形で、早期反応を防止する任意
の方法で、試験具の構造で、又は試験キット、即ち、適
切な時期に一つの反応容器に混入するため必要な試薬を
保有する１個以上の容器の包装されたものとして提供す
ることができる。組成物を、水性試験試料で希釈し、転
倒させて混合したときに検出可能な応答を生ずるキュベ
ツト中の乾燥粉末として提供することもできる。また、
組成物を非水性溶液、例えばエタノール中の溶液として
提供することもできる。水性試料を添加すると、反応が
開始し、任意の検出可能な応答を観察することができる
。
プロテアーゼによる基質の加水分解には水性環境が必要
であるから、非水性環境ではプロテアーゼ及び基質は、
混合されても未反応のままである。
プロテアーゼ及び基質が、水性試験試料の添加前には試
験組成物中に実質的に未反応の状態で存在する限り、プ
ロテアーゼ及びインヒビターの予備保温又はその後の試
薬の添加をすることなく、プロテアーゼインヒビターの
存在を測定するためこの分析方法を使用することができ
る。
２１）試験具 本発明の特に便利な形態は、担体マトリックスにプロテ
アーゼ及びその基質を、水性試験試料との接触前にはプ
ロテアーゼとその基質の反応を防止するような方法で組
み込んで含む試験具である。
担体マトリックスは、試験組成物に対して実質的に不活
性であり、多孔性及び／又は試験すべき水性試料に対し
て吸収性である限り、試験組成物の成分を組み込みうる
任意の物質であってよい。
用語“担体マトリックス”は、水又は他の生理学的液体
にさらされたときに不溶性であり、その構造的一体性を
保持する吸水性又は非吸水性マトリックスを言う。使用
しうる適当な吸水性マトリックスは紙、セルロース、木
、合成繊維フリース、織布及び不織布等を含む。非吸水
性マトリックスは、ガラス繊維、ポリマーフィルム、予
備成形又は微孔性膜及び有機プラスチック材料、例えば
ポリプロピレン等を含む。
従って、本発明の試験具を製造する際に、このような担
体マトリックスを、他のものと同様にすべて使用するこ
とができる。マトリックスは、これらの成分のいずれか
又は全部を物理的に捕捉する系、例えば水溶液と接触し
たときに破壊するポリマーマイクロカプセルを含む。例
えば、水性試料と接触するまで、反応することなく、基
質を同じ担体マトリックス内でプロテアーゼから分離し
て保持することができる。マトリックスは、各組成物成
分がその後に硬化する液体又は半液体状態で均質に混合
されている層を含み、これにより水性試験試料によって
湿潤されるまで成分を捕捉する。相転移のような技術に
よって形成された、市販の予備成形多孔性膜又は微孔性
膜の使用を含めて、他の型のマトリックスを使用するこ
ともできる。ポリマーフィルムマトリックス、例えばラ
テックスポリマー懸濁液、例えばスチレンとブタジェン
の６０：４０コポリマー、又は他の天然若しくは合成ポ
リマー又はこれらの混合物を基質とするラテックス配合
物によって製造されたフィルムも使用できる。このよう
なフィルム配合物の例は米国特許第３，６３０，９５７
号及び同第４，３１２，８３４号明細Ｗ（参考として本
明細書に含める）に記載されている。
単一の固体試験ス１〜リップ又は試験具は、担体マトリ
ックスの組み込みと組み込み工程の間の乾燥とによって
製造することができる。全血試料を試験する場合、含浸
した担体マトリックスを過剰の試料を洗い落とすか、又
は拭き取ることができるように被覆することができる。
組み込みは、浸漬、塗布又は噴霧のような、プロテアー
ゼ及び基質の早期反応を防止するが、水性試料で湿潤さ
れたときにプロテアーゼ基質及び試験試料とほとんど同
時に接触しうる方法でプロテアーゼ及び基質を担体マト
リックスに組み込みうる任意の方法で達成することがで
きる。このことは、紙担体マトリックスにプロテアーゼ
を含む水溶液を含浸し、乾燥し、次いで、乾燥した担体
に基質を含む非水性溶液を含浸し、乾燥することによっ
て達成することができる。場合により活性剤又は結合成
分を、水性溶剤又は非水性溶剤への熔解性によって決定
して最も適当などちらかの溶液を用いて組み込むことが
できる。また、プロテアーゼ及び基質を前記のように別
々にカプセルに充填し、別々のポリマーフィルムにおけ
る支持体材料上に置くか、又は米国特許第４，０４６，
５１３号明細書に記載されているようなインキジェット
印刷技術によって支持体材料上に印刷することができる
。他にも方法があるが、いずれの場合にも、基質との反
応の前にプロテアーゼとそのインヒビターとの反応の間
に時間遅延は起こらないと考えられる。乾燥は、組み込
まれる組成物に悪い影響を与えない任意の手段、通富空
気乾燥器によって達成することができる。乾燥した紙を
そあ後、切断し、支持体材料、例えば硬質又は半硬質ポ
リスチレンフィルムストリップの一端に取りつケル。ス
トリップ上への紙の取りつけは、両面接着テープ、例え
ばミネソタ州セントポールの３Ｍ社からダブル・スティ
ック（ＤＯＵＢＬＥ　５ＴＩＣＫ、商標）として入手し
うるちのを使用して達成することができる。
支持体材料には、試験具の使用を容易にするため便利な
把手を付ける。試験具は、本発明の分析方法を実施する
ため特に便利な形態である。試薬を単一の担体マトリッ
クス、例えば紙中に組み込み、先に反応することなく保
持することができる。試験具を試料と簡単に接触し、検
出可能な結果を記録する。検出可能な結果からプロテア
ーゼインヒビターの濃度を測定するための結果及びデー
タの操作を以下に結果として記載する。
３、試験成分の濃度範囲 一工程液体分析における試験成分の濃度範囲は、特定の
プロテアーゼインヒビターに関して問題となる臨床的範
囲に左右される。第ｎ表は、ヒト血漿中のプロテアーゼ
イ、ンヒビターの正常範囲を示す。この範囲をはずれる
数値は異常と考えられ、従って臨床的に問題を有する。
第■表 プロテアーゼインヒビター　　　　正常範囲（ｍｇ乙■
隻！り一 α、−アンチトリプシン　　　　　２００〜４００α１
−アンチキモトリプシン　　　３０〜６０インター−α
−トリプシンインヒビター２０〜７０アンチトロンビン
ＩＩＩ　　　　　　　　１７〜３０ｃ１−不活性化剤　
　　　　　　　１５〜３５α２−マクログロブリン　　
　　　１５０〜３５０α２−アンチプラスミン　　　　
　　９〜１２（以下余白） 一工程液体分析用の水性反応混合物中の試験成分の操作
濃度及び好適な最終濃度範囲：」−一一庄遵一一 プロテアーゼ　　　０．１〜ｌ０ＮＩ１１　０．２５〜
２．０ＮＩＩ（（トロンビン）　　単位／ｍ１　　　　
単位／ｍ１基質　　　　　　　０．０５〜５　ｍＭ　　
　Ｏ，０５〜２　ｍＭプロテアーゼインヒビター （アンチトロンビン■） １〜１０００　ｎＭ　　５〜５００　ｎＭ活性剤　　　
　　　０，１〜ｌ０ＵＳＰ　　０．２５〜５　ＵＳＰ単
位／ｍ１　　　　単位／ｍｌ 前記の濃度範囲は、色素産生性基質を用いるアンチトロ
ンビンＩ［Ｉ／）ロンビンに関するものである。螢光発
生性基質を使用する場合には、濃度は操作範囲内に入る
が、好適範囲は少し低くなる。
特に好ましい実施態様では、アンチトロンビン■に関す
る一工程液体分析は、０．５〜１．　ＯＮＩＩ（単位／
ｍｌのトロンビン、０．０５〜０．２ｍＭのトロンビン
基質、例えばＳ−２２３８及び０．５〜２　ＵＳＰ単位
単位／ｍへパリンを含む組成物と血シタ試験試料とを接
触させることを含み、この組成物は試料を接触させるの
と実質的に同時に混合して一つの液体分析試薬を形成し
たものである。
他のプロテアーゼインヒビター／プロテアーゼ対に関す
る濃度範囲は、アンチトロンビンＩＩＩ／）ロンビンに
関する前記の操作範囲内に入ると考えられる。他のプロ
テアーゼインヒビター／プロテアーゼ対に関するこれら
の濃度範囲は、主として、使用する機器の検出限界に関
連して設定される。
測定は、総プロテアーゼ１００％から総プロテアーゼ２
０％の範囲にわたって必要である。最適プロテアーゼ濃
度が決定されると、初期基質濃度が少なくともプロテア
ーゼを飽和するのに充分であるが、阻害速度を低下しな
い程度の濃度で設定される。予測される正常血漿範囲の
いずれかの末端でプロテアーゼインヒビター濃度を測定
するためには、プロテアーゼインヒビターの予測値が試
験組成物中の総プロテアーゼの８０％よりあまり多くな
い量を結合するように血漿試料を希釈する必要がある。
任意のプロテアーゼインヒビター／プロテアーゼ対に関
する希釈率は、通常約１：１〜約１：１００の範囲であ
る。試料を通常、生理食塩水又は緩衝剤水溶液（例えば
燐酸塩緩衝液）で希釈する。アンチトロンビン■分析に
は、希釈は通常、約１：１〜約１：１０であり、血漿を
生理食塩水（例えば０．８５％塩化ナトリウム）で１；
３に希釈する。当業者は、前記の操作によりプロテアー
ゼインヒビターを分析するため、試薬の適切な濃度を決
定することができるであろう。
試験組成物を担体マトリックス中に組み込んで単一の固
体試験具を作るときに必要な成分濃度は、一工程液体分
析に必要な濃度より実質上高い。次に、アンチトロンビ
ン■の測定用の試験具を製造するため使用される試薬溶
液中の成分の操作濃度及び好適な濃度範囲を示す。
（以下余白） −操詐−−好１− プロテアーゼ　　　０．２〜５ＯＮ’ｌＨ５〜２０　Ｎ
ＩＩＩ（トロンビン）　　単位／ｍｌ　　　　単位／ｍ
１基質　　　　　　　０．２〜５　ｍＭ　　　Ｏ，５〜
２　ｍＭプロテアーゼインヒビター（アンチトロンビン
ＩＩＩ、血漿の１：３希釈） ０〜１５０％Ｎ）ＩＰ　２０〜１５０％ＮＩＰ活性剤（
ヘパリン）０．２〜１００ＵＳＰ　　０．５〜３０ＵＳ
Ｐ単位／ｍ１　　　　単位／ｍｌ 特に好ましい実施態様においては、５〜ｌ０ＮＩＨ単位
／ｍｌのトロンビン及び１〜１０　ＵＳＰ単位単位／ｍ
へパリンを含む水溶液を担体マトリックスに組み込み、
乾燥し、次いで、乾燥したマトリックスに１〜２　ｍＭ
の色素産生性トロンビン基質を含む非水性溶液を組み込
み、乾燥することによってアンチトロンビン■用の単一
の固体試験具を製造する。他のプロテアーゼインヒビタ
ーの測定に必要な試薬濃度は、再び、問題となるプロテ
アーゼインヒビター／プロテアーゼ対及び選択した検出
方法の感度に主として左右される。溶液の試薬濃度を測
定するため記載したのと同様の操作を使用して、試験具
を製造するための好ましい濃度を測定する。しかし、こ
のような濃度は、アンチトロンビン■について記載した
操作濃度の範囲内に入るであろうと予測される。
アンチトロンビンＩＩＩを試験組成物又は試験具に組み
込み、ヘパリンを検出する場合には、ヘパリンを測定す
るのと同じ方法を使用して分析し、試験具を製造するこ
とができる。このため、アンチトロンビン■又は他のプ
ロテアーゼインヒビターが問題の被分析物であり、その
ままでは試験具中に組み込めないか、又は単一の分析試
薬溶液中に混入されないと考えられるとしても、アンチ
トロンビン■の操作濃度及び好適濃度範囲は前記のとお
りである。
試験具は、試料及び試験具を単に接触させることによっ
て有利に使用され、これにより検出可能な応答が生ずる
。試験具との接触は、浸漬、ピペット又は綿棒を用いて
行われる。
４、結果 液体分析において、色素産生性基質を使用する場合に監
視される、検出可能な応答は吸光度である。プロテアー
ゼインヒビターの特定の濃度で、試験試料と接触後の分
析溶液の吸光度を１２０秒間連続して監視した。時間（
秒）に対して吸光度の測定値をプロットした後、個々の
時間間隔で反応速度を測定した。これらの時間間隔での
反応速度の半対数プロットを使用して阻害反応の半減期
（ｔ　ｌ、　）を測定した。観察された速度定数（ｋｏ
ｂｓ　）を下記の式から計算した：ｋｏｂｓ　〜０．６
９３／　ｔ、／２ 分析組成物を担体マトリックス中に組み込んで単一の固
体試験具を製造する場合には、反射率を使用して検出可
能な発色応答を測定する。４０５ｎｍ干渉フィルターを
有するアメス・セラライザー（Ａｍｅｓ　５ＥＲＡＬＹ
ＺＥＲ，商標）分光光度計を使用して５秒毎に２分間、
反射率を監視した。セラライザーをヒユーレット・パラ
カード（ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ）　Ｉ（Ｐ　８
５コンピユータに接続すると、データを直接グラフで示
すことができる。
反射率の測定値を周知のクベルカームンク（Ｋｕｂｅｌ
ｋａ−Ｍｕｎｋ）の式〔ゲスタフ・コルタム（Ｇｕｓｔ
ａｖ　Ｋｏｒｔｕｍ　）著、′リフレクタンス・スペク
トロスコピー（Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ　５ｐｅｃｔｒ
ｏｓｃｏｐｙ）　　”、１０６〜１１１頁参照、ニュー
ヨークのシュプリンガー・フェルラーク（Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　）、１９６９年発行〕の単純化さ
れた形： 〔式中、Ｒは試験具からの反射率を表し、Ｋは定数であ
り、Ｓは特定の反射媒体の光散乱係数を表す〕で評価し
た。Ｋ／Ｓは吸収する種、通常、プロテアーゼと基質と
の反応によって形成される分解生成物の濃度に関係する
。Ｋ／Ｓを、液体分析に関する時間に対する吸光度のプ
ロットと同様に、時間（秒）に対してプロットした。時
間（秒）に対する反応性（時間に対するに／Ｓのプロッ
トから測定される１秒当たりのに／Ｓの変化）の半対数
プロットを使用して、阻害反応の半減期（ｔ、ｈ）を測
定した。液体分析と同様に、観察された速度定数（ｋｏ
ｂｓ）を関係式： ｋｏｂｓ　＝０．６９３／　ｔＢ７゜ から算出した。
液体分析及び単一の固体試験具の両方において、試料溶
液中のプロテアーゼインヒビターの濃度と観察しうる応
答との間に直線関係が成立する。未知試料を同様の計算
及び標準曲線との対比により測定することができる。
下記の実施例は、本発明を開発する際に実施した実験を
記載したものである。実施例は本発明を説明するための
もので、本発明の範囲を限定するものではない。本発明
の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定される。当
業者は、組成物の成分並びに成分及び反応のパラメータ
における、望ましいと思われるような変更、置換及び変
化を行うことができる。
実施例 本明細書において、便宜上、下記の記号を使用する。
ｄｌ　　　　デシリットル ｍｌ　　　　ミリリットル μＬ　　マイクロリットル Ｈモル ｍＭ　　　　ミリモル ｎＭ　　　　ナノモル μＨマイクロモル ■　　　ミリグラム ｇ　　　グラム ｎｍ　　　　ナノメートル °Ｃ摂氏度 ＩＵ　　　　国際単位−分析の条件下に１分当たり基質
１マイクロモルの加水分解を触媒 する酵素の量 ＮＨＰ　　　正常ヒト血弊 ＮＩＨ単位　３７℃で１５秒に２５０■％のフィブリノ
ーゲン溶液を凝固させるトロン ビンの量 Ｕ、Ｓ、Ｐ、ヘパリン単位 ＵＳＰ標準品に対して規定されるヘパリンの効力の単位 八ＴＩ　　　アンチトロンビン■ ｔ１／２　　　反応体の半減期 ｋｏｂＳ　　観察された速度定数 ■　　　反応速度 Ｓ−２２３８Ｄ−ｐｈｅ−ｐｉｐ−ａｒｇ−ｐＮＡ　、
スウェーデン国ストックホルムのカビ・ダイアグツス テイカ（Ｋａｂｉ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）から得ら
れるトロンビンに対する合成色素産生 性基質 トロンビン イリノイ州ネイパービルのマイルス・ サイエンティフィク社（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から得られるウシトロンビン ヘパリン ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケ ミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）か
ら得られる豚の腸粘膜ヘパリン ＥＤＴＡ　　　エチレンジアミン四酢酸ツイーン８０ ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケ ミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）か
ら得られるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ
−オレエート ガントレッズ（Ｇａｎｔｒｅｚ　）　　ＵＳ−２２５ニ
ユーヨーク州ニユーヨークのガフ社 （ＧＡＦ　Ｃｏｒｐ、　）から得られるメチルビニルエ
ーテル／マレイン酸無水物コポ リマーのエチルエステル ＤＭＦ　　　ジメチルホルムアミド トリス　トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン エマルフォー　（Ｅｍｕｌｐｈｏｒ−、商標）　０Ｎ−
８７０ニユーヨーク州ニユーヨークのガフ社 （ＧＡＦ　Ｃｏｒｐ、　）から得られるポリオキシエチ
ル化オレイルアルコール 基質の記号 ＢＯＣベンジルオキシカルボニル ｐ−ＮＡ　　　パラーニトロアナリド Ｂｚ　　　　ベンジル ＳＵＣサクシニル ｇｌｕ　　　　グルタミン酸 １１ｅ　　　イソロイシン ｇｌｙ　　　グリシン ａｒｇ　　　アルギニン ｐｒｏ　　　　プロリン ｖａｌ　　　バリン ｐｈｅ　　　フェニルアラニン ｓｅｒ　　　セリン ｌｙｓ　　　リジン ｐｉｐ　　　　ピペコリン酸 使用するパーセンテージは、特に断らない限り、溶液１
００ｍ１当たりの重量（ｇ）（％ｗ　／　ｖ　）を示す
。
実施例１：アンチトロンビン■の一工程液体分析プロチ
アーゼインヒビターに関する従来発表された分析法はイ
ン、ヒビター及びプロテアーゼの予備保温とその後の試
薬の添加を必要とするので、一工程分析の有効性を測定
する研究がなされた。
プロテアーゼインヒビターであるアンチトロンビン■の
分析をモデル系として使用した。
プロテアーゼであるトロンビンの合成色素産生性基質Ｓ
−２２３８に対する作用の阻害速度を、アンチトロンビ
ン■の濃度を増加しなから４０５部ｍで吸光度を連続的
に監視することによって測定した。トロンビン活性をＮ
ＩＨ単位で表すことができる。また、トロンビン活性を
国際単位で表すこともできる。
緩衝したヘパリン溶液（５０ｍＭ）リス、１７５ｍＭ塩
化ナトリウム及び７．５　ｍＭ　ＥＤＴＡの緩衝剤溶液
（ｐＨ８，４）中のヘパリンＩ　ＵＳＰ単位／ｍｌ）に
一定濃度のＳ−２２３８を添加した。アンチトロンビン
ＩＩＩを混合物に添加して、０〜５０ｎＨの濃度範囲と
し、ｌ０ＮＩＩ（単位／ｍｌのトロンビン（最終濃度８
．５部Ｍ）５０μＬを添加して反応を開始させた。
結果を第１図に示す。アンチトロンビン■の濃度を増加
すると共に、トロンビンの阻害速度が増加する（第１図
及び第２図）。半対数プロットを使用して、阻害反応の
半減期（ｔ１／２）を測定した。
観察された速度定数（ｋｏｂｓ）を、関係式：％式％ から算出した。ナノモル単位のアンチトロンビン■濃度
に対してｋ　ｏｂｓをプロットすると、トロンビン阻害
速度が実際、アンチトロンビン■濃度の直線函数である
ことが判る。
実施例２：アンチトロンビン■分析に有用な単一の試験
具 アンチトロンビン■の一工程分析を実施するのに必要な
全成分を含む固体試験具を下記のようにして製造した。
ファツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　５４Ｆ紙を１％ウ
シ血清アルブミン、ｌ０ＮＩＩ（単位／ｍｌのトロンビ
ン及び３０単位／ｍｌのヘパリンを含む０．２　Ｍ　ｌ
−リス、０．１７５Ｍ塩化ナトリウム及び７．５　ｍＭ
　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，４）の水溶液中に浸漬した。含浸
したう戸紙を５０℃で１５分間乾燥し、次いで、２ｍＭ
Ｓ−２２３８，０，１％ツイーン８０及び１％ガントレ
ソズＥＳ−２２５を含むエタノール４部に対してジメチ
ルホルムアミド１部の非水性溶液中に浸漬した。
正常ヒト自緊（ＮＨＰ）を希釈して０１１０．２０．４
０．６０．８０及び１００％Ｎ　Ｉ（Ｐを含む溶液を製
造することによってアンチトロンビン■の標準を調製し
た。ＮＨＰ中のＡＴＴｌｌの平均濃度は、２３．５ｍｇ
／　１００ｍｌである。ＡＴＩＩＩ濃度は下記のような
ＮＨＰ％に対応する： 皿単Ｎ几凡笈　　人工且汲変」工／則ト１ＬＩＱ　　　
　　　　　　２．３５ ２０　　　　　　　　４．７０ ４　Ｑ　　　　　　　　　９．４０ ６０　　　　　　　１４、１０ １３Ｑ　　　　　　　　１Ｂ、８Ｑ １００　　　　　　　２３．５ すべての試験試料及び標準を、利用しうる機器の測定範
囲により分析前に生理食塩水２部に対して１部に希釈し
た。
希釈した血！ｌ１３０μＬを試験其上ヘビベントで滴下
し、４０５部ｍ干渉フィルターを有するアメス・サララ
イザー（Ａｍｅｓ　５ＥＲＡＬＹＺＥＲ，商標）分光光
度計を使用して２分間５秒毎に反射率を監視した（第４
図）。
反応性のデータを例１に記載したのと同様の方法で処理
した。時間と共に反応性（１秒当たりのデルタに／Ｓ）
の半対数プロットを使用して、トロンビン活性の半減期
ｔ１ｈを測定した（第５図参照）。観察された速度定数
ｋ　ｏｂｓを算出し、標準中のアンチトロンビン■濃度
に対してプロットして応答曲線を作った（第６図参照）
。試験血賎中のアンチトロンビン■の濃度を応答曲線か
ら測定した。
実施例３：単一の試験具に使用するポリマーフィルムマ
トリックス ポリマーフィルム担体マトリックスを用いて、アンチト
ロンビン■の測定用の試験具を製造することができた。
ラテックスフィルムにプロテアーゼ及びヘパリンを混入
させ、乾燥し、乾燥した担体に基質を含む非水性溶液の
第二のポリマーフィルムを施し、乾燥する。下記のよう
な試験具を製造する： 第一層 ラテックス　　　　　　　　　　　２ｍｌトロンビン　
　　　　　　　　１００ＮＩＨ単位アビセル（八ｖｉｃ
ｅｌ、商標）　ＲＣ５９１−Ｆ　３　ｇトリス緩衝液　
　　　　　　　　　　８．０ｍｌヘパリン　　　　　　
　　　　３００ＵＳＰ単位第二の組み込み 基質Ｓ−２２３８（ＤＭＦ中１０ｍＭ）　　　　　１ｍ
ｌツイーン（Ｔｗｅｅｎ　、商標）８０　　　１■ガン
トレソズ（Ｇａｎｔｒｅｚ　）　ＩＥＳ−２２５１００
ｒＮＺアビセル（Ａｖｉｃｅｌ、商標）　ｌＩＣ５９１
−Ｐ３．　Ｏｇエマルフォー　（Ｅｍｕｌｐｈｏｒ、商
標）　０Ｎ８７０（３０％）　　　　　　　　　　　　
　１．０ｍｌポリビニルピロリドン（ＰＶＰ　　−に９
０　）　　２００ｍｇ１　：　４ｎＭＦ−エタノール　
　　　　６．０ｍｌラテックスはボリサール（Ｐｏｌｙ
ｓａｒ　）　ＸＩＥ４６５、即ち、ペンシルバニア州モ
ナカのポリサール社（Ｐｏｌｙｓａｒ　Ｉｎｃｏｒｐｏ
ｒａｔｅｄ）から得られる固形分５０％を含む６０　：
　４０スチレン／ブタジエンコポリマーである。アビセ
ル（八ｖｉｃｅｌ、商標）　ＲＣ５９１−Ｆはペンシル
バニア州フィラデルフィアのＦＭＣ社（Ｆ　Ｍ　ＣＣａ
ｒｐ、　）の食品及び医薬品部門から得られる微品性セ
ルロースである。
フィルムをドクターナイフを使用して２層で施す。好ま
しいフィルム厚は、約２５〜３５ミクロンの乾燥フィル
ム厚を生じる約３０〜４０ミクロンである。しかしなが
ら、フィルムの厚さは、試験具の性能には重要ではない
。フィルムを空気乾燥器中で６０°Ｃで１０分間、風乾
する。
試薬を２つのポリマ一層で施すが、層は水性試験試料と
接触する前にプロテアーゼと基質を分離すればよい。組
み込んだ担体を湿潤させると、すべての試薬及びインヒ
ビター（存在すれば）は、一つの反応容器に同時に添加
したかのように、実質的に同時に接触する。
実施例４：α１−アンチトリプシンの一工程液体分析 α１−アンチトリプシン（α１−プロテアーゼインヒビ
ターとしても公知）の濃度を、エラスターゼ阻害速度に
対する作用を測定するため変化させた。
ジメチルスルホキシド中の１１．０８　ｍＭ　５ｕｃ−
ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−ｐＮＡ　　５０μＬ及び５０
ｍＭ）リス及び０．１２Ｍ塩化ナトリウム（ｐ１４７．
４）を含む溶液１．４５ｍ１をキュベツトに入れた。こ
れに１０■／ｍ１のα１−アンチトリプシン５．１０．
２０及び３０μＬを添加した。５■／ｍｌのエラスター
ゼを含む溶液５μＬを添加して反応を開始させた。
４０５ｎｍでの吸光度を１分間連続して監視した。
反応速度を５秒間隔で測定し、元の速度のパーセンテー
ジとして表し、半対数グラフ用紙に時間の函数としてプ
ロットした。、半減期ｔ７をグラフから求め、ｋ　ｏｂ
ｓを下記の式により算出した：（式中ｔ１ｈは秒（この
場合ｋ　ｏｂｓはｍ１ｎ−”）単位である〕。ｋ　ｏｂ
ｓをα１−アンチトリプシン濃度に対してプロットする
ことができる。
α１−アンチトリプシンによるエラスターゼ阻害速度は
、インヒビターの濃度に比例することが判った。従って
、本発明の分析方法はα１−アンチ１−リプシンの濃度
を測定するため使用することかできる。単一の固体試験
具を前記の方法で製造することができる。
本発明の思想及び範囲から逸脱することなく、他の多数
の変更及び変化をなしうろことは明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図はＡＴＴ［によるトロンビン阻害を示す時間−吸
光度グラフ、第２図はＡＴＩ’ｆｆによるトロンビン阻
害を示す時間−反応速度の半対数グラフ、第３図はＡＴ
ＩＩＩ濃度とトロンビン阻害速度との関係を示すグラフ
、第４図はＡＴＩＩＩ用の単一の試験具の反応性を示す
時間−に／Ｓのグラフ、第５図はトロンビン阻害に対す
る応答における時間−ストリップの反応の半対数グラフ
、第６図はＡＴＩＩＩによるトロンビン阻害速度を示す
グラフである。

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）インヒビターをその対応するプロテアーゼと共に
    予め保温することなくプロテアーゼインヒビターを一工
    程で分析するため、 （ａ）試験試料、前記プロテアーゼインヒビターによっ
    て阻害されうるプロテアーゼ及びプロテアーゼによって
    分解されて検出可能な応答を生じうる基質を実質的に同
    時に混合して水性反応混合物を形成させ、 （ｂ）検出可能な応答を観察する 工程からなるプロテアーゼインヒビターの一工程分析方
    法。
  2. （２）分解生成物が着色しているか又は螢光を発する特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. （３）プロテアーゼ及び基質の分解生成物と反応して比
    色分析又は螢光測定法で検出可能な応答を生じる結合成
    分を更に含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. （４）プロテアーゼインヒビターがアンチトロンビンI
    IIであり、プロテアーゼがトロンビンである特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  5. （５）試験試料が水性緩衝液又は生理食塩水で約１：１
    〜約１：１０の範囲で希釈された血漿試料であり、工程
    （ａ）で形成した水性反応混合物が約０．１〜約１０Ｎ
    ＩＨ単位／ｍｌのトロンビン及び約０．０５〜約５ｍＭ
    の基質を含む特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. （６）試験試料を更にヘパリンと混合して約０．１〜約
    １０Ｕ．Ｓ．Ｐ．単位／ｍｌのヘパリンを含む反応混合
    物を得る特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. （７）試験試料を更にプロテアーゼインヒビターの活性
    剤と混合する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. （８）プロテアーゼインヒビターがα＿１−アンチトリ
    プシンであり、プロテアーゼがエラスターゼである特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  9. （９）プロテアーゼインヒビターがｃ＿１−エステラー
    ゼインヒビターであり、プロテアーゼがｃ＿１−エステ
    ラーゼである特許請求の範囲第１項記載の方法。
  10. （１０）プロテアーゼインヒビターがインター−α−ト
    リプシンインヒビターであり、プロテアーゼがトリプシ
    ンである特許請求の範囲第１項記載の方法。
  11. （１１）プロテアーゼインヒビターがα＿１−アンチキ
    モトリプシンであり、プロテアーゼがキモトリプシンで
    ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
  12. （１２）プロテアーゼインヒビターがα＿１−アンチプ
    ラスミンであり、プロテアーゼがプラスミンである特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  13. （１３）インヒビターをその対応するプロテアーゼと共
    に予め保温することなく水性試験試料中のプロテアーゼ
    インヒビターを一工程で分析するための試験具において
    、 （ａ）前記プロテアーゼインヒビターによって阻害され
    うるプロテアーゼ及びプロテアーゼによって分解されて
    検出可能な応答を生じうる基質を含む試験組成物、及び （ｂ）プロテアーゼ及び基質が実質的に未反応の形で存
    在する、前記組成物と組み合わされた担体マトリックス
    からなる試験具。
  14. （１４）担体マトリックスにトロンビン及びトロンビン
    用の合成色素産生性基質が組み込まれ、トロンビン及び
    基質が実質的に未反応の形で存在する特許請求の範囲第
    １３項記載の試験具。
  15. （１５）担体マトリックス中に更にヘパリンが混入され
    ている特許請求の範囲第１４項記載の試験具。
  16. （１６）（ａ）担体マトリックスをプロテアーゼを含む
    水溶液で含浸する工程、 （ｂ）含浸したプロテアーゼを乾燥する工程、 （ｃ）乾燥したマトリックスに基質を含む非水性溶液を
    混入させる工程、及び （ｄ）乾燥する工程 からなる試験具の製造方法。
  17. （１７）約０．２〜約５０ＮＩＨ単位／ｍｌのトロンビ
    ンを含む水溶液及び約０．２〜約５ｍＭの、トロンビン
    に対する合成色素産生性基質を含む非水性溶液を用いて
    試験具を製造する特許請求の範囲第１６項記載の方法。
  18. （１８）水溶液が更に、約０．２〜約１００ＵＳＰ単位
    ／ｍｌのヘパリンを含む特許請求の範囲第１７項記載の
    方法。
  19. （１９）担体マトリックスに更に活性剤を組み込む特許
    請求の範囲第１６項記載の方法。
  20. （２０）担体に更に、結合成分を組み込む特許請求の範
    囲第１６項記載の方法。
  21. （２１）特許請求の範囲第１３項記載の試験具を水性試
    験試料と接触させ、検出可能な応答を観察することから
    なる水性試験試料中のプロテアーゼインヒビターの一工
    程分析方法。
  22. （２２）特許請求の範囲第１５項記載の試験具を水性試
    験試料と接触させ、検出可能な応答を観察することから
    なる水性試験試料中のプロテアーゼインヒビターの一工
    程分析方法。
  23. （２３）（ａ）試験試料、アンチトロンビンIII、トロ
    ンビン及びトロンビンによって分解されて検出可能な応
    答を生じうる基質を実質的に同時に混合して水性反応混
    合物を形成する工程、及び （ｂ）検出可能な応答を観察する工程 からなる、アンチトロンビンIIIをトロンビンと共に予
    め保温することなく水性試験試料中のヘパリンを一工程
    で分析する方法。
  24. （２４）（ａ）アンチトロンビンIII、トロンビン及び
    トロンビンによって分解されて検出可能な応答を生じう
    る基質を含む試験組成物、及び （ｂ）該組成物を組み込んで含み、トロンビン及び基質
    が実質的に未反応の形で存在する、アンチトロンビンI
    IIをトロンビンと共に予め保温することなく水性試験試
    料中のヘパリンを一工程で分析する試験具。
  25. （２５）特許請求の範囲第２４項記載の試験具を水性試
    験試料と接触させ、検出可能な応答を観察することから
    なる水性試験試料中のヘパリンの一工程分析方法。
JP15848085A 1984-07-20 1985-07-19 プロテアーゼインヒビターの一工程分析方法、該分析用試験具及びその製造方法 Pending JPS6137100A (ja)

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