JPH0322948B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳綱の血漿中抗トロンビンの定量
的測定法に関する。 近年、特定のプロテイナーゼの分析のための小
さいペプチド基質の使用に関する多くの文献が出
ている。これらの基質は、プロテイナーゼによる
加水分解が起ると放出される原色性あるいは蛍光
原性基を通常含有し、その結果、存在するプロテ
イナーゼ酵素量を定量するために発色速度または
蛍光発現速度を用いることができる。この発展に
より血漿凝固の各段階において関与する多くの血
清プロテイナーゼを個別に分析することが可能と
なつた。トロンビンとXa因子に特異的なペプチ
ド基質が、血漿中のトロンビンとXa因子の主要
な抑制因子であると考えられている臨床上重要な
血液凝固抑制因子である抗トロンビン（AT−
）の間接溶液分析法を発展させるために用いら
れている。これらの試験法は、AT−がヘパリ
ンの存在下でトロンビンの急激な抑制因子となる
という事実に依存している。この抑制には、ヘパ
リンの不存性下では10〜60分を要するが、ヘパリ
ンの存在下では15〜60秒を要するのみである。こ
れらの試験における反応順序は、以下の式によつ
て表わされる。すなわち、 (1) AT−＋ヘパリン（過剰） →AT−・ヘパリン (2) AT−・ヘパリン＋トロンビン（過剰） →AT （不活性）・トロンビン ＋トロンビン（残余）＋ヘパリン 次いで、残余のトロンビンを好適な合成ペプチ
ド基質を用いて分析する。AT−の分析のため
には、ヘパリンは、試験系中に存在するすべての
AT−がそのトロンビン抑制作用を急激に発揮
するために、必要な触媒量を超える過剰量で与え
られる。必要なヘパリン量を測定するために、
徐々に増量したヘパリンを用いて滴定試験を行な
つて、所望の結果を得るために必要な量を測定す
ることができる。ここに記載されている実験で
は、この試験は行なわれなかつたが、その代り
に、溶液試験法のために希釈された同様の試料中
に用いられる量のヘパリンが使用された。ブロム
ボツク他著「トロン・デイアス・ヘマウ」
（Blombock、et al「Throm Diath Haemouh」
第９巻、368頁（1963年）にはトロンビンの抑制
が、ヘパリン２〜16単位／mlの間で一定であるこ
とが報告されている。AT−について発行され
たすべての試験法において、残余のトロンビンを
分析するために合成ペプチド基質の添加を行なう
前にくる反応(2)の後に時間の遅れがある。この遅
れは、AT−とトロンビンのヘパリン触媒反応
が、低いKm値を有する基質の存在下で非常にゆつ
くり進むために必要であることが発見されてい
る。上記分析法の多くにおいて、付加的な構成成
分であるポリブレン（Polybrene）をペプチド基
質と共に添加してヘパリンを中和し、かつ残余の
トロンビンの分析時におけるあらゆるさらに急速
なトロンビンの抑制作用を防止する。ポリブレン
またはもう１つのヘパリン中和物質の使用が、比
較的高いKm値を有する色原体性トロンビン基質を
用いる分析において最初に試みられた。これは、
基質がある未反応AT−・ヘパリン錯体とあま
り競合せず、加水分解工程時、さらなる抑制作用
が起り得るために必要であつた。この方法は、低
いKm値を有する色原性基質を用いるいくつかの分
析法においても行なわれた。以下の実例で報告さ
れている研究に用いられている基質、Ｓ−2238は
非常に低いKm値を有し、また、ポリブレンが必要
ではないことが見出されている。 上記のタイプの分析法は、オーデガード他著
「トロンボシス・リサーチ」（Odegard、et al
Thrombosis Research）第６巻、287〜294頁
（1975年）〔ペルガモン・プレス・インコーポレー
テイツド（Pergamon Press Inc.）発行〕に記載
されている。この分析法では、試料血漿100μ
をヘパリン含有緩衝液2.9mlと混合し、次いでこ
の希釈液400μを２本のガラス管にそれぞれ移
し、37℃の湯浴中で２〜６分間予備加温する。こ
の点で、30NIH単位／mlを含有するトロンビン
溶液を上記管内に吹き込み、正確に30秒後に基質
−ポリブレン溶液300μを反応混合物中に吹き
込む。使用される色原性基質はトリペプチドBz
−Phe−Val−Arg−PNA・HClである。基質を
添加して正確に60秒後に、酢酸300μを該混合
物中に吹き込むことによつてアミド分解反応を停
止する。標準血漿希釈液400μ、酢酸300μ、
基質−ポリブレン溶液300mlおよびトロンビン溶
液100μをこの順序で混合して得られる対照溶
液に対する、このものの光学光度を405nｍにお
いて読取る。２個の光学密度の読みを得、その平
均を用いて標準曲線からAT−濃度（ヘパリン
補助因子活性）を読取る。 この湿式分析法はフイブリンの凝固を利用する
以前の分析法より便利であるが、それでも幾分時
間を消費し、かつ人間が誤まりを起こし易い。ト
ロンビンと色原性または蛍光原性の相互作用に基
づくAT−の定量的測定用試験細片が切望され
ている。しかしながら、互いに近接してトロンビ
ンと基質を含有する細片を用いて得られる速度ま
たは簡便性の増加は、基質の存在が過剰のヘパリ
ン存在下でさえトロンビンとAT−の間の反応
を抑制する事実によつてさらに相殺されてしまつ
て余りがあろう。 本発明方法は、 (a) 血漿を過剰のヘパリンと、以下の３層試薬細
片、すなわち、 過剰のトロンビンと緩衝液を吸収した担体
マトリツクスの第１上部層 第１層と隣接して液体によつて連通し得、
かつトロンビン感応性蛍光原性または色原性
（発色性）基質および緩衝液を吸収した担体
マトリツクスからなり、前記基質が、トロン
ビンと基質が好適な液体環境中で接触すると
き分光蛍光測定手段または分光測光手段によ
つて検出可能な時間に関連する化学変化が起
きる如き方法でトロンビンと相互作用できる
ような、前記基質を有する第２下層、および 第２下層の下にある不透水性物質層からな
る試薬細片と接触させ、 (b) 基質中のあらゆる化学変化を反射蛍光分光測
光手段または反射分光測光手段によつて所定期
間に亘つて繰り返し測定して少なくとも２個の
反射蛍光値または分光測光値を時間の関数とし
得、さらに、 (c) 上記工程(b)で得られた値と既知量の抗トロン
ビンを含有する血漿試料を用いて同様の方法
で得られる値の間の関係を比較し、このような
比較値を用いることによつて試験すべき血漿試
料中の抗トロンビンの濃度を測定すること からなる。 合成蛍光原性基質または色原性（発色性）基質
を用いるAT−とヘパリンの分析法のための溶
液技術を、紙製試薬細片に適用することは試薬
の、定期的なかつ順序立つた添加を必要とするた
めに複雑である。基質を含有する下層パツドと、
トロンビンおよび任意にヘパリンを含有する上層
パツドを有する２層試薬細片を構成し、上層パツ
ドに血漿試料を施すことによつて、血漿AT−
が、上層パツドのトロンビンと接触してAT−
−トロンビン錯体を形成した後下層パツドから基
質が、抑制作用を起こすに充分拡散するまでには
充分な時間がある。試料溶液が測定装置のテーブ
ル上に流れず、基質の上層パツドへの拡散が確実
に起こるようにするために下層パツドの下に不透
水性物質を設けるべきである。 試験細片の第１上層は、トロンビンを吸収した
担体マトリツクスからなる。この担体マトリツク
スは血漿を吸収できる一方、その血漿の一部を下
層パツド中に流すことができる物質である。下層
パツドは、同一の材料でもよく、基質を吸収して
おり、かつ血漿流体が基質を溶解せしめ、それ
を、トロンビンAT−錯体が形成された後、下
層パツドから上層パツドに拡散させるように機能
する。診断用試験細片の製造に通常用いられてい
る物質がこの目的のために好適であることが見出
された。用いることができる好適な物質としては
ゼラチンまたはアガロースから形成されるフイル
ムが包含される。通常、例えば紙、セルロース、
木材、合成樹脂製フリース、織布、および不織布
等の吸収性物質が担体マトリツクスを形成するた
めに用いられる。 担体マトリツクスは、液体試薬組成物に浸沈、
浸漬するかあるいは該組成物を吹き付けまたは印
刷した後、大気あるいは強制空気乾燥等の好適な
手段によつて乾燥して乾燥試薬／マトリツクス複
合体を得ることができる。担体が吸収性物質の場
合、担体マトリツクスには試薬が吸収されてその
まま残存する。 上層は、担体マトリツクスとトロンビン溶液お
よび緩衝液を接触させることによつて調製され
る。トロンビン酵素反応の速度はPHに左右される
ので緩衝液が必要である。細片の両方のパツド中
の緩衝液のPHはトロンビンと基質の反応が最大に
なるように調整される。基質がＳ−2238の場合、
トロンビンの最大エステル分解反応はPH8.0〜8.5
で達成される。好適な緩衝液としては、例えばト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（TRIS）；Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシメチ
ル）グリシンおよびトリス（ヒドロキシメチル）
メチルアミノプロパンスルホン酸が挙げられる。
さらに、この溶液はBSA（牛血清アルブミン）等
の、乾燥工程時、トロンビンを安定化する物質を
含有すべきである。代表的な溶液は２〜5NIH単
位／mlの濃度でトロンビンを含有し、紙乾燥工程
時トロンビンを安定化させるために0.2％（ｗ／
ｖ）のBSAを含有する。 下層は通常、水溶液に約５ｍＭの基質を含有す
る溶液から調製される。緩衝液は上層に用いられ
るものと同一または異なつていてもよく、この浸
漬溶液に用いられる。 好適な色原性または蛍光原性基質について、そ
の商品名、用途、構造式および検出法を第１表に
示す。 本発明をさらに以下の実施例によつて説明す
る。これらの実施例では、TRIS、BSAおよびト
ロンビン（ウシトロンビン）をリサーチ・プロダ
クツ・デイビジヨン・オブ・マイルス・ラボラト
リーズ・インコーポレーテツド（Research
Products DiVision of Miles Laboratories、
Inc.）より得た。ワツトマン（Whatman）54ロ
紙はワツトマン・ペーパー・カンパニー
（Whatman Paper Company） 【表】
ける吸光度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 哺乳網血液血漿中の抗トロンビンの定量的
   測定法であつて、 (a) 血漿を過剰のヘパリンと以下の３層試薬細
   片、すなわち、 過剰のトロンビンと緩衝液を含有する担体
   マトリツクスからなる第１層 第１層と隣接して液体によつて連通し得、
   かつトロンビン感応性蛍光原性または色原性
   基質および緩衝液を含有する担体マトリツク
   スからなり、前記基質が、トロンビンと基質
   が好適な液体環境中で接触するとき蛍光測光
   手段または分光測光手段によつて検出可能な
   時間に関連する化学変化が起こる如き方法で
   トロンビンと相互作用できるような、前記基
   質を有する第２下層、および 第２下層の下にある不透水性物質層からな
   る試薬細片と接触させ、 (b) 基質中のあらゆる化学変化を反射蛍光分光手
   段または反射分光測光手段によつて所定期間繰
   り返し測定して少なくとも２個の蛍光値または
   分光測光値を時間の関数として得、さらに、 (c) 工程(b)で得られた値と既知量の抗トロンビン
   を含有する血漿試料を用いて同様の方法で得
   られる値の間の関係を比較し、このような比較
   を用いて試験される血漿試料中の抗トロンビン
   の濃度を測定することを特徴とする測定法。 ２ 第１層および第２層がロ紙で形成される特許
   請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ トロンビン感応物質が発色性基質Ｓ−2238で
   ある特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ４ 緩衝液がPHを8.0〜8.5に維持することができ
   る特許請求の範囲第３項記載の測定法。 ５ トロンビン感応物質が、蛍光原性基質Ｄ−
   phe−pro−arg−AIEである特許請求の範囲第１
   項記載の測定法。 ６ 哺乳綱血漿中の抗トロンビンを定量的に測
   定するに適した試験具であつて、 過剰のトロンビンと緩衝液を含有する担体マ
   トリツクスの第１上層 第１層と隣接して液体で連通し得、かつトロ
   ンビン感応性蛍光原性または色原性基質および
   緩衝液を含有する担体マトリツクスからなり、
   前記基質が、トロンビンと基質が好適な液体環
   境中で接触するとき蛍光測光手段または分光測
   光手段によつて検出可能な時間に関連する化学
   変化が起こる如き方法でトロンビンと相互作用
   できるような、前記基質を有する第２下層、お
   よび 第２下層の下にある不透水性物質層からなる
   ことを特徴とする試験具。 ７ 第１層および第２層がロ紙で形成される特許
   請求の範囲第６項記載の試験具。 ８ トロンビン感応物質が発色性基質Ｓ−2238で
   ある特許請求の範囲第６項記載の試験具。 ９ 緩衝液PHを8.0〜8.5に維持することができる
   特許請求の範囲第８項記載の試験具。 １０ トロンビン感応物質が蛍光原性基質Ｄ−
   phe−pro−arg−AIEである特許請求の範囲第６
   項記載の試験具。