JP3927403B2 - 血液凝固促進剤及び血液検査用容器 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固促進剤に関し、特にヘパリン投与を受けている患者から得られる血液検体の凝固を促進する血液凝固促進剤、及び血液検査用容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
病気の予防や診断の目的で血液検査が一般に行われているが、血液検査の多くは血清検査である。その検査に要する血清は、通常、血液検査用容器に採取した血液を凝固させた後、遠心分離によって比重の異なる血餅から分離し、ピペットを用いて、あるいはデカンテーションにより採取している。
被験者から採取した血液が凝固するには比較的長時間を必要とし、結果を知るために再来院しなければならなかったり、特に緊急に検査を実施する必要のある場合には問題となる。
そこで、従来より血液凝固を短時間で行える凝固剤の検討がなされてきた。
【０００３】
また、人工透析を受けている患者や血栓症患者の血液検体を扱う場合は、さらに別の問題が生じる。このような患者は、血栓防止のためにヘパリン投与が行われるため、血液１０ｍｌあたり１〜２０単位程度のヘパリンが存在する。このヘパリンは、血液中のアンチトロンビンIIIと結合してトロンビンの作用を著しく阻害する。さらに、第XII因子などの血液凝固因子の作用をも阻害するといわれている。そのため、フィブリノーゲンのフィブリンへの転化がおこらず、その結果、血液が凝固せず、血清の分取が困難となる。
【０００４】
これらの問題を解決するため、例えば、特開昭５８−１４６０号公報には、硫酸プロタミンまたは蛇毒に含まれるトロンビン様酵素を凝固促進剤として用いた採血管が開示されている。
しかしながら、硫酸プロタミンはヘパリン中和剤であるため、凝固作用は十分でなく、また蛇毒に含まれるトロンビン様酵素はヘパリン中和作用と凝固作用を有するものの安定性が十分でない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題点を解決するものであり、その目的は、血液、更にはヘパリンを含む血液であっても、短時間で凝固させるとともに、安定性に優れる血液凝固促進剤及び血液検査用容器を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明１の血液凝固促進剤は、加水分解酵素並びに該加水分解酵素の安定化剤としてのアルブミン及び／又はアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）を含有する。
【０００７】
本発明１において、加水分解酵素はプロテアーゼであり、ペプチド鎖において、Ａｒｇと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解しうるものが用いられる。
上記加水分解酵素の量は、少なくなると血液凝固の時間が長くなったり凝固が不完全になることがあり、多くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、血液１ｍｌあたり０．１〜１００単位が好ましく、０．５〜５０単位がより好ましい。
【０００８】
上記加水分解酵素としては、例えば、トリプシン、トロンビン、蛇毒トロンビン様酵素等のセリンプロテアーゼ；カテプシンＢ、フィシン等のチオールプロテアーゼ；キニナーゼＩ等の金属プロテアーゼなどが挙げられ、特にセリンプロテアーゼが好適に用いられる。
【０００９】
本発明１においては、上記アルブミン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸に加え、加水分解酵素の安定化剤として更にグリシン、ポリオール等を併用することもできる。ポリオールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類、グリセロール、シュークロース、デキストロース、ソルビトール、ゼラチン等の糖類などが挙げられる。
【００１０】
上記加水分解酵素の安定化剤の量は、少なくなると加水分解酵素の安定性を保つ効果が不十分となり、多くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるため、加水分解酵素１単位当たり０．０１〜１０ｍｇが好ましく、０．０５〜５ｍｇがより好ましい。
【００１１】
本発明２の血液凝固促進剤は、さらにアミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物を含有する。
本発明において、上記アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物は、ヘパリンを吸着・中和して不活性化するヘパリン中和剤として作用する。
上記アミン塩を構成するアミンは第１級、第２級及び第３級アミンのいずれでもよく、アミン塩を構成する酸も無機酸及び有機酸のいずれでもよい。無機酸としては、例えば、塩酸等のハロゲン化水素酸、硫酸、亜硫酸などが挙げられ、有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸などが挙げられる。アミン塩の有機残基は通常アルキル基であるが、イミノ基やエーテル基等の異種元素を含む炭化水素基であってもよい。アミン塩は、分子内塩でもよい。
好ましいアミン塩の具体例としては、例えば、（Ｉ）式で表されるヘキサデシルジメチルアミン塩酸塩や、（II）式で表されるテトラデシルジ（アミノエチル）グリシン等が挙げられる。
【００１２】
【化１】
【００１３】
【化２】
【００１４】
上記第４級窒素を有する有機化合物としては、例えば、テトラアルキルアンモニウムが挙げられるが、アルキル基のかわりにアリール基を有する化合物やイミノ基、エーテル基等の異種元素を含む炭化水素基を有する化合物でもよい。
好ましい第４級窒素を有する有機化合物の具体例としては、例えば、（III）式で表されるドデシルトリメチルアンモニウムクロライドが挙げられる。
【００１５】
【化３】
【００１６】
このような比較的低分子量の化合物のほか、第４級窒素を有する有機重合体も用いることができる。上記有機重合体としては、例えば、（IV）式で表される繰り返し単位を有するポリカチオンが挙げられる。
【００１７】
【化４】
【００１８】
（ここで、Ｒ1〜Ｒ4は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン根又は酸根、Ｙはアルキレン基又は−アルキレン基−ＳＯ2−を示し、繰り返し数は５〜２０００である。）
【００１９】
上記（IV）式で表される化合物のうち、特に（Ｖ）式又は（VI）式で表される繰り返し単位を有するポリカチオンが好適である。
【００２０】
【化５】
【００２１】
【化６】
【００２２】
上記アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物（中和剤）は少なくなるとヘパリンが中和されないためヘパリンを含む血液が凝固しなくなり、多くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、血液１ｍｌあたり０．００５〜１０ｍｇが好ましく、０．０１〜５ｍｇがより好ましい。
【００２３】
本発明１又は２の血液凝固促進剤は、血液１ｍｌ当たり１×１０-10 〜１×１０-1ｇの割合で使用される。少なくなると血液凝固促進効果が得られず、多くなっても使用量に応じた効果は得られず、血液検査に種々の影響を与える可能性がある。
【００２４】
血液凝固促進剤中には、さらに抗線溶剤及び／又は抗プラスミン剤が含有されてもよい。これらにより、血液の凝固反応過程で拮抗的に生成してくるプラスミンのフィブリン分解作用が阻害される。そのため血液の凝固が促進され、さらに凝固においても凝固状態を安定に保つことができる。
上記抗線溶剤及び／又は抗プラスミン剤としては、従来より臨床で用いられているアプロチニン、大豆トリプシンインヒビター、ε−アミノカプロン酸、ｐ−アミノメチル安息香酸、アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸等が、単独であるいは組み合わせて用いられる。これらは、得られる血清を用いた臨床検査に影響を及ぼさない程度の量で血液凝固促進剤中に含有される。例えば、アプロチニンは、血液１ｍｌ当たり約１００〜６００ＫＩＵ（単位）の割合で、大豆トリプシンインヒビターは血液１ｍｌ当たり約５００〜４０００ＦＵ（単位）の割合で、そしてε−アミノカプロン酸、ｐ−アミノメチル安息香酸及びアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸は、いずれも血液１ｍｌ当たり約１０-2〜１０-8ｇの割合となるように、血液凝固促進剤中に含有される。
【００２５】
血液を凝固させるには、例えば、容器中に採取した血液に上記血液凝固促進剤を加えてもよいが、本発明３の血液検査用容器は、予め上記本発明１又は２の血液凝固促進剤が内部に収容されている。
上記血液検査用容器は、ガラス製であっても樹脂製であってもよい。また血液凝固促進剤は、例えば粉末状のまま使用してもよく、予め適当な溶媒に溶解もしくは分散させておいてもよい。高濃度の血液凝固促進剤が血液と接触して蛋白成分を変性させるのを避けるために、血液凝固促進剤を比表面積の大きい担体に担持させて、これを収容してもよい。
【００２６】
上記担体としては、血液検査に有害な影響を与えず、大きい比表面積を有するものであれば特に限定されない。例えば、不織布、織布、樹脂ビーズ等が好適である。このような担体に上記血液凝固促進剤を担持させる方法としては、例えば、その溶液や分散液を担体に塗布する方法、溶液や分散液中に担体を浸漬して含浸させた後、乾燥させる方法の他、アラビアゴム等の適宜の助剤を含む血液凝固促進剤の水分散液を調製し、これを急速凍結乾燥して血液凝固促進剤担持粒子状物を得る方法などが挙げられる。
【００２７】
このような血液凝固促進剤（血液凝固促進剤担持担体を含む）を収容した血液検査用容器は、通常の血液検査用容器のほか、真空採血管としても使用できる。この真空採血管は、通常のガラスもしくは合成樹脂製採血管内部に上記血液凝固促進剤を収容し、排気して、ブチルゴム製等の密封性の優れた栓で密封することにより調製される。
【００２８】
本発明の血液凝固促進剤にはセリンプロテアーゼ等の加水分解酵素が存在するため、上記血液凝固因子の活性化が促進され、短時間で血液が凝固する。
さらに本発明２の血液凝固促進剤がヘパリンを含有する血液に加えられると、血液中のヘパリンがアミン塩などの中和剤に吸着・中和されて沈殿するため、ヘパリンのトロンビンや第ＸII因子に対する阻害作用がなくなる。そのため、血液は正常な凝固機能を回復する。
血液凝固に要する時間は、血液凝固促進剤中の加水分解酵素やその安定化剤、及び中和剤の種類、量、使用する容器の材質、血液中のヘパリンの量等により異なるが、合成樹脂製容器を用いると通常１０〜２０分である。
【００２９】
このように、正常血液のみならずヘパリンが含有される血液も短時間のうちに凝固し、凝固状態が安定に保たれうる。さらに血清と血餅との分離が容易となるため、分離採取された血清中に血餅成分が混在することもない。血餅成分の収縮度合いも十分であるため、血清収率も高い。
【００３０】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を説明する。
（実施例１）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸を、それぞれ１ｍｌ当たり２００００単位、２０００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３１】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、それぞれ４０単位、４ｍｇであった。
【００３２】
次いで、上記のようにして調製した試料の血液凝固時間を測定したところ、５分以内で血液凝固が認められた。さらに、この試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ったところ、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００３３】
（実施例２）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸を、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、２０００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３４】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、それぞれ２０単位、４ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００３５】
（実施例３）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物として下記式（ＶII）で表されるポリカチオンを、それぞれ１ｍｌ当たり５０００単位、１２５ｍｇ、５０ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３６】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、下記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、それぞれ１０単位、０．２５ｍｇ、０．１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００３７】
【化７】
【００３８】
（実施例４）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物としてテトラデシルジ（アミノエチル）グリシンを、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ、１００ｍｇを含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３９】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、テトラデシルジ（アミノエチル）グリシンの含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇ、０．２ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４０】
（実施例５）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてグリシンを、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４１】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリシンの含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４２】
（実施例６）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてポリエチレングリコール６０００を、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４３】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、ポリエチレングリコール６０００の含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４４】
（実施例７）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてグリセロールを、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４５】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリセロールの含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４６】
（比較例１）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）、アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物として上記式（ＶII）で表されるポリカチオンを、それぞれ１ｍｌ当たり５０００単位、５０ｍｇを含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４７】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、上記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、それぞれ１０単位、０．１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００４８】
（比較例２）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）を１ｍｌ当たり２００００単位含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４９】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビンの含有量は、４０単位であった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００５０】
（実施例８）
上記実施例１で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、実施例１と同じである。
以下、上記実施例１と同様にして実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５１】
（実施例９）
上記実施例２で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、実施例２と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５２】
（実施例１０）
上記実施例３で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、上記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、実施例３と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５３】
（実施例１１）
上記実施例４で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、テトラデシルジ（アミノエチル）グリシンの含有量は、実施例４と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５４】
（実施例１２）
上記実施例５で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリシンの含有量は、実施例５と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５５】
（実施例１３）
上記実施例６で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、ポリエチレングリコール６０００の含有量は、実施例６と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５６】
（実施例１４）
上記実施例７で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリセロールの含有量は、実施例７と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５７】
（比較例３）
上記比較例１で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、上記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、それぞれ１０単位、０．１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００５８】
（比較例４）
上記比較例２で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビンの含有量は、比較例２と同じである。
以下、上記実施例１と同様にして実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の血液凝固促進剤及び血液検査用容器は、上述の通りであり、正常血液のみならずヘパリンが含有される血液も短時間のうちに凝固させるとともに、安定性に優れる。さらに、凝固状態が安定に保たれ、血清と血餅との分離が容易となるため、分離採取された血清中に血餅成分が混在することもない。血餅成分の収縮度合いも十分であるため、血清収率も高い。
従って、本発明の血液凝固促進剤及び血液検査用容器は、通常の血液検査だけでなく、ヘパリン投与を受けている人工透析患者や血栓症患者の血液検査における血清の分取に好適に用いられる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固促進剤に関し、特にヘパリン投与を受けている患者から得られる血液検体の凝固を促進する血液凝固促進剤、及び血液検査用容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
病気の予防や診断の目的で血液検査が一般に行われているが、血液検査の多くは血清検査である。その検査に要する血清は、通常、血液検査用容器に採取した血液を凝固させた後、遠心分離によって比重の異なる血餅から分離し、ピペットを用いて、あるいはデカンテーションにより採取している。
被験者から採取した血液が凝固するには比較的長時間を必要とし、結果を知るために再来院しなければならなかったり、特に緊急に検査を実施する必要のある場合には問題となる。
そこで、従来より血液凝固を短時間で行える凝固剤の検討がなされてきた。
【０００３】
また、人工透析を受けている患者や血栓症患者の血液検体を扱う場合は、さらに別の問題が生じる。このような患者は、血栓防止のためにヘパリン投与が行われるため、血液１０ｍｌあたり１〜２０単位程度のヘパリンが存在する。このヘパリンは、血液中のアンチトロンビンIIIと結合してトロンビンの作用を著しく阻害する。さらに、第XII因子などの血液凝固因子の作用をも阻害するといわれている。そのため、フィブリノーゲンのフィブリンへの転化がおこらず、その結果、血液が凝固せず、血清の分取が困難となる。
【０００４】
これらの問題を解決するため、例えば、特開昭５８−１４６０号公報には、硫酸プロタミンまたは蛇毒に含まれるトロンビン様酵素を凝固促進剤として用いた採血管が開示されている。
しかしながら、硫酸プロタミンはヘパリン中和剤であるため、凝固作用は十分でなく、また蛇毒に含まれるトロンビン様酵素はヘパリン中和作用と凝固作用を有するものの安定性が十分でない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記問題点を解決するものであり、その目的は、血液、更にはヘパリンを含む血液であっても、短時間で凝固させるとともに、安定性に優れる血液凝固促進剤及び血液検査用容器を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明１の血液凝固促進剤は、加水分解酵素並びに該加水分解酵素の安定化剤としてのアルブミン及び／又はアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）を含有する。
【０００７】
本発明１において、加水分解酵素はプロテアーゼであり、ペプチド鎖において、Ａｒｇと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解しうるものが用いられる。
上記加水分解酵素の量は、少なくなると血液凝固の時間が長くなったり凝固が不完全になることがあり、多くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、血液１ｍｌあたり０．１〜１００単位が好ましく、０．５〜５０単位がより好ましい。
【０００８】
上記加水分解酵素としては、例えば、トリプシン、トロンビン、蛇毒トロンビン様酵素等のセリンプロテアーゼ；カテプシンＢ、フィシン等のチオールプロテアーゼ；キニナーゼＩ等の金属プロテアーゼなどが挙げられ、特にセリンプロテアーゼが好適に用いられる。
【０００９】
本発明１においては、上記アルブミン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸に加え、加水分解酵素の安定化剤として更にグリシン、ポリオール等を併用することもできる。ポリオールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類、グリセロール、シュークロース、デキストロース、ソルビトール、ゼラチン等の糖類などが挙げられる。
【００１０】
上記加水分解酵素の安定化剤の量は、少なくなると加水分解酵素の安定性を保つ効果が不十分となり、多くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるため、加水分解酵素１単位当たり０．０１〜１０ｍｇが好ましく、０．０５〜５ｍｇがより好ましい。
【００１１】
本発明２の血液凝固促進剤は、さらにアミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物を含有する。
本発明において、上記アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物は、ヘパリンを吸着・中和して不活性化するヘパリン中和剤として作用する。
上記アミン塩を構成するアミンは第１級、第２級及び第３級アミンのいずれでもよく、アミン塩を構成する酸も無機酸及び有機酸のいずれでもよい。無機酸としては、例えば、塩酸等のハロゲン化水素酸、硫酸、亜硫酸などが挙げられ、有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸などが挙げられる。アミン塩の有機残基は通常アルキル基であるが、イミノ基やエーテル基等の異種元素を含む炭化水素基であってもよい。アミン塩は、分子内塩でもよい。
好ましいアミン塩の具体例としては、例えば、（Ｉ）式で表されるヘキサデシルジメチルアミン塩酸塩や、（II）式で表されるテトラデシルジ（アミノエチル）グリシン等が挙げられる。
【００１２】
【化１】
【化２】
上記第４級窒素を有する有機化合物としては、例えば、テトラアルキルアンモニウムが挙げられるが、アルキル基のかわりにアリール基を有する化合物やイミノ基、エーテル基等の異種元素を含む炭化水素基を有する化合物でもよい。
好ましい第４級窒素を有する有機化合物の具体例としては、例えば、（III）式で表されるドデシルトリメチルアンモニウムクロライドが挙げられる。
【００１５】
【化３】
このような比較的低分子量の化合物のほか、第４級窒素を有する有機重合体も用いることができる。上記有機重合体としては、例えば、（IV）式で表される繰り返し単位を有するポリカチオンが挙げられる。
【００１７】
【化４】
（ここで、Ｒ1〜Ｒ4は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン根又は酸根、Ｙはアルキレン基又は−アルキレン基−ＳＯ2−を示し、繰り返し数は５〜２０００である。）
【００１９】
上記（IV）式で表される化合物のうち、特に（Ｖ）式又は（VI）式で表される繰り返し単位を有するポリカチオンが好適である。
【００２０】
【化５】
【化６】
上記アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物（中和剤）は少なくなるとヘパリンが中和されないためヘパリンを含む血液が凝固しなくなり、多くなると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、血液１ｍｌあたり０．００５〜１０ｍｇが好ましく、０．０１〜５ｍｇがより好ましい。
【００２３】
本発明１又は２の血液凝固促進剤は、血液１ｍｌ当たり１×１０-10 〜１×１０-1ｇの割合で使用される。少なくなると血液凝固促進効果が得られず、多くなっても使用量に応じた効果は得られず、血液検査に種々の影響を与える可能性がある。
【００２４】
血液凝固促進剤中には、さらに抗線溶剤及び／又は抗プラスミン剤が含有されてもよい。これらにより、血液の凝固反応過程で拮抗的に生成してくるプラスミンのフィブリン分解作用が阻害される。そのため血液の凝固が促進され、さらに凝固においても凝固状態を安定に保つことができる。
上記抗線溶剤及び／又は抗プラスミン剤としては、従来より臨床で用いられているアプロチニン、大豆トリプシンインヒビター、ε−アミノカプロン酸、ｐ−アミノメチル安息香酸、アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸等が、単独であるいは組み合わせて用いられる。これらは、得られる血清を用いた臨床検査に影響を及ぼさない程度の量で血液凝固促進剤中に含有される。例えば、アプロチニンは、血液１ｍｌ当たり約１００〜６００ＫＩＵ（単位）の割合で、大豆トリプシンインヒビターは血液１ｍｌ当たり約５００〜４０００ＦＵ（単位）の割合で、そしてε−アミノカプロン酸、ｐ−アミノメチル安息香酸及びアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸は、いずれも血液１ｍｌ当たり約１０-2〜１０-8ｇの割合となるように、血液凝固促進剤中に含有される。
【００２５】
血液を凝固させるには、例えば、容器中に採取した血液に上記血液凝固促進剤を加えてもよいが、本発明３の血液検査用容器は、予め上記本発明１又は２の血液凝固促進剤が内部に収容されている。
上記血液検査用容器は、ガラス製であっても樹脂製であってもよい。また血液凝固促進剤は、例えば粉末状のまま使用してもよく、予め適当な溶媒に溶解もしくは分散させておいてもよい。高濃度の血液凝固促進剤が血液と接触して蛋白成分を変性させるのを避けるために、血液凝固促進剤を比表面積の大きい担体に担持させて、これを収容してもよい。
【００２６】
上記担体としては、血液検査に有害な影響を与えず、大きい比表面積を有するものであれば特に限定されない。例えば、不織布、織布、樹脂ビーズ等が好適である。このような担体に上記血液凝固促進剤を担持させる方法としては、例えば、その溶液や分散液を担体に塗布する方法、溶液や分散液中に担体を浸漬して含浸させた後、乾燥させる方法の他、アラビアゴム等の適宜の助剤を含む血液凝固促進剤の水分散液を調製し、これを急速凍結乾燥して血液凝固促進剤担持粒子状物を得る方法などが挙げられる。
【００２７】
このような血液凝固促進剤（血液凝固促進剤担持担体を含む）を収容した血液検査用容器は、通常の血液検査用容器のほか、真空採血管としても使用できる。この真空採血管は、通常のガラスもしくは合成樹脂製採血管内部に上記血液凝固促進剤を収容し、排気して、ブチルゴム製等の密封性の優れた栓で密封することにより調製される。
【００２８】
本発明の血液凝固促進剤にはセリンプロテアーゼ等の加水分解酵素が存在するため、上記血液凝固因子の活性化が促進され、短時間で血液が凝固する。
さらに本発明２の血液凝固促進剤がヘパリンを含有する血液に加えられると、血液中のヘパリンがアミン塩などの中和剤に吸着・中和されて沈殿するため、ヘパリンのトロンビンや第ＸII因子に対する阻害作用がなくなる。そのため、血液は正常な凝固機能を回復する。
血液凝固に要する時間は、血液凝固促進剤中の加水分解酵素やその安定化剤、及び中和剤の種類、量、使用する容器の材質、血液中のヘパリンの量等により異なるが、合成樹脂製容器を用いると通常１０〜２０分である。
【００２９】
このように、正常血液のみならずヘパリンが含有される血液も短時間のうちに凝固し、凝固状態が安定に保たれうる。さらに血清と血餅との分離が容易となるため、分離採取された血清中に血餅成分が混在することもない。血餅成分の収縮度合いも十分であるため、血清収率も高い。
【００３０】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施例を説明する。
（実施例１）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸を、それぞれ１ｍｌ当たり２００００単位、２０００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３１】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、それぞれ４０単位、４ｍｇであった。
【００３２】
次いで、上記のようにして調製した試料の血液凝固時間を測定したところ、５分以内で血液凝固が認められた。さらに、この試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ったところ、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００３３】
（実施例２）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸を、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、２０００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３４】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、それぞれ２０単位、４ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００３５】
（実施例３）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物として下記式（ＶII）で表されるポリカチオンを、それぞれ１ｍｌ当たり５０００単位、１２５ｍｇ、５０ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３６】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、下記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、それぞれ１０単位、０．２５ｍｇ、０．１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００３７】
【化７】
（実施例４）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物としてテトラデシルジ（アミノエチル）グリシンを、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ、１００ｍｇを含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００３９】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、テトラデシルジ（アミノエチル）グリシンの含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇ、０．２ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４０】
（実施例５）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてグリシンを、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４１】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリシンの含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４２】
（実施例６）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてポリエチレングリコール６０００を、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４３】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、ポリエチレングリコール６０００の含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４４】
（実施例７）
加水分解酵素として蛇毒トロンビン様酵素（商品名：レプチラーゼ、東菱薬品社製）、加水分解酵素の安定化剤としてグリセロールを、それぞれ１ｍｌ当たり１００００単位、５００ｍｇ含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４５】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリセロールの含有量は、それぞれ２０単位、１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、さらに遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００４６】
（比較例１）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）、アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物として上記式（ＶII）で表されるポリカチオンを、それぞれ１ｍｌ当たり５０００単位、５０ｍｇを含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。
次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４７】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、上記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、それぞれ１０単位、０．１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００４８】
（比較例２）
加水分解酵素としてトロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）を１ｍｌ当たり２００００単位含有する水溶液を調製し、血液凝固促進剤とした。次いで上記血液凝固促進剤をポリエチレン製広口容器に密閉し、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
【００４９】
ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）にヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、上記血液凝固促進剤を２０μｌ滴下した後、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビンの含有量は、４０単位であった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００５０】
（実施例８）
上記実施例１で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、実施例１と同じである。
以下、上記実施例１と同様にして実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５１】
（実施例９）
上記実施例２で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸の含有量は、実施例２と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５２】
（実施例１０）
上記実施例３で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、上記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、実施例３と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５３】
（実施例１１）
上記実施例４で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸、テトラデシルジ（アミノエチル）グリシンの含有量は、実施例４と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５４】
（実施例１２）
上記実施例５で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリシンの含有量は、実施例５と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５５】
（実施例１３）
上記実施例６で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、ポリエチレングリコール６０００の含有量は、実施例６と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５６】
（実施例１４）
上記実施例７で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりの蛇毒トロンビン、グリセロールの含有量は、実施例７と同じである。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、５分以内で血液凝固が認められ、また遠心分離により、上層に清浄な血清を、下層に血餅が得られた。
【００５７】
（比較例３）
上記比較例１で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヘパリンを１単位／ｍｌ含有するヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビン、上記式（ＶII）で表されるポリカチオンの含有量は、それぞれ１０単位、０．１ｍｇであった。
以下、上記実施例１と同様に実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００５８】
（比較例４）
上記比較例２で得られた血液凝固促進剤の２０μｌを、ポリエチレン製チューブ（１６φ×１０mm）に塗布し乾燥させ、血液検査用容器を作成した。
上記血液検査用容器を、２５℃で１か月静置した後、以下の実験を行った。
ヒト新鮮血を１０ｍｌ用意し、これを上記血液検査用容器に入れ、緩やかに攪拌し２５℃で静置した。この時の血液１ｍｌ当たりのトロンビンの含有量は、比較例２と同じである。
以下、上記実施例１と同様にして実験を行ったところ、３０分以上経過しても血液凝固が認められず、また遠心分離を行うと、上層の血清中に不十分な凝固を示すフィブリンが認められた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の血液凝固促進剤及び血液検査用容器は、上述の通りであり、正常血液のみならずヘパリンが含有される血液も短時間のうちに凝固させるとともに、安定性に優れる。さらに、凝固状態が安定に保たれ、血清と血餅との分離が容易となるため、分離採取された血清中に血餅成分が混在することもない。血餅成分の収縮度合いも十分であるため、血清収率も高い。
従って、本発明の血液凝固促進剤及び血液検査用容器は、通常の血液検査だけでなく、ヘパリン投与を受けている人工透析患者や血栓症患者の血液検査における血清の分取に好適に用いられる。
Claims (2)
- ペプチド鎖において、Ａｒｇと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はＬｙｓと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解しうる加水分解酵素、並びに上記加水分解酵素の安定化剤としてのアルブミン及びアミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸を含有する血液凝固促進剤が内部に塗布乾燥された血液検査用容器。
- 血液凝固促進剤が、さらに、アミン塩及び／又は第４級窒素を有する有機化合物を含有することを特徴とする請求項１に記載の血液検査用容器。
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