DE3586640T2

DE3586640T2 - Einstufiger test fuer proteasehemstoffe.

Info

Publication number: DE3586640T2
Application number: DE19853586640
Authority: DE
Inventors: Lloyd A Schick
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1984-07-20
Filing date: 1985-07-08
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2005-07-09
Also published as: DE3586640D1; CA1254119A; EP0168738A2; JPS6137100A; EP0168738B1; EP0168738A3

Description

Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Herstellung einheitlicher Enzyminhibitorassays. Der so hergestellte Assay ist ein Einstufen-Assay für Proteaseinhibitoren, bei dem keine Vorinkubation des Inhibitors mit seiner entsprechenden Protease erforderlich ist.

Verwendbarkeit

Das klinische Interesse an Proteasen und Proteaseinhibitoren wächst wegen deren diagnostischen Nützlichkeit. Proteasen sind in verschiedene physiologische Funktionen, wie Koagulation, Fibrinolyse, Hormonproduktion, Befruchtung und Immunabwehr, verwickelt. Proteaseinhibitoren dienen dazu, die in diese Verfahren verwickelten Enzyme zu kontrollieren.
Beispielsweise ist Antithrombin-III ein primärer Inhibitor des Blutkoagulationssystems und spielt somit eine entscheidende Rolle beim Aufrechterhalten des hämostatischen Gleichgewichts und der Kontrolle. Antithrombin-III-Spiegel korrelieren gut mit der Prädisposition eines Individuums gegenüber Thrombose. Deshalb stellen diese Niveaus für den Arzt ein Instrument zum Bestimmen des Präthrombosezustandes dar. Verringerte Konzentrationen an Antithrombin-III im Plasma sind entweder mit einem vererbten hyper-koagulierbaren Zustand, starker Venenthrombose oder einer durch orale empfängnisverhütende Mittel induzierten Veränderung in der hämostatischen Funktion verbunden. Niedrigere Konzentrationen werden auch bei Leberkrankheit, dem Nephrosesyndrom und bei der Behandlung mit L-Aspariginase beobachtet.

Offenbarung

Die gegenwärtigen Assays für einen Proteaseinhibitor basieren auf der Wahl eines geeigneten Peptidsubstrates (S) für dessen entsprechendes Proteaseenzym (E), so daß die Proteasewirkung auf das Substrat in einer wäßrigen Umgebung zu einer nachweisbaren Reaktion führt. Nach Zugabe des Proteaseinhibitors (I) zum Reaktionssystem nimmt diese Reaktion ab.
I+ (Überschuß) E TIE + E
H&sub2;O + S P
nachweisbare Reaktion
Es wurde vorher angenommen, daß die Reaktion des Inhibitors mit dessen entsprechender Protease bis zu deren Beendigung vor der Zugabe des Substrats durchgeführt werden müßte, um die gewünschte Beziehung zwischen der Inhibitorkonzentration und nachweisbaren Reaktion zu erzielen. Beispielsweise offenbarten M.S. Scully et al. in Clinica. Chimica Acta, 79, (1977) 595- 602 ein Verfahren für die Messung von Plasmaantithrombin unter Verwendung des Thrombin-spezifischen chromogenen Peptidsubstrats, H-D-phe-pip-arg-p-Nitroanilid. Für den Antrithrombinassay war die Vorinkubation der Plasmaprobe mit Thrombin in Puffer bei 37ºC erforderlich. Ein Teil der vorinkubierten Lösung wurde anschließend zu einer Substrat-Puffermischung hinzugegeben, und die Mischung wurde wiederum vor Zugabe von Eisessig zur Beendigung der Reaktion bei 37ºC inkubiert. Die freigegebene Menge p- Nitroanilin wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Eine kinetische Studie hinsichtlich der Messung der Heparin-verstärkten Antithrombin- III/Thrombinreaktionsgeschwindigkeit in Anwesenheit von synthetischem Substrat wurde von M.J. Griffith in Thrombosis Research, 25: 245-253, 1982 publiziert. Diese Arbeit betrifft die Bestimmung der Gültigkeit kinetischer Modelle für den Mechanismus der Heparin-Reaktion.
Das US-Patent Nr. 4,473,639, auf das hier allgemein verwiesen wird, offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin-III in Säugerblutplasma, welches das in Berührung bringen des Plasmas mit überschüssigem Heparin und einem drei-schichtigen Reagenzstreifen umfaßt. Bei allen veröffentlichten Assays für den Proteaseinhibitor gibt es eine Zeitverzögerung nach der Reaktion des Proteaseinhibitors und der Protease, welche der Zugabe eines synthetischen Peptidsubstrats für die Untersuchung der restlichen Protease vorausgeht. Überraschenderweise ist jetzt festgestellt worden, daß keine Zeitverzögerung für die Erzeugung der Wechselwirkung von Inhibitor und Protease für die erfolgreiche Bestimmung von Proteaseinhibitor erforderlich ist.
Die Druckschriften EP-A-168 738, WO 84/2352 Kapke et al. (1982) Clin. Chem. 28 (7) 1521-1524, Scand. J. Clin. Lab. Invest Band 42, Suppl. 162, Seite 42 (1982) und Int. Symp. Chrom. Substr., item 246 beziehen sich auf Enzym- und Proteaseinhibitortests, aber alle betreffen nicht das vorliegende Verfahren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines einheitlichen Einstufen-Assays eines Proteaseinhibitors zur Verfügung. Bei dem so durchgeführten Test ist kein Vorinkubationsschritt des Inhibitors mit dessen entsprechender Protease erforderlich. Es ist eine einheitliche Festzustand-Testvorrichtung, die sich für einen derartigen Assay eignet. Die Testvorrichtung kann für den Einstufen-Assay eines Proteaseinhibitors oder für einen Aktivator (beispielsweise Heparin) eines Proteaseinhibitors verwendet werden.
Die Testvorrichtung wird hergestellt, indem eine Protease und deren Substrat in derartiger Weise mit einer Trägermatrix verbunden werden, daß die Protease und das Substrat in im wesentlichen nicht umgesetzter Form beibehalten werden. Die Testvorrichtung inkorporiert die Zusammensetzung in einer Form, die mit der wäßrigen Testprobe in Berührung gebracht werden kann, so daß eine nachweisbare Reaktion beobachtet wird. Die Erfindung liefert ein Einstufen-Lösungsassayverfahren ohne Vorinkubation von Protease mit Inhibitor oder eine einheitliche Festzustand-Testvorrichtung für einen Proteaseinhibitor oder einen Aktivator des Inhibitors, wohingegen bei gegenwärtigen Methoden die aufeinanderfolgende Zugabe von Reagenzien mit Vorinkubation der Protease und des Inhibitors erforderlich ist, vermutlich um eine lineare Beziehung zwischen der beobachteten Reaktion und der Konzentration des Proteaseinhibitors zu gewährleisten.

Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen

Figur 4

Die Reaktivitäten einer einheitlichen Festzustand- Testvorrichtung für den Assay von Antithrombin-III sind in Fig. 1 dargestellt. Gemäß Beispiel 1 hergestellte Testvorrichtungen wurden mit 1:3 Verdünnungen von AT-III- Standards, welche 0, 25, 50, 70, 100 und 125 %iges normales menschliches Plasma enthielten, in Berührung gebracht. Es wurde eine Minute lang alle 5 Sekunden das Reflexionsvermögen gemessen. Die Daten wurden in K/S- Werte umgewandelt und gegen die Zeit T in Sekunden aufgetragen. Die grafische Darstellung in Fig. 1 zeigt die Wirkung der Zugabe von Antithrombin-III auf die Reaktivität der Thrombin, S-2238 und Heparin enthaltenden Testvorrichtung.

Figur 2

Der aus der grafischen Darstellung in Fig. 1 bestimmte Logarithmus der Streifenreaktivität, K/S pro Zeit (T in Sekunden) wurde für verschiedene Antithrombin-III-Spiegel (die Konzentrationen von Antithrombin-III sind in der Zeichnung in Prozent als Testprobe verwendetes übliches menschliches Plasma angegeben. Weil AT III eine Komponente von üblichem menschlichen Plasma ist, wurde derartiges Plasma für die Herstellung von Standardtestproben verwendet) gegen die Zeit (T in Sekunden) aufgetragen. Die auf diese Weise dargestellten Daten werden für die Bestimmung der Halbwertszeit, t1/2 der Inhibierungsreaktion und für die Berechnung von kobs verwendet.

Figur 3

In Fig. 3 ist die mit einer einheitlichen Testvorrichtung, welche eine Trägermatrix mit inkorporiertem Thrombin und S-2238 enthält, bestimmte Geschwindigkeit der Thrombininhibierung durch AT III dargestellt. kobs wurde gegen Prozent übliches menschliches Plasma, welches als Testprobe verwendet wurde, aufgetragen. Die Figur zeigt eine gute lineare Korrelation zwischen der beobachteten Reaktion, welche, wie in der Patenschrift beschrieben, behandelt wurde, und der Antithrombin-III-Konzentration in der Probe.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bei den gegenwärtigen einheitlichen Proteaseinhibitor- Assayverfahren ist eine Zeitverzögerung für die Ermöglichung der Wechselwirkung von Proteaseinhibitor mit dessen entsprechender Protease vor Zugabe des Proteasesubstrats erforderlich. Diese Zeitverzögerung wird üblicherweise durch aufeinanderfolgende Zugabe von Reagenzien mit Vorinkubation erzielt. Es ist gezeigt worden, daß ein Einstufenassay in einer einheitlichen Festzustand-Testvorrichtung zur Verfügung gestellt werden kann, indem eine Trägermatrix in derartiger Weise inkorporiert wird, daß vorzeitige Wechselwirkungen der Komponenten der Testzusammensetzung verhindert werden, wohingegen bei Benetzung mit der wäßrigen Testprobe im wesentlichen gleichzeitiger Kontakt zwischen der Protease und dem Substrat und mit der Testprobe ermöglicht wird. Obwohl jede wäßrige Testprobe, die einen Proteaseinhibitor enthält, untersucht werden kann, ist die in erster Linie interessierende Probe Blut, insbesondere Plasma.

Testkomponenten

Es ist eine Anzahl von Protease/Proteaseinhibitorsystemen bekannt. Beispielsweise inhibiert Antithromin III alle aktivierten Serumproteasen des Koagulationssystems: Faktor XIIa, XIa, IXa, Xa und Thrombin. Zusätzlich umfassen alle interessierenden Protease/Proteaseinhibitorsysteme Elastase/α&sub1;- Antitrypsin; c&sub1;-Esterase/c&sub1;-Esteraseinhibitor; Trypsin/ Inter-α-trypsininhibitor; Plasmin/α&sub2;-Antiplasmin und Chymotrypsin/α&sub1;-Antichymotrypsin.
Im Falle des Thrombin/Antithrombin-III-Systems wird Heparin, ein Aktivator des Inhibitors, vorteilhaft zu der Reaktion für die Vergrößerung der Bindung des Antithrombin-III an Thrombin gegeben. Wenn das Thrombin/Antithrombin-III/Heparin-System verwendet wird, kann entweder Heparin oder Antithrombin-III quantitativ in Abhängigkeit von den Komponenten der verwendeten Assay-Zusammensetzung bestimmt werden.
Das Substrat sollte unter Beobachtung zweier Kriterien ausgewählt werden; zuerst sollte das Substrat so spezifisch wie möglich für die bei dem Assay verwendete Protease sein; zweitens bestimmt das Substrat den Charakter der Nachweisreaktion. Die Wirkung der Protease auf das Substrat spaltet das Substrat. Das Spaltungsprodukt kann selbst eine kolorimetrische oder fluorimetrische Reaktion erzeugen, oder es kann unter Hervorrufung einer nachweisbaren Reaktion mit einer Kupplungskomponente reagieren.
Es sind viele synthetische Substrate für verschiedene Proteasen, für die ein Spaltungsprodukt gefärbt oder fluoreszent ist, entwickelt worden. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt eine Übersicht von Protease/Proteaseinhibitorsystemen mit einigen kommerziell erhältlichen Substraten.
Substrate mit einem Präfix "S" werden von Kabi Diagnostica, Stockholm, Schweden, hergestellt. Substrate mit einem Zusatz "MCA" sind fluorogene Methyl- Coumarinamidester, die von Peninsula Laboratories, Belmont, California erhältlich sind. Der Zusatz "pNA" bezeichnet, das p-Nitroanilidderivat, welches bei Spaltung das gelbe p-Nitroanilin erzeugt. Tabelle I Proteaseinhibitor Protease Substrat Antithrombin-III α&sub1;-Antitrypsin c&sub1;-Esteraseinhibitor inter-α-Trypsininhibitor α&sub1;-Antichymotrypsin Faktor Xa Thrombin Elastase c&sub1;-Esterase Trypsin Chymotrypsin Proteaseinhibitor Protease Substrat α&sub2;-Antiplasmin Plasmin
Andere Substrate erzeugen direkt bei Spaltung keine nachweisbare Reaktion, können aber nachgewiesen werden, wenn das Spaltungsprodukt mit einer zusätzlich zur Verfügung gestellten Kupplungskomponente reagiert. Thiolester sind als Substrate für proteolytische Enzyme beschrieben worden (siehe beispielsweise Green et al. Anal. Biochem. 93 223 (1979) . Beispielsweise kann der Ester-N-α-benzyloxycarbonyl-L- lysinthiobenzylesterhydrochlorid als ein Substrat für Thrombin, Plasmin oder Trypsin verwendet werden. Wenn eine Kupplungskomponente, wie beispielsweise 5,5'- Dithiobis(2-nitro)benzoesäure (Ellman's-Reagenz) zu der Testzusammensetzung gegeben wird, findet eine nachweisbare chromogene Reaktion statt. Andere Kupplungskomponenten können in Kombination mit einem Thiobenzylestersubstrat verwendet werden. Diese umfassen 2,2'-Dithiopyridin und 4,4'-Dithiopyridin. Zusätzlich können Tripeptidthiolestersubstrate für die quantitative Bestimmung von proteolytischen Enzymen, wie in dem US- Patent Nr. 4,434,096 beschrieben, verwendet werden. Die während der enzymatischen Reaktion freigegebene Thiolgruppe wird photometrisch nach Reaktion mit einer Kupplungskomponente, wie zuvor beschrieben, gemessen.
Das Ergebnis der vorliegenden Erfindung ist eine Testvorrichtung, die aus einer Trägermatrix, in die eine Protease und deren Substrat inkorporiert sind, so zusammengesetzt ist, daß Wechselwirkung zwischen der Protease und deren Substrat vor Kontakt mit der wäßrigen Testprobe verhindert wird.
Die Trägermatrix kann irgendeine Substanz sein, die sich dazu eignet, die Komponenten der Testzusammensetzung zu inkorporieren, solange wie sie im wesentlichen inert gegenüber der Testzusammensetzung, porös und/oder absorbierend in Bezug auf die zu testende wäßrige Probe ist. Der Ausdruck "Trägermatrix" betrifft entweder saugfähige oder nicht-saugfähige Matrizes, welche unlöslich sind und ihre strukturelle Integrität, wenn sie Wasser oder anderen physiologischen Flüssigkeiten ausgesetzt werden, beibehalten. Geeignete saugfähige Matrizes, die verwendet werden können, umfassen Papier, Zellulose, Holz, synthetische Harzvliese, Gewebe und Faservliese u. dergl. Nicht-saugfähige Matrizes umfassen Glasfaser, Polymerfilme, vorgeformte oder mikroporöse Membranen und organoplastische Materialien, wie beispielsweise Polypropylen u. dergl.
Es werden andere Matrixformate in Betracht gezogen, einschließlich die Verwendung kommerziell erhältlicher vorgeformter poröser Membranen oder mikroporöser Membranen, die durch Techniken, wie beispielsweise Phasenumkehrung, gebildet sind. Polymerfilm-Matrizes, wie beispielsweise Filme, die mit Latexformulierungen auf der Basis von Latexpolymersuspensionen hergestellt sind, beispielsweise das 60:40 Copolymer aus Styrol und Butadien, oder andere natürliche oder synthetische Polymere oder Mischungen davon. Beispiele derartiger Filmformulierungen können in den US-Patenten mit den Nummern 3,630,957 und 4,312,834 gefunden werden.
Der einheitliche Festzustand-Teststreifen oder die Testvorrichtung wird hergestellt durch Inkorporierung einer Trägermatrix mit Trocknen zwischen den Inkorporierungsschritten. Wenn eine vollständige Blutprobe getestet wird, kann die imprägnierte Trägermatrix überzogen werden, wodurch es ermöglicht wird, überschüssige Probe abzuwaschen oder abzuwischen.
Die Inkorporierung kann mittels eines Verfahrens wie beispielsweise Eintauchen, Verteilen oder Sprühen durchgeführt werden, wodurch es ermöglicht wird, daß die Trägermatrix mit der Protease und dem Substrat in einer Weise verbunden wird, bei der vorzeitige Wechselwirkung verhindert wird, wobei aber im wesentlichen gleichzeitiger Kontakt zwischen dem Proteasesubstrat und der Testprobe, wenn mit der wäßrigen Probe benetzt wird, ermöglicht wird. Dieses kann erreicht werden, indem eine Papierträgermatrix mit einer wäßrigen Protease-haltigen Lösung imprägniert wird, getrocknet wird und anschließend der getrocknete Träger mit einer nicht-wäßrigen Lösung, die das Substrat enthält, imprägniert und getrocknet wird. Beliebige Komponenten wie beispielsweise ein Aktivator oder eine Kupplungskomponente können mit welcher Lösung auch immer, die am geeignetsten im Hinblick auf deren Löslichkeit in wäßrigen und nichtwäßrigen Lösungsmitteln ist, verbunden werden.
Das Trocknen kann mit jedweden Mitteln, welche die inkorporierte Zusammensetzung nicht schädlich beeinflussen, üblicherweise mittels eines Luftofens, durchgeführt werden. Das getrocknete Papier kann anschließend zerschnitten und auf einem Ende eines Trägergliedes, beispielsweise eines steifen oder halbsteifen Polystyrolfilmstreifens befestigt werden. Das Befestigen des Papieres auf dem Streifen kann unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebandes, wie beispielsweise des kommerziell von 3M Co. St. Paul, MN. als DOUBLE STICK erhältlichen, durchgeführt werden. Das Trägerglied stellt eine geeignete Haltevorrichtung dar, welche die Anwendung des Testes erleichtert. Das Testvorrichtungsformat ist eine besonders geeignete Form für die Durchführung des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Reaktanten können in eine einzige Trägermatrix, wie beispielsweise Papier, inkorporiert werden, und dennoch ohne vorherige Reaktion beibehalten werden. Die Testvorrichtung wird einfach mit einer Probe in Berührung gebracht, und ein nachweisbares Ergebnis wird aufgezeichnet. Die Ergebnisse und Handhabung der Daten für die Bestimmung der Konzentration des Proteaseinhibitors aus dem nachweisbaren Ergebnis sind unter "Ergebnisse" beschrieben.

3. Konzentrationsbereiche von Testkomponenten

Die Konzentrationsbereiche von Testkomponenten in dem Assay hängen von dem klinisch interessierenden Bereich für den bestimmten Proteaseinhibitor ab. Tabelle II zeigt den normalen Bereich für Proteaseinhibitoren in menschlichem Plasma. Die Werte außerhalb dieses Bereiches werden als abnorm und deshalb von klinischem Interesse angesehen. Tabelle II Proteaseinhibitor Normaler Bereich (mg/100 ml) α&sub1;-Antitrypsin α&sub1;-Antichymotrypsin inter-α-Trypsininhibitor Antithrombin-III c&sub1;-Inaktivator α&sub2;-Makroglobulin α&sub2;-Antiplasmin
Im nachfolgenden ist ein Leitfaden für die Ausführung und die bevorzugten Konzentrationsbereiche für Komponenten in der für die Herstellung der Testvorrichtung für die Bestimmung von Antithrombin-III verwendeten Reagenzlösung aufgeführt. Ausführung bevorzugt Protease (Thrombin) Substrat Proteaseinhibitor (Antithrombin-III 1:3 Verdünnung von Plasma) Aktivator (Heparin) Einheiten/ml
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine einheitliche Festzustand-Testvorrichtung für Antithrombin-III hergestellt, indem aufeinanderfolgend eine Trägermatrix mit einer wäßrigen Lösung, die 5 bis 10 NIH Einheiten/ml Thrombin und 1 bis 10 USP Einheiten/ml Heparin enthält, verbunden wird, und getrocknet wird und die getrocknete Matrix mit einer nicht-wäßrigen Lösung, die 1 bis 2 mM chromogenes Thrombinsubstrat enthält, verbunden wird und getrocknet wird. Die für die Bestimmung irgendeines anderen Proteaseinhibitors benötigten Reagenzkonzentrationen hängen wiederum in erster Linie von dem interessierenden Proteaseinhibitor/Proteasepaar und von der Empfindlichkeit der Nachweismethode ab. Ein ähnliches Verfahren, wie das, das für die Bestimmung der Lösungsreagenzkonzentrationen dargestellt wurde, würde für die Bestimmung bevorzugter Konzentrationen für die Herstellung einer Testvorrichtung verwendet werden. Es ist jedoch zu erwarten, daß derartige Konzentrationen innerhalb der für Antithrombin-III angegebenen Ausführungskonzentrationen fallen.
Das gleiche Verfahren kann für die Prüfung und Herstellung von Vorrichtungen zur Bestimmung von Heparin verwendet werden, wenn Antithrombin-III in die Testzusammensetzung oder die Testvorrichtung inkorporiert und Heparin weggelassen wird. Aus diesem Grund sind in dem Vorangegangen Ausführungs- und bevorzugter Konzentrationsbereiche für Antithrombin-III angegeben, obwohl damit gerechnet wird, daß Antithrombin-III oder ein anderer Proteaseinhibitor der interessierende Analyt sein wird, und als solcher nicht in die Testvorrichtung inkorporiert oder in die einzige Assay-Reagenzlösung eingebunden werden wird.
Die Testvorrichtung wird vorteilhaft durch einfaches in Berührung bringen der Probe mit der Testvorrichtung verwendet, woraus sich eine nachweisbare Reaktion ergibt. Der Kontakt mit der Testvorrichtung kann mittels Eintauchen, Pipette oder Tupfer hergestellt werden.

Ergebnisse

Wenn die Testzusammensetzung in eine Trägermatrix für die Herstellung einer einheitlichen Festzustand- Testvorrichtung inkorporiert wird, wird das Reflexionsvermögen für die Messung der nachweisbaren chromogenen Reaktion verwendet. Das Reflexionsvermögen wurde 2 Minuten lang alle 5 Sekunden unter Verwendung eines Ames SERALYZER Spektrophotometers mit einem 405 nm Interferenzfilter überwacht. Wenn der SERALYZER mit einem Hewlett Packard HP 85-Computer verbunden ist, kann die grafische Anzeige der Daten direkt erhalten werden.
Die Messungen hinsichtlich des Reflexionsvermögens wurden mit einer vereinfachten Form der sehr bekannten Kubelka- Munk-Gleichung (siehe Gustav Kortum, "Reflectance Spectroscopy", Seiten 106-111, Springer Verlag, NY (1969)) ausgewertet:
wobei R der Anteil des Reflexionsvermögens von der Testvorrichtung ist, K eine Konstante ist, und S der Lichtstreuungskoeffizient des bestimmten reflektierenden Mediums ist. K/S steht mit der Konzentration der absorbierenden Spezies, üblicherweise des durch Wechselwirkung der Protease mit dem Substrat gebildeten Spaltungsproduktes, in Beziehung. K/S wurde gegen die Zeit in Sekunden aufgetragen, analog zu dem Plot der Absorption gegen die Zeit für den Flüssigkeitsassay. Es wurden semilogarithmische Plots der Reaktivität (Änderung von K/S pro Sekunde bestimmt aus den K/S gegen die Zeit Plots) gegen die Zeit in Sekunden für die Bestimmung der Halbwertszeit (t1/2) der Inhibierungsreaktion verwendet. Wie bei dem Flüssigkeitsassay wurde die beobachtete Geschwindigkeitskonstante (kobs) aus der Beziehung
kobs = 0,693/t1/2
berechnet.
Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Proteaseinhibitorkonzentration in der Probenlösung und der beobachteten Reaktion festgestellt. Unbekannte Proben können mit Hilfe ähnlicher Berechnungen und Vergleich zu einer Standardkurve bestimmt werden.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben Experimente, welche im Hinblick auf die Entwicklung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden. Während die Beispiele dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen, sind sie nicht dahingehend zu interpretieren, daß sie deren Umfang beschränken, welcher allein durch die angefügten Ansprüche definiert ist. Dem Fachmann wird es möglich sein, derartige Variationen, Substitutionen und Änderungen im Hinblick auf die Komponenten der Zusammensetzung und Bestandteile und Reaktionsparameter, durchzuführen, die wünschenswert erscheinen.

Beispiele

Die nachfolgenden Abkürzungen werden in der Patentschrift aus Zweckdienlichkeitsgründen verwendet:
dl Deziliter
ml Milliliter
µL Mikroliter
M molar
mM millimolar
nM nanomolar
µM mikromolar
mg Milligramm
gm Gramm
nm Nanometer
ºC Grad Celsius
IU Internationale Einheiten-, die Enzymmenge, die die Hydrolyse eines Mikromol Substrats pro Minute unter den Bedingungen des Assays katalysiert
NHP Normales menschliches Plasma
NIH Einheit die Thrombinmenge, die eine 250 mg% Fibrinogenlösung in 15 Sekunden bei 37ºC gerinnen läßt
U.S.P. Heparin Einheit
Wirksamkeitseinheit fur Heparin, definiert in Beziehung zu einem USP-Vergleichsstandard
AT III Antithrombin-III
t1/2 Halbwertszeit des Reaktanten
kobs beobachtete Geschwindigkeitskonstante
v Reaktionsgeschwindigkeit
S-2238 D-phe-pip-arg-pNA, ein synthetisches chromogenes Substrat für Thrombin, erhalten von Kabi Diagnostica, Stockholm, Schweden
Thrombin Rinderthrombin, erhalten von Miles Scientific, Naperville, Ill.
Heparin Schweinedarmschleimhautheparin, erhalten von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
Tween 80 Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonooleat, erhalten von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Gantrez ES-225 Ethylester von Methylvinylether/Maleinsäureanhydridcopolymer, erhalten von GAF Corp., New York, N.Y.
DMF Dimethylformamid
Tris tris (Hydroxymethyl) aminomethan
Emulphor ON-870 Polyoxyethylierter Oleylalkohol, GAF Corp., New York, N.Y.

Substratnomenkatur

BOC Benzyloxycarbonyl
p-NA para-Nitroanilid
Bz Benzyl
suc Succinyl
glu Glutaminsäure
Ile Isoleucin
gly Glycin
arg Arginin
pro Prolin
val Valin
phe Phenylalanin
ser Serin
lys Lysin
pip Pipekolinsäure
Die verwendeten Prozentsätze geben das Gewicht in Gramm/100 ml Lösung (% G/V) an, sofern nicht etwas anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Für den Antithrombin-III-Assay geeignete einheitliche Testvorrichtung
Eine Festzustand-Testvorrichtung, die alle erforderlichen Komponenten für die Durchführung eines Einstufenassays für Antithrombin-III enthielt, wurde folgendermaßen hergestellt.
Whatman 54 Filterpapier wurde in eine wäßrige Lösung aus 0,2 M Tris, 0,175 M Natriumchlorid und 7,5 mM EDTA (ph 8,4), die 1 % Rinderserumalbumin, 10 NIH Einheiten/ml Thrombin und 30 Einheiten/ml Heparin enthielt, getaucht. Das imprägnierte Papier wurde 15 Minuten bei 50ºC getrocknet und anschließend in eine nicht-wäßrige Lösung aus einem Teil Dimethylformamid zu vier Teilen Ethanol, die 2 mM S-2238, 0,1 % Tween 80 und 1 % Gantrez ES-225 enthielt, getaucht.
Standards für Antithrombin-III wurden hergestellt, indem normales menschliches Plasma (NHP) unter Erhalt von Lösungen, die 0, 10, 20, 40, 60, 80 und 100 % NHP enthielten, verdünnt wurde. Die Durchschnittskonzentration von AT III in NHP ist 23,5 mg/100 ml. Die nachfolgenden AT III-Konzentrationen entsprechen den folgenden % NHP-Werten: Standard % NHP AT-III-Konzentration (mg/100 ml)
Alle Testproben und Standards wurden vor dem Assay wegen des Meßbereichs des verfügbaren Meßgeräts verdünnt, wobei ein Teil mit zwei Teilen üblicher physiologischer Kochsalzlösung verdünnt wurde.
Ein 30 µl Aliquot verdünntes Plasma wurde auf die Testvorrichtung pipettiert und das Reflexionsvermögen alle 5 Sekunden 2 Minuten lang unter Verwendung eines Ames SERALYZER -Spektrophotometers mit einem 405 nm Interferenzfilter überprüft (Fig. 1) . Es wurden semilogarithmische Plots für die Bestimmung der Halbwertszeit (t1/2) für die Inhibierungsreaktion verwendet. Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante (kobs) wurde aus der Beziehung kobs = 0,693/t1/2 berechnet. Der Plot kobs gegen die nanomolare Antithrombin-III-Konzentration (Fig. 3) zeigt, daß die Geschwindigkeit der Thrombininhibierung tatsächlich eine lineare Funktion der Antithrombin-III-Konzentration ist.
Es wurden Semi-log-Plots der Reaktivität (delta K/S pro Sekunde) gegen die Zeit zur Bestimmung der Halbwertszeit t1/2 der Thrombinaktivität verwendet (siehe Fig. 2). Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante kobs wurde berechnet und gegen die Antithrombin-III-Konzentration in dem Standard unter Erhalt einer Reaktionskurve aufgetragen (siehe Fig. 3). Die Antithrombin-III-Spiegel in den Testplasmen wurden aus der Reaktionskurve bestimmt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer einheitlichen Testvorrichtung für den einstufigen Test eines Proteaseinhibitors in einer wäßrigen Testprobe ohne Vorinkubation des Inhibitors mit dessen entsprechender Protease, umfassend die Schritte:

(a) Imprägnieren einer Trägermatrix mit einer wäßrigen, proteasehaltigen Lösung;

(b) Trocknen der inkorporierten Matrix;

(c) Inkorporieren einer nicht-wäßrigen, das Substrat enthaltenden Lösung in die getrocknete Matrix; und

(d) Trocknen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Protease Thrombin ist und das Substrat ein synthetisches, chromogenes Substrat für Thrombin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Testvorrichtung unter Verwendung einer wäßrigen Lösung, die etwa 0,2 bis etwa 50 NIH-Einheiten/ml Thrombin und gewünschtenfalls etwa 0,2 bis etwa 100 USP-Einheiten/ml Heparin enthält, und mit einer nicht-wäßrigen Lösung, die etwa 0,2 bis etwa 5 M eines synthetischen, chromogenen Substrates für Thrombin enthält, hergestellt wird.

4. Verwendung der nach einein der Verfahrensansprüche 1 bis 3 hergestellten Testvorrichtung für die Bestimmung eines Proteaseinhibitors.