NO852070L

NO852070L - Enzymatisk etanolpaavisning.

Info

Publication number: NO852070L
Application number: NO852070A
Authority: NO
Inventors: Robert Bauer; Thomas A Magers
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1984-06-04
Filing date: 1985-05-23
Publication date: 1985-12-05
Also published as: FI852225L; US4810633A; DE3576528D1; AU560448B2; JPH0586197B2; ZA853430B; IL75065A; EP0164008A2; IL75065A0; ATE51028T1; FI852225A0; DK249085A; JPS60262598A; EP0164008A3; DK249085D0; AU4285285A; CA1254117A; EP0164008B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt påvisning av en bestanddel i en vanndig prøve ved hjelp av en fast reagens-strimmel (forsøksinnretning). Spesielt vedrører oppfinnelsen en fast forsøksinnretning som er nyttig ved påvisning av etanol i en vanndig prøve. Av spesiell interesse er prøver av kroppsvæsker, som f.eks. blod, urin eller spytt.

Etanolpåvisning er nyttig industrielt, medisinsk og for håndheving av loven. Industrielt kan nivået av etanol som er til stede benyttes til å bestemme forløpet av fermentering eller av oppløsningsmiddelrensing. I tillegg må alkohol-

holdige drikkevarer og medisiner undersøkes for å bestemme om den ønskete mengden etanol er til stede. Medisinsk kan nærværet og nivået av etanol i blodstrømmen benyttes som et hjelpemiddel for å stille differensierte diagnoser blant flere mulige årsaker til tap av motorisk funksjon eller livstruende koma. Påvisning av etanol i blodet kan også benyttes som et hjelpemiddel i behandlingsprogrammer for mennesker med alkoholproblemer og for diagnostiserte alkoholikere. Juridisk kan innholdet av etanol i blodstrømmen benyttes som et objektivt indisium på sjikketheten til å drive et maskineri eller å kjøre en bil eller annet kjøretøy. En enkel, rask, hensiktsmessig fremgangsmåte til påvisning av alkohol i blodet er spesielt viktig ved håndheving av loven.

Ut fra den betydningen og den utstrakte anvendelsen som etanolpåvisning har, er det ikke overraskende at mange analysefrem-gangsmåter er tilgjengelige. Etanolpåvisning kan utføres instrumentelt med potensiometriske målinger, ved infrarød spektroskopi eller ved gasskromatografi. I tillegg er både enzymatiske- og ikke-enzymatiske oppløsningsanalyser tilgjengelige. Ved ikke-enzymatiske analyser benyttes sterke oksyda-sjonsmidler som f.eks. permanganat og dikromat som forandrer farge når det reagerer med etanol. P.g.a. sin ikke-spesifike natur reagerer de uheldigvis også med mange andre oksyderbare stoffer, og forårsaker feilaktig høye resultater. Enzymatiske analyser er generelt basert på anvendelsen av alkoholdehydrogenase eller alkoholoksydase. Disse analysene benytter også ofte en konkurrerende inhibitor av enzymet for å lette den kvantitative påvisningen av en bestanddel. (Se f.eks. U.S. patent nr. 3,977,944).

Den enzymatiske virkningen av alkoholdehydrogenase (ADH) på etanol forløper som følger:

Det reduserte nikotinadenindinukleotidet (NADH) kan så bestemmes direkte ved ultrafiolett spektroskopi eller reduksjonen ovenfor kan kobles med en andre enzymatisk reaksjon som muliggjør at omvandlingen av etanolen til NADH kan følges i det synlige området av spekteret.

Siden likevekten for reaksjonen ovenfor ligger sterkt forskjøvet mot etanol, benyttes det ofte et middel som binder acetaldehyd for å drive reaksjonen mot dannelsen av NADH. (Se f.eks.

U.S. patent nr. 3,926,736). "Alcohol Analysis: Clinical Laboratory Aspects, Part II", K.M. Dubowski, Laboratory Mana-gement, april 1982, side 33, tilveiebringer en tabell vedrørende hovedtrekkene ved enzymatisk (ADH) oksydasjonsfremgangsmåter til påvisning av alkohol i blodet. Tabellen avslører at analysene basert på den forannevnte reaksjonen kan lettes ved å benytte semikarbazid som et middel til å binde acetaldehyd.

Det dannete NADH kan så påvises ved anvendelse av diaforase og jodonitrotetrazoliumklorid slik at det dannes et farget slutt-produkt (formazan).

Det er funnet andre fremgangsmåter som opphever behovet for et middel som binder acetaldehyd. G.B. patent nr. 1,351,547 beskriver en fremgangsmåte som innbefatter undersøkelse av en prøve med en vanndig oppløsning av alkoholdehydrogenase og et spesifikt tetrazoliumsalt i mengder som tilveiebringer en kvantitativ kolorimetrisk respons når den kommer i kontakt med prøven, NAD, diaforase, og en buffer. I dette patentet beskrives en stabil lyofilisert sammensetning av alkoholdehydrogenase og tetrazoliumsalt og det antydes at ytterligere komponenter, som f.eks. albumin eller gelatin og et anti-oksydasjonsmiddel (f.eks. en redusert merkaptan), ytterligere vil stabilisere reaksjonen slik at et middel som binder acetaldehyd ikke er påkrevet.

Den andre enzymatiske reaksjonsveien benytter alkoholoksydase (AOD), og forløper som følger:

Denne reaksjonen kan kobles med en andre enzymatisk reaksjon, som tillater påvisningen av hydrogenperoksyd i det synlige området av spektret ved tilsats av peroksydase og en kromogen indikator. Denne serien av reaksjoner i væskefasen som benyttes for analyten av alkoholoksydase er publisert av Phillips Chemical Co. i "Biochemicals Technical Information Bulletin on Alcohol Oxidase" (23785E).

I U.S. patent nr. 4,430,427 ble natriumazidinhiberingen av hastigheten for metanolomvandling forårsaket av alkoholoksydase målt ved å følge oksygenforbruket i oppløsningen med en oppløst oksygenprobe. Dette patentet beskriver dannelsen av en rød absorberende kombinasjon når et azid tilsettes til et alkohol-oksydasepreparat.

Det er foreslått at sammensetningen for oppløsningsanalysen

til påvisning av alkoholdehydrogenase kan inkorporeres på en fast forsøksinnretning. Se f.eks. U.S. patent nr. 4,394,444, som beskriver en påvisning hvor stoffet som skal påvises reageres med en dehydrogenase, som f.eks. alkoholdehydrogenase under dannelse av NADH. NADH påvises så med en "frakobler" og peroksydase slik at det dannes farge. I patentet foreslås at et slikt system kan inkorporeres på en fast forsøksinnretning. Imidlertid foreligger det ingen publisert informasjon angående

hvordan en alkoholoksydaseoppløsningsanalyse skal inkorporeres på en forsøksinnretning.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forsøksinnretning

til påvisning av etanol i en vanndig prøve, en fremgangsmåte til fremstilling derav og en fremgangsmåte for anvendelse av innretningen. Forsøksinnretningen består av en bærermatriks inkorporert med alkoholoksydase, et peroksydativt aktivt stoff og et kromogent indikatorsystem som er i stand til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons, hvor det kromogene indikatorsystemet i det vesentlige foreligger i redusert (ufarget) form og alkoholoksydasen er til stede i en mengde som er tilstrekkelig til å tilveiebringe en kolorimetrisk respons på minst 100 mg/dl etanol på mindre enn 5 minutter.

Når azid i tillegg innbefattes kan innretningen benyttes til kvantitativ bestemmelse av etanolinnholdet. Anvendelsen av alkoholoksydase, et peroksydativt aktivt stoff og en egnet kromogen indikator inkorporert på bærermatriksen til påvisning av etanol i vanndig prøve betraktes også som en del av oppfinnelsen .

Ved bruk, bringes den vanndige prøven i kontakt med forsøksinn-retningen. Tilstedeværelsen av 100 mg/dl etanol og/eller konsentrasjon av etanol i prøven, påvises ved å observere en eventuell detekterbar kolorimetrisk respons som dannes på

mindre enn ca. 5 minutter. Med forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse overvinnes problemet med falske positive resultater som oppstår når økete konsentrasjoner av oppløsnings-analysekomponentene, som benyttes for å tilveiebringe tilstrekkelig følsomhet til å detektere minst 100 mg/dl etanol i en vanndig prøve, på enkelt måte inkorporeres på en bærermatriks. Forsøks-innretningen tilveiebringer raske resultater, tilstrekkelig detekterbar respons dannes på mindre enn 5 minutter. Innret-ningene kan fremstilles med ordinære tørketeknikker og krever ikke lyofilisering.

Konsentrasjonene av oppløsningsanalysereagensene er vanligvis for lav til å tilveiebringe en følsom analyse når den innbe fattes på en fast forsøksinnretning. Derfor må reagenskonsen-trasjonen som inkorporeres på en bærermatriks økes, og naturligvis er konsentrasjonene i den endelige tørre forsøksinnretningen enda høyere. Denne konsentrasjonsendringen fører ofte til spesielle problemer vedrørende forskjeller i vekselvirkninger og stabiliteter for komponentene i den faste forsøksinnret-ningen. Disse probelemene er spesielt alvorlige når enzymer anvendes.

I tilfelle med en etanolpåvisning basert på alkoholoksydase gir direkte inkorporering av konsentrasjonen av reagensene for opp-løsningsanalysen på en bærermatriks ikke en forsøksinnretning med tilfredsstillende følsomhet. Den påkrevete følsomheten vil variere med den planlagte anvendelsen av forsøksinnretningen. For behandlingsprogrammer som krever egen innsats vil svært

lave nivåer av etanol i blodet - 25 til 50 mg/dl (milligram pr. desiliter) - tyde på at personen ikke medvirker. For håndheving av loven, må forsøkene være følsomme for den juridisk fastsatte grensen, som i U.S.A. vanligvis er ca. 100 mg/dl etanol i blodet. Det eksperimentelle oppsett som her benyttes krever følsomhet for minst 100 mg/dl etanol i en vanndig flytende prøve med en kolorimetrisk respons på mindre enn ca. 5 minutter. En foretrukket forsøksinnretning kan påvise tilstedeværelsen

av 100 mg/dl etanol på ca. 1 til 2 minutter, mest fortrinnsvis 1 minutt eller mindre.

Når konsentrasjonen av reagensene for oppløsningsanalysen økes for å tilveiebringe den påkrevete følsomheten som definert ovenfor, inkorporeres på en bærermatriks og tørkes, foreligger indikatoren i det vesentlige på oksydert form (d.v.s. farget) selv før den bringes i kontakt med en vanndig prøve som inneholder etanol. Med andre ord gir en f orsøksinnretning som er fremstilt på denne måten en øyeblikkelig og ubikvitær falsk positiv påvisning av etanol. Selv om falske positive resultater alltid er uønskete er det spesielt ødeleggende ved metanolpå-visning. Falske indikasjoner på manglende medvirkning kan alvorlig ødelegge et programs evne til å rehabilitere mennesker med alkoholproblemer. Naturligvis vil også en falsk positiv påvisning av alkohol i blodet ut over den juridiske grensen ha meget alvorlige konsekvenser for en bilfører.

Problemet med faske positive resultater ses enten ikke i for-tynnete oppløsningsanalyser eller det motvirkes ved anvendelsen av en blindprøve (d.v.s. sammenligning med en ureagert del av forsøkssammensetningen). Problemet synes også å være enestående for alkoholoksydase, siden andre oksydaseenzymer som f.eks. glucoseoksydase, kolesteroloksydase, uricase og galactoseoksy-dase, benyttet i de høye konsentrasjonene som er påkrevet for å danne en følsom fast forsøksinnretning, ikke viser denne høye graden av falske positive responser.

Problemet med falske positive resultater som oppstår i reagens-strimmelutførelsen løses i foreliggende oppfinnelse enten ved anvendelse av en spesiell inkorporeringsfremgangsmåte eller ved tilsats av et azid til forsøkssammensetningen.

I forbindelse med foreliggende oppfinnelse har man overveid,

men ikke basert oppfinnelsen på, muligheten for at tilstedeværelsen av primære alkoholer av lav molekylvekt i reagensene som benyttes kan bidra til problemet med de falske positive resultatene. I tillegg foreligger det noen indikasjoner på

at alkoholoksydase kan reagere med de primære hydroksygruppene i serinrester på enzymet selv, en autooksydasjonsprosess som er ukjent i andre oksydaseenzymer.

To fremgangsmåter har vært benyttet for å avskaffe problemet

med falske positive resultater som oppstår når oppløsningsana-lysesammensetningen, ved høy konsentrasjon, inkorporeres på

en bærermatriks slik at det dannes en fast forsøksinnretning.

En fremgangsmåte benyttes når det kromogene indikatorsystemet består av et koblet par av indikatorkomponenter. I det tilfelle inkorporeres en komponent på bærermatriksen med det peroksydativt aktivt stoffet og alkoholoksydase, og den impregnerte bæreren tørkes før den andre kromogene komponenten inkorporeres.

En andre fremgangsmåte for å elliminere problemet med falske positive resultater er tilsats av et azid, som f.eks. natriumazid. Selv om azidet virker som en konkurrerende inhibitor og tillater kvantitativ analyse av etanol ved høye konsentrasjoner, vurderes det om det også beskytter enzymet med dets selvødeleggende tendenser, disse tendensene kan bidra til problemet med de falske positive resultatene. Tilsatsen av azid er den beste fremgangsmåten til fremstilling av en fast forsøksinnretning som er følsom for minst 100 mg/dl etanol sam-tidig som den kromogene komponenten av et indikatorsystem i det vesentlige foreligger på redusert form (d.v.s. ingen falsk positiv reaksjon). Tilsatsen av azid er foretrukket selv når det benyttes spesielle inkorporeringsfremgangsmåter.

Preparater som viser alkoholoksydaseaktivitet er tilgjengelige fra en rekke kilder innbefattet spesies av sopp og gjær. Preparater fra gjær av Pichia-typen er en foretrukket kilde

for alkoholoksydase. Slike gjærkilder er oppført i U.S. patent nr. 4,430,427. Alkoholoksydasepreparatene som her benyttes omsettes med etanol eller andre lavere primære alkoholer,

som f.eks. metanol og 1-propanol.

Peroksydativt aktive stoffer, som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse kan velges fra en rekke organisk og uorganiske kilder. Platenperoksydaser, som f.eks. pepperrotperoksydase eller potetperoksydase, kan benyttes. I tillegg kan man benytte hemin og heminderivater, hemoglobin og hematin, selv om disse er mindre tilfredsstillende.

Det kromogene indikatorsystemet kan være enten en enkelt komponent eller to komponenter som danner et koblet kromogent indikatorsystem. Når det benyttes en enkelt kromogen komponent, som f.eks. 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin, o-tolidin, 2-amino-8-naftol-3,6-disulfonsyre, naturproduktet guajak-gummi eller p-anisidin, innbefattes fortrinnsvis et azid i forsøkssammen-setningen for å oppheve problet med falske positive resultater. 3,3<1>,5,5<1->tetrametylbenzidin, o-tolidin og guajak-gummi er foretrukne enkle kromogen indikatorkomponenter. Koblete kromogene komponenter, som f.eks. 3,5-dikloro-2-hydroksybenzensulfon- syre (DHSA)/4-aminoantipyrin, 3,5-dikloro-2-hydroksybenzen-sulfonsyre/3-metyl-2-benzotiazolinhydrazon eller m-anisidin/ 4-aminoantipyrin, bl.a., kan benyttes til å fremstille for-søksinnretningen. Det kromogene paret, DHSA/4-aminoantipyrin er et foretrukket koblet indikatorsystem.

Valget av de kromogene indikatorsystemene kan påvirke forsøks-innretningens evne til å oppfylle de angitte kriterier som innbefatter tilveiebringelse av en kolorimetrisk respons på nærværet av 100 mg/dl etanol i en vanndig prøve på mindre enn ca. 5 minutter. Med utgangspunkt i foreliggende beskrivelse,

kan valg av et tilstrekkelig følsomt indikatorsystem foretas av en fagmann med gjennomsnittlige kunnskaper.

Foretrukne azider er metallsaltazidene, spesielt de elektro-positive metallazidene som ikke er eksplosive. Spesielt foretrukket er metallazidene valgt fra gruppe IA i den periodiske tabell ifølge Mendeleeff, som f.eks. litiumazid, natriumazid, kaliumazid o.l. Av disse ble natriumazid funnet å være den forbindelsen som var lettest tilgjengelig kommersielt.

Den optimale pH for alkoholoksydase er rundt 7,5. Derfor inkorporeres fortrinnsvis en buffer i forsøksinnretningen, selv om dette ikke er påkrevet for alle vanndige prøver. Dette er spesielt viktig dersom forsøksinnretningen formuleres for anvendelse med en kroppsvæske som f.eks. urin hvor pH av prøven kan være så lav som 4 til 5. En hvilken som helst buffer som er i stand til å tilveiebringe en pH i området fra 5,0 til 9,0, kan benyttes ved foreliggende oppfinnelse. Nyttige buffere innbefatternatriumfosfat, natriumsitrat og tris(hydroksymetyl) aminometan og tris(hydroksymetyl)aminometanglutamat. Andre buffere kan med utgangspunkt i foreliggende oppfinnelse lett velges av fagmannen.

Andre komponenter, som f.eks. fuktemidler og farge- eller lagringsstabilisatorer, kan innbefattes så lenge det ikke påvirker den enzymatiske reaksjonen mellom alkoholoksydase og etanol eller reaksjonen mellom det peroksydativt aktive stoffet og det genererte peroksydet. Egnete fuktemidler innbefatter polymerer, som f.eks. polyvinylpyrrolidon og overflateaktive midler.

En polyetoksylert fettholdig alkohol (tilgjengelig under varemerket "Emulphor ON 870" fra GAF, New York, kan også benyttes. Dioktylnatriumsulfosuksinat (tilgjengelig under varemerke "Aerosol OT" fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) virker både som et overflateaktivt middel og som

en fargestabilisator. Nyttige lagringsstabilisatorer innbefatter sorbitol og tris(hydroksymetyl)aminometanglutamat; sorbitol er spesielt foretrukket.

Bærermatriksen kan være et hvilket som helst stoff som er i

stand til å la seg inkorporere med komponentene av forsøks-sammensetningen. Matriksen kan følgelig anta mange kjente former, som f.eks. de som benyttes som reagensstrimler for oppløsningsanalyser. F.eks. beskriver U.S. patent nr. 3,846,247 anvendelsen av filt, porøse keramiske strimler og vevde eller sammenfiltrede glassfibrer. Som erstatninger for papir beskriver U.S. patent nr. 3,522,928 anvendelsen av trestykker, tekstil, svampmaterialer og leiraktige stoffer. Fransk patent nr. 2,170,397 beskriver anvendelsen av bærermatrikser som inneholder mer enn 50% polyamidfibrer. En annen fremgangsmåte til fremstilling av bærermatrikser er beskrevet i U.S. patent nr. 4,046,513, hvor konseptet med trykking av reagensene på et egnet bærermateriale er anvendt. U.S. patent nr. 4,04 6,514 beskriver sammenveving eller knytting av filamenter som inneholder reagensene i et reagenssystem.

Det bør følgelig fremheves at ved fremstilling av en forsøks-innretning ifølge foreliggende oppfinnelse kan alle slike utførel-ser av bærermatriksen benyttes, på samme måte som andre løs-ninger. Matriksen kan innbefatte et system som fysisk omslutter en hvilken som helst eller alle disse bestanddelene, som f.eks. polymere mikrokapsler som brytes ved kontakt med en vanndig oppløsning. F.eks. kan alkoholoksydase og det kromogene indikatorsystemet eller en komponent av en koblet kromogen indikator, holdes separat inne i den samme bærermatriksen uten å veksel-virke før den bringes i kontakt med en oppløsning.

Matriksen kan også innbefatte et system hvor bestanddelene i sammensetningen er homogent kombinert i en flytende eller halvtflytende tilstand, som senere stivner eller herder, hvorved bestanddelene inkorporeres. Andre matriksutførelser overveies, innbefattet anvendelsen av en mikroporøs membran eller polymer-filmmatrikser. Mikroporøse membraner er tilgjengelige som ferdige fremstilte membraner eller kan fremstilles ved slike teknikker som faseinversjon. Egnete polymerfilmer kan fremstilles med kommersielt tilgjengelige latekssammensetninger basert på latekspolymersuspensjoner som f.eks. de som dannes fra en 60:40 kopolymer av styren og butadien. Andre naturlige eller syntetiske polymerer, eller blandinger derav, kan også benyttes. Eksempler på slike filmsammensetninger kan finnes i U.S. patentene 3,630,957 og 4,312,834.

Den fremgangsmåten som nå foretrekkes er å impregnere en bærermatriks som lett suger opp væske, f.eks. filterpapir, med sammensetningen etterfulgt av festing av den impregnerte matriksen på en bærende del. Når en hel blodprøve undersøkes kan den impregnerte bærermatriksen belegges slik at overflødig prøve kan vaskes av eller tørkes bort.

Fortrinnsvis fremstilles reagensforsøksstrimmelen eller forsøks-innretningen ved trinnvis inkorporering av bærermatriksen

med tørking mellom inkroporeringstrinnene. Tørking kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst innretning som ikke på nega-tiv måte påvirker den inkorporerte sammensetningen, vanligvis finner tørkingen sted i en ovn med luftsirkulasjon. Det tørkete papiret kan deretter kuttes og monteres på den ene enden av en bærende del, f.eks. en stiv eller halvstiv strimmel av polystyrenfilm. Monteringen av papiret på strimmelen kan utføres ved å benytte et dobbeltsidig limbånd, som f.eks. "DOUBLE STICK" fra 3M Co.

De følgende eksemplene illustrer de foretrukne fremgangsmåtene for inkorporering ved a) inkorporering av en hvilken som helst organisk oppløslig enkelt kromogen komponent før inkorporeringen av alkoholoksydase og eventuelle gjenværende bestanddeler, og grundig tørking, b) inkorporering av en komponent av en koblet kromogen indikator på bærermatriksen med alkoholoksydasen med tørking før inkorporeringen av den andre kromogene komponenten eller c) inkorporering av en tørket mikroporøs polymerfilm som inneholder alkoholoksydase og peroksydase med en kromogen indikator. Når oppdelt inkorporering benyttes kan forsøks-strimmelen vise en svak farging som er tydlig forskjellig fra den hvite fargen på en papirbærermatriks. Denne fargingen kan intensiveres noe når den bringes i kontakt med vann. Imidlertid forblir de kromogene komponentene hovedsakelig på redusert (ufarget) form og det finner sted en betydelig forandring i farge på mindre enn ca. 5 minutter når innretningen bringes i kontakt med en vanndig prøve som inneholder 100 mg/dl etanol. P.g.a. denne svake fargingen er det imidlertid foretrukket å inkorporere et azid med alkoholoksydasen, selv når det koblete kromogene komponentene inkorporeres hver for seg.

Forsøksinnretningen kan også fremstilles ved å kombinere analyse-bestanddelene i en polymermatriks i en flytende eller halvflytende tilstand og påføre blandingen på en bærer. Det er også tilveiebragt eksempler på slike fremgangsmåter.

Inkorporeringen kan utføres ved en hvilken som helst kjent fremgangsmåte som f.eks. dypping, bestrykning eller spraying som tillater bærermatriksen å bli i det vesentlige uniformt impregnert med analysesammensetningen.

Konsentrasjonsområdene for forsøkskomponentene er vesentlig høyere enn de konsentrasjonene som kreves ved oppløsningsanalyser på etanol. Valget av egnete konsentrasjoner kompliseres ytterligere ved den tilsynelatende vekselvirkningen av azidet med peroksydase ("Deleterious Effeet of Sodium Azide on Activity of Peroxidase", 36 J. Clin. Pathology 10, 1983). så vel som med alkoholoksydase (U.S. patent nr. 4,430,427). I tillegg vil de egnete konsentrasjonene variere noe avhengig av om prøven er urin, spytt eller blod. Fortrinnsvis bestemmer man først den konsentrasjonen som kreves av alkoholoksydase (AOD), for at det valgte indikatorsystemet skal kunne tilveiebringe en til strekkelig følsom etanolpåvisning. Konsentrasjonen av alkoholoksydase som kreves er inverst forbundet med følsomheten av indikatoren. Det benyttes et overskudd av peroksydase, og fortrinnsvis er forholdet mellom azid og peroksydase (POD) ikke mer enn 0,4:1 vektdeler, dette er en mengde som er tilstrekkelig til å forhindre en falsk positiv indikasjon uten at den hemmer den nødvendige aktiviteten av peroksydasen.

Denfølgende tabellen tilveiebringer en oversikt over de mulige og foretrukne konsentrasjonsområdene for komponentene i reagens-oppløsningen som benyttes for å fremstille forsøksinnretningen ifølge foreliggende oppfinnelse med den følsomhet og reaksjonstid som tidligere er angitt. (Definisjon av enhetene finnes under eksemplene).

Mest foretrukket er konsentrasjonen av alkoholoksydase i en forsøksinnretning for spytt/serum 40 til 70 IU/ml og for urin 50-150 IU/ml. I et hvert tilfelle er konsentrasjonen av den enkle kromogene komponenten eller hver av det koblete kromogene komponentene ca. 0,01 til 0,2 M (molar), fortrinnsvis ca. 0,025 til 0,1 M. Bufferen bør tilveiebringe en pH på fra ca. 5 til 9, fortrinnsvis fra ca. 7 til 8. Disse konsentrasjonsområdene og relative konsentrasjonene av komponentene er gjennomførbare enten oppløsningen er en vanndig impregneringsoppløsning eller en polymer suspensjon.

Forsøksinnretningen kan med fordel benyttes ved at den raskt dyppes i en prøve eller at prøven på annen måte føres i kontakt med bærermatriksen, hvorved det oppstår en detekterbar kolorimetrisk forandring når 100 mg/dl etanol er tilstede. Kontakten med prøven kan også bevirkes ved hjelp av pipette, pensel eller spatel. Selv om dypping er en meget tilfredsstillende kontakt-fremgangsmåte når urin benyttes, vil en blodprøve normalt kreve pipettering og de sistnevnte metodene kan være nyttige ved undersøkelse av spytt.

Følgende eksempler beskriver forsøk som ble utført ved utviklingen av foreliggende oppfinnelse. Fagmannen vil være i stand til å gjøre slike variasjoner, substitusjoner og endringer av komponentene i sammensetningen og reaksjonsparametrene som kan være ønskelig.

EKSEMPLER

Alkoholoksydase (AOD, EC 1.1.3.13) ble skaffet fra PHillips Chemical Co., Bartlesville, OK. Aktiviteten av alkoholoksydasen som er benyttet er gitt i internasjonale enheter pr. ml (IU/ml)

av utgangsoppløsningen. En internasjonal enhet (IU) av aktivitet katalyserer dannelsen av en mikromol aldehyd og hydrogenperoksyd i en luft-mettet oppløsning ved pH 7,5, 25°C. Peroksydasen ble benyttet var pepperrotperoksydase skaffet fra Miles Laboratories, Inc., Kankakee, 111., med en aktivitet på 130 IU/mg.

"Aerosol OT" er handelsnavnet som benyttes av Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, for dioktylnatrumsulfosuksinat. "Emulphor

ON 870" er varemerket som benyttes av GAF, New York. De andre reagensene som er benyttet er kommersielt tilgjengelige.

Følgende forkortelser er benyttet i eksemplene:

dl desiliter

ml milliliter

M molar

ituM millimolar

°C grader Celsius

mg milligram

IU Internasjonal enhet

TMB 3,3'-5,5'-tetrametylbenzidin

DHSA 3,5-diklor-2-hydroksybenzen (sulfonsyre)

MBTH 3-metyl-2-benzotiazolinhydrazin

POD peroksydase

AOD alkoholoksydase

Prosentangivelsene som benyttes indikerer vekt i milligram pr. 100 milliliter vanndig oppløsning (% vekt/volum) med mindre annet er angitt.

EKSEMPEL 1

Direkte inkorporering av oppløsning

Det ble gjort forsøk på å inkorporere oppløsningsanalysen for etanol, beskrivet av Phillips Chemical Co. i "Biochemicals Technical Bulletin on Alcohol Oxidase", på en fast forsøks-innretning. Ved analysen følges dannelsen av peroksyd med et indikatorsystem som innbefatter en kromogen indikator og peroksydase.

"Whatman 3MM" filterpapir ble dyppet i en oppløsning hvor det var benyttet enzymkonsentrasjoner sammenlignbare med de som var anvendt ved Phillips-analysen (d.v.s. 5 IU/ml alkoholoksydase i impregneringsoppløsningen) og tørket 10 minutter ved 60°C i en luftfylt ovn.

Oppløsning

Bæreren som var inkorporert på denne måten var hvit av farge. Når den ble bragt i kontakt med en vanndig prøve som inneholdt 100 mg/dl etanol, oppsto det imidlertid ingen tydelig farge-utvikling, d.v.s. at forsøksinnretningen som var fremstilt ved direkte inkorporering av de flytende analysereagensene ikke var tilstrekkelig følsom for etanol til å gi en brukbar forsøks-innretning.

Det ble gjort et andre forsøk på å fremstille en forsøksinn-retning basert på denflytende analysen ifølge Phillips ved å

øke konsentrasjonen av enzymene slik at det ble tilveiebragt en mer følsom påvisning. "Whatman 3MM" filterpapiret ble dyppet i en oppløsning som inneholdt ca. 10 ganger den konsentrasjon av alkoholoksydase og 100 ganger den konsentrasjonen av peroksydase som tidligere var benyttet, og tørket i 10 minutter ved 60°C i en luftfylt ovn.

Oppløsning

Den tørkete bærermatriksen utviklet en svakt rosa farge når den ble bragt i kontakt enten med en blindprøve (utelukkende vann) eller en vanndig prøve som inneholdt 100 mg/dl etanol. Det var meget liten synlig forskjell mellom konsentrasjonene på 0

og 100 mg/dl etanol. Følgelig er forsøksinnretningen fremstilt på denne måten fremdeles ikke tilstrekkelig følsom over for etanol. o-dianisidin antas å være en indikator som ikke har tilstrekkelig følsomhet til å tilveiebringe en påvisningsanordning for 100 mg/dl etanol som utvikler en kolorimetrisk respons på

mindre enn 5 minutter.

En tilsvarende mangel på følsomhet, ble observert med en Phillips-analyse hvor det aldehydet som dannes ved virkningen av alkoholoksydase på etanol følges. Forsøksinnretningene ble fremstilt ved å dyppe "Whatman 3MM" filterpapir i oppløsning 1 eller oppløsning 2 nedenfor. Hver type ble tørket i 10 minutter ved 60°C i en luftfylt ovn.

I oppløsning 2 var konsentrasjonen av alkoholoksydase 20 ganger høyere enn konsentrasjonen i oppløsning 1. Forsøksinnretninger fremstilt i begge de angitte oppløsningene viste ingen reaksjon når det ble bragt i kontakt med en vanndig prøve som inneholdt 100 mg/dl etanol. Dette resultatet var ikke uventet siden den aldehyd-baserte analysen ifølge Phillips krevde en inkubasjons-tid på 1 time for etanol og analyseoppløsning, dette gjør innretningen uegnet for en rask neddyppings- og avlesningspåvisning.

EKSEMPEL 2

Falske positive resultater som dannes dersom konsentrasjonen

av reagensene ved oppløsningsanalysen økes for å tilveiebringe en følsom påvisning

Siden det ble antatt at følsomheten av forsøksinnretningen fremstilt i eksempel 1 overfor 100 mg/dl etanol kunne skyldes indikatoren, o-dianisidin, som ble benyttet ved oppløsningsanalysen ble det utført ytterligere to forsøk. I det første, (I), ble konsentrasjonene av o-dianisidin og alkoholoksydase øket ytterligere; i det andre, (II), ble indikatoren byttet ut med en mer følsom indikator, 3,3<1>,5,5<1->tetrametylbenzidin (TMB).

I.

II.

Første dyppeoppløsning

'0,05 M TMB

"Aerosol O.T." i toluen

Andre dyppeoppløsning

Sammensetning I ble inkorporert på "Whatman 3MM" papir ved dypping. Papiret antok straks en lys brun farge, denne fargen skulle ha vært en indikasjon på tilstedeværelsen av etanol.

Det impregnerte papiret ble tørket i 15 minutter ved 60°C i

en luftfylt ovn. Den brune fargen fortsatte å utvikle seg og ble mer intens med tiden. Når det tørkete papiret ble bragt i kontakt med en vanndig prøve som inneholdt 100 mg/dl etanol, ble det i løpet av mindre enn 5 minutter utviklet en farge som klart lot seg adskille fra den falske positive fargen. Følgelig viste strimlene tilstrekkelig følsomhet, men den falske positive reaksjonen gjorde den uegnet for bruk.

Sammensetning II ble inkorporert på "Whatman 3MM" papir ved en to-trinns impregnering med tørking i den luftfylte ovnen mellom impregneringene. Papiret ble først dyppet i TMB, "Aerosol O.T.", toluenoppløsningen og tørket i 3 minutter ved 60°C. Etter dypping i den andre dyppeoppløsningen som inneholdt alkoholoksydase utviklet strimlene en intens blåfarge. Intensiteten av fargen avtok noe ved tørking, men det tørkete dobbeltimpregnerte papiret var fremdeles klart blågrønt. Selv om strimlene viste en fargeendring som lot seg adskille fra den falske positive fargen på mindre enn 5 minutter når de ble bragt i kontakt med en vanndig prøve som inneholdt 100 mg/dl etanol, gjør den falske positive fargen på ubrukte strimler sammensetningen uegnet for anvendelse.

Strimler med begge sammensetningene viste også en svak økning

i fargeintensiteten når de ble bragt i kontakt med vann.

EKSEMPEL 3

Enkel kromogen komponent

"Whatman 3MM" papir ble inkorporert med forsøkssammensetningen som inneholdt et azid, peroksydase og 3,3<1>,5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) som kromogent indikatorsystem. Den kromogene indikatoren, TMB, ble inkorporert først ved å dyppe papiret i en oppløsning av TMB i toluen som inneholdt 0,5% "Aerosol O.T.". Papiret ble så tørket i en luftfylt ovn ved 60°C i

10 minutter.

Det tørkete papiret ble så dyppet i en oppløsning som inneholdt: Polyvinylpyrrolidon (IC-30)

Det dobbeltimpregnerte papiret ble tørket i 15 minutter ved 60°C. Dette papiret viste ingen farge (falsk positiv farge) før det ble bragt i kontakt med en etanol-holdig prøve.

Et 0,5x0,5 cm stort stykke av det dobbelttørkete og impregnerte papiret ble festet til en bærerdel fremstilt fra et avlangt stykke av stivt ureaktivt materiale som f.eks. polystyren,

som så virker som et håndtak.

Denne sammensetning regnes som den beste kjente fremgangsmåten til fremstilling av en forsøksinnretning som er følsom for minst 100 mg/dl etanol i en vanndig prøve.

Forsøksinnretningen reagerer med denne følsomheten slik at det tilveiebringes en detekterbar kolorimetrisk respons i løpet av 1 til 2 minutter.

EKSEMPEL 4

Forsøksinnretning uten azid

"Whatman 31 ET" papir ble først dyppet i en oppløsning som inneholdt peroksydase, alkoholoksydase og en komponent av en koblet kromogen indikator og tørket i 15 minutter ved 60°C i en luftfylt ovn. Det tørkete papiret ble så dyppet i oppløs-ning 2 og tørket i 5 minutter ved 60°C.

Oppløsning 1

Oppløsning 2

4-aminoantipyrin, 0,02 M, i toluen.

Når en innretning fremstilles uten tilsats av et azid viser papiret en svak farging. Imidlertid forblir komponentene i det vesentlige på den reduserte (ufargete) formen i den endelige innretningen, innretningen er følsom for minst 100 mg/dl etanol i en vanndig prøve, og når den bringes i kontakt med en slik prøve viser innretningen en detekterbar kolorimetrisk respons i løpet av ett til to minutter. En slik innretning er spesielt egnet for en presumtiv påvisning av etanol, hvor tilstedeværelsen av etanol ville indikeres av en sterk "positiv" farge.

EKSEMPEL 5

Separering av kromogene komponenter og azid

Selv om en fast innretning for etanolpåvisning kan fremstilles som angitt i eksempel 4, er det, selv når det benyttes koblete kromogene indikatorer som kan separeres for inkorporering, foretrukket å innbefatte et azid.

"Whatman 31 ET" papiret ble dyppet i oppløsning 1 som inneholdt natriumazid og tørket i en luftfylt ovn i 15 minutter ved 50°C. Det tørkete papiret ble så dyppet i oppløsning 2 og tørket.

Det dobbelttørkete og impregnerte papiret kan kuttes og festes til den ene enden av en bærende del som er formet med et avlangt plasthåndtak som håndteringen enkel.

Oppløsning 1

Oppløsning 2

0,02 M MBTH base i toluen.

Innretninger fremstilt på denne måten viser i det vesentlige ingen farging før det bringes i kontakt med en etanol-holdig prøve, og kan benyttes enten for en presumtiv påvisning eller for kvantitativ bestemmelse av etanol som er tilstede i prøven.

EKSEMPEL 6

Polymerfilm som bærermatriks

En forsøksinnretning som har de angitte egenskapene kan også fremstilles ved å benytte en polymerfilm som bærermatriks under anvendelse av filmsammensetningen som er angitt nedenfor:

Første lag

Andre lag

Lateksen er "Polysar XE 465", en 60:40 styren-butadien kopolymer som inneholder 50% faststoff, fra Polysar Incorporated, Monaca, PA.

"Avicel RC 591-F" er en mikrokrystallinsk cellulose fra FMC Corp., Food and Pharmaceutical Products Div., Philadelphia, PA.

Filmen påføres i to lag ved å benytte en sjaber. En foretrukket filmtykkelse er ca. 30 til 40 mikron, som gir en tørr filmtykkelse på ca. 25-35 mikron. Imidlertid er tykkelsen av filmen ikke kritisk for innretningens funksjonsevne. Filmen kan lufttørkes eller tørkes i en luftfylt ovn ved 60°C i 10 minutter.

EKSEMPEL 7

Faseinversjonsmembranfilm som bærermatriks

En fast forsøksinnretning som er følsom for minst 100 mg/dl etanol og tilveiebringer en kolorimetrisk respons på mindre enn 5 minutter kan også fremstilles ved å benytte faseinver-sjonsmembranfilmer.

En hvit hydrofil membran kan fremstilles på følgende måter: Under meget hurtig omrøring tilsettes oppløsning 2 sakte, (dråpevis), til oppløsning 1. "Uklarhetspunktet" vil nås når tilsatsen er avsluttet. Til denne blandingen tilsettes det langsomt under god omrøring 2,0 g "Cap-o-sil".

Ved å benytte en sjaber bestrykes materialet med 50 um tykkelse på klare bæreelementer av "Trycite". Filmen tørkes ved 75°C

i 8-10 minutter.

Oppløsning 1

Oppløsning 2

Celluloseacetat (viskositet 45) kan tilveiebringes fra Eastman Chemical Products, Inc., Kingspoint, TN. "KP-140" er tri-butoksyetylfosfat, en mykner, tilgjengelig fra FMC Corp., Industrial Chemical Group, Philadelphia, PA. "SMA 2625A" er er styren-maleinsyreanhydrid kopolymer fra Atlantic Richfield Co., Phialdelphia, PA. "Cab-o-sil" er en brent silisium-oksydpolymer som er tilgjengelig fra Cabot Corp., Boston, MA.

Den ferdige hvite, hydrofile membranen impregneres så med et kromogent indikatorsystem. En impregneringsoppløsning kan være 0,05 M 3,3<1->5,5<1->tetrametylbenzidin med 0,5% "Aerosol OT" i toluen. En annen impregneringsoppløsning kan være 0,5% guajakgummi i kloroform (CHCl^). Begge oppløsningene kan impregneres på den fase-inverterte filmen ved hjelp av valse-bestrykning på overflaten av filmen med hastigheter på 3-15 meter pr. minutt. Den fuktete filmen tørkes så ved flamme-punktet for oppløsningsmidlet.

Claims

1. Forsøksinnretning for påvisning av tilstedeværelsen av etanol i en vanndig prøve, karakteriser ved at forsøksinnretningen innbefatter en bærermatriks hvor det er inkorporert alkoholoksydase, et peroksydativt aktivt stoff og et kromogent indikatorsystem som er i stand til å tilveiebringe en detekterbar respons hvor en kromogen komponent av indikatorsystemet i det vesentlige foreligger på redusert form, og alkoholoksydasen er tilstede i en mengde som er tilstrekkelig til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons på tilstedeværelsen av 100 mg/dl etanol i prøven på mindre enn ca. 5 minutter.

2. Forsøksinnretning ifølge krav 1, karakterisert ved at mengden av alkoholoksydase som er tilstede er den mengden som resulterer når det på bæreren inkorporeres en oppløsning som inneholder minst 10 IU/ml alkoholoksydase og sammensetningen tørkes.

3. Forsøksinnretning ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det på bærermatriksen i tillegg inkorporeres et azid.

4. Forsøksinnretning ifølge kravene 1 til 3, karakterisert ved at det på bærermatriksen i tillegg inkorporeres et bufferstoff som er i stand til å tilveiebringe en pH i området fra ca. 5 til 9.

5. Forsøksinnretning ifølge kravene 1 til 4, karakterisert ved at det på bærermatriksen i tillegg inkorporeres et stabiliseringsmiddel.

6. Fremgangsmåte til fremstilling av forsøksinnretningen ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter følgende trinn: (a) fremstilling av en første blanding av en komponent av et kromogent indikatorsystem og et organisk oppløsningsmiddel; (b) fremstilling av en vanndig andre blanding av et peroksydativt aktivt stoff, og eventuelle gjenværende komponenter av det kromogene indikatorsystemet, og alkoholoksydase; (c) impregnering av bærermatriksen med den første eller den andre blandingen og deretter tørking; og (d) impregnering av bæreren med den andre av første og andre blanding og deretter tørking.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den vanndige andre blandingen inneholder minst 10 IU/ml alkoholoksydase.

8. Fremgangsmåte ifølge kravene 6 eller 7, karakterisert ved at det i tillegg innbefattes et azid i den vanndige andre blandingen.

9. Fremgangsmåte ifølge kravene 6 til 8, karakterisert ved at det i den andre vanndige blandingen i tillegg innbefattes et bufferstoff som er i stand til å tilveiebringe en pH i området fra ca. 5 til 9 og eventuelt et stabiliseringsmiddel.

10. Anvendelse av en forsøksinnretning som innbefatter en bærermatriks impregnert med alkoholoksydase, et peroksydativt aktivt stoff og et kromogent indikatorsystem som er i stand til å tilveiebringe en detekterbar respons hvor en kromogen komponent av indikatorsystemet i det vesentlige foreligger på redusert form, alkoholoksydasen er tilstede i en mengde som er tilstrekkelig til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons på nærværet av 100 mg/dl etanol i prøven på mindre enn ca. 5 minutter.