NO172869B

NO172869B - Forsoekspreparat og forsoeksinnretning for visuell bestemmelse av hydrogenperoksyd i en flytende proeve

Info

Publication number: NO172869B
Application number: NO883861A
Authority: NO
Inventors: Steven C Charlton; Elva Kurchacova
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1987-09-11
Filing date: 1988-08-30
Publication date: 1993-06-07
Also published as: DE3885048D1; AU594254B2; AU2195288A; NO883861L; EP0306803A2; DK168024B1; DK501388D0; EP0306803B1; JPH01109261A; IL87438A0; JPH0690199B2; NO172869C; IE61442B1; ATE96178T1; IL87438A; US4855228A; ZA886281B; FI884131A; DK501388A; IE882763L

Abstract

Anvendelsen av et multippelt oksydatlvt indikatorsystem som er istand til å generere forskjellige farger ved forskjellige konsentrasjoner av hydrogenperoksyd, eller ved forskjellige konsentrasjoner av en analyt, hvorfra hydrogenperoksyd genereres ved hjelp av den analyt-spesifike oksydasen er beskrevet. Minst en komponent av det multiple oksydative indikatorsystemet endres fra en spesiell farge til en annen farge ved oksydasjon. En andre indikatorkomponent er istand til å oksyderes til en form som har en farge som er visuelt forskjellig fra den første indikatorkomponenten i enhver av dens former. Forsøkspreparatene er istand til å generere visuelt forskjellige farger ved forskjellige konsentrasjoner av hydrogenperoksyd og kan benyttes for å generere en "regnbue" i et oksydatlvt system.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt forsøkspreparater for visuell bestemmelse av hydrogenperoksyd og, spesielt, forsøkspreparater og forsøksinnretninger som er istand til å generere forskjellige fargetoner ved forskjellige konsentrasjoner av hydrogenperoksyd.

Kolorimetriske forsøk anvendes hensiktsmessig som visuelle påvisninger hvormed relativt utrenet personell rutinemessig kan oppnå resultater ved enkel sammenligning med et egnet fargekart. Visuelle påvisninger er billige og hensiktsmes-sige idet ingen instrumentering er påkrevet. I dag anvendes visuelle tester for rutinemessig undersøkelse av urinprøver med hensyn på et antall diagnostisk viktige analytter. F.eks. anvendes slike tester av diabetikere for hjemmeunder-søkelse av urin eller blodglukose, og visuelle tester anvendes også innenfor andre felter, innbefattende vann-undersøkelse med henblikk på jerninnhold. Mange slike tester er basert på deteksjonen av hydrogenperoksyd i nærvær av peroksydase og en oksydativ indikator.

De i dag tilgjengelige testene relaterer ofte intensiteten av en spesiell farge med konsentrasjonen av analytt. F.eks. kan en forsøksinnretning endres fra fargeløs til lys blå, til mørkere nyanser av blått med økende konsentrasjon av glukose. Lettere visuell adskillelse, og derfor større nøyaktighet, er mulig når et område av farge tilveiebringes fremfor forskjellige toner eller intensiteter av en enkelt farge. Derfor vil et forsøkspreparat som viser forskjellige farger ved forskjellige analyttkonsentrasjoner være enklere å benytte, og gi mer nøyaktige visuelle resultater.

Preparatene ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et nyttig oksydatlvt indikatorsystem, og er spesielt nyttige for den visuelle bestemmelsen av klinisk viktige analytter, så som glukose og kolesterol, når en oksydase som er spesifikk for analytten av interesse tilsettes.

Mange systemer har vært angitt for den kolorimetriske bestemmelsen av hydrogenperoksyd eller analytter som kan bestemmes ved anvendelsen av hydrogenperoksyd-genererende systemer. På grunn av betydningen av bestemmelsen av glukose, beskriver mange av deteksjonssystemene en glukoseoksydase med et peroksydase/oksydativt indikatorsystem, for å tilveiebringe et kolorimetrisk resultat. Omfanget av litteraturen og patentene innenfor området kolorimetrisk undersøkelse basert på bestemmelsen av hydrogenperoksyd, indikerer at betydelig tid, anstrengelse og ekspertise har vært anvendt for å tilveiebringe bedre visuelle tester for befolkningen.

TJS-PS 4 132 527 er representativt for patenter som beskriver anvendelsen av multiple oksydative indikatorer. Imidlertid oksyderes hver av indikatorene til en form som har en klar, synlig farge. Fargen som fremtrer for brukeren er summen av fargene for de oksyderte indikatorene. Derfor blir den tilsynelatende fargen av det omsatte preparatet eller båndet mørkere og mørkere med økende konsentrasjon av analytt.

US-PS 4 234 313 beskriver et forsøkspreparat for bestemmelsen av urinsyre som anvender et indikatorpreparat som mister farge med økende mengde urinsyre tilstede. Det foretrukne indikatorsystemet er en kompieksdannet jodkilde, stivelse-12, som er blå og mister farge med økende mengde urinsyre. Det angis videre at andre forbindelser kan benyttes, idet det f.eks. hevdes "visse fargede forbindelser undergår en irreversibel endring eller et tap av farge ved oksydasjon, ved dannelsen av fargeløse produkter", ingen eksempler på indikatorer som blir fargeløse ved oksydasjon er angitt.

I tillegg har det vært beskrevet visse systemer basert på genereringen av en farget indikator hvori en andre komponent reagerer med den oksyderte formen (fargede) av indikatoren, derved reduseres den oksyderte indikatoren tilbake til den fargeløse formen. TJS-PS 4 042 329 beskriver et slikt system hvor indikatoren oksyderes fra en fargeløs form til en farget form, men kan ikke reduseres tilbake til den fargeløse formen ved hjelp av et titreringsmiddel. Bare når konsentrasjonen av analytt er større enn konsentrasjonen av titreringsmiddel er farge synlig.

I TJS-PS 3 008 879 beskrives et system for bestemmelsen av glukose med et enzymsystem bestående av glukoseoksydase og peroksydase, et primært indikatormateriale som er oksydert til dets fargede form i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase, og en andre indikator som oksyderes ved den fortrinnsvis oksyderte primære indikatoren og antar sin egen spesielt fargede form, slik at det produseres en blandet farge. De fortrinnsvis oksyderte primære indikatormaterialer kan følgelig delvis eller fullstendig vende tilbake til den reduserte eller fargeløse formen.

Tysk patent nr. DE 32 47 894 beskriver et reduktivt testsys-tem og en fremgangsmåte for bestemmelse av redusert nikotin-adenin dinukleotid, som gir et utvidet måleområde for bestemmelsen av NAD(P)H eller substrater eller enzymer som reagerer under dannelse eller forbruk av NAD(P)E. Systemet er kjennetegnet ved at det samtidig inneholder flere stoffer med forskjellige elektrokjemiske potensialer, som fungerer uavhengig av hverandre som elektronakseptorer for NAD(P)H. Det omtalte systemet innbefatter anvendelsen av diklorin-dofenol som er blått i den oksyderte formen, den ureagerte formen i et reduktivt system, og fargeløst i den reduserte formen, den reagerte formen i et reduktivt system. Oksydative indikatorsystemer nevnes ikke, og det gis ingen eksempler på slike.

Ingen av referansene beskriver eller foreslår anvendelsen av multiple oksydative indikatorer, som hver er reaktiv direkte med hydrogenperoksyd i nærvær av peroksydase, hvorav minst en mister sin farge ved oksydasjon.

Oppfinnelsen vedrører et forsøkspreparat for visuell bestemmelse av hydrogenperoksyd i en flytende prøve, innbefattende et preparat som har en første farge før kontakt med en flytende prøve, og en endelig farge etter kontakt med den flytende prøven, hvori den endelige fargen er visuelt forskjellig fra den første fargen, og avhenger av konsentrasjonen av hydrogenperoksyd i den flytende prøven. Forsøks-preparatet er kjennetegnet ved at det innbefatter:

a) et peroksydativt aktivt stoff; og

b) et multippelt oksydatlvt indikatorsystem, hvilket

multiple indikatorsystem består av minst en første og en

andre oksydativ indikatorkomponent, som hver bare oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og det peroksydativt aktive stoffet;

hvor den første indikatorkomponenten oksyderes fra en første farge til i det vesentlige fargeløst, og den andre indikatorkomponenten oksyderes til en endelig farge som er visuelt forskjellig fra den første fargen, samt eventuelt

en tredje oksydative indikator som er istand til å oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd, og den peroksydativt aktive komponenten, slik at det tilveiebringes en kolorimetrisk respons.

Oppfinnelsen vedrører videre en forsøksinnretning for bestemmelsen av hydrogenperoksyd, kjennetegnet ved at den innbefatter:

a) en bærermatriks; og

b) inkorporert i bærermatriksen et forsøkspreparat bestående

av peroksydase og et multi-oksydativt indikatorsystem,

hvilket indikatorsystem består av minst en første og en andre oksydative indikatorkomponent, begge istand til å oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase;

hvor den første indikatorkomponenten er istand til å oksyderes fra en form som har en farge til en andre form som har en annen farge, og den andre indikatorkomponenten er istand til å oksyderes til en form som har en farge som er

visuelt forskjellig fra den andre formen av den første

indikatoren;

i

hvorved den endelige fargen for det omsatte preparatet tilveiebringer forskjellige synlige farger ved forskjellige konsentrasjoner av hydrogenperoksyd.

I foretrukne systemer oksyderes indikatorkomponentene trinnvis slik at det tilveiebringes en serie av adskilte farger (dvs. en "regnbue"). Analytter av spesiell diagnostisk interesse, så som glukose, kan bestemmes ved tilsats av en oksydase som er spesifikk for denne analytten, hvilken oksydase er istand til å generere hydrogenperoksyd i nærvær av analytten. Preparatet kan inkorporeres i en bærer, slik at det tilveiebringes et reagensbånd i tørr fase. An-bringelse av indikatorene i forskjellige avdelinger i forskjellige lag, kan forbedre differensieringen mellom farger som observeres ved forskjellige konsentrasjoner av hydrogenperoksyd.

Visuell fargesammenligning er hensiktsmessig og kan tilveiebringe en akseptabel, nøyaktig bestemmelse av analyttkon-sentrasjon, uten behov for dyr instrumentering. Vanligvis sammenlignes "fargen" av den omsatte forsøksoppløsningen eller forsøksbåndet ved hjelp av øyet, med firkanter av farge trykket på et fargekart. Sammenligningen kompliseres ved mange faktorer: forskjellig visuell oppfatning av farge fra en person til en annen, lysforhold og forskjellen mellom fargene på et tørt trykket farge- eller merkekart, og fargene som observeres på et omsatt, (dvs. vått) papir, eller et filmtestbånd. Imidlertid er hovedkomplikasjonen at farge-firkantene ofte viser forskjeller av lyshet eller intensitet av en enkelt "farge".

Selv om "farge" er en vanlig brukt betegnelse, kan farge nedbrytes i komponenter så som metning, lyshet og nyanse. Nyanse betegnes ofte som "farge", f.eks. om noe "ser" blått, rødt eller gult ut. Gjennom beskrivelsen skal betegnelsen "farge" benyttes for å gjøre beskrivelsen klarere. Oppfinnelsen omfatter endringer i farge, ikke utelukkende endringer i lyshet eller metning av en enkelt fargetone.

Generelt er en farge forbundet med en form av en enkelt indikator. For derfor å generere et område av farger, er et antall forskjellige indikatorsystemer eller flere former av en enkelt indikatorkomponent påkrevet. Imidlertid blir den endelige fargen av det typiske forsøkspreparatet eller —innretningen stadig mørkere, idet den beveger seg mot sort, ettersom flere farger produseres, med mindre det finnes en fremgangsmåte for fjernelse av en farge. En stor forbedring ved tilveiebringelse av visuelt adskilte farger er funnet ved å anvende minst en indikatorkomponent som taper sin farge ved oksydasjon. Tap av farge innbefatter både tilfeller hvor den oksyderte formen av indikatoren er farget, men av en annen farge enn den uoksyderte indikatoren, og tilfellet hvor den oksyderte formen er fargeløs. Betegnelsen "fargeløs" er her definert slik at den betyr uten synlig farge, og uttrykket "tilnærmet fargeløs" er definert slik at det betyr en så svak farge at fargen av indikatoren ikke effektivt bidrar til den tilsynelatende fargen av forsøkspreparatet.

Forsøkspreparatene som her er beskrevet er nyttige for bestemmelse av hydrogenperoksyd. Preparatene kan anvendes med instrumenter som kan anvende flere bølgelengder. Imidlertid er de spesielt nyttige og utelukkende utformet for visuell påvisning. Forsøkspreparatene består av et peroksydativt aktivt stoff og multiple oksydative indikatorsystemer .

Det multiple oksydative indikatorsystemet består av minst to oksydative indikatorkomponenter. En oksydativ indikator er definert som en som er istand til å oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og et peroksydativt aktivt stoff. Forsøks-preparatet består av et peroksydativt aktivt stoff og en første og en andre indikatorkomponent, hver i den reduserte formen og hver istand til å oksyderes slik at det produseres en detekterbar respons. Den første indikatorkomponent (redusert) har en farge og er istand til å oksyderes til en form som har en annen farge (innbefattende fargeløs). Den andre indikatorkomponenten (redusert) er istand til å oksyderes til en form som har en farge som er visuelt forskjellig fra den tilsynelatende fargen av den første indikatoren, oksydert eller uoksydert. Dersom f.eks. den første indikatorkomponenten (redusert) er blå, og den andre indikatorkomponenten (redusert) er fargeløs, er den tilsynelatende fargen av det ureagerte forsøkspreparatet blå. Etter kontakt mellom forsøkspreparatet og prøven, oksyderes begge indikatorene dersom hydrogenperoksyd er tilstede, og det vil oppstå en annen farge enn blå avhengig av konsentrasjonen av hydrogenperoksyd (eller analytt), i rekkefølgen av indikatorreaksjonene og konsentrasjonen av indikatorkomponentene relativt til konsentrasjonen av hydrogenperoksyd.

Dersom reaksjonene er trinnvise og konsentrasjonen av hydrogenperoksyd er tilstrekkelig til å oksydere alle indikatormolekyler, slik at den første indikatorkomponenten Ci (redusert) oksyderes fullstendig, eller i det vesentlige fullstendig, før den andre indikatorkomponenten C2 (redusert) oksyderes; kan en dramatisk fargeendring opptre. Dersom f.eks. Ci (blå) oksyderes til C'j (fargeløs), og C£ (farge-løs) oksyderes til C2' (rød), er den tilsynelatende fargen av forsøkspreparatet blå, og den tilsynelatende fargen etter reaksjonen er rød. Dette vil gi en distinkt endring i farge fra blå til rød, som langt lettere kan følges av brukeren enn forskjellige toner av blått. Ved lavere konsentrasjoner av hydrogenperoksyd kan den tilsynelatende fargen av det reagerte forsøkspreparatet være fargeløs. Dersom reaksjonene for indikatorene overlapper hverandre til en viss grad, f.eks. dersom ikke alt av den første indikatorkomponenten oksyderes før oksydasjonen av den andre indikatorkomponenten begynner, vil det oppstå en blanding av oksyderte og reduserte indikatorkomponenter ved visse konsentrasjoner av hydrogenperoksyd, slik at det produseres en purpurfarge eller en annen farge. Flere farger kan produseres ved anvendelse av ytterligere indikatorkomponenter, som hver er istand til å oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd slik at det produseres en detekterbar endring i den tilsynelatende fargen av det omsatte forsøkspreparatet.

Hver indikatorkomponent kan være en enkelt forbindelse eller et par av forbindelser som danner et koblet indikatorpar. Valget av den første oksydative indikatoren er spesielt viktig. Antallet indikatorer som taper farge ved oksydasjon er langt mer begrenset enn antallet indikatorer som blir fargeløse ved reduksjon, fordi oksydasjonen normalt øker konjugeringen av en indikator, denne økningen er vanligvis forbundet med nærværet av farge. Imidlertid er antallet fargestoffer som er tilgjengelige enormt, og vokser stadig. Med kjennskap til de spesielt fordelaktige resultatene som kan oppnås med slike indikatorer, og med de retningslinjer som her angis, kan mange flere slike indikatorer finnes.

"Acid Black no.l", 4-amino-5-hydroksy-3-(p-nitrofenylazo)-6-(fenylazo)-2,7-naftalendisulfonsyre, dinatriumsalt, (struktur vist nedenfor) er en spesielt foretrukket første oksydativ indikatorkomponent.

Denne forbindelsen er blå i den reduserte formen og fargeløs i den oksyderte formen. Ved siden av "Acid Black no. 1" er det funnet flere andre indikatorer som blir så nært fargeløse ved oksydasjon at bidraget av fargen i den oksyderte formen, selv om det er synlig som en meget svak farge dersom den oksyderes alene, ikke bidrar til fargen av det omsatte forsøkspreparatet. Blant disse er "Nitro Red", "Acid Orange 8", "Acid Red no 1", og "Acid Red no. 4". Fargene av de reduserte og oksyderte formene er vist i tabell I. Struk-turene av alle disse indikatorene er vist i forkortelsesdelen av eksempelbeskrivelsen.

Strukturen av egnede forbindelser som blir fargeløse ved oksydasjon inneholder vanligvis en naftalenring med en diazogruppe orto-stilt til en fenol eller amingruppe som vist nedenfor.

hvor

M er H, OH, NE2 eller NH acetyl;

P er NH2 eller OH;

Zi og Z2 er uavhengig av hverandre valgt fra H eller -SO3H eller salt derav;

Y er H eller en substituert fenyl azoring; og

Z er H eller en substituert med OCH3 eller N02 som foretrukne. -N02 er spesielt foretrukket.

For "Acid Black no 1" er M OH, P er NH2, X er N02, Zj og Z2 er NaS03~ og Y er en fenylazoring.

Andre indikatorer som blir tilnærmet fargeløse ved oksydasjon, så som "Acid Yellow no 34" kan også benyttes.

Fargen av et indikatorsystem kan avhenge av pH-verdien. Det er derfor ved visse tilfeller ønskelig å kontrollere pH av forsøkspreparatet ved å tilsette et bufferstoff.

Forbindelsene som er tilgjengelige som den andre, evt. tredje og fjerde, indikatorkomponenten er en meget stor gruppe. Indikatorer som viser en endring i farge ved oksydasjon innbefatter enkle og koblede indikatorer. Disse kan innbefatte indikatorer som oksyderes fra fargeløst til en form som har en klar farge, hvilket utgjør hovedmajoriteten av oksydative indikatorer, såvel som indikatorer som oksyderes fra en farge til en annen (fargeendringsindi-katorer). Eksempler på den enkle indikatortypen innbefatter 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin, o-toluidin og guajakgummi; nyttige koblede indikatorer innbefatter 4-aminoantipyrin med 2-metylindol, 4,5-diklor-2-hydroksybenzen-sulfonat (DCHBS) eller CNSP.

En endring av farge fra en fargeløs redusert form til en oksydert form som har en intens primærfarge, så som gul, rød eller blå, er foretrukket som en andre indikatorkomponent. Mest foretrukket er et forsøkspreparat innbefattende en første indikator som er istand til å oksyderes fra blå til fargeløs, og andre og tredje indikatorer som er istand til å oksyderes fra fargeløs til gul og fargeløs til rød. En oksydativ regnbue produseres ved et forsøkspreparat som er blått i ureagert tilstand, og som har tilsynelatende farger av grønn, gul, orange og rød, ved på forhånd bestemte konsentrasjoner av hydrogenperoksyd.

Det peroksydativt aktive stoffet i forsøkspreparatet er fortrinnsvis peroksydase oppnådd fra naturlige kilder, så som pepperrot og potet. Andre stoffer som har peroksydativ aktivitet innbefatter uorganiske forbindelser som har peroksydaseaktivitet, så som blandinger av kaliumjodid og natriummolybdat, såvel som andre jodider, så som natrium og ammoniumjodider, og andre molybdater, så som kalium og ammoniummolybdater, kan benyttes. I tillegg kan urohemin og et antall andre porfyrinstoffer som har peroksydativ aktivitet benyttes. Forskjellige kompleksdannende forbindelser som aktiverer metalloporfyriner, men som ikke er operable per se kan benyttes med disse, så som 2-aminobenzotiazol, pyridin, bipyridyl, bipyridylpyridin, nikotinsyre e.l. Andre stoffer som ikke er enzymer, men som har peroksydativ aktivitet, innbefatter slike forbindelser som jernsulfo-cyanat, jerntannat, jernferrocyanid, kaliumkromsulfat o.l.

Ytterligere komponenter så som buffere, overflateaktive midler og stabilisatorer kan også tilsettes til preparatet. pH, og derfor tilsatsen av bufferstoffet, kan bestemme fargen av en spesiell form av en indikatorkomponent. F.eks. oksyderes "Acid Orange 8" fra orange til en blek, stråfarge ved pH 7,5, men oksyderes til en "blek" gulfarge ved pE 9,5. "Nitro Red" oksyderes fra purpurfarget til svakt brunt ved pH 7,5, men oksyderes til svakt blåbrunt ved pE 9,5. En pH-verdi kan være mer ønskelig enn en annen, for å produsere det ønskede området av farger. Mange bufferstoffer er kjente for fagmannen og kan benyttes, under forutsetning at de ikke interfererer med virkningene av peroksydase og hydrogenperoksyd for oksydasjon av indikatorkomponentene.

Forsøkspreparatet kan også benyttes for å bestemme mange analytter av diagnostisk interesse med tilsats av en oksydase som er spesifikk for den analytten og som er istand til å produsere hydrogenperoksyd i nærvær av denne analytten. En liste over spesielt interessante analytter, og deres tilsvarende oksydaser, er vist i tabell II nedenfor.

Andre komponenter kan være påkrevet som tilleggskomponenter for forsøkspreparatet. Imidlertid er disse reaksjonene og deres anvendelse i forsøkspreparater og forsøksinnretninger i tørr fase velkjent innen teknikken. Den foretrukne pH-verdien for forsøkspreparatet er ofte bestemt av pH-verdien som er påkrevet for oksydaseenzymet. Fra dette utgangspunktet må egnede oksydative indikatorkomponenter deretter velges for å gi de ønskede endringene i farge.

Preparatet kan være oppløst for å tilveiebringe en forsøks-oppløsning eller inkorporert i en bærermatriks, slik at det tilveiebringes en forsøksinnretningsutførelse. Utførelsen kan enten detektere nærværet av hydrogenperoksyd i en kroppsvæske eller kan detektere nærværet av en annen analytt av interesse, når komponentene tilsettes til forsøksprepara-tet for å produsere hydrogenperoksyd fra denne analytten.

En hensiktsmessig fremgangsmåte for fremstilling av en forsøksoppløsning kan finnes i eksemplene. Hver komponent oppløses i en separat oppløsning av hver indikatorkomponent, eller hver del av et koblet par fremstilles. En enzym-oppløsning inneholdende peroksydase og den egnede oksydasen fremstilles. Porsjoner av hver indikator og enzymoppløsning kombineres deretter, slik at forsøksoppløsningen tilveiebringes .

Avbalanseringen av konsentrasjonene av indikatorkomponentene vil avhenge av konsentrasjonsområdet for analytten som skal bestemmes, og de på forhånd bestemte konsentrasjonspunktene som er mest nyttige. F.eks. vil det være foretrukket å fremstille en farge for et meget lavt nivå av analytt (blå), grønn ved det "normale" kliniske området, og rød eller orange ved høye eller farlige nivåer. Dette kan utføres ved rutinemessig eksperimentering på bakgrunn av foreliggende beskrivelse og med rettledningen som er tilveiebragt i eksemplene. I tillegg til den letthet hvormed en utrenet legmann kan bestemme resultatene av en spesiell test, foreligger den fordelen at en lege kan bygge på endringene i farge for å forenkle instruksjonene overfor legmannen.

Forsøkspreparatet kan tilveiebringes som et forsøkssett bestående av en oppløsning eller serier, av oppløsninger som skal blandes. Imidlertid er reagensbånd i tørr fase velkjente, og gir en nyttig utførelse. Bærermatriksen som anvendes for å fremstille et tørt reagensbånd kan være en av flere som er kjente innen industrien, så lenge matriksen kan inkorporeres med preparatet og ikke påvirker reaksjonene som er påkrevet for dannelsen av farge. Disse innbefatter papir; filmer så som de som er fremstilt fra naturlige polymerer, latekser, polyuretaner, silikoner eller kombinasjoner av disse; og membraner, så som mikroporøse membraner som de som fremstilles ved koaguleringsteknikker fra polyuretan.

På forhånd fremstilte bærere, så som papir, kan inkorporeres med forsøkspreparatet ved spraying, trykking eller dypping. Sistnevnte er foretrukket og betegnes vanligvis som impregnering. Membraner kan også inkorporeres med forsøkspreparatet

(preparatene) ved disse teknikkene. Disse membranene har i tillegg den fordelen at en eller flere av komponentene kan tilsettes når membranen fremstilles, slik at det tilveiebringes en uniform fordeling i membranen. Det er vanligvis foretrukket å tilsette en eller flere av indikatorene under fremstillingen av membranen, deretter å tilsette de andre komponentene, så som enzym og buffere, ved inkorporering, fortrinnsvis ved impregnering.

En papir— eller membranbærer kan monteres på et stivt baksidelag eller bærerelement, med dobbeltsidig klebemiddel. Membranene eller filmene kan også dannes direkte på en bærer. Slike bærere er ofte vann-ugjennomtrengelige stive polymer-filmer, så som polyetylentereftalat, polystyren, polyester e.l. Bæreren danner et hensiktsmessig håndtak for brukeren, siden reagensarealet som er påkrevet for slike påvisninger er meget lite. Baksidelaget kan være opakt eller transpa-rent, selv om et opakt, hvitt baksidelag er foretrukket, for visuelt avleste tester. Ytterligere lag kan tilsettes til forsøksinnretningen for å tillate avsøking eller fjernelse av røde blodceller fra overflaten før avlesning. Dette kan oppnås ved polymerbelegging, eller ved tilsatsen av et lag som filtrerer de røde blodcellene som kan tørkes av, eller laget selv kan fjernes.

Indikatorkomponenter kan være isolert i separate lag av en flerlags forsøksinnretning. Slike lag kan fremstilles ved . kjente teknikker, enten for papir, membraner eller filmer. Dette kan gi ytterligere fargedifferensiering, og kan tilveiebringe en hensiktsmessig fremgangsmåte for å kontrollere rekkefølgen av utvikling av farger i den endelige innretningen. Flerlags gelatinfilm matrikser er funnet å være spesielt nyttige for dette formålet.

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer tilstrekkelig informasjon til å fremstille forsøkspreparater eller forsøksinnretninger for bestemmelse av hydrogenperoksyd eller diagnostiske analytter som vil generere visuelt distinkte farger ved forskjellige konsentrasjoner av hydrogenperoksyd. Hydrogenperoksydet kan genereres ved et oksydasesystem fra mange analyttter av klinisk interesse. Oppfinnelsen krever anvendelse av minst to indikatorkomponenter. Den første indikatorkomponenten må miste sin farge ved oksydasjon, enten til en fargeløs form eller i det minste til en annen farge. Den andre indiaktorkomponenten må også endre farge, f.eks. gå fra en fargeløs redusert form til en oksydert form som har en distinkt, relativt intens farge. Fargene som kan genereres er like varierte som antallet oksydative indikatorforbindel-ser som er tilgjengelige. Den endelige tilsynelatende fargen av preparatet vil også avhenge av de relative konsentrasjonene av indikatorkomponentene. Dette faktum kan anvendes for å forskyve området av tilgjengelige farger og analyttkon-sentrasjonene når en endring i farge er åpenbar.

Oppfinnelsen skal i det følgende beskrives nærmere ved hjelp av eksempler.

Eksempler

Forkortelser

HEPES buffer, N-2-hydroksyetyl-piperazin-N'--2-etansulfonsyre

TAPSO buffer, 3-(N-tris(hydroksymetyl)metyl-amino)_2-hydroksypropansulfonsyre TRIS buffer, tris(hydroksymetyl)aminometan (tris)2S04 Tris-buffer innstilt på den gitte pH-verdien med svovelsyre

"Triton X-100" Overflateaktivt middel, polyok-syetyleneter tilgjengelig fra Sigma Chemical Co.

U Internasjonale enheter, et mål for enzymaktivitet (en U er enzymaktivi-teten som er påkrevet for å kataly-sere omvandlingen av et mikromol sub-strat pr. min. under spesifiserte

betingelser for temperatur og pH)

Me Metyl

POD Peroksydase

GO Glukoseoksydase

AOD Alkoholoksydase

PET Polyetylentereftalat

dl deciliter

ml milliliter

jjl mikroliter

g gram

jj mikro

RT Romtemperatur, vanligvis 25"C

MW Molekylvekt

qs Tilsatt for å gi volumet.

I tabellene

(j) Visuelt distinkt farge Visuelt ikke-adskillbar farge.

Fargeforkortelser

OR Orange

R Rød

Pk Rosa

Bl Blå

Br Brun

Gn Grønn

Gr Grå

Mau Grålilla

Y Gul

L Lys.

Forbindelsesforkortelser

4AP 4-aminoantipyrin

DCEBS 3,5-diklor-2-hydroksy-benzensulfonat.

Indikatorer

"Nitro Red" (forbindelse 4)

"Acid orange 8" (forbindelse 6) "Acid Red 1" "Acid Red 4" "Acid Yellow 34" "CBSO (RNG-3608)" - 3-karboksy-4-[4"-(2"-N-4-(2 *'•,4'•'-bis-tert .-amyl-fenoksy)butylkarbamoyl)-l"-hydroksynaf tyloksy-fenylazo]-l-sulfofenyl-5-pyrazolon.

l-(4-fenoksy-3-sulfofenyl )-3( oktadecamido ) -5-pyr az ol on

(forbindelse 7)

N,N-dietyl-p-fenylendiamin (forbindelse 1) l-hydroksy-4-(2 ' -N' -tolyl-N-sulfamoylamin )fenylazo-2-N-(2"-N"-metyl-N"-oktadecyl)fenylnaftoamid (forbindelse 2).

N-[2'-oktadecyloksy-5-(N-metylsulfamoyl)]fenyl-2-(4-metoksy)-benzoylacetanilid (forbindelse 3)

Eksempel 1

Generering av forskjellige farger ved reaksjon med hydrogenperoksyd.

To forsøkspreparater ble fremstilt med forskjellige multiple oksydative indikatorsystemer, disse var istand til å generere forskjellige farger som respons på økende konsentrasjoner av hydrogenperoksyd. Forsøkspreparatene ble undersøkt som oppløsninger med tilsats av hydrogenperoksyd. For å lette fargesammenligningen, ble en porsjon (30 pl) av den omsatte oppløsningen påført på enkelt hvitt papir. Sluttpunktet ble nådd i løpet av 2-4 minutter.

A. Et multi-oksydativt indikatorsystem ble fremstilt ved anvendelse av "Nitro Red" som den første indikatorkomponenten som endres fra en farget form til en fargeløs form, og 2-amino-3-hydroksy-5-brompyridin som den andre indikatorkomponenten. "Nitro Red" oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase fra purpurfarget til meget svakt blått/brunt. Selv om den oksyderte formen kan ses dersom den første indikatorkomponenten oksyderes av seg selv, er fargen som produseres så svak at den bidrar lite, om noe, til synlig farge i et multi-indikatorsystem. Den andre indikatorkomponenten oksyderes fra fargeløs til sterk gult.

Oppløsninger av disse to forbindelsene ble fremstilt for analysen av hydrogenperoksyd. (Tabell 1). Forsøksoppløsnin-gene inneholdt også en buffer, (tris)2S04, o,l M pH 8,5, og peroksydase (200U/ml). Hydrogenperoksyd ble tilsatt til porsjoner av forsøksoppløsninger og etter at sluttpunktet var nådd i løpet av 2-4 minutter, ble 30pl av hver oppløsning påført på et rent stykke absorberende filterpapir, slik at fargene som ble dannet kunne sammenlignes.

Med disse oppløsningene kan det observeres et område av farger som svarer til økende konsentrasjoner av hydrogenperoksyd, dvs. blått ved lav konsentrasjon, grønt ved mellomliggende konsentrasjon, gult ved høy konsentrasjon. B. Et andre multi-oksydativt indikatorsystem ble fremstilt ved anvendelse av "Acid Orange 8" (forbindelse 6) som den første indikatorkomponenten og forbindelser 1 og 7, et komplett indikatorpar, som danner den andre indikatorkomponenten. "Acid Orange 8" (forbindelse 6) oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase fra sterkt orange til en meget svakt gul farge eller stråfarge. Selv om fargen av den oksyderte formen kan oppfattes visuelt dersom den oksyderes alene og plasseres nær en hvit bakgrunn, er fargen så svak at den gir lite, om noe, visuelt bidrag i kombinasjon med andre fargede indikatorer. Forbindelse 7 oksyderes i nærvær av forbindelse 1, hydrogenperoksyd og peroksydase fra en fargeløs form til magentarød. Forsøksoppløsningene ble fremstilt og undersøkt som angitt i del A. Resultatene er angitt i tabell 2 nedenfor. Tilsvarende differensiering ble oppnådd, selv om de endelige fargene var forskjellige.

Eksempel 2

Multifarge- generering for bestemma!se n av glukose.

Det ble fremstilt en forsøksinnretning for bestemmelsen av glukose som var istand til å generere forskjellige farger ved forskjellige konsentrasjoner av glukose ved anvendelse av glukoseoksydase som det hydrogenperoksyd-genererende systemet.

Forsøksoppløsningen innbefattet glukoseoksydase (50 U/ml), peroksydase (50 U/ml), TAPSO (pH 8,5, 20mM) og polyvinylalko-hol (88$ hydroLysert, 10 000 MW, 1,5 vekt-#) og forbindelser 1, 2 og 3 som indikatorkomponenter. Forbindelse 2 (rød-rosa) genererer, når den kobles oksydativt med forbindelse 1, via virkningen av hydrogenperoksyd og peroksydase, en "cyan"-farge. På samme måte gir forbindelse 3 (fargeløs) gult når den kobles oksydativt med forbindelse 1. Forholdene mellom indikatorkomponenter som ble benyttet er vist i tabell 3.

"Whatman el ET" filterpapir ble dyppet 1 oppløsningene ovenfor og tørket. Papiret ble skåret i bånd og undersøkt med glukoseoppløsninger, buf ret med (tris^SC^, 0,1 M, pH 8,5.

Sluttpunktfarger ble oppnådd i løpet av ca. 10 minutter, og er også vist i tabellen.

De dannede fargene kan endres ved å variere forholdet mellom forbindelser 2 og 3, ved et nivå på 1 jjM kan f.eks. fargen som genereres være OR-PK, OR, OR-Br eller Gn-Mau. Ved å tilsette en ytterligere indikator adderes fargene orange, lys brun og brun. Det siste forsøket vist i tabell 3 er en kontroll.

Forsøket viste at forskjellige farger kan genereres som kan relateres med den økende konsentrasjonen av glukose i en prøve. Disse fargene kan lettere adskllles enn variasjoner i intensitet eller gradering av den samme fargen. Høye konsentrasjoner kan lettere bestemmes siden de tilsynelatende fargene ikke er blitt så mørke at de ikke kan adskilles visuelt.

Eksempel 3

Regnbue- generering for bestemmelsen av glukose.

"Acid Black no 1" er et foretrukket første indikatorsystem fordi den er blå i den reduserte formen, og fargeløs når den oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase. Denne forbindelsen skapte utgangspunktet for et multi-indikatorsystem istand til å produsere regnbuens farger, med økende konsentrasjoner av glukose. Dette resultatet er spesielt foretrukket fordi genereringen av distinkte farger, blått til grønt til rødt, tilveiebringer den størst mulige visuelle adskillelsen for diabetikere.

Forsøkspreparatet ble sammensatt med en første Indikatorkomponent, "Acid Black no 1", en andre indikatorkomponent, 3,5-diklor-2-hydroksybenzensulfonat (DCHBS) og 4-aminoantipyrin (4-AP); og en tredje indikatorkomponent, 2-metylindol og 4-aminoantipyrin. Endringene i farge tilgjengelige fra disse indikatorene ved oksydasjon er vist nedenfor.

Et forsøkspreparat ble fremstilt som følger:

Sammensetning nr. 1.

Sammensetning nr. 2.

Sammensetning nr. 3.

Frem<g>an<g>småte:

100 jai av sammensetning nr. 3 ble blandet med 100 pl av en vandig oppløsning inneholdende forskjellige konsentrasjoner av glukose. Etter to minutter ble fargen av forsøks-oppløsningene bestemt ved å plassere en porsjon av hver oppløsning på et stykke filterpapir.

Ved økende konsentrasjoner av glukose ble distinkte farger (blå, grønn, orange) produsert.

B. En andre serie av oppløsninger ble fremstilt basert på sammensetningene nr. 1 og 2 ovenfor, og en annen tredje indikatorkomponent, CNSP. Denne indikatoren endres fra gul i den reduserte formen til rød i den oksyderte formen. Derfor var fargen av preparatet når ingen glukose var tilstede grønn, og fargene generert ved oksydasjon var forskjellige fra de som ble observert i eksempel 3A. Imidlertid ble visuelt distinkte farger også oppnådd ved hjelp av dette preparatet.

Sammensetning nr. 4.

Fremgangsmåte:

100 ml av sammensetning nr. 4 ble blandet med 100 pl av en vandig oppløsning inneholdende forskjellige konsentrasjoner av glukose. Etter 1-2 minutter ble fargen av oppløsningene bestemt som i del A.

Igjen ble det dannet lett adskillbare farger over et vidt konsentrasjonsområde for glukose.

Claims

1. Forsøkspreparat for visuell bestemmelse av hydrogenperoksyd i en flytende prøve, innbefattende et preparat som har en første farge før kontakt med en flytende prøve, og en endelig farge etter kontakt med den flytende prøven, hvori den endelige fargen er visuelt forskjellig fra den første fargen, og avhenger av konsentrasjonen av hydrogenperoksyd i den flytende prøven, karakterisert ved at det innbefatter: a) et peroksydativt aktivt stoff; og b) et multippelt oksydativt indikatorsystem, hvilket multiple indikatorsystem består av minst en første og en andre oksydativ indikatorkomponent, som hver bare oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og det peroksydativt aktive stoffet; hvor den første indikatorkomponenten oksyderes fra en første farge til i det vesentlige fargeløst, og den andre indikatorkomponenten oksyderes til en endelig farge som er visuelt forskjellig fra den første fargen, samt eventuelt en tredje oksydative indikator som er istand til å oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd, og den peroksydativt aktive komponenten, slik at det tilveiebringes en kolorimetrisk respons.

2. Forsøkspreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det i tillegg innbefatter et enzymsystem som er istand til å generere hydrogenperoksyd fra en analyttt i den flytende prøven.

3. Forsøkspreparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2, karakterisert ved at den første indikatorkomponenten oksyderes fra en farge til fargeløs eller tilnærmet fargeløs, og har en struktur hvori M er H, OH, NH2 eller NH acetyl; P er NH2 eller OH; Z og Z2 er uavhengig av hverandre valgt fra H eller -SO3H eller salt derav; Y er H eller en substituert fenyl azoring; og X er -N02.

4. Forsøkspreparat for visuell bestemmelse av hydrogenperoksyd i en flytende prøve ifølge krav 1, karakterisert ved at det a) peroksydativt aktive stoffet er en peroksydase; og b) indikatorsystemet utgjøres av et multipelt oksydativt indikatorsystem, hvor første oksydative indikator er "Acid Black no 1" og minst en andre oksydative indikatorkomponent som er i stand til å oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase, slik at det produseres en kolorimetrisk respons.

5. Forsøkspreparat for visuell bestemmelse av en analyttt i en flytende prøve ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre oksydative indikatoren består av to koblede oksydative indikatorkomponenter, 4-aminoantipyrin/2-metylindol og 4-aminoantipyrin/3,5-diklor-2-hydroksy-benzensulfonat.

6. Forsøksinnretning for bestemmelsen av hydrogenperoksyd, karakterisert ved at den innbefatter: a) en bærermatriks; og b) inkorporert i bærermatriksen et forsøkspreparat bestående av peroksydase og et multi-oksydativt indikatorsystem, hvilket indikatorsystem består av minst en første og en andre oksydative indikatorkomponent, begge istand til å oksyderes i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase; hvor den første indikatorkomponenten er istand til å oksyderes fra en form som har en farge til en andre form som har en annen farge, og den andre indikatorkomponenten er istand til å oksyderes til en form som har en farge som er visuelt forskjellig fra den andre formen av den første indikatoren; hvorved den endelige fargen for det omsatte preparatet tilveiebringer forskjellige synlige farger ved forskjellige konsentrasjoner av hydrogenperoksyd.

7. Forsøksinnretning ifølge krav 6, karakterisert ved at minst en indikatorkomponent er anbragt for seg selv ved hjelp av lagdeling.