DK168024B1 - Testmiddel og -materiale til visuel bestemmelse a f hydrogenperoxid - Google Patents

Description

DK 168024 B1

Den foreliggende opfindelse angår et testmiddel og et testmateriale til visuel bestemmelse af hydrogenperoxid i en flydende prøve, især testmidler og -materialer, der kan danne forskellige farvetoner ved forskellige hydrogen-5 peroxidkoncentrationer.

Kolorimetriske prøver anvendes bekvemt som visuelle prøver, hvormed et forholdsvis uøvet personale rutinemæssigt kan opnå resultater ved simpel sammenligning med et passende farvekort. Visuelle prøver er billige og bekvemme, eftersom 10 der ikke kræves nogen instrumenter. For øjeblikket anvendes visuelle prøver til rutinescreening af urinprøver for et række diagnostik vigtige analytter. Sådanne prøver anvendes f.eks. af diabetikere til hjemmeanalyse af urin- eller blod-glucose, og visuelle prøver anvendes også på andre områder, 15 herunder afprøvning af vand for jernindhold. Mange af disse prøver er baseret på påvisning af hydrogenperoxid i nærvær af peroxidase og en oxidativ indikator.

De prøver, der for tiden står til rådighed, bringer en bestemt farves intensitet i relation til analytkoncentra-20 tionen. Således kan et testmateriale skifte fra farveløs til lyseblå til mørkere nuancer af blåt med stigende glucosekon-centrationer. Større visuel skelnen og dermed større nøjagtighed kan opnås, når der foreligger en række farver i stedet for forskellige nuancer eller intensiteter af en enkelt 25 farve. Derfor ville en testsammensætning eller et testmiddel, som viser forskellige farver ved forskellige analytkoncen-trationer, være lettere at anvende og ville give mere nøjagtige visuelle resultater.

Testmidlerne ifølge opfindelsen tilvejebringer et 30 nyttigt oxidativt indikatorsystem og er især anvendelige til visuel bestemmelse af klinisk vigtige analytter, såsom glucose og cholesterol, når der tilsættes en oxidase, der er specifik for den pågældende analyt.

Der er blevet udtænkt mange systemer til kolorimetrisk 35 betemmelse af hydrogenperoxid eller analytter, som kan bestemmes ved hjælp af systemer, der danner hydrogenperoxid.

DK 168024 B1 2

Da det er vigtigt at bestemme glucose, angår mange af påvisningssystemerne en glucoseoxidase med et peroxidase-oxidativt indikatorsystem, der giver et kolorimetrisk resultat. Omfanget og mængden af litteratur og patentskrifter inden for 5 området kolorimetrisk afprøvning baseret på bestemmelse af hydrogenperoxid viser, at der er blevet anvendt megen tid, mange anstrengelser og ekspertise på at bringe bedre visuelle prøver til offentlighedens kendskab.

US patentskrift nr. 4.132.527 er repræsentativt for 10 de patentskrifter, der omhandler anvendelsen af flere (sammensatte) oxidative indikatorer. Hver af indikatorerne oxideres dog til en form med en distinkt, synlig farve. Den farve, der fremtræder for brugeren, er summationen af de oxiderede indikatorers farver, og derfor bliver det reagerede 15 middels eller strimmels synlige farve mørkere og mørkere, når analytkoncentrationen stiger.

US patentskrift nr. 4.234.313 omhandler et testmiddel til bestemmelse af urinsyre, ved hvilket der anvendes et indikatormiddel, som taber farve, når 20 der er stigende mængder urinsyre til stede. Det foretrukne indikatorsystem er en kompleksbundet iodkilde, stivelse-I2, som er blå og mister farve ved stigende mængder urinsyre. Selv om det angives, at der kan anvendes andre forbindelser, idet det f.eks. anføres, at 25 "visse farvede forbindelser gennemgår en irreversibel ændring eller tab af farve ved oxidation, med dannelsen af farveløse produkter", omtales der ingen eksempler på indikatorer, der bliver farveløse ved oxidation.

Desuden findes der omtale af nogle systemer, 30 der er baseret på dannelsen af en farvet indikator, hvori en anden komponent reagerer med den oxiderede form (farvet) af indikatoren, idet den oxiderede indikator reduceres tilbage til den farveløse form. US patentskrift nr. 4.042.329 beskriver et sådant system, 35 hvor indikatoren oxideres fra en farveløs form til en farvet form, men kan reduceres tilbage til den farve- 3 DK 168024 B1 løse form ved hjælp af et titreringsmiddel. Kun når analytkoncentrationen er højere end koncentrationen af titreringsmidlet, er farven synlig.

I US , patentskrift nr. 3.008.879 beskrives 5 et system til påvisning af glucose med et enzymsystem sammensat af glucoseoxidase og peroxidase, et primært indikatormateriale, som oxideres til dets farvede form i nærvær af hydrogenperoxid og peroxidase, og en sekundær indikator, som oxideres ved hjælp af den fortrinsvis jlo oxiderede primære indikator og antager sin egen særlige farvede form, der giver en blandet farvetone. Det fortrinsvis oxiderede primære indikatormateriale kan således delvis eller helt vende tilbage til dets reducerede eleller farveløse form.

15 I DE patentskrift nr. 3.247.894 beskrives et re ducerende testsystem og en fremgangsmåde til bestemmelse af reduceret nicotin-adenin-dinucleotid, som giver et større måleinterval for bestemmelsen af NAD(P)H eller substrater eller enzymer, der reagerer under dannel-20 se eller forbrug af NAD(P)H. Systemet er karakteristisk ved, at det samtidig indeholder flere stoffer med forskellige e-lektrokemiske potentialer, der virker uafhængigt af hinanden som elektronacceptorer for NAD(P)H. De omtalte systemer omfatter anvendelse af dichlorindophenol, som er blåt i den 25 oxiderede form, den uomsatte form i et reducerende system, og farveløst i den reducerede form, den omsatte form i et reducerende system. Der findes ingen omtale af eller eksempler på oxidative indikatorsystemer.

Ingen af publikationerne omtaler eller antyder brugen 30 af sammensatte oxidative indikatorer, der hver er direkte reaktive med hydrogenperosid i nærvær af peroxidase, og hvoraf mindst én taber sin farvetone ved oxidation.

Opfindelsen angår som nævnt et testmiddel og et testmateriale til visuel bestemmelse af hydrogenperoxid i en 35 flydende prøve, i hvilken der kan dannes forskellige farvetoner, når der tilvejebringes kontakt med forskellige 4 DK 168024 B1 koncentrationer af hydrogenperoxid. Analytter, der kan gennemgå reaktioner til dannelse af hydrogenperoxid, kan også påvises ved tilsætning af et hydrogenperoxid-dannende system. Testmidlet har en første synlig farvetone før kontakt med 5 væskeprøven (dvs. uomsat) og en endelig synlig farvetone efter kontakt med væskeprøven. Den endeligt fremkomne farvetone er visuelt forskellig fra den første synlige farvetone. Midlet omfatter et peroxidativt aktivt stof og et sammensat oxidativt indikatorsystem. Det sammensatte oxida-10 tive indikatorsystem består mindst af en første og en anden indikatorkomponent. Den første indikatorkomponent har en synlig farvetone i sin første form, men mister denne farvetone, når den oxideres til sin anden form. Den anden indikatorkomponent kan oxideres til en form med en farvetone, 15 som er visuelt forskellig fra den første indikatorkomponents i begge dens former. Indikatorkomponenten kan være en enkelt forbindelse eller et koblet indikatorpar. Det kan være en fordel af tilføje en tredje oxidativ indikator.

Testmidlet ifølge opfindelsen til visuel bestemmelse 20 af hydrogenperoxid i en væskeprøve, hvilket middel har en første synlig farvetone før kontakt med en væskeprøve og en endelig synlig farvetone efter kontakt med væskeprøven, idet den endelige synlige farvetone er visuelt forskellig fra den første synlige farvetone og afhænger af koncentra-25 tionen af hydrogenperoxid i væskeprøven, er således ejendommeligt ved, at dette middel omfatter (a) et peroxidativt aktivt stof og (b) et sammensat oxidativt indikatorsystem, der består af en første, en anden og eventuelt én eller to yderligere 30 oxidative indikatorkomponenter, idet hver komponent i systemet kun oxideres i nærvær af hydrogenperoxid og det peroxidativt aktive stof, idet den første indikatorkomponent oxideres fra en første synlig farvetone til næsten farveløs, og den anden indika-35 torkomponent oxideres til en endelig synlig farvetone, som er visuelt forskellig fra den første synlige farvetone, 5 DK 168024 B1 hvorhos hver yderligere oxidativ indikator oxideres til frembringelse af en detekterbar ændring i den synlige farvetone af den omsatte testbestanddel, og testmaterialet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter 5 (a) en bærematrix og (b) inkorporeret i bærematrixen et testmiddel ifølge ethvert af kravene 1-8.

I foretrukne systemer oxideres indikatorkomponenterne i rækkefølge, så at der frembringes en række distinkte far-10 vetoner (dvs. en "regnbue"). Analytter af særlig diagnostisk interesse, såsom glucose, kan bestemmes ved tilsætning af en oxidase, der er specifik for den pågældende analyt, og som kan danne hydrogenperoxid, når analytten er til stede. Testmidlet kan inkorporeres i en bærer, så at der fås en 15 tør reagensstrimmel. Rumopdeling af indikatorerne i forskellige lag kan fremme differentieringen mellem de farvetoner, der ses ved forskellige koncentrationer af hydrogenperoxid.

Visuel farvesammenligning er bekvem og kan være en acceptabelt præcis bestemmelse af analytkoncentration 20 uden behov for dyrt teknisk udstyr. I reglen sammenlignes den omsatte testopløsnings farve eller teststrimlens farve ved hjælp af det blotte øje med blokke af farve, der er trykt på et farvekort. Sammenligningen kompliceres af faktorer: forskellig visuel opfattelse af farve fra én 25 person til en anden, lysforhold og forskel mellem farverne af en tør trykt farve på standardetiketter og farver, der ses på en reageret (dvs. fugtet) papir- eller filmprøvestrimmel. En af de største komplikationer er dog, at farveblokkene ofte udviser forskelle med hensyn til 30 lyshed eller intensitet af en enkelt "farve".

Selv om "farve" er et almindeligt brugt udtryk, kan farve opdeles i komponenter, såsom mætning, lyshed og tone. Farvetonen omtales i reglen som "farve", f.eks. om noget "ser" blåt, rødt eller gult ud. I beskrivelsen 35 vil der for at klarlægge diskussionen blive anvendt udtrykket "farvetone". Opfindelsen tager sigte på ændrin- 6 DK 168024 B1 ger i farvetone, ikke blot ændringer i en enkelt farvetones lyshed eller mætning.

I reglen er én farvetone associeret med én form af en enkelt indikator. For derfor at danne en række far-5 vetoner er en række forskellige indikatorkomponenter eller flere former af en enkelt indikatorkomponent nødvendige. Imidlertid bliver den endelige farvetone af et typisk testmiddel eller -materiale progressivt mørkere, idet den går mod sort, efterhånden som der frembringes flere farve-10 toner, med mindre der findes en fremgangsmåde til at fjerne én farvetone. En stor forbedring ved frembringelse af visuelt distinkte farvetoner er at anvende mindst én indi-katorkoraponent, som mister sin farvetone ved oxidation.

At farvetonen mistes omfatter både det tilfælde, hvor den 15 oxiderede form af indikatoren er farvet, men med en anden farvetone end den ikke-oxiderede indikator, og det tilfælde, hvor den oxiderede form er farveløs. Udtrykket "farveløs” defineres her som uden synlig farvetone,og udtrykket "næsten farveløs" defineres her med en så svag farvetone, at 20 indikatorens farvetone ikke effektivt føjer noget til testmidlets synlige farvetone.

De her omhandlede testmidler er anvendelige til bestemmelse af hydrogenperoxid. Midlerne kan anvendes sammen med instrumenter med multibølgelængde-kapacitet. De er imid-25 lertid især anvendelige og udtrykkelig beregnet til visuel afprøvning. Testmidlerne består af et peroxidativt aktivt stof og sammensatte oxidative indikatorsystemer.

Det sammensatte oxidative indikatorsystem består af mindst to oxidative indikatorkomponenter. En oxidativ in-30 dikator defineres som en indikator, der kan oxideres i nærvær af hydrogenperoxid og et peroxidativt aktivt stof. Testmidlet består af et peroxidativt aktivt stof og en første og en anden indikatorkomponent, hver i reduceret form og hver i stand til at oxideres, så at der frembringes et påviseligt 35 respons. Den første indikatorkomponent oxideres fra en første synlig farvetone til næsten farveløs, og den anden indikator- 7 DK 168024 B1 komponent oxideres til en endelig synlig farvetone, som er visuelt distinkt fra den første indikators synlige farvetone. Hvis således f.eks. den første indikatorkomponent (reduceret) er blå, og den anden indikatorkomponent (reduceret) er far-5 veløs, er det uomsatte testmiddels synlige farvetone blå. Efter kontakt mellem testmidlet og prøven oxideres begge indikatorer, hvis der er hydrogenperoxid til stede, og der vil fremkomme en farvetone, der ikke er blå, afhængigt af koncentrationen af hydrogenperoxid (eller analyt), rækkeføl-10 gen af indikatorreaktionerne og koncentrationen af indikator-komponenterne i forhold til koncentrationen af hydrogenperoxid.

Hvis reaktionerne sker efter hinanden, og koncentrationen af hydrogenperoxid er tilstrækkelig til at oxidere 15 alle indikatormolekyler, så at den første indikatorkomponent C2 (reduceret) oxideres fuldstændigt eller i det væsentlige fuldstændigt, før den anden indikatorkomponent C2 (reduceret) oxideres, kan der frembringes et drastisk farveskift. Hvis f.eks. (blå) oxideres til C2 (farveløs), og C2 (farveløs) 20 oxideres til C2 (rød), er testmidlets synlige farvetone blå, og den synlige farvetone efter reaktion er rød. Dette giver en distinkt ændring i farvetone fra blå til rød, som langt lettere kan følges af brugeren end forskellige nuancer af blåt. Ved lavere koncentrationer af hydrogenperoxid kan 25 det omsatte testmiddels synlige farvetone være farveløs.

Dersom indikatorernes reaktioner i en vis udstrækning overlapper hinanden, dvs. at ikke al den første indikatorkomponent er oxideret, før oxidation af den anden indikatorkomponent begynder, vil der fremkomme en blanding af oxiderede 30 og reducerede indikatorkomponenter ved visse koncentrationer af hydrogenperoxid, hvilket giver violet eller en anden farvetone. Der kan frembringes flere farvetoner ved anvendelse af yderligere indikatorkomponenter, der hver kan oxideres i nærvær af hydrogenperoxid, så at der frembringes en 35 påviselig ændring i det omsatte testmiddels fremkomne farvetone.

0 8 DK 168024 B1

Hver indikatorkomponent kan være en enkelt forbindelse eller et par forbindelser, der danner et koblet indikatorpar. Valget af den første oxidative indikator er især vigtigt. Antallet af indikatorer, som mister 5 farvetone ved oxidationer langt mere begrænset end antallet af indikatorer, der bliver farveløse ved reduktion, fordi oxidation i reglen forøger en indikators konjugation, hvilken forøgelse i reglen er forbundet med tilstedeværelsen af farve. Imidlertid er antallet af farve- 10 stoffer, der står til rådighed, enormt og vokser stadig.

Når man kender de særligt fordelagtige resultater, der kan opnås med sådanne indikatorer og med de her givne vejledninger, kan der findes mange flere sådanne indikatorer.

Acid Black nr. 1, 4-amino-5-hydroxy-3-(p-nitro- 15 -phenylazo)-6-(phenylazo)-2,7-naphthaiendisulfonsyre-di- natrium salt med formlen

Na03s S03Na 20 N0 OH NH2 \=z/ er en særlig foretrukken første oxidativ indikatorkomponent. Denne forbindelse er blå i reduceret form og farveløs i oxideret form. Foruden Acid Black nr. 1 pc har man fundet flere andre indikatorer, der bliver næsten så farveløse efter oxidation, at det, at der bidrages med den oxiderede forms farvetone, når den er synlig som en meget svag farvetone, hvis den oxideres alene, ikke bidrager til et omsat testmiddels farvetone.

30 ·

Blandt disse er Nitro Red, Acid Orange 8, Acid Red nr. 1 og Acid Red nr. 4. De reducerede og oxiderede formers farvetoner er vist i tabel A. Alle disse indikatorers formler er vist i afsnittet med forkortelser til eksemplerne.

35 DK 168024 B1 0 9

Tabel A

Første oxidative indikatorer Aim. navn Reduceret forms Oxideret forms _farvetone_farvetone_ 5 Acid Black nr. 1 blå farveløs

Nitro· Red violet svagt blå/brun

Acid Orange nr. 8 stærk orange stråfarvet eller meget svagt gul

Acid Red nr. 1 orange bleggul 10 Acid Red nr. 4 pink/oranget- lys brun/lys grålilla

Acid Yellow nr. 34 gul farveløs

Forbindelser 1 og 2 rød blårød

Strukturen af egnede forbindelser, der bliver 15 farveløse efter oxidation, indeholder i reglen en naph-thalenring med en diazogruppe i ortho-stilling til en phenol- eller aminogruppe, som vist herefter:

Zi\ Z

20 \ / 2

Μ P

25 X

hvor M er H, OH, NH2 eller NH acetyl, P er NH2 eller OH, Ζ^ og Z2 hver er H eller -S03H eller et salt deraf, Y er H eller en substitueret phenyl-azo-ring, og X er H eller en substituent,hvor OCH, og NO- er 30 3 3 2 foretrukket, især N02· I Acid Black nr. 1 er M OH, P er NH2, X er N02, Z^ og Z2 er NaSO^ , og Y er en phenylazo-ring.

Andre indikatorer, der vil blive næsten farveløse ved oxidation, såsom Acid Yellow nr. 34, kan også 35 anvendes.

10 DK 168024 B1

En indikatorkomponents farvetone kan afhænge af pH. Derfor er det i nogle tilfælde ønskeligt at regulere testmidlets pH ved at tilsætte et puffermiddel.

Antallet af forbindelser, der er til rådighed 5 som den anden og eventuelt tredje eller fjerde indikatorkomponent, er meget stort. Indikatorer, der udviser en farvetoneændring ved oxidation, omfatter enkelte og koblede indikatorer. Disse kan omfatte indikatorer, som oxideres fra farveløse til en form med en distinkt farvetone, 10 hvilket udgør langt den overvejende del af oxidative indikatorer, samt indikatorer, som oxideres fra en farvetone til en anden (farveskift-indikatorer). Eksempler på den enkelte indikatortype omfatter 3,3', 5,51-tetramethyl-benzidin, o-toluidin og gujakgummi; anvendelige koblede 15 indikatorer omfatter 4-aminoantipyrin sammen med 2-methylin-dol, 4,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonat (DCHBS) eller CNSP.

En ændring af farvetone fra en farveløs reduceret form til en oxideret form med en intens primær farvetone, såsom gul, rød eller blå, foretrækkes til anden 20 indikatorkomponent. Mest foretrukket er et testmiddel omfattende en første indikator, der kan oxideres fra blå til farveløs, og en anden og en tredje indikator, der kan oxideres fra farveløs til gul og farveløs til rød. En oxidativ "regnbue" fås med et testmiddel, som 25 er blåt, når det er uomsat, og som har synlige grønne, gule, orange og røde farvetoner ved forudbestemte koncen-centrationer af hydrogenperoxid.

Det peroxidativt aktive stof i testmidlet er fortrinsvis peroxidase, der fås fra naturlige kilder, 30 såsom peberrod og kartofler. Andre stoffer med peroxida-tiv aktivitet omfatter uorganiske forbindelser med per-oxidaseaktivitet, såsom blandinger af kaliumiodid og natriummolybdat, samt andre iodider, såsom natrium- og ammoniumiodider, og andre molybdater, såsom kalium- og 35 ammoniummolybdater, kan anvendes. Desuden kan der anvendes urohemin og en række andre porphyrin-stoffer med 11 DK 168024 B1 o peroxidativ aktivitet. Sammen hermed kan der anvendes forskellige kompleksdannende forbindelser, som aktiverer metalloporphyriner, men som ikke fungerer i sig selv, såsom 2-aminobenzothiazol, pyridin, bipyridyl, bipyridyl-5 pyridin og nicotinsyre. Andre stoffer, der ikke er enzymer, men har peroxidativ aktivitet, omfatter sådanne forbindelser som jernsulfocyanat, jerntannat, ferro-fer-rocyanid og kaliumchromsyresulfat.

Yderligere komponenter, såsom puffere, overfla-10 deaktive midler og stabilisatorer^ kan også sættes til midlet. pH og derfor tilsætning af et puffermiddel kan bestemme farvetonen hos en bestemt form af en indikatorkomponent. Således oxideres syreorange nr. 8 fra orange til en bleg stråfarve ved pH 7,5, men oxideres til (bleg)-15 gul ved pH 9,5. Nitro Red oxideres fra violet til svagt brun ved pH 7,5, men oxideres til svagt blåbrun ved pH 9,5. én bestemt pH-·betingelse kan være mere ønskelig end en anden for at frembringe det ønskede interval af farvetoner. Fagfolk kender mange puffermidler, der kan anvendes, for-20 udsat at de ikke forstyrrer virkningen af peroxidase og hydrogenperoxid til oxidation af indikatorkomponenterne.

Testmidlet kan også anvendes til at bestemme mange analytter, der har diagnostisk interesse, ved tilsætning af en oxidase, der er specifik for den pågælden-25 de analyt og kan producere hydrogenperoxid, når analyt- ten er til stede. En liste over særlig interessante analytter og deres tilsvarende oxidaser er vist nedenfor i tabel B.

30 35 12 DK 168024 B1

Tabel B

Analyt Oxidase 1. Glucose glucoseoxidase 5

GO

Glucose + H20 + 02 —> gluconsyre + H202 2. Alkohol Alkoholoxidase

AOD

c2h5oh + o2 —> ch3cho + h2o2 3. Cholesterol , , , Cholesteroloxidase 10 Cholesterol

Cholesterol + 02 -> Cho3ést-4-en-3-on + oxidase ' _ H2°2

Andre komponenter kan være nødvendige som yderligere komponenter i testmidlet. Imidlertid er disse 15 reaktioner og deres brug i testmidler og tørre testmaterialer velkendte på området. Testmidlets foretrukne pH bestemmes ofte af det pH, der kræves til oxidase-enzymet. Ud fra dette udgangspunkt skal der derpå vælges passende oxidative indikatorkomponenter for at få 20 de ønskede farvetoneændringer.

Midlet kan opløses, så at der fås en testopløsning, eller inkorporeres i en bærematrix, så at der fås et testsystem eller -materiale. Hvert system kan påvise tilstedeværelsen af hydrogenperoxid i en kropsvæske eller kan påvise 25 tilstedeværelsen af en anden analyt, der har interesse, når der sættes komponenter til testmidlerne til dannelse af hydrogenperoxid ud fra den pågældende analyt.

En bekvem fremgangsmåde til fremstilling af en testopløsning findes omtalt i eksemplerne. Hver komponent opløses 30 i en separat opløsning af hver indikatorkomponent, eller hver del i et koblet par fremstilles. Der fremstilles en enzymopløsning indeholdende peroxidase og den korrekte oxidase. Alikvote mængder af hver af indikator- og enzymopløsningerne kombineres derpå, hvorved man får testopløsningen.

35 Afbalanceringen af indikatorkomponenternes koncentra tioner afhænger af det interval analytkoncentrationer, der 13 DK 168024 B1 skal bestemmes, og de forudbestemte koncentrationspunkter, der er mest anvendelige. Således vil man foretrække at frembringe én farvetone for et meget lavt analytniveau (blå), grøn i det "normale" kliniske område og rød eller orange 5 ved høje eller faretruende niveauer. Dette kan gøres ved hjælp af rutineforsøg under hensyntagen til det her anførte og den vejledning, der findes i eksemplerne. Ud over den nemme måde, hvorpå en uøvet lægmand kan bestemme resultaterne af en bestemt test, opnås den fordel, at en læge kan stole 10 på ændringen af farvetoner, hvilket letter instruktionen af lægmanden.

Testmidlet kan foreligge som et testsæt, der består af en opløsning eller en serie af opløsninger, der skal blandes. Imidlertid er tørre reagensstrimler kendte og udgør 15 et anvendeligt system. Den bærematrix, der anvendes til at fremstille en tør reagensstrimmel, kan være en hvilken som helst, der er kendt i industrien, når blot midlet kan inkorporeres i matrixen, og denne ikke forstyrrer de reaktioner, der er nødvendige for frembringelsen af farve. Disse mate-20 rialer omfatter papir, film, såsom dem, der fremstilles af naturlige polymere, latexer, polyurethaner, siliconer eller kombinationer heraf, samt membraner, såsom mikroporøse membraner, såsom dem, der fremstilles ved hjælp af koagulationsmetoder ud fra polyurethan.

25 I forud formede bærere, såsom papir, kan der inkor poreres testmiddel ved hjælp af sprøtning, trykning eller dypning. Sidstnævnte er foretrukket og omtales i reglen som imprægnering. I membraner kan der også inkorporeres testmiddel (ler) ved hjælp af disse metoder. Disse membraner har 30 den yderligere fordel, at én eller flere af komponenterne kan tilføjes, når membranen fremstilles, forudsat at de fordeles ensartet i membranen. Det foretrækkes i reglen at tilføje én eller flere af indikatorerne under membranens tildannelse, og derpå at tilsætte andre komponenter, såsom 35 enzym og puffere, ved inkorporering, især ved imprægnering.

En papir- eller membranbærer kan monteres på en stiv 14 DK 168024 B1 bagklædning eller støttedel med dobbeltsidigt klæbestof. Membranerne eller filmene kan også formes direkte på en understøtning. Sådanne understøtninger er i reglen for vand uigennemtrængelige, stive polymerfilm, såsom polyethylen-5 terephthalat, polystyren eller polyester. Understøtningen udgør et bekvemt håndgreb for brugeren, eftersom det reagensområde, der kræves til sådanne tests, er meget lille. Bagklædningen kan være uigennemsigtig eller transparent, selv om en uigennemsigtig hvid bagklædning foretrækkes for visuelt 10 af aflæse testresultaterne. Der kan føjes yderligere lag til testmaterialet, der tillader aftørring eller fjernelse af røde blodlegemer fra overfladen før aflæsning. Dette kan opnås ved polymerovertræk eller ved tilføjelse af et lag, som filtrerer de røde blodlegemer fra, eller som kan tørres 15 af, eller selve laget kan fjernes.

Indikatorkomponenter kan isoleres i separate lag i et flerlagstestmateriale. Sådanne lag kan fremstilles ved kendte metoder enten på papirmembraner eller ved hjælp af film. Der kan herved opnås yderligere farvedifferentiering 20 og en bekvem måde til regulering af graden af udvikling af farvetoner i det færdige materiale. Flerlags-gelatinefilm-matrixer har vist sig særlig anvendelige til dette formål.

Nærværende beskrivelse giver tilstrækkelig information til fremstilling af testmidler eller -materialer til bestem-25 melse af hydrogenperoxid eller diagnostiske analytter, som vil danne visuelt distinkte farvetoner ved forskellige koncentrationer af hydrogenperoxid. Hydrogenperoxidet kan dannes ved hjælp af et oxidasesystem ud fra mange analytter med klinisk interesse. Opfindelsen kræver anvendelse af mindst 30 to indikatorkomponenter. Den første indikatorkomponent skal tabe sin farvetone ved oxidation enten til en farveløs form eller i det mindste til en anden farvetone. Den anden indikatorkomponent skal også skifte farvetoner, f.eks. gå fra en farveløs reduceret form til en oxideret form med en derfra 35 forskellig, relativt intens farvetone. Farvetonerne, der kan dannes, er lige så varierede som det antal oxidative 15 DK 168024 B1 indikator forbindelser, der er til rådighed. Midlets endelige synlige farvetone vil også afhænge af indikatorkomponenternes relative koncentrationer. Denne kendsgerning kan-anvendes til at ændre det interval af farvetoner, der er til rådighed, 5 og analytkoncentrationerne, når et skift i farvetone er synligt.

Opfindelsen vil i det følgende blive belyst ved hjælp af eksempler.

10 Eksempler

Forkortelser HEPES puffer, N-2-hydroxyethylpiperazin- -N'-2-ethansulfonsyre TAPSO puffer, 3-(N-tris (hydroxymethyl)me- 2^5 thylamino) -2-hydroxypropansulfonsyre TRIS puffer, Tris (hydroxymethyl) aminomethan (tris^SO^ Tris-puffer justeret til en given pH- -værdi med svovlsyre "TRITON'® X-l00 overfladeaktivt middel, polyoxyethylen-2o ether, der fås hos Sigma Chemical Co.

U internationale enheder, et mål for en zymaktivitet (in U er den enzymaktivitet, der kræves for at katalysere omdannelsen af 1 mikromol substrat pr. mi-25 nut under bestemte temperatur- og pH-be- tingelser

Me methyl POD peroxidase GO glucoseoxidase 30 · AOD alkoholoxidase PET polyethylenterephthalat 35 o 16 DK 168024 B1 I tabellerne φ farvetone visuelt skelnelig (distinkt) = farvetone kan ikke skelnes visuelt 5 Farveforkortelser OR orange R rød

Pk pink

Bl blå 10 Br brun

Gn grøn

Gr grå

Mau grålilla Y gul 15 L. lys

Forbindelsesforkortelser 4AP 4-aminoantipyrin DCHBS 3,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonat 20 25 30 35 DK 168024 Bl 17

INDIKATORER

Nit£0.„Red (forbindelse 4) ^aS03 S03Na ! i Χν=ν7Γ)\- N0o OH NH2 \__/ Å

Acid_Qrange 8 (forbindelse 6) oa.

OH

N

j- |I

5 N

U

Acid Red 1 so^

Na03S ^^-pN^^^v^^S03Na Y^a^N-tr<f3

MeCONH OH '-'

Acid Red 4 SO.Na nri N=N_/^ OH ' OMe 18 DK 168024 B1

Acid Yellow 34 0-w*?

Me I

S03Na CNSP (RNG-3608) - 3-carboxy-4-{4"-{2"-N-4-(2’'’,411'-bis-tert^amyl-phenoxy)butylcarbaraoyl)-5 ' 1"-hydroxynaphth Pxy--phenylazo]-l-sulfophenyl- 5-pyrazolon CH, /

CH2 γη V /CH3 .C

CH3^ \ 0H O /Γ~\ CH3 (CH2) 4“°~y_y C —CH2 I N / CH, CH, 3 3 . /C02H \ N=N—-{ Δ

•V

ό

V

so3H

19 DK 168024 B1 1-(4-phenoxy-3-sulfophenyl)-3(octadecamido)-5-pyrazo-lonf (forbindelse 7) _^nhcoc17h35 q<K } Λ d

T S03H

°"0 N,N-diethyl-p-phenylenediamin· (forbindelse 1) N(c2h5) 2 5

Jh2 20 DK 168024 B1 1- hydroxy-4- (2 '-N'-tolyl-N-sulfamoylainin) -phenylazo-2~N—(2"—N”-methyl-N"-octadecy1)phenylnaphthoamid (forbindelse 2) Ά /C18H37 qH m / CONHx

N SO„H

li 3

N

A. /NHS02NH

p A

\ Me 5 N- [2 ' -octadecyloxy-5- (N-methylsulfamoyl) ] phenyl- 2- (4-methoxy) benzoylacetanilid (forbindelse 3) 9^18Η37

S0o i 2 NH

ίη3 0 21 DK 168024 B1

Eksempel 1

Dannelse af forskellige farvetoner ved omsætning med hydroqenperoxid

Der fremstilles to testmidler med forskellige 5 sammensatte oxidative indikatorsystemer, som er i stand til at danne forskellige farvetoner som respons på stigende i koncentrationer af hydrogenperoxid. Testmidlerne afprøves som opløsninger ved tilsætning af hydrogenperoxid. For at lette farvesammenligning påføres en alikvot mængde 10 (30 μliter) af den omsatte opløsning på almindeligt hvidt papir. Slutpunktet nås i løbet af ca. 2-4 minutter.

A. Der fremstilles et sammensat oxidativt indikator-sy s.tem ved hjælp af Nitro Red som den første indikatorkomponent, som skifter fra en farvet form til en farve-15 løs form, og 2-amino-3-hydroxy-5-brompyridin som den anden indikatorkomponent. Nitro Red oxideres i nærvær af hydrogenperoxid og peroxidase fra violet til en meget svagt blå/.brun farve. Medens den oxiderede form kan ses, hvis den første indikatorkomponent oxideres af sig selv, er 20 den farve, der frembringes, så svag, at den kun bidrager lidt, om overhovedet med nogen synlig farve i et sammensat indikatorsystem. Den anden indikatorkomponent oxideres fra farveløs til en kraftig gul farve.

Der fremstilles opløsninger af disse to forbin-25 delser til bestemmelse af hydrogenperoxid (tabel I). Testopløsningerne indeholder også en puffer, (tris^SO^, 0,1M, pH 8,5, og 20 U/ml peroxidase. Der sættes hydrogenperoxid til alikvote mængder af testopløsninger, og når slutpunktet er nået i løbet af-ca. 2-4 minutter, påfø-30 res 30 Mliter af hver omsat opløsning på et almindeligt stykke absorberende filtrerpapir, så at de frembragte farvetoner kan sammenlignes.

Med disse opløsninger ses en række farvetoner, som svarer til stigende hydrogenperoxid-koncentrationer, 35 dvs. blå ved lav koncentration, grøn ved middel koncentration og gul ved høj koncentration.

22 DK 168024 B1 Φ

P

Φ ni o ^ ^ "

Ti P »'.'C' ω

M

Ti

C

*H

->| g C >1 II

. U -β οώ . E c

tn c -w C3 II

H O J

4- --I II

•o-

£ r-4 QJ

tq ec I -H u ||

— w C J

0¾4 ^ ^

CM

·*· le Ή a a

• <NJ I I II

H 4- '-i c o· <s o -®· -S- <1)

Λ -P -P

rt S' c S

E-t £ 3 o <0

«I r> <0 I > M

4 tc s Ή Μη.

O CQ

-ο -Θ- o 3 3 3 flJ *3 (0

°l 2S S S

I I I

Η Η H

' - tn α m G •H I I T3 roin.H I I 1|Λ 0 >isL2 in m c x gi - — o «Η O «-Η *-4 gus «*o o 1 >1^ <N JZ Λ τί α> ^ — in in in 2 cj r» p- O £ vø m n U O o o 3 o- CT -

2 O

23 DK 168024 B1 0 B. Et andet sammensat oxidativt indikatorsystem fremstilles ved hjælp af Acid Orange 8 (forbindelse 6) som første indikatorkomponent og forbindelserne-1 og 7, et koblet indikatorpar, som danner den anden indikator-5 komponent. Acid Orange 8 (forbindelse 6) oxideres i nærvær af hydrogenperoxid og peroxidase fra stærkt orange til meget svagt gul eller stråfarvet. Selv om den oxiderede forms farvetone kan skelnes visuelt, hvis den oxideres alene og anbringes tæt på en hvid baggrund, er farveto-10 nen så bleg, at der kun er ringe, om overhovedet noget visuelt bidrag, når den kombineres med andre farvede indikatorer. Forbindelse 7 oxideres i nærvær af forbindelse 1, hydrogenperoxid og peroxidase fra en farveløs form til magentarød. Testopløsningerne fremstilles og afprø-15 ves som vist i afsnit A. Resultaterne ses i tabel II nedenfor. Der opnås en lignende differentiering, selv om de endelige farvetoner er forskellige.

20 25 30 35 24 DK 168024 B1 p

(D

3 3 - 4-' 0)

Ol r—I

4- o «

-H

fe

'M

u ml 3 m a

<3 OS

*1 X «Ρ Σ O ϋ '0 Θ- ~ M.

I p ~ 3 85 3 U1 <0 -)J o "TcS*" ε tn s -o O -Θ-

(N

3 <a s S 19 <ί| i s 4 «

o o J

-o -Θ-

H K

t_! , C I

n —ran t r· O i—i O -o- -ø.

<D

X! td E-> n n o o| o i i >< :* r—i Γ- • — m in Λ s -- Μ I ° °

O

fe \—i • — m m jj? CM o* o- ° fo -—j. m •ri’ ϋ — r\. co C g ** - <4 <TJ ^ O o w ' o 0 25 DK 168024 B1

Eksempel 2

Regnbuedannelse til bestemmelse af glucose

Acid Black nr. 1 er en foretrukket første indikatorkomponent, fordi den er blå i reduceret form og farve-5 løs, når den oxideres i nærvær af hydrogenperoxid og peroxidase. Denne forbindelse er udgangspunktet for et sammensat indikatorsystem, der kan frembringe farvetonerne i regnbuen med stigende glucosekoncentrationer. Dette resultat er særlig foretrukket, eftersom dannelsen af di-10 stinkte faretoner, blå til grøn til rød, udgør den bedste visuelle skelnen for diabetikere.

Testmidlet tilberedes med en første indikatorkomponent, Acid Black nr. 1, en anden indikatorkomponent, 3,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonat (DCHBS) og 4-aminoan-15 tipyrin (4-AP), samt en tredje indikatorkomponent, 2-meth-ylindol og 4-aminoantipyrin. De ændringer i farvetone, der kan fås med disse indikatorer ved oxidation, ses nedenfor.

20 A. Reduceret Oxideret 1. Acid Black nr. 1 blå farveløs 2. 4-AP og DCHBS farveløs orange 3. 4-AP og 2-methylindol brun orange 25 Der fremstilles et testmiddel på følgende måde:

Tilberedning nr. 1

Acid Black nr. 1 60 mg 4-AP 365 mg 30 DCHBS 50 mg H2<D indtil 100 ml

Tilberedning nr. 2

Glucoseoxidase 20 ml 35 (1221 U/ml)

Peroxidase (60 U/mg) 1 g 0 26 DK 168024 B1

Tilberedning nr. 3

Tilberedning nr. 1 2 ml

Tilberedning nr. 2 2 ml 5 4-AP (10-2M) 1 ml 2-Methylindol (10 2M) 1 ml

Procedure; 100 μliter tilberedning nr. 3 blandes med 100 μliter af en vandig opløsning indeholdende 10 forskellige koncentrationer af glucose. Efter 2 minutter bestemmes testopløsningernes farvetone ved at anbringe en alikvot mængde af hver opløsning på et stykke filtrerpapir .

i 15 Glucosekoncentration Farvetone 0 blå 50 mg/dl grøn-blå 200 mg/dl mosgrøn 1000 mg/dl orange-rød 20

Ved stigende glucosekoncentrationer fremkommer distinkte farvetoner (blå, grøn^orange).

B. Der fremstilles et andet sæt opløsninger baseret på tilberedningerne nr. 1 og 2 ovenfor samt en 25 ny tredje indikatorkomponent, CNSP. Denne indikator skifter fra gul i reduceret form til rød i oxideret form. Derfor er midlets farvetone, når der ikke forekommer glucose, grøn, og de farvetoner, der dannes ved oxidation, er forskellige fra dem, der ses under A ovenfor. Imidlertid 30 fas der også med dette middel visuelt distinkte farvetoner.

Tilberedning nr. 4

Tilberedning nr. 1 2 ml

Tilberedning nr. 2 2 ml 35 _2 4-AP (10 ZM) 2 ml CNSP (10_2M) 2 ml DK 168024 Bl 0 27

Procedure; 100 μliter tilberedning nr. 4 blandes med 100 pliter af en vandig opløsning indeholdende forskellige glucosekoncentrationer. Efter-1-2 minutter bestemmes opløsningernes farvetoner som i af-5 snit A.

Glucosekoncentration Farvetone 0 grøn 50 mg/dl mosgrøn 10 200 mg/dl brun 1000 mg/dl orange-rød

Også her fremkommer let skelnelige farvetoner over et bredt glucosekoncentrationsinterval.

15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Testmiddel til visuel bestemmelse af hydrogen-peroxid i en væskeprøve, hvilket middel har en første synlig farvetone før kontakt med en væskeprøve og en endelig synlig 5 farvetone efter kontakt med væskeprøven, idet den endelige synlige farvetone er visuelt forskellig fra den første synlige farvetone og afhænger af koncentrationen af hydrogen-peroxid i væskeprøven, kendetegnet ved, at dette middel omfatter 10 (a) et peroxidativt aktivt stof og (b) et sammensat oxidativt indikatorsystem, der består af en første, en anden og eventuelt én eller to yderligere oxidative indikatorkomponenter, idet hver komponent i systemet kun oxideres i nærvær af hydrogenperoxid og det per- 15 oxidativt aktive stof, idet den første indikatorkomponent oxideres fra en første synlig farvetone til næsten farveløs, og den anden indikatorkomponent oxideres til en endelig synlig farvetone, som er visuelt forskellig fra den første synlige farvetone, 20 hvorhos hver yderligere oxidativ indikator oxideres til frembringelse af en detekterbar ændring i den synlige farvetone af den omsatte testbestanddel.

2. Testmiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det sammensatte oxidative indikatorsystem yderligere 25 består af en tredje oxidativ indikator.

3. Testmiddel ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et puffermiddel.

4. Testmiddel ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et enzymsystem, der kan 30 danne hydrogenperoxid ud fra en analyt i væskeprøven.

5. Testmiddel ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den første indikatorkomponent har formlen 35 DK 168024 B1 w 5 ^S^^A-^-ΖΛ M p \A/ X hvor M er H, OH, NH2 eller NH-acetyl, 10. er NH2 eller OH, Zj og Z2 hver er valgt blandt H eller -S03H eller saltet deraf, Y er H eller en substitueret phenyl-azo-ring, og X er -N02.

6. Testmiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder: (a) peroxidase og (b) et sammensat oxidativt indikatorsystem sammensat af 4-amino-5-hydroxy-3- (p-nitro-phenylazo) -6- (phenylazo) - 20 -2,7-naphthalendisulfonsyre-dinatriumsalt (Acid Black nr. 1. som første indikator og mindst én anden oxidativ indikatorkomponent .

7. Testmiddel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et enzymsystem, der kan 25 danne hydrogenperoxid ud fra en analyt, der er til stede i væskeprøven.

8. Testmiddel ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det omfatter: (a) et enzymsystem, der kan danne hydrogenperoxid ud 30 fra en analyt af interesse, (b) peroxidase og (c) et sammensat indikatorsystem bestående af Acid Black nr. 1 og et par af forbindelserne 4-aminoantipyrin/2--methylindol og 4-aminoantipyrin/3,5-dichlor-2-hydroxyben- 35 zensulfonat.

9. Testmateriale til bestemmelse af hydrogenperoxid, DK 168024 B1 eller analytter, der kan bestemmes ved anvendelse af hydro-genperoxid-dannende system, kendetegnet ved, at det omfatter (a) en bærematrix og 5 (b) inkorporeret i bærematrixen et testmiddel ifølge ethvert af kravene 1-8.

10. Testmateriale ifølge krav 9, kendetegnet ved, at i det mindste én indikatorkomponent er ruminddelt ved lagdeling. i