NO166346B - Fremgangsmaate for kolorimetrisk bestemmelse av glukosekonsentrasjon samt forsoekssammensetning og -innretning for fremgangsmaaten. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for kolorimetrisk bestemmelse av glukosekonsentrasjon i en biologisk prøve, og videre en forsøkssammensetning og en forsøksinnretning for semikvantitativ bestemmelse av glukose i en biologisk prøve.

Bestemmelse av glukosekonsentrasjon i vandig oppløsning er nyttig industrielt innfor sukkerindustrien og dessuten medisinsk nyttig. Medisinsk er semikvantitativ bestemmelse av glukose i kroppsvæsker, som f.eks. urin eller blod, av betydning som et offentlig helsetiltak for å undersøke et stort antall mennesker for eventuell diabetes, og er av spesiell betydning for diabetiske pasienter som må kontrol-lere sitt sukkerinntak. Fordi tidlig diagnose og fortsatt kontroll er så viktig ved diabetes, må en glukosepåvirkning, for å være av stor verdi for legen, klinikeren eller den diabetiske brukeren, være rask og enkel nok til å virke hensiktsmessig og samtidig følsom nok til å gjenspeile meningsfulle variasjoner i glukosenivået i urin eller blod.

Semikvantitativ bestemmelse av glukose i det høye området, her definert som glukosekonsentrasjoner på 1000 milligram pr. desiliter (mg/dl) og høyere, er viktig fordi glukosekonsentrasjonen i urin hos diabetiske pasienter kan variere opptil 5000 mg/dl eller høyere. Den kvantitative bestemmelsen av høye glukosekonsentrasjoner i urin er viktig av minst to grunner. For det første er det i nødsituasjoner viktig å avgjøre om en tilstand av bevistløshet kan til-skrives diabetisk koma, dette vil fremgå ved en høy konsentrasjon av glukose i urinen. For det andre kan glukosenivåer i urinen forhøyes dersom en utilstrekkelig mengde insulin er tilført. En påvisning som kan angi høye glukosekonsentrasjoner i urinen finner derfor anvendelse i den terapeutiske overvåkningen av insulinbehovet.

De fleste diagnostiske påvisninger av glukose som idag utføres klinisk er basert på den enzymatiske virkningen av glukoseoksidase på e-D-glukose: og den resulterende oksydasjonen av et kromogen (Cr) til den oksyderte tilstanden (Cr<*>) som visuelt detekteres ved hjelp av en fargeendring: ;Stor hensiktsmessighet oppnås når forsøksinnretningen kan benyttes semikvantitativt til bestemmelse av glukosenivåer ved visuell sammenligning av fargen som er utviklet etter kontakt med en prøve, med et egnet fargekart. Slike semikvantitative bestemmelser kan også utføres instrumentelt ved å måle reflektansen for en reagert innretning. Når konsentrasjonen av glukose øker over 1000 mg/dl, er imidlertid fargen av de fleste kromogener som benyttes i enzymatiske systemer så mørk at adskillelsen av høye konsentrasjonsnivåer forhindres. US-patent nr. 4.340.669 beskriver de observerte resultatene med o-tolidin, tetrametylbenzidin og tetraetyl-benzidin som kromogen ved 0, 50, 100, 250, 500 og 1000 mg/dl glukose i væsken som ble undersøkt. Hvert av disse kromogenene endres fra gult til klart grønt når konsentrasjonen av glukose øker fra 0 til 50 mg/dl. Når konsentrasjonen av glukose øker utover 500 mg/dl mørkner fargen av det oksyderte kromogenet slik at de observerte fargene for de respektive kromogenene var olivensort, sort og dyp grønn. Denne observasjonen belyser et problem ved semikvantitativ enzymatisk bestemmelse av glukose i vandige prøver, dette er at ved høye konsentrasjoner fremstår kjente kromogener som sorte eller svært mørk grønne, derved begrenses anvendelig-heten av forsøksinnretningen ved bestemmelse av glukosenivåer på over 500 mg/dl. Selv om problemet ikke er så akutt dersom fargeendringen bestemmes instrumentelt, eksisterer det ikke desto mindre fremdeles. En viss fremgang i utvidelsen av det visuelt avlesbare området for glukose med enzymatiske preparater er oppnådd ved tilsats av sekundære kromogener som f.eks. m-anisidin (US-patent nr. 4.340.669). ;I tillegg til dårlig fargeadskillelse ved høye glukosekonsentras joner , påvirkes enzymbaserte glukosepåvisninger av askorbinsyre (vitamin C) som er tilstede i kroppsvæsker, de er dyre og er belastet med stabilitetsproblemer. ;Ikke-enzymatiske fremgangsmåter for bestemmelse av glukose har også vært benyttet. Disse innbefatter instrumentelle fremgangsmåter basert på en måleelektrode (se f.eks. US-patent nr. 4.127.448) og sågar et ikke-inntrengende automatisk glukosesensorsystem som undersøker pasientens øye med hensyn på stråling overført gjennom hornhinnen (se US-patent nr. 3.958.560). US-patent nr. 4.278.438 beskriver en fremgangsmåte og en apparatur for analyse av sakkarider. Et alkylenpolyamin fremstilt i en boratbuffer benyttes for å eluere sakkarider fra en kromatografisk kolonne. ;US-patent nr. 4.371.374 beskriver en fremgangsmåte for å overvåke glukose i blodet ved å separere og kvantifisere ikke-enzymatiske glukosylerte aminosyrer, peptider eller blandinger derav ved å behandle en urinprøve med en egnet borsyre for å kompleksdanne de glykosylerte forbindelsene, separere dem og analysere det separerte kompleksdannede materiale. ;Foreliggende oppfinnelse krever ikke avansert utstyr, men tillater ikke desto mindre bestemmelse av glukose opptil et hvilket som helst ønsket konsentrasjonsnivå, ved anvendelsen av kompleksdannelse av glukose med en dihydroksydkomponent. Kompleksdannelse av sukker med bor og jordalkalidihydroksyd-er er beskrevet ]S.A. Barker et al., Carbohydrate Research, 26 (1973) 33-40; N. Roy et al., Carbohydrate Research, 24 ;(1972) 180-183§; men dette fenomenet har ikke vært benyttet til å løse problemet med semikvantitativ bestemmelse av glukosekonsentrasjoner i en vandig prøve. ;Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for kolorimetrisk bestemmelse av glukosekonsentrasjon i en biologisk prøve som er kjennetegnet ved at den innbefatter trinnene: - blanding av en biologisk prøve med en forsøksoppløsning som har en innledende pH større enn 6,5 og som i det vesentlige består av en boratbuffer og en pH-indikator som er i stand til å detektere pH i området fra 6,5 til 12; ;- bestemmelse av pH i den resulterende blandingen; og ;- korrelasjon av den detekterte pH med en glukosekonsentrasjon for den biologiske prøven. ;Videre tilveiebringes ved foreliggende oppfinnelse en forsøkssammensetning for semikvantitativ bestemmelse av glukose i en biologisk prøve som er kjennetegnet ved at den innbefatter: - en boratbuffer som er i stand til å holde en forsøks-sammensetning ved en innledende pH over 6,5; og - en pH-indikator som er i stand til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons i pH-området fra 6,5 til 12. ;Endelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en forsøks-innretning for semikvantitativ bestemmelse av glukose i en prøve kjennetegnet ved at den innbefatter en bærermatiks og den ovenfor omtalte forsøkssammensetningen. ;En engangs-indikatorinnretning for bestemmelse av kolesterol er beskrevet i US-patent nr. 4.042.329. Den omtalte innretningen tilveiebringer en indikasjon på konsentrasjonen av kolesterol i en gitt biologisk væske som direkte kan avleses i notasjonsformat. ;Tegningen viser reproduserbarheten for visuelle bestemmelser av glukosekonsentrasjon med en ikke-enzymatisk forsøksinn-retning ifølge foreliggende oppfinnelse. Forsøksinnretninger sammensatt for semikvantitativ bestemmelse av glukose i det høye området ble bragt i kontakt med kunstige urinprøver som inneholdt fra 1 g/dl til 8 g/dl glukose. Den grafiske fremstillingen verifiserer den lineære relasjonen mellom glukosekonsentrasjon, G, i g/dl og avlesning på innretningen, R, i g/dl. Forsøksinnretningene ble fremstilt ved å forbehandle en papirbærermatriks med en boratbuffer fremstilt fra fenylboronsyre før inkorporering av et forsøks-preparat som innbefatter en boratbuffer fremstilt fra borsyre og en pE-indikator. ;Et antall karbohydrater som inneholder en cis-diolgruppe danner en lang rekke komplekser med forbindelser som inneholder en dihydroksydgruppe. (Se f.eks. N. Roy et al., Carbohydrate Research 24 (1972) 180-183, og S.A. Barker et al., Carbohydrate Research, 26 (1973) 33-40). Det er funnet at denne kompleksdannelsen kan benyttes til å tilveiebringe en semikvantitativ bestemmelse av konsentrasjonen av glukose i en vandig prøve ved at det fremstilles en forsøksoppløs-ning ved at prøvene bringes i kontakt med et dihydroksyd, ved en innledende pH over 6,5, som er istand til å danne et kompleks med glukose, hvor kompleksdannelsen frigjør et proton i oppløsningen, og bestemmelse av den endelige pH-verdien i forsøksoppløsningen. ;Egnede dihydroksyder innbefatter dihydroksyder av barium, bor, kalsium, magnesium og strontium. [Ba(0H)2. Z-B(0H)2» Ca(0H)2, Mg(0H)2 og Sr(0H)2]. Dihydroksyder av bor og strontium er foretrukket. Spesielt fordelaktige er bordi-hydroksyder av generell formel: ;hvor Z er en elektrontiltrekkende gruppe som f.eks. en nitrogruppe eller en elektronstabiliserende gruppe som f.eks. en hydroksyl- eller arengruppe. Når Z er en hydrok-sylgruppe, er bordlhydroksydet borsyre. Egnede bordihydrok-syder Innbefatter borsyre, fenylboronsyre, p-nitrofenylboronsyre, 4-metoksyf enylboronsyre og ot-naf tylboronsyre, naftylboronsyre så vel som andre arenboronsyrer og deres derivater. En arengruppe er definert som en hvilken som helst hydrokarbongruppe som inneholder minst en aromatisk ring. Disse gruppene er nyttige i forbindelse med foreliggende oppfinnelse forutsatt at den anioniske negative formen av dihydroksydet kan stabiliseres ved elektronresonans over den aromatiske ring. For eksempel er forbindelsen fenylboronsyre hvor Z er en fenylgruppe spesielt nyttig. I tillegg er arenderivater, som f.eks. p-nitrofenylboronsyre, som inneholder elektrontiltrekkende grupper som substituenter på den aromatiske ringen, også nyttige. ;Glukose kan bestemmes ved å fremstille en forsøksoppløsning med en vandig prøve og en dihydroksydkomponent, ved en innledende pH-verdi over 6,5, som er istand til å danne et kompleks med glukose, hvor kompleksdannelsen frigir et proton, og måling av den endelige pH-verdien i forsøksopp-løsningen. Forsøksoppløsningen kan vanligvis fremstilles ved enkelt å bringe dihydroksydet i kontakt med den vandige prøven. ;Barium-, bor-, kalsium-, magnesium- og strontiumdihydroksyd-er danner generelt 1:1 komplekser med glukose. Derfor må forholdet mellom dihydroksyd og glukose i prøven være ca. 1:1. For å fremstille en forsøksoppløsning av et bordihydroksyd, som f.eks. borsyre, i tilstrekkelig konsentrasjon til å bestemme glukosekonsentrasjon på ca. 500 mg/dl eller høyere, kan det være nødvendig å benytte en base som f.eks. kaliumhydroksyd eller natriumhydroksyd til å oppløse bordlhydroksydet. En ekvivalent fremgangsmåte ville være anvendelsen av saltformen av borsyre som en del av hydrok-sydkomponenten. Andre baser er også nyttige forutsatt at de ikke påvirker kompleksdannelsen mellom dihydroksydet og glukosen. ;Den endelige pH-verdien i forsøksoppløsningen kan måles konvensjonelt med et pH-meter eller bedømmes visuelt eller instrumentelt etter tilsats av en pH-indikator. ;pH-endringen som finner sted ved kompleksdannelsen mellom dihydroksydkomponenten og glukosen kan modereres ved tilsats av en buffer. Et f orsøkspreparat som innbefatter en buffer som er istand til å moderere en pH-endring over pH-området fra pH 6,5 til pH 12 kan benyttes for å bestemme glukose over et videre konsentrasjonsområde enn et forsøkspreparat uten en slik buffer. Egnede buffere innbefatter tris(hydrok-symetyl)aminometan, vanligvis kjent som TRIS, N,N-bis(2-hydroksyetyl)glycin, vanligvis betegnet BICINE og N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre, vanligvis betegnet HEPES. Det er spesielt hensiktsmessig når man benytter et bordihydroksyd som f.eks. borsyre eller fenylboronsyre å benytte bufferformen som dihydroksydkomponenten. ;En boratbuffer er definert som blandingen av syren og baseformen av en Z-B(OH )2~forbindelse. Likevekten mellom de to formene kan vises skjematisk som: ;hvor Z kan være en hvilken som helst av gruppene beskrevet ovenfor. ;Boratbufferen kan fremstilles fra borsyre (Z=OH) eller fra arenboronsyrederivater som, f.eks. fenylboronsyre eller blandinger av Z-B(OH^-forbindelser ved velkjente labora-toriefremgangsmåter. For eksempel kan en oppløsning av borsyrebuffer fremstilles ved å titrere borsyre med en base som f.eks. natrium- eller kaliumhydroksyd til en innledende pH-verdi innenfor bufferområdet for Z-B(OH^-forbindelsen som benyttes. Dette bufferområdet ventes å falle mellom pH 6,5 til pH 12 for de fleste Z-B(OH)2-forbindelser. Bufferen kan også fremstilles ved å tilsette ekvimolare deler av syren og baseformen av dihydroksydet og oppløse blandingen i vann. ;Valget av den Innledende buffer pH-verdien kan påvirke konsentrasjonsområdet for glukose som kan bestemmes med et spesielt forsøkspreparat. For eksempel kan effektiviteten for kompleksdannelsen mellom bordihydroksyd og glukosen reduseres når pH-verdien for oppløsningen faller under pKa for boratbufferen. Tilsatsen av elektrontiltrekkende substituenter på en buffer fremstilt fra et arenboronsyre-derlvat forandrer pKa-verdien for bufferen og følgelig dens effektive pH og kompleksdannelsesområde. For eksempel har borsyre, pKa 9,2, en lavere kompleksdannelseskapasitet under ca. pH 7,0, mens f enylboronsyre, pKa 8,8, danner komplekset med glukose ved en pH så lav som 6,5. p-nitrofenylboronsyre, pKa 7,4, har en enda lavere effektiv pH-verdi. En blanding av boratbuffere, f.eks. borsyrebuffer og fenylboronsyrebuffer, kan utvide det effektive pH-området for borat-glukosekompleksdannelsen og følgelig glukosekonsentrasjons-område som kan bestemmes. Når en borsyrebuffer benyttes, er en innledende pH-verdi på over 8,0 foretrukket. For bestemmelse av glukose i det høye området med en borsyrebuffer, er en innledende pH-verdi over 9,0 spesielt foretrukket. Bufferen er mest nyttig ved en glukosebestemmelse når den innledende pH-verdien ligger noe over pKa-verdien. Bufferen kan naturligvis tilføres i tørr tilstand ved å fjerne vannet etter at den Innledende pH-verdien er fastsatt. Bufferen er istand til å tilveiebringe denne pH-verdien når den rekonsti-tueres . ;Det er spesielt hensiktsmessig å tilveiebringe et forsøks-preparat for bestemmelse av glukose som innbefatter et dihydroksyd som definert ovenfor og en pH-indikator som er istand til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons i pH-området fra pH 6,5 til pH 12. En hvilken som helst pH-indikator som forandrer farge innenfor dette pH-område, eller en hvilken som helst kombinasjon av indikatorer, kan benyttes. Nyttige indikatorer innbefatter m-kresolpurpur, kresolrødt, nøytralt rødt, tymolblått, fenolftalein, o-kresolftalen, fenolrødt, bromtymolblått eller "Universal Indicator", en blanding av indikatorer som er tilgjengelige fra Kodak. Forsøkspreparatet kan benyttes til å bestemme glukosekonsentrasjon ved at den vandige prøven bringes i kontakt med preparatet og den detekterbare kolorimetriske responsen som oppstår observeres. ;En pH-indikator forandrer farge over et område av pH-verdier. pKa-verdien for en indikator representerer tilnærmet midtpunktet for dens fargeforandring. Den innledende pH-verdien for boratbufferen som velges avhenger av hvilken Indikator som benyttes. For eksempel endres m-kresolpurpur fra purpurfarget ved pH 9,0 til gult ved pH 7,4. Ved pH-verdier over 9,0 forblir Indikatoren purpurfarget eller viser svært liten fargeforandring med endringer i pH. Dersom en innledende pH på 9,0 benyttes, vil en detekterbar respons opptre ved en hvilken som helst pH-endring. Dersom en innledende pH på 9,2 eller høyere benyttes, vil sammenset-ningen Ikke forandre farge, dvs. den vil ikke vise en detekterbar respons på glukosekonsentrasjon før pH faller under 9,0. Følgelig vil preparater hvor det anvendes m-kresolpurpur som inneholder en buffer som er istand til å tilveiebringe en innledende pH-verdi på 9,0, være mer følsomme for lave glukosekonsentrasjoner enn slike preparater som inneholder en buffer som er istand til å tilveiebringe en innledende pH-verdi på 9,2. Dersom en annen pH-indikator benyttes, kan en annen innledende pH-verdi være foretrukket. For eksempel har kresolrødt et pH-område mellom 8,8 (rød) og ca. 7,2 (gul); en lavere innledende pH, som f.eks. pH 9,0, er da foretrukket for optimal virkning i dette forsøksprepa-ratet. Anvendelse av mer enn en indikator kan tilveiebringe en fargeendring over et bredere pH-område og følgelig over et videre konsentrasjonsområde for glukose. ;Et forsøkspreparat som er spesielt velegnet for bestemmelse av høye glukosekonsentras;)oner (her definert som minst 1000 mg glukose pr. dl) er en boratbuffer som er istand til å moderere pH-endringen i et pH-område på fra pH 6,5 til pH 12, og en pH-indikator som er istand til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons i et pH-område på fra pH 6,5 til pH 12. ;I et foretrukket preparat som er fremstilt for bestemmelser av høye glukosekonsentras;] oner i urin er boratbuf feren en borsyrebuffer som er fremstilt slik at den er istand til å tilveiebringe en innledende pH-verdi på ca. 9,2. Denne høye innledende pH-verdien fører til at man unngår ikke-speslfikk pH-endrlng og interferens med urinens pH og bufferkapasitet. Bufferen som er fremstilt på denne måten kan tilveiebringes i en tørr tilstand ved lyofilisering eller den kan tørkes for å fjerne vannet som benyttes til å fremstille bufferen. ;Andre komponenter som f.eks. fuktemidler, stabilisatorer eller fortykningsmidler kan tilsettes til forsøkspreparatet forutsatt at de ikke påvirker kompleksdannelsen mellom dihydroksydet og glukosen. ;Et hvilket som helst av disse preparatene kan tilveiebringes i form av en reagens på en flaske, en skjør kapsel som inneholder forsøkspreparatet på reagensform, en pille eller en tablett. ;Forsøksinnretningen ifølge oppfinnelsen, fremstilles ved å behandle en egnet bærermatriks med forsøkspreparatet i form av en flytende reagens med etterfølgende tørking. Bærermatriksen kan være et hvilket som helst stoff som lar seg inkorporere med bestanddelene i forsøkspreparatet, så lenge som det i det vesentlige er inert overfor forsøkspre-paratet, porøst og/eller absorberende overfor den vandige prøven som skal undersøkes. Uttrykket "bærermatriks" refererer til enten absorberende eller ikke-absorberende matrikser som er uoppløselige i, og beholder sin struktu-relle integritet når det eksponeres til vann eller andre fysiologiske væsker. Egnede absorberende matrikser som kan benyttes innbefatter papir, cellulose, tre, syntetisk harpiksull, vevde eller uvevde materialer og lignende. Ikke-absorberende materialer innbefatter glassfiber, polymerflimer og mikroporøse membraner. ;Det skal derfor bemerkes at ved fremstilling av en forsøks-innretning ifølge oppfinnelsen kan alle disse bærermatriks-konseptene anvendes, så vel som andre. Matriksen kan også innbefatte et system hvor preparatbestanddelene er homogent blandet i en flytende eller halvflytende tilstand, som senere herder, derved Inkorporeres bestanddelene. Andre matrlksutførelser overveies også, innbefattet anvendelsen av mikroporøse membraner eller polymerfilmmatrikser. Mikropo-røse membraner er tilgjengelige som forfremstilte membraner eller kan fremstilles ved slike teknikker som faseinversjon. Egnede polymerfilmer kan fremstilles med kommersielt tilgjengelige latekssammensetninger basert på latekspolymer-suspensjoner, som f.eks. en suspensjon fremstilt fra en 60:40 kopolymer av styren og butadien. Andre naturlige eller syntetiske polymerer eller blandinger derav kan også benyttes. Eksempler på slike filmsammensetninger kan finnes i US-patentene nr. 3.630.957 og 4.312.834. ;Den mest foretrukne fremgangsmåten for fremstilling er impregnering av en absorberende bærermatriks, f.eks. filterpapir, med en vandig oppløsning av preparatet etter-fulgt av tørking, deretter festes den tørkede, impregnerte matriksen til en bærerdel. Impregneringsoppløsningen fremstilles slik at den viser den ønskede innledende pH-verdi. Når en prøve av fullblod skal undersøkes, kan den tørkede, impregnerte bærermatriksen belegges og overskuddet av prøven vaskes eller tørkes av. Tørking kan utføres ved en hvilken som helst fremgangsmåte som ikke påvirker det inkorporerte preparatet i negativ retning, vanligvis ved hjelp av en luftfylt ovn. Inkorporering kan oppnås ved en hvilken som helst fremgangsmåte som f.eks. belegging, dypping, utgnidning, spraying eller trykking, som tillater bærermatriksen å Inkorporeres med analysepreparatet. Den tørkede bærermatriksen kan deretter oppdeles og monteres på den ene enden av en bærerdel, f.eks. en stiv eller halvstiv strimmel av polystyrenfi lm. Dihydroksydkomponenten og/eller bufferen foreligger på en slik form at det tilveiebringes en innledende pH over 6,5 ved overflaten av den Inkorporerte bæreren når bæreren fuktes. pH for den fuktede inkorporerte bæreren kan måles ved overflateelektroder. Betegnelsen "inkorporert bærer" refererer til en bærermatriks som er inkorporert med forsøkspreparatet og tørket. Når det benyttes en transparent filmstrimmel, kan instrumentell avlesning av en omsatt Innretning utføres fra en hvilken som helst side av strimmelen. Montering av papiret på strimmelen kan oppnås ved anvendelse av dobbeltklebende llmbånd, som f.eks. den kommersielt tilgjengelige kvaliteten "DOUBLE STICK" fra 3M Co. ;Når en bærermatriks av papir benyttes med en borsyrebuffer, kan det være fordelaktig å behandle papiret med en vandig oppløsning av en andre boratbuffer, som f.eks. fremstilt fra fenylboronsyre, ved en innledende pH-verdi over 6,5, før inkorporering av forsøkspreparatet som inneholder boratbufferen. Det antas at en slik forbehandling forhindrer mulig vekselvirkning mellom papiret og boratbufferen i forsøks-preparatet . ;Konsentrasjonsområder for komponentene i reagensoppløsningen som benyttes til å fremstille en fast forsøksinnretning er som følger: ;Disse konsentrasjonsområdene og relative konsentrasjonene for komponentene kan benyttes enten oppløsningen er en vandig impregneringsoppløsning eller en polymersuspens]on. En foretrukket reagensoppløsning inneholder fra 0,10 til 0,30M boratbuffer titrert til en Innledende pH-verdi på 8,5 til 9,5 og 0,05$ til 0.105É av en indikator som f.eks. m-kresolpurpur. I en foretrukket utførelse impregneres en papirmatriks med en vandig oppløsning som inneholder fra 0,1 til 0,3M boratbuffer titrert til en innledende pH-verdi over 6,5 før Inkorporering med forsøkssammensetningen. En foretrukket boratbuffer for forbehandling fremstilles fra f enylboronsyre. ;Forsøksinnretningen anvendes fortrinnsvis ved straks å dyppe den i en prøve eller ved på annen måte å Introdusere en prøve på bærermatriksen, hvorved en detekterbar kolorimetrisk endring opptrer når glukose er tilstede. Kontakt med prøven kan også tilveiebringes ved hjelp av pipette, vattpinne eller spatel. Selvom dypping er en meget tilfreds-stillende fremgangsmåte når urin benyttes, vil en serumprøve normalt kreve pipettering. ;Semikvantitative glukosekonsentras]oner kan bestemmes visuelt ved sammenligning med et egnet fargekart eller målinger kan gjøres instrumentelt ved reflektans fra en hvilken som helst side av innretningen dersom en transparent bærerdel benyttes. ;En foretrukket utførelse for en forsøksinnretning for glukosemållng er en selvindikerende innretning som tillater bestemmelse av konsentrasjoner av glukose i en vandig prøve uten sammenligning med et i tillegg tilveiebragt fargekart. På grunn av den grunnleggende kjemien for reagensene som er innbefattet ved foreliggende oppfinnelse, kan en selv-indikerende innretning tilveiebringes hvor den eneste brukerbe-stemmelsen som er påkrevet er bestemmelsen av antall forsøksinnretninger på en flerpunktsforsøksinnretning som har forandret farge. En selv-indikerende innretning kan konstru-eres slik at hver forsøksinnretning forandrer farge til tilnærmet den samme fargen når den bringes i kontakt med en glukoseprøve ved en konsentrasjon som er lik eller større enn den spesifiserte konsentrasjonen som forsøksinnretningen er utformet for å reagere med. ;Den selv-indikerende innretningen fremstilles ved å feste et stort antall forsøksmatrikser til en bærerdel. Hver forsøks-matriks fremstilles ved inkorporering av et forsøkspreparat, utformet for å reagere med en annen, men forhåndbestemt konsentrasjon av glukose, på en bærer. Forsøkspreparatet kan sammensettes som beskrevet ovenfor, imidlertid vil vanligvis de samme kjemiske komponentene være Inkorporert på hver matriks, og preparatet i hver forsøksmatriks vil adskllle seg fra hverandre bare når det gjelder konsentrasjonen av dihydroksyd og den innledende pH-verdien. I en foretrukket sammensetning for glukose i det høye konsentrasjonsområdet, fremstilles den selv-indikerende innretningen ved inkorporering av et stort antall forsøksmatrikser med en pH-indikator som er istand til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons og en boratbuffer hvor konsentrasjonen av boratbufferen og den innledende pH-verdien for boratbufferen er forskjellig i hver forsøksmatriks. ;Den selv-indikerende utførelsen er spesielt foretrukket for bestemmelsen av glukose med en boratbuffer. Ved å telle antallet felter som forandrer farge, kan brukeren avgjøre mengden av glukose som er tilstede uten å gjøre bruk av sammenligning med fargekart. Feltene kan være arrangert separat på en bærer som f.eks. "Trycite" eller sammenføyet. For en glukosekonsentras jon i prøven som er mindre enn den konsentrasjonen som innretningen er utformet for å reagere med, vil det ikke forekomme noen fargeendring. Når brukeren får informasjon om at en fargeendring på en eller to forsøksinnretninger tilsvarer en normal avlesning, men endring av tre eller flere forsøksinnretninger tyder på en mulig patologisk tilstand, kan han ta de nødvendige for-holdsregler eller søke profesjonell hjelp uten behov for å sammenligne fargen av feltet med et fargekart. Tått i betraktning forskjellene i evnen til fargeadskillelse hos forskjellige individer og forskjellene i fargeadskillelse under forskjellige belysningsbetingelser, er anvendelsen av foreliggende oppfinnelse i denne utførelsen spesielt fordelaktig. ;I dihydroksy-kompleksdanningssystemet frigjør kompleksdannelsen mellom glukose og dihydroksydet et proton. Derfor reduseres pH i systemet. I et enkeltfeltsystem forandrer indikatoren farge over pH-område som dannes ved kompleksdannelsen av glukose over det konsentrasjonsområdet for glukose som systemet er utformet for å bestemme. Vanligvis velges en indikator med en pKa tilnærmet midt i pH-området som ventes i forsøket. Reduksjonen i pH med økende glukosekonsentras jon kan modereres noe ved at den innledende pH-verdien i forsøksinnretningen fastsettes til et punkt som best modererer den dannede pH-endring. ;De fleste pH-Indikatorer endrer farge over et relativt bredt pH-område, over mindre pH-områder innenfor dette området er fargen som er synlig for øyet tilsynelatende den samme. Konsentrasjonen av dihydroksyd og den innledende pH-verdien kan velges for hver innretning slik at ved reaksjonen med en hvilken som helst konsentrasjon av glukose som er lik eller større enn den konsentrasjonen forsøksinnretningen er utformet for å reagere med, vilpH-endringen som opptrer ved kompleksdannelsesreaksjonen føre indikatoren til et punkt innenfor det mindre pH-område hvor fargen tilsynelatende er den samme for det blotte øyet. I en foretrukket utførelse hvor det benyttes en boratbuffer og kresolrødt, er det funnet at selv om nyansen for den reagerte forsøksinnret-ningen kan være forskjellig (f.eks. kan en reagert forsøks-innretning tilveiebringe en lys gullfarge, mens en annen reagert forsøksinnretning kan tilveiebringe en dyp gullfarge), er den endelige fargen for forsøksinnretningen som er utformet for å reagere med en konsentrasjon lik eller større enn glukosekonsentrasjonen i prøven den samme. På den annen side vil fargen for forsøksinnretninger som er utformet for å reagere med glukosekonsentrasjoner som er større enn konsentrasjonen i forsøksprøven, definitivt beholde fargen for en ureagert forsøksinnretning (i tilfelle kresolrødt er fargen av den ureagerte forsøksinnretningen rød). Indikatorer som skal benyttes i en selv-indikerende innretning for glukosekonsentras]oner i det høye området bør forandre farge innenfor pH-området fra 6,5 til 12. For den selv-indikerende utførelsen er det foretrukket å benytte en indikator, som f.eks. kresolrødt eller m-kresolpurpur, som har en definert farge ved mer basiske pH-verdier (høyere pH-verdier) og som forandres brått til en veldefinert og dramatisk endret farge ved lavere pH-verdier. En tilsvarende fargeendring over et ønsket pH-område kan oppnås med blandede indikatorsystemer. ;De følgende eksemplene beskriver forsøk som ble utført under utviklingen av foreliggende oppfinnelse. En foretrukket selv-indikerende utførelse er beskrevet i eksempel 4. ;Følgende forkortelser er benyttet i eksemplene. ;;EKSEMPLER ;1. Forbehandling med fenylboronsyrebuffer. ;"Whatman 54,<1->filterpapir ble neddykket i en vandig oppløs-ning som Inneholdt 0,2 M f enylboronsyrebuffer med Innledende pH-verdi 9,05. Det impregnerte papiret ble så tørket i 15 minutter ved 60"C i en luftfylt ovn. Det tørkede papiret ble neddykket i en vandig oppløsning som Inneholdt 0,25 M boratbuffer, innledende pH-verdi 9,05, og 0,0856 m-kresolpurpur (natriumsalt). En forrådsoppløsning av 1% m-kresolpurpur I etanol ble benyttet til å fremstille impregneringsopp-løsningen. Boratbufferen ble fremstilt ved å oppløse borsyre i vann, regulere pH-verdien til 9,05 med kaliumhydroksyd og fortynne til det ønskede volum. Det dobbelt impregnerte papiret ble Igjen tørket i 15 minutter ved 60<*>C I en luftfylt ovn.

Et stykke av det dobbelt tørkede papiret ble festet til en bærerdel av polystyren for å oppnå hensiktsmessig hånd-tering. Forsøksinnretningene ble undersøkt ved dypping i vandige prøver som inneholdt fra 1000 mg/dl til 8000 mg/dl (dvs. 1 g/dl til 8 g/dl) glukose. Resultatene som er vist på figuren viser god lineær korrelasjon mellom glukosekonsentrasjon (g/dl) og avlesning på innretningen.

2. Ingen forbehandling.

"Whatman 54"-filterpapir ble neddykket i en oppløsning som inneholdt:

Det impregnerte papiret ble tørket i 15 minutter ved 60"C i luftfylt ovn og et stykke av det tørkede papiret ble festet til bærerdelen fremstilt av polystyren. Den ferdige forsøks-innretningen tilveiebringer god visuell oppløsning mellom 1000, 2000, 3000, og 5000 mg/dl glukose. Fargen endres fra rødt for negativt (mindre enn 1000 mg/dl glukose) til gult (5000 mg/dl glukose).

3. Dobbelt indikatorsystem

En spesielt foretrukket forsøksinnretning for bestemmelse av glukose i det høye området (dvs. konsentrasjoner på minst 1000 mg pr. dl) i en urinprøve fremstilles som følger:

Oppløsning 1 (10$ aceton i vann)

Oppløsning 2 fremstilles i 10% aceton. Den endelige oppløs-ningen inneholder 10$ aceton og 10$ etanol.

Filterpapir, som f.eks. "Whatman 54" eller "E & D 204", forbehandles ved dypping i oppløsning 1 og tørking. Det tørkede, forbehandlede papiret dyppes i oppløsning 2 og tørkes. Det doble indikatorsystemet letter den semikvantitative adskillelsen av glukosekonsentras]oner mellom 1000 mg/dl og 10 000 mg/dl siden forskjellen i kolorimetrisk respons mellom forskjellige konsentrasjonsnivåer er større. Dette er spesielt ønskelig ved en visuell avlesning av forsøksinnretningen.

4. Selv-indikerende glukoseinnretning

A. Indikatoren m-kresolpurpur ble benyttet til å fremstille en forsøksinnretning for bestemmelse av 1, 2, 4 og 8 gram glukose pr. desiliter urin.

Fire stykker av "Whatman 54 "-papir (25,4 x 5,08 cm) ble impregnert med 0.2M fenylborat ved pH 9,0 og tørket i 15 minutter ved 50"C. Hvert stykke ble så behandlet med en av de følgende oppløsningene:

Papirene ble igjen tørket (15 minutter ved 50"C), påført på dobbeltklebende limbånd og oppskåret i bånd med bredde 0,508 cm. Båndene ble påført på "Tryclte" plassert etter økende boratkonsentrasjon og pH (mot håndtaket) og oppskåret i striper på 0,508 cm.

Ved dypping i en urinprøve som inneholdt 6 g glukose pr. dl forandret tre forsøksinnretninger farge fra purpur til gull. Selv om dybden av den endelige gullfargen var forskjellig (dvs. noe lysere gull til en dypere gullfarge) for hver av de reagerte forsøksinnretningene, kunne alle de reagerte feltene som var utformet for å bestemme 6 g/dl glukose eller mindre, lett identifiseres som gullfargede. Den fjerde forsøksinnretningen, som var utformet for å reagere med 8 g/dl glukose, forble purpurfarget.

B. En tilsvarende selv-indikerende innretning ble fremstilt ved å benytte kresolrødt som en indikator.

Fire stykker "Whatman 54 "-papir (25,4 x 5,08 cm) ble behandlet med 0,1 M fenylboratoppløsning ved en pH på 8,0, og deretter tørket i 15 minutter ved 50°C. Hvert stykke ble deretter separat impregnert med en av de fire forskjellige oppløsningene:

Forsøksinnretningene var utformet for å reagere med hen-holdsvis 1, 2, 4 og 8 g/dl glukose i urinprøver. Forsøksinn-retningene ble montert som beskrevet ovenfor. Den selv-indikerende innretningen viste ingen fargeendring (forble rød) når den ble dyppet i en urinprøve som inneholdt 0,5 g/dl glukose. Når den ble dyppet i en urinprøve som inneholdt 3 g/dl glukose, endret imidlertid to felter farge (til gult).

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for kolorimetrisk bestemmelse av glukosekonsentrasjon i en biologisk prøve, karakterisert ved at den Innbefatter trinnene: - blanding av en biologisk prøve med en forsøksoppløsning som har en innledende pH større enn 6,5 og som i det vesentlige består av en boratbuffer og en pH-indikator som er i stand til å detektere pH i området fra 6,5 til 12; - bestemmelse av pH i den resulterende blandingen; og - korrelasjon av den detekterte pH med en glukosekonsentrasjon for den biologiske prøven.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH-indikatoren er en dobbelt indikator omfattende bromtymol-blått og kresol-rødt.

3. Forsøkssammensetning for semikvantitativ bestemmelse av glukose i en biologisk prøve, karakterisert ved at den innbefatter: - en boratbuffer som er i stand til å holde en forsøks-sammensetning ved en innledende pH over 6,5; og - en pH-indikator som er i stand til å tilveiebringe en detekterbar kolorimetrisk respons i pH-området fra 6,5 til 12.

4. Forsøksinnretning for semikvantitativ bestemmelse av glukose 1 en biologisk prøve, karakterisert ved at den Innbefatter en bærermatriks og forsøkssammensetningen ifølge krav 3.