FI81451C - Foerfarande, testkompositioner och testanordningar foer semikvantitativ bestaemning av glukos i ett vattenhaltigt testprov. - Google Patents

Description

1 81451

Menetelmä, testikoostumuksia ja testivälineitä glukoosin määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti vesipitoisesta testinäytteestä 5 Keksintö koskee ei-entsymaattisia menetelmiä glu koosin määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti ja erityisesti ei-entsymaattisia diagnosointikoostumuksia glukoosin määrittämiseksi kolorometrisesti vesipitoisesta tes-tinäytteistä.

10 Glukoosikonsentraation määrittäminen vesiliuoksesta on tarpeen teollisesti sokeriteollisuudessa sekä lääketieteessä. Glukoosin määrittäminen puolikvantitatiivisesti kehon nesteistä kuten virtsasta tai verestä on kansanterveydellisistä syistä tärkeää lääketieteessä diabeteksen 15 toteamiseksi laajojen seulontatutkimusten avulla ja erityisen tärkeää määrittäminen on diabeetikoille, joiden on säännösteltävä sokerinsaantiaan. Koska diabeteksen varhainen toteaminen ja jatkuva tarkkailu on ensiarvoisen tärkeää, lääkäri, kliinikko tai kotona testiä käyttävä diabee-20 tikko saa suurimman hyödyn glukoositestistä, joka nopeutensa ja yksinkertaisuutensa ansiosta on mukava suorittaa, mutta on kuitenkin niin herkkä, että sillä pystytään osoittamaan merkitseviä vaihteluja virtsan ja veren glu-koospitoisuudessa.

25 Suurien glukoosipitoisuuksien, jotka tässä määri tellään glukoosikonsentraatioksi 1000 mg/dl eli 10 g/1, tai suuremmaksi, määrittäminen on tärkeää siksi, että glu-koosikonsentraatio diabeetikon virtsassa saattaa olla 5000 mg/dl tai suurempikin. Virtsan suurien glukoosikonsentraa-30 tioiden kvantitatiivinen arviointi on tärkeää ainakin kahdesta syystä. Ensiksikin on hätätapauksissa tärkeää voida todeta, onko tajuttomuuden syynä diabeettinen kooma, josta osoituksena on suuri glukoosipitoisuus virtsassa. Toiseksi virtsan glukoosipitoisuus kasvaa, jos insuliinia on käy-35 tetty riittämättömästi. Niinpä testi, jolla pystytään ar- 2 81 451 vioimaan suuria virtsan glukoosipitoisuuksia, on käyttökelpoinen insuliinitarpeen terapeuttisessa tarkkailussa.

Tällä hetkellä useimmat kliiniset glukoosidiagno-sointitestit perustuvat glukoosioksidaasin entsymaatti-5 seen vaikutukseen B-D-glukoosiin: β-D-glukoosi + 02 + H20 (glukoosioksidaasi) H202 + glukoni- 11 " « happo 10 ja kromogeenin (Cr) näin tapahtuvaan hapettumiseen hapettuneeseen tilaansa (Cr*), joka voidaan visualisoida värin-muutoksella: H202 + Cr -H20 + Cr* 15

Testi on suoritettavissa hyvin kätevästi, jos tes-tivälineellä voidaan määrittää glukoosipitoisuus puoli-kvantitatiivisesti vertaamalla väriä, joka kehittyy välineen oltua kosketuksessa testinäytteen kanssa, visuaali-20 sesti asianmukaiseen väriasteikkoon. Tällainen puolikvan-titatiivinen määritys voidaan myös suorittaa laitteen avulla mittaamalla heijastuma reagoineesta välineestä. Glukoosikonsentraation ylittäessä määrän 1000 mg/dl useimpien entsymaattisissa systeemeissä käytettyjen kromo-25 geenien väri on kuitenkin niin tumma, että suuria kon-sentraatioita ei voida erottaa toisistaan. US-patentissa nro 4 340 669 esitetään tuloksia, jotka saatiin käytettäessä kromogeeninä o-tolidiinia, tetrametyylibentsidiiniä ja tetraetyylibentsidiiniä testattavan nesteen glukoosipi-30 toisuuksilla 0, 50, 100, 250, 500 ja 1000 mg/dl. Kaikkien näiden kromogeenien väri muuttui keltaisesta vaaleanvihreäksi glukoosipitoisuuden kasvaessa arvosta 0 mg/dl arvoon 50 mg/dl. Kun glukoosipitoisuus kasvoi yli 500 mg/dl, hapettuneen kromogeenin väri tummui siten, että 35 ko. kromogeenien väriksi tuli oliivinmusta, musta ja tum-

II

3 81 451 manvihreä. Tämä havainto osoittaa selvästi, että määritettäessä glukoosia entsymaattisesti vesipitoisista nesteistä muodostuu ongelmalliseksi se, että tunnetut kromogeenit näyttävät suurilla glukoosikonsentraatioilla mustilta tai 5 voimakkaan tummanvihreiltä, mikä rajoittaa testivälineiden käyttökelpoisuutta määritettäessä glukoosipitoisuuksia yli 500 mg/dl. Joskaan ongelma ei ole yhtä akuutti määritettäessä värinmuutos laitteen avulla, se on yhtä kaikki olemassa. Glukoosin määrityksissä entsymaattisilla koostumuk-10 silla on jossain määrin pystytty parantamaan alueen visuaalista luettavuutta lisäämällä muita kromogeenejä, esim. m-anisidiinia (US-patentti nro 4 340 669).

Suurilla glukoosikonsentraatioilla esiintyvän huonon väridifferentioinnin lisäksi entsyymeihin pohjautuvia 15 glukoositestejä häiritsee kehon nesteissä oleva askor-biinihappo (C-vitamiini), ne ovat kalliita ja niihin liittyy pysyvyysongelmia.

Glukoosi on myös mitattu ei-entsymaattisilla menetelmillä. Näihin kuuluvat mittauselektrodiin pohjautuvat 20 instrumentaalimenetelmät (ks. esim. US-patentti nro 4 127 448) ja koskettamaton, automaattinen glukoosianturi-systeemikin, jossa potilaan silmästä määritetään skan-naamalla sarveiskalvon läpäisevä säteily (ks. US-patentti nro 3 958 560). US-patentissa nro 4 278 438 julkistetaan 25 menetelmä ja laite sakkaridien analysoimiseksi. Sakkaridit eluoidaan kromatografiapylväästä alkyleenipolyamiinilla boraattipuskurissa.

US-patentissa nro 4 371 374 julkistetaan menetelmä veren glukoosin mittaamiseksi, jossa erotetaan ja määri-30 tetään kvantitatiivisesti ei-entsymaattisesti, glykosyloi- tuja aminohappoja, peptidejä tai niiden seoksia käsittelemällä virtsanäytettä sopivalla boorihapolla glykosyloitu-jen yhdisteiden kompleksoimiseksi, erottamalla yhdisteet toisistaan ja analysoimalla erotettu, kompleksoitu aines. 35 Käsiteltävänä olevassa keksinnössä ei tarvita moni- 4 81451 mutkaisia välineitä, mutta silti se mahdollistaa glukoosin määrittämisen halutun suurena pitoisuutena muodostamalla kompleksi glukoosin ja boori- tai maa-alkalimetallidihyd-roksidin välillä. Sokerien kompleksinmuodostus boori- ja 5 maa-alkalimetallidihydroksideilla on kuvattu (S.A. Barker et ai., Carbohydrate Research, 26 (1973)) 33-40; N. Roy et ai., Carbohydrate Research, 24 (1972) 180-183), mutta tätä ilmiötä ei ole käytetty hyväksi glukoosipitoisuuden määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti vesipitoisista tes-10 tinäytteistä.

Käsiteltävänä olevan keksinnön suositeltavana toteuttamismuotona tarjotaan itseosoittava testiväline glukoosin määrittämiseksi, joka pohjautuu glukoosin komplek-sontiin dihydroksidikomponentilla. Tämän keksinnön it-15 seosoittava testiväline mahdollistaa glukoosipitoisuuden visuaalisen määrittämisen vertailematta väri-indikaattori asteikkoon .

US-patentissa nro 4 042 329 on julkistettu kertakäyttöinen osoitusväline kolesterolin määrittämiseksi. 20 Julkistettu väline ilmoittaa kolesterolikonsentraation määrätyssä biologisessa nesteessä ja konsentraatio on suoraan luettavissa välineeseen merkittynä arvona.

Piirustuksesta ilmenee keksinnön mukaisella tes-tivälineellä visuaalisesti suoritettujen glukoosikonsent-25 raatiomääritysten toistettavuus. Testivälineet, jotka oli formuloitu suurien glukoosipitoisuuksien määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti, saatettiin kosketukseen preparoitujen virtsatestinäytteiden kanssa, jotka sisälsivät 1-8 g/dl glukoosia. Graafisesta esityksestä ilmenee, että glu-30 koosikonsentraation G (g/dl) ja välineen antaman lukeman R (g/dl) välillä vallitsee lineaarisuhde. Testivälineet valmistettiin siten, että kantajana toimivaa paperimatriisia esikäsiteltiin fenyyliboorihaposta valmistetulla boraat-tipuskurilla ennen testikoostumuksen lisäämistä, joka muo-35 dostui boorihaposta valmistetusta boraattipuskurista ja pH-indikaattorista.

Il 5 81 451

Keksintö tarjoaa menetelmän glukoosin määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti vesipitoisesta testinäyt-teestä, tällaisessa määrityksessä käyttökelpoisen testi- koostumuksen, testivälineen sekä menetelmän sen valmis- 5 tamiseksi ja käyttämiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle glukoosin määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti vesipitoisesta tes-tinäytteestä on tunnusomaista, että a) valmistetaan testiliuos saattamalla vesipitoinen 10 testinäyte kosketukseen boori- tai maa-alkalimetallidihyd- roksidin kanssa, joka lähtö-pH:ssa yli 6,5 pystyy muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin kompleksin muodostuessa vapautuu protoni, ja valinnaisesti puskurin kanssa, joka pystyy vastustamaan pH:n muutosta pH-alueella 15 noin 6,5 - 12, ja b) määritetään testiliuoksen lopullinen pH-arvo.

Keksinnön mukaiselle testikoostumukselle on tunnusomaista, että se sisältää a) boori- tai maa-alkalimetallidihydroksidia, joka 20 lähtö-pH:ssa yli 6,5 pystyy muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin kompleksin muodostuessa vapautuu protoni, ja valinnaisesti puskuria, joka pystyy vastustamaan pH:n muutosta pH-alueella noin 6,5 - 12, ja b) pH-indikaattoria, jolla saadaan aikaan todettava 25 kolorimetrinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12. Testikoos- tumukseen voidaan lisätä kantajamatriisi, joka mahdollistaa muodoltaan hyvin mukavakäyttöisen testivälineen.

Keksinnön mukaiselle testivälineelle on tunnusomaista, että se muodostuu kantajamatriisistä ja siihen 30 yhdistetystä testikoostumuksesta, joka sisältää (a) boori-tai maa-alkalimetallidihydroksidin, jolla saadaan pH-arvo yli 6,5 testikoostumusta sisältävän kantajan pinnalle, kun kantaja kostutetaan, ja joka pystyy myös muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin kompleksin muodostuessa 35 vapautuu protoni, ja (b) pH-indikaattorin, jolla saadaan 6 81451 aikaan todettava kolorimetrinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12.

Suositeltava toteuttamismuoto on itseosoittava tes-tiväline käytettäväksi visuaaliseen puolikvantitatiiviseen 5 glukoosipitoisuuden määrittämiseen vesipitoisesta näytteestä ilman värikarttaa. Itseosoittavalle testivälineelle on tunnusomaista, että (a) se käsittää joukon testimatriiseja, jotka on kiinnitetty kantajajäseneen, 10 (b) kukin testimatriisi sisältää kantajamatriisia ja siihen yhdistettyä testikoostumusta, (c) kukin testikoostumus sisältää boori- tai maa-alkalimetallidihydroksidia, joka lähtö-pH:ssa yli 6,5 pystyy muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin 15 kompleksin muodostuessa vapautuu protoni, ja pH-indikaat-torin, jolla saadaan aikaan todettava kolorimetrinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12, (d) kukin testimatriisi sisältää testikoostumusta, joka eroaa toisesta yhdistetystä testikoostumuksesta käy- 20 tetyn lähtö-pH:n ja sisältämänsä boori- tai maa-alkalime-tallidihydroksidipitoisuuden suhteen, jolloin kukin testimatriisi pystyy synnyttämään vasteen eri glukoosipitoisuudelle, jolloin saadaan aikaan suunnilleen samanlainen visuaalinen kolorimetrinen vaste.

25 Lukuisat hiilihydraatit, jotka sisältävät cis-dio- liryhmittymän, muodostavat erilaisia komplekseja dihydrok-sidiryhmän sisältävien yhdisteiden kanssa (ks. esim. N. Roy et ai., Carbohydrate Research 24 (1972) 180-183 ja S.A. Barker et ai., Carbohydrate Research 26 (1973) 33- 30 40). On havaittu, että tätä kompleksinmuodostuskykyä voi daan hyödyntää glukoosikonsentraation määrittämiseksi puo-likvantitatiivisesti vesipitoisesta testinäytteestä valmistamalla testiliuos siten, että saatetaan näyte kosketukseen dihydroksidin kanssa lähtö-pH:ssa yli 6,5, joka 35 dihydroksidi pystyy muodostamaan kompleksin glukoosin

II

7 81451 kanssa, jolloin kompleksin muodostuessa vapautuu protoni liuokseen, ja määrittämällä testiliuoksen lopullinen pH-arvo.

Sopivia dihydroksideja ovat barium-, boori-, kal-5 sium- magnesium- ja strontiumdihydroksidi (Ba(OH)2, Z- B(OH)2, Ca (OH) 2, Mg(OH)2 ja Sr(OH)2). Suositeltavia ovat boori- ja strontiumdihydroksidi. Erityisen suositeltavia ovat booridihydroksidit, joilla on yleinen kaava 10 Z-B(0H)2 jossa Z on elektroneja puoleensa vetävä ryhmä, esim. nit-roryhmä, tai elektroneja stabiloiva ryhmä, esim. hydrok-syyli- tai areeniryhmä. Kun Z on hydroksyyliryhmä, boori-15 hydroksidina on boorihappo, fenyyliboorihappo, β-nitrofe-nyyliboorihappo, 4-metoksifenyyliboorihappo ja a-naf-tyyliboorihappo sekä muut areeniboorihapot ja niiden johdannaiset. Areeniryhmä määritellään hiilivetyryhmäksi, joka sisältää vähintään yhden aromaattisen renkaan. Nämä 20 ryhmät ovat käsiteltävänä olevassa keksinnössä käyttökelpoisia, mikäli dihydroksidin negatiivinen anionimuoto voidaan stabiloida aromaattisen renkaan kanssa syntyvän elek-troniresonanssin avulla. Esim. yhdiste fenyyliboorihappo, jossa Z on fenyyliryhmä, on keksinnössä erityisen käyttö-25 kelpoinen. Lisäksi ovat käyttökelpoisia areenijohdannaiset, esim. β-nitrofenyyliboorihappo, joiden aromaattisen renkaan substituentteina on elektroneja puoleensa vetäviä ryhmiä.

Glukoosi voidaan määrittää siten, että valmistetaan 30 testiliuos vesipitoisesta testinäytteestä ja dihydroksidi-komponentista lähtö-pH:ssa yli 6,5, joka komponentti pystyy muodostamaan kompleksin glukoosin kanssa ja kompleksin muodostuessa vapautuu protoni, ja määritetään testiliuoksen lopullinen pH-arvo. Testiliuos voidaan tavallisesti 35 muodostaa saattamalla yksinkertaisesti dihydroksi kosketukseen vesipitoisen testinäytteen kanssa.

β 81451

Barium-, boori-, kalsium-, magnesium- ja strontium-dihydroksidi muodostavat yleensä 1:1-komplekseja glukoosin kanssa. Siten dihydroksidin ja glukoosin suhteen on oltava testinäytteessä suunnilleen yhden suhde yhteen. Valmistet-5 taessa booridihydroksidista, esim. boorihaposta, riittävän väkevä testiliuos glukoosin määrittämiseksi, jonka konsen-traatio on n. 500 mg/dl tai suurempi, saattaa olla tarpeen käyttää emästä kuten kaliumhydroksidia tai natriumhydrok-sidia boorihydroksidin liuottamiseksi. Vastaavasti voidaan 10 käyttää boorihapon suolaa hydroksidikomponentin osana. Voidaan tietenkin käyttää muitakin emäksiä, mikäli ne eivät häiritse dihydroksidin ja glukoosin kompleksinmuodos-tusta.

Testiliuoksen loppu-pH voidaan mitata tavalliseen 15 tapaan pH-mittarilla tai visuaalisesti tai laitteen avulla pH-indikaattorin lisäämisen jälkeen.

pH:n muutos, jonka dihydroksidikomponentin ja glukoosin kompleksinmuodostus aiheuttaa, voidaan torjua lisäämällä puskuria. Testikoostumusta, joka sisältää pusku-20 ria, joka pystyy torjumaan pH:n muutokset pH-alueella n.

6,5- n. 12, voidaan käyttää glukoosin määrityksessä laajemmalla konsentraatioalueella kuin määritettäessä tes-tikoostumuksella ilman puskuria. Sopivia puskureita ovat tris(hydroksimetyyli)aminometaani, josta tavallisesti käy-25 tetään lyhennettä TRIS, N,N-bis(2-hydroksietyyli)glysiini, josta tavallisesti käytetään lyhennettä BICINE, ja N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo, josta tavallisesti käytetään lyhennettä HEPES. Käytettäessä boo-ridihydroksidia kuten boorihappoa tai fenyyliboorihappoa 30 on erityisen mukavaa käyttää puskurimuotoa dihydroksidi-komponenttina.

Boraattipuskuri määritellään yhdisteen Z-B(0H)2 happo- ja emäsmuodon seokseksi. Molempien muotojen tasapainotila voidaan kaavamaisesti esittää 35 II.

9 81451 Θ ^ΟΗ Ζ-Β(ΟΗ)2 + Η20 —ζ-Β + Η*

OH^OH

5 jossa Ζ voi olla mikä tahansa yllä kuvattu ryhmä.

Boraattipuskuri voidaan valmistaa boorihaposta (Z = OH) tai areeniboorihappojohdannaisista kuten fenyy-liboorihaposta tai Z-B(OH)2-yhdisteiden seoksista taval-10 lisesti käytettyjen ja ammattimiehen hyvin tuntemien laboratoriomenetelmien avulla. Esim. boorihappopuskuriliuos voidaan valmistaa titraamalla boorihappo emäksellä kuten natriumtai kaliumhydroksidilla lähtö-pH-arvoon, joka on käytetyn Z-B(OH)2-yhdisteen puskurointialueella. Olete-15 taan, että tämä puskurointialue ulottuu useimmilla Z-B-(OH)2 yhdisteillä pH-arvosta 6,5 arvoon 12. Puskuri voidaan myös valmistaa lisäämällä dihydroksidin ekvimoolisia määriä happo- ja emäsmuotoa ja liuottamalla ne veteen.

Lähtö-pH:n valinta voi vaikuttaa määrätyllä testi-20 koostumuksella määritettävän glukoosin konsentraatioalu-eeseen. Esim. boorihydroksidin kyky muodostaa kompleksi glukoosin kanssa vähenee, kun liuoksen pH alittaa boraat-tipuskurin pKa-arvon. Elektroneja puoleensa vetävien substituenttien lisääminen areeniboorihappojohdannaisesta 25 valmistettuun puskuriin muuttaa puskurin pKa-arvoa ja siten sen tehokasta pH- ja kompleksinmuodostusaluetta.

Esim. boorihapon, pKa 9,2, kompleksinmuodostuskyky on pienempi pH-arvossa alle n. 7,0, kun taas fenyyliboori-happo, pKa 8,8, muodostaa kompleksin glukoosin kanssa jo-30 pa niinkin matalassa pH-arvossa kuin 6,5. p-nitrofenyyli-boorihapon, pKa 7,4, tehokas pH on jopa tätäkin pienempi. Boraattipuskurien, esim. boorihappopuskurin ja fenyyli-boorihappopuskurin seos pystyy laajentamaan boraatti-glu-koosikompleksinmuodostuksen tehokasta pH-aluetta ja siten 35 laajentamaan glukoosin määrityskelpoista konsentraatio- 10 81 451 aluetta. Käytettäessä boorihappopuskuria lähtö-pH yli 8,0 on suositeltava. Määritettäessä boorihappopuskurilla suuria glukoosipitoisuuksia lähtö-pH yli 9,0 on erityisen suositeltava.

5 Glukoosin määrityksessä puskuri on käyttökelpoi- simmillaan, kun sen lähtö-pH on hieman suurempi kuin sen pKa-arvo. Puskuri voidaan tietenkin toimittaa kuivanakin, jolloin siitä poistetaan vesi lähtö-pH:n säätämisen jälkeen. Rekonstituoituna puskuri pystyy jälleen saavut-10 tamaan tämän pH-arvon.

Erityisen sopiva testikoostumus glukoosin määrittämiseksi sisältää yllä määriteltyä dihydroksidia ja pH-indikaattoria, joka synnyttää havaittavissa olevan väri-vasteen pH-alueella n. 6,5- n. 12. Voidaan käyttää mitä 15 tahansa pH-indikaattoria tai mitä tahansa indikaattoriyh- distelmää, jonka värinmuutos tapahtuu tällä pH-alueella. Käyttökelpoisia indikaattoreita ovat m-kresolipurppura, kresolipuna, neutraalipuna, tymolisini, fenolftaleiini, o-kresoliftaleeni, fenolipuna, bromitymolisini tai yleis-20 indikaattori "Universal Indicator", joka on Kodakin myymä indikaattoriseos. Glukoosikonsentraatio voidaan määrittää testikoostumuksella yksinkertaisesti siten, että koostumus saatetaan kosketukseen testinäytteen kanssa ja luetaan muodostunut, todettavissa oleva värivaste.

25 pH-indikaattorin värinmuutos tapahtuu laajalla pH- alueella. Indikaattorin pKa-arvo osuu värinmuutoksen suunnilleen keskikohtaan. Valitun boraattipuskurin lähtö-pH riippuu käytetystä indikaattorista. Esim. m-kresoli-purppuran väri muuttuu purppurasta pH:ssa 9,0 keltaiseksi 30 pH:ssa 7,4. pH-arvon 9,0 yläpuolella indikaattori pysyy purppuranvärisenä tai pH:n muutos ei juurikaan muuta väriä. Jos lähtö-pH on 9,0, jokainen pH:n muutos ilmenee todettavissa olevana vasteena. Jos lähtö-pH on 9,2 tai suurempi, koostumuksen väri ei muutu, ts. sillä ei voida 35 määrittää glukoosin konsentraatio, ennen kuin pH laskee

II

li 81451 alle 9,0. Siten m-kresolipurppuraa käyttävät koostumukset, joiden sisältämä puskuri mahdollistaa lähtö-pH:n 9,0, reagoi herkemmin pienempään glukoosikonsentraatioon kuin koostumukset, joiden sisältämä puskuri mahdollistaa 5 lähtö-pH:n 9,2. Jos käytetään toista pH-indikaattoria, toinen lähtö-pH saattaa olla suositeltava. Esim. kresoli-punan pH-alue on välillä n. 8,8 (punainen) ja n. 7,2 (keltainen) ja siten tämän testikoostumuksen optimitoiminnan lähtö-pH on suositeltavasti alempi, esim. 9,0.

10 Käyttämällä enemmän kuin yhtä indikaattoria voi värinmuu-tos tapahtua laajemmalla pH-alueella ja siten laajemmalla glukoosikonsentraatioalueella.

Suurien glukoosipitoisuuksien (tässä määriteltynä vähintään 1000 mg/dl glukoosia) määritykseen erityisen 15 sopiva testikoostumus muodostuu boraattipuskurista, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta alueella noin 6,5 - 12, ja pH-indikaattorista, jolla saadaan aikaan todettava kolorimetrinen vasteen pH-alueella noin 6,5 - 12.

Suositeltavassa, suurien virtsan glukoosipitoi-20 suuksien määrittämiseen valmistetussa koostumuksessa bo-raattipuskurina on boorihappopuskuri, joka on valmistettu siten, että sillä saavutetaan lähtö-pH n. 9,2. Tämä korkea lähtö-pH estää virtsan pH-arvosta ja puskurikapa-siteetista johtuvan ei-spesifisen pH-muutoksen ja häiriö-25 vaikutuksen. Näin valmistetusta puskurista voidaan valmistaa kuivamuoto kylmäkuivaamalla tai kuivaamalla tavalliseen tapaa, jolloin poistetaan puskurin valmistuksessa käytetty vesi.

Testikoostumukseen voidaan lisätä muita kom-30 ponentteja kuten kostutusaineita, stabilointiaineita tai sakeutusaineita edellyttäen, että ne eivät häiritse di-hydroksidin ja glukoosin kompleksinmuodostusta.

Nämä koostumukset voivat olla pullotetun reagens-sin, rikottavan, testikoostumusta reagenssin muodossa si-35 sältävän kapselin tai pillerin tai tabletin muodossa.

12 81 451

Testiväline, joka on keksinnön suositeltava toteuttamismuoto, valmistetaan käsittelemällä sopivaa kanta jamatriisia nestemäisen reagenssin muodossa olevalla testikoostumuksella ja kuivaamalla.

5 Kantajamatriisina voi olla mikä tahansa aine, joka voidaan liittää testikoostumuksen komponentteihin, mikäli se on olennaisesti inertti testikoostumuksen suhteen, huokoinen ja/tai pystyy absorboimaan testattavaa vesinäytettä. Sanonnalla "kantajamatriisi" tarkoitetaan joko 10 kosteutta imeviä tai imemättömiä matriiseja, jotka ovat liukenemattomia veteen tai muihin fysiologisiin nesteisiin ja säilyttävät rakenteensa muuttumattomana joutuessaan kosketukseen näiden nesteiden kanssa. Sopivina kosteutta imevinä matriiseina voidaan käyttää paperia, 15 selluloosaa, puuta, muovikuitumattoa, kudottua kangasta, kuitukangasta ja vastaavia. Kosteutta imemättömiä matriiseja ovat lasikuitu, polymeerikalvot ja mikrohuokoiset membraanit.

On siis otettava huomioon, että keksinnön tes-20 tivälineen valmistuksessa voidaan käyttää kaikkia näitä ja muitakin matriisivaihtoehtoja. Matriisi voi myös muodostua systeemistä, jossa koostumuksen aineosat sekoitetaan neste- tai puolinestetilassa, joka sitten muuttuu kiinteäksi kovettumalla ja aineosat liittyvät näin yh-25 teen. Muita ajateltavissa olevia matriisimuotoja ovat mikrohuokoiset membraanit tai polymeerikalvomatriisit. Mikrohuokoisia membraaneja on saatavissa valmiina tai ne voidaan valmistaa esim. käänteisfaasitekniikalla. Sopivia polymeerikalvoja voidaan valmistaa kaupan olevista latek-30 siformulaateista, jotka pohjautuvat lateksipolymeerisuspensioihin, esim. sekapolymeerisuspensioon, jossa on styreeniä ja butadieenia suhteessa 60:40. Voidaan käyttää muitakin luonnon- tai synteettisiä polymeerejä tai niiden seoksia. Esimerkkejä tällaisista kalvoformulaateista löy-35 tyy US-patenteista nro 3 630 957 ja 4 312 834, jotka täten sisällytetään selitykseen.

Il 13 81 451 Tällä hetkellä suositeltavassa valmistusmenetelmässä impregnoidaan kosteutta imevä kantajamatriisi, esim. suodatinpaperi, koostumuksen vesiliuoksella ja kuivataan ja sitten kuivattu, impregnoitu matriisi kiin-5 nitetään tukielimeen. Impregnointiliuos valmistetaan siten, että sen lähtö-pH on halutunlainen. Testattaessa ko-koverinäytettä kuivattu, impregnoitu kantajamatriisi voidaan päällystää siten, että näytteen ylimäärä voidaan poistaa huuhtelemalla tai pyyhkimällä. Kuivaus ta-10 pahtuu halutulla, välineen koostumusta vahingoittamat-tomalla tavalla, tavallisesti lämpökaapissa. Kantaja-matriisi ja testikoostumus voidaan yhdistää halutulla tavalla, esim. pinnoittamalla, kastamalla, sivelemällä, ruiskuttamalla tai painamalla. Tämän jälkeen kuivattu 15 kantajamatriisi voidaan leikata liuskoiksi ja kiinnittää toisesta päästään tukielimeen, esim. jäykkään tai puoli-jäykkään polystyreenikalvoliuskaan. Dihydroksidikom-ponentti ja/tai puskuri on sellaisesa muodossa, että kostutuksen jälkeen lähtö-pH yhdistetyn kantajan pinnalla 20 on yli 6,5. Kostutetun, yhdistetyn kantajan pH voidaan mitata pintaelektrodeilla. Sanonnalla "yhdistetty kantaja" tarkoitetaan kantajamatriisia, joka on yhdistetty testikoostumukseen ja kuivattu. Käytettäessä läpinäkyvää kalvoa voidaan reagoinut väline lukea laitteen avulla 25 liuskan kummaltakin puolelta. Paperi voidaan kiinnittää liuskaan kaksipuolisella teipillä, esim. teipillä, jota myy 3M Co., St. Paul, MN., kauppanimellä DOUBLE STICK®.

Kun käytetään paperikantajamatriisin ja boorihap-popuskurin yhdistelmää, voi olla eduksi käsitellä paperia 30 toisen boraattipuskurin, esim. fenyyliboorihaposta, läh- tö-pH yli 6,5, valmistetun boraattipuskurin vesiliuoksella ennen boraattipuskuria sisältävän testikoostumuksen lisäämistä. Oletetaan, että tällainen esikäsittely estää paperin ja testikoostumuksessa olevan boraattipuskurin 35 välisen vuorovaikutuksen.

14 81 451

Kiinteän testivälineen valmistuksessa käytetyn reagenssiliuoksen komponenttien konsentraatioalueet ovat:

Toimiva alue Suositeltava alue Boraattipuskuri 0,1 - 0,9M 0,1 - 0,4M

5 pH-indikaattori 0,025-0,2 % 0,04- 0,15 % Nämä komponenttien konsentraatioalueet ja suhteelliset konsentraatiot ovat käyttökelpoisia riippumatta siitä, onko liuos impregnointivesiliuos vaiko polymeeri-10 liuos. Suositeltava reagenssiliuos sisältää 0,10- 0,30 M boraattipuskuria titrattuna lähtö-pH-arvoon n. 8,5 - n.

9,5 sekä 0,05 - 0,10 % indikaattorina, esim. m-kresoli-purppuraan. Suositeltavassa toteuttamismuodossa paperi-matriisi impregnoidaan vesiliuoksella, joka sisältää 0,1-15 0,3 M boraattipuskuria titrattuna lähtö-pH-arvoon yli 6,5 ennen lisäämistä testikoostumukseen. Esikäsittelyssä käytettävä suositeltava boraattipuskuri valmistetaan fenyy-liboorihaposta.

Testivälinettä käytetään edullisesti siten, että 20 se kastetaan hetkeksi testinäytteeseen tai testinäytettä siirretään muulla tavoin kantajamatriisille, jolloin glukoosi, mikäli sitä on näytteessä, aiheuttaa todettavissa olevan värivasteen. Kosketus testinäytteeseen voidaan myös aikaansaada pipetillä, vanutupolla tai spaattelilla. 25 Joskin kastaminen on virtsanäytteellä hyvin toimiva menettely, seeruminäyte edellyttää normaalisti pipetointia.

Glukoosikonsentraatio voidaan määrittää puolikvan-titatiivisesti vertaamalla visuaalisesti asianmukaiseen väriasteikkoon tai mittaamalla laitteen avulla reflek-30 tanssi jommalta kummaltapuolelta, jos käytetään läpinäkyvää tukielintä.

Käsiteltävänä olevan keksinnön suositeltavana toteuttamismuotona on itseosoittava väline, joka mahdollistaa glukoosikonsentraation määrittämisen vesipitoisessa 35 testinäytteestä vertaamatta välineen mukana seuraavaan

II

is 81451 väriasteikkoon. Tässä keksinnössä käytettyjen reagenssien kemiallisesta peruskäyttäytymisestä johtuen voidaan itse asiassa valmistaa itseosoittava väline, jota käytettäessä tarvitsee vain laskea moniliuskatestivälineestä testi-5 liuskojen määrä, joiden väri on muuttunut. Itseosoittava väline voidaan valmistaa siten, että jokaisen testiliuskan, joka joutuu kosketukseen glukoositestinäytteen kanssa, jossa konsentraatio on yhtä suuri tai suurempi kuin määritelty konsentraatio, jolle testiliuska on tar-10 koitettu reagoimaan, väri muuttuu suunnilleen samaksi.

Itseosoittava väline valmistetaansiten, että kiinnitetään useita testimatriiseja tukielimeen. Jokainen testimatriisi valmistetaan siten, että liitetään tes-tikoostumus, joka on tarkoitettu reagoimaan erilaisen, 15 mutta ennalta määrätyn glukoosikonsentraation kanssa, ja kantaja yhteen. Testikoostumus voidaan formuloida yllä kuvatulla tavalla, mutta tavallisesti toimitaan siten, että samat kemialliset komponentit lisätään jokaiseen matriisiin ja testimatriisin koostumus eroaa muiden mat-20 riisien koostumuksesta vain dihydroksidikonsentraatiol- taan ja lähtö-pH-arvoltaan. Suositeltavassa formulaatissa suurien glukoosipitoisuuksien määrittämiseksi itseosoittava väline valmistetaan siten, että liitetään yhteen useita testimatriiseja ja pH-indikaattori, jolla saadaan 25 aikaan todettavan kolorimetrisen vasteen, sekä boraat- tipuskuri, jolloin boraattipuskurin konsentraatio ja läh-tö-pH ovat jokaisessa testimatriisissa erilaiset.

Itseosoittava muoto on erityisen suositeltava, kun glukoosi määritetään boraattipuskurilla. Laskemalla lius-30 kojen määrä, joiden väri on muuttunut, käyttäjä saa tietää näytteessä olevan glukoosimäärän tarvitsematta turvautua vertailuasteikkoon. Liuskat voidaan asettaa erikseen tukialustalle, jona on esim. Trycite, tai ne voidaan liittää yhteen. Näytteellä, jonka glukoosikonsentraatio 35 on pienempi kuin konsentraatio, jolle testiliuskan on ie 81451 reagoitava, ei tapahdu värinmuutosta. Käyttäjä, joka tietää, että yhden tai kahden testiliuskan värinmuutos vastaa normaaliarvoa ja kolmen tai useamman testiliuskan värinmuutos viittaa mahdolliseen patologiseen tilaan, voi 5 ryhtyä asianmukaisiin toimenpiteisiin tai mennä lääkäriin tarvitsematta verrata kaistan väriä väriasteikkoon. Kun ottaa huomioon sen, että eri ihmiset arvioivat värieroja eri tavoin ja että vaihteleva valaistus vaikuttaa värien erotuskykyyn, käsiteltävänä olevan keksinnön käyttö tässä 10 muodossaan on erityisen edullista.

Dihydroksidikompleksointisysteemissä glukoosin ja dihydroksidin välisessä kompleksinmuodostuksessa vapautuu protoni. Tästä syystä systeemin pH alenee. Yhdestä liuskasta (testiliuskasta) muodostuvassa systeemissä indi-15 kaattorin väri muuttuu pH-alueella, jonka glukoosin komp-leksinmuodostus synnyttää glukoosin konsentraatioalueel-la, jonka määrittämiseen systeemi on aiottu. Tavallisesti valitaan indikaattori, jonka pKa-arvo osuu testissä oletetun pH-alueen keskialueelle. Glukoosipitoisuuden nou-20 susta johtuvaa pH-arvon laskua voidaan jossain määrin torjua säätämällä testiliuskan lähtö-pH-arvo alueelle, joka parhaiten torjuu syntyneen pH-muutoksen.

Useimpien pH-indikaattorien väri muuttuu melko laajalla pH-alueella, joskin väri on tämän alueen kapeal-25 la osa-alueella visuaalisesti tarkasteltuna sama. Jokaisen testiliuskan dihydroksidikonsentraatio ja lähtö-pH voidaan valita siten, että reaktiossa glukoosin kanssa, jonka konsentraatio on yhtä suuri tai suurempi kuin kon-sentraatio, jolle testiliuska on tarkoitettu reagoimaan, 30 kompleksinmuodostusreaktion aiheuttama pH-muutos vie indikaattorin kohtaan pH:n kapealla osa-alueella, jossa väri näyttää paljaalle silmälle samalta. Suositeltavassa, boraattipuskuria ja kresolipunaa käyttävässä toteuttamismuodossa on todettu, että joskin reagoineen testiliuskan 35 värisävy saattaa olla erilainen (ts. toisella reagoineel-

II

17 81 451 la testiliuskalla saadaan vaalea kullanväri ja toisella reagoinneella testiliuskalla tumma kullanväri), tes-tivälineen, joka on aiottu reagoimaan konsentraatioon, joka on sama tai pienempi kuin testinäytteen glukoosi-5 konsentraatio, lopullinen väri on sama. Toisaalta tes- tiväline, joka on aiottu reagoimaan glukoosikonsentraati-oon, joka on suurempi kuin konsentraatio testinäytteessä, pysyy väriltään ehdottomasti samana kuin reagoimaton testiliuska (käytettäessä kresolipunaa reagoimattoman tes-10 tiliuskan väri on punainen). Indikaattorien, jotka käytetään suuria glukoosipitoisuuksia itseosoittavassa välineessä, värinmuutoksen on tapahduttava pH-alueella n.

6,5-12. Itseosoittavassa muodossa on suositeltavaa käyttää indikaattoria, esim. kresolipunaa tai m-kresolipurp-15 puraa, jolla on määrätty väri emäksisemmissä pH-arvoissa (korkeammissa pH-arvoissa) ja jonka väri muuttuu melko äkillisesti hyvin määritellyksi ja selvästikin erilaiseksi väriksi pienemmissä pH-arvoissa. Vastaava värinmuutos halutulla pH-alueella voidaan saavuttaa sekaindikaattori-20 systeemillä.

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan kokeita, jotka suoritettiin käsiteltävänä olevan keksinnön kehittämisen aikana. Suositeltava itseosoittava muoto kuvataan esimerkissä 4. Esimerkkien tehtävänä on valaista keksintöä ja 25 niitä ei saa tulkita keksinnön piiriä rajottaviksi, jonka vain patenttivaatimukset määrittelevät. Ammattimies pys tyy tarpeen mukaan vaihtelemaan, korvaamaan ja muuttamaan koostumuksen komponentteja ja aineosia ja reaktioparamet-rejä.

30 Lyhenteet:

Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä, mg milligrammaa ml millilitra dl desilitra 35 M molaarinen % painoprosentti 100 ml liuosta kohti 18 81 451 PVP-K90 poly(vinyylipyrrolidoni), keskimää räinen molekyylipaino 360 000, valmistaja GAF Corp. New York, N.Y. m-kresoiipurppura meta-kresolisulfoniftaleiini 5 kresolipuna o-kresoiisulfoniftaleiini neutraalipuna 2-metyyli-3-amino-6-dimetyyliamino- fenatsiini tymolisini tymolisulfoniftaleiini fenolipuna fenolisulfoniftaleiini 10 bromitymolisini dibromitymolisulfoniftaleiini

Klucel LF hydroksipropyyliselluloosa polyetyleeniglykoli polyetyleeniglykoli, molekyylipaino 4000 4000

Esimerkit 15 1. Esikäsittely fenyyliboorihapolla

Whatman 54 suodatinpaperi upotettiin 0,2 M fenyy-liboorihappopuskurin vesiliuokseen, lähtö-pH 9,05. Sitten impregnoitu paperi kuivattiin 15 minuuttia 60°C:ssa läm-pökaapissa. Kuivattu paperi upotettiin vesiliuokseen, 20 jossa oli 9,25 M boraattipuskuria, lähtö-pH 9,05, ja 0,08 % m-kresolipurppuraa (natriumsuola). Impregnoin-tiliuos valmistettllin perusliuoksesta, jossa oli 1 % m-kresolipurppuraa etanolissa. Boraattipuskuri valmistettiin liuottamalla boorihappo veteen, säätämällä pH arvoon 25 9,05 kaliumhydroksidilla ja laimentamalla tarvittavaan tilavuuteen. Kahdesti impregnoitu paperi kuivattiin uudelleen 15 minuuttia 60°C:ssa lämpökaapissa.

Kahdesti kuivatusta paperista leikattu pala kiinnitettiin käsittelyn helpottamiseksi polystyreenitukieli-30 meen. Testiväline testattiin kastamalla se vesipitoisiin testinäytteisiin, jotka sisälsivät 1000 - 8000 mg/dl (eli 1-8 g/dl) glukoosia. Piirustuksesta ilmenee glukoosikon-sentraation (g/dl) ja ]iuskalukeman hyvä lineaarikorre-laatio.

35

II

19 81 451 2. Ilman esikäsittelyä

Whatman 54 suodatinpaperi upotettiin liuokseen, jossa oli: boorihappopuskuria (IM, lähtö-pH 9,5) 2,0 ml 5 PVP K90:tä (15 %) 1,0 ml fenolipunaa (IM) 0,2 ml vettä 10,0 ml

Impregnoitu paperi kuivattiin 15 minuuttia 609C:ssa lämpökaapissa ja kuivatusta paperista leikattu 10 pala kiinnitettiin polystyreenitukielimeen. Valmiilla testivälineellä voitiin visuaalisesti helposti erottaa toisistaan pitoisuudet 1000, 2000, 3000 ja 5000 mg/dl. Väri muuttui negatiivisen tuloksen punaisesta (alle 1000 mg/dl glukoosia) keltaiseksi (5000 mg/dl glukoosia).

15 3. Kaksoisindikaattorisysteemi

Erityisen suositeltava testiväline suurien glukoo-sipitoisuuksien (ts. konsentraatio vähintään 1000 mg/dl) määrittämiseksi virtsatestinäytteestä valmistettiin seuraavasti : 20 Liuos 1 (10 % asetonia vedessä)

fenyyliboorihappopuskuria (lähtö-pH 9,0) 0,23 M

dedekyylibentseenisulfonihappoa (natriumsuola) 0,04 %

Liuos 2

boorihappopuskuria (lähtö-pH 9,0) 0,30 M

25 PVP-K 90:tä 1,2 % polyetyeleniglykoli 4000:ta 1,8 %

Klucel LF:ää (etanolissa) 0,4 %

Tween 21:tä 0,04 % kresolipunaa 0,03 % 30 bromitymolisineä (etanolissa) 0,003 %

Liuos 2 valmistettiin 10-%:iseen asetoniin. Lopullinen liuos sisälsi 10 % asetonia ja 10 % etanolia.

Suodatinpaperia, esim. Whatman 54 tai E & D 204, 35 esikäsiteltiin kastamalla se liuokseen 1 ja kuivaamalla.

20 8 1 4 51

Kuivattu, esikäsitelty paperi kastettiin liuokseen 2 ja kuivattiin. Kaksoisindikaattorisysteemin etuna on, että sillä pystytään puolikvantitatiivisesti erottamaan toisistaan glukoosikonsentraatiot alueella 1000 - 10 000 5 mg/dl, koska eri konsentraatioiden värivasteiden ero on suurempi. Tämä on erityisen toivottavaa käytettäessä visuaalisesti luettavaa testivälinettä.

4. Itseosoittava glukoositestivällne A. Käytettiin m-kresolipurppuraindikaattoria tes-10 tivälineen valmistamiseksi, jolla voitiin määrittää 1, 2, 4, ja 8 g/dl glukoosia virtsasta.

Impregnoitiin neljä Whatman 54 paperipalaa (25,4 x 5,08 cm) 0,2 M fenyyliboraatilla pH:ssa 9,0 ja kuivattiin 15 minuuttia 50°C:ssa. Sitten kutakin palaa käsiteltiin 15 yhdellä seuraavista liuoksista:

Boraattikonsentraatio (M) 0,2 0,4 0,6 0,8 (10 ml) 1 % m-kresolipurppuraa 0,8 0,8 0,8 0,8 (ml) etanolissa 20 pH 9,09,29,49,6

Paperit kuivattiin uudelleen (15 minuuttia SO’Cissa), kiinnitettiin kaksipuoliseen teippiin ja leikattiin 0,508 cm leveiksi suikaleiksi. Suikaleet puris-25 tettiin kiinni Trycite’en boraattikonsentraation ja pH:n kasvun suunnassa (kädensijaa kohti) ja leikattiin 0,508 cm leveiksi suikaleiksi.

Kastettuina virtsanäytteeseen, joka sisälsi 6 g/dl glukoosia, kolmen testiliuskan väri muuttui purppurasta 30 kullanväriseksi. Joskin lopullisen kultavärin intensiteetti (ts. hieman vaaleammasta kullanväristä intensiiviseen kullanväriin) vaihteli reagoineesta liuskasta toiseen, kaikki nämä reagoineet liuskat, joilla oli tarkoitus määrittää 6 g/dl tai vähemmän glukoosia, tunnis-35 tettiin helposti kullanvärisiksi. Neljäs testiliuska,

II

2i 81451 jonka oli määrä reagoida glukoosimäärän 8 g/dl kanssa, pysyi purppuranvärisenä.

B. Valmistettiin samanlainen itseosoittava väline käyttäen indikaattorina kresolipunaa.

5 Neljää Whatman 54 paperipalaa (25,4 x 5,08 cm) kä siteltiin 0,1 M fenyyliboraattiliuoksella pHrssa 0,8 ja kuivattiin sitten 15 minuuttia 50°C:ssa. Sitten jokainen pala impregnoitiin erikseen yhdellä seuraavista neljästä erilaisesta liuoksesta: 10 Boraattikonsentraatio (M) 0,2 0,4 0,6 0,8 (10 ml) 0,5 % kresolipunaa vedessä 0,8 0,8 0,8 0,8 (ml) pH 9,0 9,2 0,6 9,8 15

Testiliuskojen oli määrä reagoida virtsates-tinäytteissä, joissa oli vastaavasti 1, 2, 4 ja 8 g/dl glukoosia. Testivälineet koottiin yllä kuvatulla tavalla.

20 Itseosoittavan välineen väri ei muuttunut (pysyi punaisena) kastettaessa se virtsanäytteeseen, jossa oli 0,5 g/dl glukoosia. Mutta kastettuina virtsanäytteeseen, jossa oli 3 g/dl glukoosia, kahden liuskan väri muuttui (keltaiseksi ).

25 On selvää, että yllä kuvattua keksintöä voidaan modifioida ja varioida monin tavoin poikkeamatta keksinnön hengestä tai piiristä.

Claims (10)

22 81 451

1. Menetelmä glukoosin määrittämiseksi puolikvan-titatiivisesti vesipitoisesta testinäytteestä, t u n - 5. e t t u siitä, että a) valmistetaan testiliuos saattamalla vesipitoinen testinäyte kosketukseen boori- tai maa-alkalimetal-lidihydroksidin kanssa, joka lähtö-pH:ssa yli 6,5 pystyy muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin komp- 10 leksin muodostuessa vapautuu protoni, ja valinnaisesti puskurin kanssa, joka pystyy vastustamaan pH:n muutosta pH-alueella noin 6,5 - 12, ja b) määritetään testiliuoksen lopullinen pH-arvo.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että dihydroksidi on boori- tai strontiumdihydroksidi..

3. Testikoostumus glukoosin määrittämiseksi puoli-kvantitatiivisesti vesipitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että se sisältää 20 a) boori- tai maa-alkalimetallidihydroksidia, joka lähtö-pH:ssa yli 6,5 pystyy muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin kompleksin muodostuessa vapautuu protoni, ja valinnaisesti puskuria, joka pystyy vastustamaan pH:n muutosta pH-alueella noin 6,5 - 12, ja 25 b) pH-indikaattoria, jolla saadaan aikaan todet tava kolorimetrinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen testikoostumus, tunnettu siitä, että dihydroksidi on boori- tai strontiumdihydroksidi.

5. Testiväline glukoosin määrittämiseksi puoli- kvantitatiivisesti vesipitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että se muodostuu kantajamat-riisista ja siihen yhdistetystä testikoostumuksesta, joka sisältää (a) boori- tai maa-alkalimetallidihydroksidin, 35 jolla saadaan pH-arvo yli 6,5 testikoostumusta sisältävän II 23 814 51 kantajan pinnalle, kun kantaja kostutetaan, ja joka pystyy myös muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin kompleksin muodostuessa vapautuu protoni, ja (b) pH-indikaattorin, jolla saadaan aikaan todettava kolorimet-5 rinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12.

6. Testikoostumus vähintään 10 g/1 olevan glukoo-sipitoisuuden määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti vesipitoisesta testinäytteestä, tunnettu siitä, että se sisältää (a) boraattipuskuria, joka pystyy vastusta- 10 maan pH:n muutosta pH-alueella noin 6,5 - 12, ja (b) pH-indikaattorin, jolla saadaan aikaan todettava kolorimet-rinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12.

7. Testiväline vähintään 10 g/1 olevan glukoosipi-toisuuden määrittämiseksi puolikvantitatiivisesti vesi- 15 pitoisesta näytteestä, tunnettu siitä, että se muodostuu kantajamatriisista ja siihen yhdistetystä testikoostumuksesta, joka sisältää (a) boraattipuskuria, joka pystyy vastustamaan pH-muutosta pH-alueella noin 6,5 - 12, ja (b) pH-indikaattorin, jolla saadaan aikaan 20 todettava kolorimetrinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12.

8. Itseosoittava testiväline käytettäväksi visuaaliseen puolikvantitätiiviseen glukoosipitoisuuden määrittämiseen vesipitoisesta näytteestä ilman värikarttaa, tunnettu siitä, että 25 (a) se käsittää joukon testimatriiseja, jotka on kiinnitetty kantajajäseneen, (b) kukin testimatriisi sisältää kantajamatriisia ja siihen yhdistettyä testikoostumusta, (c) kukin testikoostumus sisältää boori- tai maa- 30 alkalimetallidihydroksidia, joka lähtö-pH:ssa yli 6,5 pystyy muodostamaan glukoosin kanssa kompleksin, jolloin kompleksin muodostuessa vapautuu protoni, ja pH-indikaat-torin, jolla saadaan aikaan todettava kolorimetrinen vaste pH-alueella noin 6,5 - 12, 35 (d) kukin testimatriisi sisältää testikoostumusta, 24 81 451 joka eroaa toisesta yhdistetystä testikoostumuksesta käytetyn lähtö-pH:n ja sisältämänsä boori- tai maa-alkalime-tallidihydroksidipitoisuuden suhteen, jolloin kukin testimatriisi pystyy synnyttämään 5 vasteen eri glukoosipitoisuudelle, jolloin saadaan aikaan suunnilleen samanlainen visuaalinen kolorimetrinen vaste.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen itseosoittava testiväline, tunnettu siitä, että dihydroksidi on boori- tai strontiumdihydroksidi.

10. Menetelmä patenttivaatimuksen 8 mukaisen it- seosoittavan testivälineen käyttämiseksi vähintään 10 g/1 olevan glukoosipitoisuuden määrittämiseksi puolikvan-titatiivisesti vesipitoisesta testinäytteestä värikarttaan vertaamatta, tunnettu siitä, että 15 (a) saatetaan väline kosketukseen mahdollisesti glukoosia sisältävän vesipitoisen testinäytteen kanssa ja (b) määritetään muuttuneen värin omaavien kantaja-matriisien lukumäärä. Il 25 81451