FI85774C - Stabil komposition foer bestaemning av peroxidativt aktiva aemnen. - Google Patents

Description

1 85774

Pysyvä koostumus peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi

Keksintö koskee pysyviä koostumuksia peroksidatii-5 visesti aktiivisten yhdisteiden määrittämiseksi vesiliuok sista yleensä, sekä pysyviä testivälineitä erityisesti piilevän veren määrittämiseksi virtsassa.

Hemoglobiini ja sen johdannaiset ovat tyypillisiä esimerkkejä "peroksidatiivisesti aktiivisista" aineista, 10 koska ne käyttäytyvät samaan tapaan kuin peroksidaasient-syymi. Sellaisia aineita on kutsuttu myös pseudoperoksi-daaseiksi, eli entsyymimäisiksi siinä, että ne katalysoivat hapetus-pelkistysreaktioita peroksidien ja sellaisten indikaattoriyhdisteiden kuin bentsidiini, o-tolidiini, 15 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiini, 2,7-diaminofluoreeni tai vastaavat aineet, välillä aiheuttaen värinmuutoksen. Testit peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden toteamiseksi ovat erityisen käyttökelpoisia pienten verimäärien, joita usein kutsutaan "piileväksi" vereksi, toteamiseen 20 kehonnestenäytteistä, kuten virtsasta tai ulosteista. Ve ren läsnäolo virtsassa tai ulosteessa osoittaa verenvuotoa, joka voi johtua monista epänormaaleista tiloista, syöpä mukaanlukien. Koska on tärkeää todeta sellaiset tilat aikaisin, piilevän veren määritykset sisältyvät yleen-25 sä monista eri analyytin testaamiseen sopivista testityy-nyistä koostuviin testivälineisiin, joita tässä kutsutaan monitestivälineiksi tai "monitesteiksi", joita käytetään . virtsanäytteiden testaamiseen fysikaalisten rutiinitutki musten yhteydessä. Useimpiin monitestivälineisiin kuuluu 30 myös peroksidaasiin perustuva glukoosimääritys.

On havaittu ongelma kun kaliumjodidi-indikaattori-systeemiä käyttävä glukoositesti sijoitetaan monivälinee-seen hydroperoksidia substraattina käyttävän piilevän veren testin kanssa ja kun syntyvät monitestit pullotetaan, 35 varastoidaan ja/tai kuljetetaan. Näissä testeissä yleises- 2 85774 ti käytetyt hydroperoksidit, erityisesti kumeenihydroper-oksidi, 2,5-dimetyyliheksaani-2,5-dihydroperoksidi ja /’-t-butyylikumeenihydroperoksidi, näköjään haihtuvat ja/tai hajoavat varastoinnin ja käsittelyn aikana ja rea-5 goivat glukoositestissä olevan kaliumjodidin kanssa, aiheuttaen "vihertymistä" tai väärän positiivisen reaktion suljetussa pullossa. Tämä keksintö on ratkaissut tämän ongelman.

Piilevän veren testit ovat alalla sinänsä tunnettu-10 ja ja perustuvat yleensä hydroperoksidiin substraattina hemoglobiinille, kromogeeniin ja reaktion stabilisaattoriin tai kiihdyttimeen.

US-patentin 3 853 471 kohteena on testiliuska, joka sisältää hydroperoksidia sisältävää kantajaa, kromogeenia 15 ja fosforihappo- tai fosfonihappoamidia stabiloijana. Di-isopropyylibentseeniä kuvataan yhtenä hyödyllisenä substraattina .

US-patentin 3 975 161 kohteena on testiliuska, joka sisältää imukykyistä kantajaa, jossa on valmiste, joka 20 sisältää orgaanista hydroperoksidia tai sen suolaa, hapanta puskuria, kromogeenia, kostutusainetta, kiinteää polymeeristä kalvon muodostavaa luonnollista tai synteettistä ainetta ja uutta kiihdytintä. Kiihdytin on isokinoliini tai jokin sen johdannaisista. Julkaisun mukaan hydroperok-25 sidi voidaan valita ryhmästä, johon kuuluvat kumeenihydro-peroksidi,l,4-di-isopropyylibentseeni-l,4-dihydroperoksi-di, 2,5-dimetyyliheksaani-2,5-dihydroperoksidi ja hydrok-sisykloheksaani-l-hydroperoksidi.

Kinoliinin happosuolat tai adduktit ja johdannai-30 set ovat US-patentin 3 986 833 mukaan tehostavia aineita peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden havaitsemiseen.

Keksintö tarjoaa pysyvän testikooetumukseen peroksidatiivisesti aktiivisen aineen määrittämiseksi näytteestä. Keksinnön mukaiselle testikoostumukselle on tunnus-35 omaista, että se sisältää 1,4-di-isopropyylibentseenihyd-roperoksidia ja bentsidiini-indikaattoria moolisuhteessa

II

3 85774 noin 0,9 - 3,0.

Keksintö koskee myös stabiilia testivälinettä, jonka herkkyys on ainakin yksi miljoonaosa hemoglobiinia kehon näytettä. Keksinnön mukaiselle testivälineelle on tun-5 nusomaista, että se sisältää a) kantajamatriisin, b) siihen imeytetyn testikoostumuksen, johon kuuluu 1,4-di-isopropyylibentseenidihydroperoksidia ja bent-sidiini-indikaattoria moolisuhteessa noin 0,9 - 3,0, 10 tehostetta ja puskuria, joka pystyy pitämään pH:n alueella noin 4 - 7,5.

Testiväline voidaan tehdä askorbaattiresitenssiksi lisäämällä rautakelaattia. Välinettä voidaan käyttää moni-testin valmistamiseen, joka voi myöskin määrittää glukoo-15 siä perustuen glukoosioksidaasin, peroksidaasin ja kalium-jodidi-indikaattorin käyttöön, ilman vihertymisongelmaa.

Keksinnön mukaista pysyvää koostumusta voidaan käyttää peroksidatiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseen näytteestä. Mikä tahansa vesipitoinen nestemäinen 20 näyte tai vesipitoiseen nesteeseen liukoinen näyte, jonka epäillään sisältävän peroksidatiivisesti aktiivista ainetta, voidaan testata. Testikoostumus on erityisen hyödyllinen kehonnesteiden, kuten virtsan tai ulosteiden kanssa. Eräs hyödyllisimmistä toteutuksista on kiinteä piilevän 25 veren testiväline virtsassa käyttöä varten. Virtsan piilevän veren testi on erityisen käyttökelpoinen yhtenä rea-genssityynynä monitestivälineessä. Sellaiset monitesti-välineet sisältävät yleensä ainakin yhden glukoosimääri-tyksen. Erilaisia monitestivälineitä toimittaa Ames Divi-30 sion of Miles Laboratories Inc., Elkhart, IN., tavaramerkeillä MULTISTIJ^ -reagenssiliuska ja N-MULTISTI3^ -rea-genssiliuska.

Aikaisemmissa MULTISTIJ®- ja N-MULTISTIji® -valmisteissa, joissa on sekä glukoosinmääritys että piilevän ve-35 ren testi, on huomattu glukoosireagenssityynyn "vihertymi-eeksi" kutsuttu ilmiö kuljetuksen ja/tai varastoinnin ai- 4 85774 kana ennen käyttöä. Glukoosinmääritys perustuu siihen, että glukoosioksidaasi muodostaa vetyperoksidia yhdessä glukoosia sisältävän näytteen kanssa, minkä jälkeen muodostunut vetyperoksidi määritetään kaliumjodidi-indikaattori-5 systeemillä, jolloin peroksidaasin läsnäollessa muodostuu näkyvä väri. Glukoosityynyn "vihertyminen"viittasi siihen, että oli tapahtunut jokin reaktio peroksidaasi/ka-liumjodidi -systeemin kanssa jo ennen kuin käyttäjä avasi reagenssiliuskapullon käyttöä varten. Uskottiin, että tämä 10 ilmiö aiheutui hajoamisesta ja/tai orgaanisen hydroperok-sidisubstraatin haihtumisesta monitestissä varastoinnin tai kuljetuksen aikana.

Sellaisten monitestien kaupallinen myynti vaatii riittävää varastointikestävyyttä kuljetusta, jakelua, se-15 kä asiakkaan tarvitsemaa käyttöikää varten. "Vihertymisen" voitiin ajatella osoittavan 30 glukoosimilligramman desilitraa kohden (mg/dl) positiivista tulosta näytteessä, jonka olisi pitänyt antaa negatiivinen tulos. Siksi sellaista "vihertymistä" ennen käyttöä ei voida hyväksyä.

20 Kliinisesti käyttökelpoisen piilevän veren testin herkkyyden pitäisi olla ainakin 1 ppm hemoglobiinia (piilevää verta) virtsanäytteessä. Löytyi vain yksi hydroper-oksidi, jolla oli riittävä herkkyys ja pysyvyys ja joka ei vaikuttanut muihin reagenssitesteihin monitestivälineessä: 25 1,4-di-isopropyylibentseenidihydroperoksidi.

1,4-di-isopropyylibentseenidihydroperoksidin (joka lyhennetään DBDH ja kutsutaan "dihydroksiperoksidiksi" tässä ja jota voidaan myös nimittää a,<x'-dihydroperoksi- 1,4-di-isopropyylibentseeniksi) kaava on: 30 CH3

• r H3C /K' OOH

:·:! O

35

H-.C ^P^OOH

CH 3 5 85774 DBHN:n todettiin olevan haihtumaton, sublimoitumaton yhdiste. Toisin kuin muut hydroksiperoksidit sen todettiin olevan räjähtämätön erilaisissa olosuhteissa ja sitä voitiin siksi valmistaa ja varastoida suurin määrin.

5 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiiniä käyttävän pii levän veren virtsasta määrittävän testivälineen optimointi osoitti, että on säilytettävä kriittinen moolisuhde dihydroperoksidin ja bentsidiini-indikaattorin välillä halutun vaikutuksen saamiseksi. Kriittinen moolisuhde oli 10 noin 0,9 - 3,0 moolia dihydroperoksidia yhtä bentsidiini-indikaattorimoolia kohden, edullisimmin noin 1,6 - 3,0 moolia dihydroperoksidia yhtä bentsidiini-indikaattorimoo-lia kohden. Tämän moolisuhdealueen alapuolella ei saavutettu vaadittua herkkyyttä; tämän moolisuhteen yläpuolella 15 reagenssityyny ei yllättäen osoittanut lainkaan reaktiivisuutta hemoglobiinille.

Testikoostumus

Pysyvässä testikoostumuksessa peroksidatiivisten aineiden määrittämiseksi pitää olla sama kriittinen di-20 hydroperoksidin moolisuhde bentsidiini-indikaattoriin. Koostumus on pysyvä eli säilyttää aktiivisuutensa lämpö-stressiolosuhteissa 4 viikkoa 50 °C:ssa. Vaikka 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiini on edullinen indikaattori, voidaan käyttää myös muita bentsidiini-indikaattoreita. Sopivia 25 bentsidiini-indikaattoreita ovat mm. tetraetyylibentsidii- ni, o-tolidiini, bentsidiini, o-dianisidiini ja muut vastaavat .

Herkkyys yksi ppm peroksidatiivista ainetta näytettä kohden saadaan sisällyttämällä koostumukseen tehostin-30 ta. Voidaan käyttää sinänsä tunnettuja tehostimia peroksi-datiivisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi. Näihin : kuuluvat kinoliinit ja niiden johdannaiset sekä isokino- liinit ja niiden johdannaiset. Tehostin voi edullisesti ’ olla isokinoliini, 4-bromi-isokinoliini, 4-metyylikinolii- 35 ni, 6-metoksikinoliini, 3-aminokinoliini tai 5,6-bentsoki- 6 85774 noliini. Tästä ryhmästä edullisimpia ovat kinoliinit, 4-metyylikinoliiiii ja 6-metoksikinoliini; 4-metyylikinolii-nin (saatavissa tavaramerkillä Lepidin® Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) ollessa kaikkein edullisin.

5 Testikoostumuksen tulisi olla puskuroitu, jos tes- tinäyte on hyvin hapan tai hyvin emäksinen. Puskuri voidaan valita mistä tahansa sellaisista, jotka pystyvät pitämään pH:n alueella noin 4,0 - 7,5. Sellaisia puskureita kuin fosfaatti, sitraatti, yms. tai niiden yhdistelmiä 10 voidaan käyttää sopivan pH-alueen aikaansaamiseksi.

Testiväline

Ylläkuvattuja testikoostumuksia voidaan yhdistää kantajamatriisiin ja kuivata, jolloin saadaan käytännöllinen kuivareagenssitestimuoto.

15 Testiväline on erityisen käytännöllinen tapa kehon näytteiden tutkimiseen. Stabiili testiväline, jonka herkkyys on miljoonasosa hemoglobiinia kehon näytteessä, voidaan valmistaa lisäämällä kantajamatriisiin DBDH ja bent-sidiini-indikaattoria suunnilleen moolisuhteessa 0,9 - 20 3,0, tehostinta ja puskuria, joka pystyy pitämään pH:n suunnilleen alueella 4 - 7,5. Käyttökelpoisia bentsidiini-indikaattoreita, tehostimia ja puskureita on kuvattu aiemmin. Stabiili testiväline määritellään siten, että se pystyy antamaan oikean testituloksen 4 viikon säilytyksen 25 jälkeen 50 °C:ssa. Silmämääräisesti luetun testituloksen sanotaan olevan oikea, jos värin ei katsota eroavan alkuperäisestä värialueesta. Tätä kutsutaan joskus termillä "alle puolen värialueen värinvähennys" ja se viittaa väri-alueisiin sopivassa käyttäjälle annetussa värikartassa. 30 Väri joka on lähempänä kuin "puolen värialueen" päässä oikeasta väristä, luetaan oikeaksi analyytin määräksi. Hemoglobiinin (piilevän veren) kliiniseen määritykseen sopivan herkkyyden on määrätty olevan 1 miljoonasosa. Ke-honnestenäytteiden pH on usein halutun alueen ulkopuolel-35 la, minkä vuoksi^ testikoostumukseen lisätään puskuria.

i, 7 85774

Kaupallisesti kelvollisella virtsan piilevän veren testillä on oltava kolme pääominaisuutta: stabiilisuus, herkkyys ja resistenssi askorbiinihapon vaikutuksille. Stabiilisuus- ja herkkyysvaatimukset on määritelty. Herk-5 kyys 1:1000000 vastaa 0,15 mg hemoglobiinia desilitrassa virtsaa. Askorbiinihappovaikutukset ovat sinänsä tunnettuja. Askorbiinihappo häiritsee indikaattorin hapettumista ja tuottaa näennäisiä negatiivisia tuloksia. "Askor-baattiresistenssin" määritellään tässä tarkoittavan olema-10 tonta vaikutusta havaittuun indikaattorin väriin, jossa virtsanäyte sisältää jopa 50 milligrammaa askorbiinihappoa näytedesilitraa kohden. Askorbiinihappo tai askorbaatti ovat yleisiä häiriötekijöitä redox-indikaattorisysteemei-hin perustuvissa diagnostisissa testeissä ja ovat erityi-15 sen tärkeitä testattaessa populaatiota, joka normaalisti nauttii C-vitamiinia.

Resistenssiä askorbaattihäiriöille voidaan saada testivälineeseen lisäämällä rautakelaatteja testivalmis-teeseen. Käyttökelpoisiin rautakelaatteihin kuuluvat rau-20 tapolykarboksialkyyliamiinikelaatit, kuten N-(2-hydrok- sietyyli)etyleenidiamiinitrietikkahappo (Fe-HEDTA), ety-leenidiamiinitetraetikkahappo (Fe-EDTA), sykloheksyleeni-diamiinitetraetikkahappo (Fe-CDTA), nitrilotrietikkahappo (Fe-NTA), iminodietikkahappo (Fe-IMDA), etyleenidiamiini-25 dietikkadipropionihappo (Fe-EDDP, sekä at- että fl-muodot), hydroksietyyli-iminodietikkahappo (Fe-HIMDA) ja niiden seokset. Edullisia ovat Fe-HEDTA ja Fe-EDTA; edullisin on Fe-HEDTA. Rautapolykarboksialkyyliamiinikelaatteja kuvataan tarkemmin US-patenttijulkaisussa 575 725, joka tässä 30 mainitaan lähdekirjallisuutena.

Fe-HEDTA:n käyttämiseksi halutun askorbaattiresis-tenssin aikaansaamiseen testiväline on edullisimmin puskuroitu yli pH 6,5:n, eli 6,5 - 7,1. Laajoilla kokeilla todettiin, että optimi-pH-alue 6,7 - 7,1, edullisimmin 6,80 35 - 6,82 tuotti parhaan tasapainon herkkyyden, stabiilisuu- β 85774 den ja askorbaattiresistenssin välillä käytettäessä virtsanäytteitä, joiden pH ja ominaispaino vaihtelivat suuresti. Yli 250:stä kokeillusta puskuriyhdistelmästä tris(hyd-roksimetyyli)aminometaanimalonihapon ja trietanoliamiini-5 boraatin seoksen moolisuhteessa 1:3 todettiin antavan optimituloksen virtsan testaukseen. Voidaan käyttää muitakin puskureita ja puskuriyhdistelmiä, kuten fosfaattia, sitraattia tai sukkinaattia. Silloin kuitenkin uhrataan jonkin verran herkkyyttä, stabiilisuutta tai askorbaatti-10 resistenssiä.

Muita aineosia, kuten paksuntimia, värinstabiloi-jia, pinta-aktiivisia aineita tms. voidaan lisätä. Polymeerin, kuten polyvinyylipyrrolidonin lisääminen parantaa stabiilisuutta ja testivälineen värinmuodostuksen tasai-15 suutta.

Kantajamatriisi

Kantajamatriisi voi olla mitä tahansa ainetta, johon testikoostumuksen osat voidaan imeyttää, kunhan se on inertti testikoostumuksen suhteen, huokoinen ja/tai tes-20 tattavaa vesiliukoista näytettä absorboiva. Ilmaus "kanta- jamatriisi" tarkoittaa joko imukykyisiä tai ei-imukykyisiä matriiseja, jotka ovat veteen liukenemattomia ja pitävät rakenteensa vedessä tai muissa fysiologisissa nesteissä. Sopivia imukykyisiä materiaaleja ovat paperi, selluloosa, 25 puu, synteettiset hartsivillat, kudotut ja ei-kudotut kankaat yms. Paperi on edullinen kantajamatriisi. Ei-imukykyisiä matriiseja ovat lasikuitu, polymeerikäIvot, ennal-tamuotoillut tai mikrohuokoiset membraanit ja organoplas-tiset materiaalit, kuten polypropyleeni yms.

30 Lisääminen matriisiin voidaan suorittaa millä ta hansa keinolla, kuten kastamalla, levittämällä tai ruiskuttamalla. Edullinen menetelmä on paperin kyllästäminen kastamalla reagenssiliuokseen ja kuivaamalla liuottimen poistamiseksi. Kuivaus voidaan suorittaa millä tahansa 35 keinolla, joka ei vaikuta haitallisesti käytettyihin rea- I; 9 85774 gensseihin, yleensä ilmakuivausuunilla.

Aikaisemmat piilevän veren testit valmistettiin lisäämällä kantajamatriieiin yhtä liuosta, joka sisälsi kaikki testiaineosat, ja kuivaamalla matriisi. Paperikan-5 taja kyllästettiin usein kastamalla paperi reagenssia sisältävään liuokseen. Menetelmää voidaan yhä käyttää testi-välineen valmistamiseksi yleensä peroksidatiivisesti aktiivisen aineen määritykseen. Edullinen testiväline, joka sisältää rautakelaattina Fe-HEDTAsta pitäisi kuitenkin 10 valmistaa kaksivaiheisella kyllästysmenetelmällä.

Edullisen testivälineen valmistusmenetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) ensimmäisen liuoksen valmistaminen, joka sisältää rautakelaattia, joka antaa testivälineelle askorbaat- 15 tiresistenssiä, ja puskuria, joka pitää pH:n alueella noin 6,5 - 7,1, b) toisen liuoksen valmistaminen, joka sisältää orgaanista liuotinta, 1,4-di-isopropyylibentseenidihydro-peroksidia ja bentsidiini-indikaattoria moolisuhteessa 20 noin 0,9 : 3,0 ja tehostinta, c) ensimmäisen tai toisen liuoksen lisääminen kanta jama triisiin, *. d) kantajamatriisiin kuivaaminen, e) toisen ensimmäisestä tai toisesta liuoksesta, 25 jota ei aiemmin ollut lisätty, lisääminen kuivattuun kantajaan, ja f) kantajan, johon on lisätty kahta ainetta, kuivaaminen .

Ensimmäinen liuos sisältää alle 50 % orgaanista 30 liuotinta, kun taas toinen liuos sisältää yli 50 % orgaanista liuotinta, edullisimmin 70 - 80 %. Sopivia orgaanisia liuottimia kumpaankin lisäysvaiheeseen ovat mm. dime-: tyyliformamidi, etanoli ja metoksipropanoli.

Edullinen DBDH: bentsidiini - moolisuhde on 1,6 : 35 3,0. Annetut DBDH : bentsidiini-indikaattori -moolisuhteet 10 85774 laskettiin toisen kyllästysliuoksen valmistukseen käytetyistä yhdistemääristä. Kuivatun testivälineen moolisuhde voi olla hiukan alempi, koska pieni määrä (noin 10 %) DBDHsta häviää hajoamisen vuoksi paperin kuivauksen aika-5 na. Lisäyhdisteitä, kuten polyvinyylipyrrolidonia, voi daan lisätä siihen liuokseen, johon lisääminen on käytännöllisintä.

Syntyvä kahdesti kuivattu ja kyllästetty paperi leikataan ja kiinnitetään jäykälle polymeeripohjalle, ku-10 ten polystyreenille. Muut pohjamateriaalit ovat alalla sinänsä tunnettuja. Saatu testiväline koostuu pienestä suorakaiteen muotoisesta reagenssityynystä, joka on kä-tevyyssyistä kiinnitetty vedenpitävään kädensijaan. Moni-testivälineeseen voidaan lisätä muita reagenssityynyjä, 15 jotka sisältävät erilaisia diagnostisia kokeita, kuten glukoosi, proteiini, pH, ominaispaino ja leukosyytit. Erityisesti tämän keksinnön reagenssityynyä voidaan käyttää monitestivälineessä peroksidaasi/kaliumjodidi- indikaatto-risysteemin sisältävän glukoosireagenssityynyn kanssa.

20 Testikoostumuksia voidaan käyttää muodostamalla liuos joko suoraan vesipitoisen testinäytteen kanssa tai lisäämällä vettä ennen kosketusta näytteeseen. Testiväli-nettä voidaan edullisesti käyttää saattamalla se kosketukseen kehonne s tenäytteen kanssa, poistamalla väline ja mää-25 rittämällä kehittynyt väri joko visuaalisesti tai instrumenteilla. Visuaalisesti luetut testit antavat yleensä semikvantitatiivisen konsentraatioalueen verrattaessa sopivaan käyttäjälle toimitettuun värikarttaan. Instrumentein määritetyt tulokset ovat jonkin verran kvantitatiivi-30 sempia ja niitä voidaan saada instrumentilla kuten esimerkiksi CLINITE^10 -reflektanssifotometri, myyjä Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN. Tulokset piilevän veren testistä, joka on kastettu virtsanäytteeseen saadaan yleensä alle minuutissa visuaalista tai inst-35 rumenttilukua varten. Monitestin instrumentaaliluku voi 11 85774 viedä kauemmin, johtuen siihen sisältyvistä muista rea-genssitesteistä, joiden lukuajät ovat pitemmät.

Seuraavia lyhenteitä käytetään käytännöllisyyden vuoksi. Esimerkeissä käytettyjen kemikaalien lähteet ovat 5 ilmoitetun mukaiset.

M molaarinen mM millimolaarinen mg milligrammaa dL desilitraa 10 DBDH 1,4-di-isopropyylibentseenidihydro- peroksidi % prosenttia, tilavuus-, ellei toisin mainita °C astetta Celciusta 15 PVP K30 polyvinyylipyrrolidoni molekyylipaino 40000, myyjä GAF Corp. New York, N.Y. Lepidiini 4-metyylikinoliini, myyjä Aldrich

Chemical Co., Milwaukee, WI.

SSD Standardiliuokselle annettu yksikkö 20 Fe-HEDTA Ferri-N-(2-hydroksietyyli)etyleeni- diamiinitrietikkahapo SG ominaispaino

Tris Tris(hydroksimetyyli)aminometaani

Bis-Tris l,3-bis[tris(hydroksimetyyli)metyyli- 25 amino ] propaani HEPES N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2- etaanisulfonihappo TEB trietanoliamiiniboraatti

Tris-maleaatti tris(hydroksimetyyli)amino-metaani- 30 maleiinihappo

Tris-malonaatti tris(hydroksimetyyli)aminometaani- maIonihappo

Seuraavat esimerkit kuvaavat suoritettuja kokeita. Vaikka esimerkit kuvaavat keksintöä, niiden ei pidä tulki-35 ta rajoittavan keksinnön alaa, jonka määräävät ainoastaan i2 85774 patenttivaatimukset. Alan ammattimies voi tehdä valmisteen osiin ja reaktioparametreihin sellaisia muutoksia, jotka kulloinkin vaikuttavat tarpeellisilta.

Esimerkki 1: Edullinen toteutustapa 5 Stabiili askorbaattiresistenttitesti, jonka herk kyys on yksi miljoonasosa verta virtsanäytteessä, valmistettiin kaksivaiheisella kyllästysmenetelmällä seuraavasti.

Ensimmäinen kyllästysliuos sisälsi seuraavien ai-10 neiden seoksen vedessä:

tris-malonaatti 0,1 M

trietanoliamiiniboraatti 0,3 M

natriumdodekyylisulfaatti 0,3 % (paino)

Fe-HEDTA 5 mm 15 seoksen pH oli säädetty välille 6,80 - 6,82 ja seos laimennettiin sitten dimetyyliformamidilla (lopullinen liuos sisälsi 45 % dimetyyliformamidia) Whatman^ 3MM -paperi kastettiin vesiliuokseen ja kuivattiin viisi minuuttia 85 °C:ssa.

20 Kuivattu paperi kastettiin toiseen kyllästysliuok seen, joka sisälsi: 3,3',5,5'-tetrametyylibentsi-

diiniä 25 - 35 mM

4-metyylikinoliinia 0,6 % (tilavuus) 25 PVP K30 4 % (paino)

DBDH 45 - 60 mM

dimetyyliformamidia 80 % (tilavuus) etyylioranssia 25 mg/dl oranssi 6 väriä 25 mg/dl 30 Kokeet osoittivat, että tämä valmiste täytti kaikki kaupallisesti kelvolliselle virtsan piilevän veren testille asetettavat vaatimukset.

Esimerkki 2: Sopimattomia hydroperoksideja Taulukossa 1 alla on joukko muita hydroperoksideja, 35 joita käytettiin DBDH:n tilalla esimerkin 1 valmisteessa ja jotka todettiin epäsopiviksi.

t.

i3 85774

Taulukko 1 hvdroperoksidi kommentteja kumeenihydroperoksidi Reaktiivinen, mutta muuttaa glukoositestinvihreäksi 5 monitestissä 1.4- di-isopropyylibentseeni- Reaktiivinen, mutta muuttaa monohydroperoksidi glukoositestin vihreäksi monitestissä ^>-t-butyyli-isopropyyli- Reaktiivinen, mutta muuttaa 10 bentseenihydroperoksidi glukoositestin vihreäksi monitestissä 2.5- dimetyyliheksaani-2,5- Reaktiivinen, mutta muuttaa dihydroperoksidi glukoositestin vihreäksi monitestissä 15 2-(a-hydroperoksi-isopropyy- Alhainen reaktiivisuus li-6-isopropyylinaftaleeni 2.6- di-(ct-hydroperoksi-iso- Ei reaktiivinen propyyli)naftaleeni /o-(α-hydroperoksi-isopropyy- Ei sopiva, reaktiivinen 20 libentsoehappo myös veren puuttuessa (vää riä positiivisia tuloksia) ^o-isopropyylibentseenisul- Ei reaktiivinen fonihappohydroperoksidi *:··: 25 Esimerkki 3: sopimattomia puskureita ."· Puskurisysteemin todettiin olevan tärkeä, jotta saataisiin kaupallisesti kelvollinen kuivareagenssinen .·.· virtsan piilevän veren määritys väline, joka oli vastustus kykyinen virtsalle, pH tn ja ominaispainon vaikutuksille ja 30 jolla oli muut vaaditut ominaisuudet. Testaus tehtiin yk-sityynyisellä testivälineellä virtsan piilevää verta varten käyttäen esimerkin 1 valmistetta, puskuria muunnellen. Seuraavassa taulukossa on osittainen lista puskuriyhdis-telmästä, joita kokeiltiin DBDH/Fe-HEDTA testivalmisteella 35 imeytettynä paperikantajaan.

i4 85774

Taulukko 2 Puskurisysteemit Puskurisvsteemi Tulos

Bis-Tris, pK 6,5 Ei resistentti virtsan pH:n 5 tai ominaispainon vaihtelulle HEPES, pK 7,0 Ei reaktiivinen

Imidatsoli, pK 7,0 - indikaattori reagoi valmis tusvaiheessa - ei reaktiivinen hemoglobii- 10 nille

Imidatsoli + Tris (pK 8,3) - indikaattori reagoi valmis tusvaiheessa - ei reaktiivinen hemoglobiinille 15 Fosfaatti, pK 6,9 - ei täytä askorbaattiresis- tens s ivaatimuks ia

Sitraatti + fosfaatti ei täytä askorbaattiresistens- sivaatimuksia

Tris + maleaatti (pK2=6,2) ei täytä askorbaattiresistens- 20 sivaatimuksia, toimii huonosti pH:n ja ominaispainon vaihdellessa

Maleaatti + TEB paperissa tahroja

Tris/Maleaatti/TEB ei täytä stabiilisuusvaatimuk- ··--· 25 siä

Malonaatti/TEB (ilman askorbaattiresistenssi hävi-

Tristiä) si stressikäsittelyssä

Sitruunahappo - natrium- askorbaattiresistentti, pH/ sitraattitrietanoliamiini- ominaispainoresistentti, mut-30 boraatti, pH=6,5 ta antaa vääriä posiitiivisia tuloksia 0,1 M Tris/malonaatti paras mahdollinen yhdistelmä 0,3 M TEB pH 6,8 tälle systeemille

0,2 M sitraatti, 0,3 M ei puskurikykyä pH:ssa yli 7,0 35 TEB

pH 7,1, 45 % etanolia is 85774

PuskurisvBteemi Tulos 0,1 M Tris/sitraatti ei puskurikykyä pH:ssa yli 7,0 0,3 M TEB, pH 7,1 5 Todettiin, että puskurisysteemi tris-malonaatti, trietanoliamiiniboraatti moolisuhteessa 1:3 antoi parhaat tulokset kliinisessä virtsapopulaatiossa, jossa on laaja pH- ja ominaispainovaihtelualue, joka vaihtelu vaikuttaa testin herkkyyteen.

10 Esimerkki 4: Stabiilisuus

Esimerkin 1 edullista testivälinevalmistetta käytettiin seuraavissa kokeissa testivälineen ainutlaatuisten lämpöstabiilisuusominaisuuksien osoittamiseksi. Allaolevat stabiilisuustiedot (taulukko II) vertaa HEMASTIXR-rea-15 genssitestiliuskaa, kaupallisesti Ames Division'ista,

Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN., saatavissa olevaa piilevän veren keksinnön mukaiseen testivälineeseen.

Tämän testivälineen lukemat neljän viikon lämpökäsittelyn jälkeen 50 °C:ssa olivat hyvin lähellä odotettua arvoa, 20 kun taas HEMASTIX0 -lukemat korkeammilla verotasoilla olivat jatkuvasti alhaisia.

Taulukko II

Verotaso 4 viikkoa 50°C Odotusarvo 25 fma/dl) Hemastix Tämä testi (SSD-vksikköä\ 0 10 10 10 0,018 10 18 20 0,045 18 28 30 0,135 29 38 40 30 SSD-yksiköt ovat mielivaltainen sarja yksiköitä, joita : käytetään eri värikarttatasoille, joissa negatiivinen vas- taa 10:tä ja tasot nousevat 10 yksikön välein.

Esimerkki 5: Vihertyminen 35 Eräs ongelma kvantifioitaessa visuaalisesti luet tavien kokeiden tuloksia on yksilöllinen vaihtelu värien ie 85774 näkemisessä. Vaihtelu voidaan eliminoida käyttämällä Mac-Beth 1500 -kolorimetria, valmistaja Kollmorgen Corp., Newburgh, N.Y., joka mittaa värin kolmiulotteisella asteikolla L*, a*, b*. L·*, a*, b* -arvot sallivat värin yksiselit-5 teisen kuvaamisen. Samanlaisilla väreillä on samat arvot ja ero yhdessä tai useammassa näistä arvoista osoittaa värieroa.

Monitestivälineen, saatavissa kaupallisesti nimellä N-MULTISTIJ^ SG, valmistaja Ames Division, Miles La-10 boratories, Inc., Elkhart, IN, piilevän veren testi luettiin MacBethilla kontrollinäytteellä käsittelyn jälkeen, samoin kuin liuskat, joita lämpökäsiteltiin 60°C:ssa ja testattiin 3 ja 7 vrk. välein. Käyrät saaduista L*, a*, b* -arvoista osoittivat selvän siirtymän seuraavaa kor-15 keampaa väriä kohden. Lämpökäsittelyn jälkeen liuskan väri negatiiviseen näytteeseen kastamisen jälkeen oli lähempänä odotettua väriä 30 mg/dl hemoglobiininäytteelle, kuin negatiiviselle näytteelle. Samoin värissä 30 mg/dl näytteelle oli havaittava siirtymä 100 mg/dl näytteelle odo-20 tettua väriä kohden.

Samanlaisissa käyrissä tehtynä monityynyiselle liuskalle, joka sisälsi saman glukoositestin kuin aiemmin oli käytetty (glukoosioksidaasi, peroksidaasi ja kalium-jodidi) ja keksinnön mukaisen piilevän veren testin, ei 25 näkynyt juuri minkäänlaista siirtymää L*, a*, b* -akseleilla testattaessa huoneenlämmössä ja lämpökäsittelyn jälkeen 60 °C:ssa 7 vrk. ajan. Huolimatta perusteellisesta lämpöstressistä, minkäänlaista "vihertymistä" ei havaittu negatiivisilla ja 30 mg/dl näytteillä.

30 Muunnelmia ja variaatioita edullisista toteutusta voista voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön hengestä.

li

Claims (10)

85774 Patenttivaatimukset s

1. Stabiili testikoostumus peroksidatiivisesti aktiivisen aineen määrittämiseksi näytteestä, tunnet- 5. u siitä, että se sisältää 1,4-di-isopropyylibentseeni-dihydroperoksidia ja bentsidiini-indikaattoria moolisuh-teessa noin 0,9 - 3,0.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen stabiili testi-koostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisäl- 10 tää tehostetta. '

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen stabiili testi-koostumus, tunnettu siitä, että tehoste on valittu 4-metyylikinoliinista tai 6-metoksikinoliinista.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen sta- 15 biili testikoostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää puskuria, joka pystyy pitämään pH:n alueella 4 - 7,5.

5. Stabiili testiväline, jonka herkkyys on ainakin yksi miljoonaosa hemoglobiinia kehon näytettä, t u n - 20. e t t u siitä, että se sisältää a) kantajamatriisin, b) siihen imeytetyn testikoostumuksen, johon kuuluu 1,4-di-isopropyylibentseenidihydroperoksidia ja bentsidiini-indikaattoria moolisuhteessa noin 0,9 - 3,0, 25 tehostetta ja puskuria, joka pystyy pitämään pH:n alueella noin 4 - 7,5.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää rauta-kelaattia, joka pystyy tuottamaan askorbaattiresistenssiä 30 testivalmisteelle.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että rautakelaatti on N-(2-hydrok-sietyyli)etyleenidiamiinitrietikkahapon rautakelaatti ja puskuri pystyy pitämään pH:n alueella noin 6,5 - 7,1.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 5-7 mukainen tes tiväline, tunnettu siitä, että puskuri on tris- ie 85774 (hydroksimetyyli)aminometaanimalonihapon ja trietanoli-amiiniboraatin seos moolisuhteessa l:n suhde 3:een.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 5-8 mukainen tes-tiväline, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää 5 polyvinyylipyrrolidonia.

10. Menetelmä stabiilin askorbaattiresistentin testi välineen valmistamiseksi, jonka välineen herkkyys on vähintään yksi miljoonasosa hemoglobiinia kehonäytteessä, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat vai- 10 heet: a) ensimmäisen liuoksen valmistaminen, joka sisältää rautakelaattia, joka pystyy antamaan testivälineelle askorbaattiresistenssiä, ja puskuria, joka pystyy pitämään pH:n alueella noin 6,5 - 7,1, 15 b) toisen liuoksen valmistaminen, joka sisältää orgaanista liuotinta, 1,4-di-isopropyylibentseenidihydro-peroksidia ja bentsidiini-indikaattoria moolisuhteessa noin 0,9:n suhde 3,0:n ja tehostinta, c) ensimmäisen tai toisen liuoksen lisääminen kan- 20 tajamatriisiin, d) kyllästetyn kantajamatriisin kuivaaminen, e) toisen ensimmäisestä tai toisesta liuoksesta, jota ei aiemmin ollut lisätty, lisääminen kuivattuun kantajaan, ja 25 f) kahdella aineella imeytetyn kantajan kuivaami nen . i i9 85774