JPH04213064A - 過酸化活性物質の検定のための組成物、用具及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試験試料中の過酸化活
性物質の存在及び濃度を測定する組成物、装置ならびに
方法に関する。さらに本発明は、より安定な指示試薬組
成物を用いることによって、潜血のような過酸化活性物
質に関して、尿のような液体試験試料を検定する新規及
び改良方法に関する。指示試薬組成物は、過酸化活性物
質を含有する試験試料に接触すると、検出可能又は測定
可能な反応を受ける。本発明の指示試薬組成物は、指示
試薬組成物と試験試料との接触に先立って、指示試薬組
成物中に存在する指示染料を有効に安定化することによ
って、過酸化活性物質に関する、より正確で、感受性の
高い検定を提供する。したがって、本発明の指示試薬組
成物によって達成される感度の改良は、潜血に関して尿
を検定するといったような、低濃度の過酸化活性物質に
関して試験試料を検定する改良方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】ペルオキシダーゼは、過酸化物による、
フェノール及びアミンのような種々の化合物の酸化に触
媒作用を及ぼす酵素である。さらに、特定の化合物は、
ペルオキシダーゼ酵素と同様の方法で行動する化合物で
あるため、疑似ペルオキシダーゼと呼ばれてきた。した
がって、疑似過酸化物はヒドロペルオキシドから酸素を
遊離し、その酸素をある受容体化合物に運搬する。それ
ゆえ、一般に、疑似ペルオキシダーゼは、過酸化物と被
酸化性化合物との間の反応に触媒として働くか、さもな
ければ沈殿するということが、酵素に似ている。疑似ペ
ルオキシダーゼはまた、過酸化活性物質とも呼ばれ、そ
してヘモグロビン及びその誘導体を包含する。

【０００３】例えば、グルコースに関する尿の検定にお
いては、グルコースオキシダーゼは、酸素の存在下で、
先ず尿中のグルコースをグルコン酸と過酸化水素に転化
する。つぎに、さらに検定に存在するペルオキシダーゼ
酵素は、過酸化水素と、ｏ−トリジンのような被酸化性
染料化合物との間の相互作用に触媒として働く。染料化
合物は、通常は還元状態では本質的に無色であって、過
酸化水素とのペルオキシダーゼ触媒相互作用による酸化
で変色して、ｏ−トリジンのために青色になる。変色の
程度及び強度は、グルコース転化によって生じる過酸化
水素の量に直接的に比例する。その時、グルコース転化
によって生じる過酸化水素の量は、尿試料中のグルコー
スの原濃度に相関する。

【０００４】同様に、ヘモグロビン及びその誘導体のよ
うな過酸化活性物質は、ヒドロペルオキシダーゼと被酸
化性染料との間の相互作用に触媒として働く。このよう
な相互作用においては、過酸化活性物質はペルオキシダ
ーゼ酵素を模倣して、被酸化性染料とヒドロキシペルオ
キシドとの間の相互作用に触媒として働くか、さもなく
ば沈殿する。過酸化活性物質によりヒドロキシペルオキ
シドから遊離される酸素は、被酸化性染料に運ばれる。 その結果生じる相互作用は、変色のような検出可能反応
を提供するが、この場合、その反応の強度は過酸化活性
物質の存在又は濃度を示す。

【０００５】過酸化活性物質に関する検定は、上記の色
原体相互作用に基づいているが、この場合、指示染料の
変色の程度及び強度は、試験試料中の過酸化活性物質の
濃度に相関する。過酸化活性物質に関する検定は、尿、
糞便、又は胃腸内容物のような体液試料中の、しばしば
「潜」血と呼ばれる低濃度の血液を検出及び測定する際
に特に有用である。尿、糞便、又は嘔吐物中の潜血は、
通常は裸眼では見えないけれども、潜血の検出は、胃、
腸及び尿路における出血の診断に際して重要である。出
血は、例えば問題の器官の腫瘍、潰瘍又は炎症によって
起こる。現在、試験試料中の潜血の存在を測定する方法
はほとんどが、ヘモグロビン又はミオグロビンの疑似ペ
ルオキシダーゼ活性に基づいている。

【０００６】尿中蛋白質は腎不全の最も重要な指標であ
るけれども、尿中の血液の存在も腎臓又は尿路に対する
損傷の指標である。一般に、検出可能量の潜血は、非常
に高感度の化学的方法を用いる場合でさえ、尿中には認
められない。尿中の血液は、無傷赤血球として、又は遊
離ヘモグロビンとして出現し得る。通常、遊離ヘモグロ
ビンの存在は、腎臓及び尿路を通じて膀胱への外傷性通
過のためか、あるいは血球の溶血を引き起こす膀胱中の
希釈尿に血球が暴露されていたために血球が破裂してい
たことを示す。

【０００７】とくに、尿又は糞便中の血液の存在は、癌
を含めた種々の異常状態の徴候である。尿中の血液の存
在は、潜血に関する陽性試験によって示される場合は、
しばしば尿路における出血を示す。遊離ヘモグロビンは
、腎疾患、感染性疾患、腫瘍、又は尿路の外傷作用部分
のために、尿中に存在する。尿中の遊離ヘモグロビンは
また、輸血反応、溶血性貧血、又は発作性夜間ヘモグロ
ビン尿症を示し得るし、あるいは種々の中毒から、又は
重症火傷後に出現し得る。さらに、ヘモグロビンに関す
る陽性化学試験は、赤血球が存在しない場合には、外傷
性筋損傷の結果としてのミオグロビン尿症を示し得る。

【０００８】ヘモグロビン尿症は、赤血球を伴わない尿
中の遊離ヘモグロビンの存在と定義される。これに対し
て、血尿は、尿中に無傷赤血球が存在する場合と定義さ
れる。血尿は、腎臓の顕微鏡的機能単位（ネフロン）に
おける特定の欠損を示し、そして腎臓、尿管、膀胱又は
尿道における出血を示す。血漿中の遊離ヘモグロビンは
、腎臓によって尿中に排出される。いくつかの状況にお
いては、赤血球の溶血は、赤血球が尿に入った後に起こ
る。赤血球を含有する大半の尿試料はまた、ある種の溶
血化潜血も含有する。目下、血球としての微量血液と遊
離ヘモグロビンの弁別はほとんど有意でない。

【０００９】筋肉組織の赤色呼吸色素であるミオグロビ
ンは、もう一つの過酸化活性物質である。ミオグロビン
は、その組成及び化学反応がヘモグロビンに非常によく
似ている。ミオグロビンは、ある種の損傷によって筋肉
細胞から遊離することがあるが、このような場合、ミオ
グロビンは血漿中に溶解して循環し、その後尿中に排出
される。さらに、ある種の遺伝的筋肉疾患は、筋肉から
ミオグロビンを喪失させ得るが、そのミオグロビンはそ
の後尿中に出現する。ミオグロビンは、心筋梗塞後の尿
中にも見出される。

【００１０】血尿、ヘモグロビン尿症、又はミオグロビ
ン尿症は、臨床的及び病理学的障害の明確な特性に依っ
ており、そして特定の疾患又は損傷の重症度に依ってい
る。さらに、その他の過酸化活性物質は、白血球及び細
菌中にも存在する。全般に、過酸化活性物質の検出は、
腎臓及び尿路の疾病ならびに感染の診断に際して特に重
要である。

【００１１】したがって、過酸化活性物質に関する尿及
びその他の試験試料の正確かつ徹底的な検定が、実験室
及び家庭での使用に役立たねばならない。検定によって
、過酸化活性物質が検出及び測定できるようになり、そ
こで、正しい診断がなされ、正しい医学的処置が施され
、監視され、維持されるようでなければならない。さら
に、検定方法を、尿又はその他の試験試料中の過酸化活
性物質の容易でがつ経済的な、定性又は定量的測定に対
してディップ−アンド−リード形式で利用し得る場合に
は、検定は有益である。

【００１２】さらに、尿又はその他の試験試料中の過酸
化活性物質の任意の検定方法は、過酸化活性物質以外の
試験試料成分との優先的相互作用といったような競合的
化学的又は物理的相互作用の結果としてではなく、過酸
化活性物質との相互作用の結果としての変色、もしくは
指示試薬組成物の不安定性によって生じる変色を受ける
指示試薬組成物を用いることによって、正確で、信頼で
きる、そして再現可能な結果を生じなければならない。 さらに、過酸化活性物質に関する検定方法が、尿又はそ
の他の試験試料中の過酸化活性物質の迅速で、経済的で
、しかも正確な測定のための乾相試薬ストリップにおい
て用いるのに適している場合には、その検定は有益であ
る。さらにまた、過酸化活性物質に関する検定に用いる
方法及び組成物は、多重限定試薬ストリップ上に存在す
るその他の試験試薬パッドに悪影響を及ぼしたり、ある
いは妨害したりすべきでない。

【００１３】したがって、ある個人が過酸化活性物質を
排出中であるか否かを測定するために、そして治療の有
効性を調べるための医学的処置の経過を監視するために
、潜血のような過酸化活性物質に関する簡単で、正確で
、経済的な検出検定が開発されてきた。さらに、尿中の
潜血の検出又は測定のために開発されたいくつかの異な
る検定方法のうち、ディップ−アンド−リード乾相試験
ストリップに基づく方法は、乾相試験ストリップ法が自
動化が容易で、そして再現可能であり、かつ正確な結果
を提供するために、特に有用であることが立証されてい
る。

【００１４】過酸化活性物質に関する検定に用いられる
いくつかの試験ストリップは、ベンジジン染料のような
指示染料；ヒドロペルオキシド；及び緩衝液を含む指示
試薬組成物を含浸させた適当な担体マトリックスの小四
角形パッドからなる単一試験領域を有する。その他の試
験ストリップは、上述のように過酸化活性物質の検定の
ための一試験領域を含有し、そしてさらに、その他の尿
中成分の同時検定を可能にするために同一ストリップ上
にさらにいくつかの試験領域を含有する多重限定試薬ス
トリップである。両タイプの比色試験ストリップに関し
ては、尿中の過酸化活性物質のための検定は、比色試験
ストリップを十分に混合した未遠心分画尿試料中に浸漬
し、ついで、その結果生じる試験ストリップの試験領域
の色を、比色試験ストリップ瓶上に提示される標準カラ
ーチャートと比較することによって、簡単に実施できる
。潜血試験は、初期に出血状態を検出することが重要で
あるために、通常は、ルーチン身体検査中に尿試料をス
クリーニングするための多重限定試薬ストリップに含ま
れている。

【００１５】試験ストリップ法は、尿中の血液の存在に
関する最も簡単で最も直接的な検定である。試験領域を
、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンのよう
な被酸化性指示染料、及び緩衝化ヒドロペルオキシドで
含浸する。試験領域は、尿試料中に存在するヘモグロビ
ンがヒドロペルオキシドによってテトラメチルベンジジ
ンの酸化反応に触媒として作用する場合、緑色ないし暗
青色になる。試験領域上の緑色スポットの発現は、無傷
の非溶血化赤血球を示す。上記の方法に従い、ある個人
について、尿試料中の過酸化活性物質の濃度を視覚的に
容易に測定できる。試験ストリップの色は、試験ストリ
ップを尿に浸漬して約１分後にカラーチャートと比較す
る。カラーチャート上のカラーブロックは、陰性、非溶
血化微量、溶血化微量、少量（１＋）、中等度量（２＋
）、及び大量（３＋）の血液を示す。カラーチャートは
橙色から緑色を経て青までの範囲である。検定は、通常
、約０．０１５〜約０．０６ｍｇ／ｄｌ（ミリグラム／
デシリットル）の遊離ヘモグロビン、又は１ミクロリッ
トル当たり約５〜約２０個の無傷赤血球を検出できる。

【００１６】さらに加えて、アスコルビン酸イオンが存
在すると、過酸化活性化合物に関する上記検定方法はひ
どく妨害される。指示試薬組成物中にある種の金属イオ
ン錯体が含まれていると、アスコルビン酸塩妨害問題は
本質的に排除されることが判明している。しかしながら
、一般に、金属イオン錯体はペルオキシダーゼ活性も示
し、ペルオキシダーゼ又は疑似ペルオキシダーゼと同様
に行動して、ヒドロペルオキシドと被酸化性染料との間
の発色反応に触媒として作用する。したがって、金属イ
オン錯体はアスコルビン酸塩妨害を排除するけれども、
その金属イオン錯体は、ヒドロペルオキシドによる被酸
化性染料の酸化を触媒し得るために、偽陽性検定結果も
生じ得るし、それによって、過酸化活性物質が試験試料
中に存在しない場合でさえ、本装置において色変化を生
じ得る。さらに、過酸化活性物質が試験試料中に存在す
る場合は、金属イオン錯体によって媒介される付加的な
染料酸化のために、見当違いに高い検定結果が生じる可
能性がある。

【００１７】研究者等は、特定の第二鉄イオン錯体が、
アスコルビン酸塩妨害を排除するために用いられる大半
の金属イオン錯体の関与する偽陽性検定結果を事実上減
少させることを見出した。しかしながら、第二鉄イオン
錯体はアスコルビン酸塩妨害を有効に排除し、そして実
際上低減された過酸化活性を立証したけれども、指示試
薬組成物を、最適変色を提供しないｐＨ値に緩衝せねば
ならなかった。

【００１８】したがって、低レベルの過酸化活性物質に
関して尿を検定する、簡単で、正確でかつ信頼できる方
法を提供することは有益である。今日、過酸化活性物質
のための試験ストリップは、ホウ酸アミン安定剤を含む
指示試薬組成物を包含する。しかしながら、従来の技術
に用いられたホウ酸アミンは、周囲の湿気に晒された場
合に加水分解し、その結果、指示試薬組成物のｐＨの上
昇を引き起こすという不利益を有する。その結果として
、今日、アスコルビン酸塩妨害に関する金属イオン錯体
をも含有し、最も劇的な変色を提供しないｐＨに緩衝さ
れた指示試薬組成物は、ホウ酸アミンの加水分解によっ
てｐＨが増大する。したがって、過酸化活性物質に関す
る検定感度は低下する。意外でそして予期せぬことに、
本発明の方法は、指示試薬組成物中に耐加水分解性ホウ
酸アミンを含入することによって、湿潤状態に暴露後の
指示試薬組成物のｐＨ上昇を事実上排除する。したがっ
て、金属イオン錯体のような化合物が存在する場合でさ
え、検定感度の低下の問題が解決されて、アスコルビン
酸塩妨害は排除される。

【００１９】したがって、浸漬−読取り（ディップアン
ドリード）試験ストリップのようなすぐに使える形態の
より正確な検定方法を提供することによって、実験室職
員は過酸化活性物質に関する定量的尿検定を実施して、
迅速で信頼できる試験結果を得ることができる。さらに
、この試験ストリップ法は家庭で患者が実行して、尿中
の過酸過活性物質レベル及び／又は患者が受けている医
療の首尾をより正確に監視することができる。

【００２０】以下にさらに十分に述べるように、本発明
の方法は、本発明の指示試薬組成物で含浸した適当な担
体マトリックスを包含する試験パッドを含有する試験ス
トリップを用いることによって、過酸化活性物質に関す
る迅速、正確かつ信頼のおける検定を可能にする。指示
試薬組成物は、指示染料；ヒドロペルオキシド；湿潤状
態に暴露した場合に加水分解を阻止する二環式ホウ酸ア
ミン；及び緩衝剤を包含する。指示試薬組成物は低濃度
の過酸化活性物質に感受性であり；指示染料を安定化し
、それによって指示染料とヒドロペルオキシドとの間の
早期相互作用を事実上排除し；そして、意外でそして予
期せぬことに、湿潤状態に暴露した場合の試験ストリッ
プのｐＨ増大を事実上排除する。したがって、指示試薬
組成物の安定性の改良は、検定の感度を増大し、それに
よって過酸化活性物質に関する、より正確で信頼できる
検定を提供する。

【００２１】本発明以前には、過酸化活性物質に関して
尿又はその他の試験試料を検定する公知の方法の中には
、指示染料；ヒドロペルオキシド；緩衝剤；及び指示試
薬組成物中の指示染料を安定化する耐加水分解性ホウ酸
アミンを包含する指示試薬組成物を含有する方法はなか
った。ｏ−トリジン又は３，３′、５，５′−テトラメ
チルベンジジンのような被酸化性指示染料；緩衝剤；及
びヒドロペルオキシドを含有する乾相試験ストリップが
従来用いられてきたけれども、これら３つの化合物を包
含する乾相試験ストリップは、ヒドロペルオキシドと指
示染料との早期相互作用による変色を被る傾向を示した
。したがって、このような偽陽性検定が、試験試料中の
過酸化活性物質に対する試験ストリップの実用性及び感
度を低下させた。本発明の指示試薬組成物は、指示染料
とヒドロペルオキシドとの早期相互作用を事実上排除す
る。その結果として、指示試薬組成物の安定性の改良は
、検定の感度を増大して、過酸化活性物質に関する正確
で信頼できる検定を達成させる。

【００２２】従来の技術には、過酸化活性物質に関して
尿を検定する際に用いられる湿相化学及び乾相化学に関
する多数の言及が含まれる。例えば、研究者等は、指示
染料の過酸化性酸化の酵素様触媒作用に頼る過酸化活性
物質のための湿式化学検定手法及び乾相試験ストリップ
装置を開発した。過酸化活性物質に関する湿式化学検定
の一例は、Ｒ．Ｍ．　Ｈｅｎｒｙ，　ｅｔ　ａｌ．，　
Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２ｎｄ　
ｅｄ．，　Ｈａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗ，　ｐｐ．　
１１２４　〜１１２５　（１９７４）に示されている。 この湿相検定手法は、緩衝液として氷酢酸；指示染料と
してジフェニルアミン；及び過酸化水素を用いる。この
ような湿相検定は分析的に有用であるけれども、にもか
かわらずそれらは不十分な試薬安定性及び不適切な分析
対象物感度を含めたひどい不利益を有する。例えば、湿
相検定に用いられる試薬溶液は、急速に安定性が、その
結果として感度が低減する。したがって、２〜３日貯蔵
後には、新鮮な試薬溶液を調製しなければならない。新
鮮な試薬溶液の連続調製は、時間がかかり、費用のかか
る試薬を浪費するために、非経済的である。

【００２３】過酸化活性物質に関する検定の好ましい方
法は、乾相試験ストリップ装置を用いる。一般的な乾相
試験ストリップは、ＨＥＭＡＳＴＩＸ（登録商標）とい
う商品名で　Ｍｉｌｅｓ社のＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　
事業部から市販されている。試験ストリップは、有機ヒ
ドロペルオキシドと指示染料の緩衝化混合液を含浸し、
プラスチックストリップ又は取手に貼ったペーパーマト
リックスのような多孔性担体マトリックスを含有する試
験パッドを含む。試験パッドは、ヘモグロビン、ミオグ
ロビン、赤血球、又は別の過酸化活性物質を含有する試
験試料中に浸漬し、そして試験パッドは青色を発現する
。青色の強度は、試験試料中の過酸化活性物質の濃度に
比例する。試験パッド中に発現した色を標準化カラーチ
ャートと比較することによって、分析者は試験試料中に
存在する過酸化活性物質の量を定量的に測定できる。

【００２４】概して、乾相試験ストリップは、試験スト
リップフォーマットが使用するのにより容易であり、試
薬の連続調製も付随装置も必要でないために、湿相検定
よりも有利である。さらに、試薬の安定性は、乾相試験
ストリップにおいてはより大きく、それによって検定の
精度、感度及び経済性が改良される。今日、過酸化活性
物質を測定するための試験ストリップは事実上湿相検定
よりも安定であり、そして感度がより高いにもかかわら
ず、試験ストリップは安定性及び感度の領域の改良を要
する。したがって、試験ストリップが貯蔵中にさらに安
定で、過酸化活性物質に対してさらに感受性になったな
らば、それは診断検定についての当業界における有意の
進歩である。それは、本発明の組成物、装置及び方法を
結果として生じる研究は、これらの改良の達成へと向か
っている。

【００２５】安定性及び感度を増大するという上記の目
標を達成しようとするいくつかの試みは、従来の技術の
中に見出される。例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔ
ｒａｃｔｓ，　Ｖｏｌ．　８５，　ｐ．　１８６　（１
９７６）には、ｏ−トリジン及びフェニルイソプロピル
ヒドロペルオキシドを含有する乾相試験ストリップを調
製する２回浸漬法が記載されている。この方法において
は、エチルセルロースを含浸した濾紙ストリップを、指
示薬の塩酸ｏ−トリジン；ポリビニルピロリドン；界面
活性剤；及び３．７のｐＨを提供するに十分な量のクエ
ン酸塩緩衝液を含むエタノール溶液中に浸漬した。つぎ
に含浸濾紙を乾燥し、その後、１，４−ジアゾビシクロ
［２．２．２］オクタン、フェニルイソプロピルヒドロ
ペルオキシド、及びポリビニルピロリドンを含有するエ
タノール−トルエン溶液中に浸漬した。研究者等は、ジ
アゾヒシクロオクタン化合物とポリビニルピロリドンを
用いてヒドロペルオキシドを安定化し、それによって指
示染料との早期相互作用を排除したいと考えた。

【００２６】Ｌａｍ　は、米国特許第４，０７１，３１
８号において、過酸化活性物質に関する検定に有用な、
ヒドロペルオキシド、指示染料及び二環式ホウ酸アミン
を包含する組成物を開示した。Ｌａｍ　は、二環式ホウ
酸アミンがヒドロペルオキシドと錯化合物を形成し、そ
れによって貯蔵中にヒドロペルオキシドが指示染料と相
互作用するのを阻止する、という理論を構築した。した
がって、指示染料の早期酸化を低減することによる組成
物の安定性改良は、過酸化活性物質に関するより正確な
検定を提供する。しかしながら、ホウ酸トリエタノール
アミン及びホウ酸トリ（ｎ−プロパノール）アミンのよ
うな、Ｌａｍ　が用いたホウ酸アミンは、周囲の湿気に
暴露されると加水分解して、試験パッド中に包含される
指示試薬組成物のｐＨの上昇を引き起こす、ということ
が判明した。その結果生じたｐＨ上昇は、過酸化活性物
質に関する検定の感度の低下を引き起こした。

【００２７】Ｈ．　ＳｔｅｉｎｂｅｒｇとＤ．Ｌ．　Ｈ
ｕｎｔｅｒ　は、その著書”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　
ａｎｄ　Ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ
　Ｂｏｒｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｅｓｔｅｒｓ”，　Ｉｎｄ．
　ａｎｄ　Ｅｎｇ．　Ｃｈｅｍ．，　４９，　２，　ｐ
ｐ．　１７４〜１８１　（１９７４）、及び”Ｔｈｅ　
Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐａ
ｎｏｌａｍｉｎｅ　Ｂｏｒａｔｅ”，　Ｊ．　Ａｍ．　
Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　８２，　ｐｐ．　８５３〜８
５９　（１９６０）において、ホウ酸トリイソプロパノ
ールアミンのようなメチル側基を有する二環式ホウ酸ア
ミンは、ホウ酸トリエタノールアミンのようなメチル側
基を含有しない二環式ホウ酸アミンよりも、大体におい
てゆっくり加水分解する、ということを示した。Ｓｔｅ
ｉｎｂｅｒｇ　等は、安定性増大は、ホウ酸トリイソプ
ロパノールアミン中のメチル側基によってもたらされる
立体効果に寄与する、と理論づけた。しかしながら、Ｓ
ｔｅｉｎｂｅｒｇ　等の著書は、立体的封鎖性二環式ホ
ウ酸アミンが過酸化活性物質に関する検定に有用である
とは、教示も示唆もしていない。

【００２８】Ａｄａｍｓ　等は、米国特許第３，２５２
，７６２号に、試験ストリップを安定化するための、ゼ
ラチンのようなコロイド物質内への有機ヒドロペルオキ
シドの物理学的封入を開示した。したがって、水性試験
試料が試験ストリップと接触すると、ゼラチンカプセル
は溶解し、それによって過酸化活性物質によって媒介さ
れる指示染料との相互作用に対してヒドロペルオキシド
を遊離する。しかしながら、Ａｄａｍｓ　の封入工程は
時間がかかり、相対的に高価な装置及び過大な操作工程
を要する。 これらの従来技術の開示はそれぞれ、配合禁忌の可能性
がある試薬、すなわちヒドロペルオキシドと指示染料が
早期に相互作用しないように、試験ストリップの試験パ
ッド中に一緒に合わせた試薬を安定化することに向けら
れ、それによって偽陽性試験を提供するかもしくは試験
ストリップを過酸化活性物質に対して低感受性にする。

【００２９】別の試験ストリップ及び方法は、Ｒｉｔｔ
ｅｒｓｄｏｒｆ　ｅｔａｌ．に対する米国特許第３，８
５３，４７１号に開示されている。Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏ
ｒｆ　は、過酸化活性物質に関する検定に用いられる試
験ストリップを安定化するためのリン酸アミド又はホス
ホン酸アミドの使用を記載した。Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏｒ
ｆ　が開示したリン酸アミド又はホスホン酸アミドは、
ヒドロペルオキシドと指示染料を十分に安定化したので
、試験ストリップは、ヒドロペルオキシドと指示染料と
の早期相互作用によって変色しなかった。

【００３０】Ｋｕは、米国特許第３，４１１，８８７号
に、アスコルビン酸塩「トラッピング系」を用いること
によって、グルコースオキシダーゼのような酵素性酸化
物質に頼る試薬組成物によるアスコルビン酸塩妨害の排
除を記述した。「トラッピング系」は、レドックス指示
染料とアスコルビン酸塩との間の酸化−還元ポテンシャ
ル低下を示す重金属イオンを用いる。実施例として引用
される好適な重金属化合物としては、コバルト、鉄、水
銀及びニッケルが挙げられる。Ｋｕの開示に加えて、従
来技術はまた、Ｃｏ（ＩＩＩ）のような金属イオンは実
は疑似ペルオキシダーゼであることを開示している。例
えば、Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ，　９ｔｈ　ｅ
ｄ．，　ｐ．　３１１　（１９７６）は、触媒的にクメ
ンヒドロペルオキシドを分解するために酢酸コバルト（
ＩＩＩ）　が商業上用いられることを開示する。さらに
、触媒的にペルオキシドを分解するための一連のＣｏ（
ＩＩＩ）錯体が、Ｋ．　Ｌｏｈｓ，　Ｍｏｎａｔｓｂｅ
ｒ．　Ｄｅｕｔ．　Ａｋａｄ．　Ｗｉｓｓ．　Ｂｅｒｌ
ｉｎ，　８，　ｐｐ．　６５７〜６５９　（１９６６　
）によって報告されている。

【００３１】Ｍａｙａｍｂａｌａ−Ｍｗａｎｉｋａ　等
に対する米国特許第４，５８７，２２０号は、　過酸化
活性物質に関する検定におけるアスコルビン酸及びアス
コルビン酸塩イオン妨害を排除するためのキレート化第
二鉄イオンの使用を開示した。Ｍａｙａｍｂａｌａ−Ｍ
ｗａｎｉｋａ　は、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチ
レンジアミントリ酢酸の第二鉄キレート化合物（Ｆｅ−
ＨＥＤＴＡ）のような第二鉄キレート化合物はアスコル
ビン酸塩妨害を排除し、過酸化活性化合物に対して偽陽
性試験を生じない、ということを開示した。Ｍａｙａｍ
ｂａｌａ−Ｍｗａｎｉｋａ　の方法に従って、この試験
装置を調製する二段階法は、貯蔵中の偽陽性検定結果を
阻止するに十分な安定性をも示すアスコルビン酸塩阻止
試験パッドを提供した。

【００３２】従来の技術に対比して、そして現在市販さ
れている試験ストリップに対比して、本発明の組成物は
、試験ストリップの安定性を増大し、したがって試験試
料中の過酸化活性物質の検出及び測定に用いられる試験
ストリップの感度を増大する。本発明の方法は、指示染
料が過酸化活性物質を含有する試験試料と接触するまで
指示染料の酸化を有効に阻止する指示試薬組成物を用い
る。

【００３３】意外にも、本発明の方法及び組成物は、金
属イオン錯体及びヒドロペルオキシドによる早期指示染
料酸化に寄与し得る発色、又はその他の検出可能な反応
を本質的に排除する。そこで、本発明の方法に従って、
メチル基及び／又はエチル基を側鎖として有する耐加水
分解性ホウ酸アミンを含有する安定な指示試薬組成物を
用いることにより、過酸化活性物質に関する尿及びその
他の試験試料の乾相試験ストリップ検定において、新し
くまた予期せぬ結果が達成される。

【００３４】

【発明の要約】要約すると、本発明は、試験試料中のあ
る成分の存在及び濃度を測定する新規及び改良型の組成
物、試験具及び方法を示す。その装置には、検出可能な
反応を生じるために試験試料成分と相互作用し得る指示
試薬組成物を一緒に合わせた適当な担体マトリックスを
包含する試験パッドが含まれる。家庭で用いるために、
指示試薬組成物は視覚的に検出可能な反応を生じる。実
験室での使用に対しては、指示試薬組成物は眼で見て検
出可能な反応を生じるか、もしくは計器による。試験パ
ッドの担体マトリックスは、濾紙のような吸湿性物質；
高分子物質のストリップ、層又は膜のような非吸湿性物
質；又はその組み合わせを包含する。指示試薬組成物が
、担体マトリックス中に均質に導入されると、担体マト
リックスは全体に均質に指示試薬組成物を保有するが、
一方、試験試料中のあらかじめ選択された成分によって
担体マトリックス浸透性を保持する。

【００３５】さらに、本発明は、新規及び改良型指示試
薬組成物を用いることによって、過酸化活性物質に関す
る尿又はその他の試験試料の検定方法を示す。（ａ）過
酸化活性物質に対する反応において変色を受け得る、レ
ドックス指示染料；（ｂ）ヒドロペルオキシド；（ｃ）
緩衝剤；そして（ｄ）一般構造式：

【００３６】

【化６】

【００３７】（式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は、独
立してメチル基又はエチル基であり、ｍ、ｎ及びｐは１
〜約３の範囲の数である）を有するホウ酸アミン化合物
を包含する指示試薬組成物が安定性を改良し、したがっ
て過酸化活性物質に対する感度を増大したことが立証さ
れている。

【００３８】指示試薬組成物中に含まれる二環式ホウ酸
アミンは、環境湿度に暴露された場合に加水分解を有効
に阻止する。したがって、耐加水分解性ホウ酸アミンは
、指示試薬組成物を包含する試験パッドと試験試料との
接触により、過酸化活性物質が指示染料とヒドロペルオ
キシドとの相互作用を媒介することができるようになる
まで十分に指示染料を安定化する。さらに、指示試薬組
成物中に含まれる耐加水分解性二環式ホウ酸アミンは、
試験ストリップ中に含まれる指示試薬組成物のｐＨを増
大し、つぎに劇的変色をほとんど起こさず、過酸化活性
物質に関する検定感度を低くするアルカリ性加水分解物
質を生成しない。

【００３９】本発明の重要な特徴によれば、指示試薬組
成物は、該指示試薬組成物と過酸化活性物質を含む試験
試料とが接触する前にヒドロペルオキシドによって指示
染料の発色性酸化を有効に阻止することから、試験試料
中の過酸化活性物質の、より正確で信頼できる定性的又
は定量的測定が達成される。臨床試験方法に本発明の指
示試薬組成物を用いることにより、指示試薬組成物は指
示染料の早期酸化による偽陽性検定を生じないため、尿
又はその他の試験試料中のヘモグロビンのような過酸化
活性物質に関する定性的又は定量的検定がより正確にな
る。

【００４０】

【発明が解釈しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、液体試験試料中の化学化合物の相対的濃度を測
定するための新規で改良された方法及び試験装置を提供
することである。

【００４１】本発明の別の目的は、過酸化活性物質に関
して尿及びその他の試験試料を検定する簡単で、信頼で
きて、正確で、かつ再現可能な方法を提供することであ
る。

【００４２】本発明のいま一つの目的は、過酸化活性物
質に対する感度増大を提供する安定な指示試薬組成物を
用いて、過酸化活性物質に関する尿又はその他の液体試
験試料の検定方法を提供することである。

【００４３】さらに本発明の別の目的は、低濃度の過酸
化活性物質に感受性で、そして実質的に偽陽性検定を排
除する生物試験試料の検定方法を提供することである。

【００４４】本発明の別の目的は、１兆部の試験試料当
たり約１部という低濃度の潜血を検出するのに十分に感
受性の、潜血に関する尿又はその他の液体試験試料の検
定方法を提供することである。

【００４５】本発明の別の目的は、指示染料、緩衝剤、
及び側鎖としてメチル基又はエチル基を含む二環式ホウ
酸アミンを含む指示試薬組成物を用いて、過酸化活性物
質に関する尿又はその他の試験液を検定する方法を提供
することであって、この場合、指示試薬組成物中に存在
する指示染料のヒドロペルオキシドによる早期酸化は本
質的に排除される。

【００４６】本発明のさらにいま一つの目的は、指示染
料を有効に安定化し、そのことによって指示染料が試験
試料を接触させる前に酸化することを本質的に排除する
；そして試験試料との接触時に試験試料中の過酸化活性
物質と相互作用して試験試料中の過酸化活性物質の存在
又は濃度を確定するための、検出可能で、かつ測定可能
な変色を蒙り得る指示試薬組成物を用いることによる、
尿又はその他の試験試料の検定方法を提供することであ
る。

【００４７】本発明の別の目的は、試験試料中の過酸化
活性物質の濃度を示す、変色といったような試験装置の
可視的変化を生じるための試験試料中の過酸化活性物質
との相互作用のための、新規で改良された試験装置を提
供することである。

【００４８】さらに本発明の別の目的は、低濃度の過酸
化活性物質に感受性で、貯蔵中、ほとんど一定のｐＨを
維持し、そして指示染料とヒドロペルオキシドとの早期
相互作用に起因する過酸化活性物質に関する偽陽性検定
結果を事実上排除するのに十分安定である組成物及び試
験具を提供することである。

【００４９】本発明のさらに別の目的は、過酸化活性物
質と接触した場合に検出可能な又は測定可能な変色を蒙
り得る安定な指示試薬組成物を提供することであって、
この場合、指示試薬組成物は、指示染料、ヒドロペルオ
キシド；緩衝剤；及び一般構造式：

【００５０】

【化７】

【００５１】（式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は、独
立してメチル基又はエチル基であり、ｍ、ｎ及びｐは１
〜約３の範囲の数である）を有する二環式ホウ酸アミン
を包含する。

【００５２】本発明の上記及びその他の目的、そして利
点及び新規な特徴は、指示試薬組成物、試験具、及び過
酸化活性物質に関する液体試験試料の検定を説明してい
る本発明の好ましい実施例についての以下の詳しい説明
から明らかになる。

【００５３】

【発明の効果】本発明の方法によれば、指示染料；ヒド
ロペルオキシド；メチル基又はエチル基を側鎖として含
有する二環式ホウ酸アミン化合物；及び緩衝剤を包含す
る安定な指示試薬組成物を用いることにより、尿及びそ
の他の試験試料中のヘモグロビン及びミオグロビンのよ
うな過酸化活性物質に関する定性的又は定量的検定が成
し遂げられる。本発明の指示試薬組成物は、指示染料を
十分に安定化して、指示試薬組成物と試験試料との接触
の前に、ヒドロペルオキシドによる指示染料の早期酸化
を事実上排除する。しかしながら、指示染料は、過酸化
活性物質を含有する試験試料と接触後、試験試料中の過
酸化活性物質によって媒介されるヒドロペルオキシドと
の相互作用に反応して、検出可能又は測定可能な変色を
容易に被る。

【００５４】さらに、本発明の指示試薬組成物中に含ま
れるホウ酸アミン化合物は加水分解を十分に阻止するの
で、そこで、指示試薬組成物のｐＨ、そして指示試薬組
成物を包含する試験パッドのｐＨは、高湿潤状態に長期
暴露中はほとんど一定のままである。したがって、過酸
化活性物質が媒介する指示染料とヒドロペルオキシドと
の間の相互作用に起因する変色は、より劇的である。し
たがって、低濃度の過酸化活性物質に対する検定の精度
及び感度は増大する。

【００５５】本発明の方法によってもたらされる低レベ
ルの過酸化活性物質に対する精度の改良及び感度の増大
は、潜血に関する尿検定に特に有用である。商業的に有
用な、潜血に関する尿検定は、安定な指示試薬組成物を
含有せねばならず、アスコルビン酸妨害に対して感受性
でなければならず、そして好ましくは耐性である。有用
な潜血検定のための安定性及び感度要件が定義されてい
る。例えば、１兆部の尿標本当たり少なくとも１部の潜
血、あるいは等価的に尿１デシリットル（ｄｌ）当たり
０．０１５ｍｇのヘモグロビン、又は尿１リットル（ｌ
　）当たり２×１０−９モルのヘモグロビンという感度
が必要である。

【００５６】さらに、前述のように、アルコルビン酸及
びアスコルビン酸塩イオンは、レドックス指示染料を基
礎にした診断的試験の一般的妨害剤である。潜血に関す
る尿検定におけるアスコルビン酸妨害は当業界で十分公
知であって、好ましくは、排除されねばならない。アス
コルビン酸は指示染料の酸化を妨げるので、したがって
試験試料中のアスコルビン酸は過酸化活性物質に対して
明らかに陰性の結果を生じる。したがって「アスコルビ
ン酸塩妨害」は、尿試料が、試料１デシリットル（ｄｌ
）当たり約５０ｍｇの量のアスコルビン酸を含有する場
合には、指示染料の変色の無視できるほどの妨害と定義
される。

【００５７】潜血のような過酸化活性物質に関する今日
の商業的検定は、約０．０１５ｍｇ／ｄｌという低い濃
度での尿中のヘモグロビンを検出し得る。健康人の尿は
、大体においてヘモグロビンを含まない。したがって、
尿中のこのように低濃度のヘモグロビンを検出すること
は、尿中のヘモグロビンをさらに調べる必要のある疾病
又は損傷状態を意味し得るために、臨床的に重要である
。したがって、以下においてさらに十分に考察されるよ
うに、本発明の方法及び装置は、尿中の低濃度の過酸化
活性物質を正確に検定する。本発明の方法及び装置に用
いられる組成物は、試験試料中の過酸化活性物質の濃度
に反応する場合にのみ変色を被って、それにより過酸化
活性物質に関する感度のよい、信頼できる検定を提供す
る安定な指示試薬組成物を用いる。

【００５８】さらに、尿の検定に加えて、本発明の方法
及び装置は、血漿又は血清、糞便、及び胃腸内容物中の
過酸化活性物質の存在又は定量的濃度を、そしてさらに
一般的には多くのその他の生物的液体及び半固体の過酸
化活性物質濃度を測定するために用いることもできると
いうことが明らかになる。概して、任意の水性試験試料
、又は水性溶媒に溶解する試験試料が検定可能である。 本発明の十分な利益を達成するためには、本発明の組成
物を尿又はその他の試験試料中の過酸化活性物質の存在
又は濃度を測定するためには乾相試験ストリップ検定に
おいて用いる。

【００５９】

【課題を解決するための手段】意外にも、そして予期せ
ぬことに、指示染料、ヒドロペルオキシド及び緩衝剤を
包含する指示試薬組成物中にメチル基又はエチル基側鎖
として有する二環式ホウ酸アミン化合物を含有すると、
指示染料を安定化することによって指示試薬組成物の安
定性を増大することが見出された。本発明の指示試薬組
成物は、過酸化活性物質に関する偽陽性検定について、
そして従来の技術で用いられた特定の二環式ホウ酸アミ
ンの加水分解に起因する指示試薬組成物及び試験パッド
のｐＨの増大による検定感度の低下についての今日の問
題を事実上排除する。以下においてさらに十分に考察さ
れるように、指示染料を安定化し、加水分解を有効に阻
止し、したがって本組成物の安定性、ならびに過酸化活
性物質に関する検定の精度、感度及び信頼度を増大する
ことが判明しているホウ酸アミン化合物は、一般構造式
（Ｉ）及び（ＩＩ）：

【００６０】

【化８】

【００６１】

【化９】

【００６２】（式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は独立
してメチル基又はエチル基であり、ｍ、ｎ及びｐは１〜
約３の範囲の数である）によって表わされる。

【００６３】本発明の組成物を使用する方法及び試験具
は、指示染料が試験試料中に存在する過酸化活性物質の
量に反応する場合にのみ変色を受け、ヒドロペルオキシ
ドと指示染料との早期相互作用に対しては変色しないの
で、過酸化活性物質に関するより正確で、信頼のおける
、そして臨床的に有意の検定を提供する。さらに、指示
試薬組成物中に含まれる耐加水分解性ホウ酸アミンは指
示試薬組成物のｐＨを増大するアルカリ性加水分解物質
を生成せず、その結果として、検定の感度を増大する。 したがって、過酸化活性物質に関する迅速、正確、再現
可能で、そして信頼できる検定の方法で、家庭又は研究
室で実行可能であり、事実上、直後の検定結果が得られ
る方法が成し遂げられる。

【００６４】本発明の方法は、ヒドロペルオキシドが酸
素を放出し、次いでその酸素を運搬して指示染料を酸化
する反応の触媒として働くか、さもなくば沈殿する過酸
化活性物質の能力を利用する。指示染料の酸化により、
指示試薬組成物の変色が起こるが、その変色の程度及び
強度は、直接、試験試料中の過酸化活性物質の濃度に比
例する。したがって、本発明の指示試薬組成物は、ヒド
ロペルオキシド及び指示染料を含有するが、この場合、
指示染料は、ヒドロペルオキシド及び試験試料中に存在
する過酸化活性物質の媒介によってその酸化型に転化す
る際に変色する。

【００６５】本発明の重要な特徴によれば、指示染料は
、耐加水分解性ホウ酸アミンによって安定化する。従来
技術において、Ｌａｍ　は、ヒドロペルオキシドとホウ
酸アミンが十分に安定な錯体を生成して、過酸化活性物
質との接触の前にヒドロペルオキシドと指示染料が相互
作用するのを阻止する、という理論を立てた。しかしな
がら、ホウ酸アミンは指示染料を安定化し、指示染料と
ヒドロペルオキシドとの早期相互作用を阻止することが
見出された。しかしながら、意外でそして予期せぬこと
に、過酸化活性物質の存在下での安定化指示染料とヒド
ロペルオキシドの反応性は低減しない。

【００６６】指示試薬組成物は、過酸化活性物質に関す
る検定に伴うアスコルビン酸塩妨害を排除するための成
分も任意に含有し得る。金属イオン錯体を指示試薬組成
物に付加することによって、アスコルビン酸塩耐性を試
験具に付与する。しかしながら、第二鉄イオン錯体又は
コバルト（ＩＩＩ）錯体のような金属イオン錯体は、固
有の過酸化活性を有する。したがって、金属イオン錯体
は、ヘモグロビンのような過酸化活性物質に対して同様
に行動し得るし、そして指示染料の発色性ヒドロペルオ
キシド酸化を触媒するか、そうでなければ沈澱する。し
たがって、指示染料は、早期に酸化されて、偽陽性検定
結果を生じ得る。Ｍａｙａｍｂａｌａ−Ｍｗａｎｉｋａ
　等に対する米国特許第４，５８７，２２０号は、指示
試薬組成物の安定性低下の問題、及び偽陽性検定結果の
問題を実質的に軽減するための特定の第二鉄イオン錯体
の使用を開示する。以下で十分に考察されるように、本
発明の指示試薬組成物はまた、過酸化活性物質に関する
正確で信頼できる検定を生み出す、より安定な指示試薬
組成物を提供するために、金属イオン錯体の過酸化活性
を有効に妨害する特定の緩衝剤化合物を含有し得る。

【００６７】指示試薬組成物中に含まれる指示染料は、
ヒドロペルオキシド及び過酸化活性物質の存在下で検出
可能な反応、好ましくは色原体反応を受け得るもののみ
に制限される。したがって、指示染料は、好ましくは、
過酸化活性物質によりヒドロペルオキシドから遊離され
た酸素によってその還元状態から酸化状態に転化する際
に変色するレドックス指示薬である。指示染料は、変色
が起こる前にヒドロペルオキシドと過酸化活性物質とが
存在するように十分に安定であるか又は安定化される必
要がある。本発明の十分な利益を達成するためには、指
示染料は、変色の程度及び強度が試験試料中の過酸化活
性物質の濃度に相関し得るような色の種々の検出が可能
で、また測定可能な程度ないし強度に変色する。

【００６８】いくつかの指示染料は、本発明の組成物中
に用いるのに適していて、一般に、相対的に容易に酸化
されて暗色酸化生成物質を生じる化合物を包含する。好
適な種類の指示染料としては、ベンジジン型指示化合物
及び複素環式アジン指示化合物が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。複素環式アジン指示化合物
の例としては、ビス−（Ｎ−エチルキノール−２−オン
）アジン及び（Ｎ−メチルベンズチアゾール−２−オン
）−（１−エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾ
ール−２−オン）アジンが挙げられるが、これらに限定
されない。ベンジジン型指示化合物としては、例えば、
ベンジジン；ｏ−トリジン；３，３´，５，５´−テト
ラ（低級アルキル）ベンジジン；ｏ−ジアニシジン；２
，７−ジアミノフルオレン；及びこれらの混合物、そし
てその他の適当な指示染料が挙げられるが、これらに限
定されない。上記で用いたような「低級アルキル」とい
う用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピ
ル、ならびに種々のブチル、ペンチル及びヘキシル異性
体を含めた、１〜約６個の炭素原子を有するアルキル部
分と定義される。本発明の十分な利点を達成するために
は、レドックス指示薬３，３´，５，５´−テトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）を指示薬組成物中に含有する。

【００６９】指示染料は、通常、約５ｍＭ（ミリモル、
又は１リットルの指示試薬組成物当たりの指示染料のミ
リモル数）〜約６０ｍＭの濃度で、好ましくは約２０ｍ
Ｍ〜約４０ｍＭの濃度で指示試薬組成物中に存在する。 指示試薬組成物中の指示染料の量は、特定の指示染料が
酸化によって受ける変色の強さによっては、約５ｍＭ未
満又は約６０ｍＭ以上であり得る、と理解されるべきで
ある。概して、指示試薬組成物中に含まれる指示染料の
量は、指示染料が定性的検定に対して、又は定量的検定
に対して検出可能な変色を受けるに違いない、もしくは
試験試料中の過酸化活性物質の量に比例して測定可能な
変色を受けるに違いないもののみに、限定される。

【００７０】本発明の別の重要な特徴によれば、指示試
薬組成物は、ヒドロペルオキシドも含有する。ヒドロペ
ルオキシドは、遊離酸素を遊離できる化合物である。遊
離酸素は次に指示染料を酸化して、指示試薬組成物中の
変色を引き起こす。試験試料中に存在する過酸化活性物
質は、ヒドロペルオキシドからの遊離酸素の遊離に対し
て触媒として作用し、酸化当量を指示染料に運搬して、
そこで指示染料の変色を開始する。

【００７１】したがって、本発明の指示試薬組成物中に
含まれるヒドロペルオキシドは、過酸化活性物質の非存
在下では遊離酸素が遊離されないように、十分に安定し
ている必要がある。さらに、ヒドロペルオキシドは、貯
蔵中、あるいは指示試薬組成物が乾相試験ストリップの
試験パッドの担体マトリックス中に導入された後に、ヒ
ドロペルオキシドが指示試薬組成物から蒸発又は昇華し
ないように、十分に低い蒸気圧を有するべきである。さ
らに、ヒドロペルオキシドは、潜血に関する尿の検定に
おいて、１兆部の試験試料中の１部のヘモグロビンを検
出するに十分な感度を示す必要がある。

【００７２】したがって、本発明の指示試薬組成物中で
有用なヒドロペルオキシドは、多数の十分に公知のヒド
ロペルオキシドの中から選択される。しかしながら、ヒ
ドロペルオキシドは、適切な指示染料の存在下で過酸化
活性物質と相互作用して、変色もしくは試験試料による
光の吸収量又は反射量の変化といったような検出可能な
反応を生じることが可能でなければならない。有機ヒド
ロペルオキシドが好ましい。好適なヒドロペルオキシド
の特定の例としては、クメンヒドロペルオキシド、ｔｅ
ｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソプロピルベン
ゼンヒドロペルオキシド、１−ヒドロキシシクロヘキサ
ン−１−ヒドロペルオキシド、２，５−ジメチルヘキサ
ン−２，５−ジヒドロペルオキシド、パラメンタンヒド
ロペルオキシド、１，４−ジイソプロピルベンゼンモノ
ヒドロペルオキシド、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルイソプロピ
ルベンゼンヒドロペルオキシド、２−（α−ヒドロペル
オキシイソプロピル）−６−イソプロピルナフタレン、
テトラリンヒドロペルオキシド、及びその組み合わせが
挙げられるが、これらに限定されない。潜血に関する尿
の検定においては、安定性、感度、及び非揮発性のため
に、１，４−ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキ
シド（ＤＢＤＨ）が好ましい。

【００７３】指示試薬組成物中に含まれるヒドロペルオ
キシドの濃度は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは
約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの範囲である。指示試薬組成物
中に含まれる特定のヒドロペルオキシドの特定量は、過
酸化活性物質に対する安定性及び感度、それに揮発性と
いったような特定のヒドロペルオキシドの物理的及び化
学的特性に依存する。

【００７４】ヒドロペルオキシド及び指示染料のみを含
有する組成物を過酸化活性物質に関して試験試料を検定
するための方法に用いる場合、一定の不利益が明らかに
なる。前述のように、ヒドロペルオキシドは、過酸化活
性物質とヒドロペルオキシドの併用作用による指示染料
の酸化のための酸素供給源として組成物中に含入する。 しかしながら、指示染料とヒドロペルオキシドの併用は
また、ヒドロペルオキシドによるレドックス指示染料の
早期酸化により過酸化活性化合物に関する偽陽性検定を
生じ得る。例えば、ヒドロペルオキシドとｏ−トルイジ
ン染料を含有するクロロホルム溶液は、ｏ−トルイジン
染料の酸化により、約２時間で黒色となる。

【００７５】したがって、ヒドロペルオキシドによる早
期指示染料酸化は、乾相試験ストリップの安定性に、そ
して乾相試験ストリップを製造するために用いる工程に
厳しい制限を持ち込むことがある。例えば、組成物成分
は２工程で担体マトリックス中に包含されねばならなか
ったが、この場合、第一工程はヒドロペルオキシドの取
り込みを含み、そして第二工程は指示染料取り込みを含
む。その結果として、レドックス指示染料、ヒドロペル
オキシド及び金属イオン錯体を用いる過酸化活性物質に
関する湿相検定は、指示染料の大きなバックグラウンド
酸化のために用いることができない。同様に、レドック
ス指示薬、ヒドロペルオキシド及び金属イオン錯体を包
含する乾相試験ストリップは、偽陽性検定結果を提供す
る。

【００７６】意外にも、そして予期せぬことに、指示染
料、ヒドロペルオキシド及び緩衝剤をさらに含有する指
示試薬組成物中の、側鎖としてメチル基又はエチル基を
有する二環式ホウ酸アミンを含有すると、指示染料が十
分に安定化されて、指示試薬組成物を乾相試験ストリッ
プで用いて、過酸化活性物質に関して試験試料を正確に
検定することができることが見出された。概して、本発
明の組成物に有用なホウ酸アミン化合物は、一般構造式
（Ｉ）及び（ＩＩ）：

【００７７】

【化１０】

【００７８】

【化１１】

【００７９】（式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は、独
立して、メチル基又はエチル基であり、ｍ、ｎ及びｐは
１〜約３の範囲の数である）で表わされる。本発明の十
分な利益を達成するために、ホウ酸トリイソプロパノー
ルアミンを指示試薬組成物中に含有して、指示染料をさ
らに安定化する。トリイソプロパノールアミンは、一般
構造式（Ｉ）（式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は各々
メチル基であり、数ｍ、ｎ及びｐは各々１である）のホ
ウ酸アミンである。

【００８０】一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の二環式ホ
ウ酸アミンは、約２５ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは
約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲の濃度で、指示試薬組
成物中に含有される。本発明の利益を十分に達成するた
めに、二環式ホウ酸アミンは、約７５ｍＭ〜約１５０ｍ
Ｍの範囲の濃度で、指示試薬組成物中に含有される。

【００８１】さきに考察したように、Ｌａｍ　は、米国
特許第４，０７１，３１８号において、一般構造式（Ｉ
ＩＩ）：

【００８２】

【化１２】

【００８３】（式中、ｒ、ｓ及びｔは１〜約４の範囲の
整数である）を有するホウ酸アミン化合物を指示試薬組
成物中に含有して、ヒドロペルオキシドの安定性を増大
し、指示染料の早期酸化を低減したことを開示した。Ｌ
ａｍ　は、これらのホウ酸アミン化合物が、ホウ酸アミ
ンの電子の過剰な窒素原子がヒドロペルオキシドの陽子
と結合し、そして電子不足のホウ素原子がヒドロペルオ
キシドの残基と結合するような独特の配置及び電子配置
を有する、と理論づけした。その結果として、一般構造
式（ＩＩＩ）のホウ酸アミンはヒドロペルオキシドと結
合してキレート環を作り、試験試料と接触する前にヒド
ロペルオキシドが指示染料と相互作用するのを防止し得
る。

【００８４】しかしながら、ホウ酸アミンはヒドロペル
オキシドとキレート結合しないしそれを安定化しないが
、しかしおそらく指示染料とキレート結合することによ
って、むしろ指示染料を安定化する、ということが見出
された。さらに、Ｌａｍ　が開示したホウ酸アミンは、
環境湿度に暴露された場合に加水分解する。したがって
、加水分解は従来技術の二環式ホウ酸アミンを分解する
ので、指示染料をヒドロペルオキシドとの相互作用に用
いると、早期バックグラウンド色を生成する。さらに、
ホウ酸アミン加水分解の生成物はアルカリ性である。ア
ルカリ性加水分解物質は、次に、試験ストリップ中に包
含された指示試薬組成物のｐＨを増大する。このｐＨ増
大は、変色の程度及び強度がｐＨ依存性であるために、
試験パッドの変色を余り劇的でない、区別のつきにくい
ものにする。その結果、変色の弁別及び分解能が余り劇
的でないために、検定感度は低下する。

【００８５】したがって、本発明の重要な特徴によれば
、一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ酸アミンを、本
発明の指示試薬組成物中に含有する。メチル基又はエチ
ル基を側鎖として有する、一般構造式（Ｉ）及び（ＩＩ
）のホウ酸アミンは、指示染料を安定化し、加水分解を
阻止する。したがって、一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）
のホウ酸アミンは、指示試薬組成物中の安定性を増大す
る。 したがって、さらに、ホウ酸アミンは加水分解を阻止し
、アルカリ性加水分解物質を生じないため、検定の感度
が増大する。

【００８６】ホウ酸トリイソプロパノールアミンのよう
な、一般構造式（Ｉ）のホウ酸アミン化合物は、メチル
側基又はエチル側基が酸素原子に隣接した炭素原子位置
にあるため、特に好ましい。したがって、側鎖のメチル
基又はエチル基は、ホウ酸アミンのホウ素−酸素結合の
加水分解を立体的により有効に妨げる。以下で十分に立
証するように、指示試薬組成物中に一般構造式（Ｉ）又
は（ＩＩ）の耐加水分解性ホウ酸アミンを含有すること
によって、指示試薬組成物に付与される安定度は、意外
であり、予期せぬものである。

【００８７】さらに、指示染料、ヒドロペルオキシド及
び耐加水分解性ホウ酸アミンに加えて、指示試薬組成物
は適当な緩衝剤も含有する。試験試料は、しばしば問題
の検定に関して所望のｐＨ範囲外のｐＨを有するので、
そこで緩衝剤が試験組成物に加えられる。したがって、
任意の種々の公知の種類の緩衝剤を、必要により、本発
明の指示試薬組成物中に含有できることが示される。緩
衝剤は、尿のｐＨ及び尿の比重の作用を阻止する商業的
に受容可能な乾相試験ストリップ中で特に重要である。 緩衝剤の機能は、指示試薬組成物の安定性を維持するの
に、そして検定中の指示染料において所望の変色を生じ
るのに十分なｐＨに指示試薬組成物を保持することであ
る。

【００８８】緩衝剤は、通常約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ
の濃度で、本発明の指示試薬組成物中に含まれるが、し
かしながら特定の状況においては、緩衝剤の濃度はこの
範囲を上回るか、又は下回る可能性がある。

【００８９】最適検定結果のためには、指示試薬組成物
のｐＨは、一般に、中性ｐＨ値に対してわずかに酸性で
保持されるべきであることが見出された。したがって、
約５〜約７、好ましくは約６〜約７のｐＨが、過酸化活
性物質の検定に際して、より目ざましい、そしてより容
易に弁別可能な変色を提供する。

【００９０】これに対比して、過酸化活性物質に関する
今日の検定方法は、しばしば、指示試薬組成物中に含ま
れる従来技術のホウ酸アミンの加水分解が、試験パッド
の表面のｐＨを増大するアルカリ性加水分解物質を生じ
るために、弱アルカリ性ｐＨで実行する。意外にも、そ
して予期せぬことに、本発明の指示試薬組成物を用いて
、一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）の耐加水分解性ホウ酸
アミン化合物を含有すると、指示試薬組成物が緩衝され
て酸性〜中性のｐＨを維持し、そしてより目ざましい変
色を達成し得るような十分な安定性が示される。

【００９１】例えば、従来の技術は、Ｎ−（２−ヒドロ
キシエチル）エチレンジアミントリ酢酸の第二鉄イオン
錯体（Ｆｅ−ＨＥＤＴＡ）のような第二鉄イオン錯体を
、所望のアスコルビン酸塩耐性を提供するために指示試
薬組成物中に含有する場合、指示試薬組成物をｐＨ６．
５以上、例えば６．７〜７．１の範囲のｐＨに緩衝する
よう教示している。最も好ましくは、ｐＨは６．８０〜
６．８２に緩衝される。非常に変動し易いｐＨ値及び比
重を示す尿標本を検定する場合、このｐＨ範囲が感度、
安定性、及びアスコルビン酸塩耐性の最良の平衡を提供
する。ホウ酸アミンのアルカリ性加水分解物質により指
示試薬組成物のｐＨが増大する場合、検定感度は低下す
る。

【００９２】本発明の重要な特徴によれば、一般構造式
（ＩＶ）又は（Ｖ）：

【００９３】

【化１３】

【００９４】（式中、Ｒ４　及びＲ５　は水素、１〜約
１２個の炭素原子を含有する非置換又は置換アルキル部
分、非置換又は置換芳香族部分、及び脂肪族又は芳香族
多価化合物の残基から成る群から選択され；ＸはＯ、Ｓ
又はＮＨである）のリン化合物が本発明の指示試薬組成
物中に緩衝剤として用い得ることが見出された。

【００９５】一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン化合
物は、５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、好ましくは約１００ｍ
Ｍ〜約４００ｍＭの範囲の濃度で、緩衝剤として本発明
の指示試薬組成物中に含有される。本発明の十分な利益
を達成するために、リン化合物は、約１５０ｍＭ〜約３
００ｍＭの範囲の濃度で存在する。以下で十分に考察す
るように、少なくとも５０ｍＭの濃度で存在する場合、
一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン化合物は、緩衝剤
として役立つのに加えて、アスコルビン酸塩耐性を付与
するための化合物を含有する指示試薬組成物に対する安
定性の改良をも与える。さらに、一般構造式（ＩＶ）又
は（Ｖ）のリン化合物は、本発明の指示試薬化合物又は
方法に悪影響を及ぼすことがなく、約６００ｍＭ以上の
濃度で指示試薬組成物中に含有し得る。しかしながら、
指示試薬組成物のそれ以上の緩衝特性及びそれ以上の安
定性の改良は示されず、したがってリン化合物の濃度を
増大するのは無駄である。

【００９６】一般構造式（ＩＶ）及び（Ｖ）のリン化合
物のオキソ（Ｘ＝Ｏ）、チオ（Ｘ＝Ｓ）及びイミノ（Ｘ
＝ＮＨ）誘導体は、緩衝剤として、そして本発明の指示
試薬組成物の安定性をさらに改良するために有用である
と考えられる。より安定な指示試薬組成物を提供する好
ましい緩衝剤は、少なくとも２の遊離酸官能価を有する
一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン化合物である。し
たがって、Ｒ４　が水素である一般構造式（ＩＶ）のリ
ン化合物、すなわち燐酸と、Ｒ５　が水素である一般構
造式（Ｖ）のリン化合物、すなわちホスホン酸が、本発
明の組成物に有用である。

【００９７】一般構造式（ＩＶ）のリン化合物上の置換
基Ｒ４　、又は一般構造式（Ｖ）のリン化合物上の置換
基Ｒ５　は、二水素リン酸エチルのような、１〜約１２
個の炭素原子を含有する脂肪族部分であり得ることも判
明している。さらに脂肪族部分に含まれる炭素原子数が
増すと、一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン化合物が
さらに有効に本発明の指示試薬組成物を緩衝し、安定化
する。 したがって、Ｒ４　又はＲ５　が約５〜約１０個の炭素
原子を含む脂肪族部分である一般構造式（ＩＶ）又は（
Ｖ）の燐化合物が好ましい。

【００９８】フェニルのような、Ｒ４　又はＲ５　が芳
香族部分である一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン化
合物が、指示試薬組成物中の緩衝剤として有用である。 芳香族部分は炭素環式又は複素環式芳香族部分であって
もよく、縮合環を有する芳香族部分を含有する。例えば
、芳香族部分は、ベンゼン、ナフタレン、ピロール、フ
ラン、ピリミジン、チオフェン、ピリジン、ピラジン、
インドール、キノリン、カルバゾール、プリン、イソキ
ノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ならびに他
の同様の炭素環式及び複素環式芳香族化合物から誘導さ
れ得るが、これらからの誘導に限定されるものではない
。 特定の例としては、二水素リン酸フェニル及びホスホン
酸フェニルが挙げられる。さらに、本発明に有用なリン
化合物は、構造式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）：

【００９９
】

【化１４】

【０１００】（式中、ＹはＣＨ又はＮである）；ならび
に構造式（ＶＩＩＩ）及び（ＸＩ）

【０１０１】

【化１５】

【０１０２】（式中、ＺはＮＨ、Ｏ又はＳである）によ
って表わされる。一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン
化合物の脂肪族部分又は芳香族部分、すなわちそれぞれ
Ｒ４　又はＲ５　は、本発明の指示試薬組成物を緩衝し
、安定化するリン化合物の能力に悪影響を及ぼすことな
く、１つ又はそれ以上の置換基を含有し得る。１つ又は
それ以上の置換基は、過酸化活性物質に関する検定にお
いて、指示試薬組成物に悪影響を及ぼさずに、脂肪族部
分の任意の炭素位置に、又は芳香族部分の任意の位置に
存在し得る。一般式（ＩＶ）及び（Ｖ）の燐化合物の脂
肪族部分又は芳香族部分に含有され得る置換基としては
、二水素リン酸ｐ−ニトロフェニルにおけるようなニト
ロ（−ＮＯ２）；シアノ（−ＣＮ）；ハロ（−Ｃｌ、−
Ｂｒ）；アミノ（−ＮＨ２）；置換アミノ（−ＮＨＲ６
　、−ＮＲ７　Ｒ８　；ここでＲ６　、Ｒ７　及びＲ８
　は１〜約１０個の炭素原子を含む置換又は非置換芳香
族又はアルキル部分である）；ヒドロキシ（−ＯＨ）；
アルコキシ（−ＯＲ９　；式中、Ｒ９　は１〜約１０個
の炭素原子を含む置換又は非置換アルキル基）；アリー
ルオキシ（−ＯＲ１０；式中、Ｒ１０は置換又は非置換
炭素環式又は複素環式芳香族環系である）；スルホネー
ト（−ＳＯ３　Ｈ）；カルボニル（−ＣＯ−Ｒ１１；式
中、Ｒ１１は水素、ヒドロキシル、アルキル、アリール
、アルコキシ、アリールオキシ又はアミノである）；又
はその組み合わせが挙げられるが、しかしこれらに限定
されない。

【０１０３】本発明の重要な特徴によれば、脂肪族多価
化合物の、又は芳香族多価化合物の残基である置換基Ｒ
４　又はＲ５　を含有する一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ
）のリン化合物は、緩衝剤として特に有用である。多価
化合物は少なくとも２個のヒドロキシ官能価を有し、そ
してグリコール、トリオール、ポリオール、糖類及びヒ
ドロキシフェノールのような種類の化合物を含む。一般
構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン化合物上の置換基とし
て有用な多価化合物の残基の例としては、エチレングリ
コール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、
ヘキサンジオール、グリセロール、ネオペンチルグリコ
ール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール
、トリエチレングリコール、シクロペンタンジオール、
シクロヘキサンジオール、ヒドロベンゾイン、フルクト
ース、及びソルビトールの残基が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。多価化合物の残基を含有す
る一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ）のリン化合物の特定例
としては、構造式（Ｘ）〜（ＸＩＩＩ）で示される化合
物が挙げられる。

【０１０４】

【化１６】

【０１０５】特に、構造式（Ｘ）の化合物としてはシク
ロヘキサンジオールが挙げられるが、一方、構造式（Ｘ
Ｉ）の化合物としてはエチレングリコールの残基が挙げ
られるし、構造式（ＸＩＩＩ）の化合物としてはグルコ
ースのような単糖類の残基が挙げられる。構造式（ＸＩ
Ｉ）として示される、グリセロールの残基を含有し、グ
リセリル−２−ホスフェートと呼ばれるリン化合物は、
本発明の指示試薬組成物中で緩衝剤として用いられる好
ましいリン化合物である。

【０１０６】グリセリル−２−ホスフェート（ＸＩＩ）
は公知の緩衝剤である。しかしながら、以下で十分に考
察するように、グリセリル−２−ホスフェートは、緩衝
剤としての作用に加えて、アスコルビン酸塩耐性を提供
するために組成物中に金属イオン錯体を含有する場合、
本発明の組成物に安定性の改良をもたらす。当業界で公
知のその他の緩衝剤を、それらの緩衝能力に関して指示
試薬組成物中に含有し得るが、しかしこれらの緩衝剤は
金属イオン錯体を含有する指示試薬組成物をさらに安定
化することはない。例えば、グリセリル−２−ホスフェ
ートは緩衝剤として作用し、アスコルビン酸塩阻止のた
めに含有される金属イオン錯体の固有の過酸化活性に対
して指示試薬組成物を安定化する。その他の公知の緩衝
剤は、アスコルビン酸塩阻止のために付加される金属イ
オン錯体の固有の過酸化活性に対して指示試薬組成物を
安定化しない。

【０１０７】したがって、一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ
）のリン化合物は、緩衝剤として用い得る。さらに、酢
酸塩；フタル酸塩；ホウ酸塩；トリクロロ酢酸塩；スル
ホサリチル酸塩；リン酸塩；酒石酸塩；クエン酸塩；コ
ハク酸塩；マレイン酸；２，２−ビス（ヒドロキシメチ
ル）−２，２′，２″−ニトリロトリエタノール；１，
４−ピペラジンビス（エタンスルホン酸）；３，３−ジ
メチルグルタル酸；３−Ｎ−モルホリノ−プロパンスル
ホン酸（ＭＯＰＳ）；マロン酸；１，３−ビス［トリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（Ｂｉｓ
−ｔｒｉｓ）；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）；トリス−（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン−マレイン酸（Ｔｒｉｓ−マレイン酸塩）；トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マロン酸（Ｔｒ
ｉｓ−マロン酸塩）；３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメ
チル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホ
ン酸（ＴＡＰＳＯ）；２−［トリス（ヒドロキシメチル
）メチルアミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）；１，４
−ピペラジンビス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）
；４−（モルホリノエタンスルホン酸）（ＭＥＳ）；Ｎ
−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）のようなその他の十分公知
の緩衝剤；ならびに当業界で公知のその他の適当な緩衝
剤、又はその組み合わせを、本発明の指示試薬組成物中
に緩衝剤として用いてもよい。

【０１０８】したがって、指示染料、ヒドロペルオキシ
ド、一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ酸アミン化合
物、及び緩衝剤を含有する本発明の指示試薬組成物を、
改良された方法に用いて、液体試験試料中の過酸化活性
物質の存在又は濃度を測定する。指示試薬組成物は液体
試験試料と接触する前は安定であり、その後、試験試料
中の過酸化活性物質と相互作用して、目で見て又は計器
を用いて弁別可能及び測定可能な変色を生じることが立
証された。さらに、上記の必須成分に加えて、本発明の
指示試薬組成物は、指示染料が、過酸化活性物質により
ヒドロペルオキシドから触媒的に放出される酸素と接触
し、相互作用する場合に変色するのに十分な量の、金属
イオン錯体のような任意の成分を含有してアスコルビン
酸耐性を付与し得る。したがって、変色は、試験試料中
の過酸化活性物質の存在又は濃度を正確に確定する。

【０１０９】したがって、必須成分に加えて、指示試薬
組成物は、検定に対してアスコルビン酸塩耐性を付与す
るための金属イオン錯体を、任意に含有してもよい。概
して、金属イオン錯体は、試験試料中に存在するアスコ
ルビン酸イオンの酸化を促し、それによってアスコルビ
ン酸塩妨害を排除する。金属イオンは固有の過酸化活性
を有し、キレート結合しない限り、指示染料中に存在す
るヒドロペルオキシドと相互作用して、変色を生じる。 さらに、従来の技術は、キレート化第二鉄イオン以外の
キレート金属イオンは、ヒドロペルオキシド及び指示染
料と相互作用して、変色を生じる。

【０１１０】したがって、キレート化した場合にアスコ
ルビン酸塩妨害を排除し得る金属イオンを、本発明の指
示試薬組成物中に任意に含有してもよい。したがって、
金属イオン錯体に有用な適当な金属イオンは、第二鉄イ
オン、コバルト（ＩＩＩ）イオン、第二銅イオン、第二
水銀イオン、第二スズイオン、ニッケル（ＩＩ）イオン
、鉛（ＩＩ）イオン、マンガン（ＩＩＩ）イオン、カド
ミウム（ＩＩ）イオン、亜鉛（ＩＩ）イオン、モリブデ
ン（Ｖ）イオン、クロム（ＩＶ）イオン、バナジウム（
ＩＩＩ）イオン、及びその組み合わせからなる群より選
択される。さらに、（ＩＩＩ）より大きい原子価状態を
示す金属イオンは、金属イオンがキレート化して十分に
指示染料の早期酸化を防止し得る長さだけ、金属イオン
として用い得る。本発明の利益を十分に達成するために
は、金属イオン錯体中に存在する金属イオンは、第二鉄
イオンである。

【０１１１】前述のように、金属イオンはキレート結合
して、指示染料の早期酸化を防止しなければならない。 しかしながら、キレート化剤の本性は特に限定されてい
るわけではなく、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸又
はニトリロトリ酢酸のようなポリカルボキシアルキルア
ミン；クエン酸、酒石酸、又はグルコン酸のようなポリ
カルボン酸又は塩；ヒスチジン；ソルビトールのような
多水酸基化合物；リグノスルホネート；グルコヘプトネ
ート；ビス（ジメチルグルコキシマト）；ビスサリチル
アルデヒドエチレンジイミナトのようなサリチル酸塩錯
体；ジチオ酸塩誘導体；トリエチレンアミンのようなポ
リエチレンアミン；（２−ジメチルアミノエチル）アミ
ンコバルト（ＩＩ）；２，４−ペンタンジオン；フェナ
ントロリン誘導体；トリエチレンピリジンアミンのよう
なジピリジン誘導体；システイン、グリシン、又はヒス
チジンを含有するポリペプチド；プロリン又はプロリン
誘導体；１，４，８，１１，２２，２５−オクタチアシ
クロオクタサンのようなチオクラウンエーテル；トリフ
ェニルホスフィン；又はその組み合わせがその例として
挙げられる。

【０１１２】特に、指示試薬組成物に有用な第二鉄イオ
ン錯体としては、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレ
ンジアミントリ酢酸の第二鉄イオン錯体（Ｆｅ−ＨＥＤ
ＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（Ｆｅ−ＥＤＴＡ
）、シクロヘキシレンジアミンテトラ酢酸（Ｆｅ−ＣＤ
ＴＡ）、ニトリロトリ酢酸（Ｆｅ−ＮＴＡ）、イミノジ
酢酸（Ｆｅ−ＩＭＤＡ）、エチレンジアミンジ酢酸ジプ
ロピオン酸（Ｆｅ−ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルイミ
ノジ酢酸（Ｆｅ−ＨＩＭＤＡ）、ジエチレントリアミン
ペンタ酢酸（Ｆｅ−ＤＴＰＡ）、エチレンビス（オキシ
エチレンニトリロ）テトラ酢酸（Ｆｅ−ＥＧＴＡ）、Ｎ
−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（Ｆｅ−ＡＤＡ）
の第二鉄イオン錯体、又はその組み合わせが挙げられる
が、これらに限定されない。第二鉄イオン−ポリカルボ
キシアルキルアミン錯体は米国特許第４，５８７，２２
０号にさらに詳しく記載されており、その記載内容は、
参照により本明細書中に含めるものとする。その他の適
当な第二鉄イオン錯体としては、クエン酸第二鉄、グル
コン酸第二鉄、グルコヘプトン酸第二鉄、ビスサリチル
アルデヒドエチレンジイミナト第二鉄及びトリエチレン
ピリジンアミン第二鉄が挙げられる。特に有用な第二鉄
イオン錯体はＦｅ−ＨＥＤＴＡ及びＦｅ−ＥＤＴＡであ
る。第二鉄イオン錯体以外の金属イオン錯体を指示試薬
組成物中に含有する場合、一般構造式（ＩＶ）又は（Ｖ
）のリン化合物を緩衝剤として指示試薬組成物中に用い
て、金属イオン錯体の固有の過酸化活性を低減すべきで
ある。

【０１１３】金属イオン錯体は、約０ｍＭ〜約５０ｍＭ
、好ましくは約１ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲の量で、指示
試薬組成物中に含有する。この量で存在する場合、金属
イオン錯体は、約５０ｍｇ／ｄｌまでのアスコルビン酸
塩を含有する試験試料の検定において、アスコルビン酸
塩妨害を事実上排除する。さらに、Ｆｅ−ＨＥＤＴＡの
ような適当な金属イオン錯体は市販され得るので、した
がって指示試薬組成物中に直接導入され得ると理解され
ねばならない。あるいはまた、金属イオン錯体は、塩化
第二鉄・六水和物（ＦｅＣｌ３　・６Ｈ２　Ｏ）のよう
な金属イオン塩、及びほぼ等モル量のＮ−（２−ヒドロ
キシエチル）−エチレンジアミントリ酢酸（ＨＥＤＴＡ
）のようなキレート化剤を、独立して指示試薬組成物中
に導入して、Ｆｅ−ＨＥＤＴＡ第二鉄イオン錯体を生成
するといったことにより、指示試薬組成物の製造中にそ
の場で（ｉｎ　ｓｉｔｕ）生成され得る。金属イオン錯
体をｉｎ　ｓｉｔｕで生成する場合、金属イオン錯体は
未キレート化金属イオンがヒドロペルオキシド及び指示
染料と接触し、相互作用し得る前に生成される。

【０１１４】指示染料、ヒドロペルオキシド、緩衝剤、
及び一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ酸アミン化合
物に加えて、４つの必須成分の性質及び機能を物質的に
変えず、そして過酸化活性物質に関する検定を妨害しな
い、金属イオン錯体以外の他の任意の成分も、指示試薬
組成物中に含有してもよい。例えば、指示試薬組成物は
、試験試料による試験具の試験パッドの湿潤を改良し、
被酸化性指示染料を安定化するための化合物を任意に含
有し得る。この化合物は、通常、陰イオン界面活性剤又
は非イオン界面活性剤である。長炭素鎖硫酸塩又はスル
ホン酸塩、例えばドデシル硫酸ナトリウム、スルホコハ
ク酸ジオクチルナトリウム及びドデシルベンゼンスルホ
ン酸ナトリウムのような陰イオン界面活性剤は、好まし
い界面活性剤である。オクトキシノール、ノノキシノー
ル又はポリオキシエチレン脂肪アルコールのような非イ
オン界面活性剤も、本発明の指示試薬組成物中に含有し
てもよい。界面活性剤は、０ｍＭ〜約２００ｍＭ、好ま
しくは約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で指示試薬組成
物中に含まれる。

【０１１５】指示試薬組成物はさらに、試験具の変色の
安定性及び均一性を改良する高分子物質を含有し得る。 さらに、指示試薬組成物の成分を２つの別々の溶液から
試験パッド中に包含すると、高分子物質は第一含浸溶液
中に存在する成分が第二含浸溶液中に存在する成分と相
互作用しないよう分離するのを助ける。したがって、試
験ストリップは安定性の増大を立証する。適当な高分子
物質としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアル
コール、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン、カラゲー
ナン、カゼイン、アルブミン、メチルセルロースならび
に同様の天然及び合成高分子物質が挙げられるが、これ
らに限定されない。好ましい高分子物質は、分子量４０
，０００でＧＡＦ　Ｃｏｒｐ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　
から市販されているポリビニルピロリドンであるＰＶＰ
　　Ｋ−３０のような、ポリビニルピロリドンである。 高分子物質は、一般に、指示試薬組成物の０〜約５重量
％、好ましくは約１〜約４重量％の範囲の量で指示試薬
組成物中に含まれる。

【０１１６】さらに、過酸化活性物質に関する呈色検定
における変色の分解能及び弁別度を改良するために、不
活性バックグラウンド染料を指示試薬組成物中に含有し
てもよい。適当なバックグラウンド染料としては、エチ
ルオレンジ（４−（４−ジエチルアミノフェニルアゾ）
ベンゼンスルホン酸）；オレンジＧ（４−［２−ヒドロ
キシ−（７，９−ジスルホン酸ナトリウム）−１−ナフ
チルアゾ］ベンゼン）；ジスパースオレンジ１１，１３
，又は２５；カルコミンオレンジ；メチルオレンジ；及
びオレンジ（ＩＩ）（４−（２−ヒドロキシ−１−ナフ
チルアゾ）ベンゼンスルホン酸）；又はその組み合わせ
が挙げられるが、これらに限定されない。バックグラウ
ンド染料は、本発明の指示試薬組成物中に、０ｍＭ〜約
２ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１．２ｍＭの範囲
の濃度で含有する。

【０１１７】指示試薬組成物はまた、試験試料中の過酸
化活性物質に関するより感度の高い検定を達成するため
に、促進剤を含有してもよい。促進剤は、過酸化活性物
質に関する検定の当業界で公知であって、キノリン及び
イソキノリン、並びにその誘導体を含有する。米国特許
第３，９７５，１６１号は、有機ヒドロペルオキシド、
酸性緩衝剤、色原体、湿潤剤、硬質フィルム形成天然又
は合成高分子物質、及びイソキノリン、又はイソキノリ
ン誘導体促進剤を含む組成物で含浸した吸湿性担体を包
含する試験ストリップを開示した。さらに、キノリン及
びキノリン誘導体の酸塩及び付加物も、過酸化活性物質
の検出のための試薬組成物中の増強剤として、米国特許
第３，９８６，８３３号に開示されている。米国特許第
３，８５３，４７２号には、促進剤として有用なキノリ
ン及びイソキノリンが詳しく記載されているが、その記
載内容は参照により本明細書中に含めるものとする。

【０１１８】したがって、イソキノリン、４−ブロモイ
ソキノリン、４−メチルキノリン、６−メトキシキノリ
ン、３−アミノキノリン及び５，６−ベンゾキノリンが
好ましい促進剤である。本発明の利点を十分に達成する
ためには、Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，
　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，　ＷＩ　からＬＥＰＩＤＩＮＥ
の商標で市販されている４−メチルキノリン、又は６−
メトキシキノリンを反応促進剤として用いる。促進剤は
、一般に、０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、好ましくは約２５ｍ
Ｍ〜約１２５ｍＭの範囲の濃度で指示試薬組成物中に含
まれる。診断検定の当業界には十分公知のように、その
他の任意の成分を指示試薬組成物中に含んでもよいと理
解されねばならない。

【０１１９】指示試薬組成物中に含まれる成分のための
担体ビヒクルとしては、水がある。しかしながら、指示
試薬組成物中に含まれる特定の成分の水溶解度が限定さ
れるために、メタノール、エタノール、イソプロピルア
ルコール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド、アセトニトリル、酢酸エチルのような有
機溶剤及び同様の溶剤が担体ビヒクルに含有され得る。 水に加えて、指示試薬組成物の担体ビヒクル中に含有す
るための適当な１つ又は複数の有機溶剤の選択は、診断
的検定を意図する当業者の能力内である。

【０１２０】指示試薬組成物中に存在する有機溶剤の量
は、担体ビヒクルの０〜約９０重量％、好ましくは約１
０〜約７０重量％の範囲内である。水、及びエタノール
又はアセトニトリルのような有機溶剤を包含する担体溶
剤は、指示試薬組成物で含浸された担体マトリックスが
２・３分〜数分以内に乾燥されるため、特に好ましい。

【０１２１】前述のように、指示試薬組成物は、試験試
料と接触すると変色して、過酸化活性物質の存在を立証
する。さらに、変色の強度及び程度を用いて、試験試料
によって生じた色を公知の濃度の過酸化活性物質を有す
る溶液によって生じた色と比較し、又は相関させること
によって、試験試料中の過酸化活性物質の定量的濃度を
測定する。本発明の重要な特徴によれば、本発明の指示
試薬組成物は、試験試料中の過酸化活性物質の量が分光
光度計又は比色計を用いなくても測定でき、そして正確
に調べることができるよう十分に分解され、弁別される
変色を提供することが立証されている。しかしながら、
所望により、このような測色計器を用いて、試験試料と
、公知の濃度の過酸化活性物質を有する溶液との間の色
の程度及び強度の差を測定する。

【０１２２】したがって、本発明の指示試薬組成物を用
いる過酸化活性物質に関する検定は、検定の精度及び信
頼度を改良して、検定における医者の信頼限界を増大す
る。さらに、実験室の熟練した医者や技術者に対照して
、未熟練患者が家庭で実行する過酸化活性物質に関する
尿検定の数のために、尿中の過酸化活性物質含量に関す
る正確で信頼できる定量的検定方法を提供することは緊
急の課題である。

【０１２３】本発明の方法によって達成される新しい、
そして予期せぬ結果を立証するために、指示染料、ヒド
ロペルオキシド、一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ
酸アミン、及び緩衝剤を含有する指示試薬組成物を、過
酸化活性物質に関する乾相試験ストリップ検定に用いた
。 本発明の指示試薬組成物を用いる乾相試験ストリップ検
定は、当業界で十分公知の方法に従って実施する。概し
て、過酸化活性物質に関する検定は、尿又はその他の試
験試料を指示試薬組成物を含有する分析対象物検出具と
接触させることによって実行する。分析対象物検出具は
、試験試料中に浸漬するか、あるいは試験試料を分析対
象物検出具に滴下適用してもよい。その結果生じる分析
対象物検出具の変色は、過酸化活性物質の存在を立証す
る；そして、そのように意図された場合には、その結果
生じる変色を標準カラーチャートと比較して、尿又は試
験試料中の過酸化活性物質の濃度の定量的測定値を提供
し得る。

【０１２４】一般に、分析対象物検出用具は、単一パッ
ド試験ストリップとして（単一分析対象物のみを検定す
るため）、又は多目的パッド試験ストリップとして（い
くつかの分析対象物を同時に検出するため）企画された
試薬含浸試験ストリップである。いずれの型の試薬含浸
試験ストリップに関しても、試験ストリップは、一般に
疎水性プラスチックで作られた支持ストリップ又は支持
ハンドルと、指示試薬組成物を混合した吸湿性又は非吸
湿性の担体マトリックスを包含する試薬試験パッドとを
含有する。概して、担体マトリックスは、毛管力に感応
して、試験試料が担体マトリックスを通って動き、指示
試薬組成物に接触し、検出可能な又は測定可能な変色を
生じ得るようにする吸収物質である。

【０１２５】担体マトリックスは、化学試薬に関して担
体マトリックスが事実上不活性である限りは、問題の検
定を実施するために必要な化学試薬と組み合わせること
ができる任意の物質であり得るし、そして多孔性であり
、及び／又は液体試験試料に関して吸収性である。 「担体マトリックス」という表現は、水及びその他の生
理的液体に不溶性であって、水又はその他の生理的液体
にさらされた場合、その構造保全性を維持する吸湿性又
は非吸湿性マトリックスを意味する。好適な吸湿性マト
リックスとしては、濾紙、スポンジ材、セルロース、木
材、織布及び不織布などが挙げられる。非吸湿性マトリ
ックスとしては、ガラス繊維、高分子薄膜、及び予備成
形膜又は微孔質膜が挙げられる。その他の適当な担体マ
トリックスとしては、シリカゲル、アルミナ、ケイ藻土
などのような親水性無機粉末；粘度質物質；布；親水性
天然高分子物質、特にセルロース系ビーズのようなセル
ロース系物質、そして特に濾紙又はクロマトグラフィ紙
のような繊維含有紙；酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル
、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリウレタ
ン、架橋デキストラン、アガロース、そして他のこのよ
うな架橋及び非架橋の水不溶性親水性ポリマーといった
合成又は変性天然ポリマーが挙げられる。疎水性及び非
吸収性物質は、本発明の担体マトリックスとして用いる
には適していない。担体マトリックスは、異なる化学組
成物又は化学組成物の混合物を有してもよい。マトリッ
クスはまた、平滑性及び粗さに関しては、硬さ及び柔ら
かさと結びついて変化し得る。しかしながら、すべての
場合において、担体マトリックスは親水性又は吸湿性物
質を含有しなければならない。柄は、通常、酢酸セルロ
ース、ポリエチレンテレフタレート、ポルカーボネート
又はポリスチレンのような疎水性物質で形成される。 そして担体マトリックスは、吸湿性濾紙又は非吸湿性高
分子薄膜から作られるのが最も有益である。

【０１２６】試験ストリップが試験試料中の過酸化活性
物質を検定するように意図されている場合、担体マトリ
ックスは、指示試薬組成物で含浸される試験ストリップ
の試験パッドを試験試料の浸透により飽和させる、任意
の吸湿性又は非吸湿性物質であり得る。

【０１２７】本発明の十分な利益を達成するためには、
試験試料中の過酸化活性物質に関する検定においては、
担体マトリックスは、紙、好ましくは濾紙のようなセル
ロース系物質を含有する親水性吸湿性マトリックスであ
る。濾紙は、本発明の吸湿性マトリックスに必要な特性
をすべて有している上に、それに加えて、十分に供給さ
れ、経済的に好ましく、そして種々の適切な等級のもの
があるという利点がある。濾紙は、指示試薬組成物中に
含まれる必須成分及びあらゆる任意の成分のいずれをも
、懸濁したり、置いたりするためのマトリックス物質と
して用いるのに非常に申し分ないことが判明している。

【０１２８】本発明の十分な利益を達成するためには、
指示試薬組成物を適当な担体マトリックス中に含浸し、
試験試料中の過酸化活性物質の検定のための乾相試験ス
トリップ中で用いる。本発明の方法は、家庭であるいは
研究室で実施できる、試験試料中の過酸化活性物質の存
在又は濃度に関する経済的で、正確で、信頼できる検定
を提供する。さらに、本発明の方法は、試験試料中の低
濃度の過酸化活性物質の検出、弁別及び測定を可能にし
、したがって検定を臨床的により有用なものにする。

【０１２９】本発明の方法によれば、過酸化活性物質に
関する乾相試験ストリップ検定を実施するためには、約
５０ｍＭ〜約６００ｍＭの、一般構造式（ＩＶ）又は（
Ｖ）のリン化合物のような緩衝剤；２５ｍＭ〜約４００
ｍＭの一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ酸アミン；
０ｍＭ〜約５０ｍＭの金属イオン錯体；０ｍＭ〜約２０
０ｍＭの界面活性剤；及びその他のあらゆる所望の任意
の成分又は溶剤を含む水溶液を、まず調製する。つぎに
この水溶液を、１Ｎ塩酸のような適当な有機酸又は無機
酸で、約６〜約７のｐＨに調節する。ついで、濾紙のよ
うな吸湿性マトリックスを、水溶液に浸漬するか、ある
いは濾紙シ−ト又はあらかじめ切断しておいた濾紙片上
に水溶液を噴霧することによって、水溶液で飽和又は含
浸させる。

【０１３０】つぎに、約４０℃〜約１００℃の温度で約
５分間、空気炉内で乾燥させることによって水性溶剤を
除去後、濾紙を、約５ｍＭ〜約６０ｍＭの指示染料；約
５ｍＭ〜約１００ｍＭのヒドロペルオキシド；０％〜約
５％の高分子物質；０ｍＭ〜約１５０ｍＭの促進剤；そ
してあらゆるその他の所望の任意の成分又は溶剤、例え
ばバックグラウンド染料を含むエタノール系溶液で、浸
漬又は噴霧によって、飽和及び含浸する。約４０℃〜約
１００℃で約５分間、二次オーブン乾燥後、２回含浸し
た濾紙を約０．２５ｃｍ×約０．５ｃｍ〜約０．５ｃｍ
×約１．０ｃｍの大きさのパッドのような適当なサイズ
に切断する。

【０１３１】本発明の方法及び組成物を用いて過酸化活
性物質に関する定量的検定を意図するために、試薬パッ
ドのサイズ間の固有の平衡、試薬含浸液の強度、試験試
料の量、ならびに浸漬よりも分取によるといったような
試験試料を試験ストリップに導入する方法を調べるため
の試験用具の調製について、十分に当業者の実験技術の
範囲内である、と理解されねばならない。

【０１３２】つぎに、乾燥し、２回含浸した濾紙を、両
面接着テープで不透明又は透明な疎水性プラスチック製
の柄に取り付ける。そうして出来上った試験ストリップ
を、つぎに、試験パッドに試料が十分に浸み込む時間、
新鮮な未遠心分離尿試料中に浸漬する。約１５秒〜約６
０秒間といった予定時間待った後、反応を目で見て、あ
るいは計器を用いて、試験ストリップを調べる。試験パ
ッドに変色が認められれば、それは尿試料中の過酸化活
性物質の存在又は濃度を示す。

【０１３３】多くの場合、試験ストリップを目で観察し
ただけで、所望の情報が得られる。さらに正確な情報が
必要な場合には、試験ストリップに用いる特定の指示試
薬組成物に対して、種々の公知の濃度の過酸化活性物質
に対応するカラースポットを有するカラーチャートを調
製する。つぎに、尿試料と接触後に生じた試験ストリッ
プの色をチャート上のカラースポットと比較して、試験
試料中の過酸化活性物質の濃度を測定する。さらに正確
な測定を要する場合は、分光光度計又は比色計を用いて
、変色の程度をより正確に測定し得る。さらに、変色の
程度をより信頼できるよう、そしてより正確に測定し、
したがって特に低濃度の、例えば０．０１５ｍｇ／ｄｌ
以下といったような試験試料中の過酸化活性物質の濃度
をより正確に測定するためには、目で見て調べるのと対
比して、分光光度計又は比色計を用いることによって、
定量的に、乾相試験ストリップ検定を行い得る。

【０１３９】

【実施例】本発明の一実施例によれば、下記の乾相試験
ストリップを調製して、過酸化活性物質に関する乾相検
定を実施した。Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ．，　Ｍａｉｄ
ｅｎ−ｈｅａｄ，　Ｋｅｎｔ，　Ｕ．Ｋ．　から市販さ
れているＷＨＡＴＭＡＮ　　３ＭＭなどの濾紙のような
担体マトリックスのストリップ又はシートを、まず、次
の物質を含有する水溶液中に浸漬した。

【０１３５】

【表１】

【０１３６】処方物＃１の指示試薬組成物の一次浸漬液
中に含まれる緩衝剤は、ｐＨを約６．８に調節したマロ
ン酸、又は約ｐＨ６．７に調節したグリセリル−２−ホ
スフェートであった。

【０１３７】つぎに、一回含浸した濾紙マトリックスを
約４５℃〜約６０℃の範囲の温度のオーブン内で乾燥し
た。乾燥後、１回含浸した濾紙を次のものを含有するエ
タノール系溶液に浸漬した：

【０１３８】

【表２】

【０１３９】つぎに、２回含浸した濾紙マトリックスを
、約４０℃〜約６０℃の温度のオーブン内で乾燥した。 乾燥し、２回含浸した濾紙を、ついで約０．５ｃｍ×約
０．５ｃｍの大きさのパッドに切断して、本発明の指示
試薬組成物を含浸した担体マトリックスからなる試験パ
ッドを作った。

【０１４０】さらに、本発明の指示試薬組成物は、担体
マトリックスを指示試薬組成物の必須成分と任意の成分
をすべて含有する水溶液中に浸漬することによって、担
体マトリックスが含浸され得るように十分な安定性を示
す、と理解されるべきである。しかしながら、指示試薬
組成物中に金属イオン錯体が含まれる場合は指示染料と
金属イオン錯体との接触を最小限にされ、したがって早
期相互作用が予め防止されるので、２回の浸漬を用いる
２段階法が好ましい。

【０１４１】本発明の方法によって達成された新しい、
予期せぬ結果を立証するために、本発明の指示試薬組成
物（処方物＃１）を包含する乾相試験ストリップを、（
ａ）従来技術のホウ酸アミンを含有する指示試薬組成物
を包含する乾相試験ストリップ、及び（ｂ）ホウ酸アミ
ンを含まない指示試薬組成物を包含する乾相試験ストリ
ップと比較して、試験ストリップの相対的安定性と、環
境湿度に暴露された場合の試験ストリップのｐＨの変化
とを調べた。

【０１４２】比較試験に用いた個々の乾相試験ストリッ
プは、上記のような２回浸漬法によって作製した。つぎ
に、試験ストリップを０．０４５ｍｇ／ｄｌのヘモグロ
ビンを含有する標準尿試験試料中に浸漬した。標準尿試
料と接触させて１分後に、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｌｅｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｅｌ
ｋｈａｒｔ，　ＩＮ．のＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ　Ｒａｐｉｄ　Ｓｃａｎｎｅｒ　反射率分光計に
より、６６０ｎｍで、試験ストリップの試験パッドの反
射率を測定した。反射率測定値は、標準量の過酸化活性
物質を含有する尿試料に対する特定の乾相試験ストリッ
プの反応性を表わす。概して、反射率測定値が低いほど
発色度は大きく、したがって試験試料中の過酸化活性物
質の濃度は高い。

【０１４３】さらに、個々の乾相試験ストリップの安定
性は、６０℃で２週間貯蔵した乾相試験ストリップの反
応性と、−２３℃で２週間貯蔵した同一乾相試験ストリ
ップの反応性とを比較して立証した。試験ストリップを
０．０４５ｍｇ／ｄｌのヘモグロビンを含有する標準尿
試料中に浸漬し、つぎに、その試験ストリップを尿試料
中に浸漬して１分後に、試験ストリップの反射率を、Ａ
ｄｖａｎｃｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒａｐｉｄ　Ｓｃ
ａｎｎｅｒ　反射率分光計を用いて６６０ｎｍで測定し
た。負荷を加えた（すなわち６０℃で貯蔵）試験ストリ
ップと非負荷（すなわち−２３℃で貯蔵）試験ストリッ
プとの間の反射率の変化（パーセント）は、試験ストリ
ップの安定性を表わす。試験試料を接触後の負荷試験ス
トリップと非負荷試験ストリップとの間のパーセント反
射率の変化が小さいほど、指示試薬組成物の安定性は大
きい。

【０１４４】表Ｉは、負荷又は非負荷の、いずれもホウ
酸アミンを含まない指示試薬組成物を含有する乾相試験
ストリップ（実施例２及び５）、従来技術のホウ酸アミ
ン（ホウ酸トリエタノールアミン）を含有する試験スト
リップ（実施例３）、ならびに本発明の方法及び組成物
に有用なホウ酸アミン（ホウ酸トリイソプロパノールア
ミン、処方物＃１）を含有する試験ストリップ（実施例
１及び４）の反応性及び安定性データを要約したもので
ある。表Ｉにおいて、実施例１は、指示染料のための安
定剤としてホウ酸トリイソプロパノールアミンを、そし
て、緩衝剤としてマロン酸を含有する本発明の指示試薬
組成物（処方物＃１）を包含する負荷及び非負荷乾相試
験ストリップ間のパーセント反射率の変化を示す。非負
荷試験ストリップは、試験ストリップを、０．０４５ｍ
ｇ／ｄｌのヘモグロビンを含有する標準尿試料中に浸漬
して１分後に、６６０ｎｍで２１．３％の反射率を示し
た。負荷試験ストリップは、３５．６％の反射率を示し
た。したがって、負荷及び非負荷試験ストリップ間のパ
ーセント反射率の差は１４．３であった。

【０１４５】

【表３】

【０１４６】実施例１におけるパーセント反射率の変化
を、実施例２における負荷及び非負荷試験ストリップ間
の反射率の変化と比較する必要がある。実施例２の試験
ストリップ中に包含した指示試薬組成物は、ホウ酸アミ
ンが組成物中に含まれていないことを除いては、実施例
１の試験ストリップ中の包含した指示試薬組成物と同一
であった。その結果、負荷及び非負荷試験ストリップ間
の反射率の変化は３０．１％に増大した。したがって、
ホウ酸アミンを含まない実施例２の試験ストリップは、
３個のメチル側基を有する二環式ホウ酸アミンを含む実
施例１の試験ストリップよりも実質的に安定度が低い。 同様に、従来技術のホウ酸アミンを含む指示試薬組成物
を包含する実施例３に用いた試験ストリップも、反射率
の変化が１５．７％まで増大したことによって立証され
るように、本発明の指示試薬組成物を包含する試験スト
リップよりも安定度が低い。定量的には、本発明の組成
物（実施例１）は、従来技術の組成物（実施例３）より
も約１０％安定度が高く、ホウ酸アミンを含まない組成
物（実施例２）よりも約１１０％安定度が高い。

【０１４７】実施例４及び５に用いた試験ストリップは
、緩衝剤としてグリセリル−２−ホスフェートを含む本
発明の指示試薬組成物（処方物＃１）に起因するより高
い安定性を示す。実施例４は、指示試薬中にホウ酸トリ
イソプロパノールアミンを含有し、グリセリル−２−ホ
スフェートが緩衝剤である場合、負荷試験ストリップと
非負荷試験ストリップとの間のパーセント反射率の変化
が６．６％に過ぎないことを立証している。実施例５は
、ホウ酸アミンを指示試薬組成物に含入しない場合の反
射率の変化が２８．９％という受け入れ難い値であるこ
とを示す。

【０１４８】表Ｉはまた、実施例１及び実施例４に存在
する本発明に有用なホウ酸アミン、即ちホウ酸トリイソ
プロパノールアミンが、試験ストリップを、２３．３℃
で約１０分間、約５５％の相対湿度の空気に暴露した場
合に一定のｐＨに保持することを示す。実施例３は、従
来技術のホウ酸アミン、すなわちホウ酸トリエタノール
アミンを含有する試験ストリップが２３．３℃で約１０
分間、約５５％の相対湿度空気に試験ストリップを暴露
後に、０．７ｐＨ単位のｐＨ変化を示したことを明示す
る。指示試薬組成物のｐＨ増大の悪影響が試験ストリッ
プの反応性に認められるが、この場合、実施例１及び実
施例４は、ＴＭＢ指示染料の最大変色がｐＨ７．５で現
われた実施例３（このｐＨ値は最適ｐＨ値から実質的に
除去される値である）よりも劇的で、より弁別可能な変
色を、それぞれｐＨ６．８及びｐＨ６．７で示した。

【０１４９】指示染料を安定化するために一般構造式（
Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ酸アミン化合物を含有する本発
明の指示試薬組成物が偽陽性検定の問題を取り除くとい
うことをさらに立証するために、処方物＃２の指示試薬
組成物を調製した。ついで、処方物＃２の指示試薬組成
物を含有する試験ストリップを作製した。試験ストリッ
プに負荷試験を施し、つぎに試験ストリップ中に残存す
る未反応指示染料の量を測定した。負荷試験ストリップ
と非負荷試験ストリップの間のパーセント反射率の変化
を、標準尿試料を検定するための試験ストリップを用い
て測定した。

【０１５０】

【表４】

【０１５１】

【表５】

【０１５２】試験結果を表ＩＩに要約する。この場合、
本発明の好ましい指示試薬組成物（処方物＃２）は、実
施例１２及び１３で用いた試験ストリップ中に包含した
。 実施例６〜９においては、指示試薬組成物中には緩衝剤
、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を含まず
、それによって緩衝剤としてはグリセリル−２−ホスフ
ェート（ＧＰＡ）のみが含まれた。さらに、実施例６、
７、１０及び１１では、耐加水分解性ホウ酸アミンを指
示試薬組成物から省いた。各試験ストリップを０．０４
５ｍｇ／ｄｌのヘモグロビンを含有する標準尿試料中に
浸漬し、つぎに、試験ストリップと尿試料を接触させて
約１分後に、６６０ｎｍで反射率を測定した。非負荷試
験ストリップと負荷試験ストリップとの間の反射率の変
化は、指示試薬組成物の安定性の尺度であり、したがっ
て、試験ストリップの安定性の尺度である。負荷及び非
負荷の、同一試験ストリップを、標準高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）法によって、試験パッド中に残
存する未反応ＴＭＢ指示染料の量に関して調べた。

【０１５４】表ＩＩの実施例６〜１３に要約されたデー
タは、本発明の指示試薬組成物の安定性の増大を示す。 例えば、表ＩＩは、モルホリノプロパンスルホン酸（Ｍ
ＯＰＳ）緩衝剤及びホウ酸トリイソプロパノールアミン
（ＴＩＢ）安定剤を含まない指示試薬組成物を包含する
実施例６及び７の試験ストリップで実施した負荷試験の
結果を要約する。実施例７の負荷試験ストリップは、５
１．９３％の反射率を示し、実施例６の非負荷試験スト
リップの２３．０７％という反射率からの変化は、２８
．８６％であった。さらに、未反応３，３´，５，５´
−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）指示染料の濃度は
、実施例６の非負荷試験ストリップの２０１μｇ　／ｃ
ｍ２（試験パッド１平方センチメートル当たりのミリグ
ラム数）から、実施例７の負荷試験ストリップの１２１
μｇ　／ｃｍ２　に減少し、あるいはＴＭＢ濃度は約４
０％減少した。負荷及び非負荷試験ストリップ間の反射
率の相当の変化、及びＴＭＢ濃度の減少は、ホウ酸アミ
ンを含まない場合、指示試薬組成物中に存在する指示染
料がヒドロペルオキシドと早期に相互反応していること
を示す。

【０１５５】実施例６及び７の試験ストリップに関して
表ＩＩに要約された試験結果を、実施例８及び９の試験
ストリップに関して要約された試験結果と比較する必要
がある。この場合、実施例８及び９の試験ストリップは
、ＭＯＰＳ緩衝剤は含まないが耐加水分解性ＴＩＢホウ
酸アミンを含有する指示試薬組成物を包含した。実施例
８及び９の試験ストリップに、実施例６及び７の試験ス
トリップと同じ負荷試験を施した。−２３℃で２週間貯
蔵後の試験結果は、実施例６及び８に関しては同一であ
った。しかしながら、試験ストリップを６０℃で貯蔵し
て負荷試験をした実施例９においては、実施例７の試験
ストリップを上回る安定性の実質的改良が立証された。 実施例８（非負荷）と実施例９（負荷）との間の反射率
の変化は、６．５９％にすぎなかったが、これに比して
実施例６と実施例７の間の変化は２８．８６％であった
。 さらに、実施例９は、２０４μｇ　／ｃｍ２　から１７
２μｇ　／ｃｍ２　というＴＭＢ指示染料の濃度の１６
％にすぎない減少を示した。したがって、ＴＩＢホウ酸
アミンを含有する、実施例８及び９に用いた試験ストリ
ップは、耐加水分解性ホウ酸アミンを含まない、実施例
６及び７で用いた試験ストリップに比して、安定度の実
質的増大を示した。

【０１５６】同様の比較は、ＴＩＢホウ酸アミンを含ま
ない指示試薬組成物を包含する実施例１０及び１１で用
いた試験ストリップ間でも行い得るし、さらに、処方物
＃２の指示試薬組成物を包含する、実施例１２及び１３
に用いた試験ストリップ間でも行ない得る。そのデータ
は、指示試薬組成物中にＧＰＡ及び二次緩衝剤であるＭ
ＯＰＳを用いることによって、試験ストリップにより高
い安定性が付与され（実施例１１と７との比較）、ＴＩ
Ｂホウ酸アミンを含有すると試験ストリップの安定性が
実質的に増大する（実施例１３と実施例１１との比較）
ということを立証している。特に、反射率パーセンテー
ジ単位の変化は、実施例１２の非負荷試験ストリップと
実施例１３の負荷試験ストリップとの間では４．３０に
過ぎなかったが、これに比して、耐加水分解性二環式ホ
ウ酸アミンを含まない、実施例１０の非負荷試験ストリ
ップの実施例１１の負荷試験ストリップとの間のパーセ
ンテージ単位の変化は２５．４０であった。さらに、Ｔ
ＭＢ指示染料の濃度は、実施例１３の負荷試験ストリッ
プを実施例１２の非負荷試験ストリップと比較すると約
９％だけ（２０１μｇ　／ｃｍ２　から１８３μｇ　／
ｃｍ２　に）減少したが、一方、ＴＭＢ濃度は、ホウ酸
アミンを含まない実施例１１と実施例１２の負荷及び非
負荷試験ストリップにおいては、約３０％（２０２μｇ
　／ｃｍ２　から１４１μｇ　／ｃｍ２　に）減少した
。処方物＃２の指示試薬組成物を包含する試験ストリッ
プは、５０℃で８週間試験ストリップを貯蔵後、標準試
験試料中の０．０４５ｍｇ／ｄｌのヘモグロビンを正確
に検出したことも見出された。

【０１５７】したがって、過酸化活性物質に関する乾相
試験ストリップ検定に用いる指示試薬組成物中に一般構
造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ酸アミン化合物を含有す
ると、指示試薬組成物が安定化し、より感度の高い検定
が達成される。したがって、本発明の重要な特徴によれ
ば、過酸化活性物質に関する乾相試験ストリップ検定に
おける、指示染料とヒドロペルオキシドとの早期相互作
用についての、そして、環境湿度に暴露した場合の指示
試薬組成物のｐＨの上昇についての継続的且つ本質的な
問題が事実上取り除かれる。ブランク色の発色を本質的
に排除し、したがって偽陽性検定の問題を本質的に排除
するという指示試薬組成物についての発見は、潜血に関
する検定のような、過酸化活性物質に関する乾相試験ス
トリップ検定について、当業界で予期せぬ改良である。 さらに、本指示試薬組成物は、貯蔵中、及び環境湿度に
暴露された場合に、事実上一定のｐＨを維持し、したが
って、特に低濃度の過酸化活性物質に対する検定感度を
改良する。したがって、本発明の重要な特徴によれば、
尿及びその他の試験試料中の過酸化活性物質に関するよ
り正確で信頼できる検定が、本発明の指示試薬組成物を
用いることによって実行できる。

【０１５８】指示染料、ヒドロキシペルオキシド、緩衝
剤及びメチル又はエチル側基を有する二環式ホウ酸アミ
ンを包含する本発明の組成物は、指示染料とヒドロペル
オキシドとの早期相互反応を防止するに十分安定してい
る。さらに、本指示試薬組成物は、貯蔵中及び環境湿度
に暴露された場合に事実上一定の試験パッドｐＨを維持
する。したがって、本指示試薬組成物は、試験試料中の
過酸化活性物質の濃度に反応して、より劇的な変色を被
る。概して、一般構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）のホウ酸ア
ミン化合物を含有する本発明の指示試薬組成物は、安定
性の改良を示し、したがって指示染料とヒドロペルオキ
シドとの相互作用による試験パッドの早期バックグラウ
ンド色の発色を排除し；環境湿度に暴露した場合の試験
パッドにおけるｐＨ変化を排除し；試験パッドと試験試
料との接触後の試験パッドのｐＨ変化を防止し；環境湿
度に暴露される試験ストリップの耐用年数を増し；過酸
化活性物質及びヒドロペルオキシドによる指示染料酸化
を妨害せず；そして金属イオン錯体及びヒドロペルオキ
シドによって提供されるアルコルビン酸塩耐性を妨害し
ない。

【０１５９】明らかに、本発明の多数の修正及び変化は
、その精神及び範囲から逸脱せずに行われ、したがって
、特許請求の範囲に示されているような制限が課される
だけである。

【表６】

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試験試料中の過酸化活性物質の存在又
   は濃度を立証するために試験試料を接触させた場合に十
   分な変色を示すことができる組成物であって、次の：（
   ａ）指示染料； （ｂ）ヒドロペルオキシド； （ｃ）緩衝剤； （ｄ）式： 【化１】 （式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は、独立してメチル
   基又はエチル基であって、ｍ、ｎ及びｐは１〜約３の範
   囲の数である）を有するホウ酸アミン化合物；及び（ｅ
   ）適当な担体ビヒクル； を含有する組成物。
2. 【請求項２】　　指示染料が組成物１リットル当たり約
   ５ミリモル〜約６０ミリモルの範囲の量で存在する請求
   項１記載の組成物。
3. 【請求項３】　　指示染料がレドックス指示薬である請
   求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】　　レドックス指示薬が、ベンジジン；ｏ
   −トリジン；３，３´，４，５´−テトラアルキルベン
   ジジン（式中、アルキル基は１〜約６個の炭素原子を含
   有する）；ｏ−ジアニシジン；２，７−ジアミノフルオ
   レン；ビス−（Ｎ−エチルキノール−２−オン）−アジ
   ン；（Ｎ−メチルベンズチアゾール−２−オン）−（１
   −エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２
   −オン）−アジン；及びその組み合わせからなる群から
   選択される請求項３記載の組成物。
5. 【請求項５】　　指示染料が３，３´，５，５´−テト
   ラメチルベンジジンである請求項１記載の組成物。
6. 【請求項６】　　ヒドロペルオキシドが、クメンヒドロ
   ペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソ
   プロピルベンゼンヒドロペルオキシド、１−ヒドロキシ
   シクロヘキサン−１−ヒドロペルオキシド、２，５−ジ
   メチルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキシド、パラ
   メンタンヒドペルオキシド、１，４−ジイソプロピルベ
   ンゼンモノヒドロペルオキシド、ｐ−ｔ−ブチルイソプ
   ロピルベンゼンヒドロペルオキシド、２−（α−ヒドロ
   ペルオキシイソプロピル）−６−イソプロピルナフタレ
   ン、テトラリンヒドロペルオキシド、及びその組み合わ
   せから成る群から選択される請求項１記載の組成物。
7. 【請求項７】　　試験試料中の過酸化活性物質の存在又
   は濃度の測定方法であって、次の： （ａ）試験試料を、指示染料、ヒドロペルオキシド、緩
   衝剤、式： 【化２】 （式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は独立してメチル基
   又はエチル基であって、ｍ、ｎ及びｐは１〜約３の範囲
   の数である）を有するホウ酸アミン化合物、及び適当な
   担体ビヒクルを含有する組成物と接触させ；そして（ｂ
   ）組成物の変色の強度又は程度から試験試料中の過酸化
   活性物質の存在又は濃度を測定する；ことを包含する方
   法。
8. 【請求項８】　　生体液中の潜血の存在又は濃度の測定
   方法であって、次の： （ａ）試験試料を、指示染料、ヒドロペルオキシド、緩
   衝剤、式： 【化３】 （式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は独立してメチル基
   又はエチル基であり、ｍ、ｎ及びｐは１〜約３の範囲の
   数である）を有するホウ酸アミン化合物及び適当な担体
   ビヒクルを含有する組成物と接触させ；そして（ｂ）組
   成物の変色の強度又は程度から生体液中の潜血の存在又
   は濃度を測定する；ことを包含する方法。
9. 【請求項９】　　液体試料中の過酸化活性化合物の存在
   又は濃度の測定方法であって、次の： （ａ）液体試料を、指示染料、ヒドロペルオキシド、緩
   衝剤、式： 【化４】 （式中、Ｒ１　、Ｒ２　又はＲ３　は独立してメチル基
   又はエチル基であり、ｍ、ｎ及びｐは１〜約３の範囲の
   数である）を有するホウ酸アミン化合物及び適当な担体
   ビヒクルを包含する組成物を含有する試薬試験パッドを
   包含する分析対象物検出具と接触させ；そして（ｂ）液
   体試料中に存在する過酸化活性物質に対する変色に関し
   て分析対象物検出用具を調べる；ことを包含する方法。
10. 【請求項１０】　　液体試験試料中の過酸化活性物質の
    存在又は濃度を測定するための分析対象物検出用具であ
    って、次の： 支持ストリップ； 試薬試験パッド；及び 試薬試験パッド中に取り込まれる組成物であって、その
    組成物が （ａ）指示染料； （ｂ）ヒドロペルオキシド； （ｃ）緩衝剤； （ｄ）式： 【化５】 （式中、Ｒ１　、Ｒ２　及びＲ３　は独立してメチル基
    又はエチル基であり、ｍ、ｎ及びｐは１〜約３の範囲の
    数である）を有するホウ酸アミン化合物；及び（ｅ）適
    当な担体ビヒクル； を含む組成物；を包含する用具。