RU2458992C1 - Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови - Google Patents
Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458992C1 RU2458992C1 RU2011118091/15A RU2011118091A RU2458992C1 RU 2458992 C1 RU2458992 C1 RU 2458992C1 RU 2011118091/15 A RU2011118091/15 A RU 2011118091/15A RU 2011118091 A RU2011118091 A RU 2011118091A RU 2458992 C1 RU2458992 C1 RU 2458992C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peroxidase activity
- blood plasma
- hemoglobin
- plasma
- dianisidine
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимической диагностике и касается способа определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови. В разбавленную фосфат-цитратным буфером (рН 5,5) плазму крови вносят субстрат о-дианизидин. После добавления пероксида водорода в концентрации 2 мМ осуществляют спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата в присутствии ингибитора миелопероксидазы - гидразида 4-аминобензойной кислоты. Пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления субстрата о-дианизидина. Способ позволяет быстро и достоверно определить вклад гемоглобина в общую пероксидазную активность плазмы крови, что может быть использовано в прогнозировании развития заболеваний и выборе стратегии их лечения. 2 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биохимической диагностике, а именно к способам определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Определение параметров, характеризующих окислительно-восстановительные и воспалительные процессы в крови, необходимо как для диагностики и прогнозирования течения заболеваний, так и для мониторинга эффективности проводимой терапии. Одним из таких важных показателей является пероксидазная активность плазмы крови, которая определяется преимущественно активностью железосодержащих белков миелопероксидазы (МПО) и гемоглобина и его производных.
Являясь основным компонентом эритроцитов, гемоглобин при патологических процессах в результате разрушения эритроцитов (гемолиза) в достаточно больших количествах (до 15,3 мкМ) может попадать в плазму крови. Так, показано изменение содержания свободного гемоглобина в плазме при гемолитических анемиях, сердечной недостаточности, сахарном диабете и др.
МПО секретируется во внеклеточное пространство в результате дегрануляции или лизиса лейкоцитов в очагах воспаления. Повышение концентрации МПО, а также появление ее биомаркеров обнаружено при атеросклерозе, сердечно-сосудистых, онкологических, нейродегенеративных заболеваниях, нарушении дыхательной функции легких, при заболеваниях почек, системных васкулитах, ревматоидном артрите и др.
Известен способ определения пероксидазной активности МПО в плазме, включающий внесение в плазму крови субстрата пероксидаз, в качестве которого используют о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ) в присутствии и в отсутствие ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 4,5) [1]. Однако данным способом нельзя оценить пероксидазную активность гемоглобина в плазме.
В качестве прототипа принят способ определения общей пероксидазной активности плазмы, включающий внесение в плазму крови субстрата, в качестве которого используют о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости его окисления в присутствии пероксида водорода (3 мМ) в фосфатном буфере (рН 6,9) [2].
Однако известный способ имеет недостатки, так как не позволяет оценивать пероксидазную активность присутствующего в плазме гемоглобина, а дает возможность определить лишь общую пероксидазную активность, включающую вклад как МПО, так и гемоглобина.
Задачей изобретения является создание способа быстрого определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови, включающем внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5), пероксид водорода используют в концентрации 2 мМ, а пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления о-дианизидина.
Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидин вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрически определяют пероксидзаную активность гемоглобина как скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (2 мМ) в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5) в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Такие условия измерения позволяют минимизировать вклад миелопероксидазы в определяемую пероксидазную активность гемоглобина.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами, где:
на фиг.1 показана рН-зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме;
на фиг.2 приведена зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме от концентрации H2O2.
Способ позволяет определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови. Это дает возможность прогнозировать развитие заболеваний, уточнить диагноз и своевременно принять меры, направленные на регулирование пероксидазной активности гемоглобина, а также провести мониторинг пероксидазной активности плазмы во время клинических испытаний фармакологических препаратов.
Простота и скорость предлагаемого способа обеспечивают возможность его использования в экспресс-диагностике.
Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофотометр, позволяющий регистрировать оптическую плотность в видимой области спектра. Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом не менее 0,8 мл, содержащую фосфат-цитратный буфер (рН 5,5) в присутствии ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин (380 мкМ). После добавления пероксида водорода (2 мМ) пробу (общий объем пробы 0,8 мл) быстро перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450-460 нм в течение 8-10 мин. Оптическим контролем служит проба, содержащая те же компоненты, что и опытная проба, но вместо плазмы добавлен равный объем буферного раствора. Расчет пероксидазной активности гемоглобина (ПАHb) проводят по формуле:
где ΔD - прирост оптической плотности при 460 нм за t минут;
V - общий объем реакционной смеси (мл);
υ - объем образца плазмы (мл);
0,0152 - прирост ΔD, соответствующий окислению 1 мкМ о-дианизидина. Данный коэффициент определяли по калибровочной прямой зависимости оптической плотности при 460 нм от концентрации о-дианизидина (25-150 мкМ) после его полного окисления пероксидазой хрена (0,1 мкг/мл) в присутствии пероксида водорода (2 мМ). Единица пероксидазной активности гемоглобина в плазме (ПАHb) выражена в условных единицах (далее усл. ед.) и соответствует окислению 1 мкМ о-дианизидина за 1 минуту в описанных условиях.
Пример 1, демонстрирующий выбор оптимального рН при определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме.
В одну опытную кювету вносили фосфат-цитратный буфер (0,05 М Na2HPO4/0,025 М), 60 мкл плазмы, содержащей гемоглобин в концентрации 13,3 мкМ, и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В контрольную кювету - те же компоненты за исключением того, что вместо плазмы вносили 60 мкл фосфат-цитратного буфера. Общий объем образца - 0,8 мл. Растворы в кюветах тщательно перемешивали и одновременно в две кюветы добавляли раствор пероксида водорода (1 мМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и регистрировали оптическую плотность в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность гемоглобина в плазме при различных значениях рН: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 и 7,0, что достигалось путем использования фосфат-цитратного буфера с указанными значениями рН.
Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле:
где ΔDHb и ΔD - прирост оптической плотности за t мин в присутствии и в отсутствие добавленного извне гемоглобина соответственно;
0,8 - объем реакционной смеси (мл);
0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл).
Результаты измерений приведены на фиг.1, откуда следует, что зависимость пероксидазной активности гемоглобина в плазме от рН имеет максимум в диапазоне рН 4,5-5,5. Однако ранее было показано, что зависимость активности МПО от рН носит экстремальный характер с максимумом при рН 4,5 и значительно снижается при рН 5,5. Поэтому анализ данных, приведенных на фиг.1, позволяет сделать вывод о том, что значение рН 5,5 оптимально для измерения активности гемоглобина в плазме с миминальным вкладом активности МПО.
Пример 2, демонстрирующий выбор оптимальной концентрации пероксида водорода при определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме.
Определение пероксидазной активности гемоглобина плазмы проводили, как описано в примере 1, но при различных концентрациях пероксида водорода в диапазоне 100-4000 мкМ. Используемый фосфат-цитратный буфер имел значение рН 5,5.
Результаты определения активности гемоглобина при разных добавках пероксида водорода приведены на фиг.2, откуда следует, что пероксидазная активность гемоглобина в плазме практически линейно увеличивалась с ростом концентрации H2O2 вплоть до 2 мМ. Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что концентрация пероксида водорода, равная 2 мМ, оптимальна для определения пероксидазной активности гемоглобина.
Пример 3. Предлагаемым способом измерена активность гемоглобина в плазме крови 5 человек.
В одну опытную кювету вносили 60 мкл плазмы, фосфат-цитратный буфер (0,05 М Na2HPO4/0,025 М), (рН 5,5), гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации 50 мкМ и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В контрольную кювету - те же компоненты за исключением того, что вместо плазмы вносили 60 мкл фосфат-цитратного буфера. Содержание кювет тщательно перемешивали и одновременно в две кюветы добавляли раствор пероксида водорода (2 мМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию плотности в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин.
Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле:
где ΔD - прирост оптической плотности плазмы крови за t мин;
0,8 - объем реакционной смеси (мл);
0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл).
Полученные результаты приведены в таблице.
| Таблица | |
| Показатель пероксидазной активности гемоглобина в плазме | |
| Номер образца | ПАHb, усл. ед. |
| 1 | 0,855 |
| 2 | 0,789 |
| 3 | 6,776 |
| 4 | 0,461 |
| 5 | 5,263 |
Анализ данных, приведенных в таблице, позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ пригоден для определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и реально определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови.
Источники информации
1. Патент BY №13675, G01N 33/48, 30.10.2010.
2. Waugh W.H. (2003) J. Pediatr. Hematol. Oncol, 25, 831-834.
Claims (1)
- Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови, включающий внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови с последующим спектрофотометрическим определением скорости его окисления после добавления пероксида водорода, отличающийся тем, что спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5), пероксид водорода используют в концентрации 2 мМ, а пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления о-дианизидина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011118091/15A RU2458992C1 (ru) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011118091/15A RU2458992C1 (ru) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2458992C1 true RU2458992C1 (ru) | 2012-08-20 |
Family
ID=46936682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011118091/15A RU2458992C1 (ru) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2458992C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2612149C1 (ru) * | 2015-11-23 | 2017-03-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0222700B1 (en) * | 1985-10-31 | 1991-01-02 | Warner-Lambert Company | Composition and method for determining peroxidase-like activity of hemoglobin |
| EP0444273B1 (en) * | 1990-01-30 | 1994-11-02 | Miles Inc. | Composition, device and method of assaying for a peroxidatively active substance |
-
2011
- 2011-05-04 RU RU2011118091/15A patent/RU2458992C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0222700B1 (en) * | 1985-10-31 | 1991-01-02 | Warner-Lambert Company | Composition and method for determining peroxidase-like activity of hemoglobin |
| EP0444273B1 (en) * | 1990-01-30 | 1994-11-02 | Miles Inc. | Composition, device and method of assaying for a peroxidatively active substance |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WAUGH W.H. Simplified method to assay total plasma peroxidase activity and ferriheme products in sickle cell anemia, with initial results in assessing clinical severity in a trial with citrulline therapy. J Pediatr Hematol Oncol. 2003 Oct; 25(10): 831-834. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2612149C1 (ru) * | 2015-11-23 | 2017-03-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Erel | A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation | |
| Dounousi et al. | Oxidative stress is progressively enhanced with advancing stages of CKD | |
| Turpin et al. | Enhanced oxidative stress and damage in glycated erythrocytes | |
| Davison et al. | Exercise, free radicals, and lipid peroxidation in type 1 diabetes mellitus | |
| Can et al. | Role of oxidative stress and serum lipid levels in stable chronic obstructive pulmonary disease | |
| Lacy et al. | Plasma hydrogen peroxide production in hypertensives and normotensive subjects at genetic risk of hypertension | |
| Russa et al. | Oxidative balance and inflammation in hemodialysis patients: biomarkers of cardiovascular risk? | |
| JP5829766B2 (ja) | 酵素法を利用したヘモグロビンＡ１ｃ定量分析のための溶血試薬組成物 | |
| Sharkey et al. | Use of lactate in small animal clinical practice | |
| Gorni et al. | Oxidative stress in elderly population: A prevention screening study | |
| Qi et al. | Thioredoxin is a novel diagnostic and prognostic marker in patients with ischemic stroke | |
| JPH09511575A (ja) | ヘモグロビンの定量用無シアン化物試薬及び方法 | |
| Gaggini et al. | Conventional and innovative methods to assess oxidative stress biomarkers in the clinical cardiovascular setting | |
| Bulbul et al. | Are oxidative stress markers useful to distinguish schizoaffective disorder from schizophrenia and bipolar disorder? | |
| Schillern et al. | Serum free thiols in type 2 diabetes mellitus: A prospective study | |
| Goemans et al. | Validation and determination of a reference interval for canine HbA1c using an immunoturbidimetric assay | |
| Cialoni et al. | Nitric oxide and oxidative stress changes at depth in breath-hold diving | |
| Maciejczyk et al. | Effect of normobaric hypoxia on alterations in redox homeostasis, nitrosative stress, inflammation, and lysosomal function following acute physical exercise | |
| Lima et al. | Identification of erythrocyte biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis | |
| Sánchez-Illana et al. | Oxidative stress biomarkers in the preterm infant | |
| RU2458992C1 (ru) | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови | |
| JP6249511B2 (ja) | 酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクの診断的判定のための方法 | |
| Le Jeune et al. | Low grade intravascular hemolysis associates with peripheral nerve injury in type 2 diabetes | |
| Wolf et al. | Retrospective evaluation of carboxyhemoglobin and methemoglobin levels in dogs and cats with respiratory disease | |
| Izumino et al. | Balance of the prooxidant and antioxidant system is associated with mortality in critically ill patients |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140505 |