RU2612149C1 - Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных - Google Patents
Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2612149C1 RU2612149C1 RU2015150140A RU2015150140A RU2612149C1 RU 2612149 C1 RU2612149 C1 RU 2612149C1 RU 2015150140 A RU2015150140 A RU 2015150140A RU 2015150140 A RU2015150140 A RU 2015150140A RU 2612149 C1 RU2612149 C1 RU 2612149C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- activity
- biological substrate
- blood smears
- myeloperoxidase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии и касается способов определения пероксидазной активности нейтрофилов в мазках крови. Способ предусматривает подготовку биологического субстрата. Подготовленный биологический субстрат обрабатывают буферно-инкубационной смесью на основе 4-метилпарааминофенол сульфата. Осуществляют инкубацию в темноте с последующим инкубированием, промыванием дистиллированной водой, сушкой и микроскопированием. Изобретение позволяет повысить точность способа.
Description
Изобретение относится к биохимической диагностике и касается способа определения пероксидазной активности нейтрофилов в мазках крови, что может быть использовано в прогнозировании развития заболеваний и выборе стратегии их лечения.
Установлено, что в клетках крови у клинически здоровых животных определяется высокая активность миелопероксидазы, а у больных - снижена. Активность миелопероксидазы снижена в нейтрофилах при инфекционных лейкоцитозах и некоторых метастазирующих опухолях. Определение активности миелопероксидазы клеток крови является одним из тестов иммунного статуса организма животных.
В цитологических исследованиях определение миелопероксидазы осуществляется с помощью бензидиновой пробы. Общепринятые методики основаны на окислении бензидина пероксидпероксидной системой до нестабильного бензидинового синего, который самопроизвольно превращается в стабильный бензидиновый коричневый.
Известны методы определения миелопероксидазы, описанные в научных и патентных публикациях.
Определение пероксидазы в мазках периферической крови и костного мозга человека [Graham (1966) З. Лойда, Р. Госсрай, Т. Шиблер. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Пер. с англ. к.б.н. И.Б. Бухвалова, к.м.н. О.В. Копьева, под ред. проф. Н.Т. Райхлина. М.: изд. "Мир", 1982, с. 206]; Определение миелопероксидазы в крови [Справочник. Медицинские лабораторные технологии. / Под редакцией А.И. Карпищенко, издательство Санкт-Петербурга "Интермедика", 1999. Т. 2, с. 298]; «Способ выявления пероксидазы в иммунокомпетентных органах животных» [патент РФ №2198403, МПК7 G01N 33/50, C12Q 1/28, опубликован 10.02.2003, авторы Гугушвили Н.Н., Радуль Н.П., Шевкопляс В.Н.]; «Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови» [патент РФ №2458992, публ. 20.08.2012, авторы Горудко И.В., Панасенко О.М., Григорьева Д. В., Соколов А. В., Черенкевич С.Н., Сергиенко В.И.]; «Способ определения активности пероксидаз и субстратная смесь для определения активности пероксидаз» [патент РФ №2525137, опубликован 10.08.2014, авторы Сахаров И.Ю., Вдовенко М.М., Демьянова А.С.] и др.
Одним из недостатков перечисленных способов выявления миелопероксидазной активности является использование бензидина, который обладает канцерогенным действием.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению по совокупности существенных признаков является способ определения миелопероксидазы в крови, включающий подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью, инкубацию биологического субстрата с последующим высушиванием и микроскопированием, выбранный нами в качестве прототипа [Справочник. Медицинские лабораторные технологии. / Под редакцией А.И. Карпищенко, издательство Санкт-Петербурга "Интермедика", 1999. Т. 2, с. 298], включающий подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью, инкубацию биологического субстрата с последующим высушиванием и микроскопированием.
Недостатками данного метода являются затруднительное получение растворения бензидина в органических растворителях и нагревание раствора, что влечет за собой разложение бензидина, а также отсутствие окраски ядер нейтрофилов.
Техническим результатом изобретения является снижение вредности используемых веществ, в том числе канцерогенности, т.е. изыскание безвредного вещества, не уступающего по чувствительности бензидину, а также снижение себестоимости методики.
Поставленная задача достигается тем, что в способе цитологического определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных используется реакция с метолом, которая основана на окислении метола пероксидпероксидной системой.
Для решения поставленной задачи проводят подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью, инкубацию биологического субстрата с последующим высушиванием и микроскопированием. Для приготовления буферно-инкубационной смеси используют 4-метилпарааминофенол сульфат (коммерческое название - метол) - вещество, не являющееся дефицитным, используется в сочетании с гидрохиноном для проявления фото- и кинопленки, он значительно дешевле бензидина, и что наиболее важно - безвреден для организма человека. Метол представляет собой белый порошок либо бесцветные кристаллы (крупноразмерный вариант). Достаточно неплохо растворяется в воде (растворимость составляет 5 г на 100 мл), но при этом не растворяется в органических растворителях. Метол легко окисляется под действием атомарного кислорода, который образуется при разрушении перекиси водорода. Это свойство метола используется нами в заявленном способе определения миелопероксидазы.
Подготовку биологического субстрата осуществляют, фиксируя мазки крови животных 96 об.% этиловым спиртом или в парах 40% формалина.
Для получения буферно-инкубационной смеси готовят 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,2-7,5). В день исследования 10 мг метола растворяют в 10 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляют 13,5-14 мл 0,1 М трис-HCl буфера и 2-3 капли 1% раствора перекиси водорода и осуществляют инкубацию мазков крови в темноте в течение 5 мин. После окончания инкубации мазков крови их промывают дистиллированной водой, высушивают и дополнительно окрашивают ядра клеток 0,5%-водным раствором сафранина или нейтрального красного, что позволяет определить нейтрофилы крови по форме ядер. Окрашенные мазки крови промывают дистиллированной водой, сушат и микроскопируют, используя иммерсионный объектив светового микроскопа. Относительный процент пероксидазопозитивных нейтрофилов периферической крови животных определяют после подсчета 100 нейтрофилов. Об активности исследуемого фермента судят по количеству специфически окрашенных в коричневый цвет гранул в цитоплазме пероксидазопозитивных нейтрофилов крови животных.
Новизна обусловлена тем, что в предложенном способе используется метол, не обладающий способностью ингибировать активность миелопероксидазы гранулоцитов крови животных и не обладающий канцерогенным действием. Для сопоставления результатов и сравнения с известными методами и способами выявления миелопероксидазы с помощью бензидинового реактива проводилась микроскопия мазков крови с использованием иммерсионной системы при увеличении (90×10). Активность определяемого фермента устанавливали по интенсивности окрашивания и количеству гранул коричневого цвета в цитоплазме нейтрофилов.
При визуальной оценке цитохимической реакции учитывали различную степень активности фермента:
0-я степень - окрашено только ядро нейтрофилов, цитоплазма не окрашена, не видно контуров гранул;
1-я степень - вся цитоплазма диффузно окрашена в светло-коричневый цвет или окрашено не более 1/4 цитоплазмы;
2-я степень - в цитоплазме видны хорошо окрашенные в коричневый цвет
гранулы;
3-я степень - всю цитоплазму занимают гранулы, но ядро свободно от гранул;
4-я степень - гранулы занимают всю цитоплазму и наслаиваются на ядро.
Средний цитохимический индекс (СЦИ) выводили по следующей формуле, предварительно подсчитывая 100 нейтрофилов,
где а, б, в, г, д - количество клеток соответственно 0, 1, 2, 3, 4-й степени.
Заявляемый способ является экспресс-методом для проведения цитохимического анализа активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах в мазках крови животных. Способ позволяет определять как относительный процент пероксидазопозитивных нейтрофилов крови, так и внутриклеточную активность исследуемого фермента, что дает возможность оценить состояние клеточных микробицидных систем крови, принимающих участие в формировании неспецифической резистентности организма животных.
Заявляемый способ является более экономичным, т.к. метол не относится, по сравнению с бензидином, к дорогостоящим химическим реактивам.
Claims (1)
- Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных, включающий подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью, инкубацию биологического субстрата с последующим высушиванием и микроскопированием, отличающийся тем, что используют буферно-инкубационную смесь на основе 4-метилпарааминофенол сульфата.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150140A RU2612149C1 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150140A RU2612149C1 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2612149C1 true RU2612149C1 (ru) | 2017-03-02 |
Family
ID=58459277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015150140A RU2612149C1 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2612149C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198403C2 (ru) * | 2000-08-15 | 2003-02-10 | Кубанский государственный аграрный университет | Способ выявления пероксидазы в иммунокомпетентных органах животных |
| RU2458992C1 (ru) * | 2011-05-04 | 2012-08-20 | Белорусский Государственный Университет (Бгу) | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
| RU2525137C2 (ru) * | 2012-04-27 | 2014-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ определения активности пероксидаз и субстратная смесь для определения активности пероксидаз |
-
2015
- 2015-11-23 RU RU2015150140A patent/RU2612149C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198403C2 (ru) * | 2000-08-15 | 2003-02-10 | Кубанский государственный аграрный университет | Способ выявления пероксидазы в иммунокомпетентных органах животных |
| RU2458992C1 (ru) * | 2011-05-04 | 2012-08-20 | Белорусский Государственный Университет (Бгу) | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
| RU2525137C2 (ru) * | 2012-04-27 | 2014-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ определения активности пероксидаз и субстратная смесь для определения активности пероксидаз |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Под ред. КАРПИЩЕНКО А.И., Медицинские лабораторные технологии. 1999, т.2 Санкт- Петербугр, Интермедика, стр.298. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| He et al. | Combined whole-mount fluorescence in situ hybridization and antibody staining in zebrafish embryos and larvae | |
| Bradfield | The localization of enzymes in cells | |
| Thisse et al. | High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos | |
| Arkhipchuk et al. | Using the nucleolar biomarker and the micronucleus test on in vivo fish fin cells | |
| CN108061677A (zh) | 用于生物材料的澄清试剂和其用途 | |
| Small et al. | The roles of oxygen and ammonia in the symbiotic relationship between the spotted salamander Ambystoma maculatum and the green alga Oophila amblystomatis during embryonic development | |
| Manger et al. | Amplification of potential thermogenetic mechanisms in cetacean brains compared to artiodactyl brains | |
| Wetzker et al. | Distinct metabolic profiles in Drosophila sperm and somatic tissues revealed by two-photon NAD (P) H and FAD autofluorescence lifetime imaging | |
| CN111505260B (zh) | 一种重金属经口生物可及性与毒性检测体系的建立方法 | |
| Leite et al. | Analytical method for determination of nitric oxide in zebrafish larvae: toxicological and pharmacological applications | |
| CN102907357A (zh) | 一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法及其应用 | |
| CN102023207B (zh) | 在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法及其应用 | |
| Wake et al. | Improved Kupffer's gold chloride method for demonstrating the stellate cells storing retinol (vitamin A) in the liver and extrahepatic organs of vertebrates | |
| RU2612149C1 (ru) | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных | |
| CN102590488A (zh) | 调控斑马鱼卵黄蛋白原水平的方法 | |
| Shrestha et al. | Detection of Zn2+ ions using a high-affinity low-molecular-weight fluorescence probe in two freshwater organisms | |
| Bates | Persistence, morphology, and nutritional state of a gastropod hosted bacterial symbiosis in different levels of hydrothermal vent flux | |
| Benga et al. | Morphology and water permeability of red blood cells from green sea turtle (Chelonia mydas) | |
| RU2595849C1 (ru) | Способ выявления нервных структур в тканях | |
| WO2021001348A1 (en) | Method for preparing biological material for microscopy analysis | |
| CN111094537A (zh) | 阿尔茨海默症诊断装置及方法 | |
| Yumnamcha et al. | Confocal Microscopy Technique in Teratogenicity Testing Using Zebrafish (Danio rerio) Embryos as Model | |
| RU2771258C1 (ru) | Способ моделирования алкоголь-индуцированной нефропатии на фоне аутоиммунного нефрита у крыс в эксперименте | |
| Schmitt et al. | Comparison of contrast, sensitivity and efficiency of signal amplified and nonamplified immunohistochemical reactions suitable for videomicroscopy-based quantification and neuroimaging | |
| Langenbacher | In Situ Hybridization Nanoprobes to Investigate Mu Opioid Receptor Alternative Splicing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181124 |