CN111094537A - 阿尔茨海默症诊断装置及方法 - Google Patents

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CN111094537A CN201880057860.5A CN201880057860A CN111094537A CN 111094537 A CN111094537 A CN 111094537A CN 201880057860 A CN201880057860 A CN 201880057860A CN 111094537 A CN111094537 A CN 111094537A
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稻川裕之
数村公子
小林优多郎
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Kagawa University NUC
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Laboratory Of Innate Immune Regulation
Hamamatsu Photonics KK
Kagawa University NUC
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Abstract

本发明为了简便并且高精度地提供阿尔茨海默病的病态指标，阿尔茨海默病诊断装置包含：对末梢血中的选自超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量、吞噬细胞吞噬能、三甘油酯、空腹时血中葡萄糖、总胆甾醇、血红蛋白A1c及胰岛素的1个以上进行测定的测定单元，和将由该测定单元测定的指标作为阿尔茨海默病的病态指标表示的表示单元。

Description

阿尔茨海默症诊断装置及方法
【技术领域】
本发明涉及使用嗜中性粒细胞功能评价系统等的阿尔茨海默症诊断装置及方法。
【背景技术】
在日本，近年，随着人口的高龄化而认知症的患者数逐年增加。国内的患者数现在超460万人，预期在2025年达到700万人、高龄者的5人中1人。认知症患者的约60％是阿尔茨海默症、约20％是血管性认知症，其余含Lewy小体型认知症等的各种认知症疾病。阿尔茨海默症的原因、治疗法、预防法尚不明，要求早急的医学解决。在2011年由NIA/AA(TheNational Institute on Aging and the Alzheimer's Association，美国国家衰老研究所和阿尔茨海默病学会)提议的阿尔茨海默症的诊断基准中，将阿尔茨海默症分类为发病前阶段、轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默症导致的认知症的3个阶段，提示主要临床诊断基准和研究用诊断基准。前者是认知功能障碍(记忆障碍、失语、失行等)或精神障碍(抑郁，不眠、幻觉等)等的临床上见解。后者含关于阿尔茨海默症的生物标志物评价(脑脊髓液中的淀粉样β或τ蛋白质的定量)、由PET(正电子释放断层摄影)的脑内淀粉样蓄积的成像、由MRI的脑萎缩的评价，但这样的诊断指标多未充分地解明与病理变化的关系，留下高的侵袭性或高额的装置－检查费用等的课题。从而，为了进行阿尔茨海默症的早期诊断－发病前诊断，可简便并且低侵袭地检测阿尔茨海默症的发病的生物化学诊断指标被认为特别有效。至此，作为血液的生物化学标志物的各种炎症性细胞因子、氧化应激标志物(例如，过氧化脂质、4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)、最终糖化产物(AGEs))、微RNA等的测定作为阿尔茨海默症的诊断指标被提倡(例如，非专利文献1)。近年，指出末梢血的氧化应激与阿尔茨海默发病的初期阶段相关(非专利文献2)。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特开2015-084757号公报
专利文献2：特开2017-074008号公报
专利文献3：特开2017-040473号公报
【非专利文献】
非专利文献1：N.Sharma et al.,Journal of Clinical and DiagnosticResearch,10,1-6,2016
非专利文献2：M.Schrag et al.,Neurobiology of Disease,59,100-110,2013
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
嗜中性粒细胞是关于生物体防御的免疫活性细胞，当识别生物体内异物时，由酶NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)氧化酶产生作为活性氧种的超氧化物阴离子自由基(通称超氧化物、O2 ·-)。再者，以作为超氧化物代谢产物的过氧化氢作为底物，酶髓过氧化物酶(MPO)生成次氯酸。这样的活性氧种在生理性的浓度中控制各种各样的生物体内反应(例如，细胞周期、吞噬反应)，但如果过量地产生，则引发在组织中的炎症反应，因此指出在脑内的特定的部位的嗜中性粒细胞活性等与以阿尔茨海默症为首的氧化应激关联疾病的发病相关。与此相比，当将与被血脑屏障阻隔的脑内独立的末梢血中的嗜中性粒细胞活性等设为与阿尔茨海默病关联时，通过对此末梢血中的嗜中性粒细胞活性等进行测定而可简便地评价阿尔茨海默症的病态指标。即便如此，数村等使用荧光及化学发光的实时测定系统而开发了用简便的操作同时评价血液的MPO活性及超氧化物产生活性的方法(专利文献1、3)、另外，也公开评价嗜中性粒细胞等的吞噬细胞的吞噬能的方法(专利文献2)。
从而，本发明旨在提供使用在专利文献1～3中公开的嗜中性粒细胞活性评价系统(以下，也简称为“嗜中性粒细胞活性评价系统”)等而进行阿尔茨海默症的诊断的装置及方法。
【用于解决课题的技术方案】
本发明的阿尔茨海默病诊断装置的特征在于，具备对末梢血中的选自超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量、吞噬细胞吞噬能、三甘油酯、空腹时血中葡萄糖、总胆甾醇、血红蛋白A1c及胰岛素的1个以上进行测定的测定单元，和将由该测定单元测定的指标作为阿尔茨海默病的病态指标表示的表示单元。
另外，上述测定单元通过对选自超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量及吞噬细胞吞噬能的2个以上(其中选择超氧化物产生活性)进行测定，可以更高的精度提供阿尔茨海默病的病态指标。
另外，上述测定单元通过对超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性及氧化LDL量进行测定，可以再更高的精度提供阿尔茨海默病的病态指标。
另外，本发明的阿尔茨海默病诊断装置的特征在于，具备对末梢血中的超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量及吞噬细胞吞噬能进行测定的测定单元，和对于由该测定单元测定的指标，将a×A+b×B+c×C+d×D表示为阿尔茨海默病的病态指标的表示单元。
其中，
A：标准化超氧化物产生活性
B：标准化髓过氧化物酶活性
C：标准化氧化LDL量
D：标准化吞噬细胞吞噬能
a、b、c、d：系数
另外，本发明的阿尔茨海默病诊断方法是以采血的末梢血中的选自超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量、吞噬细胞吞噬能、三甘油酯、空腹时血中葡萄糖、总胆甾醇、血红蛋白A1c及胰岛素的1个以上作为阿尔茨海默病的病态指标的方法。
【发明的效果】
根据本发明，可简便并且高精度地提供阿尔茨海默病的病态指标。
【附图的简单的说明】
【图1】显示与水迷宫试验的相关的图。
【具体实施方式】
以下，一边参照附图，一边对于本具体实施方式详细地进行说明。
本实施方式涉及的嗜中性粒细胞活性的评价根据专利文献1及专利文献3中记载的方法。即，试样中的MPO活性基于以氨基苯基荧光素(APF：Aminophenyl fluorescein)作为指示剂的荧光检测法，超氧化物产生活性基于以2-甲基-6-(4-甲氧基苯基)-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮(MCLA)作为指示剂的化学发光法。通过将嗜中性粒细胞刺激剂添加到试样中，因为可评价嗜中性粒细胞的炎症防御能力(也可称为抗氧化能或氧化应激防止能)，在本实施方式中，使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐(PMA)。由嗜中性粒细胞刺激剂的试样中的净MPO活性或超氧化物产生活性可作为从刺激剂添加后的最大荧光量或发光量各减去刺激前的荧光量或发光量的值进行评价。另外，试样中的吞噬能根据专利文献2中记载的方法。即，基于以标记pH感受性荧光染料的吞噬粒子(ThermoFisher·Scientific公司制)作为指示剂的荧光检测法。小鼠末梢血中的氧化LDL量可使用市售的ELISA试剂盒(Kamiya Biomedical Company)而进行评价。
在实验中，作为阿尔茨海默症模型小鼠，使用12～14周龄的雄SAMP8小鼠(SAMP8/Ta Slc、日本SLC公司)，1周预备饲育后，分为2组，向一组给高脂肪食(含35％脂肪的饲料(研究膳食))，向另一组给低脂肪食(详细如后述。)。通过给高脂肪食，促进阿尔茨海默症的发病。再者，水通过自由饮水给予。小鼠的饲育用温度湿度管理的动物设施，在自由摄食、自由饮水、12小时光照射/12小时暗黑下的环境条件下进行。饲育17周后，进行以下所示的水迷宫试验1周，评价学习功能。水迷宫试验结束的次日、从心脏采血。本动物实验被香川大学动物实验委员会承认。
关于生物体内的炎症反应的白细胞的超氧化物产生活性、MPO活性及吞噬能使用嗜中性粒细胞活性评价系统(CFL-P2200、浜松Photonics公司)(专利文献1～3)进行测定。在采血中以肝素作为抗凝固剂使用。血液进行离心分离(1200g 20分钟)，得到血浆。血浆的生物化学分析使用以下所示的市售的试剂盒进行评价。
胰岛素(insulin)：小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Shibayagi)
血红蛋白A1c(HbA1c)：HbA1c测定试剂盒(积水Medical)
三甘油酯(TG)、总胆甾醇(TC)：各测定试剂盒(和光纯药)
空腹时血中葡萄糖(fasting BG)：血糖自身测定器(Roche·Diagnostics)
在本实施例中，将小鼠分为以下的2组。
(1)NC组：由自由摄取给含4％脂肪的饲料(低脂肪饲料)及水。
(2)PC组：由自由摄取给含35％脂肪的饲料(高脂肪饲料)及水。
[超氧化物(O2 ·-)产生活性]和[髓过氧化物酶(MPO)活性]
小鼠末梢血的嗜中性粒细胞活性(O2 ·-产生活性和MPO活性)使用嗜中性粒细胞活性能评价样机(专利文献1、3)进行评价。向小鼠末梢血30μL添加溶血试剂(TonboBiosciences)500μL，于室温反应2分钟后，进行200×g，离心3分钟的处理，回收细胞悬浮液。溶血试剂也可使用市售的，但优选不含细胞固定化剂。向从血液30μL得到的嗜中性粒细胞级分添加化学发光试剂(MCLA、终浓度0.5μM)及荧光试剂(APF、终浓度2μM)，使用缓冲液(氯化钠154mM、氯化钾5.6mM、HEPES10mM、氯化钙1mM)而将全量设为500μL。将测定试样设置于嗜中性粒细胞活性能评价样机，对PMA(终浓度1μM)刺激前后的化学发光及荧光值进行实时(每0.5秒钟)测定。超氧化物产生活性及MPO活性的值作为PMA刺激前后的测定值荧光强度差。将各测定值以成为平均值0、标准偏差1的方式变换(标准化(Wikipedeia：将数量除以代表值等而无量纲量化而变得可互相比较称为标准化。在多变量解析中使用“线形变换至平均成为0、分散成为1”))。
[氧化LDL(oxLDL)]
小鼠末梢血中的氧化LDL量使用市售的ELISA试剂盒(Kamiya BiomedicalCompany)进行测定。测定方法根据试剂盒附属的流程，将小鼠血浆用试剂盒附属的缓冲液稀释1000倍的样品供于测定。将各测定值以成为平均值0、标准偏差1的方式变换(标准化)。
[吞噬能(吞噬)]
小鼠末梢血的吞噬细胞吞噬能使用吞噬细胞吞噬能评价装置(专利文献2)进行评价。对于测定，向小鼠末梢血30μL添加pH感受性荧光粒子(Green大肠埃希氏菌(E.coli))，于37℃反应1小时，向阴性对照施加低温(4℃)处理，抑制吞噬反应。吞噬能的值作为得到在吞噬反应后使用吞噬细胞吞噬能评价装置测定10次(5秒钟)荧光的平均值、减阴性对照的测定值的荧光强度差的值。将各测定值以成为平均值0、标准偏差1的方式变换(标准化)。
[水迷宫试验]
(1)装置
将市售的黑色墨水添加到圆筒形池(直径100cm、深度40cm)的水(23±1℃)中，使得游泳中的小鼠无法目视确认平台。再者，透明的平台(直径10cm)以位于水面下1cm的方式设置。利用设置于池水面的正上方的市售的数字摄像机，将小鼠的游泳用动画记录。游泳轨迹的解析使用图像解析软件AminalTracker而根据“Neuroinformatics,14,479-481,2016”记载的方法进行。
(2)顺序
在试验前日，为了使小鼠适应池，使各游泳1次。顺序是，使小鼠在固定于水面上1cm的平台上静置20秒钟之后，使自由游泳30秒钟。其后，用实验者的手将小鼠诱导到平台上，静置20秒钟。另外，放入池时，使小鼠面向池的壁而入水，实验者快速移动到小鼠见不到的位置。第1～5天实施使小鼠记忆平台的位置的训练(4次/日)。训练的顺序是，将小鼠从任意的位置放入池中，使游泳60秒钟，探索设置于水面下1cm的平台。记录到达平台所要求的时间，在60秒钟无法到达的情况中记录为60秒钟。另外，未在时间内到达平台的小鼠用实验者的手诱导到平台上。到达平台后，静置20秒钟，将小鼠从池取出。再者，由5天的训练，在任何的组中均确认到到达平台所要求的时间的缩短，但在组间确认不到差异。在第6天实施探针试验。探针试验从池去除平台，使小鼠游泳60秒钟，对在池的平台所具有的4分圆区域内的滞留时间进行测定。再者，探针试验对各小鼠进行1次。
[学习功能]
基于阿尔茨海默病模型小鼠(SAMP8)的数据而探讨统计解析。进行嗜中性粒细胞活性－氧化LDL－吞噬能的各测定值和学习功能评价的以往方法(水迷宫试验)的相关解析的结果，与嗜中性粒细胞活性(O2 ·-产生活性)之间确认到非常强的相关(相关系数：-0.81)、与氧化LDL之间也确认到强的相关(相关系数：-0.63)(图1)。使嗜中性粒细胞活性－吞噬能－氧化LDL的各测定值统合化，探讨是否变得能预测学习功能。
将各测定值以成为平均值0、标准偏差1的方式变换。向此变换值(标准化的测定值)应用多重回归分析法，得到如以下的结果。
(水迷宫试验)＝-0.78×(O2 ·-产生活性)-0.08×(氧化LDL)
相关系数＝0.8228(1)
(水迷宫试验)＝-1.29×(O2 ·-产生活性)+0.62×(MPO活性)
相关系数＝0.9131(2)
(水迷宫试验)＝-1.295×(O2 ·-产生活性)+0.620×(MPO活性)+0.021×(吞噬能)
相关系数＝0.9133(3)
(水迷宫试验)＝-1.264×(O2 ·-产生活性)+0.787×(MPO活性)-0.316×(氧化LDL)
相关系数＝0.9480(4)
(水迷宫试验)＝-1.24×(O2 ·-产生活性)+0.79×(MPO活性)-0.05×(吞噬能)-0.33×(氧化LDL)
相关系数＝0.9489(5)
统合化的测定值与单独的测定值比，显示与水迷宫试验的更高的相关性(统合化：0.9489、单独：-0.21～-0.81)，从而发现使嗜中性粒细胞活性、氧化LDL、吞噬能统合化的意义。
另外，从这些结果得知，在使用下列变量时：
在4变量的情况中，(O2 ·-产生活性)、(MPO活性)、(氧化LDL)、(吞噬能)
在3变量的情况中，(O2 ·-产生活性)、(MPO活性)、(氧化LDL)
在2变量的情况中，(O2 ·-产生活性)、(MPO活性)
在1变量的情况中，(O2 ·-产生活性)，
确认到更高的相关系数，从而更优选。
就是在其中，在单独的情况中，与氧化LDL之间确认到强的相关(相关系数：-0.63)，与此相比，在2变量的情况中，相比(O2 ·-产生活性)和(氧化LDL)的组合(相关系数＝0.8228)、(O2 ·-产生活性)和(MPO活性)的组合的一方确认到更高的相关系数(相关系数＝0.9131)的点值得关注。
将各测定值以成为平均值0、标准偏差1的方式变换。向此变换值(标准化的测定值)应用多重回归分析法，得到如以下的结果。
标准化测定值的多重回归分析
(通过制作多重回归式，得到了比单独的相关式(单回归式)高的相关系数的顺序)
【表1】
Figure BDA0002402000750000081
Figure BDA0002402000750000091
*构成多重回归式的项目单独表示的与(水迷宫试验)的相关系数之中，最高的值和通过制作多重回归式而得到的相关系数的差异。
标准化测定值的单回归分析
(用单回归式显示高的相关系数的顺序)
【表2】
Figure BDA0002402000750000092
由多重回归式得到的相关系数比单回归式的相关系数变高，可认为通过多重回归而成为更正确地预测水迷宫试验(认知功能)的式。从而显示，评价选择的多个项目对于改善评价认知功能有用。在以上的方面，如表1所示，对相关系数变得比单回归还高0.129的4个项目(O2 ·-、MPO、吞噬、oxLDL)进行测定是最有用的。除此之外，变高到0.1以上的组合(O2 ·-、MPO、oxLDL)、(HbA1c、吞噬)、(TG、O2 ·-)、(MPO、oxLDL)也有希望。另外，变高到0.05以上的组合(O2 ·-、MPO、吞噬)、(O2 ·-、MPO)、(TG、MPO)、(MPO、吞噬、oxLDL)、(吞噬、oxLDL)、(HbA1c、O2 ·-)、(MPO、吞噬)、(TG、吞噬)、(空腹时BG、O2 ·-)也有用。
在本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请直接通过引用并入本文。
另外，含说明书、专利权利要求及附图的在2017年9月8日申请的日本国专利申请2017-173037的公开直接通过引用并入本文。

Claims (5)

1.阿尔茨海默病诊断装置，其包含：
对末梢血中的选自超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量、吞噬细胞吞噬能、三甘油酯、空腹时血中葡萄糖、总胆甾醇、血红蛋白A1c及胰岛素的1个以上进行测定的测定单元，和
将由该测定单元测定的指标表示为阿尔茨海默病的病态指标的表示单元。
2.权利要求1所述的阿尔茨海默病诊断装置，其中所述测定单元对选自超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量及吞噬细胞吞噬能的2个以上进行测定，其中选择超氧化物产生活性。
3.权利要求1所述的阿尔茨海默病诊断装置，其中所述测定单元对超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性及氧化LDL量进行测定。
4.阿尔茨海默病诊断装置，其包含：
对末梢血中的超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量及吞噬细胞吞噬能进行测定的测定单元，和
对于由该测定单元测定的指标，将a×A+b×B+c×C+d×D表示为阿尔茨海默病的病态指标的表示单元，
其中，
A：标准化超氧化物产生活性
B：标准化髓过氧化物酶活性
C：标准化氧化LDL量
D：标准化吞噬细胞吞噬能
a、b、c、d：系数。
5.方法，其以采血的末梢血中的选自超氧化物产生活性、髓过氧化物酶活性、氧化LDL量、吞噬细胞吞噬能、三甘油酯、空腹时血中葡萄糖、总胆甾醇、血红蛋白A1c及胰岛素的1个以上作为阿尔茨海默病的病态指标。
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