JPH09511575A - ヘモグロビンの定量用無シアン化物試薬及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 全血試料中の合計ヘモグロビンの濃度を１０秒未満以内に正確に定量する無シアン化物方法及び試薬であって、試薬は、イミダゾール、イミダゾール誘導体、Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリミジン、プリン、キノリン及びイソキノリンから構成される群から選択される配位子と、ラウリルジメチルアミンオキシド及びオクチルフェノキシエタノールから構成される群から選択される強溶血能をもつ界面活性剤を含む。試薬ｐＨは約１１〜約１４に調整されている。試薬を血液試料と迅速に混合すると、安定な色素原が形成され、５４０ｎｍ〜５５０ｎｍでその吸光度を測定することができる。無シアン化物試薬は自動高処理量臨床血液分析器で使用するのに理想的である。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモグロビンの定量用無シアン化物試薬及び方法 技術分野 本発明は一般には、手動方法又は自動方法のいずれかで全血試料中に存在する ヘモグロビン濃度を定量するのに使用する試薬及び方法に関する。特定試薬は、 シアン化物を使用せずに試料中の全ヘモグロビンを検出及び測定のために明確に 定義された色素原に迅速に変換する。発明の背景 ヘモグロビン分子は肺から種々の身体組織及び器官に酸素を輸送するので、血 液試料中のヘモグロビンの量を測定することの重要性は血液科学で旧来から認め られている。患者の血液中のヘモグロビン濃度の正確な測定値は、血液分析で測 定される最も重要なパラメーターであると言える。ヘモグロビン濃度は内在疾患 の徴候である貧血をスクリーニングするために使用される。 「西洋食」の国々では、ヘモグロビン濃度が男子では１４ｇ／ｄＬ、女子では １２ｇ／ｄＬを下回ると貧血であると判断される。貧血の原因は多様であるが、 ヘモグロビン濃度が低い場 合には患者の主治医は精密検査を行う必要がある。従って、ヘモグロビン濃度の 正確で確実な測定方法は血液学系の根幹である。患者が貧血に陥る最も一般的な ２つの理由は、血液損失と、食物接取における鉄、ビタミンＢ１２又は葉酸の欠 乏である。前者の場合には医師は血液損失の原因を調べて治療しなければならな い。後者の場合にも適切な栄養補給治療を決定するために正しい診断が必要であ る。 貧血の一次指標としての重要さに加え、ヘモグロビン濃度は数種の指数を計算 するために他の血球パラメーターと組み合わせて使用される。平均赤血球ヘモグ ロビン量（ＭＣＨ）は赤血球１個当たりのヘモグロビンの質量であり、ヘモグロ ビン濃度を同等容量中の赤血球の数で除することにより計算される。平均赤血球 ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）は赤血球中のヘモグロビンの重量百分率であり、 ヘモグロビン濃度をヘモクリットで除して百分率に変換することにより計算され る。ＭＣＨとＭＣＨＣはいずれも貧血の診断に有用なパラメーターである。これ らのパラメーターの重要さにより、血液試料中のヘモグロビン濃度を正確で確実 に測定する必要は一層重視される。 ヘモグロビン濃度の最近の測定法では、試料中の酸素輸送タ ンパク質の量を定量するために分光光度法を利用している。血液試料中のヘモグ ロビンを測定するために、分光光度法は、 １．全ヘモグロビンを封鎖している赤血球から放出しなければならず、 ２．反応開始時のヘモグロビンの形態に関係なく、試料中の全ヘモグロビンを単 一色素原種に変換しなければならない という２つの要件を満たさなければならない。 第１の要件は多くの手段により満たすことができ、最も簡単な手段は低張溶解 を生じるように血液試料を蒸留水で希釈する方法である。しかし、最近の自動血 液分析器具は低張溶解で達せられるよりも迅速な溶解を必要とする。多くの場合 には、溶解剤に界面活性剤を加えてヘモグロビンの放出を速めると共に、高脂質 濃度により試料中に生じ得る濁りを澄ませている。アニオン、非イオン、両性イ オン及びカチオンを含む種々の界面活性剤がこの作業に適している。界面活性剤 の必要量は界面活性剤の「力価」と試薬のイオン強度に依存して約１００ｍｇ／ Ｌ〜約５０ｇ／Ｌであり得る。 第２の要件は、グロブリンタンパク質分子内で錯形成して酸素を輸送するヘム 鉄の化学機構を説明する必要がある。ヘム鉄 は正常血液試料中では＋２（Ｆｅ^II）酸化状態に維持されている。血液試料は通 常は静脈から採取されるので、ヘモグロビンは一般にはデオキシ状態であり、即 ちヘム鉄に酸素は結合していない。しかし、試料は大気と接触するか又は酸素を 含有する緩衝液もしくは溶解試薬で希釈されるや否やオキシヘモグロビンに迅速 に変換され、ヘム鉄は酸素と結合するが、Ｆｅ^II（還元）状態に止まる。多くの 場合、試料中のヘモグロビンの量は空気に触れると自然に形成されるオキシヘモ グロビン色素原から決定することができる。しかし、この試料溶液を許容できな いような条件もある。ある種の疾患、遺伝条件又は中毒によっては、患者が循環 中に有意量のメトヘモグロビンをもつ場合がある。メトヘモグロビンではヘム鉄 は＋３（Ｆｅ^III）酸化状態である。ヘム鉄は酸素に結合することができず、ま た、オキシヘモグロビンとして測定するために酸素と結合できるようにＦｅ^IIに 容易に還元することもできない。また、ヘビースモーカーや、高濃度の自動車排 気ガスにさらされる労働者には、ヘム鉄と結合した高濃度の一酸化炭素が蓄積し がちである。一酸化炭素は強く結合して酸素の結合を妨げるので、オキシヘモグ ロビン法により測定する場合にはヘモグロビンの濃度に誤りが 生じる。ヘモグロビンの測定に最も一般に使用されているアプローチは、全ヘム 鉄を＋３状態に酸化させ、全ヘム鉄と定量可能に結合して分光光度法による定量 のために単一色素原種を生成する配位子を導入する方法である。 古典的な方法はドラブキン法である。要約すると、ヘモグロビンを低張溶解に より放出させ（最近の改良法では溶解を速めるために界面活性剤を加えている） 、フェリシアン化カリウムによりヘム鉄をＦｅ^IIIに酸化させ、鉄をシアン化カ リウムのシアン化物アニオンと反応させる。シアン化物はＦｅ^IIIと非常に強く 結合し、約５４０ｎｍにピークをもつ示差的色素原を与える。最近の改良法では フェリシアン化物酸化剤を使用せずに、界面活性剤の存在下で高ｐＨでヘム鉄を 大気酸素（又は酸素平衡試薬）により酸化させる方法もあるが、ほとんどの方法 ではその周知の毒性にも拘らず、依然としてシアン化物がヘム鉄配位子として使 用されている。 多くの自動血液分析器はドラブキン法の変形を使用している。これらの方法で は、シアン化物の存在下でｐＨ＞１０でカチオン界面活性剤により赤血球を溶解 している。これらの条件下では白血球核は無傷のままであり、通常のインピーダ ンス法によ り計数することができる。ヘモグロビンはドラブキン法で通常実施されるように 、５４０ｎｍで同一溶液の光学密度を読み取ることにより測定される。この方法 は、核による光の散乱によって濁りが生じるため、白血球数の高い試料中では測 定値に誤りを生じることがある。試料の濁り度即ち吸光度の増加により脂肪血症 及び黄桓試料も干渉しかねない。本発明は、他の血液成分による干渉を受けずに ヘモグロビンを測定する試薬を提供することにより、これらの問題を回避する。 Ｓｔｒｏｕｐｅら（米国特許第４，２００，４３５号）は、アロステリックエ フェクターの存在下でグリコシル化ヘモグロビンを定量するために配位子として イミダゾールを使用することを開示している。同著者らは試料中のヘモグロビン の量を測定するために、界面活性剤溶解剤、酸化剤及びヘム結合配位子を使用す ることも開示している。Ｓｔｒｏｕｐｅら（米国特許第４，２５５，３８５号） は上記試薬を含む試薬キットも開示している。本発明は、酸化剤を加える必要が ないという点と、従来技術の発明の約１０分間に比較して１０秒以内で反応が完 了するという点で、Ｓｔｒｏｕｐｅらの特許により開示されている発明と相違す る。 Ｂｅｎｅｚｒａら（米国特許第４，８５３，３３８号）は界面活性剤濃度が非 常に高く（２０〜５０ｇ／Ｌ）、ｐＨが１１．３〜１３．７の無シアン化物ヘモ グロビン試薬を開示している。ｐＨが高いことと、所望のｐＨに達するために多 量のＮａＯＨが必要であることから、この発明のヘム結合配位子は水酸化物アニ オンであると考えられる。試薬の水酸化物イオン濃度が十分に高くないと、ヘム は単一色素原に化学量論的に変換されず、高濃度（５５Ｍ）で存在する水が鉄結 合部位と競合して誤った結果を生じる恐れがある。本発明はこの問題を回避する 。 本発明の目的は、全血試料中に存在する合計ヘモグロビンを定量するための無 シアン化物法及び試薬を提供することである。本発明の別の目的は、自動器具で 使用できる迅速な合計ヘモグロビン定量法を提供することである。本発明の別の 目的は、費用効率の高い試薬を提供することである。本発明の別の目的は、他の 血液成分の干渉を受けずに全血中の合計ヘモグロビンを定量する方法を提供する ことである。 本発明の上記及び他の目的は、以下の説明及び図面から当業者に自明である。発明の概要 ヘモグロビン定量法で使用する無シアン化物試薬は、（ｉ）イミダゾール、イ ミダゾール誘導体、Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピ リジン、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリミジン、プリン、キノリ ン及びイソキノリンから構成される群から選択される無シアン化物配位子の濃度 ０．１〜２．０モルと、（ｉｉ）ラウリルジメチルアミンオキシド及びオクチル フェノキシエタノールから構成される群から選択される強溶血性界面活性剤の約 ０．１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）の水溶液からなり、該試薬のｐＨは好ましくは １価塩基で１１〜１４に調整されている。本発明の方法によると、無シアン化物 試薬を血液試料と迅速に混合して色素原を形成する。次に、得られた色素原の吸 光度即ち光学密度をヘモグロビンの濃度の指標として測定する。この方法で形成 される色素原は約１０秒以内で得られるので、自動器具で使用するのに特に好適 である。図面の簡単な説明 図１は本発明の方法及び試薬を使用して調製した試料のスペクトルである。 図２は、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）分析器でシアン化物含有ヘモグロビン 法を実施して得られたヘモグロビンデータと、実験用自動血液分析器で本発明の 無シアン化物ヘモグロビン法を実施して得られたヘモグロビンデータの相関プロ ットである。 図３は、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＳＴＫＳでシアン化物含有ヘモグロビン 法を実施して得られたヘモグロビンデータと、実験用自動血液分析器で本発明の 無シアン化物ヘモグロビン法を実施して得られたヘモグロビンデータの相関プロ ットである。 図４は、本発明の無シアン化物ヘモグロビン試薬の新鮮な調製物（対照）のヘ モグロビンデータと、無シアン化物試薬の６カ月調製物のヘモグロビンデータの 相関プロットである。 図５Ａ及びＢは、対照と、４５℃で３カ月間保存したときの本発明の無シアン 化物ヘモグロビン試薬の反応速度を示す。発明の詳細な説明 本発明の試薬は、高処理量自動血液分析器具で合計ヘモグロビン分析を行うた めに開発された。 ヘモグロビン定量に有用な試薬は、検出及び測定のために検出可能な色素原構 造を形成するように、赤血球を迅速に溶解でき、ヘモグロビンと迅速に錯形成で きなければならない。本発 明は、錯体が迅速に形成され、自動器具に適合可能な時間にわたって安定に維持 されるので特に有利である。反応体は何週間にもわたって安定である。本発明は 、得られる色素原が他の血液成分により干渉されず、現場に既存の自動血液分析 器具のスペクトル範囲内の波長で測定できるという点でも特に有利である。これ に対して、シアンメトヘモグロビン法は通例５４０ｎｍで吸光度を測定する。本 発明によると、約５４４ｎｍに吸収最大値をもつ赤みがかった茶色の色素原を形 成することができる。 本発明の試薬は、イミダゾールやイミダゾール誘導体等の配位子形成化合物の 水溶液である。配位子形成化合物は０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度で存在する。本発 明の試薬からのイミダゾールは、試料中の赤血球から放出されるヘモグロビンと 結合する。本発明で有用な他の配位子形成化合物としては、Ｎ−ヒドロキシアセ トアミド、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、ピ ラゾール、ピリミジン、プリン、キノリン及びイソキノリンが挙げられる。酸化 鉄ヘムと結合可能なアニオンとしては、シアン酸、フッ化物、アジ化物、亜硝酸 、水酸化物、酢酸及びギ酸が挙げられ、これらのアニオンの許容 可能な塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム等が挙げられる。 試薬は更に、強い溶血能をもつ界面活性剤を含有する。ラウリルジメチルアミ ンオキシド（Ａｍｍｏｎｉｘ Ｌ．Ｏ．）［Ｓｔｅｐａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，イリノイ州］及びオクチルフェノキシ ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００）又は他の強力洗浄剤を溶 解剤（ｌｙｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）の界面活性剤成分として使用することが できる。界面活性剤は約０．１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在すべきで ある。試薬のｐＨは１１〜１４、好ましくは１２．５に調整すべきである。水酸 化ナトリウムや水酸化カリウム等の１価塩基をｐＨ調整に使用することができる 。 本発明の方法によると、試薬と血液の比が約５０〜１０００：１となるように 溶解剤を全血試料と混合する。試料と試薬を迅速に混合し、溶血と、ヘモグロビ ンから色素原への変換を行う。次に試料と試薬の混合物を吸光度分光光度計に加 え、形成された色素原の光学密度を測定する。配位子がイミダゾールであるとき には、５４０ｎｍ〜５５０ｎｍで測定することができる。 試料中の合計ヘモグロビン濃度は、変換された色素原の光学密度と相関する。 以下、本発明を実施例により説明するが、これらの実施例は例示の目的に過ぎ ず、請求の範囲を制限するものではない。実施例１ 目盛り付きシリンダーに入れた約９００ｍｌの蒸留水に０．４モルのイミダゾ ール（２７．２ｇ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）と０． １モルの水酸化ナトリウム（４．０ｇ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ ｏｍｐａｎｙ）を加えた。磁気撹拌機を使用して試薬を溶かした。ラウリルジメ チルアミンオキシド（非イオン界面活性剤、３０％溶液、Ｓｔｅｐａｎ Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，イリノイ州）３．３ｍｌ を撹拌下に加え、蒸留水を加えて容量を１０００ｍｌに調整した。溶液を０．２ ミクロンＮａｌｇｅｎｅフィルターで濾過し、使用時まで室温で保存した。この 調製物を以下の文中ではイミダゾール０．４と呼ぶ。 イミダゾールの量を０．１モル（６．８ｇ）〜１．０モル（６８．１ｇ）とし た以外は同様にして他の試薬を調製した。 これらの調製物を以下の文中ではイミダゾールＸ（Ｘはモル濃度を表す）と呼ぶ 。実施例２ 全血１２μｌを３．０ｍｌのイミダゾール０．４と混合した。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈ ｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＰ）を使用して７８０ｎｍから４８０ｎｍまでの吸収スペ クトルを記録した。図１は５４４ｎｍにピークを示し、５８０ｎｍ付近に肩を示 す。比較のために、同一濃度のオキシ及びデオキシヘモグロビンのスペクトルも 示す。実施例３ 全血１２μｌを０．１〜１．０Ｍのイミダゾール試薬３．０ｍｌと迅速に混合 した。吸光度を５４４ｎｍで６０秒間モニターした。混合後１０秒から混合後６ ０秒までの吸光度の変化を測定し、「変動」の欄に示した。 実施例４ ＮａＯＨ、界面活性剤及びイミダゾールの各濃度を種々変化させた一連の調製 物を調製し、溶解の完全性とシグナルの安定性を試験した。全血１２μｌを試薬 と混合した。溶解の完全性については７００ｎｍの吸光度を観察し、色素原への 変換の完全性については５４４ｎｍの吸光度を観察した。溶解の完全性を「＋」 で示し、変動の存在を「＋」で示し、「＋＋」は顕著な変動を示す。 短時間で反応が完了すること、即ち短時間で完全に溶解し且つ変動のないこと が望ましいが、試薬添加と吸光度測定のタイミングを調節するならば変動シグナ ルを使用することも可能である。 実施例５ 本実施例と実施例６及び７ではイミダゾール０．４のみを使用した。一定範囲 のヘマトクリット値を与えるように操作した血液試料を調製した。これらの試料 は、ＥＤＴＡ抗凝血剤で処理した血液試料を５００ｇで１０分間遠心分離するこ とにより調製した。血漿を正常血液試料に加え、低ヘマトクリット試料を調製し た。バフィーコートを保存し、正常ヘマトクリットをもつ高白血球数試料を得た 。沈降した赤血球を高ヘマトクリット試料として分析した。ヘマトクリット及び 白血球数を Ｂａｋｅｒ ４０００分析器で測定した。イミダゾール０．４で１：２５１に希 釈した試料の吸光度をＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａ Ｄｉｏｄ ｅ Ａｒｒａｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで５４０ｎｍで読み取っ た。結果を下表に示す。 実施例６ ドラブキン法によるヘモグロビン定量用キットを使用し、従来確立されている 参照方法とイミダゾール０．４試薬の性能を比較した。カタログ番号５２５−Ａ のキットはＳｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １４５０８ ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州，６３１７８から入手し、指示に従って再構成 及び使用した。 ０〜約２０ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度を与えるように全血 の正常試料を操作した。試料をドラブキン法及びイミダゾール０．４を使用して 分析した。ドラブキンの試料は１：２５１の比で反応させ、イミダゾール０．４ は１：１０１の比で反応させた。全反応混合物をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒ ｄ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで５４０ｎ ｍで読み取った。イミダゾール０．４の反応は１０秒以内に完了するが、便宜の ために反応混合物を約３０分間インキュベートさせてから読み取った。 イミダゾール０．４試薬とドラブキン試薬の相関係数はｒ＝＋０．９９７６で あり、傾きは７５．２ｍＡ／ｇ／ｄＬであり、切片は−１２．０ｍＡである。イ ミダゾール０．４試薬と標準ドラブキン試薬により与えられるＡ５４０の優れた 線形相関は、これらの２種の方法による結果が等価であることを立証し、シアン 化物含有標準方法の代わりに本発明の方法の非毒性調製物を使用できることが明 らかである。実施例７ 市販の半自動血液分析器Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）βＪＴでＬｙｓｉｓ Ｓ （登録商標）ＩＩＩ（シアン化カリウム含有）とＩｓｏｔｏｎ（登録商標）ＩＩ Ｉ試薬（いずれもＣｏｕｌｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ， フロリダ州の製品）を使用し、イミダゾール０．４試薬と比較した。０〜約２５ ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度をもつ一連の全血処置試料を上記のように調製した 。試料をＣｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＪＴ分析器で器具マニュアルに記載されて いるように分析した。ポジティブディスプレースメントピペット（Ａｂｓｏｌｕ ｔｅｒ Ｐｉｐｅｔｔｏｒ，Ｔｒｉ−Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｒａ ｓｓ Ｖａｌｌｅｙ，カリフォルニア州）を使用して血液試料４０μｌを試験管 に分配し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｒｅｐｉｐｅｔｔｏｒ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．）でイミダゾー ル０．４試薬５．０ｍｌを加えることにより、イミダゾール０．４試薬を試料と １：１２６の比で反応させた。シッパーを備えるＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ−７ Ｓ ｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，カリフォルニア州）で５４０ｎｍにおける反応試料の吸 光度を読み取った。イミダゾール０．４による定量を２回繰り返し、結果を平均 した。 強い線形相関（相関計数ｒ＝０．９９９８、傾きｍ＝４９．９４ｍＡ／ｇ／ｄ Ｌ、切片ｂ＝４．４ｍＡ）は、本発明が公知市販器具と厳密に同等の結果を与え ることを立証するものである。 実施例８ １２ｇ／ｄＬ〜１７．５ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度をもつ５２個の臨床試料 を、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｄｉ ｖｉｓｉｏｎ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ．より現在市販されている全自動 血液分析器である較正Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３５００システムと、本発 明で開発された全自動実験用血液分析器（本発明の 試薬及び方法を利用できるように任意の自動血液分析器を容易に改造することが できる）で分析した。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３５００ヘモグロビン試薬 はシアン化カリウムを含有しており、血液ヘモグロビンの反応体はシアンメトヘ モグロブリンである。ヘモグロビン測定に用いた全血希釈比は１：３０１であり 、反応体の検出波長は５４０ｎｍである。実験用ヘモグロビン試薬は脱イオン水 中に０．４モルのイミダゾール、０．１モルの水酸化ナトリウム及び０．１％（ ｗ／ｖ）のラウリルジメチルアミンオキシドを含有する。無調整時の試薬のｐＨ は１３．０であった。市販システムでＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３５００に よるヘモグロビン測定に用いた全血希釈比は１：１２５であり、反応時間は１０ 秒間である。変換された色素原の検出波長は５４０ｎｍである。次に、実験用分 析器のヘモグロビン結果を線形回帰分析によりＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３ ５００の結果と比較した。 図２の回帰統計から明らかなように、２種の方法の性能はほぼ等価である。相 関係数＝０．９９、傾き＝０．９７、及びＹ切片＝０．３４。 強い線形相関は、本発明が公知市販器具と厳密に同等の結果 を与えることを立証するものである。実施例９ １２ｇ／ｄＬ〜１７．５ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度をもつ５２個の臨床試料 を、市販の全自動血液分析器である較正Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＳＴＫＳシ ステムと、（実施例８に記載したような）本発明で開発された較正実験用血液分 析器で分析した。Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＳＴＫＳヘモグロビン試薬はシア ン化カリウムを含有し、血液ヘモグロビンの反応体はシアンメトヘモグロビンで ある。反応体の検出波長は５４０ｎｍである。実験用ヘモグロビン試薬は０．４ モルのイミダゾール、０．１モルの水酸化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｖ）の ラウリルジメチルアミンオキシドを含有する。無調整時の試薬のｐＨは１３．０ であった。市販システムでヘモグロビン測定に用いた全血希釈比は１：１２５で あり、反応時間は１０秒間である。変換された色素原の検出波長は５４０ｎｍで ある。次に、実験用分析器のヘモグロビン結果を線形回帰分析によりＣｏｕｌｔ ｅｒ（登録商標）ＳＴＫＳの結果と比較した。図３の回帰統計から明らかなよう に、２種の方法の性能はほぼ等価である。相関係数＝０．９８、傾き＝１．０２ 、及びＹ切 片＝−０．２１。 強い線形相関は、本発明が周知の市販血液分析器具のシアンメトヘモグロビン 法と厳密に同等の結果を与えることを立証するものである。実施例１０ 脱イオン水中に０．４モルのイミダゾール、０．１モルの水酸化ナトリウム及 び０．１％（ｗ／ｖ）のラウリルジメチルアミンオキシドを含有するヘモグロビ ン試薬を新たに調製し、この試薬を使用して、７．０〜１７．６ｇ／ｄＬのヘモ グロビン濃度をもつ１２個の臨床試料を（実施例８に記載したような）較正実験 用分析システムで分析した。無調整時の試薬のｐＨは１３．０であった。同一の １２個の試料を再較正せずに、室温で６カ月間老化させた同一組成のヘモグロビ ン試薬で再試験し、試薬の安定性を評価した。 対照試薬の結果を調製後６カ月の試験試薬の結果と比較し、図４に線形回帰デ ータを示す。２つの試験の間に有意差は認められず、試薬は少なくとも６カ月間 は室温で安定であることが判明した。相関係数＝０．９９８、傾き＝１．０１、 及びＹ切片＝−０．２７。実施例１１ 脱イオン水中に０．４モルのイミダゾール、０．１モルの水酸化ナトリウム及 び０．１％（ｗ／ｖ）のラウリルジメチルアミンオキシドを含有する本発明の試 薬の安定性を調べるために、調製後１カ月未満の試薬での変換時間及び変換され た色素原のスペクトルを、４５℃で３カ月間保存した試薬と比較した。この試験 では、新鮮な正常血液２４μｌをキュベットに入れ、適当な試薬３．０ｍｌを血 清用ピペットから迅速に加えた。次に、反応混合物をパスツールピペットにより ２回の吸引／分配サイクルで混合した。 結果を図５に示す。同図から明らかなように、混合は１０秒以内で完了した。 反応を５４４（吸収最大）、５８０（肩）、５００（谷）及び７００（濁り度標 準）ｎｍ（頂部から底部までのスペクトル）で追跡した。７００ｎｍの読み取り 値は溶解の完全性を示す。対照と４５℃で保存した試薬は同一の反応速度をもつ ことが明らかである。変換時間は１０秒未満であった。これらのデータからアレ ニウスの外挿によると、本発明の試薬調製物は室温で１年間以上安定であると推 定される。実施例１２ 較正Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）３５００システムで測定した場合に１５． ８ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度をもつ正常血液試料を使用し、本発明で脂肪血症 試料がヘモグロビン測定値に及ぼす濁り度干渉レベルを評価した。これは、ＩＣ ＳＨシアンメトヘモグロビン法を含む多くの方法によるヘモグロビン測定で周知 の問題である。Ｌｉｐｉｄ−Ｔｒｏｌ（ＰＮ＃Ｌ２６４８）をＳｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。この製品はトリグリセリド１３３ ０ｍｇ／ｄＬとコレステロール８４０ｍｇ／ｄＬを含有していた。臨床範囲を十 分にカバーするように下表に示すトリグリセリドとコレステロールの最終濃度ま で等張塩類溶液で製品の５種の希釈液を調製した。これらの溶液２０μｌ（対照 調製物には塩類溶液２０μｌを加えた）を、実施例１０に記載したような本発明 のヘモグロビン試薬で１：１２５に希釈した血液試料の希釈液に加え、混合し、 １ｃｍキュベットを使用してＴｕｒｎｅｒ Ｍｏｄｅｌ ６９０分光光度計で５ ４０ｎｍ（ヘモグロビン）及び７００ｎｍ（濁り度）で各試料の光学密度を測定 した。対照のヘモグロビン値（同一血液試料のＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録 商標）３５００システムヘモグロビン値）を使用して各調製物中のヘモグロビン の濃度を計算した。 本発明により変換された色素原の光学密度（Ｏ．Ｄ．）はヘモグロビンの濃度 と線形関係があることに留意されたい。 データが示すように、これらの試料調製物にトリグリセリドとコレステロール を加えても、濁り度（７００ｎｍＯ．Ｄ．）測定値にもヘモグロビン値（５４０ ｎｍＯ．Ｄ．）にも有意差は観察されなかった。実施例１３ 較正Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ３５００システムで測定した場合に１５．６ｇ／ｄＬの ヘモグロビン濃度をもつ正常血液試料を使 用し、本発明でビリルビン過剰血症患者の試料がヘモグロビン測定値に及ぼすビ リルビン干渉レベルを評価した。これは、ＮＣＣＬＳシアンメトヘモグロビン法 を含む多くの方法によるヘモグロビン測定で周知の問題である。ビリルビン標準 （カタログ番号５５０−１１）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎ ｙから入手した。この製品は、バイアル中の合計内容物を脱イオン水１．５ｍｌ で再構成したときにビリルビン３０ｍｇ／ｄＬを含有していた。臨床範囲を十分 にカバーするように下表に示すビリルビンの最終濃度まで等張塩類溶液で製品の ５種の希釈液を調製した。これらの溶液２０μｌ（対照調製物には塩類溶液２０ μｌを加えた）を、実施例１０に記載したような本発明のヘモグロビン試薬で１ ：１２５に希釈した血液試料の希釈液に加え、混合し、１ｃｍキュベットを使用 してＴｕｒｎｅｒ Ｍｏｄｅｌ ６９０分光光度計で５４０ｎｍ（ヘモグロビン ）及び７００ｎｍ（濁り度）で各試料の光学密度を測定した。対照のヘモグロビ ン値（同一血液試料のＣｅｌｌ−Ｄｙｎ３５００システムヘモグロビン値）を使 用して各調製物中のヘモグロビンの濃度を計算した。本発明により変換された色 素原のＯ．Ｄ．はヘモグロビンの濃度と線形関係 にあることに留意されたい。 データが示すように、これらの試料調製物にビリルビンを加えても、濁り度（ ７００ｎｍＯ．Ｄ．）測定値にもヘモグロビン値（５４０ｎｍＯ．Ｄ．）にも有 意な増加は観察されなかった。この結果から明らかなように、ビリルビン過剰血 症患者の試料は本発明による全血ヘモグロビン濃度の測定に干渉しない。 以上、本発明の例示の目的で所定の代表的な態様と詳細を説明したが、請求の 範囲に記載する発明の範囲内で種々の変更及び変形が可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．合計ヘモグロビン測定用無シアン化物試薬であって、 （ａ）濃度０．１〜２．０モルのイミダゾール、イミダゾール誘導体、Ｎ−ヒド ロキシアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピリジン、オキサゾール、チア ゾール、ピラゾール、ピリミジン、プリン、キノリン及びイソキノリンから構成 される群から選択される無シアン化物配位子と、 （ｂ）濃度約０．１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）の、ラウリルジメチルアミンオキ シド及びオクチルフェノキシエタノールから構成される群から選択される界面活 性剤 の水溶液からなり、試薬のｐＨが１１〜１４に調整されていることを特徴とする 前記試薬。 ２．界面活性剤がラウリルジメチルアミンオキシドである請求項１に記載の試薬 。 ３．ラウリルジメチルアミンオキシドが約０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する 請求項２に記載の試薬。 ４．配位子がイミダゾールである請求項１に記載の試薬。 ５．イミダゾールが約０．４Ｍの濃度で存在する請求項１に記 載の試薬。 ６．配位子がイミダゾールであり且つ界面活性剤がラウリルジメチルアミンオキ シドである請求項１に記載の試薬。 ７．１価塩基を使用して試薬ｐＨを調整する請求項１に記載の試薬。 ８．全血試料中の合計ヘモグロビン濃度を定量する無シアン化物方法であって、 （ａ）（ｉ）イミダゾール、イミダゾール誘導体、Ｎ−ヒドロキシアセトアミド 、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール 、ピリミジン、プリン、キノリン及びイソキノリンから構成される群から選択さ れる無シアン化物配位子と、（ｉｉ）ラウリルジメチルアミンオキシド及びオク チルフェノキシエタノールから構成される群から選択される界面活性剤の水溶液 からなり、１価塩基でｐＨを１１〜１４に調整した無シアン化物試薬を提供する 段階と、 （ｂ）試料を無シアン化物試薬と迅速に混合して色素原を形成する段階と、 （ｃ）色素原を含む試料−試薬混合物を吸光度分光光度計に加える段階と、 （ｄ）試料−試薬色素原の光学密度を測定する段階と、 （ｅ）試料−試薬色素原の光学密度測定値から試料中の合計ヘモグロビン濃度を 決定する段階を含む前記方法。 ９．光学密度の測定を５４０ｎｍ〜５５０ｎｍで実施する請求項８に記載の方法 。 １０．試薬配位子がイミダゾールである請求項８に記載の方法。 １１．イミダゾールが０．４Ｍの濃度で存在する請求項１０に記載の方法。 １２．試薬界面活性剤がラウリルジメチルアミンオキシドである請求項８に記載 の方法。 １３．ラウリルジメチルアミンオキシドが０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する 請求項１２に記載の方法。 １４．試薬配位子がイミダゾールであり且つ試薬界面活性剤がラウリルジメチル アミンオキシドである請求項８に記載の方法。