DK158995B - Blanding til bestemmelse af naervaerelsen af en forbindelse i en proeve samt teststrimmel impraegneret med blandingen - Google Patents

Description

DK 158995 B

Opfindelsen angår en blanding til bestemmelse af nærværelsen af en forbindelse i en prøve, hvilken blanding omfatter et enzymatisk oxidationssystem, der frigører peroxid og tilvejebringer en farve i nærværelse af forbindelsen ved 5 omsætning med en chromogen indikator omfattende benzidin eller et af dets chromogene derivater eller blandinger deraf, hvorhos blandingen, da den er udsat for ugunstig indflydelse ved tilstedeværelse af ascorbinsyre i prøven, omfatter en tyngmetalforbindelse, der i ioniseret tilstand har et oxida-10 tionspotential under portentialet for indikatoren, men over potentialet for ascorbinsyre, og opfindelsen angår tillige en teststrimmel til bestemmelse af nærværelsen af en bestanddel i en prøve.

Der er sket store fremskridt inden for den analytiske 15 kemi, siden biokemien begyndte at vise sig som en primær videnskabelig front med krav til stedse mere komplicerede analysemetoder og midler til løsning af problemer, der ikke tidligere var forsøgt løst. Ligeledes har den medicinske videnskab og praksis givet incitamenter til væksten af den 20 analytiske kemi, idet der kræves såvel høj præcision som hastighed ved opnåelsen af resultater. Dette bemærkelsesværdige fremskridt er blevet yderligere ansporet af f.eks. bryggeriindustrien og den kemiske fremstillingsindustri.

Til tilfredsstillelse af disse ekspanderende teknolo-25 giers behov er der blevet udviklet talløse analytiske procedurer, kompositioner og apparater, herunder kemisk opløsningsteknik, automatiseret maskineri og de såkaldte "dyp-og-aflæs"-reagensstrimler. Den foreliggende opfindelse angår primært de sidstnævnte, omend der i den sidste ende også 30 opnås betydelige fremskridt i forbindelse med de øvrige procedurer.

Testmaterialer af reagensstrimmel-typen har udstrakt anvendelse til mangeg analytiske formål, især ved den kemiske analyse af biologiske væsker, og dette skyldes materialernes 35 forholdsvis lave pris, deres lette anvendelighed og den hastighed, hvormed resultaterne opnås. I medicinen kan tal-

DK 158995 B

2 rige fysiologiske funktioner f.eks. måles blot ved dypning af reagensstrimler i en prøve af legemsvæske, f.eks. urin, og iagttagelse af et detekterbart respons, f.eks. en ændring i farve eller en ændring i mængden af lys, der reflekteres 5 fra eller absorberes af strimlen.

Sammen med sådanne "dyp-og-aflæs,,-metoder er der fremkommet mange kemiske metoder til detektering af legems-væskebestanddele. Ved de fleste af disse metoder tilvejebringes der et detekterbart respons, som er kvantitativt eller 10 i det mindste semi-kvantitativt. Ved måling af responset efter en forudbestemt tid kan den, der analyserer, således opnå ikke blot en positiv indikation på tilstedeværelsen af en bestemt bestanddel i en forsøgsprøve, men også en bedømmelse af, hvor meget der er til stede af bestanddelen. Sådan-15 ne strimler giver lægen et letanvendeligt diagnostisk værktøj samt evnen til at måle eller anslå udstrækningen af en sygdom eller en unormal legesfunktion.

Eksempler på "dyp-og-aflæs"-strimler, der for tiden er i brug, er produkter, der kan fås fra Ames Division af 20 Miles Laboratories, Inc., under varemærkerne CLINISTIX®, MULTISTIX®, KETOSTIX®, N-MULTISTIX®, N-MULTISTIX®-C, DIAS-TIX®, DEXTROSTIX® og andre. Testmaterialer såsom disse omfatter normalt én eller flere bærermatrixer, f.eks. absorberende papir, der hver for sig har et inkorporeret bestemt reagens-25 system, der tilvejebringer en farveændring i nærværelse af en bestemt forsøgsprøve-bestanddel. Afhængigt af det reagenseller reaktant-system, der er inkorporeret i en bestemt matrix, kan disse materialer anvendes til påvisning af tilstedeværelsen af glucose, ketonstoffer, bilirubin, okkult 30 blod, nitrit og andre patologiske stoffer. Den specifikke farveændring og den intensitet af farven, der kan iagtages efter et bestemt tidsrum efter kontakten mellem strimlen og prøven, indicerer nærværelsen af en bestemt bestanddel og dennes koncentration i prøven. Nogle af disse testmaterialer 35 og deres reaktantsystemer er angivet i US patentskrifterne nr. 3.123.443 (CLINISTIX®), 3.212.855 og 4.147.514 (KETO-

DK 158995B

3 STIX®), 3.814.668, 3.164.534 og 2.981.606 (DIASTIX®) og 3.298.789, 3.092.465, 3.164.534 og 2.981.606 (DEXTROSTIX®).

Sukkeranalysens historie er måske mest bemærkelsesværdig, fordi den er ændret drastisk gennem årene, både med 5 hensyn til den anvendte, grundlæggende kemi og med hensyn til omfanget. For det meste kan disse analyser karakteriseres som oxidationssystemer, der efter reduktion initierer reaktionsbetingelser, der fører til et detekterbart respons, f.eks. en farveændring eller ændring i bølgelængden af ultraviolet 10 lys, der absorberes eller reflekteres af systemet. Reducerende sukkerarter vil således omdanne sølvoxid til metallisk sølv, og hvis en opløsning af sukkerarten påføres et stykke filtrerpapir imprægneret med sølvoxid, udvikles der en sort plet, jfr. F. Feigl, Chem. Ind., Vol. 57, p. 1161, London 15 1938. Ligeledes giver o-dinitrobenzen og 3,4- og 3,5-isomere- ne af dinitrophthalsyre en følsom farvereaktion (dannelse af violette nuancer), når de opvarmes sammen med reducerende sukkerarter i Na2C03, jfr. T. Momose et al., Chem. Pharm.

Bull. Tokyo, Vol.12, p. 14 (1964), og F. Feigl, Spot Test 20 in Organic Analysis, 7th. Ed., p. 338-339, Elsevier Publ.

Co., New York 1966.

Så tidligt som i 1849 var det imidlertid kendt, at reducerende sukkerarter ville forårsage, at der fra en alkalisk opløsning af CUSO4 udfældes det gule til røde cupro(I)-25 oxid (eller oxyhydrat), jfr. H. Fehling, Ann., Vol. 72 (1849), se også B. Herstein, J. Am. chem. Soc., Vol. 32, p.

779 (1910). Denne tidlige milepæl, der er kendt som Fehling's prøve, gav incitament til udviklingen af en langt mere følsom prøve, ved hvilken der anvendtes sølvoxid i ammoniak, det 30 såkaldte Toliens' reagens, som reagerer let med reducerende midler til dannelse af en sort fældning af metallisk sølv, der ofte danner et spejl på indervæggene af glasreaktionskar, jfr. B. Tollens, Ber., Vol. 14 p. 1950 (1881) og vol. 15, p. 1635, 1828 (1882).

35 På grund af den forholdsvis store hyppighed af diabe tes mellitus og denne lidelses ledsagende, alvorlige kliniske

DK 158995 B

4 konsekvenser er der fra biologisk og medicinsk side udvist stor interesse for nye metoder til analyse af glucoseniveauer i urin og serum. Denne betydelige interesse har ført til udviklingen af flere procedurer, som afviger drastisk fra 5 deres forudgående opløsningskemiske metoder. De nævnte procedurer betjener sig af specielt udtænkte biokemiske systemer, der kan inkorporeres i større "dyp-og-aflæs"-materialer, anvendes i opløsning eller suspension eller i forbindelse med spektrofotometre og andre apparaturer.

10 Blandt disse nye metoder er den foreliggende opfindel se særlig aktuel i forbindelse med et enzymatisk system, hvor analyten, f.eks. glucose, er et substrat for et bestemt enzym, idet reaktionsprodukterne er i stand til at fremkalde et detekterbart respons fra chromogene indikatorforbindelser, 15 f.eks. de, der i teknikken løst betegnes som "indikatorer af benzidin-typen". Disse skal defineres mere omhyggeligt i det følgende, med det er her tilstrækkeligt af anføre, at disse forbindelser kan undergå farveændringer i nærværelse af hydrogenperoxid og et peroxidativt stof, f.eks. enzymet 20 peroxidase. Glucose-glucoseoxidase-systemet er et eksempel på den kendte teknik, ifølge hvilken glucose oxideres til gluconsyre under samtidig dannelse af H202 i overensstemmelse med følgende reaktionsskema: CH,0H CH20H CH20II ^ 25 H/^VH ' H/^\o $ i-o

Hflrø «Λ 'S N HOT H/ H(fal y ri fad ri ri 30 --^ H2°2 (3-D-glucose <5-gluconolacton D-gluconsyre 35 Det er dannelsen af hydrogenperoxid, der letter de påfølgende, indikator-relaterede trin, der fører til en

DK 158995 B

5 iagttagelig farvedannelse eller andet detekterbart respons.

En indikator af benzidin-typen giver således respons i nærværelse af hydrogenperoxid og peroxidase ved ændring af dens lysabsorberende evne.

5 I praksis anvendes denne teknologi nu til glucose- analyse i form af ,,dyp-og-aflæs"-reagensstrimler såsom de, der markedsføres af Ames Division af Miles Laboratories,

Inc., under varemærket CLINISTIX® og andre. Stort set omfatter disse strimler en plaststrimmel, på hvis ene ende der 10 er anbragt en absorberende papirdel imprægneret med de pågældende enzymer, indikatorforbindelse og puffermidler som de væsentlige aktive bestanddele. Strimlerne anvendes ved dypning af den reagens-bærende ende i forsøgsprøven, fjernelse af strimlen og sammenligning af en i papiret dannet farve 15 med et standard-farvekort, der er kalibreret til forskellige glucosekoncentrationer.

Til trods for de bemærkelsesværdige fordele, der frem-bydes af reagensstrimler, viser visse stoffer, der ofte er til stede i forsøgsprøven, sig hyppigt at interferere med 20 prøvens nøjagtighed. Når koncentrationerne af sådanne stoffer når en vis tærskelværdi i sammenligning med værdien for det substrat, der måles på, kan den uheldige virkning på forsøget blive markant. Eksempelvis har kyndige på reagensstrimmel-området længe været klar over, at nærværelsen af ascorbinsyre 25 i urin uheldigt kan påvirke analysen af sådanne ikke-relate-rede bestanddele såsom glucose, okkult blod, bilirubin og nitrit. Høje koncentrationer i urin af ascorbinsyre fra terapeutiske doser af vitamin C eller parenterale præparater, der indeholder vitamin C som reduktionsmiddel, f.eks. tetra-30 cyclin, kan således inhibere reaktionen ved sådanne tests og begrænse deres nøjagtighed.

Betydningen af dette i lang tid uløste problem fremgår af de mange forsøg på en løsning, der findes i den kendte teknik. I US patentskrift nr. 3.411.887 er der beskrevet 35 anvendelsen af en metalion med et oxidations-reduktions-po-tentiale over potentialet for det interfererende stof, men

DK 158995B

6 under potentialtet for den chromogene forbindelse eller indikator. Omend denne løsning forekommer teoretisk mulig og rent faktisk i nogen grad minimerer interferens fra ascorbinsyre, nedsætter den den kvantitative nøjagtighed af indi-5 katorerne i sukker-følsomme reagenssystemer, især glucose-systemer. Primært synes vanskeligheden at stamme fra en alvorlig mangel på opbevaringsstabilitet for en sukker-følsom indikatorkomposition i nærværelse af metalionen. På grund af den nedsatte opbevaringslevetid og manglen på kvantitativt 10 respons har forbindelserne beskrevet i US patentskrift nr. 3.411.887 aldrig givet tilstrækkeligt gode resultater til opnåelse af en pålidelig sukkerprøve, idet kuren populært sagt har været værre end sygdommen.

I US patentskrift nr. 3.975.398 og 3.988.208 beskrives 15 der indikator forbindelser, som angives ikke at blive inhi-beret af acetoeddikesyre eller af ascorbinsyre. Andre forsøg på at løse dette interferensproblem er foregået gennem anvendelsen af ionbytterstoffer (britisk patentskrift nr. 1.193.594) og flerlags-bærematrixer (britisk patentskrift 20 nr. 1.171.788) i det håb, at de interfererende stoffer fysisk kunne adskilles fra forsøgsprøven inden kontakten med reagenssystemet .

Til trods for i lang tid fortsatte anstrengelser, såsom de ovenfor omtalte, er der til dato ikke blevet fundet 25 nogen egentlig løsning på problemet. Det "opfangnings-sy-stem", der er tale om i US patentskrift nr. 3.411.887, jfr. de følgende eksempler, giver kompositioner med marginal stabilitet. Testmaterialer, der betjener sig af en sådan teknologi, er i virkeligheden uanvendelige efter blot en 30 kortvarig opbevaringspreriode ved stuetemperatur.

Med den foreliggende opfindelse løses dette længe følte behov for et indikatorsystem med en væsentlig resistens mod interferens fra reducerende midler såsom ascorbinsyre (vitamin C).

35 Blandingen ifølge opfindelsen, der er af den i det foregående angivne art, er ejendommelig ved, at tungmetalfor-

DK 158995B

7 bindeisen er et kompleks af en mercuriion og én eller flere ligander, hvor liganderne er covalent bundet til ionen til dannelse af et vandopløseligt kompleks, hvilken ligand har et højere oxidationspotential end ionen i dens kompleksbundne 5 tilstand, og hvor komplekset har stabilitetskonstant Kg større end 107, hvorhos komplekset i det væsentlige ikke virker forstyrrende på reaktionssystemet.

Teststrimlen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den omfatter en bærermatrix impræneret med en blanding 10 ifølge opfindelsen.

Anvendelsen af det her omhandlede mercuriion-ligand-kompleks, i det følgende kaldet "komplekset", er at betragte som enestående. Selv når forsøgsopløsninger indeholder forholdsvis høje mængder reducerende midler, er analyse stadig 15 mulig, medens nøjagtig bestemmelse i sådanne forsøgsprøver hidtil var umulig, medmindre man forinden havde fjernet interferanten forud for analysen. Eksempelvis har komplekset, der indgår i blandingen ifølge opfindelsen, vist sig at lette en nøjagtig analyse af glucose i urinprøver indeholden-20 de op til 200 mg pr. deciliter (mg-%) af ascorbinsyre. Alligevel er de her omhandlede blandinger uventet stabile i sammenligning med kendte blandinger, af hvilke ingen har blot tilnærmelsesvis samme anvendelighed, idet der samtidig tilvejebringes et produkt, der er stabilt nok til at tåle 25 opbevaring over mere end minimale tidsrum.

Efter de første heldige forsøg med et aminosyrekom-pleks med Hg++ er mange yderligere aminosyrer blevet afprøvet som ligander. Nogle fungerede tilfredsstillende, andre ikke. Endvidere har det senere vist sig, at andre forbindelser, 30 tilsyneladende uden relation til aminosyrer, er lige så effektive som ligander i komplekset. Også her fungerede nogle forbindelser tilfredsstillende og andre ikke.

På grund af denne store spredning af ligander, der tilvejebringer både stabile komplekser med mercuriioner og 35 ophævelse af interferens fra reducerende midler, er man gået meget vidt for at identificere den eller de fælles

DK 158995 B

8 egenskaber, der gælder for alle ligander og komplekser, der har vist sig tilfredsstillende, og som ikke genfindes hos de mulige forbindelser, der har vist sig utilstrækkelige.

De fælles træk menes at omfatte de følgende fire parametre: 5 (a) ligandens evne til at bindes i det væsentlige covalent til mercuriionen, idet der fås et vandopløselige kompleks, hvorved ionens ioniske natur lades i det væsentlige fri til påvirkning af det interfererende reducerende middel, (b) et ligand-oxidationspotential, der er højere end potenti-10 alet for mercuriionen i den kompleksbundne tilstand, således at ionen ikke kan fremme oxidativ nedbrydning af liganden ved opbevaring, (c) en stabilitetskonstant for komplekset på mindst 107 således, at liganden og ionen ikke er bundet for løst eller 15 for kraftigt, hvorved komplekset enten bliver for ustabilt til at hindre Hg++-hydrolyse, eller for kraftigt bundet således, at metalionen af skæmes fra dens omgivelser i en sådan grad, at den ikke længere kan påvirke det interfererende reducerende middel, og 20 (d) komplekset eller dets reaktionsprodukters manglende evne til efter reduktion at interferere med reagenssystemet.

Inden der fortsættes med en næmere omtale af komplekserne, er det nyttigt at komme næmere ind på visse teoretiske aspekter af mecuriionens kemi og dens evne til at danne 25 covalente bindinger med visse ligander. Hg++ betragtes som en stærk Lewis-syre, idet den opfører sig på lignende måde som HF eller H2P04-i vandige medier og let hydrolyserer til dannelse af hydroxykomplekser i overensstemmelse med skemaet: 30 Hg++ + H20 ^------- ^ HgOH+ + H+ (1)

Ligevægtskonstanten for denne reaktion kan udtrykkes som: [HgOH+] [H+] 35 K = - = 3,2 x 10“3 (2) [Hg++]

DK 158995 B

9 Går man et skridt videre, hydrolyseres HgOH+ let til Hg(OH)2f der disproportionerer til dannelse af gult HgO og vand i overensstemmelse med den samlede reaktion: 5 Hg++ + 20H\ - -r* Hg (OH) HgO + H20 (3)

Opløselighedsproduktet for mercuri(II)hydroxid i denne reaktion er: 10 Ksp = [Hg++][0H-]2 = 4 x 10"26 (4)

Ud fra værdierne for ligevægtskonstanterne vedrørende hydrolysen af Hg++ (ligningerne (2) og (4) er det åbenbart, at Hg++ kun er stabil i vandig opløsning ved pH-værdier 15 under ca. 2, idet der forudsættes fraværelse af stabiliserende kompleksdannende midler. Ved svagt højere pH-værdier er HgOH+ overvejende, og ved pH-værdier større end 3 vil HgO udfældes næsten kvantitativt.

Det kan ikke undre, at der ved forsøg på anvendelse 20 af angivelserne i det ovennævnte US patentskrift nr. 3.411.887 fremkom alvorlig misfarvning og tab af mængdebestemmelse og opbevaringsstabilitet. Uden midler til stabilisering af Hg++ som sådan såvel som i opløsning dannes det kraftigt farvede HgO spontant efter forholdsvis korte opbeva-25 ringsperioder eller ved anvendelsen, hvorved testmaterialet bliver både følsomt over for interfererende reducerende midler og upålideligt set fra såvel kvalitative som kvantitative synspunkter. Nærværende erkendelse ligger således i den truisme, at mercuriforbindelser i opløsninger ved pH-30 værdier over 3 er ustabile, medmindre hydrolyse udelukkes, f.eks. ved kompleksdannelse mellem Hg++ og en ligand, der er i stand til at tilvejebringe tilstrækkelig stabilitet.

Der er ved arbejdet med opfindelsen fundet ikke blot kompleksdannende ligander, som giver den påkrævede stabilisering 35 (og mange, som ikke gør det), men også ligander, der tillader, at komplekset fungerer fortrinligt til fjernelse af

DK 158995 B

10 interferens fra reducerende midler.

Det første af de fire kriterier, som menes at relatere de her omhandlede ligander til hverandre, er evnen til covalent at bindes til Hg++, idet der samtidig tilvejebringes 5 vandopløselige komplekser. Blandt ligander, der kan bindes covalent til Hg++, er CN”, SCN", Cl“, Br", I", acetat, NH3, CH3NH2, pyridin, anilin, ethylendiamin, ethylendiamintetraed-dikesyre, triphenylphosphin, aminosyrer, carboxamider, imi-der, heterocycliske amider såsom uridin samt mange andre.

10 Ved undersøgelse af mulige ligander til dannelse af komplekset begynder man således med at bestemme de ligander, der vil bindes covalent til Hg++, og af disse findes der et stort antal.

Dernæst undersøges det, om et kompleks af liganden 15 vil opløses i vand i nævneværdig grad. En opløselighed, der er tilstrækkelig til at give en vandig koncentration på mindst ca. 0,01 M, betragtes i øjeblikket som passende for komplekset, omend man foretrækker komplekser, der er i stand til at danne mindst ca. 0,1 M opløsninger i vand ved stan-20 dardtryk og -temperatur (STP).

Når der foreligger en liste over ligander, som bindes covalent til Hg++ til dannelse af vandopløselige komplekser, er det næste trin at undersøge, hvilke af disse, der ikke vil oxideres af metalionen. Hvis liganden har for lavt et 25 oxidationspotentiale i forhold til mercuriionen, vil komplekset være tilbøjeligt til dekomponering, hvilket medfører manglende evne til eliminering af interferens fra reducerende midler. En af metoderne til undersøgelse af liganders tilbøjelighed til oxidation med den kompleksdannende mercuriion 30 går ud på fremstilling af en opløsning af komplekset i vand og iagttagelse ved STP i flere dage. Udfældningen af gråt, metallisk kviksølv indicerer et uacceptabelt ligand-oxidationspotential .

Den tredie parameter, der skal undersøges ved bestem-35 melse af ligander, hvis mercurikomplekser løser problemet med interferens fra reducerende midler, er det termodynamiske

DK 158995 B

11 kriterium, der kendes som stabilitetskonstanten (Ks). Som det fremgår af det ovenstående, kræves der kompleksdannende ligander på grund af den spontane dannelse af gult HgO fra Hg++ ved pH-værdier over ca. 3, og fordi denne ion er tilbø-5 jelig til langsomt at danne HgO i den tørre tilstand. Den stabiliserende indflydelse af forskellige ligander kan bedømmes ved hjælp af Ks-data for hvert enkelt Hg++-ligand-kom-pleks. Dannelsen af komplekset udtrykkes som følger: 10 Hg++ + nL v — HgLn (5)

Ks-værdien for denne reaktion udtrykkes som: [HgLn] *s = -—- (6) 15 [Hg++][L]n I ligningerne (5) og (6) er L en ligand, n er antallet af sådanne ligander bundet til metalionen, og Hgl^ er komplekset. Sædvanlige værdier for n er 2, 3 eller 4, men n 2 0 kan have en så høj værdi som 6. Det vil forstås, at HgLn kan være et heterogent kompleks, hvor Ln kan omfatte forskellige ligander bundet til den samme ion.

Ud fra ligningen (4) udledes ligningen: 4 x 10"26 25 [Hg++] = --- (7) [OH-]2 Når denne kvotient indsættes i ligning (6), fås ligningen: [OH~]2[HgLn] 30 Ks = - (8) 4 X 10"26[L]n

Med det formål at bestemme numeriske værdier for Ks, og dermed at beskrive komplekset numerisk, skal der her anvendes en række antagelser. Eftersom forholdsvis høje, i 35 det væsentlige ækvimolære koncentrationer af ligand L og kompleks HgLn er ønskelige ved fremstillingen af blandingen ifølge den foreliggende opfindelse, og eftersom sådanne koncentrationer kommer nær til aktiviteten 1, vil det her

DK 158995 B

12 blive antaget, at [HgLn] * [L] * 1 (9) På grundlag af denne antagelse kan ligning (8) forenkles til følgende: 5 [OH-]2

Ks =-— do) 4 x 10 26

Det ses således, at Ks spiller en vigtig rolle ved definitionen af komplekser, der vil være stabile under forskellige 10 pH-betingelser, jfr. ligning (10). Den følgende tabel I viser, hvorledes denne matematiske afhængighed kan udtrykkes som de Ks-værdier, som et kompleks skal have for at hindre, at det omdannes til HgO ved forskellige pH-værdier.

Tabel I

15 Ks nødvendig til hindring af HgO-dannelse.

pH [OH-] Ks 4 10-10 2,5 X 105 5 10-9 2,5 X 107 20 6 10-8 2,5 X 109 7 10-7 2,5 X 1011 8 10“6 2,5 x 1013 9 10“5 2,5 x 1015 10 10"4 2,5 X 1017 25 11 10“3 2,5 X 1019

Det fremgår af tabellen, at et mercurikompleks, såfremt det skal holdes i opløsning ved en pH-værdi på 6, dvs. i pH-området for normal urin, skal have en Ks-værdi på 30 2,5 x 109. Det har vist sig, at komplekser med en Ks-værdi så lav som ca. 105 er stabile ved en pH-værdi på ca. 4.

Omend er disse værdier ikke er absolutte, har det vist sig at være at foretrække, at komplekset har en Ks-værdi på mindst ca. 107.

35 Det sidste kriterium, der skal opfyldes af det her omhandlede kompleks, er ikke-interferensen med reagenssystemet og det sidstnævntes evne til detektering af analytens

DK 158995B

13 tilstedeværelse. Det er klart, at en kompleks, der reagerer kemisk med systemet, eller som inhiberer et enzym, der er essentielt for det kvantitative respons på tilstedeværelsen af bestanddelen, vil modvirke opfindelsens formål. Endvidere 5 må komplekset ved dets reduktion med et interfererende reducerende middel, f.eks. ascorbinsyre, ikke give reaktionsprodukter, der i sig selv hindrer den ønskede analyse.

Dette fænomen med kviksølvkompleks-interferens med reagenssystemer kan let bestemmes i laboratorie på basis af 10 det i det foranstående angivne. Det eneste, der skal gøres, er at inkorporere komplekset sammen med det ønskede reagenssystem. Kompositionen kan derpå anvendes til måling af nærværelsen af bestanddelen i to for-kalibrerede opløsninger, én indeholdende urin med bestanddelen nærværende, og den anden 15 urin indeholdende den samme bestanddel, men med en forholdsvis høj tilsætning af ascorbinsyre (ca. 10-100 mg/dl). Resultaterne af disse analyser sammenlignes dernæst med resultater opnået ved anvendelse af reagenssystemet uden komplekset i de samme opløsninger. Rimelig farveoverensstemmelse mellem 20 de to indicerer en acceptabel ikke-interferens i reagenssystemet fra kviksølvkomplekset eller dets reduktionsprodukter.

Til opsummering generelt af de ovennævnte resultater, både eksperimentelle og teoretiske, kan det anføres, at der er blevet fundet et væsentligt antal ligander, som, når de 25 kompleksbindes med Hg++, tilvejebringer løsningen på et problem, der i årevis har generet analyseteknikken, især analyser, ved hvilke der anvendes "dyp-og-aflæs"-reagensstrimler: ukorrekte eller forkerte, negative aflæsninger på grund af de interfererende virkninger af ascorbinsyre eller 30 andre lignende reducerende midler. Disse ligander tilhører sådanne tilsyneladende ikke-relaterede, generiske kategorier som aminosyrer, nucleosider, sekundære og tertiære amider og phosphiner. Endvidere virker nogle forbindelser af en given kategori som ønsket, medens andre ikke gør det.

35 Efter opnåelsen af de nævnte forvirrende forsøgsresul tater stillede man sig den opgave at finde en række fælles

DK 158995 B

14 egenskaber, der sammenkæder de virkningsfulde ligander og komplekser, men udelukker de, der ikke er effektive til formålet. Fire parametre synes herefter vigtige: (a) ligandens evne til covalent binding med Hg++ til dannelse 5 af vandopløselige komplekser, (b) ligandens evne til at modstå den oxidative tilbøjelighed af Hg++, dvs. et højere oxidationspotentiale, (c) en Ks-værdi på fra 105 til 108 eller mere for komplekset, og (d) kompleksets forenelighed med et bestemt reagenssystem.

10 Godt anvendelige komplekser tilfredsstiller alle disse krav, medens dårligt anvendelige kun tilfredsstiller ét eller flere af kravene.

I den følgende tabel er der anført ligander, med hvilke der har været udført forsøg, jfr. de følgende eksemp-15 ler, såvel med godt som med dårligt resultat, og liganderne er opregnet i overensstemmelse hermed. I tabellen er også angivet årsagerne til, at visse ligander giver komplekser med Hg++, der er ude af stand til at sikre et kendt glucose-reagenspræparat mod ascorbat-interferens. I tabel II betyder 20 angivelsen (1), at liganden ikke bindes covalent til Hg++ eller danner et vanduopløseligt kompleks, (2) betyder, at liganden ikke har et oxidationspotentiale, der er tilstrækkeligt til at af væge oxidation med Hg++, og (3) betyder, at der er tale om komplekser med en for lav Ks-værdi.

25 Tabel II

Godt anvendelige ligander sarcosin uridin threonin triethanolamin serin diethanolamin 3 0 prolin natriumlauroylsarcosinat bicen [(HOCH2CH2)2 NCH2C00H] triphenylphosphin Dårligt anvendelige ligander (årsager).

Alanin (2) 35 Glycin (2)

Trishydroxymethylaminomethan (2)

DK 158995 B

15

Glutaminsyre (2)

Asparagin (1 og 3) DL-a-amino-n-smørsyre (1 og 3) α-Methylaminoisosmørsyre (1 og 3) 5 2,6-Pyridin-dicarboxylsyre (1 og 3)

Nitrilotrieddikesyre (1 og 3)

Adenin (1 og 3)

Guanin (1 og 3)

Cystin (2) 10 Leucin (2) m-Dimethylaminobenzoesyre (1, 2 og 3)

Aminomethansulfonsyre (1 og 3)

Sulfaminsyre (1 og 3)

Glycylglycin (2) 15 L-Histidin (2)

Cytidin (1 og 2)

Acetone (3) EDTA*

Morpholin (2) 20 Thianthren (3)

Methyliminodieddikesyre (1)

Arginin (1 og 2)

Ornithin (1 og 2)

Lysin (1 og 2) 25 Citronsyre* * Komplekserne af kviksølv med EDTA og/eller citronsyre oxiderer interferenten (ascorbinsyre) for langsomt til at være effektive ved kemisk forekommende bestemmelser med tørre reagenser, 30 Skønt dybtgående undersøgelse af årsagen til, at visse ligander ikke synes effektive til bekæmpelse af interferens, ikke er blevet fuldført i forsøgene, fører en nøje iagttagelse af opførslen af hver af de i eksemplerne angivne ligander på overbevisende måde til de konklusioner, der er 35 angivet i tabel II under "årsager". Det er desuden sandsynligt, at forholdsvis ikke-flygtige ligander vil resultere i

DK 158995B

16 komplekser med bedre opbevaringsholdbarhed end komplekser på basis af de mere flygtige, tilsvarende ligander.

Det vil på dette sted være hensigtsmæssigt at give en nærmere beskrivelse af, hvorledes de her omhandlede, 5 ifølge opfindelsen anvendte komplekser kan fremstilles. Eksempelvis kan mercuri-sarcosinat, ligesom mange af komplekserne, fremstilles ved tilsætning af mercurioxid til en opløsning af liganden, her sarcosin, i vand. Tilsvarende kan mercuriserinat dannes ud fra en serin-opløsning. Disse 10 opløsninger kan derpå anvendes som additiver til standard-glucosesensitive reagenser, eller de kan anvendes til isolering af en renset fast form af komplekset ved fældning, f.eks. med isopropanol. Komplekser, der fremstilles ved andre metoder, falder naturligvis inden for opfindelsens 15 rammer, blot de tilfredsstiller de kriterier, der er beskrevet ovenfor.

Nogle få bemærkninger om reagenssystemer ifølge den kendte teknik anvendt til bestemmelse af nærværelsen af en forsøgsprøves bestanddele skulle yderligere lette forståelsen 20 af nærværende opfindelse. Disse reagenssystemer omfatter de ovenfor under den kendte teknik beskrevne indikator sy s terner, jfr. også den litteratur, hvortil der er henvist i det foregående.

Et sådant system, der har vist sig særlig resistent 25 mod ascorbat-interferens ved kombination med et af de her omhandlede komplekser, er et system indeholdende en sukker-oxidase, et peroxidativt aktivt stof og en oxidations-reduktionsindikator, der er i stand til at tilvejebringe en farveændring i forhold til H202 og den peroxidativt aktive sub-30 stans. Afhængigt af den bestemte sukkerart, der skal analyseres, vælges der et enzym, som vil påvirke dannelsen af H202 ved oxidation af sukkeranalyten. Til glucose-analyse foretrækkes der således glucoseoxidase. Hvis analyten skal være galactose, anvendes der tilsvarende galactoseoxidase som et 35 H202-producerende enzym.

Når der først er dannet H202, kræves der en peroxida-

DK 158995B

17 se-lignende katalysator til at oxidere den bestemte indikator, der er valgt. Typiske peroxidativt aktive stoffer omfatter peroxidase og hæmoglobin. Blandt de mange kendte oxida-tions-reduktions-indikatorer, der giver en farveændring i 5 nærværelse af H202 og et peroxidativt aktivt stof, kan nævnes benzidin og dets mange chromogene derivater. Disse omfatter o-tolidin, 2,7-diaminofluoren, 3,3 ', 5,5'-tetra(lavere alkyl) -benzidin og de N-, Ν'- og N,N'-(lavere alkyl)-substituerede benzidiner. Ved "lavere alkyl" skal der forstås substuerede 10 og usubstituerede carbonhydridgrupper med fra 1 til ca. 6 carbonatomer, herunder methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, cyclopropyl, n-butyl, isobutyl, tert.butyl, cyclobutyl, n-pentyl, sek.pentyl, tert.pentyl, neopentyl, cyclopentyl, n-hexyl, cyclohexyl og alle andre isomere deraf.

15 Det vil naturligvis forstås, at der kan tænkes mange sukker-sensitive reagenssystemer, der er udsat for interferens fra ascorbat og lignende reducerende midler. Det menes, at man også ved disse systemer vil kunne drage nytte af nærværende opfindelse, og at inkorporering af de her om-20 handlede komplekser i sådanne reagenssystemer i høj grad vil bidrage til at løse problemet. Sådanne systemer falder også inden for opfindelsens rammer.

Et andet reagenssystem, der bliver resistent mod ascorbat-interferens ved kombination med det her omhandlede 25 kompleks, er systemet indeholdende et peroxidativt aktivt stof og en redoxindikator, der kan tilvejebringe en farveændring i nærværelse af H202 og den peroxidativt aktive forbindelse. Et sådant reagenssystem er kendt til detektering af peroxid-analyter, såsom cumenhydroperoxid og hydro-30 genperoxid.

På baggrund af de ovennævnte reagenssystemer er det rimeligt at forvente, at ethvert sådant system baseret på en redoxindikator med et oxidationspotentiale, der er signifikant højere end potentialet for ascorbinsyre, er udsat 35 for interferens med et reducerende middel med et oxidationspotential svarende til potentialet for ascorbinsyre. Opfind-

DK 158995B

18 elsen vedrører således alle sådanne reagenssystemer, der er sensitive over for reducerende midler.

Ved fremstillingen af teststrimlen ifølge opfindelsen, i hvilken blandingen er det ovenfor beskrevne glucose-respon-5 sive reagens, omfatter blandingen en glucose-responsiv reagensopløsning i vand (første opløsning) og en opløsning indeholdende kviksølvkomplekset (anden opløsning). Den glucose-responsive opløsning indeholder en indikator af benzidin-typen, f. eks. 3,3^5,51 -tetramethyl -benz idin, glucoseoxidase, 10 peroxidase og puffer. Et stykke filterpapir neddyppes i og mættes med den første opløsning og tørres. Derpå neddyppes det tørrede, imprægnerede filterpapir i den anden opløsning, mættes dermed og tørres.

X én udførelsesform for opfindelsen skæres et papir 15 indeholdende reagenserne fra den første og den anden opløsning i små kvadrater, af hvilke ét anbringes ved den ene ende af en strimmel polystyrenfilm. Adhæsion af papiret til polystyren kan gennemføres ved anvendelse af en dobbeltsidet klæbestrimmel såsom den, der markedsføres af 3M Co. under 20 betegnelsen Double-stick®. Den resulterende teststrimmel kan derpå anvendes til måling af glucose i urin, idet målingen praktisk taget ikke inhiberes ved tilstedeværelsen af op til 200 mg-% ascorbinsyre i forsøgsprøven.

Den bærermatrix, der anvendes i den her omhandlede 25 teststrimmel, kan indeholde et vilkårligt stof, der kan inkorporeres sammen med materialet. Matrixen kan således antage mange kendte former, f.eks. de, der anvendes til reagensstrimler til opløsningsanalyser. Eksempelvis beskrives i US patentskrift nr. 3.846.247 anvendelsen af filt, porøse 30 keramiske strimler og vævede eller matterede glasfibre. Som erstatninger for papir omtales der i US patentskrift nr. 3.552.928 anvendelsen af træpinde, klæde (stof), svampemateriale og leragtige eller -holdige stoffer. Anvendelsen af syntetiske harpiksfiberflor og glasfiberfilt i stedet for 35 papir er blevet foreslået i britisk patentskrift nr. 1.369.139. I et andet britisk patentskrift, nr. 1.349.623,

DK 158995 B

19 foreslåes anvendelsen af et lyspermeabelt netværk af tynde filamenter som dæklag for en underliggende papirmatrix. I dette patentskrift foreslås også en imprægnering af papiret med en del af et reagenssystem og imprægnering af netværket 5 med andre, potentielt inkompatible reagenser. I fransk patentskrift 2.170.397 beskrives anvendelsen af bærermatrixer med mere end 50% polyamidfibre deri. Et andet forslag til bærermatrixer er beskrevet i US patentskrift nr. 4.046.513, hvor der anvendes trykkemateriale-reagenser på en egnet bæ-10 rermatrix. I US patentskrift nr. 4.046.514 beskrives sammenvævning eller -tilknytning af filamenter, der bærer reagenser, i et reaktantsystem. Fortrinsvis indeholder bærermatrixen et sugende materiale såsom filtrerpapir. Alle sådanne bærermatrixtyper kan anvendes i forbindelse med nærværende 15 opfindelse, men også andre kan anvendes.

Den basisunderstøtning, på hvilken den imprægnerede bærermatrix kan anbringes eller monteres, kan varieres på mange måder med hensyn til form, størrelse og konstruktionsmateriale. Understøtningen kan således være konstrueret af 20 ethvert i det væsentlige væskeuigennemtrængeligt materiale, f.eks. polystyren, polyolefin, glas, papir eller metal. Almindeligvis foretrækkes det dog, at basisunderstøtningen er af et polymert materiale, f.eks. biaksialt orienteret polystyren, der sælges af Plastic Suppliers, Inc. Til de 25 fleste formål har det vist sig at være at foretrække, at understøtningen er forholdsvis stiv og strækker sig tilstrækkeligt langt fra bærermatrix-positionen til, at brugeren får adgang til et bekvemt håndgreb.

Eksempler 30 De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen og repræsenterer i øjeblikket foretrukne udførelsesformer.

A. Fremstilling af forskellige komplekser

Der er ved forsøg blevet fundet to metoder til tilve-35 jebringelse af kviksølvkomplekser, der giver den uventede kombination af stabilitet og effektivitet ved eliminering

DK 158995 B

20 \ ---------- reducerende midler, der interfererer med sukker-sensitive reagenssystemer. Disse metoder er mercurioxid-metoden og det opløselige salts metode.

Den førstnævnte metode indebærer anvendelsen af HgO 5 som et udgangsmateriale, hvori liganden og HgO er kombineret i destilleret vand til dannelse af en opløsning af komplekset. Den sidstnævnte metode og den teknik, der synes at hvae den bredeste anvendelse, omfatter anvendelsen af sådanne vandopløselige mercurisalte som mercuriacetat og -nitrat.

10 Begge de omtalte metoder er illustreret i de i det følgende beskrevne forsøg.

Eksempel 1

Mercurisarcosinat; oxidmetoden

Komplekser af Hg++ og aminosyrer kan let dannes ved 15 tilsætning af pulverformet HgO og aminosyre, enten sekventi- . elt eller samtidigt, til vand, hvorved der dannes en opløsning af komplekset. Opløsningen kan derpå anvendes direkte til opfindelsens formål, eller komplekset kan isoleres og opbevares til senere brug. Analysen beregnet for Hg(CH3NHCH2-20 C00")2 er C=19,15%, H=3,21%, N=7,44%, Hg=53,24% og 0=16,99%.

De fundne værdier er C=18,94%, H=3,93%, N=7,26%, Hg=53,04% og 0=17,33%.

Når HgO omrøres med vandig sarcosin i et molært forhold på 1:2, opløses kun 2/3 af HgO. Anvendelsen af et tre 25 ganges molært overskud af sarcosin bevirker fuldstændig opløsning. Dette fænomen er endnu ikke blevet forklaret tilfredsstillende, eftersom begge støkiometrier resulterer i det samme kompleks, dvs. Hg(sarcosin)2f hvilket fremgår af elementæranalyser.

30 Ved et forsøg under anvendelse af denne metode sættes der prøver af HgO og sarcosin med en vægt på henholdsvis 1,83 g (8,45 x 10-3 mol) og 3,014 g (38,2 x 10“3 mol) til 10 ml destilleret vand under omrøring. Der dannes en orange, opak suspension, der bliver klar efter ca. 10-20 minutter ved 35 stuetemperatur. Komplekset isoleres fra denne opløsning ved fældning under anvendelse af isopropanol.

DK 158995B

21

Eksempel 2

Mercurisarcosinat: saltmetoden

Ved saltmetoden til fremstilling af kviksølvkomplekser opløses et mercurisalt, såsom acetatet eller nitratet, i et 5 egnet opløsningsmiddel sammen med en bestemt ligand. Medens aminosyrekomplekser kan fremstilles ved oxidmetoden såvel som ved saltmetoden, er det den sidstnævnte, der finder anvendelse i forbindelse med en bred mangfoldighed af ligander, af hvilke mange ikke danner komplekser, eller kun danner . 10 dem med en meget ringe hastighed, når der anvendes HgO.

En prøve af mercuriacetat med en vægt på 31,0 g (0,143 mol) opløses i 400 ml ehanol, og 17,54 g sarcosin opløses i 60,0 ml destilleret vand. Den vandige sarcosin sættes til den metanoliske opløsning, der sammenblandes, og blandingen 15 henstilles ved stuetemperatur i 1 time, hvorefter der sker en krystallisation af mercurisarcosinat. Efter 2 timer filtreres reaktionsblandingen. Krystallerne isoleres og tørres, hvorved der fås 26,3 g produkt (80% af det teoretiske udbytte) . Ved afkøling natten over af filtratet fås der yderligere 20 3 g produkt.

Eksempel 3

Mercuriserinat: oxidmetoden.

Der fremstilles mercuriserinat under anvendelse af den i eksempel 1 beskrevne metode. Der kombineres således 25 1,83 g HgO og 1,78 g serin i 10 ml destilleret vand under omrøring, som i det foregående forsøg fås der til slut en klar opløsning af mercuriserinat.

Eksempel 4

Mercuribicenat.

30 Ved omsætning af HgO med bicen, bis-hydroxyethylgly- cin, (HOCH2CH2)2NCH2COOH, som i eksempel 1 i et molært forhold på 1:2 dannes der en klar, stabil opløsning. Der gøres intet forsøg på isolering af komplekset.

Eksempel 5 35 Mercuriprolinat

Ved omsætning af HgO med prolin i vandig opløsning

DK 158995B

22 som beskrevet i eksempel 1 og i et molært forhold på 1:3 dannes der en klar, stabil opløsning af Hg-prolin-komplekset.

Eksempel 6

Mercurithreonat 5 HgO omsættes med vandig threonin som i eksempel 1 i et molært forhold på 1:2, hvorved der dannes en klar, stabil opløsning af Hg-threonin-kompleksproduktet.

Eksempel 7

Mercuriuridinat 10 HgO sættes til en vandig opløsning af uridin som beskrevet i eksempel 1 og i et molært forhold på 1:2. Der fås herved en klar, stabil opløsning af produktet Hg-uridin-kompleks.

Eksempel 8 15 Mercuritriphenvlphosphinat

En portion triphenylphosphin på 3 g opløses i 50% dimethyl formamid og omsættes med 1,30 g HgCl2, indtil der dannes en hvid fældning. Dette kompleks af mercuriion og triphenylphosphin opsamles ved filtrering og tørres. Komplek-20 set opløses i destilleret vand under dannelse af en klar, stabil opløsning.

Eksempel 9

Mercuridiethanolaminat

En portion mercuriacetat med en vægt på 2,6 g (8,4 x 25 10“3 mol) opløses i 10 ml destilleret vand. Til opløsningen sættes der 1,92 g (0,016 mol) diethanolamin. En klar stabil opløsning af komplekset fås næsten umiddelbart efter tilsætning af liganden.

Komplekset isoleres ved inddampning af reaktionsblan- 30 dingen.

Eksempel 10

Mercuritriethanolaminat

Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 9 kombineres vandigt mercuriacetat med triethanolamin i et 35 støkiometrisk forhold på 1:2. Der fås en klar, stabil opløsning af produktet Hg-triethanolamin-kompleks.

DK 158995B

23

Eksempel 11

Mercurilaurovlsarcosinat

Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 9 kombineres vandigt mercuriacetat og natriumlauroylsarcosinat 5 i et molært forhold på 1:2 til dannelse af en klar, stabil opløsning. Kompleksproduktet isoleres ved inddampning efterfulgt af flere acetonevaskninger til fjernelse af natriumacetat, der er til stede i indampningsremanensen.

Eksempel 12-36 , 10 Under anvendelse af de i eksemplerne 1 eller 2 be skrevne metoder fremstilles der komplekser af et stort antal ligander, hvilke komplekser af de i tabel III angivne årsager ikke tilfredsstiller de i nærværende sammenhæng stillede fordringer.

15

DK 158995 B

24 ti 1) fl g g g ns te ns m P -P -P 0) m ω w t) _ _ _ G G G 51 S' ^

(D <D O) G G G

xjxixltin tn

G GGGGGGGGtnG

•ri Ό Ό -ri ti ·Η ·Η -H ti ·Η ti ti ·Η G -H

(D(D(DGGGGGHGHHG-rjG > > >ti (tiTtititi fUti SB fflti Gti - γΗ+3ΗΗΗΉγΗ1Η1ΗΗγ0Η

01 10 æ IH di e SI 18 fB 8 H IB

(D φ O) ιρ G 4-) 4-) 4-1 0)4-) 0) 0)4-) fB 4-J

£ S g 0) tn tr> to 4-1

GGGti3i!rd'd'GG43GG4-> G

(ti (ti (ti -Η ·Η ·Η -H (ti -H (ti (ti G o(ti G

'G'drd>O>P>!>P>PPOPS-l . ΛΟ)ΛΛΛΟΛΟΟθΐΟ\Α G tx> Cr> tr» > 0) IXJKM4-) 4-1 4-1 4-1 4-1 4-4 4-1 4-1 4-1 4-1 4-1 jjl ΠΪ oftj iti (ti (ti (ti (ti (ti (ti (ti (ti (ti

G ^4 G

•H (0(0(00)^0)0)0)0)0)0)(1)0)0)0) G -P -H -P (O (0(0(0(0(0(0(0 (0(0(0

,¾ Hrprpi—IprPHHHr-1HHHHH

p i—lr-)HO)0)0)0)Q)0)0)0)0)0)0)0)

SB (ti(ti(OG>GGGGGGGGGG

g +)4J+>G-HGGGGGGGGGG

φ <Da)a)(tiH(ti(ti(ti(ti(ti(ti(ti(ti(C(ti

ffl gggPÆPPPPPPPPPP

G

(ti

A

μ Q) 0) O) g m h! n

I 0) >i pH

o μ (o to G >i H Q)

•P 0) (0 >i Q

g ρ μ κ o) s

(3 pH "©- O P G

H (O g Λ >i ^ . Ph 4 (O 4 » Λ

Η A "S- O (ti 0) O

H +) g ® O ,* G

Η 0) (O ·γ4 ‘ri *p O

g 1 O ti ti S

H R 0) G G I Ti ti

(D X P 1- -rt G 0) H

o O >i O g ·Ρ -P- PH

(ti p (0 G G ti Τ5 P rG

E-i 03 G Ή ·Ρ rp ·Ρ· -P -P

• >i-H tn g >i P O ^ 0) 03 G G Λ S (Cti,G>iHGGGGg

G ·Η ·Η I (ti P I· -P P-c ·Ρ ·Ρ ·Η ·Η· -Ρ -H

(ti G O (0 -P tiaOi-PGG-POQ

tn (ti Ph -H G C4 1- g VD -P (D ti (0 G I-

•Η ι-H rp p H (0 p 1 ' Ή1 ti ί Pi 0) C

P COEhO CQaMSCOUPf^ •

P

G

r-) 0)

Gi n n >j in iDhoooiOriNM'iin

g Η Η Η H HrHHHCMCMCMCMCMCM

0) (0 ^4

H

DK 158995 B

25 tn

Ti β β β ·Η (ti β Μ β

+1 +J (D tJ

W W tJ Η β β $ ^ tr ίΐ ίί 5 ^ 21 . _ _ β β β tn β tn tn Η -Η Ό iJ Ή Ό Μ ·Η β -Η β β β φ φ β β ® <3 ‘d £ Τί 'ΰ'ΰ>>ιΐΐιιΐ^Μ,ϋβββ HH H4->CQHH'd ti

(8f8tocnf8cD-HQ)(8HtnH IHM-I tDCDU-l βπΗβΜ-lfBO FB β β Φ Η β U-t *H

'ΰτίββ'β,βββ'β β^ Η -Η β (ti ·Η +> Ό -Η 0(0 β °β >>tit3>ti(Utn>MM^ . .β ,β βΦβββίηΛίη Μ C5 Ο > α) α) u-ι ιμ μ κ Μ-ι it-iHmmmm tn β β βοβββ^ββββ f-4 ^ ^ ^ •Η φφΜΜΦίηΦΟΦβΦΦ β ωω-Η-πω μ β ω ω ω ω

ν· ι—1 ι—1 ι—I ι—I ι—I Μ '—I 1 ! 1 I 1 ^ 1 I

β (I) <1ί ι—I ι—I (DCUOt! CDCDO^QJ

g ββ(ΰ(ΰβ>βφββββ g ββ+ι+ΐβ·μβ&'ββββ S ββφφβΗββββββ

W QQSSQAQHpQQQ

^ S

Μ Γ -μ φ >ι μ β ο >ι $ *μ ω ^ β -ri Η Ο 2 η *μ 'ΰ Η Η ω β ·Η Η to Ο) β ti Φ β μ ·μ ο η β >ί Ο β β β β β W >ι ·Η β φ -Η Β JJ β Η ti • (1Ϊ ·Η ϊη ·Η β ι—I *£3 -Η β Ή ti g g Η .μ -Η ο +> Η ·Η β β Οβί^ω^ β β >, β -μ β β β (μ Ο ·Η ·Η ft β ί τΙ -Η ·Η tn ti η >1 κ -μ μ ·η -μ tn β ω •η ε β η ι. >j ο β φ μ μ :* ρ <! ω ο ρ u S ^ s < ο hi • μ β Η Φ a ^ 05 οι ο η (Μ η <f κι (ο (¾ (\ι ν μ cm π mcommo'im

S

Φ ω β Μ

DK 158995 B

26 B. Fremstilling af teststrimler I de følgende forsøg fremstilles der forskellige ““ komplekser på samme måde som i eksemplerne 1-11, og der kombineres med reagenser, som er glucose-sensitive, til 5 bestemmelse af virkningen af komplekset med hensyn til nedsættelse af interferensen fra ascorbinsyre. De specifikt anvendte ligander er sarcosin, serin, alanin, prolin, bicen og uridin.

Eksempel 37 10 Mercurisarcosinat

Der fremstilles et antal teststrimler under anvendelse af glucose-sensitive reagenser og mercurisarcosinat. Hver strimmel fremstilles i form af en aflang polystyrenstrimmel, på hvis ene ende der er monteret et kvadratisk filterpapir 15 imprægneret med blandingen. Papiret holdes på plads ved anvendelse af en dobbeltsidet klæbestrimmel.

Ved fremstillingen af disse teststrimler neddyppes en 5 mm bred strimmel af Eaton and Dikeman 204-filtrerpapir i en første neddypningsopløsning, som indeholder glucose-20 oxidase, peroxidase, 3,31,5,5'-tetramethylbenzidin og en puffer i vand. Det imprægnerede papir tørres derpå i en luftovn ved ca. 50°C i ca. 30 minutter. Efter tørringen nedsænkes papiret i en anden neddypningsopløsning indeholdende mercurisarcosinat-kompleks. Efter en yderligere tørring 25 anbringes den imprægnerede strimmel langs en kant af en film af biaksialt orienteret polystyren under anvendelse af et dobbeltsidet adhæsiv, der er kendt som Double Stick og markedsføres af 3M Company. Filterpapir-film-materialet skæres i strimler vinkelret på den kant, der bærer det im-30 prægnerede papir. Strimlerne måler ca. 4 x ca. 5 mm, og papirdelen ved enderne måler i hvert enkelt tilfælde ca. 5 mm x ca. 5 mm i kvadrat.

Den første neddypningsopløsning indeholder de i det følgende angivne bestanddele. Disse blandes i den angivne 35 rækkefølge:

DK 158995 B

27 3,3 1,5,5' -Tetramethylbenzidin 0,05 g

Acetone 6,0 ml

Citratpuffer (pH=5)* 1,88 ml

Tris-glutamatpuffer ** 2,82 ml 5 Steol® CA 460, 10 vægt-% i vand (ammonieret fedtether) (Stepan Chemical Co.) 0,5 ml

Plasdone® K-29-32 polyvinylpyrrolidon (GAF Corp.) 6,0 ml

Gantrez® AN-139, 10 vægt-% i vand 10 (polymethylvinylether/maleinsyreanhydrid) 1,5 ml

Ascorbinsyre, 10 vægt-% i vand 0,05 ml

Glucoseoxidase, 5000 I.U./ml (Miles Laboratories, Inc.) 1,5 ml

Peberrodsperoxidase, 68 I.U./mg 15 (Miles Laboratories, Inc.) 0,05 g * Citratpufferopløsningen, der fremstiles separat, indeholdt 15,4 g citronsyre og 68,0 g trinatriumcitrat i 208 ml destilleret vand.

20 ** Tris-glutamatpufferopløsningen indeholdt 45 g glutaminsyre og 37,5 g tris-hydroxymethylaminomethan i 208 ml destilleret vand.

Den anden neddypningsopløsning fremstilles ved først at fremstille to forblandinger og dernæst kombinere dem.

25 Forblanding A fås ved blanding af de følgende bestanddele i den rækkefølge, hvori de er angivet:

Polyvinylpyrrolidon (K-60 fra GAF Corporation). 20,0 g

Natriumdodecylbenzensulfonat 0,8 g 30 Ninol® 2012 (cocoyldiethanolamid fra

Stepan Chemical Co.) 1/5 g

Destilleret vand 124,0 ml

Forblanding B indeholder komplekset mercurisarcosinat 35 og fremstilles ved blanding af de følgende bestanddele i den angivne rækkefølge:

DK 158995 B

28

Destilleret vand 20,0 ml

Mercurioxid 3,66 g

Sarcosin 6,03 g 5 Forblanding A sættes til forblanding B, når al sarco sin og HgO er gået i opløsning.

Eksempel 38-41

Teststrimler med anvendelse af andre komplekser Forsøget fra eksempel 37 gentages med mercurikomplek-10 ser af serin, prolin, bicen og uridin, idet man følger den allerede beskrevne fremgangsmåde.

Forblanding A fremstilles ud fra:

Polyvinylpyrrolidon K-60 10,0 g 15 Natriumdodocylbenzensulfonat 0,4 g

Ninol® 2012 0,75 g

Destilleret vand 62,0 ml Særskilte forblanding B-præparater fremstilles for 20 hvert kompleks ud fra 1,83 g HgO i 10,00 ml destilleret vand med de følgende mængder ligander:

Eksempel 38 Serin 1,79 g " 39 Prolin 2,94 g 25 " 40 Bicen 2,77 g " 41 Uridin 4,15 g C. Effektivitet af forskellige teststrimler efter varmepåvirkning_ 30 Teststrimlerne fremstillet ifølge eksemplerne 37-41 udsættes for varmepåvirkning til bedømmelse af stabiliteten.

Hvert af komplekserne bedømmes således ved opbevaring ved stuetemperatur i ca. 7 dage og efter 3 dage i en luftovn med en temperatur på 60°C. Efter påvirkningen undersøges 35 hvert sæt teststrimler til bestemmelse af (a) evnen til at differentiere mellem de forskellige glucose-

DK 158995 B

29 niveauer i en prøve, og (b) hvorvidt glucoseanalysen udsættes for interferens af ascorbinsyre. For hvert sæt strimler bærende et forskelligt mercurikompleks dyppes prøver i forsøgsopløsninger af urin-5 prøver indeholdende glucose. Forsøgsopløsningerne indeholder 0, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500, 700 og 1000 mg glucose pr. deciliter opløsning (mg-%). En bestemt klasse materialers evne til bestemmelse af disse forskellige glucoseniveauer bedømmes under anvendelse af teststrimler ældet ved stuetem-10 peratur. Når farveudviklingen forøges med glucosekoncentra-tionen, betragtes en strimmel som i stand til at differenti-ere mellem koncentrationsniveauerne. Når der ikke iagttages nogen signifikant forøgelse af farveintensitet mellem gluco-seniveauerne, betragtes differentieringen som den samme.

15 Til bedømmelse af teststrimlernes modstandsdygtighed mod interferens fra ascorbinsyre afprøves de med to sæt glucoseopløsninger, et sæt med 50 mg-% og et andet sæt med 100 mg-%. Hvert sæt omfatter tre opløsninger, der ud over glucose indeholder 0, 100 og 200 mg-% ascorbinsyre. For 20 hvert sæt strimler bærende et forskelligt mercurikompleks dyppes prøver i begge sæt af glucoseopløsninger. Når farver svarende til nærværelsen af glucose er identiske til trods for ascorbatkoncentrationen kort tid efter neddypningen, bedømmes interferens-problemet som løst gennem tilstedeværel-25 sen af mercurikomplekset.

Eksempel 42

Mercurisarcosinat

De teststrimler, der fremstilles ifølge eksempel 37, afprøves efter ældning ved stuetemperatur i ca. 7 dage ved 30 hjælp af de forskellige, ovenfor omtalte glucoseopløsninger til bestemmelse af evnen til at differentiere mellem glucoseniveauer. Resultaterne er, ordnet efter stigende farveintensitet, 0<10<20<30<40<50<100<250 = 500 = 1000 mg-%. Strimler påvirket ved 60°C er i det væsentlige lige så reaktive.

35 De ved stuetemperatur ældede strimler afprøves derpå i de to sæt opløsninger, der indeholder 50, henholdsvis 100

DK 158995 B

30 mg-% glucose. Hvert sæt indeholder tre opløsninger med varierende ascorbinsyrekoncentrationer: 0, 100 og 200 mg-%. I — de tre opløsninger indeholdende 50 mg-% glucose er den i strimlerne udviklede farve praktisk taget den samme efter 5 15 sekunder. I 100 mg-%-glucoseopløsningerne er farverne næsten identiske efter 10 sekunder.

I det væsentlige de samme resultater fås med strimmelmaterialer ældet ved 60°C i tre dage.

Eksempel 43 10 Mercuriserinat

Teststrimler som fremstillet ifølge eksempel 38 påvirkes og afprøves som beskrevet i eksempel 42. Strimler, der ældes ved stuetemperatur, giver følgende evne til differentiering mellem glucoseniveauer: 15 0<10<20<30<40<50<100<250 = 500 = 1000 mg-% Påvirkde strimler (60“C i tre dage) har ingen iagttagelig formindskelse af respons.

Ved iagttagelse med ascorbinsyre-glucose-opløsningeme fra eksempel 42 kræver strimler dyppet i de 50 mg-%'s gluco-20 seopløsninger 5 sekunder til farveudvikling til afstemning, medens strimler dyppet i de 100 mg-%'s opløsninger kræver 10 sekunder.

Eksempel 44

Mercuriorolinat 25 Teststrimler fremstillet som beskrevet i eksempel 39 påvirkes og afprøves som beskrevet i eksempel 42. De strimler, der ældes ved stuetemperatur, giver følgende evne til differentiering mellem glucoseniveauer: 0<10<20<30<40<50<100<250 = 500 = 1000 mg-% 30 Strimler, der påvirkes ved 60°C i tre dage, har ingen iagttagelig formindskelse i aktivitetsrespons.

Ascorbat-resistensforsøget med ved stuetemperatur påvirkende strimler viser, at de tre 50 mg-%'s glucoseopløs-ninger kræver 15 sekunder til at frembringe i det væsentlige 35 afstemt farveudseende hos teststrimlerne, medens 100 mg-%'s glucoseopløsningerne giver afstemte farver efter 10 sekunder.

DK 158995 B

31

Det samme forsøg med strimler ældet ved 60“C i tre dage giver de samme resultater.

Eksempel 45

Mercuribicenat 5 Strimlerne fra eksempel 40 påvirkes og afprøves som beskrevet i eksempel 42. De ved stuetemperatur ældede strimler giver følgende evner til differentiering mellem glucose-niveauer: 0<10<20<30<40<50<100<250 = 500 = 1000 mg-% 10 De strimler, der ældes ved 60“C i tre dage, mister ingen iagttagelig differentieringsevne.

Ved ascorbat-resistens-forsøget kræver ved stuetemperatur påvirkede strimler i 50 mg-%'s glucoseopløsningerne 10 sekunder til tilvejebringelse af praktisk taget afstemt 15 farveudseende. Ligeledes giver de i 100 mg-%'s glucoseopløsningerne afstemte farver efter 10 sekunder. Det samme forsøg med strimler ældet ved 60°C i tre dage giver de samme resultater.

Eksempel 46 20 Mercuriuridinat

Strimlerne fra eksempel 41 påvirkes og afprøves som beskrevet i eksempel 42. De strimler, der er ældet ved stuetemperatur, giver følgende evner til differentiering mellem glucoseniveauer: 25 0<10<20<30<40<50<100<250 = 500 = 700 = 1000 mg-%

De strimler, der er ældet ved 60“C i tre dage, giver ikke farverespons ved 10 mg-%-niveauet, men differentierer let mellem højere niveauer ligesom de strimler, der er ældet ved stuetemperatur.

30 Ved ascorbat-resistens-forsøget kræver ved stuetempe ratur påvirkede strimler i 50 mg-%'s glucoseoplsningerne 35 sekunder til frembringelse af et i det væsentlige afstemt farveudseende, medens der i 100 mg-%'s glucoseopløsningerne fås afstemte farver efter 60 sekunder. Ved det samme forsøg 35 under anvendelse af strimler ældet ved 60°C i tre dage fås der lignende resultater.

DK 158995B

32 D. Mercuriforbindelser fra den kendte teknik

Der udføres forsøg til bedømmelse af virkningen af ~ mercuriforbindelser fra den kendte teknik, idet der herved fås et grundlag for sammenligning med de resultater, der 5 opnås ifølge opfindelsen. US patentskrift nr. 3.411.887 (Ku) menes at være den opfindelsen nærmest kommende kendte teknik. Patentskriftet (Ku-patentet) beskriver tre mercuriforbindelser til anvendelse som "opfangningsmidler", nemlig acetatet, nitratet og chloridet, jfr. spalte 4, linie 9 og 10 10. Disse forbindelser inkorporeres i testmaterialer som beskrevet i Eksempel I i Ku-patentet, jfr. dettes spalte 6.

Eksempel 47

Mercuriacetat (Ku-patent)

Ved fremstilling af dette testmateriale tilvejebringes 15 der to blandinger. Den første indeholder de aktive bestanddele til reagenssystemet til detektering af glucose, og den anden indeholder bestanddelene til ascorbat-opfangningssyste-met. Detekteringssystemet indeholder følgende bestanddele: Ortho-tolidin-dihydrochlorid 250 mg 20 Glucoseoxidase 1,9 mg

Peroxidase 40 mg

Gelatine 1,2 mg F.D & C, Soluble Red No. 3 60 mg

Puffer indeholdende en blanding af 55,5 g 25 vandfrit citronsyre og 244,5 g trinatriumcitrat formalet sammen og opløst i 750 ml vand 30 ml

Der overholdes følgende rækkefølge ved fremstillingen af detekteringssystemet. Peroxidasen opløses i 5 ml vand og kombineres med en 5 ml vandig suspension af glucoseoxidase.

30 Gelatinen og F.D & C-farvestoffet opløses i 25 ml kogende vand og afkøles til stuetemperatur. Ortho-tolidin-dihydro-chloridet suspenderes derpå i 12,6 ml 2 B alkohol og kombineres med pufferopløsningen. Alle de ovennævnte blandinger og opløsninger kombineres i én beholder og blandes grundigt.

35 Papirstrimler på 5 cm x 6 mm dyppes i den således fremstillede opløsning og lufttørres ved 100°C i 9 minutter.

33

DK 158995 B

Opfangningssystemet indeholder følgende bestanddele: Vinylpyrrolidon-vinylacetat-copolymer (PW/VAE 535 - 50g% i ethanol fra GAF Corp.) 6,5 ml

Nonoxyl-9-phosphat (10g% i 2B alkohol -Gafac® 5 RE 610 fra GAF Corp.) 0,7 ml

Dioctylnatriumsulfosuccinat (25g% i 2B alkohol - Aerosol® OT fra American Cyanamid Co., Industrial Chemicals & Plastics Div.) 0,4 g

Mercuriacetat 8,0 g 10 Natriumacetat 2,0 g

Dimethylsulfoxid 91,5 ml

Mercuriacetat-opfangningsmidlet opløses i dimethylsulfoxid og kombineres med en opløsning indeholdende fortykkelsesmidlet, fugtemidlet og puf fer stof fet. Disse bestanddele 15 blandes derefter grundigt, indtil der fås en homogen opløsning. Cirka halvdelen af de imprægnerede strimler overtrækkes derpå med den homogene blanding indeholdende opfangningssystemet ved dypning af strimlerne i blandingen. Strimlerne lufttørres dernæst ved en temperatur på 80° C i et tidsrum på 20 ca. 9 minutter.

Disse materialer afprøves derefter i opsamlet urin indeholdende koncentrationer af glucose strækkende sig fra 0 til 1000 mg-% glucose og findes at give respons over hele koncentrationsområdet. Farvedifferentiering er mulig fra 10 25 til 250 mg-% glucose.

En gruppe friskfremstillede strimler stilles derpå til side på et laboratoriebord i en tæt tillukket kolbe indeholdende silicagel og molekylsigter. Efter 1 uges (7 dages) opbevaring på denne måde afprøves materialerne igen 30 i friskfremstillede opløsninger af glucose i opsamlet urin. Materialerne giver intet farverespons på glucose, selv ved en koncentration på 1000 mg-%. Materialerne har altså ikke overlevet opbevaring ved stuetemperatur og lav fugtighed i 1 uge.

35

DK 158995 B

34

Eksempel 48

Mercuriacetat (alternativ præparat)

Eftersom blandinger eller teststrimler ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles uden det dimethylsulf-5 oxid, der anvendes ifølge Ku-patentet, udføres der et forsøg som i eksempel 47 ovenfor, men med den undtagelse, at der anvendes 91,5 ml vand i stedet for den samme mængde dimethyl-sulfoxid. Det bemærkes, at medens strimlerne tørres, begynder HgO at fælde ud fra mercuriacetat-opfangningssystem-opløs-10 ningen (ca. 15 minutter).

Disse strimler afprøves dernæst som i eksempel 47, og de giver lignende resultater såvel før som efter opbevaring.

Eksempel 49 οσ 50 15 Mercurichlorid oa mercurinitrat

Der udføres forsøg som beskrevet i de ovenstående eksempler 47 og 48, men med den undtagelse, at der fremstilles separate sæt af strimler ud fra henholdsvis mercurichlorid og mercurinitrat. De mængder af disse forbindelser, der 20 anvendes til fremstillingen af opfangningssystemerne (og som erstatter de 8 g mercuriacetat), er 6,8 g HgCl2 og 13,4 g Hg(N03)2.

De ud fra HgCl2 friskfremstillede strimler er i stand til at differentiere mellem glucosekoncentrationer fra 50 25 til 500 mg-%. Efter ældning i 1 uge ved stuetemperatur og lav fugtighed giver de intet respons, selv ved tilstedeværelse af 1000 mg-% glucose. De strimler, der fremstilles ud fra Hg(N03)2, giver intet respons, uanset om der er tale om friskfremstillede strimler eller strimler, der har været 30 opbevaret.

E. Fremstilling og effektivitet af en blanding, der er i stand til at detektere hydrogenoeroxid._

Eksempel 51-56

Der udføres en række forsøg til bestemmelse af effek-35 tiviteten af opfindelsen med hensyn til at gøre et peroxid-sensitivt reagenssystem frit for ascorbat-interferens. Der

DK 158995 B

35 fremstilles en reagensopløsning, der er i stand til at danne en blå farve i nærværelse af hydrogenperoxid, og denne opløsning indeholder en puf ret opløsning af peroxidase og o-toli-din i ethanol. Dens evne til detektering af H2C>2 i nærværelse 5 af ascorbinsyre og forskellige mercurikomplekser undersøges.

De følgende bestanddele anvendes til fremstilling af forskellige mercurikomplekser i vand, idet der som angivet anvendes HgO eller mercuriacetat.

36 DK 158995 B

o σι Γ" ^ vo cm ' σ vo *· ** Η CM 00 o — on (Μ on oo cm σ ΚΩ *· ** Η H on on i—I o CM OO <Ti ΚΩ *· * o

H i—I H

O

σι * H co oo o CO v 'd’ I—1 CM -

CM1 O

on on *· o co vo o

vo »· ** H

H HO

r* * λ σι ο σ g vo *· Η m3*· cm P cm o w rn 'S' o

oo oo t" H

m 0 * * H on o - β σ> m o r-~ g co m h m g

cm H

o oo - vo σι γ*» ο

m co * H

*· H

CM

m m o m oo h - m * o

Η H

on on o co σι * m *· o

H CM H

o m Γ"· *· on oo vo o

m ·* ** H

H CM

on on o cm oo o *> m *· *· o

H on H

H on vo I -P o m co cm -H 3 » * * Ό β o

H CM Ο ·Η H

β W

I H 0

3 SO

P HP

•P 1-^3¾ β 0 —> ω β β Η -Ρ Ο ο Η 3 -Ρ -Hg β Ό(β>ι> • 3 g 0 Ο 0) ·Η Η — Ο

Ρ Τί-Ρ 3 Η Ρ Ρ g gP-P

β Η Η Ο Η Ο >ι >ι 3 Ο 30)30)0 0^0 ο β ω ω -η ρ -Ρ ρ ο ρ ρ ΗΤ3 Ο 3 β β β 3 β β Ό >ϊ Ο >ι Η >ι Ο Ο Ό -Η Η ·Η ·Η 3 ,β -Η -Η β W Ο 0) g 03 Η

& β ΡΡΟβ β jS-PggOOfirfJOPfiH

g 3 ΡβΟΟβ-Ηβ-ΡΟΟΟΗ^ΗΙ^-ΗΟΗ Ο -Ρ Ο Ο Ο ΟΗΗ Ο Ο O-Pm >ι ·Η Ο CM ·Η Ρ Ρ ·Ρ ω ω ρρρρΡ0ϋ·ΗββΗχ;^>ι'-''3·Ρ-ΡΜ Μ Ο 0)03ΛΟΡ·ΗΡΟΗ3·ΡΓΟΗΙ'03·ΗΟ

Η CQ SSWEHWPipqEHgOWIxlOOSOSUQ

DK 158995 B

37

Det viser sig, at blandingerne i eksempel 51-54 og 56 og klare opløsninger, medens 55 er klar med suspenderede krystaller, 57 har en grå, fast fældning, 58-62 har enten en hvid eller orange fældning til stede, 63 resulterer i en 5 turbid suspension, og 64 danner en gel.

En forrådsopløsning af reagenser, der er responsive over for peroxid, fremstilles ved blanding af de følgende reagenser i den angivne rækkefølge:

Citratpuffer (pH=3) loo ml . 10 Peberrods-peroxidase (70 I.U/mg) 100 mg ortho-Tolidin 100 mg

Ethanol (23A) 25 ml

Alliquoter på hver 1,5 ml af denne opløsning sættes til 16 fordybninger i en punktplade, hvor hver fordybning har en 15 kapacitet på 2,0 ml. Til 15 af fordybingerne indeholdende opløsning sættes der 3 μΐ (mikroliter) af en 10 g/dl opløsning af ascorbinsyre i vand. Fordybningerne mærkes 51-66, idet nr. 65 og 66 tjener til kontrolforsøg uden mercurikom-pleks og henholdsvis med og uden ascorbinsyre. Endelig sættes 20 der en portion på 1 μΐ af hver mercurikomplekserne til hver mærket fordybning (nr. 51-64).

Når de 16 fordybninger er præpareret på den angivne måde, podes hver af dem med 5 μΐ af en 10%'s opløsning af H202 i vand, idet der omrøres med en glasstav. Efter 5 sekun-25 ders omrøring iagttages hver fordybning med hensyn til fremkomsten af blå farve. Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

3q Eksempel nr. Ligand Resultater 51 Sarcosin Blå farve dannes 52 Threonin " 53 Serin " 54 Prolin " 35 55 Bicen " 56 Triethanolamin " 57 Monoethanolamin Ingen farve 38

DK 15 8 9 9 5 B

58 Glutaminsyre " 59 Sulfaminsyre " 60 Citronsyre 11 61 Ethylendiamintetraeddikesyre " 5 62 Glycin " 63 N-(2-acetamido)-iminodi- eddikesyre (ADA) Blå farve dannes 64 Natriumlauroylsarcosinat " 65 Kontrol (intet ascorbat) 11 10 66 Kontrol (ascorbat til stede) Ingen farve

Eksemplerne 51-66 viser, at de her omhandlede komplekser er forenelige med et reagenssystem til detektering af peroxid, og at de ved forsøgene inhiberer interferens frem-15 kaldt af ascorbinsyre.

Claims (6)

1. Blandinger til bestemmelse af nærværelsen af en forbindelse i en prøve, hvilken blanding omfatter et enzymatisk oxidationssystem, der frigører peroxid og tilvejebrin-5 ger en farve i nærværelse af forbindelsen ved omsætning med en chromogen indikator omfattende benzidin eller et af dets chromogene derivater eller blandinger deraf, hvorhos blandingen, da den er udsat for ugunstig indflydelse ved tilstedeværelse af ascorbinsyre i prøven, omfatter en tyngmetalforbind-. 10 else, der i ioniseret tilstand har et oxidationspotential under potentialet for indikatoren, men over potentialet for ascorbinsyre, kendetegnet ved, at tungmetalforbindelsen er et kompleks af en mercuriion og én eller flere ligander, hvor liganderne er covalent bundet til ionen 15 til dannelse af et vandopløseligt kompleks, hvilken ligand har et højere oxidationspotential end ionen i dens kompleks-bundne tilstand, og hvor komplekset har en stabilitetskonstant Ks større end 107, hvorhos komplekset i det væsentlige ikke virker forstyrrende på reaktionssystemet.

2. Blanding ifølge krav 1, kendetegnet ved, at liganden er sarcosin, threonin, serin, prolin, bicin, uridin, triethanolamin, diethanolamin, natriumlauroylsarco-sinat eller triphenylphosphin.

3. Blanding ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at komplekset er mercurisarcosinat.

4. Blanding ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at prøvebestanddelen er glucose, og at reaktionssystemet omfatter glucoseoxidase og peroxidase.

5. Blanding ifølge krav 1-4, kendetegnet 30 ved, at den chromogene indikator er benzidin, o-tolidin, 3,3',5,5'-tetra(lavere alkyl)benzidin, N- eller Ν,Ν'-poly-(lavere alkyl)-substitueret benzidin, 2,7-diamino-fluoren eller blandinger deraf, idet lavere alkyl betegner eventuelt substituerede alkylgrupper med 1-6 carbonatomer.

6. Teststrimmel til bestemmelse af nærværelsen af en bestanddel i en prøve, kendetegnet ved, at strim DK 158995B len omfatter en bærermatrix inprægneret med en blanding ifølge krav 1-5.