CS250653B2

CS250653B2 - Means for searched component's presence determination e. g. glucose in tested sample

Info

Publication number: CS250653B2
Application number: CS806921A
Authority: CS
Inventors: Thomas A Magers; John E Sheats; David L Tabb
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1979-10-15
Filing date: 1980-10-13
Publication date: 1987-05-14
Also published as: NO802907L; IL60779A; EP0027236A1; DE3064956D1; FI68126C; ES495912A0; ZA805030B; DK158995C; US4288541A; DK158995B; AU521370B2; NO153822C; FI68126B; IE49861B1; DK434580A; NO153822B; CA1144455A; ATE4730T1; ES8106935A1; EP0027236B1

Description

Vynález se týká prostředku pro stanovení přítomnosti hledané složky, například glukózy, ve zkoušeném roztoku, například v moči, odolného proti rušivému působení přítomného askorbátu.

Obor analytické chemie učinil velké pokroky, protože se biochemie začala uplatňovat jakožto přírodní vědecký obor, vyžadující chytré analytické způsoby a zařízení к řešení problémů, o jejichž řešení se nikdo dříve nepokoušel. Podobně bylo lékařství podnětem к rozvoji analytické chemie, jelikož vyžaduje vysoce přesné a rychlé výsledky zkoušek. Další podněty pro tento výrazný pokrok přinesla průmyslová odvětví, jako je například pivovarství a chemická výroba.

К uspokojení potřeb rozvíjejících se technologií byly vyvinuty četné analytické metody, přípravky a zařízení, včetně vyřešení chemických technik, automatických přístrojů a tak zvaných proužků „ponoř a odečti⁴⁴. Vynález se týká především těchto reakčních proužků ponoř a odečti, jelikož se jejich podstatný přínos uplatňuje i v jiných analytických metodách.

Reakčních proužků typu zkušebních zařízení se ve velké míře používá pro četné analytické účely, zvláště při chemickém rozboru biologických kapalin, pro jejich poměrně nízkou cenu, snadnost použití a pro rychlost dosahování výsledků. V lékařství se například četné fyziologické funkce mohou sledovat pouhým ponořením proužku do vzorku tělesné kapaliny, jako je moč, a pozorováním zjistitelné odezvy, jako je změna barvy nebo změna množství odráženého nebo absorbovaného světla proužkem.

V souhlase s rozvojem reakčních proužků a metod ponoř a odečti se rozvíjí rovněž chemie stanovení a rozboru tělesných kapalin; většina reagencií vytváří zjistitelnou odezvu, která je kvantitativní nebo alespoň polokvantitativní. Tak měřením odezvy po předem určené době může analytik získat nejen pozitivní indikaci přítomností určité složky ve zkoušeném vzorku, ale stanovit rovněž, kolik je této složky přítomno. Takové reakční proužky poskytují pracovníkovi snadný diagnostický prostředek a také možnost posoudit rozsah onemocnění a špatné tělesné funkce.

Jakožto příklady reakčních proužků ponor a odečti, kterých se v současné době používá, se uvádějí produkty obsahující jednu nebo několik nosičových matric, jako je například absorpční papír, které obsahují určitý reakční systém, který se projeví změnou barvy v přítomnosti specifické složky ve zkoušeném vzorku. V závislosti na reakčním systému vneseném do určité matrice může zkušební zařízení zjišťovat přítomnost glukózy, ketonu, bilirubinu, skryté krve, dusitanu a jiných patologických látek. Specifická barevná změna a intenzita pozorované barvy v určité době po uvedení do styku reakčního pásku se zkoušeným vzorkem jsou indikativní na přítomnost určité složky a na její koncentraci ve vzorku. Některá z těchto zkušebních zařízení a jejich reakční systémy jsou popsány v amerických patentových spisech číslo 3 123 443 (CLINISTIX), 3 212 855 a 4 147 514 (KETOSTIX), 3 814 668; 3 164 534 a 2 981 606 (DIASTIX), 3 298 789, 3 092 465, 3 164 534 a

981 606 (DEXTROSTIX).

Vývoj stanovení cukru je pravděpodobně nejzajímavější, jelikož se stanovení cukru v průběhu let dramaticky vyvíjelo, a to jak se zřetelem na chemické zásady, tak se zřetelem na vlastní provádění zkoušky. Pro většinu analytických způsobů je charakteristické, že oxidační systémy, které se redukují, iniciují reakční podmínky vedoucí ke zjistitelné odezvě, jako je změna barvy nebo změna vlnové délky ultrafialového světla absorbovaného nebo odráženého systémem. Proto redukční cukry převádějí οχιά stříbrný na kovové stříbro; jestliže se tedy roztok cukru nanese na filtrační papír napuštěný oxidem stříbrným, vyvine se černá skvrna.

Reakci popsal F. Feigl v Chem. Ind., ročník 57, str. 1161, Londýn (1938). Podobně o-dinitrobenzen a 3,4-isomer a 3,5-isomer dinitroftalové kyseliny poskytují citlivou barevnou reakci za vzniku fialového zabarvení při zahřátí s reduktivními cukry v uhličitanu sodném. Tuto reakci popsal T. Momose a kol. v publikaci Chem. Pharm. Bull. Tokyo, svazek 12, strana 14 (1964) a F. Feigl v publikaci Spot Tests in Organic Analysis, 7. vydání, str. 338—339, Elsevier Publ. Co., New York (1966).

Již před rokem 1849 bylo však známo, že redukující cukry mohou z alkalického roztoku síranu měďnatého vysrážet žlutý až červený oxid měďný nebo oxyhydrát měďný. Tuto reakci popsal H. Fehling v Ann., svazek 72 (1849). Rovněž je popsána B. Hersteinem v J. Am. Chem. Soc. svazek 32, str. 779 (1910). Tento dávný poznatek, známý jako Fehlingova zkouška, byl podnětem к vývoji mnohem citlivějších zkoušek, při kterých se používá oxidu stříbrného v amoniaku, tak zvaného Tollensova činidla, které reaguje rychle s redukujícími činidly za vzniku černé sraženiny kovového stříbra a často za vzniku zrcátka na vnitřní stěnách skleněné reakční nádoby. Reakci popsal B. Tollens v Ber., svazek 14, str. 1 950 (1881), svazek 15, str. 1 635, 1 828 (1882).

Pro poměrně vysoký počet výskytu onemocnění diabetes mellitus a pro doprovodné vážné klinické následky věnují biologové a lékaři velkou pozornost novým způsobům stanovení obsahu glukózy v moči a v séru. Tento velký zájem je podnětem vývoje četných analytických způsobů, které se naprosto liší od způsobů dosavadních. Využívají biologických systémů, které se mohou vnášet do suchých zařízení, urče ných pro zkoušky ponor a odečti, přičemž se tyto biologické systémy používají v roztoku nebo v suspenzi nebo ve spojení se spektrofotometry anebo s jiným zařízením.

Z těchto nových technik využívá vynález enzymatického systému, přičemž analyzovaná látka, například glukóza, je substrátem pro určitý enzym a reakční produkty jsou schopny vytvářet zjistitelnou odezvu chromogenní indikátorové sloučeniny, například ze souboru známého jako „indikátory benzidinového typu“. Tyto indikátory budou dále ještě pečlivěji definovány, zatím stačí uvést, že tyto sloučeniny vytvářejí barevné změny v přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidových sloučenin, jako je například enzym peroxidáza. Jakožto příklad ze známého stavu techniky se uvádí systém glukóza/oxidáza glukózy, přičemž se glukóza oxiduje na glukonovou kyselinu se současným vytvářením peroxidu vodíku podle schématu.

и OH

Η 0 . HO

Ы н)-~°

HOj-f

H OH (Tgukolakton

D-glukonová kyselina

Vytváření peroxidu vodíku usnadňuje následující indikátorem podmíněné pozorovatelné vytváření barvy nebo jiné pozorovatelné odezvy. Tak indikátor benzidinového typu odpovídá na přítomnost peroxidu vodíku a peroxidázy měněním jeho schopnosti absorbovat světlo.

V praxi se této technologie v současné době využívá pro stanovení glukózy ve formě reakčních proužků ponoř a odečti, jako jsou například reakční proužky z plastické hmoty, které mají na jednom konci upevněný kousek absorpčního papíru, napuštěný vhodnými enzymy, indikátorovou sloučeninou a pufry, kteréžto látky tvoří aktivní složky. Proužků se používá ponořením konce obsahujícího reakční systém do zkouše ného vzorku, vyjmutím proužku -a porovnáním jakékoliv vzniklé barvy na absorpčním papíru se standardní barevnou stupnicí kalibrovanou pro různé koncentrace glukózy.

Reakční proužky znamenají sice velký přínos, avšak určité látky, často přítomné ve zkoušených vzorcích, narušují často přesnost zkoušky. Jestliže koncentrace takových látek dosáhne určitého násobku ve srovnání s koncentrací měřeného substrátu, může se stát nepříznivý vliv na zkoušku výrazným. Například pracovníci v obou reakčních proužků již dlouho vědí, že přítomnost askorbové kyseliny v moči může . nepříznivě ovlivňovat analytické stanovení tak odlišných složek moči, jako je glukóza, skrytá krev, bilirubin a dusitan.

Proto vysoká koncentrace askorbové kyseliny v moči, způsobená terapeutickými dávkami vitaminu C nebo parenterálními přípravky, které obsahují vitamin C jakožto redukční činidlo, jako je například tetracyklin, může inhibovat reakci při zkoušce a omezovat přesnost zkoušky.

Urputnost tohoto dlouho nevyřešeného problému je zřejmá z četných pokusů jeho překonání, známých ze stavu techniky. Americký patentový spis číslo 3 411 887 (Ku) popisuje použití kovového iontu, který má oxidačně redukční potenciál vyšší než rušící látka avšak nižší než chromogenní látka nebo indikátor. Jakkoliv se toto řešení jeví teoreticky jednoduché a mělo by minimalizovat rušivé působení askorbové kyseliny, snižuje kvantitativní přesnost indikátorů v reakčních systémech citlivých na cukry, zvláště glukózových systémů. Především se projevuje obtíž založená na vážném. nedostatku skladovatelnosti směsových indikátorů citlivých na cukr v přítomnosti kovového iontu. Pro sníženou životnost a nekvantitativní odezvu se sloučenin podle amerického patentového spisu číslo 3 411 887 nikdy nemohlo použít dostatečně uspokojivě pro užitečnou zkoušku cukru; vyšetřování bylo horší než samotná nemoc.

Americké patentové spisy číslo 3 975 398 a 3 988 208 popisují idikátorové sloučeniny, které údajně nejsou inhibovány acetooctovou kyselinou nebo askorbovou kyselinou.

Jinými pokusy řešit tento problém interference je použití ionexových sloučenin (britský patentový spis číslo 1 193 594) a několikavrstvových nosičových matric (britský patentový spis číslo 1 171788) v naději, že interferenční látky budou fyzikálně odděleny ze zkušebního vzorku před jeho uvedením do styku se systémem reagencie.

Přes shora popsané dlouho trvající úsilí nebyl do současné doby tento problém vyřešen. „Zachycovací systém“ podle amerického patentového spisu číslo 3 411 887, jak bude dále v příkladech ukázáno, poskytuje směsi malé stálosti. Zkušební zařízení, založené na takové technologii, je ve skutečnosti nepoužitelné i po krátké době skladování při teplotě místnosti.

5 O 6 5 3

Vynález řeší tuto dlouho trvající potřebu indikátorového systému, který by byl odolný proti rušivému působení redukčních látek, jako je například askorbová kyselina (vitamin C).

Vynález je založen na zlepšené směsi ke stanovení přítomnosti složek v kapalném zkušebním vzorku. Směs, známá ze stavu techniky, se zlepšuje tím, že obsahuje reakční systém schopný vytvářet zjistitelnou odezvu, jako barevnou změnu, v přítomnosti. určité složky a zachycovací systém redukčního činidla; tímto zachycovacím systémem je sloučenina iontu těžkého kovu mající ’ oxidační potenciál ležící mezi oxidačním potenciálem chromogenní látky a oxidačním potenciálem redukční látky s oxidačním potenciálem podobným, jako má askorbová kyselina. Podle vynálezu byla tato směs rozhodujícím způsobem zlepšena tím, že obsahuje kovový iont ve formě komplexu dvoumocné rtuti se specifickou třídou ligand. Ligand je vázán kovalentně se rtuťnatým iontem za vzniku ve vodě rozpustného komplexu a má vyšší oxidační potenciál než iont ve svém komplexovém stavu. Tento komplex má konstantu stability Ks, větší než asi 10⁷ a je v podstatě neinterferenční s reakčním systémem.

Vynález se rovněž týká zkušebního zařízení vyrobeného vnesením směsi do nosičové matrice a také se týká analytického způsobu za použití uvedené směsi nebo zařízení jejich uváděním do styku se zkušebním vzorkem a pozorováním zjistitelné odezvy.

Použití komplexu rtuťnatého . lontu a ligandu, označovaného nadále jako „komplex“ podle vynálezu, je jedinečné. I v případech, kdy zkoušené roztoky obsahují poměrně vysoké množství redukujících látek, je stále analytické stanovení možné, přičemž přesná analýza takových vzorků byla dříve nemožná bez předchozího odstranění látek rušících stanovení. Například komplex podle vynálezu usnadňuje přesné stanovení glukózy v moči obsahující až 200 miligramů na decilitr (mg %) askorbové kyseliny. Kromě toho jsou takové směsi neočekávaně stálé ve srovnání se směsmi známými ze stavu techniky, z nichž žádná se nepřibližuje směsi podle vynálezu v tom smyslu, že by současně představovala produkt dostatečně stálý při skladování i po minimální dobu.

Po úspěšných zkouškách komplexu aminokyseliny se rtuťnatým iontem byly zkoušeny jakožto ligandy další aminokyseliny. Některé se osvědčily, jiné nikoliv. Kromě toho se dále zjistilo, že jiné sloučeniny, chemicky nepříbuzné aminokyselinám, jsou rovněž účinné jakožto ligandy v komplexu.

Opět se některé osvědčily, jiné nikoliv.

Pro velkou rozličnost ligand, které vytvářejí jak stálé komplexy se rtuťnatým iontem, tak odstraňují interferenční působení redukujících látek, byl proveden důkladný průzkum ke zjištění, které vlastnosti jsou společné všem ligaudům a komplexům, které se pro daný účel osvědčují. Byly zjištěny čtyři nutné předpoklady:

a) schopnost ligandu vázat v podstatě kovalentně rtuťnatý iont za vzniku ve vodě rozpustného komplexu a tak poskytovat ionickou povahu iontu v podstatě bez interakce s interferenční redukující látkou;

b) oxidační potenciál ligandu musí být vyšší než rtuťnatého. iontu ve stavu komplexu, takže iont nemůže promotovat oxidační rozklad ligandu při skladování; ’ cj konstanta stálosti komplexu musí být alespoň asi 107, takže ligand a iont nejsou vázány příliš volně nebo příliš těsně, čímž komplex není ani příliš nestálý k předcházení hydrolýzy rtuťnatého iontu ani není příliš stálý, čímž by byl kovový iont chráněn před svým okolím do té míry, že by již nebyl schopen interakce s interferenčními redukujícími látkami a

d) neschopnost komplexu nebo jeho reakčních produktů po redukci narušovat reakční systém.

Nyní je především užitečné vysvětlit některá teoretická hlediska chemie rtuťnatých iontů a jejich schopnost kovalentní vazby s určitými ligandy.

Rtuťnaté ionty se považují za silnou Lewisovu kyselinu, chovající se podobně jako fluorovodík nebo dihydrogenfosforečné ionty ve vodném prostředí a. ochotně se hydrolyzují za vzniku hydroxykomplexů podle rovnice 1 aď⁺ * oh + ^H

Rovnovážná konstanta pro tuto reakci je vyjádřena rovnicí 2 ₌ [HgOH⁺] [H*J [Hg⁺⁺j

3,2 χ ΙΟ-·’ (2)

Hg(OH)₃ který se rozkládá za vzniku žlutého oxidu rtuťnatého vzorce

HgO a za vzniku vody podle rovnice 3

V dalším stupni se HgOH+ snadno hydrolyzuje na hydroxid rtuťnatý vzorce

Hg⁴* + 2 OH -—— H5(OH)_Z —© H grQ > H-O (3)

Konstanta rozpustnosti hydroxidu rtuťnatého v této reakci je dána vztahem 4

Ks_P · [ Hg ⁺ ' ) [OH~]2 = 4 x 10--6 (4)

Z hodnot rovnovážných · konstant, vztahujících se k hydrolýze rtuťnatých iontů (rovnice 2 a 4), je zřejmé, že rtuťnaté ionty jsou stálé ve vodném roztoku pouze při hodnotě pH nižší než 2 v nepřítomnosti stabilizačních komplexotvorných látek. Při mírně vyšších hodnotách pH je převážně přítomen iont HgOH+ a při hodnotách pH větších než 3 se většinou kvantitativně vysráží oxid rtuťnatý.

Proto, když se postupovalo podle shora uvedeného amerického patentového spisu číslo 3 411 687, docházelo ke značným barevným změnám a ke ztrátě možnosti kvantitativního stanovení a ke ztrátě skladovatelnosti. Bez určitých prostředků ke stabilizaci rtuťnatých iontů jako takových a ve (ormě roztoků, kterých se vynález týká, se spontánně vytváří silně zabarvený oxid rtuťnatý po· poměrně krátké době skladování nebo po použití, čímž se směs, používaná ke zkoušce stává citlivou k rušivým redukčním prostředkům a stává se nespolehlivou jak z kvalitativního, tak z kvantitativního hlediska. Vynález je tedy založen na zjevné skutečnosti, že rtuťnaté sloučeniny jsou v roztoku při hodnotách pH nad 3 nestálé pokud se nevyloučí hydrolýza, jako například převedením· rtuťnatých iontů do komplexu s některými ligandy, schopnými dodávat dostatečnou stabilitu. Podle vynálezu jsou objeveny nejen komplexotvorné ligandy, které dodávají rtuťnatým iontům dostatečnou stabilitu (přičemž některé ligandy nejsou toho schopny), jsou však také objeveny ligandy, které umožňují, aby komplex byl vynikajícím způsobem účinný k odstraňování interference, působené redukujícími ionty.

Prvním ze čtyř kritérií, které musí ligandy splňovat, je schopnost kovalentní vazby se rtuťnatými ionty za současného · vzniku ve vodě rozpustných komplexů. Mezi ligandy, které jsou schopny kovalentně vázat rtuťnaté ionty, patří ionty kyanidové, sulfokyanidové, chloridové, bromidové, jodidové, acetát, amoniak, methylamin (CH3NH2), pyridin, anilin, ethylendiamin, aminokyseliny, karboxamidy, imidy, ethylendiamintetraoctová kyselina, trifenylfosfin, heterocyklické amidy, jako je uridin a četné další látky.

Při výzkumu ligand, schopných vytvářet komplex, se započalo výzkumem ligand, které jsou schopny kovalentní vazby se rtuťnatými ionty. Je jich mnoho.

Dále se zkoumalo, do· jaké míry je komplex ligandu schopen rozpouštět se ve vodě. Jako přiměřená se považuje rozpustnost za vytvoření vodného roztoku o koncentraci alespoň 0,01 M při posuzování komplexu, jakkoliv komplexy vytvářející alespoň asi 0,1 M roztoky ve vodě za standardních podmínek teploty a tlaku jsou výhodnými.

Po stanovení ligand, ktoré se váží kovalentně se rtuťnatými ionty za vzniku komplexů rozpustných ve vodě se zkoumalo, které z nich nejsou oxidovány kovovým iontem. Jestliže má ligand příliš nízký oxidační potenciál se zřetelem na rtuťnatý iont, je komplex náchylný k rozkladu a je proto neschopen eliminovat interferenci redukujících činidel. Jedním ze způsobů ke zjišťování citlivosti ligandu k oxidaci komplexně vázaným rtuťnatým iontem je příprava roztoku komplexu ve vodě a pozorování tohoto roztoku za standardních podmínek teploty 0· tlaku po několik dnů. Vysrážení šedé, kovové rtuti je indikací nepřijatelného oxidačního potenciálu ligandu.

Třetím parametrem, který se zkoumá při stanovení, jak dalece jsou ligandy rtuťnatého komplexu schopny vyřešit problém interference reduktivních činidel je termodynamická charakteristika, známá jakožto konstanta stability. Jak bylo shora uvedeno, je komplexotvorných ligand zapotřebí proti spontánnímu vytváření žlutého oxidu rtuťnatého ze rtuťnatých iontů při hodnotách pH nad 3 a pro náchylnost těchto iontů k pomalému vytváření oxidu rtuťnatého v suchém stavu. Stabilizační vliv různých ligand se může posoudit z hodnot konstant stability K pro každý určitý komplex rtuťnatý iont/ligand.

Vytváření komplexu vyjadřuje vztah:

Hg·* * nL ~~ HgL_n (5)

Konstanta stability K_s pro tuto reakci je vyjádřena rovnicí 6 _ [HgLJ__ [L]n (6)

V rovnících 5 a 6 znamená L ligand, n je číslo vyjadřující počet ligand vázaných na kovový iont a HgL_n znamená komplex.

Běžnými hodnotami pro n jsou 2, 3 nebo 4,

5 0 6 5 3 ho zařízení podle vynálezu a jelikož se takové koncentrace blíží jednotkové aktivitě, předpokládá se platnost vztahu n však může být i 6. Přitom HgL„ může být heterogenním komplexem, kde L_n může znamenat různé ligandy vázané na tentýž i ont.

Z rovnice 4 se získá rovnice 7 _x [и<⁺⁺1 ^“iOiF]r ⁽⁷⁾ [HgL„] s [LI“ - 1 (9]

Tento předpoklad zjednodušuje rovnici 8 na rovnici 10

Dosazením tohoto vztahu do rovnice 6 se získá rovnice 8 (OH i² [HgL_n] ^χ 10-^{26 [}L]ⁿ

Ke stanovení číselných hodnot konstanty stálosti K_s a tak k popsání komplexu číselnými údaji se používá určitých zvyklostí. Jelikož jsou žádoucí poměrně vysoké a v podstatě ekvimolární koncentrace ligandu L a komplexu HgLn při přípravě zkušební4 x 10-26 (10)

Je tedy zřejmé, že konstanta stálosti má význam při definování komplexu se zřetelem na stálost za různých podmínek hodnot pH podle rovnice 10. V tabulce I je ukázáno, jak je možno tento matematický vztah vyjadřovat potřebnou hodnotou stálosti K_s, aby se předešlo k převádění na οχιά rtuťnatý při různých hodnotách pH.

Tabulka I

Potřebná hodnota K_s k předcházení vytváření oxidu rtuťnatého

PH [OH-] Ks

4	1Q-10	2,5 χ 105
5	10^-9	2,5 χ 107
6	Ю-8	2,5 χ 109
7	10-7	2,5 χ 1011
8	lO6	2,5 x 10¹³
9	l0^-5	2,5 x 1015
10	10-⁴	2,5 χ 10‘⁷
11	lQ-3	'2,5 χ 1019

Z tabulky je zřejmé, že pro udržení komplexu dvojmocné rtuti v roztoku při hodnotě pH 6, to znamená při hodnotě pH jakou má normální moč, musí být konstanta stálosti Ks 2,5 χ 109. Zjistilo se, že komplexy s hodnotou stálosti K_s nižší než asi 10⁵ jsou stálé při hodnotě pH asi 4. Jakkoliv tyto hodnoty nejsou absolutní, zjistilo se, že je výhodné, aby měl komplex hodnotu K₃ alespoň kolem 107.

Posledním kritériem, které musí splňovat komplex podle vynálezu je, aby nenarušoval reakční systém, který je určen ke zjištění přítomnosti hledané látky. Jinak řečeno, komplex, který chemicky reaguje se systémem, nebo který inhibuje enzym, takže enzym není schopen kvantitativní odezvy na přítomnost hledané sloučeniny, maří výsledek stanovení podle vynálezu. Nadto komplex nesmí po redukování interferující reduktlvní látkou, jako je kyselina askorbová, vytvářet reakční produkt, které by bránily žádanému analytickému stanovení.

Jev interferenčního působení komplexu dvoumocné rtuti s reakčním systémem se může snadno stanovit v laboratorním měřítku dále popsaným způsobem. Je zapotřebí uvést komplex do styku s žádaným reakčním systémem. Směsi se pak může použít k měření přítomnosti složek ve dvou předem kalibrovaných roztocích, z nichž je den obsahuje m.oč a zkušební směs a druhý má totéž složení, obsahuje vsak navíc vysoké množství přidané askorbové kyseliny (asi 10 až 100 mg/dl). Výsledky těchto analýz se pak porovnávají s výsledky získanými za použití reakčního systému bez komplexu v těchže roztocích.

Odpovídající souhlas barvy těchto dvou zkušebních roztoků, dokazuje, že reakční systém není rušen komplexem rtuti nebo jeho redukčními produkty.

Po shrnutí shora uvedených experimentálních a teoretických poznatků je možno říci, že existuje velký počet ligand, které po komplexním vázání se dvoumocnýini ionty rtuti poskytují řešení problému, který po léta · trápil analytiky zvláště v souvislosti rozborů za použití pásků ponoř a odečti: nesprávné neebo nepravdivé negativní výsledky odečtení v důsledku interferenčních vlivů askorbové kyseliny nebo jiných podobných redukčních prostředků. Tyto ligandy patří do zdánlivě tak nepříbuzných typů sloučenin, jako jsou aminokyseliny, nukleosidy, sekundární a terciární aminy, amidy a fosfiny. Nadto některé sloučeniny uvedeného typu jsou podle vynálezu použitelné, jiné nikoliv.

Rozluštění uvedených experimentálních výsledků je podle vynálezu ve vyhledání

14 společných vlastností úspěšných ligand a komplexů s vyloučením ligand, které jsou podle vynálezu nepoužitelné. Důležité jsou čtyři charakteristiky:

a) schopnost ligandu kovalentně vázat dvoumocné ionty rtuti za vzniku ve vodě rozpustných komplexů;

b) schopnost ligandu odolávat oxidačnímu sklonu dvoumocných iontů rtuti [to je vyšší oxidační potenciál);

c) hodnota konstanty stálosti Ks komplexní sloučeniny 10⁵ až 10⁸ nebo vyšší;

d) slučitelnost komplexu s odpovídajícím reakčním systémem.

Úspěšné komplexy splňují všechny uvedené požadavky, neúspěšně selhávají v jednom až ve všech z těchto požadavků.

V následující tabulce jsou uvedeny ligandy, které se odzkoušely [viz následující příklady), ukázaly se úspěšnými nebo neúspěšnými a jsou podle toho seřazeny. V tabulce jsou také uvedeny důvody, proč určité ligandy vytvářejí komplexy s dvojmocnými ionty rtuti neschopné ochránit reagenční směsi na glukózu podle stavu techniky před rušivým vlivem askorbátu. V tabulce II znamená označení [1), že se ligand neváže kovalentně se rtuťnatými ionty nebo nevytváří ve vodě rozpustný komplex, označení (2) znamená, že ligand nemá dostatečný oxidační potenciál k odvrácení oxidace dvojmocnými rtuťnatými ionty a označení [3) znamená, že komplexy mají příliš nízkou hodnotu konstanty stálosti.

Tabulka II

Úspěšné ligandy sarkosin threonin serin prolin bicenf (HOCH₂,CH₂) ýNCHýCOOH] uřítím triethanolamin diethan.o lamrn r^^tru^ma^ur(^y^]^a^i^k^c^f^irjáít МГепуИозНи

Neúspěšné ligandy a důvody neúspěšnosti alanin (2) . glycin (2) trishydroxymethylaminomethan (2) glutamová kyselina (2) asparagin (1 a 3)

DL-aHa-amino-n-máselná kyselina (1 a 3) alia-methylaminoiscmáselná kyselina (1 a 3)

2,6-pyridindikarboxylová kyselina (1 a 3) nitrilotrioctová kyselina (1 a 3) adenin [1 a 3) guanin (1 a 3) cystin (2) leucin (2) in-dimethylaminobenzoová kyselina (1, 2 a 3) aminomethansulionová kyselina (1 a 3) suliamová kyselina [1 a 3) glycylglycin (2) L-hvstidin (2) cytidin [1 a 2) aceton (3) ethylerdlamlntetraoctová kyselina^Kmoriolin [2) thiantren (3) methyliminodioctová kyselina [1) a.rginin (1 a 3) ornitin [1 a 2) lysin (1 a 2) citrónová kyselina* * oxidace interierujících látek probíhá příliš pomalu

Jakkoliv nebylo důkladně zkoumáno, proč se určité ligandy nejeví účinnými jako ochrana proti interferenčním vlivům v následujících příkladech, pouhé pozorování, jak se jednotlivé ligandy chovají při zkouškách popsaných v následujících příkladech, vedlo k přesvědčivým závěrům, uvedeným v tabulce II jakožto důvody neúspěchu. Kromě toho je domněnka, že poměrně netěkavé ligandy vedou ke komplexům s vyšší životností, než jakou mají jejich těkavější protějšky.

Komplexní sloučeniny, používané podle vynálezu, se připravují například tak, že se přidá oxid rtuťnatý do· roztoku ligandu. Tak se například sarkosinát rtuťnatý může připravit, podobné jako· jiné komplexy, přidáním oxidu rtuťnatého do roztoku ligandu, v tomto případě do roztoku sarkosinu ve vodě. Podobně se může připravit seriát rtuťnatý ze serinového roztoku. Těchto roztoků se může použít jakožto přísad do standardních činidel pro stanovení glukózy nebo se jich používá k izolaci čisté, pevné formy komplexu srážením, například isopropanolem.

Komplexy se také mohou připravit jinými způsoby za podmínky, že splňují shora uvedené požadavky.

Několik slov o reakčních systémech, používaných podle stavu techniky pro stanovení přítomnosti zkoušené látky usnadní pochopení vynálezu. Reakční systémy podle stavu techniky obsahují shora uvedené indikátorové systémy.

Zjistilo se, že jeden takový systém je obzvláště odolný proti interferenčnímu působení askorbátu za současného použití shora definovaného komplexu: je to systém obsahující cukroxidázu, látku s funkcí peroxidu a oxidačně redukční indikátor schopný barevné změny působením peroxidu vodíku a látky s funkcí peroxidu. V závislosti na cukru, který se má zjišťovat, se volí enzym, který má vliv na vytváření peroxidu vodíku po oxidaci stanovovaného cukru. Proto pro stanovení glukózy se jakožto enzym, vyvíjející peroxid vodíku, volí galaktózaoxidáza.

Jakmile se vytvoří peroxid vodíku, je potřebí látky s funkcí peroxidu k usnadnění aktivace určitého, zvoleného indikátorového systému. Látky s funkcí peroxidu typicky zahrnují peroxidázu a hemoglobin. K četným oxidačně redukčním indikátorům, které vytvářejí barevnou změnu v přítomnosti vodíku a látek s funkcí peroxidu, patří benzidin a. jeho mnohé chromogenní deriváty. Tyto chromogenní deriváty zahrnují o-tolidin, 2,7-diaminofluoren, 3,3‘,5,5‘-tetra(nižší alkyl] benzidin a N-nižším alkylem, Nenižším alkylenem a N,N‘-nižším alkylem substituované benzidiny. Nižším alkylem se vždy míní substituovaná nebo· nesubstituovaná uhlovodíková skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, včetně skupiny methylové, ethylové, n-propylové, isopropylové, cyklopropylové, n-butylové, isobutylové, terc.-butylové, cyklobutylové, n-pentylové, sek.-pentylové, terc.-pentylové, neopentylové, cyklopentylové, n-hexylové, cyklohexylové a včetně všech jejich isomerů.

Připomíná se, že jsou četné reakční systémy, citlivé na cukry, na které působí interferenčně askorbát a podobné redukční prostředky. Pro tyto systémy bude vynález rovněž prospěšný a vnášení komplexů podle vynálezu do takových reakčních systémů také z velké míry vyřeší problém interference redukujících látek. Proto se vynález týká všech takových systémů.

Jiným reakčním systémem, který se stane odolným proti interferenčnímu působení askorbátu působením komplexu podle vynálezu, je systém, obsahující látku s funkcí peroxidu a redoxový indikátor schopný ovlivnit barevnou změnu v přítomnosti peroxidu vodíku a látky s funkcí peroxidu. Takový reakční systém je známý pro zjišťování peroxidických látek, jako jsou například kumenhydroperoxid a peroxid vodíku.

Ze shora uvedených reakčních systémů je rozumné očekávat, že každý takový systém, založený na redox indikátoru majícím oxidační potenciál značně vyšší, než je oxidační potenciál askorbové kyseliny, je nutno považovat za interferenční s redukčním činidlem majícím oxidační potenciál podobný jako askorbové kyselina. Vynález je tudíž vhodný pro všechny takové k redukčním činidlům citlivé reakční systémy.

Při přípravě zkušebního zařízení podle vynálezu, kde zkušebním činidlem je shora popsané reakční činidlo s odezvou na glukózu, zahrnuje zkušební směs roztok činidla s odezvou na glukózu ve vodě (první roztok) a roztok obsahující komplex dvoumocné rtuti (druhý roztok). Roztok, s odezvou na glukózu, obsahuje indikátor benzidinového typu, jako je 3,3‘,5‘,5‘-tetramethylbenzidin, oxidázu .glukózy, peroxidázu a pufr.

Kousek filtračního papíru se ponoří do prvního roztoku, nasytí se prvním roztokem a usuší se. Nyní se usušený, impregnovaný, filtrační papír ponoří do druhého roztoku, nasytí se tímto roztokem a usuší se.

Při jednom provedení vynálezu se papír obsahující první a druhý roztok činidel rozřeže na malé čtverečky, z nichž každý se upevní na jeden konec pásku polystyrénového filmu. Pro přilnutí papíru k polystyrenu se může použít oboustranně lepicí pásky, známé například jako Double Stick^Rspolečnosti 3M Co. Výsledného zkušebního zařízení se pak může používat ke stanovení obsahu glukózy v moči, přičemž tato zkouška není inhibována přítomností až 200 mg⁰/o askorbové kyseliny ve zkoušeném vzorku.

Nosičova matrice, používaná pro zkušební zařízení podle vynálezu, může obsahovat jakoukoliv látku schopnou napuštění reakční směsí. Taková matrice může mít jakoukoliv formu používanou pro reakční pásky pro analýzu roztoků. Například podle amerického patentového spisu číslo 3 846 247 se používá plsti, porézních keramických pásků a tkaných nebo na rohož zpracovaných skleněných vláken. Jako náhradu za papír doporučuje americký patentový spis číslo 3 552 928 použití dřevěných tyček, látky houbovitého materiálu nebo jílovitých látek. Použití roun ze syntetických pryskyřic a plsti ze skleněných vláken se popisuje v britském patentovém spise číslo 1 369 139. Jiný britský patentový spis, číslo 1 349 623 popisuje použití pro světlo propustné síťoviny z tenkých filamentů jakožto krycí vrstvy pro pod ní ležící papírovou matrici. V tomto spise se · také doporučuje impregnace papíru částí reakčního systému a impregnace síťoviny jiným potenciálně neslučitelným reakčním činidlem. Francouzský patentový spis číslo 2 170 397 popisuje použití nosičové matrice obsahující více než 50 % polyamidových vláken. Jinou nosičovou matrici popisuje americký patentový spis číslo 4 046 513, kde se reakční systém na nosičovou matrici nanáší natištěním. A^^i^jrický patentový spis číslo 4 046 514 popisuje vetkávání nebo vplétání filamentů obsahujících reakční činidlo do reakčního systému. Výhodnou nosičovou matricí je savý papír, jako je například filtrační papír. Všech takových nosičových matric se může použít podle vynálezu.

Základní nosný člen, na který se impregnovaná nosičova matrice může upevnit, může být z nejrůznějšího materiálu a může mít nejrůznější tvar a velikost. Může být z jakéhokoliv pro kapalinu v podstatě nepropustného materiálu, jako je polystyren, polyolefin, sklo, papír, kov nebo jiný materiál. Zpravidla je však výhodné, aby byl tento nosný člen z polymerního materiálu, jako je například biaxiálně orientovaný polystyren společnosti Plastic Suppliers, lne. Pro většinu účelů se považuje za výhodné, aby byl nosičový člen poměrně tuhý a aby byl dostatečně prodloužen od nosičové matrice a vytvářel tak možnost pohodlného držení.

Vynález objasňují následující příklady. Představují výhodná provedení a vynález objasňují, aniž by jej jakkoliv omezovaly.

A. Příprava různých komplexů

Dvě techniky se experimentálně osvědčily pro přípravu rtuťnatých komplexů, které se vyznačují neočekávanou kombinací stálosti a účinnosti se zřetelem na vyloučení interferenčního působení redukujících činidel na reakční svstémy pro stanovení cukrů. Je to způsob založený na použití oxidu rtuťnatého a na použití rozpustné soli·

Způsob, založený na použití oxidu rtuťnatého, používá oxidu rtuťnatého jakožto výchozí látky, přičemž se ligand a oxid rtuťnatý uvádějí do vzájemného styku v destilované vodě za vzniku roztoku komplexu.

Způsob založený na použití rozpustné soli, se jeví jako siřeji použitelný a používá se při něm rtuťnaté soli rozpustné ve vodě jako například octanu rtuťnatého a dusičnanu rtuťnatéh o.

Oba shora, uvedené způsoby jsou objasněny v následujících příkladech.

Příklad 1

Příprava sarkosinátu rtuťnatého oxidovým způsobem

Komplexy dvojmocného kationtu rtuťnatého a aminokyselin se mohou snadno připravit vnesením práškovitého oxidu rtuťnatého a aminokyseliny, buď postupně, nebo najednou do vody, čímž vznikne roztok komplexu. Roztoku se pak může přímo použít podle vynálezu, nebo se komplex může izolovat a skladovat pro pozdější použití. Analýzou pro Hg(CH3NHCH₂COO_ )₂ vypočteno:

19,15 % C, 3,21 % H, 7,44 % N, 53,24 % Hg, 16,99 % O, nalezeno:

18.94 % C, 3,93 % H, 7,26 % N. 53,04 % Hg, 17,33 % O.

Jestliže se oxid rtuťnatý míchá s vodným sarkosinem v molovém poměru 1 : 2, rozpustí se pouze dvě třetiny oxidu rtuťnatého. Jestliže se použije trojnásobného molového· nadbytku sarkosinu, dosáhne se dokonalého rozpuštění. Tento jev se nepodařilo uspokojivě vysvětlit, jakkoliv stechiometrie vedou k témuž komplexu, to je k sarkosinátu rtuťnatému, jak je doloženo elementární analýzou.

Při pokusu za využití této techniky se vzorky oxidu rtuťnatého a sarkosinu o hmotnosti 1,83 g (8,45 · x 10'³' molů) a 3,014 g (38,2 x 10'³ molů) přidají do 10 ml destilované vody za míchání. Oranžová, opakní suspenze, která se vytvoří, se vyčeří po asi 10 až 20 minutách při teplotě místnosti. Komplex se z roztoku izoluje vysrážením isopropanolem.

Příklad 2

Příprava sarkosinátu rtuťnatého způsobem založeným na použití soli

Při způsobu založeném, na použití soli při přípravě rtuťnatých komplexů se rozpouští rtuťnatá sůl, jako například octan nebo dusičnan rtuťnatý ve vhodném rozpouštědle spolu s určitým ligandem. Zatímco aminokyselinové komplexy se mohou připravovat jak oxidovým způsobem, tak způsobem založeným na použití soli, používá se způsobu, založeného na použití soli pro širší obor ligaudů, protože mnohé z ligandů nevytvářejí komplexy nebo je vytvářejí příliš pomalu za použití oxidu rtuťnatého.

Vzorek octanu rtuťnatého o hmotnosti 31,0 g (0,143 moly) se rozpustí ve 400 ml methanolu a 17,4 g sarkosinu se rozpustí v 60,0 m.l destilované vody. Vodný sarkosin se přidá do methanolového roztoku, zamíchá se a nechá se stát při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny, načež dojde к vykrystalování sarkosinátu rtuťnatého. Po dvou hodinách se reakční směs zfiltruje. Oddělené krystaly se usuší, čímž se získá 26,3 g produktu (80 °/o teoretického výtěžku). Ponecháním filtrátu přes noc v lednici se získá dalších 3 g produktu.

Příklad 3

Příprava serinátu rtuťnatého oxidovým způsobem

Serinát rtuťnatý se připraví způsobem popsaným v příkladu 1, přičemž se 1,83 g oxidu rtuťnatého a 1,78 g šeřinu smíchá v 10 mililitrech destilované vody za míchání. Jako ve shora uvedeném případě se vytvoří čirý roztok serinátu rtuťnatého.

Příklad 4

Bicenát rtuťnatý

Reakcí oxidu rtuťnatého s bicenem, bis-hydroxyethylglycinem vzorce (HOCH₂CH_2;)₂NCH₂COOH se způsobem popsaným v příkladu 1 za molového poměru 1 : 2 získá čirý, stálý roztok. Nebyly provedeny zkoušky к izolování tohoto komplexu.

P ř í к 1 a d 5

Prolinát rtuťnatý

Reakcí oxidu rtuťnatého s prolinem ve vodném roztoku, jak je popsáno v příkladu 1, v molovém poměru 1 : 3 se vytvoří čirý, stálý roztok obsahující komplex prolinu a rtuti.

Příklad 6

Threonát rtuťnatý

Oxid rtuťnatý se nechá reagovat s vodným threoninem způsobem, popsaným v příkladu 1, za molového poměru 1 : 2 za vzniku čirého, stálého roztoku komplexního produktu threoninu rtuťnatého.

Příklad 7

Uridinát rtuťnatý

Oxid rtutnatý se přidá do vodného roztoku uridinu způsobem, popsaným v příkladu 1, v molovém poměru 1 : 2 za vzniku čirého, stálého roztoku komplexního uridl· nu rtuťnatého.

Příklad 8

Trifenylfosfinát rtuťnatý

Trifenylfosfinát (3 g) se rozpustí v 50% dimethylformamidu a nechá se reagovat s 1,30 g chloridu rtuťnatého až do vytvoření bílé sraženiny. Komplex rtuťnatého iontu a trifenylfosfinu se oddělí filtrací a usuší se. Komplex se rozpustí v destilované vodě, čímž se získá čirý, stálý roztok.

Příklad 9

Dietlianolaminát rtuťnatý

Octan rtuťnatý o hmotnosti 2,6 g (8,4 x x 10'³ molů) se rozpustí v 10 ml destilované vody. Do roztoku se přidá 1,92 g (0,016 molu) diethanolaminu. Téměř okamžitě po přidání ligandu vznikne čirý, stálý roztok komplexu.

Komplex se izoluje odpařením reakční směsi.

Příklad 10

Způsobem, popsaným v příkladu 9, se smísí vodný octan rtuťnatý s triethanolaminem ve stechiometrickém poměru 1 : 2. Vznikne čirý, stálý roztok komplexního triethanolaminu rtuťnatého.

Příklad 11

Lauroylsarkosinílt rtuťnatý

Způsobem popsaným v příkladu 9 se smísí vodný octan rtuťnatý a lauroylsarkosinát sodný v molovém poměru 1 : 2, čímž se získá čirý, stálý roztok. Komplexní produkt se izoluje odpařením a opakovaným promytím acetonem к odstranění obsaženého octanu sodného ve zbytku po odpaření.

Příklad 12

Způsobem popsaným v příkladech 1 a 2 se připraví komplex četných ligand, které z důvodů uvedených v následující tabulce

III neuspokojují požadavky podle vynálezu.

Tabulka III

Příklad číslo	Ligand
XII	Alanin
XIII	Glycin
XIV	Tris-hydroxymethylaminomethan
XV	Glutamová kyselina
XVI	Asparagin
XVII	DL-a-amino-n-máselná kyselina
XVIII	a-methylaminoisomásehiá kyselina
XIX	2,6-pyridmdikarbí.>xyl.ová kyselina
XX	Nitrolotrioclová kyselina
XXI	Adenin
XXII	Guanin
XXIII
XXIV	Leucin
XXV	m-Drnethyaminobenzoová kyselina
XXVI	Arninornethansu. lfonová kyselina
XXVII	Sulfaminová kyselina
XXVIII	Glycylglycin
XXIX	L-Histidin
XXX	Cytidln
XXXI	Morfolin
XXXII	Thianthren
XXXIII	Methyliminodioctová kyselina
XXXIV	Arginin
XXXV	Ornithin
XXXVI	Lysin

B. Příprava zkušebního zařízení

V následujících zkouškách se připravují různé komplexy způsobem popsaným v příkladu 1 až 11, smíchají se s činidly citlivými na glukózu a posuzuje se jejich vliv na potlačení interferenčního působení askorbové kyseliny. Specifickými používanými. ligandy jsou sarkosin, serin, alanin, pro lín., bicen. a uridin.

Příklad 37

Sarkosinát rtuťnatý

Připraví se zkušební proužky za použití reakčních činidel citlivých na glukózu a sarkosinátu rtuťnatého. Každý zkušební proužek se připraví ve formě obdélníkového polystyrénového proužku, na jehož jednom konci se upevní čtvereček filtračního papíru impregnovaný reakční směsí. Filtrační papír se přichytí oboustranně lepicí páskou.

Pro přípravu tohoto zkušebního zařízení se 5 mm široký proužek filtračního papíru napustí ponořením do prvního napouštěcího roztoku, obsahujícího glukózooxidázu, pePoznámky

Kovová rtuť se vytvoří stárnutím Kovová rtuť se vytvoří stárnutím

Kovová rtuť se vytvoří stárnutím Vytvořená bílá sraženina přechází stárnutím na šedou sraženinu Vytvoří se bílá sraženina

Vytvoří se bílá sraženina

Vytvoří sc oranžová sraženina Vytvoří se bílá sraženina Vytvoří se oranžová sraženina Vytvoří se oranžová sraženina Vytvoří se Černá sraženina Vytvoří se šedá sraženina

Vytvoří se hnědá sraženina.

Vytvoří se bílá sraženina Vytvoří se bílá sraženina Kovová rtuť se vytvoří stárnutím Kovová rtuť se vytvoří stárnuto m Vytvořená, bílá sraženina přechází stárnutím na šedou Vytvoří se kovová rtuť Nevytvoří se žádný komplex

Vytvoří se bílá sraženina

Vytvoří se šedá sraženina.

Vytvoří se hnědá a bílá sraženina. Vytvoří se šedá. sraženina roxidázu, 3,3^<,5,5‘-tetramethylbenzidin a pufr ve vodě.

Impregnovaný filtrační papír se pak nechá uschnout ve vzdušné sušárně při teplotě 50 stupňů Celsia po dobu 30 minut. Po usušení se fitrační papír ponoří do druhého napouštěcího roztoku obsahujícího komplex sarkosinátu rtuťnatého. Po opětném usušení se impre gnovaný filtrační papír upevní podél jedné hrany filmu biaxiálně orientovaného polystyrenu za použití oboustranně lepicí pásky. Útvar, sestávající z filtračního papíru a z filmu, se rozřeže na proužky kolmo ke hraně nesoucí impregnovaný papír. Rozměr proužků je asi 4x5 mm, papír na konci každého proužku je čtverečkem o straně 5 mm.

První napouštěcí roztok obsahuje- tyto složky, které se misí v uvedeném pořadí. (Pokud se v tomto příkladu nebo v dalších příkladech uvádí výraz ,,I. . . ' ¹ . míní se jím vždy ir^ewachcnální jednotka aktivity· enzymu., mikromoly/min použitého substrátu nebo prod'..· kovaného produktu. Podobně se uváděnými g% vždy míní procenta. hmotnost/objem, gramy/100 ml a mg% se rovněž vždy míní procenta ' hmotnost/objem, mg/lOO ml).

3 0 6 5 3

0,05 g

6,0 ml

1,88 ml

2,82 ml

0,5 ml

3,3‘,5,5‘-tetramethylbenzidin aceton citrátový pufr (hodnota pH 5)* tri-glutamátový pufr**

Sterol CA 460 (aniontová povrchově aktivní látka), amoniová sůl kokosového ethersulfátu

Plasdon K—29—32 (polyvinylpyrrolidon)

Gantrez AN—139 (aniontová povrchově aktivní látka poly/methylvinylether) anhydridu maleinové kyseliny askorbová kyselina, hmotnostně 10% vodný roztok glyukozooxidáza, 5 000 I. J./ml křenová peroxidáza, 68 I. J./mg * Roztok citrátového pufru, odděleně připravený, obsahuje 15,4 g kyseliny citrónové a 68,0 g trinatriumcitrátu v 208 ml destilované vody pp Roztok tri-glutamátového pufru obsahuje 45 g glutamové kyseliny a 37,5 g trishydroxymethylaminomothanu v 208 ml destilované vody polyvinylpyrrolidon (K—60 společnosil . GAF Corp.) natrihimdodccylbenzensulfonát

Ninol 2 01.2 (kokoyldiethanolarnid společnosti Stepán Chemical Co.) destilovaná voda

Druhý roztok B obsahující komplex sarkosinátu rtuťnatého se připraví smíšením následujících složek v pořadí, jak jsou uvedeny:

destilovaná voda 20,0 ml oxid rtuťnatý 3,66 g sarkosin 6,03 g

Směs A se přidá do směsi B jakmile veškerý sarkosin a oxid rtuťnatý přejdou do roztoku.

Příklady 38 až 41

Zkušební pásky připravené s jinými komplexy

Opakuje se zkouška popsaná v příkladu 37 pro komplexy dvoumocné rtuti a šeřinu, prolinu, blcenu a uridinu následujícím způsobem:

6,0 ml

1,5 ml

0,05 ml

1,5 ml

0,05 _g

Dcuhý napouštěcí roztok se připraví tak, že se nejdříve připraví dva předběžné, roztoky a smísí se. První takový roztok A se připraví smíšením těchto složek v pořadí, jak jsou uvedeny:

20,0 g 0,8 g 1,5 g
	124,0 ml
příklad 38	serin	l,79g
příklad 39	prolin	2,94g
příklad 40	bicen	2,77g
příklad 41	uridin	4,45g

C. Chování některých zkušebních zařízení po působení tepla

Na zkušební zařízení, připravená způsobem podle příkladů 37 až 41 se působí teplem ke zjištění jejich stálosti. Každý komplex se posuzuje po skladování při teplotě místnosti po. dobu 7 dní a po třídenním uchovávání ve vzdušné sušárně při teplotě 60 °C. Po vystavení působení tepla se každá sada zkušebních zařízení posuzuje ke stanovení

a) schopnosti rozlišovat různý obsah glukózy ve vzorku,

b) jak dalece je stanovení glukózy ovliv něno přítomností kyseliny askorbové.

Připraví se směs A z těchto složek

Pro každou sadu pásků s různými komplexy rtuti se vzorky namáčejí do zkušebních roztoků moči obsahující glukózu. Zkušební roztoky obsahují 0, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 230, 500, 700 a 1000 miligramů glukózy v decilitru roztoku (mg%). Schopnost určité třídy zařízení pro stanovení těchto rozdílných obsahů glukózy se posuzuje za použití zkušebních pásků stárnutých při teplotě místnosti. Vzrůstá-li zabarvení se polyvinylpyrrolidon K—60 10,0 g natriumdodecylbenzensulfonát 0,4 g

Ninol 2 012 0.75g destilovaná voda 62,0 ml

Pro každý komplex se odděleně připraví směs B z 1,83 g oxidu rtuťnatého v 10,00 ml destilované vody s následujícím množstvím ligandu;

.550653 vzrůstající koncentrací glukózy, je zařízení považováno za schopné rozlišovat různý obsah glukózy. Nedochází-li k výraznému vzrůstu, intenzity zabarvení při různém obsahu glukózy, je diferenciační schopnost reakčn.íh.o roztoku rovněž ztlumena.

K posouzení odolnosti zkušebního zařízení proti rušivému působení askorbové kyseliny so zkouší dvě řady glykosových roztoků, jedna řada obsahuje 50 mg%, druhá 100 mg%. Každá řada sestává ze tří roztoků, které vedle glukózy obsahují 0, 100 a 200 mg% askorbové kyseliny. Pro každou řadu zkušebních zařízení nesoucích různý komplex dvojmocné rtuti, se zkušební vzorky ponořují do obou řad glukózových roztoků. Kde barvy odpovídající přítomnosti glukózy jsou stejné nehledě na koncentraci askorbátu krátce po ponoření, je problém interference potlačen a vyřešen, přítomností rtuťnatého komplexu.

Příklad. 4 2

Sarkosínát rtuťnatý

Zkušební zařízení, připravené podle příkladu 37 se po stárnutí při teplotě místnosti po dobu 7 dní zkouší za použití různých shora popsaných glukózových roztoků ke stanovení schopnosti rozlišovat různé koncentrace glukózy. Výsledky zvýšení intenzity barvy jsou: 0 < 10 < 20 < 30 <40 < 50 < 100 < 250 = = 500 --1 000 mg°/o

Zařízení vystavené působení teploty 60 stupňů Celsia, má v podstatě stejnou reaktivitu.

Zařízení, které se nechalo stárnout při teplotě místnosti, se pak zkouší za použití dvou řad roztoků obsahujících 50 a 100 mgproc. glukózy. Každá zkušební řada zahrnuje tři roztoky s rozdílnou koncentrací askorbové kyseliny: 0, 100 a 200 mg°/o. Ve třech roztocích, obsahujících 50 mg% glukózy je barva vyvinutá na pásku v podstatě stejná po 15 sekundách. V glukózových roztocích obsahujících 100 mg% glukózy, je barva téměř stejná po 10 sekundách.

V podstatě stejných výsledků se dosáhne, jestliže se zkušební zařízení s reakčním páskem nechá stárnout při teplotě 60 ^eC po dobu tří dnů.

Příklad 4 3

Serinát rtu ťnatý

Zkušební zařízení se připraví způsobem podle příkladu 38 a zachází se s ním jako v příkladu 42 a zkouší se jako podle příkladu 42. Zařízení, které se nechalo stárnout při teplotě místnosti, poskytuje následující možnost diferenciace obsahu glukózy:

< 10 < 20 < 30 < 40 < 50 < 100 < 250 -- 500 -—1. 000 mg%

U pásků, na které se působí teplotou 60 stupňů Celsia po dobu tří dnů, se nepozoruje pokles odezvy. ·

Pro zkoušení s roztoky askorbové kyseliny a glukózy podle příkladu 42 se zařízení ponoří do 50 mg°/o glukózového roztoku, přičemž je zapotřebí 5 sekund pro vývoj barvy pro měření, zatímco zařízení ponořené do 100 mg% roztoků potřebuje 10 sekund.

P i' í k 1 e, d 4 4

Proliuát rtu tria 1 ý

Zkušební zařízení, připravené způsobem podle příkladu 39 se namáhá a zkouší způsobem popsaným, v příkladu 42. Zařízení se nechá stárnout při teplotě místnosti za vzniku následující schopnosti rozlišovat mezi těmito koncentracemi glukózy:

< 10 < 20 < 30 <40 < 50 <100 < 250 -= = 500 = 1, 000 mg%

Zařízení, na které se nechá působit teplota 60 C po dobu tří dnů, nevykazuje pokles odezvy.

Odolnost proti působení askorbátu zařízení, na které se nechala působit teplota místnosti, ukazuje, že tři 50 mg% roztoky glukózy vyžadují 15 sekund k vytvoření v podstatě měřitelného zabarvení zkušebního zařízení, zatímco 100 m.g% glukózové roztoky vedou k měřitelnému zabarvení po 10 sekundách. Stejná, zkouška se zkušebním zařízením, ' které se nechalo stárnout při teplotě 60 °C po dobu tří dnů, poskytuje stejné výsledky.

Příklad , 45

Sicenát rtu ťnatý

So zařízením podle příkladu. 40 se stejně zachází a toto zařízení se stejně zkouší jako podle příkladu 42. Zařízení,’ které se nechá stárnout při teplotě místnosti, vykazuje následující schopnosti rozlišovat mezi koncentracemi glukózy:

< 10 < 20 < 30 <40 < 50 < 100 < 250 -- , - , 500 -= 1 000 mg%

Zařízení, které se nechá stárnout při teplotě 60 'C po dobu tří dnů, nemá, pozorovatelnou ztrátu rozlišovací schopností.

Odolnost proti působení askorbátu zařízení. na k<oré se nechala působit teplota místnosti, ukazuje, že 50 rog% rozinky glukózy vyžadují 10 sekund k vytvoření v podstatě měřitelné barvy. Podobně 100 mg% glukózové roztoky vedou k měřitelnému za2 5 Ο Β 5 3 barvení za 10 sekund. Stejná zkouška se zkušebním zařízením, které se nechalo stárnout při teplotě 60 °C po· dobu tří dnů, poskytuje stejné výsledky.

Příklad 4 6

Uridinát rtuťnatý

Se zkušebním zařízením podle příkladu 41 se zachází a toto zařízení se zkouší stejně jako podle příkladu 42. Zařízení se nechá stárnout při teplotě místnosti za vzniku následující schopnosti rozlišovat mezi těmito koncentracemi glukózy:

< 10 < 20 < 30 < 40 < 50 < 100 < 250 = == 500 = 750 = 1 000 mg%

Toto zařízení po stárnutí při teplotě 60 stupňů Celsia po dobu tří dnů neodpovídá barevně při koncentraci 10 mg°/o, snadno lze však rozlišit vyšší koncentrace podobně jako se zařízením, které se nechalo stárnout při teplotě místnosti.

Při zkoušení odolnosti proti působení askorbátu vyžaduje zařízení, které se nechá stárnout při teplotě místnosti v 50 mg°/o glukózových roztocích 35 sekund pro vytvoření v podstatě měřitelného zabarvení, zatímco v 100 mg% glukózových roztocích dochází k měřitelnému vývoji barvy za 60 sekund. Stejných výsledků se dosahuje za použití zkušebních pásků, které se nechaly stárnout při teplotě 60 °C po dobu tří dnů.

D. Zkoušky se sloučeninami rtuti známými ze stavu techniky

Provádějí se zkoušky ke zjištění použitelnosti sloučenin rtuti známých ze stavu techniky, které se stávají základem pro srovnání se sloučeninami podle vynálezu. Ze známého stavu techniky se vynálezu nejvíce blíží americký patentový spis číslo 3 411 887 (Ku, označovaný nadále jakožto Ku-patent). V tomto patentovém spise se popisují sloučeniny rtuti, používané k „maskování“ octanu, dusičnanu a chloridu (sloupec 4, řádek 9 a 10·). Tyto sloučeniny se vnášejí do zkušebního zařízení způsobem popsaným v příkladu 1 Ku-patentu (sloupec 6).

Příklad 4 7

Octan rtuťnatý (Ku-patent)

Pro přípravu zkušebního zařízení se formulují dvě směsi. První obsahuje aktivní složky pro stanovení glukózy, druhá obsahuje složky systému pro maskování askorbátu. Systém pro stanovení glukózy obsahuje tyto složky:

orto-tolidindihydrochlorid 2'50 mg glukózová oxidáza 1.,9 g peroxidáza 40 mg želatina 1,,2 g

F, D a C rozpustná červen číslo 3 60 mg pufr obsahující směs 55,5 g bezvodé kyseliny citrónové a 244,5 g triatriumcitrátu mleté dohromady a rozpuštěné v 750 ml vody 30 ml

Při přípravě systému pro stanovení glukózy se postupuje tímto způsobem. Peroxidáza se rozpustí v 5 ml vody a smíchá ,se s 5 ml vodné suspenze glukózooxidázy. Želatina a F, D a C barvivo se rozpustí ve 25 ml vroucí vody a ochladí se na teplotu místnosti. Orto-tolidindihydrochlorid se pak suspenduje ve 12,6 ml 2B alkoholu (to je v 95% ethanolu denaturovaném 0,5 % benzenu) a smísí se s roztokem pufru. Všechny shora uvedené roztoky a směsi se mísí v nádobě a dokonale se promíchají. Papírové proužky o rozměru 5 cm x 6 mm se ponoří do takto připraveného roztoku a suší se na vzduchu při teplotě 100 °C po dobu 9 minut.

Maskovací neboli zachycovací systém obsahuje:

kopolymer vinylpyrrolidonu a vinylacetátu (50 g °/o v ethanolu) 6,5 ml nonoxyl-9-fosfát (10 g % v alkoholu) 0,7 ml dioktylnatriumsu lf osukcinát (25 g % v 2B alkoholu) 0,4ml octan rtuťnatý 8,0 g octan sodný 25,0 g dimethylsulfoxid 91,5 ml

Octan rtuťnatý jakožto zachycovací prostředek se rozpustí v dimethylsulfoxidu a smísí se s roztokem obsahujícím zahušťovací prostředek, smáčedlo a pufr. Tyto složky se pak důkladně mísí až do vzniku homogenního roztoku. Přibližně polovina napuštěných pásků se pak povlékne homogenní směsí obsahující zachycovací systém ponořením pásek do směsi. Pásky se pak suší na vzduchu při teplotě 80 °C po dobu asi 9 minut.

Tato zařízení se pak zkoušejí v moči obsahující koncentrace glukózy od 0 do 1 000 mg% glukózy a zjištěná odezva na celý systém koncentrací. Barevná diferenciace je možná od 10 do 250 mg% glukózy.

Skupina čerstvě připravených pásků se pak uloží v laboratoři do těsně uzavřené láhve obsahující silikagel a molekulární síta. Po jednotýdenním (sedmidenním skladování) za těchto podmínek, se zkušební zařízení opět zkoušejí v čerstvě připravených roztocích glukózy v moči. Neposkytují barevnou odezvu na glukózu i při koncentraci glukózy 1000 mg%. Zařízení nevydrželo skladování při teplotě místnosti za nízké vlhkosti po, dobu jednoho týdne.

250 6 5 3

Příklad 48

Octan rtuťnatý (obměněná příprava)

Jelikož se přípravky podle vynálezu připraví bez použití dimethylsulfoxidu používaného v Ku-patentu, provádí se zkouška jako podle příkladu 47 s tou výjimkou, že se použije 91,5 ml vody místo stejného množství dimethylsulfoxidu. Připomíná se, že v průběhu sušení se začne srážet oxid rtufnatý ze zachycovacího systému na bázi octanu rtuťnatého (asi za 15 minut).

Zkušební zařízení se zkouší stejně jako je popsáno v příkladu 47 a odezva je podobná jak před skladováním, tak po skladování.

Příklady 49 a 50

Chlorid rtuťnatý a dusičnan rtuťnatý

Provádějí se zkoušky jak je popsáno v příkladech 47 a 48, s tou výjimkou, že se při praví oddělené řady pásků za použití chloridu rtuťnatého a dusičnanu rtuťnatého. Použité množství těchto sloučenin v zachycovacím systému a nahrazující 8 g octanu rtuťnatého je 6,8 g chloridu rtuťnatého a 13,4 g dusičnanu rtuťnatého.

Zařízení čerstvě připravené z chloridu rtuťnatého je schopno rozlišovat koncentraci glukózy od 50 do 500 mg%. Po jednotýdenním stárnutí při teplotě místnosti a při nízké vlhkosti jsou pásky bez odezvy i při koncentraci 1 000 mg% glukózy. Zařízení připravené z dusičnanu rtuťnatého je bez odezvy jak bezprostředně po přípravě, tak po skladování.

E. Příprava a vlastnosti směsi schopné určit peroxid vodíku

Příklady 51 až 56

Provede se řada zkoušek ke stanovení účinnosti vynálezu odstranit interferenční působení askorbátu na reakční systém citlivý na peroxid. Připraví se reakční roztok schopný vytvářet modré zabarvení v přítomnosti peroxidu vodíku, obsahující pufrovaný roztok peroxidázy a orto-tolidin v ethanolu. Studuje se jeho schopnost zjistit peroxid vodíku v přítomnosti askorbové kyseliny a různých komplexů dvojmocné rtuti.

Pro přípravu různých rtuťnatých komplexů ve vodě se použije následujících složek, za použití oxidu rtuťnatého nebo octanu rtuťnatého, jak shora uvedeno.

со

СП со сч

со оо

сч со со

гН со о со со ш ю

сч ю

оо сч со СО

О) <О сч °°

со со

00^ °0_л

о. (О сч о со со оо^ сч и сх но LO тН

Q0 ю гЧ

СП сч

о о о гН о о

5 O 6 5 3

Je zřejmé, že směsi podle příkladů 51 až 54 a 56 jsou čirými roztoky, směs podle příkladu 50 je čirá se suspendovanými krystaly, směs podle příkladu 57 má - šedou pevnou sraženinu, ve směsích podle příkladů 58 až 62 je obsažena buď bílá, nebo oranžová sraženina, směs podle příkladu 63 je zakalenou suspenzí a směs podle příkladu 64 vytváří gel.

Zásobní roztok činidel s odezvou na peroxid se připraví smíšením těchto reagencií v uvedeném pořadí:

citrátový pufr (hodnot a pH 5) 100 ml peroxidáza kžřenu (70 I. J./mg ) 100 mg orto tolidin 100 mg ethanol (23A) 25 ml

Alikvotní podíly 1,5 ml každého tohoto roztoku se vnesou do důlků kapkovací destičky, přičemž každý důlek má kapacitu 2,0 mililitrů.

Do 15 důlků obsahujících roztok se přidají 3 μΐ (mikrolitry) 10 g/dl roztoku askorbové kyseliny ve vodě. Důlky se označí čísly 51 až 61, důlek označený 65 a 66 slouží jako kontrolní zkouška bez komplexu dvojmocné rtuti o s obsahem askorbové kyseliny nebo bez obsahu askorbové kyseliny. Konečně 1 μΐ každého ze rtuťnatých komplexů se přidá do příslušně číslovaného důlku.

Po takové přípravě všech 16 důlků se každý naočkuje 5 «1 10% roztoku peroxidu vodíku ve vodě zo míchání skleněnou tyčkou. Po 5sekundovém míchání se každý důlek pozoruje se zřetelem na vývoj modré barvy. Výsledky jsou v následující tabulce.

Příklad číslo

Ligond

Výsledky

51	sarkosin	vytvoří se modrá barvo
52	threonin	vytvoří se modrá barvo
53	šeřin	vytvoří se modrá barva
54	prolin	vytvoří se modrá barvo
55	bicen	vytvoří se modrá barva
56	tnethanolomin	vytvoří . se modrá barva
57		žádné zabarvení
58	glutamová kyselina	žádné zabarvení
59	sulfamová kyselina	žádné zabarvení
60	citrónová kyselina.	žádné zabarvení
61	ethylendiomintetrooctová kyselina	žádné zabarvení
62	glycin	žádné zabarvení
63	N- (2-acetamido) iminodioctová kyselina (ADA)	vytvoří se modrá barva
64	natriumlαurhylsorkosillát	vytvoří se modrá barvo
65	kontrolní (žádný oskorbát)	vytvoří se modrá barva
66	kontrolní (obsažen oskorbát)	žádné zabarvení

Z příkladů 51 až 66 vyplývá, že komplexy podle vynálezu jsou slučitelné s reakčním systémem pro zjišťování peroxidu vo díku a inhibují interferenční působení askorbové kyseliny.

Claims

1. Prostředek pro stanovení přítomnosti hledané složky, například glukózy ve zkoušeném roztoku, například v moči, odolný proti rušivému působení přítomného askorbátu, sestávající z reakčního systému s redoxindikátorem vytvářejícím zjistitelnou odezvu v přítomnosti stanovované složky o ze sloučeniny těžkého kovu, které v Ionizovaném stavu má oxidační potenciál nižší než redoxin0ikátor, avšak vyšší než askor bát, vyznačený tím, že sloučeninou těžkého kovu je ve vodě rozpustný komplex rtuťnatého iontu s alespoň jedním ligondem kovalentně vázaným na rtuťnatý iont, přičemž ligand má vyšší oxidační potenciál než rtuťnatý iont v jeho komplexní formě, a komplex má konstantu stálosti alespoň 10⁷ a je inertní k reakčnímu systému, a re okční systém, obsahuje popřípadě ehromogenní látku.

2. Prostředek podle bodu 1, vyznačený tím, že ligondem je aminokyselina,. například sarkosin, serin, prolin, bicen, threonin, nukleid, sekundární nebo terciární amin, například uridin, trieth^a^niola.min, dietb.anhlαmidl, lauroylsarkosin, močovina, omid nebo fosfin, například trifenylfosfin.

3. Prostředek podle bodu 1, vyznačený tím, že komplexem je sorkosinát rtuťnatý.

4. Prostředek podle bodu 3, vyznačený tím, že jako chromogenní látku obsahuje benzidin, o-loUdin, 3,3⁴,5,5‘-tetraalkylbenzidin s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylovém podílu, N- nebo Ν,Ν-polyalkylem substituovaný benzidin s 1 až 6 atomy uhlíku v a.lkylovém podílu nebo 2,7-diaminofluoren.