JPS6021454A - 過酸化物活性化物質の測定用試験組成物及び試験具 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、試験試料中の過酸化物活性化物質の
測定用分析試験に関し、さらに詳しくは、高い保存安定
性を有する、かかる測定のための改良試験組成物および
試験具並びに、該改良組成物および試験具の製造カニ・
法−および使用方法に関、する。

多くの分析方法が、尿、糞便懸濁液および胃腸内容物の
ような生物学的試料中の過酸化物活性化物質の存在を検
出するために利用できる。ヘモグロビンおよびその誘導
体は酵素ペルオキシダーゼと類似した挙動をするので、
それらはかかる°°過醇化物活性化″物質の典型例であ
る。かかる物質はまた、擬ペルオキシダーゼとも呼ばれ
ている。

すなわち、それらは、過酸化物類と、ベンジジン、０−
トリジン、３．３’、５，５°−テトラメチルベンジジ
ン、２，７−ジアミツフルオレンまたはそれらに類似し
た物質のような指示薬化合物との間のレドックス反応の
触媒として働き、それによって色の変化のような検出可
能な応答を生ずるという点で酵素に類似している。例え
ば、尿中潜血の存在を４１１定するためのほとんどの診
断試験はこの擬ベルオキシグーゼ活性に基づく。

分析試験法はここ何年かにわたって、呈色指示薬を過酸
化物によって酸化する際の酵素様触媒作用に基づいてい
るが、この分析試験法としては、湿式化学法または溶液
法、およびいわゆる゛浸漬−読取り°′型試薬含有細片
試験具がある。前者のうち、典型例は、リチャード・エ
ム・ヘンリー（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｍ、　Ｈｅｎｒｙ）等
、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＰｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、第２版、
（ハーゲルスタウン、メリーランド：ハーバ−およびロ
ー（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ：Ｈａ
ｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗ）、　１９７４）＋１２４−
１１２５頁に述べられている。この方法には、氷酢酸（
緩衝剤）、ジフェニルアミン（指示薬）および過酸化水
素を用いる。かかる湿式法は分析上の有用性を立証して
きたが、それにも拘らず、それらは、試薬の安定性が低
く感度が適切でないというような欠点をも有する。

過酸化物活性化物質の測定のための別の方法で、現在多
くの臨床検査技師に好まれているものでは“浸漬−読取
り′°固相試薬細片試験具を用いる。かかる試験具の典
型的なものは、ヘマスナックス（ＨＥＭＡＳＴＩＸ”　
）の商標名で、マイルス・ラボラトリーズ会インコーポ
レーテンドのエイ１１ズ・ディビジョン　（ＡＩＩｌｅ
ｓ　［１ｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）より市販されているもノテ
ある。それらは本質的に、プラスチック細片または把手
に固着された多孔性の紙マトリックスよりなる。このマ
トリックスは有機ヒドロペルオキシド、例えば、クメン
ヒドロペルオキシドと指示薬化合物の緩衝化混合物で含
浸される。ヘモグロビン、ミオグロビン、赤血球または
他の擬ペルオキシダーゼのような分析対象物を含有する
液体中に浸漬すると、マトリックスに青色が発現し、そ
の強さは試料中の過酸化物活性化物質の濃度に比例する
。マトリックスに発現した色を標準カラーチャートと比
較することにより、検査技師は、゛ト定量的ベースで、
存在する分析対象物の量を測定することができる。

試薬細片は湿式化学法に比べて多くの有利性を有してお
り、例えば、試薬調製も付属装置も必要としないので遥
に使いやすく、また試薬が乾燥した固体状態なので試薬
の相対的安定性が大きく。

結果として精度、感度および経済性が改良される。しか
しながら、従来の、現在利用しうる試薬細片試験具の多
くは保存寿命が限定されるという重大な欠点がある。す
なわち、製造後長期間にわたる保存安定性が欠如し、試
験具を実際に使用する際、過酸化物活性化分析対象物の
存在に対する反応性が著しく減少する結果となる。すな
わち、試薬細片のような分析具は、通常、製造直後には
使用されず、使用までの保存期間がまちまちであるため
に、かつ、従来の試薬細片の製造と使用との間の期間が
あまりに長く、反応性が著しく失われる結果となり、そ
れに伴って誤った負の試験結果を導くために、高い保存
寿命は著しい長所となりうる：保存寿命が長ければ長い
ほど、分析結果の信頼性は高いものとなる。

過酸化物活性化物質、例えば、尿中の潜血またはヘモグ
ロビンを測定するための従来の固相試薬細片試験具では
、通常、指示薬系として、有機ヒドロペルオキシド、例
えば、クメンヒドロペルオキシドによる、ポルフィリン
を触媒とするベンジジン系指示薬、例えば、０−トリジ
ンまたは３．３’　、５，５°−テトラメチルベンジジ
ンの酸化が利用されている。しかしながら、このような
従来の試験細片は、長い保存期間中または高温での保存
中に反応性を喪失する傾向が特にあることが知られてお
り、この現象は、細片の１またはそれ以上の試薬成分の
蒸発または化学分解に因るものと信じられている。雰囲
気温度で保存されたこのような従来の試薬細片において
、反応性の実質的低下が観察されるばかりでなく、高温
での保存によって、これらの低下は著しく強調され、か
つ、低下の割合も加速されるようである。試薬細片中の
反応性の低下についての説明としては次のものが可能で
ある：（１）試薬組成物の主成分が分解または蒸発して
、成分濃度が適切な反応性を維持するのに必要な最低濃
度以下に落ちる；および　（２）細片中の２またはそれ
以上の成分が有害な相互反応を行って、反応性のないま
たは妨害性のある１またはそれ以上の新しい種を生成す
る。

試薬組成物、およびそれから製造される過酸化物活性化
物質測定用の固相細片試験具の反応性を安定化する試み
は種々のアプローチをたどってきている。例えば、アダ
ムス・ジュニア　（Ａｄａｍｓ　。

Ｊｒ、）等の米国特許第３，０９２，４８３号は体液中
の潜血を検出するための改良試験組成物および試験具を
開示している。この組成物は、コロイド物質製の微小球
状の泡中にカプセル化またはトラップ化された有機ヒド
ロペルオキシド、有機ヒドロペルオキシドからの酸素の
移動を受容してヘモグロビンの補欠分子族の触媒作用に
より誘起される呈色応答を生ずることのできる指示薬ま
たは色素前駆体、および試験される物質のｐＨを４から
６．５の範囲に維持するだめの緩衝剤よりなる。この特
許は、コロイＩ・物質、例えば、ポリビニルアルコール
、七′ラチン、アラビアゴムまたはカルボキシビニルポ
リマーにより、該組成物より製造された試験具の好まし
い実施態様での反応性を、７５°Ｃで３００時間の保−
存後でさえも安定化することができ、それに対してヒド
ロペルオキシドのカプセル化なしに製造した同様の試験
具は５０°Ｃで２４時間後にはかなりの反応性が失われ
ることを開示している。

安定化された試験組成物および試験具に関する別の開示
としては、アダムスｅジュニア（Ａｄａｍｓ　。

Ｊｒ、’）等の米国特許ｖＪ３，２５２，７［１２号の
アプローチがあり、そこでは、有機ヒドロペルオキシド
が、ジアルデヒド多糖類で固定することによって硬化さ
れたゼラチンのようなコロイド状物質中にカプセル化さ
れている。このようにカプセル化されたヒドロペルオキ
シド、適切な指示薬および緩衝剤を含有するかかる組成
物は、種々の悪影響のある温度条件のもとで高い安定性
を示すといわれている。

試薬細片試験具の安定化についての、更に別に開示され
た試みとしては、Ｃｈｅｍｉｃａｌ＾ｂｓｔｒａｃｔｓ
８５＠　、１８Ｂ頁（１９７Ｂ）の詳説があり、これは
、ｏ−トリジンおよびフェニルインプロピルヒドロペル
オキシドを含有する試薬細片を製造するための２段階−
浸漬法について述べている。この開示は、指示薬（ｏ−
トリジン−２ＨＣ１）およびポリビニルピロリドンのエ
タノール溶液を調製することを報告している。この溶靜
に少量の界面活性剤および十分な量のクエン酸塩緩衝剤
を添加して、ｐＨを３．７とし、その後エチル・セルロ
ースを含浸せしめたろ紙細片をこの溶液に浸漬し乾燥し
た。この含浸ろ紙を、次に、エタノール−トルエン混合
物中に溶解した１、４−ジアザビシクロ［２，２，２］
−オクタン、フェニルイソプロピルヒドロペルオキシド
およびポリビニルピロリドンを含有する第２溶液中に浸
漬した。この作業の目的はビシクロオクタン誘導体およ
びポリビニルピロリドンの使用により、ペルオキシドお
よび指示薬の組合せを安定化することであった。

同様の方法が米国特許第３，８５３，４７１号に開示さ
れている。この特許は、その置換アミド基が主にＮ−モ
ルホリン基であるリン酸アミド類またはホスホン酸アミ
ド類の使用を開示している。

試薬組成物を安定化するための別のアプローチとしては
、ヒドロペルオキシドおよび指示薬に加えて１種々の稀
釈側化合物、例えば、ジメチルスルホンおよびＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミドの４１．１合物を用いる米国特許
第４，０７１，３．１７号；同第４．０７１，３１８号
（ホウ酸エステル類の使用）；および同第４，０７１，
３２１号（稀釈剤およびホウ酸エステル類の両者の使用
）がある。

これらの一般概念にとって関連する別の参考文献として
は、触媒および酸化剤として用いられる有機ヒドロペル
オキシド類の安定化に向けられている米国特許第３，２
３８，８５０号がある。この参考文献は有機過酸化物と
共に一級、二級または三級アミン塩を使用することを開
示しており、固相試薬細片試験具の安定性の問題には向
けられていない。

アルキルヒドロペルオキシドの熱分解反応についての研
究はジェー・アール・トーツス（Ｊ、　Ｒ。

Ｔｈｏｍａｓ）　、　Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅＩ＋＋、　
Ｓｎｃ、、　１０１巻、　２４８−２４８頁（１１３５
５年）に述べられている。炭化水素溶液中での４つの異
なるヒドロペルオキシドの分解速度を、温度の関数とし
て測定した。フェニル−１−ナフチルアミンを溶液混合
物に包含させると、ヒドロペルオキシドの消滅速度が減
少することが観察された。更に、ジェー・アール・トー
ツス（Ｊ、　Ｒ，Ｔｈｏｍａｓ）及びオー・エル・バー
ル（０，Ｌ。

Ｈａｒｌｅ）、Ｊ、　Ｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｍ、、　ｆｉ
３巻、１０２７−１０３２頁（１９５９年）はテトラリ
ンヒドロベルオキシトの分解速度に対する溶媒の影響に
ついて検討している。これらの研究では、フェニル−１
−ナフチルアミンが、ヒドロペルオキシドの分解におけ
るラジカル連鎖反応を阻止するためのラジカル・トラッ
プとして用いられることが開示されている。

これら−上述の論文は、直接、固相試薬細片試験具の安
定性の問題に向けられていない。先に報告した研究のす
べては、固相状態ではなく溶液中で行われたもので、こ
の固相状思１は、細片試験具に従来用いられるヒドロペ
ルオキシドの状態である。更に、細片試験具に典型的に
用いられる溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド及びア
セトンは、この文献に述べられている溶媒、すなわち、
医療用白油、オクタン、デカン、シクロヘキサン及びデ
カリンとは実質的に異なる。また、試薬細片は、ヒドロ
ペルオキシドとばかりではなく、また他の細片成分とも
相互反応して悪影響を与えるｉｉ）能性を潜在的に有す
る試薬を典型的に含有する。

したがって、溶液化学法と比べて固相試薬細片試験几固
有の分析上の利点、および−ヒ記細片試験共の反応性の
安定化についての従来技術における先に例示した利点に
も拘らず、後者の安定特性は、特に、過酸化物活性化物
質の測定用試験具の場合には、なお、更なる改良を必要
としている。

現在の技術水準の、過酸化物活性化物質測定用固相組成
物および試験具の性質は湿式化学法によるものおよび安
定性向上技法を全く含まないものより大幅に高められて
いるが、それにも拘らず、長期の保存中、より安定にす
ることができ、かつ、かかる長期間の保存後も過酸化物
活性化分析対象物に対して、適切な感度を保持して、“
誤った負の°′結果を排除することができれば著しく右
利なものとなるであろう。好ましくは、このことは、カ
プセル化による試薬の隔離、またはかかる組成物および
試験具の、同様の比較的複雑かつ高価な処理を必要とせ
ずに達成きれるべきである。例えば、市販品として容易
に入手可能であり、使用するのが経済的であり、固相試
験組成物および試験具に用いられた他の従来の試薬／指
示薬系に対して適切な感度を有し、同時に、長期の保存
中、これら組成物および試験具を実質的により安定にす
ることができる適切な安定剤を提供することができれば
有利となるであろう。

過酸化物活性化物質測定用の従来の固相試薬組成物およ
び試験具の、保存安定性もしくは”保存寿命”の欠如を
もたらす、反応性の低下がしばしば観察されるが、これ
は試薬細片中に用いられる有機ヒドロペルオキシドの喪
失および／または化学分解に主に起因するものと現在仮
定されている。かかる喪失または分解は、例えば、ヒド
ロペルオキシドの分解または蒸発、または他の細片成分
との化学相互反応から起こることがあるだろう。しかし
なから、悪影響を与える相〃反応に起因する崩壊がほと
んどの反応性低下の理由となるであろうが、かかる相互
反応を引起す機構は現在解明されていない。

かかる試薬系にある種のアニリン化合物を有利に包含さ
せることによって、現在の技術水準である、はぼ慣用の
過酸化物活性化物質測定用の固相試薬系を実質的に改良
し、かつ、かかる慣用系の前述の安定性についての問題
を大幅に克服することができることが現在発見されてお
り、かつ本発明はこの発見に基づくものである。このよ
うなアニリン類は、固相試験において通常用いられる有
機ヒドロペルオキシドの結合鎖分解に対する阻害剤とし
て機能するばかりではなく、また、試薬間の、悪影響を
与える相互反応を減少もしくは防止するのに有利である
と信しられている。更に、試薬の隔離等のような従来公
知の多くの安定化技法と比較すると、これらのアニリン
類を使用すれば経済的であり、その結果の信頼性も高い
。

前述のように、過酸化物活性化物質測定用の従来の試薬
系は、一般に、有機ヒドロペルオキシドおよびｏ−トル
イジンまたは３，３°、５，５−テトラメチルベンジジ
ンのようなレドックス指示薬よりなる。過酸化物活性化
分析対象物は、酵素ベルオギシダーセに似た挙動をする
ので指示薬および有機ヒドロペルオキシドの間の反応に
おいて、触奴として働くか、さもなければ指示薬と有機
ペルオキシドとの反応に関与して、呈色し、その強度が
分析対象物の濃度を示唆するものである。従来の分析試
薬系とは異なり、本発明によれば、試験試料中の過酸化
物活性化物質を測定するための改良分析組成物が提供さ
れる。該組成物は、有機ヒドロペルオキシド、並びに該
有機ヒドロペルオキシドおよび過酸化物活性化物質の存
在下で検出可能な応答をなすことができる指示薬より成
るばかりではなく、また、式： 式中、Ｒ１およびＲ２は、同一であっても異ってもよく
、水素、炭素数ｌないし６個の低級アルキル、フェニル
、α−ナフチルまたはβ−ナフチルであり、Ｘｉまたは
×２のいずれかは水素、ＮＯ２、ＮＯ２マタはＮＯテあ
り、ｘ１マタはＸ２の他方は水素である、 で示されるアニリンをも含有する。

先のクラスの化合物から使用のために選択ｙれうる好ま
しいアニリンとしては、フェニル−１−ナフチルアミン
、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、０−フェニレンジアミン
、Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−ニトロアニリン、ｐ−二トロ
アニリンおよびそれらの混合物が挙げられ、最も好まし
いものはフェニル−１−ナフチルアミンおよびこの化合
物と列挙した他の化合物との混合物である。

本発明はまた試験試料中の過酸化物活性化物質を測定す
るための改良分析試験具をも提供する。

該試験具は、好ましい実施態様においては、本発明の改
良組成物を包含せしめた担体マトリックスよりなる。適
切なアニリン、または適切なアニリンの混合物を、組成
物中において、他のほぼ慣用的な成分と組合せて包含さ
せることによる総体的効果によって、反応性を、有意に
安定させることができ、従来の固相試験と比較して、特
に、優れた“保存寿命″をもたらすことが信じられてい
る。更に、本発明により、試験試料中の過酸化物活性化
分析対象物の存在に対する優れた感度を保持することが
可能となり、それは予期しないことであったが、従来の
試験の保持力に匹敵する。

更に、本発明は該改良分析具の使用法ならびにその製造
法を提供する。好ましい実施態様においては、該試験具
は分析下の液体試験試料中にそれを侵漬し、過酸化物活
性化分析対象物の存在に対して、そこに生じた、色の変
化のような検出可能な応答を観察することにより用いら
れる。好ましくは、本試験具の製造法は、担体マトリッ
クス、例えば、多孔性の紙に、試薬および他の組成物成
分からなる２以−１−の溶液または懸濁液を包含せしめ
ることよりなる。

本発明の開発に当っては、従来公知の方法論に頼らずに
、従来の固相試薬組成物および試験具の前述の安定性に
関する問題を克服するための試みが行われた。この目的
のために、アニリン化合物類を市販品より得た。得られ
た化合物は従来典型的に用いられる種々の有機ヒドロペ
ルオキシド上に安定化効果を付与することができると思
われる芳香族環」−の置換基を示唆している。しかしな
がら、このような安定化をもたらす機構は現在、まだ解
明されていない。

したがって、本発明の試験組成物および試験具に用いる
のに適切であると決定されたアニリンとしては、非置換
アニリン、一般式： 式中、Ｒ１およびＲ２は、同一であっても異ってもよく
、水素、炭素数１ないし６個の低級アルキル、フェニル
、α−ナフチルまたはβ−ナフチルであり、ｘｌまたは
ｘ２のいずれかは水素、ＮＯ２、ＮＯ２またはＮＯであ
り、ＸｌまたはＸ２の他方は水素である、 で示される、モノ−およびジー置換アニリン、およびそ
の混合物が挙げられる。

したがって、本発明によれば、適切な、好ましいアニリ
ンとしては、フェニル−１−ナフチルアミン、Ｎ、Ｎ−
ジメチルアニリン、０−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−
ジメチル−３−ニトロアニリン、ｐ−ニトロアニリン、
およびそれらの混合物が挙げられる。本発明において、
有利に利用されうる他の適切なアニリンとしては、Ｎ、
Ｎ−ジエチルアニリン１、ｍ−ニトロアニリン、および
Ｎ、Ｎ−ジメチル−４−ニトロアニリンがある。また、
前述の化合物の混合物のみならず、構造式で説明した化
合物のクラス内のそれらおよび他のものも種々の比率で
有利に使用することができる。

したがって、フェニル−１−ナフチルアミンおよびＮ、
Ｎ−ジメチルアニリンが現在最も好ましく、フェニル−
１−ナフチルアミンが最も望ましいが、ここに、構造式
を定義したような、すべての化合物は本発明に使用する
のに適切である。本発明に使用するために、いずれかの
適切な特定のアニリンを選択することは、この開示を与
えられた、普通の当業者の能力内の通常の選択に任され
るべき事柄である。

本発明に用いられる適切なアニリン類は、市販されても
おり、また、はぼ慣用有機合成法を用いて市販材料から
通常の技術者により容易に合成することもできる。例え
ば、実施例（後出）において示したフェニル−１−ナフ
チルアミンのようなアニリン類はイーストマン・コダッ
クーカンパニー（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍ
ｐａｎｙ）より入手できる。

本発明の組成物および試験具にについての具体例におい
て用いられる特定のアニリンまたは混合物の量は、本発
明の有利性を達成させるために、決定的に重要なことで
はなく、本技術の観点からの、当業者の日常的な選択に
任される事柄である。例えば、ヒドロペルオキシドの分
解を阻害し、かつ、悪影響をもたらす試薬間の相互反応
を妨害するのに必要な、固相における化学反応および化
学変化をおこさせるのに十分な量を選択するであろう。

このことは、例えば、□用いたヒドロペルオキシドの濃
度および形次第で、□組成物を安定化し、特定の分析情
況において要求される程度に過酸化物活性化物質の存在
に対して反応性を付与するに適切な量となるであろう。

したがって、例えば、望まれる、または必要な安定性は
、分析試験が、分析対象物についての、半定量測定また
は定量測定のいずれのためのものであるか、または保存
の期間もしくは保存温度が過酷な促進作用を有するよう
に意図されているかというような要素によって、かなり
変動することがある。かくして、かかる、アニリンもし
くは混合物の濃度は、好ましくは、試験具を調製するた
めに用いられる溶液の最終容量巾約０．０２モル（Ｍ）
である。典型的な実施態様において、かかる試験共は、
ｌデシリットルあたり　０．０４５ミリグラムの低濃度
の尿中ヘモグロビン（潜血）を測定するための分析具と
して、更なる操作を加えることなく即時使用（ｏｆｆ−
ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ　ｕｓｅ）に伺される。しかしなが
ら、本発明によって製造された組成物および試験具に存
在するであろう特定のアニリンのノーは広範囲に変動し
てもよく、かつ、ここに述べたように、本発明の教示に
従って、広範囲に変動するＩｇの上記化合物を利用する
ことにより、従来の調製物の安定性および感度を実質的
に改良することができることを認識すべきである。

先に示したように、安定剤として、適切なアニリンまた
はアニリン類の混合物を包含する本発明の試験組成物は
、更に、少なくとも１つの有機ヒドロペルオキシド、並
びに該有機ヒドロペルオキシドおよび過酸化物活性化物
質の存在下で検出可能な応答をなすことができる指示薬
物質を含む。

このような検出可能な応答は、目視によるか、または計
器手段によって検出可能な、色の変化または他の応答で
あることもある。

本発明の組成物および試験具は、ｏ、０４５ｍｇ／ｄＬ
のような低濃度の尿中ヘモグロビンの存在下において、
目視または計器によって検出可能な応答、例えば、呈色
応答を生ずることが判明している。しかしながら、ヘモ
グロビンの検出のためのこのような利用の他に、本発明
の組成物および試験具により検出することができる他の
過酸化物活性化物質としては、例えば、ベルオキシター
ゼ、ミオグロビン、赤血球、および他の擬ベルオキシダ
ーセがある。更に、このような物質は、本発明の実施態
様により、尿中ばかりではなく、また胃腸内容物、を髄
液、工業廃水、水泳用プール等のような多くの他の物質
中においても検出することができる。

本発明に使用することが期待される有機ヒトロペルオキ
シドは、多くの周知の有機ペルオキシド類から選択する
ことができる。しかしながら、選＋１．！　”れたもの
は、適切な指示薬の存在下で過酸化物活性化物質と相互
反応して、色の変化又は試験Ｍ１成物による光の吸収量
もしくは光の反射量の変化のような検出可能な応答を生
ずることが可能でなければならない。特に適切なヒドロ
ペルオキシド類としては、クメンヒドロペルオキシド、
ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソプロピルベンゼ
ンヒドロペルオキシド、２．５−ジメチルヘキサン−２
，５−ジヒドロペルオキシド、パラメンタンヒドロペル
オキシド及び用いた指示薬を酸化することができる他の
周知のヒドロペルオキシド又はそれらの化合物の混合物
が挙げられる。前述したものの中では、クメンヒドロペ
ルオキシドが最も好ましい。

有機ヒドロペルオキシド及び過酸化物活性化物質の存在
下で、相互反応して、検出ｔＪ（能な応答を生ずること
ができさえすれば、多くの指示薬が本発明に使用するの
に適切である。これらのものとしでは、例えば、いわゆ
る“ベンジジン系゛化合物、すなわち、ベンジジン、０
−トリジン、３．３°、５．５−テトう（低級アルキル
）ベンジジン、２．７−ジアミツフルオレン及びこれら
の混合物又は種々の他のものが挙げられる。ここで用い
られる用語゛低級アルキル″は、メチル、エチル、ｎ−
プロピルおよびイソプロピル、並びに種々のブチル、ペ
ンチルおよびヘキシル異性体をはじめとする、■ないし
６個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。しかし
ながら、指示薬として最も好ましいものは、３．３’　
、５．５’−テトラメチルベンジジンである。

好ましい実施態様においては、本発明の改良試験組成物
を担体マトリックス上に包含するか、または担体マトリ
ックスに包含せしめて、固相”浸漬−読取り”試験具を
製造する。かかる本発明の試験具は、試験組成物の溶液
を吸収剤マトリックス材に含浸させ、ついで、含浸マト
リックスを乾燥して、微細かつ均一な組成物成分の混合
物をこのようにマトリックス内に包含させることを含む
種々の周知の方法により製造することができる。

用いることができる適切な担体マトリックスとしては、
紙、セルロース、木１合成樹脂フリース、ガラス繊維紙
、ポリプロピレン・フェルト、不織ＩＩｊまたは織布等
を挙げることができる。担体マトリックスとして、本発
明に用いるのに最も適切で好ましいものは、ろ紙のよう
な多孔性の紙である。しかしながら、担体マトリックス
として用いるのに適切な材料の選択は当業者の通常の選
択に任される事柄であり、マトリックスは種々の物理的
形態をとることができ、それらのすべては本発明の範囲
内のものとされることを認識すべきである。

本発明による試験具の製造の最も好ましい方法は、二溶
液法でマトリックスを含浸する方法である。このような
好ましい方法においては、組成物成分を共に２つの別々
の溶液または懸濁液に混合し、続いて、この溶液にマト
リックスを含浸または侵清し、ついで、各含浸毎に取出
し乾燥を行なう。最終的な含浸（好ましくは、アセトン
のような適切な有機溶媒とのアニリン溶液又は懸濁液へ
の含浸）及び最終的な乾燥に続いて、乾燥された含浸マ
トリックスは次に、両面粘着テープのような適切な手段
により、担体部材の一端に固着させることができる。こ
の担体部材は、例えば、ポリスチレンのような長方形の
プラスチック細片よりなることができる。マトリックス
が固着されていない、細片の他端は、この場合、試験具
を使いやすくするために把手として働く。

試験反応に積極的に関与する前述の試験組成物成分に加
えて、用いられた指示薬を分散させるための溶媒、増粘
剤、湿潤剤、緩衝液、乳化剤および他の周知のアジュバ
ントのような更なる成分もまた本発明の組成物に含有さ
せることができる。

すなわち、例えば、増粘剤としては、ゼラチン、アルギ
ン、カラゲーン、カゼイン、アルブミン、メチルセルロ
ース、ポリビニルピロリドン等のような種々の材料を用
いることができる。湿間剤としては、Ｆデシル硫酸ナト
リウムが好ましいが、スルホコハク酸ジオクチルナトリ
ウムまたはドデシルペンｉンスルホン酸ナトリウムのよ
うな長い鎖状有機硫酸塩またはスルホン酸塩もまた用い
ることができる。緩衝系としては、酒石酸塩、リン酸塩
、フタル酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、またはコハク耐塩
又は他の従来の緩衝剤を用いることができる。Ｈ’０７
系はクエン酸ナトリウム及びクエン酸からなることが好
ましく、組成物は約５．５から７．０のＰＨ値に緩衝化
されることが好ましい。乳化剤としては、ポリビニルア
ルコール、アラビアゴム、カルボキシビニルポリマー等
を用いることができる。

指示薬と同時にアニリン化合物を懸濁するのに有用な有
機溶媒としては、ジメチルホルムアミド、アセトン、ク
ロロホルム、二塩化エチレン、ベンセン、酢酸エチル等
のような、はとんどの非反応性で、低沸点（約１５０℃
以下）の蒸発性有機溶媒、またはそれらの混合物を挙げ
ることができる。適切ではない溶媒としては、オクタン
、デカン、デカリン、および比較的非蒸発性の他の溶媒
（すなわち、沸点が約　１５０℃より高いもの）が挙げ
られる。本発明に用いるための特定の溶媒は、容易に蒸
発し、したがって固相試薬試験具の製造の際の乾燥工程
において実質的に除去されうる性質に基づいて選択され
ることが重要であり、これは、用いた溶媒の残渣が大量
に担体マトリックス中に残留して、試験具を過酸化物活
性化物質の測定のために用いた場合、試験具の反応性を
阻害することがないようにするためである。その他の点
では、個々の溶媒゛の選択は１本開示を受けた普通の当
業者により容易に行われることである。

６−メドキシキノリンのような他の試薬、または、他の
、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性に対する活性化
剤もまたここに開示した組成物に使用することができる
。

使用に当っては、固相において、本発明の組成物を包含
する、含浸しかつ乾燥した、試験具のマトリックスを、
試料液体または試験されるべき物質の液体懸濁液中に浸
漬し、ついで、直ちに、引上げることができる。過酸化
物活性化物質が存在する場合は、マトリックスに包含さ
れた固相試験組成物を試料と接触させると、正の検出可
能な応答、例えば、マトリックス中に発現する呈色反応
を生じる。試料中に含まれる過酸化物活性化物質φにつ
いての定量的評価のために、この呈色応答を、次に、予
め検量された標準色と比較することができる。非溶血赤
血球細胞のような非処理の過酸化物活性化物質はマトリ
ックス上に点もしくは斑点状の色として現われる。溶崩
赤血球細胞はマ（・リンクスを一様に着色することがで
きる。目視比較に加えて、種々の計器による手法を用い
、それにより人間の眼の主観的測定を排除することによ
り、試験の精度を高めることができる。

本発明の試験具は、溶液中ばかりでなく又糞便、胃腸内
容物等のような固相または半固相物質中の過酸化物活性
化物質の測定にもまた用いることができることを認識す
べきである。すなわち、例えば、固相または半固相物質
の薄層を試験具の担体７トリツク、スに塗布し、色の変
化のような検出可能な応答をマトリックス中で観察する
ことができる。

改良された本発明の試験組成物および試験具は、従来の
試験組成物および試験具に比べて安定性が高いという点
で有利なばかりではなく、また感度が高い。好ましい実
施態様においては、本発明の試験組成物は０．０４５＋
ｅｇ／ｄＬの低濃度の尿中ヘモグロビンを検出すること
ができることが判明しており、これは１　：　１．００
０．０００の血液稀釈に相当する。この感度の程度は、
真に予期しなかった有利性であり、過酸化物活性化物質
のための多くの従来の技術水準の試験の感度に匹敵する
ものであり、本試験組成物において、安定剤として妥当
かつ適切なアニリン化合物を包含させることが、悪影響
を与える保存および温度促進下での反応性を安定化する
のに有利であるばかりではなく、また、上記物質を検出
するためにそこに用いた試薬系の機能に対して有害では
ないことを立証している。

本発明によれば、試験具のマトリックスへ包含させるた
めの組成物の配合に際しては、好ましい実施態様におい
て、アニリン化合物を先ず適切な有機溶媒１例えば、ジ
メチルホルムアミドもしくはアセトン、またはそれらの
ａ０合物および／または他の溶媒に懸濁および／または
溶解し、その後浸漬および乾燥によりマトリックス中に
含浸させて、前述のようにマトリックスにアニリンを包
含させることができる。

組成物の残りの成分もまた様々な方法でマトリックスに
包含させて試験具を形成することができ、本発明による
前記試験具の°製造は、したがっていかなる特定の方法
に限定されるものではない。例えば、残りの成分は、水
と、ジメチルホルムアミド、アセトン、エタノール、ま
たはそれらの混合物のような適切な溶媒１種以上との混
合物に溶解または懸濁することができ、上記溶液または
懸濁液を用いて、同様にそれらの成分をマトリックスに
含浸させることができる。また、担体マトリックスは、
例えば、ドクター・ブレードで組成物を塗布するか、イ
ンキとしての組成物を包含せしめることができるが、そ
の場合試薬はマトリックス上に印刷される。

試験具を製造するための、現在好まれている方法の１つ
は、２つの別々の、組成物成分の溶液または懸濁液を順
次ろ紙に含浸することであり、好ましい溶媒は蒸留水ま
たは脱イオン水、ジメチルホルムアミド（ＩＩＭＦ）お
よびアセトンである。このような含浸は、１枚のろ紙を
緩衝液、湿潤剤および他の非試薬成分の水溶液、ＤＭＦ
中のヒドロペルオキシド並びに指示薬に浸漬し、空気炉
中でろ紙を乾燥し、続いてアセトン中の、アニリン化合
物の第二溶液に前記乾燥ろ紙を浸漬し、最後にこのろ紙
を乾燥することにより、達成することができる。試験具
を完成させるために、次に、乾燥ろ紙を一辺約０．６セ
ンチメードル（ｃｍ）の正方形に裁断し、これを約（１
８ｘｌＯｃ＋ｓのポリスチレン・フィルム細片の一端に
貼付する。貼付は、スリー・エム・カンパニー（３Ｍ　
Ｃｏｍｐａｎｙ）より市販されているような、両面接着
剤テープを使用して達成される。

本発明の試験具を製造するための現在の最も好まれてい
る方法は、緩衝剤、湿潤剤等からなる組成物成分を含む
第一水溶液を調製し、次に、　ＤＭＦ中の、ヒドロペル
オキシドおよび指示薬試薬からなる第二有機溶液を調製
することである。次に。

これら２つの溶液を混合し、次いで、混合溶液にろ紙マ
トリックスを浸漬もしくは含浸し、乾燥させる。乾燥マ
トリックスは、それからアニリンと適νＪな溶媒を含む
第三溶液に浸漬する。試験具はそこで」−述のように完
成される。

笈崖１ 次の実施例は、本発明の概念および有利性を更に示すた
めに用意された。実施例は、本発明の試験具をいかに製
造し、いかに使用するかを説明することを意図しており
、その範囲を制限するものと理解すべきものではない。

ここで表わされるすべての百分率（パーセント）は、＠
に断わらない限りｆｆ１ｆｉｔパーセントである。

次の成分を、列挙した順で混合することにより第一含浸
溶液を調製した： ５０ミリリツトル（ｍｌ）の茂留水 ２．７７ｇのクエン酸、　ｐＨ６・８ ６．８７ｇのホウ酸トリ エタノールアミン、　０．４　Ｍ家 １．０ｇ　のドデシル硫酸ナトリウム；　１．ＯＣＯ，
０６７ｇ　のエチレンジアミン四酢酸第二溶液を次のも
のを混合することにより調製した： ５０１　のジメチルホルムアミド ０．４１の６−メドキシキノリン；　０．４Ｃ４，０ｍ
ｌのクメンヒドロペルオキシド０、Ｅ１０４ｇの３．３
’、５．５°−テトラメチルベンジジン；　０．０３Ｎ
攻 （１１０８ｇのオレンジＧ　染料 第三溶液を次の成分を混合することにより調製した： ０．４３９ｇ（０，０２Ｎ）のフェニル−１−ナフチル
アミン １００．０ｍｌのアセトン 禾：混合溶液中の成分の最終濃度 第−溶液を第二溶液と十分に混合し、１枚の実験室用ろ
紙［（ワットマン・スリーエムエム（Ｗｈａｔｍａｎ　
３ＭＭ）］を混合溶液に浸漬（含浸）し、ろ紙を取出し
、次いで空気炉中１０５℃で約８分乾燥することにより
、ろ紙に組成物を含浸せしめた。

次に、この乾燥ろ紙を第三溶液に浸漬し、空気炉ｒｌ＋
７Ｑ°Ｃで５分間乾燥させることにより、このろ紙に第
三溶液を含浸させた。このようにして、３つの溶液の成
分からなる組成物を、後の乾燥に続く固相状態で、ろ紙
に包含させた。組成物をこのように包含せしめて、試験
マトリックスを形成した乾燥含浸紙を、０．６センチメ
ードル（ｃｍ）平方に裁断し、約０．６　Ｘ　１０ｃｍ
のポリスチレンフィルム細片の一端に、両面接着剤テー
プ［スリーエムφカンパ＝　−（３Ｍ　Ｃｏｍｐａｎｙ
）］を用いて貼付した。

種々の低濃度のヘモグロビンを含有する尿試料中で、」
−述のようにして製造された本発明の試験具の試験を行
なうと、ヘモグロビン濃度に相当するレベルの、目視で
認識されうる呈色を生じた。

実施例■■：フェニルーｌ−ナフチルアミン　した　よ
び　−２°　、 ３溶液ではなく、成分を含有する２溶液を用いた他は、
実質的に実施例Ｉ（前出）において述べたようにして、
本発明に従って試験組成物を調製した。第二溶液はヒド
ロペルオキシド、指示薬および実施例工の第二溶液の他
の成分からなり、更にアニリンを含有した。用いられた
第一溶液は、蒸留水の容量を１００１に増加した他は実
施例Ｉの第一溶液と、その成分および量が同一であった
。

第二溶液は、［１ＭＦの容量を１００１に増加し、フェ
ニル−１−ナフチルアミン０．４３９ｇ（０，０２Ｍ）
を添加した他は、同様に実施例工の第二溶液と同一であ
った。溶液に浸漬し、乾燥することによる試験具の製造
法は、実質的に、実施例工において述べたと同様であり
、試験具の試験も種々の濃度のヘモグロビンを含有する
尿試料中において、前述のようにして行った。実施例工
における場合と同様に、この試験により、試料中のヘモ
グロビンの濃度レベルに相当する。目視で認識されうる
色が生じた。

フェニル−１−ナフチルアミンの代りにＮ、Ｎ−ジメチ
ルアニリン０．２５３ｍ１（０，０２Ｍ）を用いた他は
、実質的に実施例ＴＩ　（前出）に述べたようにして、
本発明に従って試験組成物を調製した。この組成物から
試験具を製造する方法はまた実質的に実施例ＩＩにおい
て述べたと同様であり、試験具の試験もまた、種々の濃
度のヘモグロビンを含有する尿試料中において、前述の
ようにして行った。実施例ＩＩにおける場合と同様に、
この試験により、試料中のヘモグロビンの濃度レベルに
相当する、目視で認識されうる色が生じた。

フェニル−１−ナフチルアミンではなくフェニレンジア
ミン（二塩酸塩）　０．２２ｇ（０，０１２Ｍ）　Ｉ用
イ、７セ）　７１０ｈｌ　−ｃ’はす＜　ＤＭＦ　１０
０ｍ１を用イタ他は、実質的に実施例Ｉ（前出）に述べ
たようにして、本発明に従って試験組成物を調製した。

この組成物から試験具を製造する方法は、第二の浸漬後
、５０℃で１０分間ろ紙を乾燥した他は、実質的に実施
例工に述べたと同様であった。試験具の試験もまた、種
々の濃度のヘモグロビンを含有する尿試料中において、
前述のようにして行った。先の実施例と同様に、この試
験により、試料中のヘモグロビンの濃度レベルに相当す
る、目視で認識されうる色が生じた。

第三溶液に、フェニル−１−ナフチルアミンではなく　
Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−ニトロアニリン０．２５ｇ（０
，０２Ｍ）を用いた他は、実質的に実施例工（前出）に
述べたようにして、本発明に従って試験組成物および試
験具を調製した。先の実施例における場合と同様に、こ
のようにして製造した試験具の試験を同時に行ったとこ
ろ、種々のヘモグロビン濃度に相当する、目視で認識さ
れうる色を呈した。

実施例■：ｐ−ニル−ニトロアニリンする−　組第三溶
液に、フェニル−１−ナフチルアミンではなく、ｐ−ニ
トロアニリン０．２８ｇ（０，０２Ｍ）を用いた他は、
実質的に実施細工（前出）に述べたようにして、本発明
に従って試験組成物および試験具を調製した。先の実施
例における場合と同様に、このようにして製造した試験
具の試験を同様に行ったところ、種々のヘモグロビン一
度に相当する、目視で認識されうる色を呈した。

え１止１１ 前出の実施例に述べたようにして、本発明によって製造
された試験具の“保存寿命”、すなわち雰囲気温度およ
び高温での保存安定性を測定するために試験が行なわれ
た。

・試験組・酸物、および本発明による組成物を包含する
試験具を０．０２Ｍのフェニル−１−ナフチルアミンを
用いて実施例に述べたようにして製造し、更に、実施例
Ｉの試験具と実質的には同一であるが、第三溶液および
安定剤としてのフェニル−１−ナフチルアミンを利用し
ない対照試験具を製造した。製造に引続き、いくつかの
試験具に、５０℃の炉中に４週間保存することによって
、促進試験を行なった。５０℃における４週間の保存は
、雰囲気温度（約２３℃）における約１年間の保存に相
当すると考えられた。−組の製造したばかりの細片と一
組の促進試験に何した細片を、次に過酸化物活性化物質
が負であることが分っている尿試料に浸漬し、他の数組
を、種々の量のヒト全血を添加した尿試料に浸漬した。

呈色についての、試験具の目視試験の結果（すなわぢ、
尿試料中のヘモグロビンの検出能）は次表に示されてい
る。ｌ］視による。試験具の色の読取りは、慣用のヘモ
グロビン試験具と、種々の量の血液を含む標準尿試料と
の反応によって、正常に生ずる色と関連している照合カ
ラーブロックを有するカラーチャー１・に相当する標準
溶液表示（ＳＳＤ）に当てはめた。この試験の結果を次
表に示しであるが、すべての読取りはＳＳＤ単位で表わ
しである。

第工表 （ｍｇ／ｄＬ） 損失率ωｆ；）　３４．８　＋２．５　、　１２．５損
失率（５□　３３．３　２Ｅｉ、３　３０．０実施例■
〜■において述べたようにして、本発明に従って製造し
た更に別の試験具、および安定剤としての適切なアニリ
ンを使用することなく、同様に製造した対照試験具を、
種々の濃度のヘモグロビンを含有する尿試料中で、先に
述べたようにして試験を行ったが、いくつかは製造した
ばかりのもの、いくつかは５０°Ｃで４週間、または７
０℃で６１−１間もしくは７日間のいずれかの期間、空
気炉中で促進試験を行った後のものであった。これら更
なる試験の結果は次の第１Ｉ　−Ｖ表に示されているが
、組成物および試験具に利用された試薬の保存安定性お
よび温度安定性を高めたという点で本発明の有利性を更
に示している。

第１１表 目視試験の結果：　ＳＳＤ　の変　化 損失率σの　４０　２１．＋ ５０°Ｃで４週間　１５２５ 損失率Ｑの　５０　’２８．Ｅｉ 組成物および試験具に有利に付与すること力くできる。

ここに述べた本発明の好ましい実施例にお（する多くの
修正および変更が、本発明の精神および範囲を逸脱する
ことなしに可能であり、力）つ１本発明についての制限
は、前記特許請求の範囲によってのみ定まることを認識
すべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　試験試料中の過酸化物活性化物質を測２するため
   の試験組成物であって、該組成物が、有機ヒドロペルオ
   キシド、該ヒドロペルオキシドおよび過酸化物活性化物
   質の存在下で検出ｕ（能な応答をなすことができる指示
   薬、並びに、式：式中、Ｒ１およびＲ２は、同一であっ
   ても異ってもよく、水素、炭素数１ないし６個の低級ア
   ルキル、フェこル、α−ナフチルまたはβ−ナフチルで
   あり、　Ｘｌまたはｘ２のいずれかは水素、Ｎｌ２　、
   　ＮＯ２マタ（ｆＮ（ｌｔ’あり、ｘ１マタは×２の他
   方は水素である、 で示されるアニリンからなることを特徴とする組成物。 ２、　該アニリンが、フェニル−１−ナフチルアミン、
   Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、０−フェニレンジアミン、
   　Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−ニトロアニリン、ｐ−ニトロ
   アニリンおよびそれらの混合物からなる群より選択され
   る特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、該ヒドロペルオキシドが、クメンヒドロペルオキシ
   ド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソプロピルベ
   ンセンヒドロベルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン
   −２，５−ジヒドロペルオキシド、パラメンタンヒドロ
   ペルオキシドおよびそれらの混合物からなる群より選択
   される特許請求の範囲第１項記載の改良組成物。 ４、該指示薬が、ベンジジン、Ｏ−）　ＩＪレジン３．
   ３′、５，５°−テトラ（低級アルキル）ベンジジン、
   ２．７−ジアミツフルオレンまたはそれらの混合物より
   なる特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記
   載の組成物を包含せしめた担体マトリックスよりなるこ
   とを特徴とする試験試料中の過酸化物活性化物質の存在
   を測定するための試験共。 ８、　試験試料中の過酸化物活性化物質の存在を測定す
   るための方法であって、該方法が、試料を特許請求の範
   囲第５項記載の試験具と接触させる工程、および試験具
   申の検出可能な応答を観察する工程よりなることを特徴
   とする方法。 ？、Ｊｊ３体マトリックスに、特許請求の範囲第１ｓｎ
   ないし第４項のいずれかに記載の組成物を包含させるこ
   とを特徴とする試験試料中の過酸化物活性化物質の存在
   を測定するための試験具の製造法。 ８、　試験試料中の過酸化物活性化物質の存在を′Ａｌ
   １１定するための試験具製造法であって、有機ヒドロペ
   ルオキシド、ならびに、該ヒドロペルオキシドおよび過
   酸化物活性化物質の存在下で検出０■能な応答をなすこ
   とができる指示薬よりなる第一溶液を調製する工程；式
   ： 式中、Ｒ１およびＲ２は、同一であっても異ってもよく
   、水素、炭素数１ないし６個の低級アルキル、フェニル
   、α−ナフチルまたはβ−ナフチルであり、Ｘｉまたは
   Ｘ２のいずれかは水素、ＮＯ２、ＮＯ２マたはＮＯテあ
   り、Ｘｉまたは×２の他方は水素である、 で示されるアニリンからなる第二溶液を調製する工程； 担体マトリックスを該第−溶液で湿潤させることにより
   、該第−溶液を該担体マトリックスに包含せしめる工程
   ； 該湿潤マトリックスを乾燥して、該マトリックス中に該
   第−溶液成分の残査を残す工程；該乾燥マトリックスを
   該第二溶液で湿潤させることにより、該第二溶液を該マ
   トリックスに包含せしめる工程；および 最後に、該湿潤マトリックスを乾燥して、該マトりンク
   ス中に該第二溶液成分の残査を残す工程 からなることを特徴とする製造法。 ９、最終的に乾燥せしめられたマトリ・ンクスを４１１
   体部材に固着する更なる−［程を更に含む特許請求の範
   囲第８項記載の製造法。