JPH0347708B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、一般に、試験試料中の過酸化物活性
化物質の測定用分析試験に関し、さらに詳しく
は、高い保存安定性を有する、かかる測定のため
の改良試験組成物および試験具並びに、該改良組
成物に関する。 多くの分析方法が、尿、糞便懸濁液および胃腸
内容物のような生物学的試料中の過酸化物活性化
物質の存在を検出するために利用できる。ヘモグ
ロビンおよびその誘導体は酵素ペルオキシダーゼ
と類似した挙動をするので、それらはかかる“過
酸化物活性化”物質の典型例である。かかる物質
はまた、擬ペルオキシダーゼとも呼ばれている。
すなわち、それらは、過酸化物類と、ベンジジ
ン、ｏ−トリジン、３，3′，５，5′−テトラメチ
ルベンジジン、２，７−ジアミノフルオレンまた
はそれらに類似した物質のような指示薬化合物と
の間のレドツクス反応の触媒として働き、それに
よつて色の変化のような検出可能な応答を生ずる
という点で酵素に類似している。例えば、尿中潜
血の存在を測定するためのほとんどの診断試験は
この擬ペルオキシダーゼ活性に基づく。 分析試験法はこの何年かにわたつて、呈色指示
薬を過酸化物によつて酸化する際の酵素様触媒作
用に基づいているが、この分析試験法としては、
湿式化学法または溶液法、およびいわゆる“浸漬
−読取り”型試薬含有細片試験具がある。前者の
うち、典型例は、リテヤード・エム・ヘンリー
（Richard M.Henry）等、Clinical Chemistry
Principles and Techniques、第２版、｛ハーゲ
ルスタウン、メリーランド：ハーパーおよびロー
（Hagerstown，Maryland：Harper and Row），
1974｝1124−1125頁に述べられている。この方法
には、氷酢酸（緩衝剤）、ジフエニルアミン（指
示薬）および過酸化水素を用いる。かかる湿式法
は分析上の有用性を立証してきたが、それにも拘
らず、それらは、試薬の安定性が低く感度が適切
でないというような欠点をも有する。 過酸化物活性化物質の測定のための別の方法
で、現在多くの臨床検査技師に好まれているもの
では“浸漬−読取り”固相試薬細片試験具を用い
る。かかる試験具の典型的なものは、ヘマスチツ
クス（HEMASTIX の商標名で、マイルス・
ラボラトリーズ・インコーポレーテツドのエイム
ズ・デイビジヨン（Ames Division of Miles
Laboratories，Inc.）より市販されているもので
ある。それらは本質的に、プラスチツク細片また
は把手に固着された多孔性の紙マトリツクスより
なる。このマトリツクスは有機ヒドロペルオキシ
ド、例えば、クメンヒドロペルオキシドと指示薬
化合物の緩衝化混合物で含浸される。ヘモグロビ
ン、ミオグロビン、赤血球または他の擬ペルオキ
シダーゼのような分析対象物を含有する液体中に
浸漬すると、マトリツクスに青色が発現し、その
強さは試料中の過酸化物活性化物質の濃度に比例
する。マトリツクスに発現した色を標準カラーチ
ヤートと比較することにより、検査技師は、半定
量的ベースで、存在する分析対象物の量を測定す
ることができる。 試薬細片は湿式化学法に比べて多くの有利性を
有しており、例えば、試薬調製も付属装置も必要
としないので遥に使いやすく、また試薬が乾燥し
た固体状態なので試薬の相対的安定性が大きく、
結果として精度、感度および経済性が改良され
る。しかしながら、従来の、現在利用しうる試薬
細片試験具の多くは保守寿命が限定されるという
重大な欠点がある。すなわち、製造後長期間にわ
たる保存安定性が欠如し、試験具を実際に使用す
る際、過酸化物活性化分析対象物の存在に対する
反応性が著しく減少する結果となる。すなわち、
試薬細片のような分析具は、通常、製造直後には
使用されず、使用までの保守期間がまちまちであ
るために、かつ、従来の試薬細片の製造と使用と
の間の期間があまりに長く、反応性が著しく失わ
れる結果となり、それに伴つて誤つた負の試験結
果を導くために、高い保守寿命は著しい長所とな
りうる；保存寿命が長ければ長いほど、分析結果
の信頼性は高いものとなる。 過酸化物活性化物質、例えば、尿中の潜血また
はヘモグロビンを測定するための従来の固相試薬
細片試験具では、通常、指示薬系として、有機ヒ
ドロペルオキシド、例えば、クメンヒドロペルオ
キシドによる、ポルフイリンを触媒とするベンジ
ジン系指示薬、例えば、ｏ−トリジンまたは３，
3′，５，5′−テトラメチルベンジジンの酸化が利
用されている。しかしながら、このような従来の
試験細片は、長い保存期間中または高温での保存
中に反応性を喪失する傾向が特にあることが知ら
れており、この現象は、細片の１またはそれ以上
の試薬成分の蒸発または化学分解に因るものと信
じられている。雰囲気温度で保存されたこのよう
な従来の試薬細片において、反応性の実質的低下
が観察されるばかりでなく、高温での保存によつ
て、これらの低下は著しく強調され、かつ、低下
の割合も加速されるようである。試薬細片中の反
応性の低下についての説明としては次のものが可
能である：(1)試薬組成物の主成分が分解または蒸
発して、成分濃度が適切な反応性を維持するのに
必要な最低濃度以下に落ちる；および(2)細片中の
２またはそれ以上の成分が有害な相互反応を行つ
て、反応性のないまたは妨害性のある１またはそ
れ以上の新しい種を生成する。 試薬組成物、およびそれから製造される過酸化
物活性化物質測定用の固相細片試験具の反応性を
安定化する試みは種々のアプローチをたどつてき
ている。例えば、アダムス・ジユニア（Adams，
Jr.）等の米国特許第3092463号は体液中の潜血を
検出するための改良試験組成物および試験具を開
示している。この組成物は、コロイド物質製の微
小球状の泡中にカプセル化またはトラツプ化され
た有機ヒドロペルオキシド、有機ヒドロペルオキ
シドからの酸素の移動を受容してヘモグロビンの
補欠分子族の触媒作用により誘起される呈色応答
を生ずることのできる指示薬または色素前駆体、
および試験される物質のPHを４から6.5の範囲に
維持するための緩衝剤よりなる。この特許は、コ
ロイド物質、例えば、ポリビニルアルコール、ゼ
ラチン、アラビアゴムまたはカルボキシビニルポ
リマーにより、該組成物より製造された試験具の
好ましい実施態様での反応性を、75℃で300時間
の保存後でさえも安定化することができ、それに
対してヒドロペルオキシドのカプセル化なしに製
造した同様の試験具は50℃で24時間後にはかなり
の反応性が失われることを開示している。 安定化された試験組成物および試験具に関する
別の開示としては、アダムス・ジユニア
（Adams，Jr.）等の米国特許第3252762号のアプ
ローチがあり、そこでは、有機ヒドロペルオキシ
ドが、ジアルデヒド多糖類で固定することによつ
て硬化されたゼラチンのようなコロイド状物質中
にカプセル化されている。このようにカプセル化
されたヒドロペルオキシド、適切な指示薬および
緩衝剤を含有するかかる組成物は、種々の悪影響
のある温度条件のもとで高い安定性を示すといわ
れている。 試薬細片試験具の安定化についての、更に別に
開示された試みとしては、Chemical
Abstracts85巻，30353（1976）の詳説があり、こ
れは、ｏ−トリジンおよびフエニルイソプロピル
ヒドロペルオキシドを含有する試薬細片を製造す
るための２段階−浸漬法について述べている。こ
の開示は、指示薬（ｏ−トリジン・2HCl）およ
びポリビニルピロリドンのエタノール溶液を調製
することを報告している。この溶液に少量の界面
活性剤および十分な量のクエン酸塩緩衝剤を添加
して、PHを3.7とし、その後エチル・セルロース
を含浸せしめたろ紙細片をこの溶液に浸漬し乾燥
した。この含浸ろ紙を、次に、エタノール−トル
エン混合物中に溶解した１，４−ジアザビシクロ
［２，２，２］−オクタン、フエニルイソプロピル
ヒドロペルオキシドおよびポリビニルピロリドン
を含有する第２溶液中に浸漬した。この作業の目
的はビシクロオクタン誘導体およびポリビニルピ
ロリドンの使用により、ペルオキシドおよび指示
薬の組合せを安定化することであつた。 同様の方法が米国特許第3853471号に開示され
ている。この特許は、その置換アミド基が主にＮ
−モルホリン基であるリン酸アミド類またはホス
ホン酸アミド類の使用を開示している。 試薬組成物を安定化するための別のアプローチ
としては、ヒドロペルオキシドおよび指示薬に加
えて、種々の稀釈剤化合物、例えば、ジメチルス
ルホンおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混
合物を用いる米国特許第4071317号；同第4071318
号（ホウ酸エステル類の使用）；および同第
4071321号（稀釈剤およびホウ酸エステル類の両
者の使用）がある。 これらの一般概念にとつて関連する別の参考文
献としては、触媒および酸化剤として用いられる
有機ヒドロペルオキシド類の安定化に向けられて
いる米国特許第3236850号がある。この参考文献
は有機過酸化物と共に一級、二級または三級アミ
ン塩を使用することを開示しており、固相試薬細
片試験具の安定性の問題には向けられていない。 アルキルヒドロペルオキシドの熱分解反応につ
いての研究はジエー・アール・トーマス（J.R.
Thomas）、J.Am.Chem.Soc.，101巻、246−248
頁（1955年）に述べられている。炭化水素溶液中
での４つの異なるヒドロペルオキシドの分解速度
を、温度の関数として測定した。フエニル−１−
ナフチルアミンを溶液混合物に包含させると、ヒ
ドロペルオキシドの消減速度が減少することが観
察された。更に、ジエー・アール・トーマス（J.
R.Thomas）及びオー・エル・ハール（０，L.
Harle）、J.Phys.Chem.，63巻、1027−1032頁
（1959年）はテトラリンヒドロペルオキシドの分
解速度に対する溶媒の影響について検討してい
る。これらの研究では、フエニル−１−ナフチル
アミンが、ヒドロペルオキシドの分解におけるラ
ジカル連鎖反応を阻止するためのラジカル・トラ
ツプとして用いられることが開示されている。 これら上述の論文は、直接、固相試薬細片試験
具の安定性の問題に向けられていない。先に報告
した研究のすべては、固相状態ではなく溶液中で
行われたもので、この固相状態は、細片試験具に
従来用いられるヒドロペルオキシドの状態であ
る。更に、細片試験具に典型的に用いられる溶
媒、例えば、ジメチルホルムアミド及びアセトン
は、この文献に述べられている溶媒、すなわち、
医療用白油、オクタン、デカン、シクロヘキサン
及びデカリンとは実質的に異なる。また、試薬細
片は、ヒドロペルオキシドとばかりではなく、ま
た他の細片成分とも相互反応して悪影響を与える
可能性を潜在的に有する試薬を典型的に含有す
る。 したがつて、溶液化学法と比べて固相試薬細片
試験具固有の分析上の利用、および上記細片試験
具の反応性の安定化についての従来技術における
先に例示した利点にも拘らず、後者の安定特性
は、特に、過酸化物活性化物質の測定用試験具の
場合には、なお、更なる改良を必要としている。
現在の技術水準の、過酸化物活性化物質測定用固
相組成物および試験具の性質は湿式化学法による
ものおよび安定性向上技法を全く含まないものよ
り大幅に高められているが、それにも拘らず、長
期の保守中、より安定にすることができ、かつ、
かかる長期間の保守後も過酸化物活性化分析対象
物に対して、適切な感度を保持して、“誤つた負
の”結果を排除することができれば著しく有利な
ものとなるであろう。好ましくは、このことは、
カプセル化による試薬の隔離、またはかかる組成
物および試験具の、同様の比較的複雑かつ高価な
処理を必要とせずに達成されるべきである。例え
ば、市販品として容易に入手可能であり、使用す
るのが経済的であり、固相試験組成物および試験
具に用いられた他の従来の試薬／指示薬系に対し
て適切な感度を有し、同時に、長期の保守中、こ
れら組成物および試験具を実質的により安定にす
ることができる適切な安定剤を提供することがで
きれば有利となるであろう。 過酸化物活性化物質測定用の従来の固相試薬組
成物および試験具の、保守安定性もしくは“保守
寿命”の欠如をもたらす、反応性の低下がしばし
ば観察されるが、これは試薬細片中に用いられる
有機ヒドロペルオキシドの喪失および／または化
学分解に主に起因するものと現在仮定されてい
る。かかる喪失または分解は、例えば、ヒドロペ
ルオキシドの分解または蒸発、または他の細片成
分との化学相互反応から起こることがあるだろ
う。しかしながら、悪影響を与える相互反応に起
因する崩壊がほとんどの反応性低下の理由となる
であろうが、かかる相互反応を引起す機構は現在
解明されていない。 かかる試薬系にある種のアニリン化合物を有利
に包含させることによつて、現在の技術水準であ
る、ほぼ慣用の過酸化物活性化物質測定用の固相
試薬系を実質的に改良し、かつ、かかる慣用系の
前述の安定性についての問題を大幅に克服するこ
とができることが現在発見されており、かつ本発
明はこの発見に基づくものである。このようなア
ニリン類は、固相試験において通常用いられる有
機ヒドロペルオキシドの結合鎖分解に対する阻害
剤として機能するばかりではなく、また、試薬間
の、悪影響を与える相互反応を減少もしくは防止
するのに有利であると信じられている。更に、試
薬の隔離等のような従来公知の多くの安定化技法
と比較すると、これらのアニリン類を使用すれば
経済的であり、その結果の信頼性も高い。 前述のように、過酸化物活性化物質測定用の従
来の試薬系は、一般に、有機ヒドロペルオキシド
およびｏ−トルイジンまたは３，3′，５，5′−テ
トラメチルベンジジンのようなレドツクス指示薬
よりなる。過酸化物活性化分析対象物は、酵素ペ
ルオキシダーゼに似た挙動をするので指示薬およ
び有機ヒドロペルオキシドの間の反応において、
触媒として働くか、さもなければ指示薬と有機ペ
ルオキシドとの反応に関与して、呈色し、その強
度が分析対象物の濃度を示唆するものである。従
来の分析試薬系とは異なり、本発明によれば、試
験試料中の過酸化物活性化物質を測定するための
改良分析組成物が提供される。該組成物は、有機
ヒドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペルオ
キシドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出
可能な応答をなすことができる指示薬より成るば
かりではなく、また、式： 式中、R₁およびR₂は、同一であつても異つて
もよく、水素、炭素数１ないし６個の低級アルキ
ル、又はα−ナフチルであり、X₁またはX₂のい
ずれかは水素又はNO₂であり、X₁またはX₂の他
方は水素である、 で示されるアニリンをも含有する。 先のクラスの化合物から使用のために選択され
うる好ましいアニリンとしては、フエニル−１−
ナフチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ニトロアニリン、ｐ−ニ
トロアニリンおよびそれらの混合物が挙げられ、
最も好ましいものはフエニル−１−ナフチルアミ
ンおよびこの化合物と列挙した他の化合物との混
合物である。 本発明はまた試験試料中の過酸化物活性物質を
測定するための改良分析試験具をも提供する。該
試験具は、好ましい実施態様においては、本発明
の改良組成物を包含せしめた担体マトリツクスよ
りなる。適切なアニリン、または適切なアニリン
の混合物を、組成物中において、他のほぼ慣用的
な成分と組合せて包含させることによる総体的効
果によつて、反応性を、有意に安定させることが
でき、従来の固相試験と比較して、特に、優れた
“保存寿命”をもたらすことが信じられている。
更に、本発明により、試験試料中の過酸化物活性
化分析対象物の存在に対する優れた感度を保持す
ることが可能となり、それは予期しないことであ
つたが、従来の試験の保持力に匹敵する。 更に、本発明は該改良分析具の使用法ならびに
その製造法を提供する。好ましい実施態様におい
ては、該試験具は分析下の液体試験試料中にそれ
を浸漬し、過酸化物活性化分析対象物の存在に対
して、そこに生じた。色の変化のような検出可能
な応答を観察することにより用いられる。好まし
くは、本試験具の製造法は、担体マトリツクス、
例えば、多孔性の紙に、試薬および他の組成物成
分からなる２以上の溶液または懸濁液を包含せし
めることよりなる。 本発明の開発に当つては、従来公知の方法論に
頼らずに、従来の固相試薬組成物および試験具の
前述の安定性に関する問題を克服するための試み
が行われた。この目的のために、アニリン化合物
類を市販品より得た。得られた化合物は従来典型
的に用いられる種々の有機ヒドロペルオキシド上
に安定化効果を付与することができると思われる
芳香族環上の置換基を示唆している。しかしなが
ら、このような安定化をもたらす機構は現在、ま
だ解明されていない。 したがつて、本発明の試験組成物および試験具
に用いるのに適切であると決定されたアニリンと
しては、非置換アニリン、一般式： 式中、R₁およびR₂は、同一であつても異つて
もよく、水素、炭素数１ないし６個の低級アルキ
ル、又はα−ナフチルであり、X₁またはX₂のい
ずれかは水素又はNO₂であり、X₁またはX₂の他
方は水素である、 で示される、モノーおよびジー置換アニリン、お
よびその混合物が挙げられる。 したがつて、本発明によれば、適切な、好まし
いアニリンとしては、フエニル−１−ナフチルア
ミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメ
チル−３−ニトロアニリン、ｐ−ニトロアニリ
ン、およびそれらの混合物が挙げられる。本発明
において、有利に利用されうる他の適切なアニリ
ンとしては、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、、ｍ−
ニトロアニリン、およびＮ，Ｎ−ジメチル−４−
ニトロアニリンがある。また、前述の化合物の混
合物のみならず、構造式で説明した化合物のクラ
ス内のそれらおよび他のものも種々の比率で有利
に使用することができる。 したがつて、フエニル−１−ナフチルアミンお
よびＮ，Ｎ−ジメチルアニリンが現在最も好まし
く、フエニル−１−ナフチルアミンが最も望まし
いが、ここに、構造式を定義したような、すべて
の化合物は本発明に使用するのに適切である。本
発明に使用するために、いずれかの適切な特定の
アニリンを選択することは、この開示を与えられ
た。普通の当業者の能力内の通常の選択に任され
るべき事柄である。 本発明に用いられる適切なアニリン類は、市販
されてもおり、また、ほぼ慣用有機合成法を用い
て市販材料から通常の技術者により容易に合成す
ることもできる。例えば、実施例（後出）におい
て示したフエニル−１−ナフチルアミンのような
アニリン類はイーストマン・コダツク・カンパニ
ー（Eastman Kodak Company）より入手でき
る。 本発明の組成物および試験具にについての具体
例において用いられる特定のアニリンまたは混合
物の量は、本発明の有利性を達成させるために、
決定的に重要なことではなく、本技術の観点から
の、当業者の日常的な選択に任される事柄であ
る。例えば、ヒドロペルオキシドの分解を阻害
し、かつ、悪影響をもたらす試薬間の相互反応を
妨害するのに必要な、固相における化学反応およ
び化変化をおこさせるのに十分な量を選択するで
あろう。このことは、例えば、ーー用いたヒドロ
ペルオキシドの濃度および形次第で、−−組成物
を安定化し、特定の分析情況において要求される
程度に過酸化物活性化物質の存在に対して反応性
を付与するに適切な量となるであろう。したがつ
て、例えば、望まれる。または必要な安定性は、
分析試験が、分析対象物についての、半定量測定
または定量測定のいずれのためのものであるか、
または保存の期間もしくは保存温度が過酷な促進
作用を有するように意図されているかというよう
な要素によつて、かなり変動することがある。か
くして、かかる、アニリンもしくは混合物の濃度
は、好ましくは、試験具を調製するために用いら
れる溶液の最終容量中約0.02モル（Ｍ）である。
典型的な実施態様において、かかる試験具は、１
デシリツトルあたり、0.045ミリグラムの低濃度
の尿中ヘモグロビン（潜血）を測定するための分
析具として、更なる操作を加えることなく即時使
用（off−the−shelf use）に付される。しかしな
がら、本発明によつて製造された組成物および試
験具に存在するであろう特定のアニリンの量は広
範囲に変動してもよく、かつ、ここに述べたよう
に、本発明の教示に従つて、広範囲に変動する量
の上記化合物を利用することにより、従来の調製
物の安定性および感度を実質的に改良することが
できることを認識すべきである。 先に示したように、安定剤として、適切なアニ
リンまたはアニリン類の混合物を包含する本発明
の試験組成物は、更に、少なくとも１つの有機ヒ
ドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペルオキ
シドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出可
能な応答をなすことができる指示薬物質を含む。
このような検出可能な応答は、目視によるか、ま
たは計器手段によつて検出可能な、色の変化また
は他の応答であることもある。 本発明の組成物および試験具は、0.045mg／dL
のような低濃度の尿中ヘモグロビンの存在下にお
いて、目視または計器によつて検出可能な応答、
例えば、呈色応答を生ずることが判明している。
しかしながら、ヘモグロビンの検出のためのこの
ような利用の他に、本発明の組成物および試験具
により検出することができる他の過酸化物活性化
物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、ミオ
グロビン、赤血球、および他の擬ペルオキシダー
ゼがある。更に、このような物質は、本発明の実
施態様により、尿中ばかりではなく、また胃腸内
容物、脊髄液、工業廃水、水泳用プール等のよう
な多くの他の物質中においても検出することがで
きる。 本発明に使用することが期待される有機ヒドロ
ペルオキシドは、多くの周知の有機ペルオキシド
類から選択することができる。しかしながら、選
択されたものは、適切な指示薬の存在下で過酸化
物活性化物質と相互反応して、色の変化又は試験
組成物による光の吸収量もしくは光の反射量の変
化のような検出可能な応答を生ずることが可能で
なければならない。特に適切なヒドロペルオキシ
ド類としては、クメンヒドロペルオキシド、ｔ−
ブチルヒドロペルオキシド、ジイソプロピルベン
ゼンヒドロペルオキシド、２，５−ジメチルヘキ
サン−２，５−ジヒドロペルオキシド、パラメン
タンヒドロペルオキシド及び用いた指示薬を酸化
することができる他の周知のヒドロペルオキシド
又はそれらの化合物の混合物が挙げられる。前述
したものの中では、クメンヒドロペルオキシドが
最も好ましい。 有機ヒドロペルオキシド及び過酸化物活性化物
質の存在下で、相互反応して、検出可能な応答を
生ずることができさえすれば、多くの指示薬が本
発明に使用するのに適切である。これらのものと
しては、例えば、いわゆる“ベンジジン系”化合
物、すなわち、ベンジジン、ｏ−トリジン、３，
3′，５，5′−テトラ（低級アルキル）ベンジジ
ン、２，７−ジアミノフルオレン及びこれらの混
合物又は種々の他のものが挙げられる。ここで用
いられる用語“低級アルキル”は、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピルおよびイソプロピル、並びに
種々のブチル、ペンチルおよびヘキシル異性体を
はじめとする、１ないし６個の炭素原子を有する
アルキル基を意味する。しかしながら、指示薬と
して最も好ましいものは、３，3′，５，5′−テト
ラメチルベンジジンである。 好ましい実施態様においては、本発明の改良試
験組成物を担体マトリツクス上に包含するか、ま
たは担体マトリツクスに包含せしめて、固相“浸
漬−読取り”試験具を製造する。かかる本発明の
試験具は、試験組成物の溶液を吸収剤マトリツク
ス材に含浸させ、ついで、含浸マトリツクスを乾
燥して、微細かつ均一な組成物成分の混合物をこ
のようにマトリツクス内に包含させることを含む
種々の周知の方法により製造することができる。
用いることができる適切な担体マトリツクスとし
ては、紙、セルロース、木、合成樹脂フリース、
ガラス繊維紙、ポリプロピレン、フエルト、不織
布または織布等を挙げることができる。担体マト
リツクスとして、本発明に用いるのに最も適切で
好ましいものは、ろ紙のような多孔性の紙であ
る。しかしながら、担体マトリツクスとして用い
るのに適切な材料の選択は当業者の通常の選択に
任される事柄であり、マトリツクスは種々の物理
的形態をとることができ、それらのすべては本発
明の範囲内のものとされることを認識すべきであ
る。 本発明による試験具の製造の最も好ましい方法
は、二溶液法でマトリツクスを含浸する方法であ
る。このような好ましい方法においては、組成物
成分を共に２つの別々の溶液または懸濁液に混合
し、続いて、この溶液にマトリツクスを含浸また
は浸漬し、ついで、各含浸毎に取出し乾燥を行な
う。最終的な含浸（好ましくは、アセトンのよう
な適切な有機溶媒とのアニリン溶液又は懸濁液へ
の含浸）及び最終的な乾燥に続いて、乾燥された
含浸マトリツクスは次に、両面粘着テープのよう
な適切な手段により、担体部材の一端に固着させ
ることができる。この担体部材は、例えば、ポリ
スチレンのような長方形のプラスチツク細片より
なることができる。マトリツクスが固着されてい
ない、細片の他端は、この場合、試験具を使いや
すくするために把手として働く。 試験反応に積極的に関与する前述の試験組成物
成分に加えて、用いられた指示薬を分散させるた
めの溶媒、増粘剤、湿潤剤、緩衝液、乳化剤およ
び他の周知のアジユバンドのような更なる成分も
また本発明の組成物に含有させることができる。
すなわち、例えば、増粘剤としては、ゼラチン、
アルギン、カラゲーン、カゼイン、アルブミン、
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のよ
うな種々の材料を用いることができる。湿潤剤と
しては、ドデシル硫酸ナトリウムが好ましいが、
スルホコハク酸ジオクチルナトリウムまたはドシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウムのような長い鎖
状有機硫酸塩またはスルホン酸塩もまた用いるこ
とができる。緩衝系としては、酒石酸塩、リン酸
塩、フタル酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、またはコ
ハク酸塩又は他の従来の緩衝剤を用いることがで
きる。緩衝系はクエン酸ナトリウム及びクエン酸
からなることが好ましく、組成物は約5.5から7.0
のPH値に緩衝化されることが好ましい。乳化剤と
しては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、
カルボキシビニルポリマー等を用いることができ
る。 指示薬と同時にアニリン化合物を懸濁するのに
有用な有機溶媒としては、ジメチルホルムアミ
ド、アセトン、クロロホルム、二塩化エチレン、
ベンゼン、酢酸エチル等のような、ほとんどの非
反応性で、低沸点（約150℃以下）蒸発性有機溶
媒、またはそれらの混合物を挙げることができ
る。適切ではない溶媒としては、オクタン、デカ
ン、デカリン、および比較的非蒸発性の他の溶媒
（すなわち、沸点が約150℃より高いもの）が挙げ
られる。本発明に用いるための特定の溶媒は、容
易に蒸発し、したがつて固相試薬試験具の製造の
際の乾燥工程において実質的に除去されうる性質
に基づいて選択されることが重要であり、これ
は、用いた溶媒の残渣が大量に担体マトリツクス
中に残留して、試験具を過酸化物活性化物質の測
定のために用いた場合、試験具の反応性を阻害す
ることがないようにするためである。その他の点
では、個々の溶媒の選択は、本開示を受けた普通
の当業者により容易に行われることである。 ６−メトキシキノリンのよう他の試薬、また
は、他の、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性
に対する活性化剤もまたここに開示した組成物に
使用することができる。 使用に当つては、固相において、本発明の組成
物を包含する、含浸しかつ乾燥した、試験具のマ
トリツクスを、試料液体または試験されるべき物
質の液体濁液中に浸漬し、ついで、直ちに、引上
げることができる。過酸化物活性化物質が存在す
る場合は、マトリツクスに包含された固相試験組
成物を試料と接触させると、正の検出可能な応
答、例えば、マトリツクス中に発現する呈色反応
を生じる。試料中に含まれる過酸化物活性化物質
量についての定量的評価のために、この呈色応答
を、次に、予め検量された標準色と比較すること
ができる。非溶血赤血球細胞のような非処理の過
酸化物活性化物質はマトリツクス上に点もしくは
斑点状の色として現われる。溶血赤血球細胞はマ
トリツクスを一様に着色することができる。目視
比較に加えて、種々の計器による手法を用い、そ
れにより人間の眼の主観的測定を排除することに
より、試験の精度を高めることができる。 本発明の試験具は、溶液中ばかりでなく又糞
便、胃腸内容物等のような固相または半固相物質
中の過酸化物活性化物質の測定にもまた用いるこ
とができることを認識すべきである。すなわち、
例えば、固相または半固相物質の薄層を試験具の
担体マトリツクスに塗布し、色の変化のような検
出可能な応答をマトリツクス中で観察することが
できる。 改良された本発明の試験組成物および試験具
は、従来の試験組成物および試験具に比べて安定
性が高いという点で有利なばかりではなく、また
感度が高い。好ましい実施態様においては、本発
明の試験組成物は0.045mg／dLの低濃度の尿中ヘ
モグロビンを検出することができることが判明し
ており、これは１：１，000，000の血液稀釈に相
当する。この感度の程度は、真に予期しなかつた
有利性であり、過酸化物活性化物質のための多く
の従来の技術水準の試験の感度に匹敵するもので
あり、本試験組成物において、安定剤として妥当
かつ適切なアニリン化合物を包含させることが、
悪影響を与える保存および温度促進下での反応性
を安定化するのに有利であるばかりではなく、ま
た、上記物質を検出するためにそこに用いた試薬
系の機能に対して有害ではないことを立証してい
る。 本発明によれば、試験具のマトリツクスへ包含
させるための組成物の配合に際しては、好ましい
実施態様において、アニリン化合物を先ず適切な
有機溶媒、例えば、ジメチルホルムアミドもしく
はアセトン、またはそれらの混合物および／また
は他の溶媒に懸濁および／または溶解し、その後
浸漬および乾燥によりマトリツクス中に含浸させ
て、前述のようにマトリツクスにアニリンを包含
させることができる。 組成物の残りの成分もまた様々な方法でマトリ
ツクスに包含させて試験具を形成することがで
き、本発明による前記試験具の製造は、したがつ
ていかなる特定の方法に限定されるものではな
い。例えば、残りの成分は、水と、ジメチルホル
ムアミド、アセトン、エタノール、またはそれら
の混合物のような適切な溶媒１種以上との混合物
に溶解または懸濁することができ、上記溶液また
は懸濁液を用いて、同様にそれらの成分をマトリ
ツクスに含浸させることができる。また、担体マ
トリツクスは、例えば、ドクター・ブレードで組
成物を塗布するか、インキとしての組成物を包含
せしめることができるが、その場合試薬はマトリ
ツクス上に印刷される。 試験具を製造するための、現在好まれている方
法の１つは、２つの別々の、組成物成分の溶液ま
たは懸濁液を順次ろ紙に含浸することであり、好
ましい溶媒は蒸留水または脱イオン水、ジメチル
ホルムアミド（DMF）およびアセトンである。
このような含浸は、１枚のろ過を緩衝液、湿潤剤
および他の非試薬成分の水溶液、DMF中のヒド
ロペルオキシド並びに指示薬に浸漬し、空気炉中
でろ紙を乾燥し、続いてアセトン中の、アニリン
化合物の第二溶液に前記乾燥ろ紙を浸漬し、最後
にこのろ紙を乾燥することにより、達成すること
ができる。試験具を完成させるために、次に、乾
燥ろ紙を一辺約0.6センチメートル（cm）の正方
形に裁断し、これを約0.6x10cmのポリスチレン・
フイルム細片の一端に貼付する。貼付は、スリ
ー・エム・カンパニー（3M Company）より市
販されているような、両面接着剤テープを使用し
て達成される。 本発明の試験具を製造するための現在の最も好
まれている方法は、緩衝剤、湿潤剤等からなる組
成物成分を含む第一水溶液を調製し、次に、
DMF中の、ヒドロペルオキシドおよび指示薬試
薬からなる第二有機溶液を調製することである。
次に、これら２つの溶液を混合し、次いで、混合
溶液にろ紙マトリツクスを浸漬もしくは含浸し、
乾燥させる。乾燥マトリツクスは、それからアニ
リンと適切な溶媒を含む第三溶液に浸漬する。試
験具はそこで上述のように完成される。 実施例 次の実施例は、本発明の概念および有利性を更
に示すために用意された。実施例は、本発明の試
験具をいかに製造し、いかに使用するかを説明す
ることを意図しており、その範囲を制限するもの
と理解すべきものではない。ここで表わされるす
べての百分率（パーセント）は、特に断わらない
限り重量パーセントである。 実施例：フエニル−１−ナフチルアミンを包含
した試験組成物および試験具−３溶液、２浸
漬法 次の成分を、列挙した順で混合することにより
第一含浸溶液を調製した： 50ミリリツトル（ml）の蒸留水 2.13グラム（ｓ）の クエン酸ナトリウム；
緩衝剤；0.1モル（Ｍ）^*PH6.9 2.77ｇのクエン酸； 6.67ｇのホウ酸トリエタノールアミン ：0.4M^* 1.0ｇのドデシル硫酸ナトリウム ；1.0％^* 0.067ｇのエチレンジアミン四酢酸 第二溶液を次のものを混合することにより調製
した： 50mlのジメチルホルムアミド 0.4mlの６−メトキシキノリン ：0.4％^* 4.0mlのクメンヒドロペルオキシド 0.604ｇの３，3′，５，5′−テトラメチルベンジ
ジン ：0.03M^* 0.108ｇのオレンジＧ染料 第三溶液を次の成分を混合することにより調製
した： 0.439ｇ（0.02M）のフエニル−１−ナフチル
アミン 100.0mlのアセトン ＊：混合溶液中の成分の最終濃度 第一溶液を第二溶液と十分に混合し、１枚の実
験室用ろ紙［（ワツトマン・スリーエムエム
（whatman 3MM）］を混合溶液に浸漬（含浸）
し、ろ紙を取出し、次いで空気炉中105℃で約８
分乾燥することにより、ろ紙に組成物を含浸せし
めた。次に、この乾燥ろ紙を第三溶液に浸漬し、
空気炉中70℃で５分間乾燥させることにより、こ
のろ紙に第三溶液を含浸させた。このようにし
て、３つの溶液の成分からなる組成物を、後の乾
燥に続く固相状態で、ろ紙に包含させた。組成物
をこのように包含せしめて、試験マトリツクスを
形成した乾燥含浸紙を、0.6センチメートル（cm）
平方に裁断し、約0.6×10cmのポリスチレンフイ
ルム細片の一端に、両面接着剤テープ［スリーエ
ム・カンパニー（3M Company）］を用いて貼付
した。 種々の低濃度のヘモグロビンを含有する尿試料
中で、上述のようにして製造された本発明の試験
具の試験を行なうと、ヘモグロビン濃度に相当す
るレベルの、目視で認識されうる呈色を生じた。 実施例：フエニル−１−ナフチルアミンを包含
した試験組成物および試験具−２溶液、２浸
漬法 ３溶液ではなく、成分を含有する２溶液を用い
た他は、実質的に実施例（前出）において述べ
たようにして、本発明に従つて試験組成物を調製
した。第２溶液はヒドロペルオキシド、指示薬お
よび実施例の第二溶液の他の成分からなり、更
にアニリンを含有した。用いられた第一溶液は、
蒸留水の容量を100mlに増加した他は実施例の
第一溶液と、その成分および量が同一であつた。
第二溶液は、DMFの容量を100mlに増加し、フエ
ニル−１−ナフチルアミン0.439ｇ（0.02M）を
添加した他は、同様に実施例の第二溶液と同一
であつた。溶液に浸漬し、乾燥することによる試
験具の製造法は、実質的に、実施例において述
べたと同様であり、試験具の試験も種々の濃度の
ヘモグロビンを含有する尿試料中において、前述
のようにして行つた。実施例における場合と同
様に、この試験により、試料中のヘモグロビンの
濃度レベルに相当する。目視で認識されうる色が
生じた。 実施例：Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリルを包含した
試験組成物および試験具 フエニル−１−ナフチルアミンの代りにＮ，Ｎ
−ジメチルアニリン0.253ml（0.02M）を用いた
他は、実質的に実施例（前出）に述べたように
して、本発明に従つて試験組成物を調製した。こ
の組成物から試験具を製造する方法はまた実質的
に実施例において述べたと同様であり、試験具
の試験もまた、種々の濃度のヘモグロビンを含有
する尿試料中において、前述のようにして行つ
た。実施例における場合と同様に、この試験に
より、試料中のヘモグロビンの濃度レベルに相当
する、目視で認識されうる色が生じた。 実施例：Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ニトロアニリ
ンを包含する試験組成物および試験具 第三溶液に、フエニル−１−ナフチルアミンで
はなくＮ，Ｎ−ジメチル−３−ニトロアニリン
0.25ｇ（0.02M）を用いた他は、実質的に実施例
（前出）に述べたようにして、本発明に従つて
試験組成物および試験具を調製した。先の実施例
における場合と同様に、このようにして製造した
試験具の試験を同時に行つたところ、種々のヘモ
グロビン濃度に相当する、目視で認識されうる色
を呈した。 実施例：ｐ−ニトロアニリンを包含する試験組
成物よび試験具 第三溶液に、フエニル−１−ナフチルアミンで
はなく、ｐ−ニトロアニリン0.28ｇ（0.02M）を
用いた他は、実質的に実施例（前出）に述べた
ようにして、本発明に従つて試験組成物および試
験具を調製した。先の実施例における場合と同様
に、このようにして製造した試験具の試験を同様
に行つたところ、種々のヘモグロビン濃度に相当
する、目視で認識されうる色を呈した。 安定性試験 前出の実施例に述べたようにして、本発明によ
つて製造された試験具の“保存寿命”、すなわち
雰囲気温度および高温での保存安定性を測定する
ために試験が行なわれた。 試験組成物、および本発明による組成物を包含
する試験具を0.02Mのフエニル−１−ナフチルア
ミンを用いて実施例に述べたようにして製造し、
更に、実施例の試験具と実質的には同一である
が、第三溶液および安定剤としてのフエニル−１
−ナフチルアミンを利用しない対照試験具を製造
した。製造に引続き、いくつかの試験具に、50℃
の炉中に４週間保存することによつて、促進試験
を行なつた。50℃における４週間の保存は、雰囲
気温度（約23℃）における約11年間の保存に相当
すると考えられた。一組の製造したばかりの細片
と一組の促進試験に付した細片を、次に過酸化物
活性化物質が負であることが分つている尿試料に
浸漬し、他の数組を、種々の量のヒト全血を添加
した尿試料に浸漬した。呈色についての、試験具
の目視試験の結果（すなわち、尿試料中のヘモグ
ロビンの検出能）は次表に示されている。目視に
よる、試験具の色の読取りは、慣用のヘモグロビ
ン試験具と、種々の量の血液を含む標準尿試料と
の反応によつて、正常に生ずる色と関連している
照合カラーブロツクを有するカラーチヤートに相
当する標準溶液表示（SSD）に当てはめた。この
試験の結果を次表に示してあるが、すべての読取
りはSSD単位で表わしてある。

【表】 実施例〜において述べたようにして、本発
明に従つて製造した更に別の試験具、および安定
剤としての適切なアニリンを使用することなく、
同様に製造した対照試験具を、種々の濃度のヘモ
グロビンを含有する尿試料中で、先に述べたよう
にして試験を行つたが、いくつかは製造したばか
りのもの、いくつかは50℃で４週間、または70℃
で６日間もしくは７日間のいずれかの期間、空気
炉中で促進試験を行つた後のものであつた。これ
ら更なる試験の結果は次の第〜表に示されて
いるが、組成物および試験具に利用された試薬の
保存安定性および温度安定性を高めたという点で
本発明の有利性を更に示している。

【表】

【表】

【表】 先のデータは、適切なアニリンを包含させた本
発明の組成物および試験具は、亜影響のある保存
および温度負荷条件下でも、上記アニリン化合物
は包含しないが、過酸化物活性化物質を測定する
ための同一の試薬を包含する従来の試験具と比較
して実質的に高められた安定性を示すことを示唆
している。更に、従来の対照試験具の反応性の喪
失は比較的大きいのに対し、本発明の組成物およ
び試験具のこの高い安定性、すなわち“保存寿
命”のために、上記促進試験の後でさえも、ヘモ
グロビンの存在に対してより高い感度を本発明の
組成物および試験具に有利に付与することができ
る。 ここに述べた本発明の好ましい実施例における
多くの修正および変更が、本発明の精神および範
囲を逸脱することなしに可能であり、かつ、本発
明についての制限は、前記特許請求の範囲によつ
てのみ定まることを認識すべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試験試料中の過酸化物活性化物質を測定する
   ための試験組成物であつて、該組成物が、有機ヒ
   ドロペルオキシド、該ヒドロペルオキシドおよび
   過酸化物活性化物質の存在下で検出可能な応答を
   なすことができる指示薬、並びに、式： 式中、R₁およびR₂は、同一であつても異つて
   もよく、水素、炭素数１ないし６個の低級アルキ
   ル又はα−ナフチルであり、X₁またはX₂のいず
   れかは水素又はNO₂であり、X₁またはX₂の他方
   は水素である、 で示されるアニリンからなることを特徴とする組
   成物。 ２ 該アニリンが、フエニル−１−ナフチルアミ
   ン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
   ル−３−ニトロアニリン、ｐ−ニトロアニリンお
   よびそれらの混合物からなる群より選択される特
   許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３ 該ヒドロペルオキシドが、クメンヒドロペル
   オキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイ
   ソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、２，５
   −ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキ
   シド、パラメンタンヒドロペルオキシドおよびそ
   れらの混合物からなる群より選択される特許請求
   の範囲第１項記載の改良組成物。 ４ 該指示薬が、ベンジジン、ｏ−トリジン、
   ３，3′，５，5′−テトラ（低級アルキル）ベンジ
   ジン、２，７−ジアミノフルオレンまたはそれら
   の混合物よりなる特許請求の範囲第１項記載の組
   成物。 ５ 試験試料中の過酸化物活性化物質を測定する
   ための試験組成物であつて、該組成物が、有機ヒ
   ドロペルオキシド、該ヒドロペルオキシドおよび
   過酸化物活性化物質の存在下で検出可能な応答を
   なすことができる指示薬、並びに、式： 式中、R₁およびR₂は、同一であつても異つて
   もよく、水素、炭素数１ないし６個の低級アルキ
   ル又はα−ナフチルであり、X₁またはX₂のいず
   れかは水素又はNO₂であり、X₁またはX₂の他方
   は水素である、 で示されるアニリンからなる組成物を包含せしめ
   た担体マトリツクスよりなることを特徴とする試
   験試料中の過酸化物活性化物質の存在を測定する
   ための試験具。 ６ 該アニリンが、フエニル−１−ナフチルアミ
   ン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
   ル−３−ニトロアニリン、ｐ−ニトロアニリンお
   よびそれらの混合物からなる群より選択される特
   許請求の範囲第５項記載の試験具。 ７ 該ヒドロペルオキシドが、クメンヒドロペル
   オキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイ
   ソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、２，５
   −ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキ
   シド、パラメンタンヒドロペルオキシドおよびそ
   れらの混合物からなる群より選択される特許請求
   の範囲第５項記載の試験具。 ８ 該指示薬が、ベンジジン、ｏ−トリジン、
   ３，3′，５，5′−テトラ（低級アルキル）ベンジ
   ジン、２，７−ジアミノフルオレンまたはそれら
   の混合物よりなる特許請求の範囲第５項記載の試
   験具。