JPS59195157A - 過酸化物活性化物質測定用試験組成物、試験具並びにそれらの使用方法および製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、試験試料中の過酸化物活性化物質の
測定用分析試験、並ひに特に、高い保存安定性を有する
、かかる測定のための改良試験組成物および試験具に関
すると共に、該改良組成物および試験具の製造方法およ
び使用方法に関する。

多くの分析方法が、尿、糞便懸濁液および胃腸内容物品
ような生物学的試料中の過酸化物活性化物質の存在を検
出するために利用できる。ヘモグロビンおよびその誘導
体は酵素ペルオキシダーゼと類似した挙動をするので、
それらはかかる″過酸化物活性化゛物質の典型例である
。かかる物質はまた、偽ペルオキシダーゼとも呼ばれて
いる。

すなわち、それらは、過酸化物類と、ベンジジン、ｏ−
トリジン、３．３°、５，５″−テトラメチルベンジジ
ン、２，７−ジアミツフルオレンまたはそれらに類似し
た物質のような指示薬化合物との間のレドンクス反応の
触媒として働き、それによって変色のような検出可能な
応答を生ずるという点で酵素様である。したがって、試
験試料中の潜血の存在を測定するための方法のほとんど
は偽ペルオキシダーゼ活性に基づく。

７色指示薬を過酸化物によって酸化する際の酵素様触媒
作用に基づいた分析試験法が、ここ何年にわたって発展
してきている。これらには、湿式化学法または溶液法、
およびいわゆる“浸漬−読取り″型試薬含有細片試験具
かある。前者のうち、典型例は、リチャート・エム・ヘ
ンリー（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｍ、Ｈｅｎｒｙ）等、Ｃ１１
ｎｉｃａｌ　ＧｈｅｍｉｓｔｒｙＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、第２版、（ハーケ
ルスタウン、メリーランド：ハーバ−およびロー（Ｈａ
ｇｅｒｓｔｏｗｎ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ：Ｈａｒｐｅｒ
　ａｎｄ　Ｒｏｗ）　。

１９７１１１１１２４−１１２５頁に述べられている。

この方法には、氷酢酸（緩衝剤）、ジフェニルアミン（
指示薬）および過酸化水素を用いる。かかる湿式法は分
析上の有用性を立証してきたが、それらは、又試薬の安
定性が低く感度が適切でないというような欠点も有する
。

過酸化物活性化物質の測定のだめの別の方法で、現在多
くの臨床検査技師に好まれているものでは゛浸漬−読取
り°゛固相試薬細片試験具を用いる。かかる試験具の典
型的なものは、ヘマスチックス（ｌ（ＥＭＡＳＴＴＸθ
）の商標名で、マイルス・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテンドのエイムズ０ディビジョン　（Ａｍｅｓ　Ｄ
ｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、Ｉｎｃ、）より市販されているものである。そ
れらは木質的に、プラスチック細片または把手に固着さ
れた多孔性の紙マトリフクスよりなる。このマトリツク
スは有機ヒドロペルオキシド、例えば、クメンヒドロペ
ルオギシドと指示薬化合物のＨＭｉ化化合合物含浸され
る。ヘモグロビン、ミオグロビン、赤血球または他の偽
ペルオキシダーゼのような分析対象物を含有する液体中
に浸漬すると、７トリツクスに青色が発現し、その強さ
は試料中の過酸化物活性化物質の濃度に比例する。かく
して、マトリックスに発現した色を標準カラーチャート
と比較することにより、検査技師は、半定量的ベースで
、試料中に存在する分析対象物の量をＸｌｌ定すること
ができる。

試薬細片は湿式化学法に比べて多くの有利性を有してお
り、試薬調製も付属装置も必要としな（１ので遥に使い
やすく、また試薬が乾燥した固体状態なので試薬の相対
的安定性が大きく、結果として精度、感度および経済性
が改良される。し力へしなから、多くの従来の、現在利
用しうる試薬細片試験具は保存寿命が限定されるという
重大な欠点がある。すなわち、製造後長期間にわたる保
存安定性が欠如し、試験具を使用する際、過酸化物活性
化分析対象物の存在に対する反応性が著しく減少する結
果となる。すなわち、試薬細片のような分析具は１通常
、製造直後には使用されず、使用までの保存期間がまち
まちであるため（こ、力）つ、従来の試薬細片の製造と
使用との間の期間があまりに長く、反応性が著しく失わ
れる結果となり、誤った負の試験結果を導くために、高
０保存寿命は著しい長所となリラる：保存寿命が長けれ
ば長いほど、分析結果の信頼性は高いものとなる。

過酸化物活性化物質、例えば、尿中の潜血またはヘモグ
ロビンを測定するだめの従来の同相試薬細片試験具では
、通常、指示薬系として・有機３ドロペルオキシド、例
えば、クメンヒドロペルオキシドによる、ポルフィリン
を触媒とするベンジジン系指示薬、例えば、０−トリジ
ンまたは３．３’。

５．５°−テトラメチルベンジジンの醇化を利用する。

しかしながら、このような従来の試験細片は、長い保存
期間中または高温での保存中に反応性を喪失する傾向が
特にあることが知られており、この現象は、細片の１ま
たはそれ以」二の試薬成分の蒸発または化学分解に因る
ものと信じられている。雰囲気温度で保存されたこのよ
うな従来の試薬細片において、反応性の実質的低下が観
察されるばかりでなく、高温での保存によって、これら
の低下は実質的に強調され、かつ、低下の割合も加速さ
れるようである。試薬細片中の反応性の低下についての
説明としては次のものが５７能である：（１）試薬組成
物の主成分が分解または蒸発して、成分濃度が適切な反
応性を維持するのに必要な最低濃度以下に落ちる；およ
び（２〕細片中の２またはそれ以上の成分が有害的に相
互反応して、反応性のないまたは妨害性のあるｌまたは
それ以上の新しい種を生成する。

試薬組成物、およびそれから製造される過酸化物活性化
物質測定用の固相細片試験具の反応性を安定化する試み
は種々のアプローチをたどってきている。例えば、アダ
ムス・ジュニア　（Ａｄａｍｓ。

Ｊｒ、）等の米国特許第３，０９２，４Ｅｉａ号は体液
中の潜血を検出するための改良試験組成物および試験具
を開示している。この組成物は、コロイド物質製の微小
球状の泡中にカプセル化またはトラップ化された有機ヒ
ドロペルオキシド、有機ヒドロペルオキシドからの酸素
の移動を受容してヘモグロビンの補欠分子族の触媒作用
により誘起される呈色応答を生ずることのできる指示薬
または色素前駆体、および試験される物質のｐＨを４か
ら６．５の範囲に維持するための緩衝剤よりなる。この
特許は、ヒドロペルオキシドをカプセル化またはトラッ
プ化するために用いるコロイド物質１例えば、ポリビニ
ルアルコール、ゼラチン、アラビアゴムまたはカルボキ
シドこルポリマーにより、該組成物より製造された試験
具の好ましい実施態様での反応性を、７５°Ｃで３００
時間の保存後でさえも安定化することができ、それに対
してヒドロペルオキシドのカプセル化なしに製造した同
様の試験具は５０℃で２４時間後には反応性が失われる
ことを開示している。

安定化された試験組成物および試験具の別の開示として
は、アダムス・ジュニア（Ａｄａｍｓ、Ｊｒ、）　等の
米国特許第３，２５２，７８２号のアプローチがあり、
そこでは、用いられた有機ヒドロペルオキシドがコロイ
ド物質、例えば、ジアルデヒド多糖類で固定することに
よって硬化されたゼラチンのようなコロイド状物質中に
カプセル化されている。このようにカプセル化されたヒ
ドロペルオキシド、適切な指示薬および緩衝剤を含有す
るかかる組成物は、種々の悪影響のある温度条件のもと
で高い安定性を示すといわれている。

かかる試薬細片試験具の安定化についての、更に別に開
示された試みとしては、Ｃｈ　ｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒ
ａｃｔｓ　８５巻、１８６頁（１９７６）ノ詳説があり
、これは、ｏ−トリジンおよびフェニルイソプロピルヒ
ドロペルオキシドを含有する試薬細片を製造するための
２段階−浸漬法について述べている。この開示は、指示
薬（０−トリジン−２１（ＯＬ）およびポリビニルピロ
リドンのエタノール溶液を調製することを報告している
。この溶液に少計の界面活性剤および十分な量のクエン
酸塩緩衝剤を添加して、ＰＨを３．７とし、その後エチ
ル・セルロースを含浸せしめたろ紙細片をこの溶液に浸
漬し乾燥した。この含浸る紙を、次に、エタノール−ト
ルエン混合物中に溶解した１、４−ジアザビシクロ［２
，２，２］−オクタン、フェニルイソプロピルヒドロペ
ルオキシドおよびポリビニルピロリドンを含有する第２
溶液中に浸漬した。この作業の目的はビシクロオクタン
誘導体およびポリビニルピロリドンの使用により、ペル
オキシドおよび指示薬の組合せを安定化同様の方法が米
国特許第３，８５３，４７１号に開示されている。この
特許は、その１δ換アミド基が主にＮ−モルホリン基で
あるリン酸アミド類またはホスホン酸アミド類の使用を
開示している。

試薬組成物を安定化するだめの別のアプローチとしては
、クメンヒドロペルオキシドおよび指示薬に加えて、種
々の稀釈剤化合物、例えば、ジメチルスルホンおよびＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミドの６、Ｂ合物を用いる米国
特許第４，０７１，３１７号、同第４．０７１，３１８
号（ホウ酸エステル類の使用）；および同第４，０７１
，３２１号（稀釈剤およびホウｍエステル類の両者の使
用）がある。

これらの一般概念にとっての重要な別の参考文献として
は、触媒および酸化剤として用いられる有機ヒドロペル
オキシド類の安定化に向けられている米国特許第３，２
３３８５０号がある。この参考文献は有機過酸化物と共
に一級、二級または三級アミン塩を使用することを開示
しており、固相試薬細片試験具の安定性の問題には向け
られていない。

湿式化学法と比べて固相試薬細片試験具固有の分析」二
の利点、およびかかる細片試験具の反応性の安定化につ
いての従来技術における先に例示した利点にも拘らず、
後者の安定特性は、特に、過酸化物活性化物質の測定用
試験具の場合には、なお、更なる改良を必要としている
。現在の技術水／１１８の、過酸化物活性化物質測定用
固相組成物および試験具の性質は湿式化学法および安定
性向上技法を全く含まないものより大幅に高められてい
るが、それにも拘らず、もしも化学的物質の添加、カプ
セル化による試薬の隔離、またはかかる組成物および試
験具の、同様の比較的複雑かつ高価な処理を必要とせず
に、かかる細片を長期の保存中、より安定にすることが
でき、かつ、かかる長＋１ＪＩ間の保存後も過酸化物活
性化分析対象物に対して、より高い感度を持たせること
ができれば著しく有利なものとなるであろう。例えば、
従来、固相試験組成物および試験具に用いられた公知の
有機ヒドロペルオキシドにとっての適切な直接的代替物
、および長期の保存中、これら組成物および試験具の試
薬系をより安定にすることができるものを提供すること
ができれば当業界において大幅な進歩となるであろう。

従来用いられるヒドロペルオキシド類としては、例えば
、クメンヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド、ジイソプロビルベンセンヒドロペルオキド、２
，５−シメｆ　Ｊｌ／−ヘキサン−２，５−ジヒドロペ
ルオキシドおよびバラメタンヒドロペルオキシドが挙げ
られる。

従来の有機ヒドロペルオキシド類、例えば、過酸化物活
性化物質測定用組成物および試験具において先に列挙し
たものに代るべく選択される代替物は、従来用いられる
指示薬系の存在下で分析対象物とのレドックス反応に同
様に関与して変色または試験組成物による光吸収量また
は光反射量の変化のような検出可能な応答を生ずること
ができるばかりでなく、それら従来のヒドロペルオキシ
ド類のそれに匹敵する程度にかかる反応性を示さねはな
らない。シー拳チェンおよびシー・シーφリン（Ｃ、Ｃ
ｈｅｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ｃ：、Ｌｉｎ）Ｂｉｏｃｈｉｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、１７０（１９８８）、３８８−３７４頁は溶
液実験において、テトラリンヒドロペルオキシドは、テ
トラロールへの転換中、１デシリットル当り１００　ミ
リグラム（ｍｇ／ｄｌ）濃度のヘモグロビンと共に１時
間３７°Ｃで温１δすると、ある触媒活性を示すことを
開示している。この論文はまたテトラリンヒドロペルオ
キシドが正常な溶液状態の下で、およびヘモグロビン以
外の種々の鉄化合物の存在下で安定であることを開示し
ている。従って、少くとも湿式化学法における従来の有
機ヒドロペルオキシドに比べ、その使用の利点は明らか
なようである。しかしながら、現在知られているかぎり
では、ヘモグロビンのような過酸化物活性化物質を用い
る触媒反応における、固相でのテトラリンヒドロペルオ
キシドの関与に関するいかなる示唆もこの文献にはない
。事実１．著者は、溶液中のヘモグロビンのこのヒドロ
ペルオキシドに対するの触媒活性は、活性肝臓酵素、す
なわち還元ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
・ホスフェイト（ＮＡＤＰＨ）で得られる活性度の僅か
約３６％であると述べている。

これは、分析対象物が０．０４５ｍｇ／ｄｌの低濃度と
予想される、過酸化物活性化物質のための固相試薬試験
において用いるのに適切だと考えられるものより、かな
り低い活性レベルである。したがって、。

クメンヒドロペルオキシドのような、かかる従来用いら
れる化合物により示される活性と比較することにより、
この文献には、テトラリンヒドロペルオキシドが、従来
の固相試験具に典型的に用いられるベンジジン型指示薬
系を用いての触媒反応において適切に機能するであろう
という示唆は全く含まれない。

過酸化物活性化物質測定用の従来の固相試薬組成物およ
び試験具の、保存安定性または“保存寿命”の欠如をも
たらす、反応性の低下がしばしば観察されるが、これは
試薬細片中に用いられる有機ヒドロペルオキシドの喪失
および／または化学分解に起因するものと現在仮定され
ている。かかる喪失または分解は、例えば、ヒドロペル
オキシドの分解または蒸発、または他の細片成分との化
学相互反応から起こることがあるだろう。しかしながら
、分解、または悪影響を与える相互反応に起因する崩壊
がほとんどの反応性低下の理由となるであろう。かかる
分解を引起す機構は現在解明されていない。

かかる試薬系にテトラリンヒドロペルオキシド類を有利
に包含させることによって、現在の技術水準である、慣
用の過酸化物活性化物質測定用の同相試薬系を木質的に
改良し、がっ、かがる慣用系の前述の安定性についての
問題を大幅に克服することができることが現在発見され
ており、かつ本発明はこの発見に基づくものである。本
発明によれば、従来技術において典型的に用いられる、
１またはそれ以上の、これら有機ヒドロペルオキシド類
、例えば、クメンヒドロペルオキシドの代りに、醇化剤
として、テトラリンヒドロペルオキシドが用いられる。

試薬、化学添加物等の隔離のような技法を用いる安定化
組成物と比較すると、この直接的な代替は、本発明の組
成物についての経済性および信頼性が高められる結果と
なることが判明している。更に、予想に反して、テトラ
リンヒドロペルオキシドにより、その系は固相において
過酸化物活性化物質の存在に対して十分な感度を示すこ
とができ、クメンヒドロペルオキシドを用いる従来の組
成物のそれに匹敵する効率特性を有する有利な分析具と
することが可能なようである。ヘモグロビンの存在下で
のテトラリンヒドロペルオキシドの反応特性が知られて
おり、前述の溶液実験の見地から、このヒドロペルオキ
シドは使用に不適切であろうことを示唆しているにも拘
らず、１デシリットル当り０．０４５　ミリグラム（ｍ
ｇ／ｄ　ｌ　）と低い濃度の尿中ヘモグロビンの検出が
本発明により達成されている。

一般に有機ヒドロペルオキシドおよびヘンシシン系レド
ックス指示薬よりなる、従来の過酸化物活性化物質測定
用分析試薬系とは異なり、本発明は、試験試料中のがか
る物質を測定するための、改良固相安定化分析組成物を
提供する。該組成物は、テトラリンヒドロペルオキシド
、並ひにこのヒドロペルオキシドおよび過酸化物活性化
物質の存在下で検出−可能な応答を提供することができ
る指示薬を用いることにより改良され、後者の過酸化物
活性化物質はこのヒドロペルオキシドと指示薬との間の
反応を触媒するか、さもなければこの反応に関与し、こ
の指示薬が、順次、色または他の検出可能な応答を生じ
、その強度が分析対象物の濃度を示唆する。

本発明はまた改良固相分析試験具をも提供し、好ましい
実施態様においては、本発明の改良組成物を包含せしめ
た担体マトリックスよりなる。テトラリンヒドロペルオ
キシドと、組成物中の他のほぼ慣用的な成分との新規な
組合せの総体的効果によって、該組成物、およびそれを
包含せしめた試験具の反応性を、特に雰囲気温度および
高温の双方での長期にわたる保存において、著しく安定
させることができると信じられている。このことが従来
の組成物および試験具と比較して、高められた゛°保存
寿命゛°をもたらす点で有利である。更に、本発明の組
成物および試験具は、試料中の過酸化物活性化分析対象
物の存在に対する優れた感度を有する。

更に、本発明の分析具の使用法並びにその製造法が提供
される。好ましい実施態様においては、本発明の試験具
は分析下の液体試験試料中にそれを浸漬し、そこに生じ
た変色のような検出可能な応答を観察することにより用
いられる。好ましくは、本発明試験具の製造法ば、担体
マトリックス、例えば、多孔性の紙に組成物成分の溶液
または＠濁液を包含せしめることよりなる。

本発明に用いられるテトラリンヒドロペルオキシドは、
市販されてもおり、またほぼ慣用の有機合成技法を用い
て市販材料から容易に合成することもできる。例えば、
エッチ命ビー・ナイトおよびディー舎スワーン（）１．
Ｂ、Ｋｎｉｇｈｔ　ａｎｄ　Ｄ、Ｓｗｅｒｎ）Ｏｒｇ、
Ｓｙｎ、　３４巻（１９５４）　、９０頁記載の方法を
参照されたい。

かくして、テトラリンヒドロペルオキシドは後の実施例
に記載したようにしてテトラリンの空気酸化により合成
することができる： テトラリン　　　　　　　テトラリンヒドロペルオキシ
ド この合成において、過剰のテトラリンは威圧蒸留によっ
て除去し、生成物はトルエンより再結晶させることがで
きる。

組成物および試験具に用いられるテトラリンヒドロペル
オキシドの量は、本発明の有利性を達成ごせるために、
決定的に重要なことではなく、ａｌ１１定される分析対
象物および試験に所望される感度のレベルに基づいて、
当業者の通常の彦根に任される事柄である。すなわち、
テトラリンヒドロペルオキシドの存在によって与えられ
る安定性と同時に特定の分析情況において要求される応
答感度を達成するのに望ましい程度に、過酸化物活性化
分析対象物の存在下において、組成物または試験共が指
示薬物質との灰地性を右することを可能にするに必要な
化学反応および化学変化を提供するに十分なｈ（を、例
えば、含有させる。したがって、テＩ・ラリンヒドロペ
ルオキシドのり１１は分’Ｊｒ　＋ｂｕ験が、特定の分
析対象物についてのスクリーニング、半定量分析または
定ｒ′１−分析のいずれのために用いられるかによって
、広範囲に変化する。テトラリンヒドロペルオキシドの
へ１は例えは、米国４′ｒ許第３，０９２，９７６号お
よび第３．０！１１２，４６３号にｊ用７１＜されてい
るもののような従来公知の調製物に用いられるクメンヒ
ドロペルオキシドのような、従来のヒドロペルオキシド
の量と実質的に同じでよく、同様の参考文献にはかがる
分析対象物の半定１１１−的ａｌ！Ｉ定か記載されてお
り、ヒドロペルオキシ］・の好ましい濃度範囲について
参考にすることもできる。したがって、前述の有利な安
定性を達成するために、本発明の組成物および試験共に
おいては、過酸化物活性化物質に対する試薬系の機能お
よび感度に大きな影響を与えることなしに、公知の有機
ヒドロペルオキシドをテトラリンヒＩ・ロペルオキシ１
Ｓ′で代任することが可能−である。

先に示したように、テＩ・ラリンヒドロペルオキシトの
存在によって改良された本発明の試験組成物は、テトラ
リンヒドロベコレオキシドおよび過酸化物活性化物質の
存在下で、目視によるか、または器具手段によって検出
可能な、変色または他の応答のような検出可能な応答を
生ずることができる指示薬化合物を、更に少くとも１つ
含む。適切な指示薬としてはいわゆる“ベンジジン系パ
化合物、例えば、ベンジジン、０−トリジン、　３．３
’。

５．５′−テトラ−（低級アルキル）ベンジジン、２，
７−ジアミツフルオレンまたは種々の比でこれらを４昆
合したものが挙げられる。”低級アルキルパは、メチル
、エチル、ｎ−プロピルおよびイソプロピル、並ひに種
々のヲチル、ペンチルおよびヘキシル異性体をはじめと
する、１から６の炭素原子を右するアルキル基を一〇、
味する。他の適切な指示薬としては、ｏ−ｌ・ルイジン
、Ｐ−トルイジン、０−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ’
−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ’−ジエ
チル−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−アニシジン、ジ−
アニシジン、０−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ〜ク
レツール、アルファーナフトール、ヘーターナフトール
、カテコール、グアヤコール、ピロガロール、またはへ
テロ環式アジン系のもの、例えば、ビス−（Ｎ−エチル
−午ノールー２−オン）−アジンまたは（Ｎ−メチルベ
ンツチアソール−２−オン）−（１−エチル−３−フェ
ニル−５−メストリアゾール−２−オン）−アジンがあ
る。しかしながら、指示薬として最も好ましいものは、
３゜３’　、５．５’−テトラメチルベンジジンである
。

好ましい実施ｙル様においては、本発明の改良試験組成
物を担体マトリックス上に包含するか、または担体マト
リックスに包含せしめて、固相゛浸漬−読取り゛試験具
を製造する。かかる本発明の試験具は、試験組成物の溶
液を吸収剤マトリックス相に含浸させ、ついで、含浸マ
トリックスを乾燥して、微細かつ均一な組成物成分のｌ
昆合物をこのようにマトリックス内に包含させることを
含む挿々の公知の方法により製造することができる。

用いることができる適すコなＪｐ体マトリンクスとして
は、紙、セルロース、木、合成樹脂フリース、カラスＩ
ＪＩ　ｍｌ−紙、ポリプロピレン・フェルＩ・、不織布
または織布等を挙げることができる。４［１体マトリッ
クスとして、本発明に用いるのに最も適切で好ましいも
のは、ろ紙のような多孔性の紙である。しかしながら、
担体マトリックスとして用いるのに適切な材料の選択は
当業者の通常の選択に任される事柄であり、マＩ・リッ
ークスは種々の物理的形態をとることができ、それらの
すべては本発明の範囲内のものとされることを認識すべ
きである。試験具の製造の最も好ましい方法は、組成物
成分が共に溶液または懸濁液に混合され、この８液に７
トリツクスを含浸または浸漬し、ついで、取出し乾燥を
行なう、ｌ工程方法でマトリックスを含浸することであ
る。乾燥された含浸マトリックスは次に、両面粘着テー
プのような適！、ＩＪな手段により、例えば、長方形の
プラスチンク細片よりなる担体部材の一端に固着させる
ことができ、細片の他端は使いやすくするために把手と
して働く　。

試験反応に積極的に関与する前述の試験組成物成分の外
に、用いられた指示薬を分散させるための溶媒、増粘剤
、湿潤剤、緩衝液、乳化剤および（ｔｈｌの周知のアジ
ュパンｉ・のような更なる成分もまた本発明の試験組成
物および試験共に含有させることができる。すなわち、
例えは、増粘剤としては、セ゛ラチン、アルキン、カラ
ケーン、カセイン、アルブミン、メチルセルロース、ポ
リビニルピロリドン等のような種々の材料を用いること
かできる。湿潤剤としては、ラウリル硫酸す］・リウム
が好ましいが、スルホコハク醇ジオクチルナトリウムま
たはドデシルベンゼンスルホン酸すトリウムのような長
い鎖状有機硫酸塩′またはスルホン酸塩もまた用いるこ
とかできる。緩衝系としては、酒石酸塩、リン酸塩、フ
タル酸塩、クエン酎１月、酢酸塩、またはコハク酸塩緩
衝剤を用いることができる。組成物は約３．５から７．
０のｐＨ値に緩げす化されることが好ましい。乳化剤と
しては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、カルホ
キシヒニルポリマー等を用いることかできる。指示薬を
懸濁するのに有用な有機溶媒としては、ジメチルホルム
アミド、クロロホルム、二１ム化エチレン、ベンセン、
酢酸エチル等のほとんどの非反応性、蒸発性溶媒を挙げ
ることができる。

使用に際し、試験具の含浸７トリツクスは試ネ１液体ま
たは試験されるべき物質の液体懸濁液中に浸漬し、つい
で、直ちに、引上げることができる。例えば、ヘモグロ
ビンのような過酸化物活性化物質が存在する場合は、試
験組成物を試料と接触させると、正の検出可能な応答、
例えば、呈色反応を生しる。次に、呈色応答を、例えば
、予め検−４１された標準色と比較して、試料中に含ま
れるヘモグロビン量についての半定量的評価を（４４る
ことかできる。非溶血赤血球細胞は通常無色のマトリッ
クス内に点もしくは斑点状の色として現われ、それに対
して、溶血赤血球細胞はマＩ・リンクスを一様に着色す
るであろう。本発明の組成物および試験具により検出で
きる他の過酸化物活性化物質としては、例えば、ペルオ
キシダーゼ、ミオプロピン、赤血球、および他の偽ペル
オキシダーゼを挙げることかできる。１１視比較に加え
て、マトリックス内の色または他の応答を測定するため
に種々の器具を用い、それにより人間の眼の主観的測定
を排除することにより、試験の定量！？、度を高めるこ
とができる。

本発明の組成物および試験具は、溶液中ばかりでなく又
糞便、胃腸内容物等のような固相または半固相物質中の
過酸化物活性化物質の測定にもまた用いることができる
ことを認識すべきである。

すなわち、例えば、固相または半固相物質の薄層を試験
具の担体マトリックスに塗１１）シ、変色のような検出
可能な応答を７トリンクス中で観察することかてきる。

改良された本発明の試験組成物および試験具は、安定性
が高いという点で有利なばかりではなく、また過酸化物
活性化物質に対する感度が高く、比較的低い濃度の過酸
化物活性化物質に対して検出可能な応答を生じることが
見出されている。好ましい実施態様においては、本発明
の試験組成物は０．０４５ｍｇ／ｄｉの低濃度の尿中ヘ
モグロビンを検出することができることが判明しており
、これはＩ：Ｉ、０００，０００の血液稀釈に相当する
。この高感度は、少なくとも、過酸化物活性化物質のた
めの多くの従来の技術水準の試験の感度に匹敵する。

」二連のように、本発明の組成物を種々の方法で適切な
担体マＩ・リックスに包含せしめて、試験具を製造する
ことができる。例えば、水、またはジメチルホルムアミ
ド、アセトン、エタノールまたはそれらの混合物のよう
な他の適切な溶媒に、成分を溶解または懸濁させること
ができる。次に、かかる溶液または懸濁液をろ紙担体マ
Ｉ・リックスを含浸するのに用いることができる。１１
１体マＩ・リックスは、組成物中に浸漬するかまたは、
例えは、ドクター・ブレードで組成物を塗布するか、イ
ンキとしての組成物を包含せしめることかできるが、そ
の場合試薬はマトリックス上に印刷される。その後、マ
Ｉ・リックスを乾燥して、マトリックス内に包含された
同相組成物を有する完成試験具を製造する。

現在好まれている方法は、組成物成分の溶液または懸濁
液をろ紙に含浸することであり、好ましい溶媒は蒸留水
または脱イオン水および／またはジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）である。かかる含浸は、１枚のろ紙を溶液ま
たは懸濁液に浸漬し、ついで空気炉中でろ紙を乾燥する
ことにより達成することができる。試験具を完成させる
ために、次に、乾燥ろ紙を一辺約０．６センチメー］・
ル（ｃｍ）の正方形に裁断し、これを約０．８ｘｌＯｃ
ｍのポリスチレン・フ）ルム細片の一端に貼伺する。貼
付は、スリー・エム・カンパニー（３Ｍ　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）より市Ｉ坂されているような、両面接着剤転写テー
プを使用して達成される。

本発明の試験具の別の製造方法は、組成物成分のいくつ
かを含む水溶液をろ紙マトリ・ンクスに含浸させ、つい
で、テＩ・ラリンヒドロペルオキシＩ・および指示薬を
含有する有機溶液を７トリンクスに含浸させる。すなわ
ち、この”二段階−浸漬”法においては、ろ紙を、第一
溶液で含浸し、ついで乾燥し、ヒドロペルオキシドおよ
び指示薬の第二溶液で再び含浸し、ついで１度１」の乾
燥を行う。

本発明の試験具の最も好ましい製造方法は、試薬（ヒド
ロペルオキシドおよび指示薬以外の）、緩衝剤、湿潤剤
等からなる組成物成分を含む第一水溶液を調製し、ヒド
ロペルオキシドおよび指示薬試薬をすべての残りの成分
と共に含む第二有機溶液を調製し、それに続いて、二つ
の溶液を混合し、混合物にろ紙を浸漬し、乾燥させるこ
とである。試験具はそこで上述のように完成される。

Ｌ亙ｊ 次の実施例は、本発明の概念および有利性を更に示すた
めに用意された。実施例は、本発明の試験具をいかに製
造し、いかに使用するかを説明することを意図しており
、その範囲を制限するものと理解すべきものではない。

更に、テトラリンヒドロベルオキシトを合成するための
、多くの従来の有機合成法が詳述されているが、これも
また、単に説明のためであることを認識されたい。ここ
で表わされるすべての百分率（パーセント）は、特に断
わらない限り重量パーセントである。

ａ、テトラリンヒドロペルオキシドのＡ蒸留したばかり
のテトラリン［１６３グラム（ｇ）。

１．２１ｍｏ１］に＃素を２４時間θ３−８５°Ｃで通
気した。次に、温度を　８８−７０　’Ｃに上げ、反応
を更に２４詩間そのまま続けた。過剰の出発物質はアル
ゴン雰囲気中減圧下［０，３ミリメートル°（ｍｍ）］
　で留去し、残査油をトルエン−ヘキサンより再結晶し
た。結晶を５０ミリリツトル（１）のヘキサンで洗浄し
、アルゴン雰囲気中２ｍｍの減圧下で一晩乾燥して、融
点５２．５−５４℃のテトラリンとドロペルオキシド１
３．８ｇ（８，８３％収率）を生成した。ヨウ素滴定は
この生成物がＨ％の純粋なテトラリンヒドロペルオキシ
ドであることを示した。

ｂ、試験、成　゛よび試験具の４製 次の成分を、列挙した順で混合することにより第一・溶
液を調製した： ２５ｍ１の蒸留水 １．３９ｇのクエン酸、　　　　　　ｐ）１．８・９３
．３４ｇのホウ酸トリ エタノールアミン、　０．４　Ｍ＊ ０．５ｇ　　のラウリル硫酸ナトリウム；　１．０２：
２０．０３４ｇ　　のエチレンジアミン四酢酸次いで、
第二溶液を次のものを混合することにより調製した： ２５１　のジメチルホルムアミド （１，２ｍｌの６−メドキシキノリン；　Ｑ、４＄＊０
．０５ｇのオレンジＧ　染ネ：［ よ：混合溶液中の成分の最終濃度 第一溶液を第二溶液と十分に混合して、テトラリンヒド
ロペルオキシド約０．２モル濃度の、本発明による試験
組成物を調製した。

前述の組成物から試験具を製造するために、１枚の実験
室用ろ紙［（ワットマン・スリーエムエム（Ｗｈａｔｍ
ａｎ　３８Ｍ））を混合溶液に約８分浸漬し、ろ紙を取
出し、空気炉中１０５°Ｃで乾燥することにより、ろ紙
に組成物を含浸せしめた。次に、０．６センチメードル
（ｃｍ）平方の乾燥含浸紙を裁断し、約０．８　Ｘ　１
０ｃｍのポリスチレンフィルム細片の一端に、両面接着
剤転写テープ［スリーエム・カンパ＝　−（３Ｍ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）］　を用いて貼付した。

１デシリットル当り０．０４５　ミリグラム程度の、種
々の低濃度のヘモグロビンを含有する尿試料中で、上述
のようにして製造された本発明の試験具の試験を行なう
と、ヘモグロビン濃度に相当するレベルの、［１視で認
識されうる呈色を生し、試験具が、尿中ヘモグロビンの
検出能を有していることを示した。テトラリンヒドロペ
ルオキシドの代りにクメンヒドロペルオキシドを用いた
外は実質的に先に述べたようにして製造した対照試験具
は、同様の尿試料中の同一レベルのヘモグロビンに相当
する、実質−的に同一の呈色応答を生した。

この試験の結果は、本発明の好ましい実施態様によって
製造した試験具が、尿中のヘモグロビンに対して、クメ
ンヒドロペルオキシドを含有する従来の試験具と実質的
に同じ感度を有することを示した。

グｊＬ性」（紛 前出の実施例に述べたようにして、本発明によって製造
された試験具の、雰囲気温度および高温での保存安定性
すなわち　”保存寿命”を測定するために試験が行なわ
れた。

本発明による試験組成物、およびそれから製造される細
片試験具を実施例に述べたようにして製造し、更に、こ
れらの試験具と実質的には同一であるが、テトラリンヒ
ドロペルオキシドの代りにクメンヒドロペルオキシド（
２ｍｌ、０．２モル濃度）を含有する対照試験具を製造
した。製造に引続き、数組の試験具に、５０°Ｃで１−
４週間の範囲の種々の期間、保存することによって、促
進試験を行なった。５０°Ｃにおける１週間の保存は、
雰囲気温度においては少なくとも８力月の保存に相当す
ると考えられた。かかる保存の後、−組の促進試験に伺
した試験具を、過酸化物活性化物質が負であることが分
っている尿試料に浸漬したところ、呈色応答を生しなか
った。他の数組の促進試験に付した試験具を、既知量の
ヒト全血を添加した尿試料に浸漬した：これら後者の試
験具に呈色が観察された。

別の数組の試験具における呈色を、マクヘス（Ｍａ’ｃ
ｂｅｔｈ）　比色計（コロモルガン・カンパニー（Ｋａ
ｌｌｍｏｒｇａｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ）より市販〕を用い
て更に監視した。この計器は、マイクロプロセンサによ
り制御された、ｕｆ視範囲内の反射率スペクトルの高速
測定に適した走査反射率スペクトロメータである。マク
ベス　（Ｍａｃｂｅｔｈ）比色計での試薬細片試験具の
性能測定は、同一細片中の呈色の目視観察と比較して、
次の長所を有する： ｌ）　光源および試料の周囲の他の条件が一定である； ２）　目視観察では検出主体（すなわち、観察者の眼）
が個人個人により変化し、同一人物でも日によって変化
するのに対し、検出主体の特性が一定である；および ３）　計器測定は目視観察が行なうより、より正確な定
量データを可能にし、結果について、より客観的な比較
ができる。

マクヘス　（Ｍａｃｂｅｔｈ）比色計により得られたデ
ータを有意に算定するために、それを用いての試験結果
はＢ零単位で表わされた。これらの単位は三次元カラー
空間における黄変／青度値の計器基準尺度である。マク
ベス　（Ｍａｃｂｅｔｈ）比色計により得られた任意の
反射率（色）値からのＢ＊値を得るために、ディー・ビ
ー・シャットおよびジー・つ°イスゼック（Ｄ、Ｂ、Ｊ
ｕｄｄ　ａｎｄ　Ｇ、Ｗｙｓｚｅｃｋ）、　リ±其ｉｎ
　Ｂｕｓｉｎｅｓｓ　、　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｙ［ジゴン０ワイリー・アンドやサンプ（
Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄＳｏｎｓ）、ニューヨー
ク　１９７５］に記載されている方法を用いて相関式を
作成する。促進試験に付されない、すなわち実質的に十
分反応性を有する、クメンヒドロペルオキシドを含む、
本発明によらない従来の試験具は、ヘモグロビン０．１
３５ｍｇ／ｄ　ｌを含む尿試料に浸漬すると、目視可能
の青色を呈する；相関値Ｂ木の数値は小さい　（約８）
。

しかしながら、保存期間を経た従来試験具、さもなけれ
ば促進試験に付された従来試験具は、０、１３５ｍｇ／
ｄｌのヘモグロビンを含有する尿中に浸漬すると、感度
の実質的低下を示して、青色ではなく緑色を呈する；そ
のような色は、より高いＢ本領（約３０）と相関する。

したがって、本発明の試験具の相対的安定性をＩＩＩ定
するためには、促進試験条件、例えば、高温での長期間
の保存ドでの、時間に対するＢ木の変化率が小さけれは
小さい程試験具の安定性が大きいことになる したがって、前出の実施例に述へたようにして、本発明
によって製造された一組の試験具から省１られたマクベ
ス比色計の変化率のデータおよびテトラリンヒドロペル
オキシドではなくクメンヒドロペルオキシドを含有する
以外は実施例に記載したようにして製造された一組の対
照試験具からイ↓ノられたデータを下に示す。試験具を
前述の促進試験状態からはずし、０．１３５ｍｇ／ｄ　
ｌのヘモグロビンを含有する尿試料中に含浸し、ついで
取出した後、４０−４５秒以内に、−Ｍｌの対照試験具
および実施例試験具から読取りを行なった；次に、この
読取りを他の数組の同一の試験具から先に同様にしてｌ
ｊｊ、た読取りと比較した。次に、Ｂ木の変化率を伸出
した。すべての試験具についての反応性の変化率の平均
値を、１週間当りのＢ木単位で次表に示す。

試験具の形式　　　　変化率　（Ｂ＊／週）クメンヒド
ロ ペルオキシド（対照）　　　　２７．．５１テトラリン
ヒドロ ペルオキシド　　　　　　１３．４２ 更に、目視観察された呈色は、促進試験期間後、本発明
試験具においては、対照試験具におけるものより、実質
的により強くかつ均一であった。

先のデータは、クメンヒドロペルオキシドを包含させた
従来の試験具と比較して、テトラリンヒドロペルオキシ
ドを包含させた本発明の試験具は、悪影響のある保存お
よび温度負荷条件下の後でも、ヘモグロビンに対する反
応性について実質的により大きい安定性を示すことを示
唆している。更に、有利なことに、本発明の試験具のこ
の高い安定性、すなわち°゛保存寿命”のために、かか
る促進試験の後でさえも、この試験具によって、尿中の
０．１３５ｍｇ／ｄｉ濃度のヘモグロビンを十分に検出
しうる。しかしながら、クメンヒドロペルオキシドを包
含させた従来の試験具の反応性の喪失は極めて速くしか
も木質的であり、促進試験期間後、それらの試験具はヘ
モグロビンに対する反応性が著しく低下し、かかる長期
のかつ高温での保存後には分析具としてはかなり望まし
くないものとなる。

ここに述べた本発明の好ましい実施例における多くの修
正および変更が、本発明の精神および範囲を逸脱するこ
となしに可能であり、かつ、かかる精神および範囲につ
いての制限は特許請求の範囲によってのみ定まることを
認識すべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有機ヒドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペル
   オキシドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出可能
   な応答を提供することができる指示薬よりなる、試験試
   料中の過酸化物活性化物質測定用同相組成物において、
   該有機ヒドロペルオキシドかテトラリンヒドロペルオキ
   シドであることを特徴とする組成物。 ２該指示薬が、ベンジジン、０−トリジン、３．３’　
   、５，５°−テトラ−（低級アルキル）−ベンジジン、
   ２，７−ジアミツフルオレンまたはそれらの混合物より
   なる特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３有機ヒドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペルオ
   キシドおよびｉＭＭ化物活性化物質の存在下で検出可能
   な応答を提供することができる指示薬よりなる、試験試
   料中の過酸化物活性化物質測定用同相組成物において、
   該有機ヒドロペルオキシドがテトラリンヒドロベルオキ
   シトである改良組成物を包含せしめた担体マトリックス
   よりなることを特徴とする試験試料中の過酸化物活性化
   物質の存在を測定するための試験具。 ４、該指示薬が、ベンジジン、０−）リジン、３．３’
   、５．５’−テトラ　（低級アルキル）−ベンジジン、
   ２，７−ジアミツフルオレンまたはそれらの混合物より
   なる特許請求の範囲第３項記載の試験具。 ５有機ヒドロペルオキシド、並ひに該有機ヒドロペルオ
   キシドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出可能な
   応答を提供することができる指示薬よりなる、試験試料
   中の過酸化物活性化物質測定用同相組成物において、該
   有機ヒドロペルオキシドがテトラリンヒドロベルオキシ
   トである改良組成物を包含せしめた担体マトリックスよ
   りなる、試験試料中の過酸化物活性化物質の存在を測定
   するための試験具と、試料を接触させる工程、および試
   験具申の検出可能な応答を観察する工程よりなることを
   特徴とする試験試料中の過酸化物活性化物質の存在を測
   定するための方法。 ６、該指示薬が、ベンジジン、０−トリジン、３．３’
   　、５．５’−テトラ　（低級アルキル）−ベンジジン
   、２，７−ジアミツフルオレンまたはそれらの混合物よ
   りなる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、テトラリンヒドロペルオキシド、並びに該テトラリ
   ンヒドロペルオキシドおよび過酸化物活性化物質の存在
   下で検出可能な応答を提供することができる指示薬より
   なる溶液を調製する工程； 担体マトリックスを該溶液で湿潤させることにより、該
   溶液を該担体マトリックスに包含せしめる］二程；およ
   び 該湿潤マトリックスを乾燥して、該マトリックス中に該
   組成物残香を残す工程 よりなることを特徴とする試験試料中の過酸化物活性化
   物質の存在を測定するための試験具の製造法。 ８、更に、乾燥マトリックスを担体部材に固着する更な
   る工程を含む特許請求の範囲第７項記載の製造法。