JPS6326869B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ベンジジン型指示薬によつて検出し
得る分析対象物の存在についての試験試料の分析
の分野に関する。詳述すれば、本発明はベンジジ
ン型指示薬によつて検出し得る分析対象物の存在
で検知しうる応答を生じることのできる組成物に
関する。このような組成物は、過酸化水素、パー
オキシダーゼ、過酸化反応に活性な物質、種々の
還元糖、次亜塩素酸塩及びその他の分析物の検出
に役立つ。 糖の存在に関する試験試料の分析は、関連のな
い多くの技術に利用されている。従つて、本発明
は醸造工業、生化学研究及び医学的診断学のよう
な多様な技術に関する。醸造工業においては、例
えば殿粉を実際に発酵させる前に麦芽糖のような
糖類に変換させる。従つて、穀類出発物質から高
い収率を確実に得るために、麦芽糖の存在を注意
深く監視する。また、多くの生化学系はその細胞
エネルギー源として注意深く調節された濃度のグ
ルコースを必要とし、このような系の研究には、
その濃度を注意深く監視する必要がある。医師
は、血液及び尿中の異常に高いグルコース濃度に
よつて証明される糖尿病のような病気を診断し、
治療する際に大部分糖分析を利用する。 同様に、尿、排泄物懸濁液及び胃腸内容物のよ
うな試料中の過酸化反応に活性な物質の存在を検
出するために、現在多くの分析法が利用されてい
る。ヘモグロビン及びその誘導体は、酵素パーオ
キシダーゼの挙動と同様に挙動するので、“過酸
化反応に活性な”物質の代表的なものである。こ
のような物質は擬パーオキシダーゼとも言われ
る。過酸化反応に活性な物質は、過酸化物とベン
ジジン、ｏ―トリジン、３，3′，５，5′―テトラ
メチルベンジジン、２，７―ジアミノフルオレン
又は同様のベンジジン型指示薬物質との間のレド
ツクス反応に対して触媒作用をし、変色のような
検知しうる応答を生じる点で、酵素様である。試
験試料中の潜血の存在を測定する多くの方法は、
この擬パーオキシダーゼ活性による。 従つて、本発明の分野は非常に異なる一連の仕
事に及ぶ。本発明は、醸造業、食品工業、科学研
究又は医薬であれ、糖分析が重要になる場合にい
かなる場合も適用しうる。更に、本発明は、パー
オキシダーゼ又は擬パーオキシダーゼの存在を測
定する多種の技術に役立つ。事実、本発明は、検
知しうる応答を示す特異な性質を適応させうる任
意の分野に利用される。反応生成物として最終的
にH₂O₂を生じうる系又はパーオキシダーゼ又は
擬パーオキシダーゼを含む系は、次亜塩素酸塩を
含む水泳プールの水や他の強酸化性の系のような
他の系と同様に、本発明を適用するのに好適であ
る。 糖分析の歴史は、利用される基礎化学において
も、その構成においても、多年にわたつて顕著な
変化をとげたので、恐らく最も注目に値いする。
これらの分析は、概して、還元された場合に検知
しうる応答、例えば変色又は系によつて吸収或い
は反射される紫外線の波長における変化を生ずる
反応条件を開始する酸化系として特徴づけられ
る。従つて、還元糖は酸化銀を金属銀に変え、糖
の溶液を酸化銀で含浸した紙片に適用すれば、
黒色の斑点が生じる。フアイグル（F.Feigl）、
Chem.Ind.57巻1161頁ロンドン（1938）参照。同
様に、ｏ―ジニトロベンゼン並びにジニトロフタ
ル酸の３，４―及び３，５―異性体は、Na₂CO₃
中で還元糖と共に加熱すると、鋭敏な発色反応
（紫の色相を形成する）を生じる〔モモース（T.
Momose）ら、Chem.Pharm.Bull.東京12巻14頁
（1964）；フアイグル、スポツト、テスツ・イン・
オーガニツク・アナリシス（Spot Tests in
Organic Analysis）７版338〜339頁、ニユーヨ
ークのエルスフイア出版（Elsevier Publ.Co.）
（1966）参照〕。 しかし早くも1849年に還元糖がCuSO₄のアルカ
リ性溶液から黄色乃至赤色の酸化銅（Ｉ）（又は
その水和物）を沈殿させることが知られている
〔フエーリング（H.Fehling）著Ann.72巻（1849
年）及びハースタイン（B.Herstein）著J.Am.
Chem.Soc.，32巻779頁（1910年）参照〕。フエー
リング試験として知られている、この早期の画期
的研究は、アンモニア中の酸化銀、即ち還元剤と
容易に反応して金属銀の黒色沈殿を生じ、屡々ガ
ラス反応器の内壁に鏡を形成する、いわゆるトレ
ンス試薬を利用するはるかに鋭敏な試験の開発を
促進した〔トレンス（B.Tollens）、Ber.14巻1950
頁（1881年）：15巻1635頁、1828頁（1882年）〕。 糖尿病の発生率が比較的高く、また糖尿病に伴
なう臨床症状が重大であるため、生物学及び医学
関係者から尿及び血清中のグルコース濃度を分析
する新しい技術に関して高い興味が起つた。この
熱心な興味から、溶液化学の始祖からは著しく逸
脱している若干の操作が開発された。これらの操
作法は、溶液又は懸濁技術で又は分光計及び他の
器機（ハードウエア）と共に使用される乾式、浸
漬読取り装置中に組入れうる精巧な生化学的系を
利用する。 これらの新しい方法のうち、本発明は、分析物
質、例えばグルコースが特定の酵素に対する基質
であり、反応生成物が“ベンジジン型指示薬”と
してこの分野に漠然と知られている指示薬化合物
群から検知しうる応答を引出しうる酵素系に特に
良好に役立つ。これらの化合物は以下に詳細に定
義するが、目下のところこれらの化合物は過酸化
水素及び酵素パーオキシダーゼの存在下で変色し
うるものと言つておく。グルコース／グルコース
オキシダーゼ系は先行技術の一例であり、この場
合にはグルコースは下記の式によりH₂O₂の生成
を伴つてグルコン酸に酸化される： 過酸化水素の同時形成は、観察しうる発色又は
他の検知しうる応答を生じるその後の指示薬関連
工程を容易にする。従つてベンジジン型指示薬
は、過酸化水素及びパーオキシダーゼの存在下で
その吸光能を変えることによつて応答する。 実際、この技術は現在浸漬読取り試薬片、例え
ば商標クリニステイツクス（CLINISTIX）の
下でマイルス・ラボラトリイーズ社（Miles
Laboratories，Inc.）のエームス・カンパニイ・
デイビイジヨン（Ames Company Division）に
よつて市販されている試薬片等の形でグルコース
分析に利用されている。概して、これらの試薬片
は、一端に主活性成分として適切な酵素、指示薬
化合物及び緩衝剤で含浸された吸収紙部分が設け
られているプラスチツク片から成る。これらの試
験片は、試験試料中に試薬保有端を浸漬し、取り
出し、紙に形成した色を種々のグルコース濃度に
検量された標準カラーチヤートと比較することに
よつて使用される。 グルコース分析への適用に関して本発明に関連
すると考えられる数種の特許が交付された。アル
フレツド・エイチ・フリー（Alfred H.Free）に
交付された米国特許第2848308号明細書は基礎酵
素化学を開示し、特許を請求し、これによればグ
ルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及びベ
ンジジン型指示薬を試薬片に使用して尿又は他の
体液中のグルコースを測定する。スペツク
（speck）に交付された米国特許第3753863号明細
書は、ベンジジン型の指示薬溶液を“安定化”す
るため低級アルカンポリオールの使用を開示して
いる。最後に、ラム（Lam）に交付された米国
特許第4071317号明細書には、組成物を調製する
間に希釈剤として一定のスルホン化合物、スルホ
キシド化合物及びアミド化合物を使用することに
より潜血感受性組成物が安定化されている。この
後者の組成物は、有機ヒドロパーオキシド化合物
及び指示薬化合物、例えばベンジジン型化合物を
含む。 糖分析の場合のように、パーオキシダーゼ又は
擬パーオキシダーゼ分析に関しても、過酸化水素
の存在下で発色指示薬の酸化の酵素様触媒作用に
依存する数種の方法が多年にわたつて開発され
た。まず、これらの方法は湿式化学操作及び“浸
漬読取り”型試薬保有片を含む。前者の代表例は
リチヤード・エム・ヘンリイ（Richard M.
Henry）ら著、クリニカル・ケミストリイ・プリ
ンシプルス・アンド・テクニクス（Clinical
Chemistry Principles and Techniques）〔メリ
ーランドのハガースタウン：ハーパー・アンド・
ロウ（Harper and Row）（1974年）1124〜1125
頁〕に示されている。この操作は氷酢酸（緩衝
剤）、ジフエニルアミン（指示薬）及び過酸化水
素の使用を含む。このような湿式法は分析能を証
明したが、それにもかかわらず明白な欠点を伴な
い、そのほとんどは、試薬の安定性に欠け、感度
が適切でないことである。このような試薬溶液に
固有の欠点は、数日貯蔵後には新しい試薬溶液を
調製しなければならない程早い安定性（従つて感
度）の減退であり、この必要性から分析者に過剰
な時間を必要とし、高価な試薬を浪費しなければ
ならないため経済性に乏しくなる。 過酸化反応に活性な物質を測定する第二の方法
及びほとんどの臨床研究者と分析者によつて現在
好まれている方法は“浸漬読取り”試薬片を利用
する。このような試験具の代表的なものは、マイ
ルス・ラボラトリーズ社のエームス・カンパニ
イ・デイビイジヨンによつて製造され、商標ヘマ
ステイツクス（HEMASTIX））の下で市販さ
れている試薬片である。これらの試験片は、本質
において、プラスチツク片又はハンドルに固定さ
れた多孔性紙マトリツクスから成る。マトリツク
スを有機ヒドロパーオキシド及びｏ―トリジンの
緩衝された混合物で含浸する。ヘモグロビン、ミ
オグロビン、赤血球又は他の擬パーオキシダーゼ
を含む液体中に浸漬すると、マトリツクスに青色
が生じ、その強度は試料中の過酸化反応に活性な
物質の濃度に比例する。従つて、マトリツクスに
生じた色を標準カラーチヤートに対比することに
より、分析者は試料中に存在する未知物質量を半
定量的に測定することができる。 湿式化学法にまさる試薬片の利点は、主として
下記の２点である：試薬片は、試薬の調製も付随
する装置も必要としないので一層使用しやすい。
また試薬の一層大きい安定性が与えられ、従つて
一層大きい精度、感度及び経済性を生じる。 しかし湿式化学法にまさる試薬片の固有の利点
にもかかわらず、安定性及び感度の特性は更にな
お改良を必要とする。擬パーオキシダーゼ及び糖
類を測定する現在の技術水準の試験片のこれらの
性質は温式化学法の性質より著しく好ましいが、
それにもかかわらず、このような試薬片を貯蔵中
に更に安定にかつ各々の分析物質に対して更に鋭
敏に作られることができれば、この分野に大きい
進歩をもたらすであろう。 擬パーオキシダーゼ感受性系を改良する試みが
先行文献に少なくとも３種記録されている。ケミ
カル・アブストラクツ（Chemical Abstracts）
85巻186頁（1976年）には、ｏ―トリジン及びフ
エニルイソプロピルヒドロパーオキシドを含む潜
血感受性試薬片を製造する２回浸漬法が説明され
ている。この方法では、エタノール中の指示薬
（ｏ―トリジン・2HCl）及びポリビニルピロリド
ンから溶液を作つた。この溶液に少量の表面活性
剤及びPH3.7を生ずるのに充分なクエン酸塩緩衝
液を加えた。この溶液にエチルセルロースで含浸
した紙片を浸漬し、乾燥した。こうして含浸し
た紙をその後にエタノールとトルエンとの混合
物中に１，４―ジアザビシクロ〔２・２・２〕オ
クタン、フエニルイソプロピルヒドロパーオキシ
ド及びポリビニルピロリドンを溶解して含む第二
の溶液中に浸漬した。この実験を押し進めること
は、ビシクロオクタン誘導体及びポリビニルピロ
リドンを使用することにより過酸化物及び指示薬
の組合せを安定化することであつた。 このような第二の方法は米国特許第3853471号
明細書に開示されている。この特許は、置換基ア
ミド基が第一にＮ―モルホリン基である燐酸アミ
ド又はホスホン酸アミドの使用を教示する。 これらの試みの他に、米国特許第3252762号明
細書の開示もあり、この特許では有機ヒドロパー
オキシドをゼラチンのようなコロイド状物質内に
物理的に封入する。このような試験片を利用する
場合には、水性試験試料にゼラチンカプセルを溶
かし、これにより過酸化反応に活性な物質の存在
下で指示薬と更に反応するためにヒドロパーオキ
シドを遊離させる。 これらの先行の試みの各々は試薬の安定化をめ
ざしており、潜在的に矛盾する反応成分（ヒドロ
パーオキシド及び指示薬）は早期には結合せず、
これにより試験片を感受性の低いものにする。従
つて、従来法は安定性及び感度を同時に向上させ
る複合目的を志向するものではなく、むしろ貯蔵
中の試薬の分解を防止することによつて存在する
感度を保有させようとするものであつたと言うこ
とができる。 本明細書において論ずる一般的概念に対して興
味ある別の先行文献は、米国特許第3236850号明
細書である。この特許は触媒及び酸化剤として使
用する有機ヒドロパーオキシドの安定化に関す
る。この文献における特許権者は、有機過酸化物
と共に第一級、第二級又は第三級アミン塩を使用
することを開示している。この文献は試薬試験片
に関するものではない。 本発明以前の技術水準を要約すると、19世紀の
中頃程度の早い時期にフエーリング液及びトレン
ス試薬の出現と共に糖感受性化学が分析の場に現
れ始めた。それ以来現れた“純化学的”系のほと
んどは、生化学的系、特に糖オキシダーゼ、パー
オキシダーゼ及びベンジジン型の過酸化物感受性
指示薬を含む系によつてたいてい取つて代わられ
ている。これらの後者の指示薬化合物は低級アル
キルポリオールの存在によつて安定化されると言
われている。 擬パーオキシダーゼ感受性化学作用は、早くか
ら湿式化学法として利用され、担体マトリツクス
に含浸させた有機過酸化物及び指示薬、例えばベ
ンジジン誘導体を含む浸漬読取り法に道を与え
た。これらの試薬を安定化する試みは、(a)ビシク
ロオクタンとポリビニルピロリドンの併用、(b)燐
酸アミド又はホスホン酸アミド、(c)ゼラチンカプ
セルを使用する試薬の物理的分離、及び(d)第一
級、第二級及び第三級アミン塩を含んでいた。 最後に、尿中の潜血の存在に対して感受性の組
成物は、一定のスルホン、スルホキシド及び／又
はアミド化合物の存在下で配合すれば、安定化さ
れることが教示されている。出願人の知る限り、
先行技術のどれにもここで開示し、特許を請求す
る組成物及び試験用具又はその使用方法を示唆し
ているものはない。 簡単に言えば、本発明は試験試料中の成分の存
在の検出に使用するための改良された組成物、試
験用具及び方法に関する。組成物は成分の存在で
変色のような検出しうる応答を生ずることがで
き、ベンジジン型指示薬及び向上剤としてアミン
オキシド化合物を含む。 本発明はまた組成物を含浸した担体マトリツク
スを含む試験用具に関する。特定の成分の存在
は、試験試料を試験用具又は組成物と接触させ、
検出しうる応答を観察することによつて測定され
る。 本発明は周知の“ベンジジン型指示薬”系の分
流に属する。ベンジジン及びその誘導体は、水泳
プール水の次亜鉛素酸イオン及び尿中のグルコー
ス又は潜血のような種々の試験試料成分の分析に
色原体指示薬として長く使用されてきた。これら
の指示薬が容易に認識しうる種々の強度の青色を
生じうることにより、これらは定性的にも半定量
的にも利用できるようになる。 本発明は大規模でのこの指示薬系に関するの
で、用語“ベンジジン型指示薬”の範囲内に含ま
れる化合物の型並びにこのような指示薬が有効で
あることの判つている、現在公知の多くの系を明
らかにすることは重要であると考えられる。 ベンジジン及びその誘導体（“ベンジジン型指
示薬”）は、式： 〔式中Ｒ及びR^*置換基は同一又は異なり、水素、
低級アルキル基（即ち１乃至約６個の炭素原子を
有するアルキル基）、低級アルキルオキシ基（即
ち１乃至約６個の炭素原子を有するアルキルオキ
シ基）、アリール基又はアリールオキシ基であつ
てよい〕によつて最もよく定義される。更にR^*
置換基は一緒に―（CH₂）―_o（式中ｎは１又は２で
ある）を形成していてよい。Ｒ及びR^*の前記定
義の他に、これらの基自体は例えば水酸基、ハロ
ゲン、シアノ基等で置換されていてもよい。用語
“ベンジジン型指示薬”に含まれる代表的化合物
は、ベンジジン、ｏ―トリジン、ｏ―ジアニシジ
ン、３，3′，５，5′―テトラメチルベンジジン
（以下“テトラメチルベンジジン”と記す）、３，
3′，５，5′―テトラ（アルキル）ベンジジン、
種々のＮ及びN′―置換ベンジジン等である。 ベンジジン型及びその他の指示薬からの発色の
メカニズムは確実には判つていないが、２種の続
いて生じる色が生じる：第一は青色であり、第二
は褐色である。青色種は移行しやすく、最終的に
は褐色に変態するので、所定の時間内に変色を見
る必要がある。そうしなければ、青色の鋭敏な色
相（これは容易に識別しうる）はあまり容易には
判断されない褐色に変わるので、変色の真の意義
は失なわれる。試験試料中の分析物質の濃度が高
い程、高い範囲の分析物質の濃度を検出する能力
に対する制限作用により、この問題はそれだけ悪
化する。青色種の持続を延長し、これにより濃度
間の差を大きくし、かつ検出しうる濃度範囲の限
度をより高く、またより低くするのが極めて有利
であることが判る。 更に、試薬片のような分析用具は製造直後に使
用されず、通常比較的長期間貯蔵されるので、ま
た製造と使用との間の期間が長すぎて効力を失な
い、誤まつた陰性の結果を生ずることがあるの
で、貯蔵寿命の向上は極めて有用である。貯蔵寿
命が良い程、分析結果はそれだけ信頼できる。 ベンジジン型指示薬自体の他に、本発明は、特
定の分析物質の存在下で検出しうる指示薬の応
答、例えば色の出現又は変化を促進する無数の試
薬系を考慮する。従つて、本発明の組成物を次亜
鉛素酸塩の測定に使用すべき場合には、指示薬と
アミンオキシドの組成物をそのまま使用すること
ができ、多分、緩衝剤を除いて別の試薬を必要と
しない。 他方、尿中のグルコースの測定には、本発明の
組成物の他にグルコースオキシダーゼ、パーオキ
シダーゼ及び適当な緩衝剤を含む試薬系を使用す
る必要がある。このような系をグルコースを含む
尿試料と接触させる場合には、グルコースオキシ
ダーゼはグルコースの酸化を触媒し、副生成物と
してH₂O₂を生じる。H₂O₂はパーオキシダーゼの
存在下で、ベンジジン型指示薬／アミンオキシド
組成物に色の変化又は出現を起す。緩衝剤を含む
場合、その目的は最も有利なPHを生ずることによ
つてこれらの反応を最適にすることである。 潜血又は他の擬パーオキシダーゼ又はパーオキ
シダーゼの測定にはなお別の試薬系、即ち有機ヒ
ドロパーオキシド、例えばクメンヒドロパーオキ
シド及び好ましくは適当な緩衝剤を必要とする。
従つて、擬パーオキシダーゼが試験試料中に存在
する場合には、有機過酸化物／擬パーオキシダー
ゼ系は本発明の組成物と反応して定性的及び半定
量的擬パーオキシダーゼ分析を可能にする変色を
生じる。 本発明の向上剤化合物、即ちアミンオキシド
は、向上剤が存在しない同じ系を用いて可能な濃
度より低い分析物質濃度で観察しうる色を出現さ
せることによつて感度を促進することが判つた。
向上剤は分析物質を更にはるかに高い濃度で半定
量的に同様に評価することができる。従つて本発
明の向上剤が組成物中に存在する場合には、特定
の試薬系及びベンジジン型指示薬を用いて検出し
うる分析物質濃度の全範囲が拡張される。 本発明の範囲内にあると考えられるアミンオキ
シドは広範囲に及ぶ。このアミンオキシド類は
式： R′₃N→Ｏ 〔式中R′置換基は同一又は異なり、水素、低級
アルキル基、低級アルキルオキシ基、アリール基
又はアリールオキシ基を表わす〕を有する。“低
級アルキル基”とは、メチル基、エチル基、ｎ―
プロピル基、イソプロピル基、ｎ―ブチル基、イ
ソブチル基、ｔ―ブチル基、シクロブチル基並び
にベンチル基及びヘキシル基の種々の異性体すべ
てを含む、１乃至約６個の炭素原子を有する炭化
水素基を表わす。用語“低級アルキルオキシ基”
は同様に定義され、低級アルキル基のエーテルで
ある。これらの置換基自体は例えば水酸基、ハロ
ゲン、シアノ基等で置換されていてもよい。更
に、２個のR′置換基及びこれらが結合している
窒素原子は一緒に３乃至約６個の原子を有する閉
環を形成していてもよい。この環は飽和、不飽和
又は芳香族であつてもよい。環は更に例えば水酸
基、ハロゲン及びアルキル基で置換されていても
よい。 更に環はそれ自体ポリマー分子中の多数のペン
ダント基の１つであつてもよい。このようなポリ
マー分子は、例えばポリ（４―ビニルピリジン―
１―オキシド）及びポリ（２―ビニルピリジン―
１―オキシド）である。これらはそれぞれ構造
式：

【式】及び

【式】 〔式中括弧内の構造はアミンオキシドモノマー単
位を表わし、ｎは平均ポリマー鎖中のモノマー単
位の相対数であり、ｎの数値は重合度によつて示
される〕によつて表わされる。 これらのポリマーの他に、本発明の範囲に含ま
れる他のアミンオキシドはトリメチルアミンオキ
シド、トリ―（β―ヒドロキシエチル）アミンオ
キシド、ピリジン―１―オキシド、３―ヒドロキ
シピリジン―１―オキシド、４―メチルピリジン
―１―オキシド、及び２―クロルピリジン―１―
オキシド及び４，4′―アゾビス（ピリジン―１―
オキシド）である。３―ヒドロキシピリジン―１
―オキシド及び２―クロルピリジン―１―オキシ
ドは向上剤として特に有用である。 ベンジジン型指示薬と共に使用するアミンオキ
シドの量は限定的なものではないが、指示薬のモ
ル数に基いて約50〜800モル％の範囲又はそれ以
上の量が前記の指示薬感度を向上させるのに有効
であることが判つた。必らずしも必要ではない
が、この基準を指針として使用して、所望の分析
物質に関する種々の化学で使用すべき本発明の組
成物の量は先行技術並びに下記の実施例から容易
に決定することができる。 本発明の試験用具は、指示薬／アミンオキシド
組成物を含浸した担体マトリツクスから成る。更
に、試験用具は更にベンジジン型指示薬と共に使
用しうる公知の任意の系又は他の試薬系、例えば
前記のグルコース感受性系及び擬パーオキシダー
ゼ感受性系で含浸されていてもよい。 試験用具の形成に利用される担体マトリツクス
は多数の形であつてよい。米国特許第3846247号
明細書はフエルト、多孔性セラミツク片及び織布
又はマツト化ガラス繊維の使用を教示している。
更に、米国特許第3552928号明細書は木材ステイ
ツク、布、スポンジ材料及び粘土質物質の使用を
開示している。英国特許第1369139号明細書には、
担体マトリツクスとして合成樹脂フリース及びガ
ラス繊維フエルトを使用することが示唆されてい
る。更に英国特許第1349623号明細書には、基礎
となる紙マトリツクスに対する被覆として薄いフ
イラメントの光透過性メツシユ材料の使用が提案
されている。フランス特許第2170397号明細書に
は、ポリアミド繊維が記載されている。しかしこ
れらの示唆があるにもかかわらず、担体マトリツ
クスとしてこの分野に主として使用され、本発明
に特に適当な材料は紙のような吸水性の紙であ
る。従つて、担体マトリツクスとして使用するた
め適切な材料を選択する際には大きい選択幅があ
り、マトリツクスは種々の物理的形を取りうるこ
とが判る。これらの型はすべて本発明の範囲内に
あるものである。 いずれを選択しても、担体マトリツクス材料の
ウエブ（Web）を数種の方法で本発明の組成物
で含浸することができる。ウエブを水、メタノー
ル、ベンゼン、シクロヘキサン等のような適切な
溶剤中の指示薬及びアミンオキシドの溶液又は懸
濁液に通して引き出すことができる。乾燥後、組
成物を負荷したマトリツクスウエブを次に幅約
0.5cmの細片に裂き、幅約８cmのプラスチツク支
持材料片の一端に固定することができる。これは
3Mカンパニイ（3M Company）から入手しうる
ダブル・ステイツク（Double Stick）として知
られている両面接着テープを使用して達成され
る。マトリツクス片を適当な場所に付けた支持材
料をついで横に切断して、一端に試薬を担持した
0.5cm²担体マトリツクスを有し、他端が把持部と
して作用する８×0.5cmの試薬片を形成する。 本発明の組成物で担体マトリツクスを包含させ
る別の方法は、印刷による。米国特許第4046513
号明細書には、組成物を含むインクをプラスチツ
ク担体マトリツクス上にシルクスクリーン印刷す
る技術が記載されている。他の方法、例えばマト
リツクスへの組成物の噴霧は先行技術に属し、従
つて当業者の知識の範囲内であろう。 次に実施例に基づいて、本発明の組成物及び試
験用具並びにその使用方法を詳述する。現在好ま
しいと考えられ、現在本発明の最良の実施形態と
思われる、本発明の上記の３つの面の具体例を記
載する。更に前記の検討から判るように、ここに
開示する概念は極めて広範囲であり、下記の実施
例は決して本発明を限定するものと考えるべきで
はない。 例１〜例８ グルコース検出 水溶液中のグルコースの存在の測定における本
発明の組成物の効力を評価するため、一連の実験
を行なつた。グルコースオキシダーゼ、パーオキ
シダーゼ及びｏ―トリジンの基礎溶液を調製し
た。７個のアリコート（aliquot）に７種の異な
るアミンオキシドを添加し、アミンオキシドを含
まない第８のアリコートを対照として使用した。
各溶液の試料を、徐々に増加する量のグルコース
を用いて試験して、(a)最初の青色の発色並びに(b)
褐変の開始を測定した。 基礎試薬溶液は下記の成分を含む： ｏ―トリジン 0.25g ポリ（ビニルピルロリドン）（水中10重量％）
30.0ml ON870ポリエトキシ化脂肪アルコール（General
Aniline＆Film社） 0.25g エタノール（溶液100ml当りメタノール５mlで変
性） 18.0ml 緩衝剤^* 23.5ml G.A.F.社から得られるガントレツツ（Gantrez）
AN―139（水中、無水マレイン酸．ビニルエーテ
ルコポリマー10重量％） 7.5ml アスコルビン酸（水中10重量％） 0.25ml 水中のグルコースオキシダーゼ（１ml当り5000I.
U.マイルス・ラボラトリイーズのマーシヤルデ
イビイジヨンから入手） 7.5ml 西洋ワサビパーオキシダーゼ（１mg当り68I.U.マ
イルス・ラボラトリイーズから入手） 0.25g 水 13.25ml ＊緩衝剤は下記の成分から成る混合物である： 水 208.0ml トリス―ヒドロキシメチルアミノメタン〔フイツ
シヤー・サイエンテイフイツク（Fisher
Scientific）〕 22.5g クエン酸三ナトリウム 27.2g グルタミン酸 27.0g クエン酸 6.16g 得られた混合物をそれぞれ19mlの８個のアリコ
ートに分割し、異なるアミンオキシド（第表参
照）0.1gを７個のアリコートに加え、第８のアリ
コートを対照として使用した。各アリコートの
1.0mlをスポツトプレートの別個の凹所に置いた。
各々にグルコース水溶液（１重量％）1μを加
えた。青色の開始時間を測定し、定性的特徴とし
た。続いて、更にグルコース溶液を褐色着色が検
出されるまで加え、グルコース溶液の量を記録し
た。グルコースの溶液を、目盛付き注入器〔ハミ
ルトン・シリーズ（Hamilton Series）No.700、
容量10μ〕を使用して行なつた。初めの1μを
瞬間的に加えた。青色が生じ、その時間を記録す
るまではそれ以上グルコースを添加しないでお
き、青色発色時間を記録した後、付加的グルコー
スを添加した。それぞれの場合に、付加的グルコ
ースを60秒以内に添加した。

【表】 リジン−１−オキシ ５秒
ド）
例１〜例５のデータから、試験した４種のアミ
ンオキシドは基礎グルコース試薬を(a)低グルコー
ス濃度で青色発色に要する時間を著しく減少さ
せ、(b)グルコースがかなり高濃度になるまで指示
薬の褐色形態の出現を制止することによつて改良
したことが判る。このように、グルコース配合中
のアミンオキシドの存在は、現在の技術水準の酵
素化学を用いて検出し得るグルコース濃度の幅を
顕著に拡大又は広め得るということができる。 例９及び例10 擬パーオキシダーゼの検出 活性成分としてｏ―トリジン、グルコースオキ
シダーゼ及び緩衝剤を含む溶液を調製した。この
系の19ml宛のアリコート２個を試験のため取つて
おいた。一方のアリコートにトリメチルアミンオ
キシド0.1gを添加し、他方のアリコートを対照と
して使用した。次に、少量のヘモグロビン、続い
て少量のグルコースを添加することによつて、各
溶液を試験した。ヘモグロビンの存在は青色発色
によつて示される。理論的には、グルコースオキ
シダーゼがグルコースに作用して過酸化水素を形
成する。過酸化物は擬パーオキシダーゼ（ここで
はヘモグロビン）の存在下でｏ―トリジンと反応
して青色を生じる。 下記の成分を合することによつて初溶液を調製
した： ｏ―トリジン 0.1g 緩衝剤^* 4.7ml エタノール 3.6ml ポリ（ビニルピロリドン）（水中、10重量％）
6.0ml ガントレツツAN―139（水中、無水マレイン酸／
ビニルエーテルコポリマー10重量％） 1.5ml 水中のグルコースオキシダーゼ（１ml当り5000I.
U. 1.5ml ＊前記の注を参照 この混合物19mlの２個のアリコートを取り、１
方のアリコートにトリメチルアミンオキシド0.1g
を添加した。各アリコート19mlをスポツトプレー
トの別個の凹所に置いた。各々にヘモグロビン水
溶液（１ml当り赤血球160で検定）1μ及びグル
コース水溶液（水１当りグルコース10g）5μ
を加えた。結果を第表に示す。

【表】 に明瞭な青色環が形成す
る。
この比較実験の結果は、極めて少量の擬パーオ
キシダーゼ、例えばヘモグロビンを検出する際に
アミンオキシド含有混合物の感度が向上したこと
を証明する。例９の実験条件下では青色発色は60
秒後に肉眼で認められるが、少量のアミンオキシ
ドが存在する場合には、同じ実験条件下で同じ系
は僅か30秒後にスポツトプレートの凹所の周りに
明瞭な青色環を生じた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： 〔式中、Ｒ及びR^*置換基は同一又は異なり、水
   素、低級アルキル基、低級アルキルオキシ基、ア
   リール基又はアリールオキシ基を表わすか、又は
   R^*置換基は一緒に（―CH₂）―_o（式中、ｎは１又は
   ２を表わす）を構成する〕のベンジジン型指示薬
   を含む、試験試料中の、ベンジジン型指示薬によ
   つて検出し得る分析対象物の存在を検出する組成
   物において、更に向上剤としてトリメチルアミン
   オキシド、トリエタノールアミンオキシド、ピリ
   ジン―１―オキシド、３―ヒドロキシピリジン―
   １―オキシド、４―メチルピリジン―１―オキシ
   ド、２―クロルピリジン―１―オキシド、ポリ
   （４―ビニルピリジン―１―オキシド）、ポリ（２
   ―ビニルピリジン―１―１―オキシド）又は４，
   4′―アゾビス（ピリジン―１―オキシド）を含む
   ことを特徴とする組成物。 ２ 前記アミンオキシドが２―クロルピリジン―
   １―オキシドである特許請求の範囲第１項記載の
   組成物。 ３ 前記アミンオキシドが３―ヒドロキシピリジ
   ン―１―オキシドである特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ４ 前記指示薬がベンジジンである特許請求の範
   囲第１〜３項のいずれか１項に記載の組成物。 ５ 前記指示薬がｏ―トリジンである特許請求の
   範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の組成物。 ６ 前記指示薬が３，3′，５，5′―テトラメチル
   ベンジジンである特許請求の範囲第１〜３項のい
   ずれか１項に記載の組成物。 ７ 更にグルコースオキシダーゼ及びパーオキシ
   ダーゼを含む特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   か１項に記載の組成物。 ８ 更にグルコースオキシダーゼ及びパーオキシ
   ダーゼを含む特許請求の範囲第４項記載の組成
   物。 ９ 更にグルコースオキシダーゼ及びパーオキシ
   ダーゼを含む特許請求の範囲第５項記載の組成
   物。 １０ 更にグルコースオキシダーゼ及びパーオキ
   シダーゼを含む特許請求の範囲第６項記載の組成
   物。 １１ 更に有機ヒドロパーオキシダーゼを含む特
   許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の
   組成物。 １２ 更に有機ヒドロパーオキシダーゼを含む特
   許請求の範囲第４項記載の組成物。 １３ 更に有機ヒドロパーオキシダーゼを含む特
   許請求の範囲第５項記載の組成物。 １４ 更に有機ヒドロパーオキシダーゼを含む特
   許請求の範囲第６項記載の組成物。