NO153822B - Askorbat-motstandsdyktig blanding og teststrimmel. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en blanding for bestemmelse av nær-

vær av en forbindelse i en prøve hvori blandingen omfatter et enzymatisk oksydasjonssystem som frigjør peroksyd, hvilket vil tilveiebringe en farge i nærvær av forbindelsen,

ved omsetning med en kromogen indikator, og fordi blandingen er utsatt for ugunstig innvirkning av nærværet av askorbinsyre i prøven, omfatter den en tungmetallforbindelse.

Typen av analytisk kjemi er blitt meget avansert etter

at biokjemi har begynt å tre frem som en primær vitenskape-lig enhet som krevde stadig mer kompliserte analytiske metoder og utstyr for å løse problemer hvis løsning tidligere ikke er forsøkt. Likeledes har medisinen gitt impulser til veksten av analytisk kjemi, og krever både høy nøyaktig-het og hurtighet for å oppnå resultater. Disse enestående fremskritt er ytterligere påskyndet av industrier som bryg-gerier, kjemiske fabrikker o.l.

For å tilfredsstille kravene av disse ekspanderende tek-nologier, er det utviklet en myriade av analytiske fremgangsmåter, blandinger og apparater, innbefattende oppløs-ningskjemi teknikk, automatisert maskineri og såkalt "dypp-og-les" reagens-strimler. Det er til det siste av disse at foreliggende oppfinnelsen primært er rettet, men også andre fremgangsmåter berøres.

Reagensstrimler har mange analytiske anvendelser, spesielt

i kjemiske analyser på biologiske væsker på grunn av deres relativt lave omkostninger, letthet å utnytte og hurtige resultater. I medisinen eksempelvis, kan utallige fysio-logiske funksjoner oppdages bare ved å dyppe reagensstrimler i en prøve av legemsvæsker som f.eks. urin, og iakttagelse av et påvisbart svar som fargeforandring eller forandring i mengde av lys reflektert fra eller absorbert av strimmelen.

I samsvar med slike "dypp-og-les" metoder har det fremkommet mange kjemier for å påvise kroppsvæske-komponenter. De fleste av disse produserer et påvisbart svar som er kvantitativt eller i det minste semi-kvantitativt. Således,

ved å måle svaret etter en på forhånd bestemt tid, kan det ikke bare oppnås en positiv påvisning av nærvær av en spesiell bestanddel i en prøve, men også bestemmes inn-holdet av bestanddelen. Slike strimler gir legen et pålite-lig diagnostisk verktøy såvel som muligheten til å vurdere graden av sykdom eller gal funksjon av kroppen.

Eksempler på "dypp-og-les" strimler som tidligere var i

bruk er "Clinistix", "Multistix", "Ketostix", "N-Multistix", "N-Multistix-C", "Diastix", "Dextrostix", og andre. Reagensstrimler som disse omfatter vanligvis en eller flere bærematriser, som et absorberende papir, som respektivt er inkorporert med et spesielt reagenssystem som fastslår en fargeforandring i nærvær av en spesifik prøveforbindelse. Avhengig av det inkorporerte reagenssystem med en spesiell matrix, kan disse innretninger bestemme nærvær av glukose, ketonlegemer, bilirubin, absorbert blod, nitrit og andre patologiske forbindelser. Den spesifike fargeendring og intensiteten av den iakttagbare farge, innen et spesielt tidsområde etter berøring av strimmelen med prøven, er en indikasjon på nærvær av en spesiell forbindelse og dens konsentrasjon i prøven. Noen av disse reagensstrimler og deres reagenssystemer, er omtalt i US-PS 3.123.443, 3.212,855 og 4,147.514, 3,814,668, 3.164.534 og 2.981.606

og 3.298.798, 3.092.465, 3.164.534 og 2.981.606.

Utviklingen av sukkeranalyse er muligens mest bemerkelses-verdig på grunn av den dramatiske endring i løpet av årene, både i basis-kjemi som anvendes og dets omfang. Flertallet av disse analyser kan karakteriseres som oksiderende systemer som når de er redusert, initierer reaksjonsbetingelser som fører til et påvisbart svar som f.eks. en fargeforandring, eller i endring i bølgelengden av ultrafiolette lys, som absorberes eller reflekteres av systemet. Således vil reduserende sukker overføre sølvoksyd til metallisk sølv, og hvis en oppløsning av sukker påføres til et stykke filtrerpapir impregnert med sølvoksyd, fremkalles en svart blekk. (F. Feigl. Chem.Ind., Vol. 57, s. 1161, London,

(1938)). På samme måte vil o-dinitrobenzen og 3,4- og 3,5-isomere av dinitroftalsyre gi en følsom fargereaksjon (som danner fiolette skygger) når det oppvarmes med reduserende sukker i en Na2CC>2 - (T.Momose et al., Chem. Pharm., Bull., Tckyo, vol. 12, side 14 (1964), F. Feigl. Spot Tests in Organic Analysis, 7. utg. side 338-339. Elsevier Publ.

Co. New York (1966)).

Men så tidlig som i 1849 var det kjent at reduserende sukker vil bevirke til at en alkalisk oppløsning av CuSO^ utfelles som gule til rød kobber(I)oksyd (eller oksyhydrat), (H. Fehling. Ann. Vol. 72 (1949). Se også B.Herstein, J.Am. Chem. Soc., vol. 32, s. 779 (1910)). Denne tidlig milesten, kjent som Fehlings prøve, ga impuls til utvikling av en meget mer følsom prøve som utnytter sølvoksyd i ammoniakk, såkalte Tollens reagens, som reagerer lett med reduserende stoffer for å danne en svart utfelling av metallisk sølv, som ofte danner et speil på den indre vegg av glassreak-sjonskarene (B.Tollens, Ber., vol. 14 s, 1950, (1881),

vol. 15, s. 1635, 1828 (1882)).

På grunn av den relativt høye forekomst av diabetes mellitus og dens medfølgende alvorlige kliniske følger, fremkom stor interesse fra biologer og medisinere, for å finne en ny teknikk for å analysere glukosenivået i urin og serum. Denne hovedinteresse førte til utvikling av flere fremgangsmåter som avviker sterkt fra deres oppløsningskjemi forløp-ere. Disse anvender komplekse biokjemiske systemer som kan inkorporeres i tørre "dypp-og-les" strimler og kan benyttes i oppløsning eller suspensjonsteknikk eller i forbindelse med spektrofotometer og andre instrumenter.

Av disse nye teknikker, egner foreliggende oppfinnelse

seg spesielt for et enzymatisk system, hvor analyten, f.eks. glukose er et substrat for et spesielt enzym, idet reaksjons-

produktene er istand til å utvikle et påvisbart svar fra kromogene indikatorforbindelser, som de som er kjent på området som "benzidintypeindikatorer". Dette defineres nærmere senere, men disse forbindelser kan få farge - forandringer i nærvær av hydrogenperoksyd og en peroksydert forbindelse, som f.eks. enzymet peroksydase. Glukose/ glukoseoksydasesystemet, eksemplifiserer teknikkens stand, hvori glukose oksyderes til glukonsyre med samtidig dannelsen av # 2^ 2 i overensstemmelse med ligningen:

Det er dannelsen av hydrogenperoksyd som muliggjør det etterfølgende indikator-forbundne trinn som fører til iakttagelse av fargedannelse eller andre synlige svar. Således svarer en benzidin-type indikator i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase ved å endre lysabsorbsjonskapasiteten.

I praksis utnyttes denne teknologi nå for glukoseanalyse

i form av "dypp-og-les" reagens-strimler slik som "Clinistix" og andre. Stort sett omfatter disse en plastikkstrim-mel ved hvis ene ende det er fastgjort en absorberende papirdel impregnert med det angjeldende enzym, indikatorfor-bindelse og bufferforbindelse som de hovedsakelig aktive forbindelser. De benyttes ved å dyppe en reagensbærende del ned i prøven, fjerne det, og sammenligne enhver farge som dannes i papiret med et standard fargekart, kalibrert til forskjellige glukosekonsentrasjoner.

På tross av de merkbare resultater oppnådd av reagensstrimler, vil visse stoffer som ofte er tilstede i prøven virke forstyrrende på prøvenøyaktigheten. Når konsentrasjonen av slike stoffer når et visst nivå sett i forhold til det målte substratet, kan den ugunstige innvirkningen på prøven bli markant. Eksempelvis har fagfolk innen fagområdet angående reagensstrimler i lengre tid vært klar over at nærvær av askorbinsyre i urinen kan uheldig påvirke analysen av slike ikke-beslektede forbindelser som glukose, skjult blod, bilirubin og nitrit. Således kan høy urinkonsentra-sjon av askorbinsyre fra terapeutiske doser av vitamin C eller parenterale preparater som inneholder vitamin C

som reduserende middel, f.eks. tetracykliner, inhibere reaksjonen av slike prøver, og begrense deres nøyaktighet.

Dette lenge uløste problem,er grunn til de mange forsøk

som er referert tidligere for å overvinne dette. US-PS

3 411 887 omtaler bruk av et metallion som har et oksyda-sjons-reduksjons portensial som er høyere enn for det forstyrrende stoff, men som er lavere enn for det kromogene stoff eller kation. Mens dette forsøk synes teoretisk mulig, og til en viss grad nedsetter forstyrrelsen fra askorbinsyre, reduserer den den kvantitative nøyaktighet av indikatorene i sukkerfølsomme reagenssystemer, spesielt glukosesystemer. Primært synes vanskeligheten å stamme fra en sterk mangel på lagringsstabiliteten av sukkerføl-somme indikatorsammensetninger i nærvær av metallioner.

På grunn av redusert holdbarhet og mangel på kvantitativt svar, har forbindelsen omtalt i US-PS 3 411 887 aldri fungert tilstrekkelig godt til å gi en sikker sukkerprøve, en kan si at kuren er verre enn sykdommen.

US-PS 3 975 398 og 3 988 208 vedrører indikatorblandinger som antas å være uforstyrret av acetoeddiksyre eller askorbinsyre. Andre forsøk på å løse dette problem med forstyrrelse var gjennom bruk av ioneutvekslingsforbindelser (Britisk patent 1 193 594) og multi-lag bærermatrise

(britisk patent 1 171 788) med en antagelse at forstyrrelses-stoffene kan fysisk adskilles fra prøven før berøring med reagens-systemet.

På tross av langvarige forsøk som de omtalt ovenfor, har

det til idag ikke fremkommet noen vesentlig løsning på problemet. "Trappings-systemet" ifølge US-PS 3 411 887

som vil vises i eksemplene, tilveiebringer sammensetninger av marginal stabilitet. Prøveinnretningene som utnytter slik teknologi, er ubrukelig etter nettopp kort lagrings-periode ved værelsestemperatur.

Foreliggende oppfinnelse gir en løsning for behovet for

et indikatorsystem som har en vesentlig motstand mot forstyrrelser fra reduserende stoffer som askorbinsyre (vitamin C) .

Oppfinnelsen vedrører en blanding for bestemmelse av nærværet av en forbindelse i en prøve, hvori blandingen omfatter et enzymatisk oksydasjonssystem som frigjør peroksyd og hvilket vil tilveiebringe en farge i nærvær av forbindelsen ved omsetning med en kromogen indikator, omfattende benzidin eller en av dets kromogene derivater eller blandinger herav, og fordi blandingen er utsatt for ugunstig innvirkning ved nærvær av askorbinsyre i prøven, omfatter den en tungmetall forbindelse som i ionisert tilstand har et oksydasjonspotensial lavere enn indikatoren, men høyere enn for askorbinsyre, idet blandingen er karakterisert ved at tungmetallforbindelsen er et kompleks av kvikksølvion og en eller flere ligander, idet liganden er kovalent bundet til ionet for å danne et vannoppløselig kompleks, idet liganden har et høyere oksydasjonspotensial enn ionet i dets komplekse tilstand, og komplekset har en K større 7 S enn 10 , og komplekset virker i det vesentlige ikke forstyrrende på reaksjonssystemet.

Oppfinnelsen vedrører også en prøveinnretning fremstilt

ved å inkorporere blandingen med en bærematrix.

Bruken av kvikksølvion/ligand-kompleks ifølge oppfinnelsen er enestående. Selv når prøveoppløsninger inneholder relativt høye mengder av reduserende stoffer, er analyse likevel mulig, mens nøyaktig bestemmelser i slik prøver tidligere var umulig, uten først å få fjernet forstyrrelsesmomentet før analysen. Eksempelvis har komplekset ifølge oppfinnelsen blitt funnet å utøve nøyaktig analyse av glukose i urinen, inneholdende opptil 200 mg pr. dl (mg %) askorbinsyre. Likevel er slike blandinger uventet stabile, sammen-lignet med tidligere blandinger, idet ingen av disse har vært egnet til slik bruk, mens samtidig tilveiebringes et produkt stabilt nok til å motstå lagring over mere enn en minimal periode.

Etter eksperimentet med aminosyrekompleks med Hg<++>, ble

det undersøkt mange andre aminosyrer som ligander. Noen virket, noen virket ikke. Videre ble det senere funnet at andre forbindelser av tydeligvis kjemisk ubeslektede aminosyrer, var like effektive som ligander i komplekset. Også her virket noen, andre ikke.

På grunn av dette store utvalg av ligander som gir både stabile komplekser med kvikksølvioner såvel som demping av forstyrrelse fra reduserende stoffer, er det ifølge oppfinnelsen identifisert felles egenskaper ved alle ligander og komplekser som kan anvendes, men ikke ved ikke brukbare ligander. Denne synes å omfatte fire parametere (a) muligheten av liganden å binde vesentlig kovalent til kvikksølvioner, under dannelse av et vannoppløselig kompleks, og således å la den ioniske natur av ionene vesentlig fritt til å reagere med det forstyrrende, reduserende stoff, (b) et ligand-oksydasjonspotensial høyere enn for kvikksølvioner i kompleks tilstand, således at ionene ikke kan bevirke oksydativ nedbrytning av en ligand under lagring, (c) en stabilitet konstant for komplekset på min,st ca.

10^, således at ligand og ion ikke bindes for løst eller tett, og derved gjør komplekset enten for ustabilt til å hindre Hg<++->hydrolyse eller for hardt bundet og således fjerne metallioner fra dets omgivelser, til den grad at det ikke mere kan reagere med det forstyrrende, reduserende stoff, og (d) umulighet for komplekset eller reaksjonspro-duktene etter reduksjon å forstyrre reagenssystemet.

Det skal angis disse teoretiske aspekter av kjemien av kvikksølvion og dets egenskap til å binde kovalent med visse ligander. Hg<++> anses som en sterk Lewis-syre, som har likhet med HF eller H^PO^ i vandig medium, og det hydrolyseres lett for å danne hydroksykomplekser overens-stemmende med

Denne reaksjons-likevektskonstant kan uttrykkes som Idet det gåes et trinn videre, hydrolyserer HgOH<+> lett til Hg(OH)2/ som disproposjonerer for å danne gult HgO og vann ifølge den generelle ligning Oppløselighetsproduktetav kvikksølv (II)hydroksyd i denne reaksjon er

Fra verdien av likevektskonstlantene i forhold til hydro-lysen av Hg (ligning 2 og 4) er det klart at Hg er stabilt i vandig oppløsning som mangler stabiliserende komplekserende stoffer, bare ved pH nivå under ca. 2. Svakt høyere pH-verdier er den overveiende HgOH<+> og ved

pH> 3 vil HgO utfelle omtrent kvantitativt.

Ved forsøk på å benytte det som fremgår av US-PS 3 411 887, fremkom store misfarginger og tap av mengder og lagrings-kapasitet. Uten noen midler til å stabilisere Hg<++> på overtrekket såvel som i oppløsning, dannes et middel tilveie-bragt av foreliggende oppfinnelse, sterkt farget HgO spontant etter relativ kort 'lagringsperiode, eller ved bruk, og gjør prøveblandingen både følsom overfor forstyrrende, reduserende midler og upålitelige både kvalitativt og kvantitativt. Følgelig ligger foreliggende oppfinnelse i det faktum at kvikksølv-forbindelser i oppløsning er usta-bile over pH 3, hvis ikke hydrolyse utelukkes som ved å kompleksdanne Hg<++> med en ligand som er istand til å tilveiebringe en tilstrekkelig stabilitet. Det er ikke bare funnet kompleksdannende ligander som bevirker at den nødvendige stabilisering (så vel så mange som ikke gjør det), men også ligander som muliggjør at komplekset virker utmerket ved å fjerne reduserende forstyrrelsesstoffer.

Det første av de fire kriterier som antas å være felles

for de foreliggende ligander er muligheten til kovalent å binde Hg<++> under samtidig tilveiebringelse av vannopp-løselige komplekser. Blant ligander som kan bindes til Hg<++> kovalent er CN~, SCN~, Cl", Br", I~, acetat, NH^, CH^IS^, pyridin, anilin, etylendiamin, etylendiamintetra-eddiksyre, trifenylfosfin, aminosyre, karboksamider, imider, heterocykliske amider som uridin og mange andre. Ved å undersøke mulige liganders mulighet til å danne komplekset, ble det undersøkt hvilke som vil binde kovalent med Hg++. Det er mange.

Deretter ble det undersøkt om et kompleks av liganden ville oppløses til en ønskelig grad i vann. En oppløslighet tilstrekkelig til å danne en vandig konsentrasjon på minst ca. 0,01M antas adekvat for komplekset, skjønt komplekser som er istand til å danne minst ca. 0,IM oppløsninger i

vann ved standardtrykk og temperatur (STP) foretrekkes.

Når det er funnet ligander som binder kovaléimttil Hg<++> for å danne vannoppløselige komplekser, er det neste trinn å finne hvilke av disse som ikke oksyderes av metallioner. Hvis ligandene har for lavt oksydasjonspotensial i forhold til kvikksølvionene, vil komplekset være utsatt for spalting og være ubrukbart til å eliminere reduserende forstyrrelsesstoffer. En måte for å finne ligander som er utsatt for oksydasjon ved kompleksdannende kvikksølvion er å fremstille en oppløsning av komplekset i vann, og iaktta ved STP i flere dager. Utfelling av grått, metallisk kvikk-sølv er indikasjon på et ubrukelig ligandoksydasjonspoten-sial .

Det tredje parameter som skal undersøkes ved bestemmelse

av ligander hvis kvikksølvkompleks løser problemet med reduserende forstyrrelsesstoffer, er det termodynamiske kriteriet kjent som stabilitetskonstanten (I^). Som det ble funnet på grunn av den spontant dannelse av gult HgO fra Hg<++> ved pH over ca. 3, og på grunn av ionets tendens til langsomt å danne HgO i tørr tilstand, er kompleksdannende ligander nødvendig. Den stabiliserende innvirkning av forskjellige ligander kan fastslås av K data av det

++ s

spesielle Hg /ligand kompleks. Kompleksdannelsen uttrykkes som

Ks for denne reaksjon uttrykkes som

I ligningene 5 og 6 er L en ligand, n er antall av slike ligander, bundet til metallioner, og HgLn er komplekser. Vanlige verdier for n er 2, 3 eller 4, men kan bli så høy som 6. Det skal forståes at HgLn kan være et heterogent kompleks, hvori Ln kan omfatte forskjellige ligander, bundet til samme ion.

Av ligning 4 fremgår

Ved å erstatte dette forhold i ligning 6, fremkommer For å bestemme tallverdien av K s og 3 således beskriver komplekset i tallverdier, vil det bli benyttet flere be-tegnelser her. Da relativt høy vesentlig ekvimolare konsentrasjoner av ligand L og kompleks HgLn er ønskelig ved å fremstille blandingen ifølge oppfinnelsen, og da slike konsentrasjoner nærmer seg enhetlig aktivitet, vil det her antas at Derved forenkles ligning 8 til

Således ses at Kg spiller en vesentlig rolle i definering av kompleksene som vil være stabile ved forskjellig pH-forhold ifølge ligning 10. Tabell I viser hvorledes dette matematiske forhold kan uttrykkes i grader av Kg et kompleks krever for å hindre at det overføres til HgO ved forskjellige pH-verdier.

Det ses fra tabellen at for å holde et kvikksølvkompleks

i oppløsning ved pH 6, dvs. i pH-området for normal urin, mbeør d edn et Khg a sea n lK avs t psoå o m 2c,a5 . x 10 10 59e. r Dsett abeir le fuvennd eet n apt H kpomå pcleak.ser 5. Disse verdier er ikke absolutte, men det er funnet fordelaktig at komplekset har en Kg på o minst ca. 10 7.

Det siste kriteria som skal tilfredsstilles ved komplekset ifølge oppfinnelsen, er ikke -innvirkning på reagens-systemet og sistnevntes mulighet til å påvise nærvær av analyten. Det er klart at et kompleks som reagerer kjemisk med systemet , eller som hindrer en enzymsammensmeltning til kvantiteten som reagerer på nærvær av komponenten,

ikke vil være egnet ifølge oppfinnelsen. Videre må ikke komplekset gi ved reduksjon med forstyrrende reduksjons-middel som askorbinsyre, reaksjonsprodukter som i seg selv vil hindre den ønskede analyse.

Dette fenomen med kvikksølv kompleks-forstyrrelse med et reagenssystem kan lett bestemmes i laboratoriet, ut fra det som fremgår av foreliggende oppfinnelse. Alt som trengs å gjøre, er å inkorporere komplekset med det ønskede reagenssystem. Den blanding kan benyttes for å måle nærvær av komponentene i to prekalibrerte oppløsninger, en inneholdende urin som har komponenten tilstede, og den andre samme komponentholdig urin, men med en relativt høy mengde askorbinsyre tilsatt (ca. 10-100 mg/dl). Resultatene av disse analyser sammenlignes deretter med resultatene oppnådd ved å benytte reagenssystemer uten komplekser i samme opp-løsninger. Farge overensstemmelse mellom de to angir hold-bar ikke-forstyrrelse av reagenssystemet ved kvikksølv-komplekset i reduksjonsproduktene.

For generelt å summere opp det ovennevnte, er det funnet både eksperimentelt og teoretisk et vesentlig antall av ligander som når de kompleksdannes med Hg<++>, tilveiebringer løsningen av et problem som i årrekker har hindret disse analysetyper, spesielt slike analyser som benytter "dypp-og-les"-reagensstrimler; ukorrekte eller falske negative avlesninger på grunn av forstyrrende effekt av askorbinsyre eller andre tilsvarende reduserende stoffer. Disse ligander fremkommer fra slike tilsynelatende ubeslektede generiske kategorier, som aminosyre, nukleosider, sekundære og terti-ære aminer, amider og fosfiner. Videre virker noen forbindelser av den angitte kategori, mens andre ikke virker.

Med kjennskap til disse eksperimentelle resultater er det oppfinnelsens gjenstand å finne felles egenskaper som forbinder de ligander og komplekser men som ekskluderer de som ikke virker. Fire parametere synes viktig: (a) ligandenes egenskap til kovalens og bindende med Hg<++> for å danne vannoppløselige komplekser, (b) egenskapene av liganden til å motstå oksydativ beskadeliggjørelse av Hg<++>

(dv8 s. et høyere oksydasjonspotensial), (c) en K ^på 10^ til 10 eller høyere for komplekset, og (d) forenligheten av komplekset med et spesielt reagenssystem. Brukbare komplekser tilfredsstiller alle disse krav, ikke brukbare oppfyller ikke et eller flere av disse krav.

Nedenstående tabell angir ligander som ble undersøkt (se eksemplene) både brukbare og ikke brukbare, og er oppstilt tilsvarende. Det er også angitt i tabellen grunnen hvorfor visse ligander tilveiebringer komplekser med Hg<++>som er istand til å sikre en tidligere glukosereagens formulering fra askorbat-forstyrrelse. I tabell II, en angivelse (1), indikerer at liganden ikke binder kovalent Hg , eller danner et vann-uoppløselig kompleks (2) indikerer at liganden ikke har et oksydasjonspotensial tilstrekkelig til å hindre oksydasjon av Hg<++>, og (3) indikerer komplekser som har en for lav K .

s

Enskjønt det ikke er undersøkt hvorfor visse ligander ikke viser seg effektive i å motvirke forstyrrelser, fører nøyak-tige iakttagelser av oppførselen av hver av ligandene som angitt i eksemplene til konklusjonene angitt i tabell II under "(grunner)". I tillegg er det sannsynlig at relativt ikke flyktige ligander vil resultere i komplekser som har høyere lagringstid enn deres mere flyktige motparter.

Det er klart at det er forsøkt å tilveiebringe noe innsikt i hvordan komplekser kan fremstilles innen oppfinnelsens ramme.

Eksempelvis kan kvikksølv (II)sarkosinat fremstilles som mange av kompleksene ved å tilsette kvikksølvoksyd til en oppløsning av liganden, her sarkosin, i vann. Tilsvarende kan kvikksølv-serinat fremstilles fra en serin opp-løsning. Disse oppløsninger kan deretter benyttes som tilsetninger til standard glukose-følsomme reagenser, eller de kan benyttes for å isolere en renset fast form av komplekset ved utfelling, som med isopropanol. Selvsagt ligger komplekser som fremstilles med andre fremgangsmåter innenfor oppfinnelsens ramme, forutsatt at de tilfredsstiller de kriteria som tidligere er angitt.

Videre vil en liten omtale av reagenssystemer som tidligere ble benyttet for å bestemme nærvær av prøveinnhold, ytterligere tilveiebringe en forståelse av oppfinnelsen. Disse reagenssystemer innbefatter de omtalte indikatorsystemer,

og siterte referenser og ellers omfattes av referanser.

Et slikt system som ble funnet spesielt motstandsdyktig mot askorbatforstyrrelser når det kombineres med et kompleks som tidligere angitt, er det som omfatter en sukkeroksydase, et peroksydativt aktivt stoff, og en oksydasjonsreduksjons-indikator istand til å danne en fargeforandring overfor H2°2' ^et Per°ksyderte aktive stoff. Avhengig av det spesielle sukker som skal analyseres, velges et enzym som vil bevirke dannelsen av f^C^ ved oksydasjon av sukker-analyten. Således er for glukoseanalyse glukose oksydase foretrukket. På samme måte hvis analyten er galaktose,

er et ^C^-produserende enzym en galaktose oksydase.

Når f^C^ en gang er dannet, kreves et peroksydativt aktivt stoff for å muliggjøre aktivering av den spesielt valgte indikator. Typiske peroksydative : aktive stoffer innbefatter peroksydase og hemoglobin. Blant de mange oksydasjon-reduksjonsindikatorer som er kjent som danner en fargeforandring i nærvær av f^C^ og et peroksydativt aktivt stoff, er benzidin og i dets mange kromogene derivater. Disse innbefatter o-tolidin, 2,7-diaminofluoren, 3,3', 5,5'-tetra-(lavere alkyl)benzidin, og N,N'- og N,N'-(lavere alkyl) substituerte benzidiner. Med uttrykket "lavere alkyl" menes substituerte, usubstituerte hydrokarbonradikaler med fra 1 til 6 karbonatomer, innbefattende metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, cyklopropyl, n-butyl, isobutyl, tert.-butyl, cyklobutyl, n-pentyl, sec.-pentyl, tert.-pentyl, neopentyl, cyklopentyl, n-heksyl, cykloheksyl og alle andre isomere herav.

Det er klart at det er betraktelig mange sukker-følsomme reagenssystemer som er følsomme for forstyrrelser fra askorbat og tilsvarende reduserende stoffer. Det antas at disse systemer også vil kunne nyttes i foreliggende oppfinnelse, og at inkorporering av kompleksene ifølge oppfinnelsen i slike reagenssystemer vesentlig vil lette problemet. Følgelig ligger slike systemer innen oppfinnelsens ramme.

Et annet reagenssystem som gjøres motstandsdyktig til askor-batforstyrrelsen ved å kombinere med komplekset ifølge oppfinnelsen, er et som omfatter et peroksydativt aktivt stoff, og en redoks indikator istand til å bevirke en fargeforandring i nærvær av H2C>2 og det peroksydative aktive stoff. Et slikt reagenssystem er kjent for påvisning av peroksyd-analyter som kumen, og hydrogenperoksyd .

Av reagenssystemene nevnt ovenfor, er det sannsynlig å

anta at et hvilket som helst slikt system basert på en redox-indikator og som har et oksydasjonspotensial tilstrekkelig høyere enn for askorbinsyre, er følsom for å være forstyrret av et residuerende stoff som har et oksydasjonspotensial tilsvarende askorbinsyre. Følgelig kan foreliggende oppfinnelse anvendes på alle slike reduserende stoffer, følsomme reagenssystemer.

Ved fremstilling av prøveinnretningen ifølge oppfinnelsen, hvori blandingen er det omtalte glukose-følsomme reagens, omfatter blandingen en glukose-følsom reaksjonsoppløsning i vann (første oppløsning), og en oppløsning inneholdende kvikksølv-komplekset (annen oppløsning). Den glukoserea-gerende oppløsning inneholder en benzidintype-indikator som 3,3'-, 5,5'- tetrametylbenzidin, glukoseoksydase, peroksydase og buffer. Et stykke av filtrerpapir, neddyppes og mettes med første oppløsning og tørkes. Deretter dyppes det tørkede impregnerte filtrerpapir og mettes med annen oppløsning og tørkes.

I en utførelse ifølge oppfinnelsen, ble papiret inneholdende første og annen oppløsningsreagens, kuttet i små firkanter, hvorav en monteres på den ene ende av en strimmel av poly-styrenfilm. Klebning av papiret til polystyren kan utføres ved å benytte en på begge sider adhesiv-tape, som den som finnes pa markedet som "dobbe1—stikk" fra 3M Co. Den resul-terende prøveinnretning kan deretter benyttes til å måle glukose i urin, idet prøven er i det vesentlige uhindret av nærvær av opptil 200 mg% askorbinsyre i prøven.

Bærematriksen som anvendes i innretningen kan omfatte et hvilket som helst stoff istand til å inkorporeres med sammensetningen. Således kan matriksen ha mange kjente former, som de som anvendes for reagensstrimler for opp-ladningsanalyse. Eksempelvis omtales i US-PS 3 846 247 bruk av filt, porøse keramiske strimler, og vevet eller matterte glassfibre. Som erstatning for papir, omtaler US-PS 3.552 928 bruk av trepinner, tøy, svampmateriale

og leirholdige stoffer. Bruk av syntetiske harpiksflor og glassfiber-filt istedet for papir omtales i britisk patent 1 369 139. Britisk patent 1 349 623 omtaler bruk av lett-permeabelt nettverk av tynne filamenter som er dekket av en underliggende papirmatriks. Denne referanse angir også impregnering av papiret med deler av reagens-system, og impregnering av nettverket med annet potensiell uforenlig reagens. Fransk patent nr. 2 170 397 omtaler bruk av bærematrikser som er mer enn 50% polyamidfibre.

En annen omtale av bærematrikser er angitt i US-PS 4 046 513 hvori det anvendes bruk av trykking av reagenser på en egnet bærematriks. US-PS 4 046 514 angir mellomveving eller knipling av filamenter som bærer reagensen i et reaksjonssystem. Fortrinnsvis omfatter bærematriksen et biboløst materiale som filterpapir. Alle slike anførte bærematrikser kan anvendes ifølge oppfinnelsen som andre og alle ovennevnte referanser som omfattes av oppfinnelsen.

Basis-bæredelen ' hvorpå den impregnerte bærematriks kan monteres, kan ha mange forskjellige variasjoner i form, størrelse og konstruksjonsmateriale. Således kan det fremstilles at et hvilket som helst likvid og tett materiale som polystyren, polyolefin, glass, papir, metall eller annet materiale. Vanligvis er det imidlertid foretrukket at basisdelen kan være av et polymert materiale, som biak-sialt orientert polystyren. For de fleste formål er det funnet fordelaktig at bæredelen er relativt stiv, og strekker seg tilstrekkelig langt fra bærematriksstillingen for å

gi brukeren en god håndtering.

Eksempler.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler. De viser foretrukkede utførelsesformer,

og viser utøvelsen av oppfinnelsen.

A. Fremstilling av forskjellige komplekser.

To teknikker er blitt funnet eksperimentelt som tilveiebringer kvikksølv-komplekser som gir den uventede kombina-sjon av stabilitet og effektivitet ved å eliminere reduserende stoffer som forstyrrer sukker-følsomme reagenssystemer. Disse er kvikksølv-oksyd metoden og den oppløse-lige saltmetoden.

Førstnevnte teknikk innbefatter bruk av HgO som utgangs-materiale, idet liganden HgO kombineres i destillert vann for å danne en kompleks-oppløsning. Den sistnevnte teknik-ken som viser seg å ha flest anvendelsesmuligheter, omfatter bruk av slike vannoppløselige kvikksølvsalter som kvikk-sølv (II)acetat og nitrat. Begge disse teknikker illu-streres av følgende eksempler.

Eksempel 1.

Kvikksølv (II)sarkosinat: Oksyd-metoden.

Komplekser av Hg<++> og aminosyrer kan lett dannes ved tilsetning av pulverisert HgO og aminosyrer, enten i rekkefølge eller samtidig til vann, og således danne en oppløsning av komplekset. Oppløsningen kan deretter benyttes direkte ifølge oppfinnelsen, eller komplekset kan isoleres og lagres for senere bruk. Analysen beregnet for Hg(CH3 NHCH2COO~)2 er C, 19,15; H 3,21: N, 7,44, Hg 53,14, 0,

16, 99. Funnet: C, 18,94, H, 3,93, N, 7,26, Hg, 53,14,

0, 17,33.

Når HgO omrøres med vandig sarkosin ved et molart forhold på henholdsvis 1:2, oppløses bare 2/3 av HgO. Ved å bruke 3 ganger molart overskudd av sarkosin, oppnås fullstendig oppløsning. Dette fenomen er ennå ikke tilfredsstillende forklart da begge støkiometriske forhold resulterer i samme kompleks, dvs. Hg (sarkosin)2, som er vist ved elementær analyse.

I et eksperiment som utnytter denne teknikk,; . ble prøver

av 1,83 g (8,45 x 10~<3> mol) HgO og 3,014 g (38,2 x 10~<3 >mol) sarkosin satt til 10 ml destillert vann under omrøring. Det dannet seg en orange opak suspensjon som ble klart etter 10-20 minutter ved værelsestemperatur. Komplekset ble isolert fra denne oppløsning ved utfelling av isopropanol.

Eksempel 2.

Kvikksølv (II)sarkosinat: Saltmetoden.

For å fremstille kvikksølv-komplekser via saltmetoden, oppløses et kvikksølv-salt som acetat eller nitrat i et tilstrekkelig oppløsningsmiddel, sammen med en spesiell ligand. Mens aminosyrekomplekset kan fremstilles ved oksyd-metoden, såvel som saltmetoden, er det den sistnevnte som finner anvendelse for et stort utvalg av ligander, hvorav mange ikke danner komplekser eller gjør dette meget langsomt idet det benyttes HgO.

En prøve kvikksølv-acetat som veier 31,0 g (0,143 mol)

ble oppløst i 400 ml metanol, og 17,54 g sarkosin ble oppløst i 60 ml destillert vann. Den vandige sarkosin

ble tilsatt til metanol-oppløsningen, blandet og hensatt ved værelsestemperatur i 1 time, hvorpå det opptrådte krys-tallisering av kvikksølv-sarkosinat. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen filtrert. Krystallene ble fjernet,

og tørket for å danne 2 6,3 g produkt (80% av det teoretiske). Nedkjøling natten over av filtratet, ga ytterligere 3 g produkt.

Eksempel 3.

Kvikksølv (II)serinat: Oksydmetoden.

Kvikksølv-serinati fremstilles idet det benyttes samme teknikk som i eksempel 1. Følgelig ble 1,83 g HgO og 1,78

g serin blandet i 10 ml destillert vann under omrøring.

Som i de tidligere eksempler, dannet det seg med en gang

en klar oppløsning av kvikksølv (II)serinat.

Eksempel 4.

Kvikksølv (Il)bicinat.

Omsetning av HgO med bicin, bis-hydroksyetylenglycin (HOCH2CH2)2NCH2COOH som i eksempel 1, i et 1:2 molart forhold, dannet en klar, stabil oppløsning. Det" ble ikke gjort noe forsøk på å isolere komplekset.

Eksempel 5.

Kvikksølv (II)prolinat.

Omsetning av HgO med prolin i vandig oppløsning som angitt

i eksempel 1, i et 1:3 molart forhold, dannet en klar, stabil oppløsning av Hg: prolinkomplekset.

Eksempel 6.

Kvikksølv (Il)treonat.

HgO ble omsatt med vandig treonin, som i eksempel 1 et

HgO ble omsatt med vandig treonin, som i eksempel 1 ["et

1:2 molart forhold for å danne en klar, stabil oppløsning

av Hg:treoninkompleksprodukt.

Eksempel 7.

Kvikksølv (II)uridinat.

HgO ble satt til en vandig oppløsning.av uridin som i eksempel 1 i et 1:2 molart forhold for å danne en klar, stabil oppløsning av produktet Hg:uridinkompleks.

Eksempel 8.

Kvikksølv (II)trifenylfosfinat.

En del av trifenylfosfin (3g) ble oppløst i 50%-ig dimetyl-formamid og omsatt med 1,30 g HgCl2 til det dannet seg en hvit utfelling. Dette kompleks som er kvikksølvion og trifenylfosfin ble samlet ved filtrering og tørket. Komplekset oppløst i destillert vann gir en klar, stabil oppløsning.

Eksempel 9.

Kvikksølv (II)dietanolaminat.

En del kvikksølvacetat som veier 2,6 g (8,4 x 10 3 mol)

ble oppløst i 10 ml destillert vann. Til oppløsningen ble det satt 1,92 g (0,016 mol) av dietanolamin. Det fremkom en klar, stabil oppløsning av komplekset, omtrent med en gang ved tilsetning av liganden.

Komplekset ble isolert ved fordampning av reaksjonsblandingen.

Eksempel 10.

Kvikksølv (II)trietanolaminat.

Idet det gåes frem som angitt i eksempel 9, ble vandig kvikksølv-acetat kombinert med trietanolamin i et 1:2 støk-iometrisk forhold. Det fremkom en klar, stabil oppløsning

av produktet Hg:trietanolaminkompleks.

Eksempel 11.

Kvikksølv (II)lauroylsarkosinat.

Idet det ble fulgt fremgangsmåten ifølge eksempel 9, ble vandig kvikksølvacetat og natriumlauroylsarkosinat kombinert i et 1:2 molart forhold for å gi en klar, stabil oppløsning. Produktkomplekset ble isolert ved fordampning, etterfulgt av flere acetonvaskinger for å fjerne natriumacetat tilstede i fordampningsresidivet.

Eksempler 12- 36.

Idet det gåes frem etter fremgangsmåten ifølge eksempel

1 eller 2, er det fremstilt komplekser av mange ligander som av grunner angitt i tabell III ikke tilfredsstiller kravene i henhold til oppfinnelsen.

B. Fremstilling av prøveinnretninger.

I følgende eksempler ble forskjellige komplekser dannet som angitt i eksemplene 1-11 og forbundet med reagenser som er følsomme overfor glukose for å bestemme effekten av komplekset ved å minske forstyrrelser fra askorbinsyre.

De spesielle anvendte ligander var sarkosin, serin, prolin, bicin og uridin.

Eksempel 37.

Kvikksølv-sarkosinat.

Et antall prøvestrimler ble fremstilt idet det ble benyttet glukosefølsomme reagenser, og kvikksølv-sarkosinat. Hver strimmel var fremstilt i form av en avlang polystyrenstrim-mel, i hvis ene ende det ble montert en firkant av filterpapir impregnert med blandinger. Papiret ble holdt på

plass idet det ble anvendt dobbeltsidig klebetape.

Ved fremstilling av denne prøveinnretning ble en 5 mm bred strimmel av Eaton og Dikeman 204 filtrerpapir neddyppet i en første dyppeoppløsning, omfattende glukoseoksydase, peroksydase, 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin og en buffer i vann. Det impregnerte papir ble deretter tørket i en luftovn ved ca. 50°C i ca. 30 minutter. Etter tørking ble papiret neddyppet i en annen dyppeoppløsning, omfattende kvikksølv-sarkosinatkompleks. Etter annen tørking ble den impregnerte strimmel montert langs en kant av en film av biaksial orientert polystyren, idet det ble benyttet en dobbeltsidig klebetape, kjent som "Double Stick". Filterpapir/filmjsammensetningen ble kuttet i strimler perpen-dikulært til kanten som har det impregnerte papir. Strimmelen målte ca. 4x5 mm, papirdelen ved enden målte hver ca. 5 mm .

Den første dyppeoppløsning inneholdt de nedenfor angitte ingredienser. Disse ble blandet i den angitte rekkefølge. Den annen dypping ble fremstilt ved først å danne to pre-blandinger og kombinere disse. Premix A ble dannet ved å blande følgende ingredienser i den angitte orden:

Premix B inneholdt komplekset kvikksølv-sarkosinat og ble fremstilt ved å blande følgende stoffer i den angitte rekke-følge :

Premix A ble satt til premix B når alt sarkosin og HgO hadde gått i oppløsning.

Eksemplene 38- 41.

Prøvestrimler som anvender andre komplekser.

Eksperimentet i eksempel 37 ble gjentatt for kvikksølv-komplekset av serin, prolin, bicin og uridin, idet det ble gått frem som angitt.

Premix A ble fremstilt av:

Preparatet premix B formulering ble fremstilt for hvert kompleks fra 1,83 HgO i 10,00 ml destillert vann med følg-ende mengder ligand. C. Flere prøveinnretningers ytelse etter varmepåkjenning.

Prøveinnretning ble fremstilt ifølge eksempel 32-41 og

ble utsatt for varme for å bedømme stabiliteten. Følgelig ble hvert kompleks bedømt etter lagring ved værelsestemperatur i ca. 7 dager og ved 3 dager i 60°C i luftovn. Etter varmepåkjenningen ble hvert sett av prøveinnretningene undersøkt med hensyn på A) evnen til å differensiere mellom forskjellige nivåer av glukose i en prøve, og B) hvorvidt

glukoseanalysen var gjenstand for forstyrrelse av askorbinsyre. For hvert sett av strimler som hver har et forskjellig kvikksølv-kompleks, ble prøven dyppet i en prøveoppløs-ning av oppsamlet urin, inneholdende glukose. Prøveoppløs-ningene inneholdt 0, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500,

700 og 1000 mg glukose pr. dl av oppløsning (mg%). Evnen til en spesiell klasse av innretnignen til å bestemme disse forskjellige glukosenivåer ble bedømt idet det ble benyttet prøvestrimler aldret ved værelsestemperatur. Hvor fargefremkalling . øket med glukosekonsentrasjon ble en innretning ansett å differensiere mellom konsentrasjons-nivåene. Hvor ingen tydelig økning av fargeintensitet ble iakttatt mellom glukosenivåene, ble differensieringen bedømt som lik.

For å bedømme motstanden av prøveinnretningen mot forstyrrelser å interferere fra askorbinsyre, ble de prøvet med to sett av glukoseoppløsninger, et sett ved 50 mg%, det annet ved 100 mg%. Hvert sett omfatter tre innretninger som i tillegg til glukose inneholdt henholdsvis 0, 100

og 200 mg askorbinsyre. For hvert sett innretninger som hver har forskjellig kvikksølv-kompleks, ble prøver dyppet i begge sett av glukoseoppløsninger. I de tilfeller hvor farger som tilsvarer nærvær av glukose forble uendret uansett askorbatkonsentrasjon etter en kort tid etter dypping,

ble problemet med forstyrrelser vurdert til å være løst gjennom nærvær av kvikksølv-komplekset.

Eksempel 42.

Kvikksølv-sarkosinat.

Prøveinnretningen fremstilt ifølge eksempel 37, etter romtemperatur-aldring i ca. 7 dager, ble undersøkt ved forskjellig glukoseoppløsninger omtalt overfor for å bestemme evnen til å differensiere mellom glukosenivåer. Resultatene, i rekken av økende fargeintensitet var 0 < 10 < 20 30 < 40 < 50 < 100 < 250 = 500 = 1000 mg%.

Innretninger varmeutsatt ved 60°C var i det vesentlige

like reaktive.

Innretninger aldret ved værelsestemperatur ble deretter prøvet i de to sett oppløsninger inneholdende henholdsvis 50 og 100 ml % glukose. Hvert sett omfatter 3 oppløsninger av forskjellige askorbinsyrekonsentrasjoner: 1, 100 og 200 mg %. I de 3 oppløsninger inneholdende 50 mg % glukose, forble fargene utviklet i strimlene vesentlig de samme etter 15 sekunder. I 100 mg % glukoseoppløsninger forble fargene omtrent identiske etter 10 sekunder.

I det vesentlige samme resultatet ble oppnådd ved strimler aldret ved 60°C i 3 dager.

Eksempel 43.

Kvikksølv-serinat.

Prøveinnretninger som er fremstilt ifølge eksempel 38 ble varmeutsatt og prøvet som i eksempel 42. Innretningen aldret ved værelsestemperatur ga følgende endelige diffe-rensiering mellom glukosenivået: 0 < 10 < 20 < 30 < 40 < 50 < 100 < 250 = 500 = 1000 mg %.

Varmeutsatte strimler (60°C i 3 dager) hadde ingen iakttatt økning i reaksjon.

Når det ble undersøkt med askorbinsyre/glukose-oppløsninger som i eksempel 42, trengte innretninger dyppet i 50 mg % glukoseoppløsning 5 sekunder for fargeutvikling som kunne sammenlignes, mens innretninger dyppet i 100 mg % oppløs-ninger tok 10 sekunder.

Eksempel 44.

Kvikksølv-prolinat.

Prøveinnretninger fremstilt \ om i eksempel 39 ble varmeutsatt og prøvet som i eksempel 42. Innretningen aldret ved værelsestemperatur ga følgende ytelser i adskillelse mellom glukosenivåer: 0 < 10 < 20 < 30 < 40 < 50 < 100 < 250 = 500 = 1000 mg %.

Innretninger utsatt for 60°C i 3 dager tapte ingen iakttatt økning i aktivitetsreaksjonen.

Askorbatmotstandseksperiment påført innretningen ved værelsestemperatur, viste at de 3 50 mg % glukoseoppløsninger krevde 15 sekunder for å gi omtrent samme fargefremtreden i prøveinnretningene, mens 100 mg % glukoseoppløsning ga tilsvarende farge etter 10 sekunder. Samme eksperiment med innretninger aldret i 60°C i 3 dager, ga samme resultater .

Eksempel 45.

Kvikksølv-bic inat.

Innretningene fra eksempel 40 ble varmeutsatt og prøvet

som i eksempel 47. De som var aldret ved værelsestemperatur ga følgende evner til å differensiere mellom glukosenivåer: 0 < 10 < 20 < 30 < 40 < 50 < 100 < 250 = 500,= 1000 mg %.

De som ble eldet ved 60°C i 3 dager, tapte ingen iakttag-

bar differensieringskapasitet.

1 askorbatmotstandseksperimentet krevde værelsestemperatur-utsatte innretninger i 15 mg % glukoseoppløsninger 10 sekunder for å danne i det vesentlige samme fargefremtreden.

På samme måte i 100 mg % glukoseoppløsninger ga de tilsvarende farger etter 10 sekunder. Samme eksperiment ved innretninger aldret ved 60°C i 3 dager ga samme resultater.

Eksempel 46.

Kvikksølv-uridinat.

Innretninger fra eksempel 41 ble behandlet og prøvet som

i eksempel 42. De som var aldret ved værelsestemperatur, ydet følgende evne i å differensiere mellom glukosenivåer: 0 < 10 < 20 < 30 < 40 < 50 < 100 < 250 = 500 = 750 = 1000 mg%.

Innretningene eldet ved 60°C i 3 dager, reagerte ikke på farge ved 10 mg %-nivå, men differensierte lett mellom høyere nivå tilsvarende innretninger aldret ved værelsestemperatur .

I askorbatmotstandseksperimentet, romtemperatur-behandlede innretninger, krevde i 50 mg % glukoseoppløsninger 35 sekunder for å danne vesentlig samme fargefremtreden, men i 100 mg % glukoseoppløsninger ga de tilsvarende farger etter 60 sekunder. Samme eksperiment under anvendelse av strimler aldret ved 60°C i 3 dager, ga tilsvarende resultater.

D. Tidligere kjente kvikksølv-forbindelser.

Eksperimentet ble utført for å vurdere ytelsen av kvikk-sølv-f orbindelsen hørende til teknikkens stand, idet det derved ble dannet basis for sammenligning med foreliggende oppfinnelse. US-PS 3 411 887 er det nærmeste teknikkens stand som er kjent. Patentet angir tre kvikksølv-forbindelser som bruk som "fellesmidler": acetat, nitrat og klorid (spalte 4, linje 9 og 10). Disse forbindelser ble inkorporert i prøveinnretninger som er vist i eksempel 1 i ovennevnte US-patent (i kolonne 6).

Eksempel 47.

Kvikksølv-acetat (US-PS 3 411 887).

Ved å fremstillingen av denne prøveinnretning ble det formulert to blandinger. Første inneholdt de aktive stoffer for glukopåvisende reaksjonssystem, og annet inneholdt ingredienser for askorbat-fellessystemer. Påvisningssys-temet inneholdt:

buffer, inneholdende en blanding av 55,5 g vannfri sitronsyre og 244,5 g trinatriumstearat,

malt sammen og oppløst i 750 ml vann 30 ml.

Følgende sekvens ble fulgt ved å fremstillingen av påvis-ningssystemet. Peroksydase ble oppløst i 5 ml vann, og kombinert med en 5 ml vandig suspensjon i glukoseoksydase. Gelatin og F, D og C-farge ble oppløst i 25 ml kokende

vann og avkjølt til værelsestemperatur. Orto-tolidin di-hydroklorid ble deretter suspendert i 12,6 ml alkohol,

og kombinert med bufferoppløsning. Alle ovennevnte blandinger og oppløsninger ble kombinert i en beholder og blandet godt. Papirstrimler som målte 5 cm x 6 mm ble dyppet i denne fremstilte oppløsningen, og lufttørket ved 100°C

i 9 minutter.

Kvikksølv-acetat fellesmidlet ble oppløst i dimetylsulfoksyd og kombinert med en oppløsning inneholdende fortyk-ningsmiddel, fuktemiddel og buffer. Disse forbindelser ble deretter godt blandet inntil det fremkom en homogen oppløsning. Omtrent halvparten av de impregnerte strimler ble deretter dekket med den homogene blanding, omfattende utfellingssystemet ved å dyppe strimlene i blandingen. Strimlene ble deretter lufttørket ved en temperatur på 80°C i 9 minutter.

Disse innretninger ble deretter undersøkt i oppsamlet urin inneholdende konsentrasjoner av glukose i området fra 0

til 1000 mg % glukose, og det ble funnet reaktive over hele konsentrasjonsområdet. Fargedifferensiering var mulig fra 10 til 250 mg % glukose.

En gruppe nyfremstilte strimler ble deretter satt til siden på laboratoriebenken i en tett, lukket flaske, inneholdende silikagel og molekylsikt. Etter en ukes (7 dager) lagring på denne måten, ble innretningen igjen prøvet i nyfremstilte oppløsninger av glukose i urin. De ga intet fargesvar på glukose, selv ved en konsentrasjon på 1000 mg %. Innretningene hadde ikke tålt lagring ved værelsestemperatur i lav fuktighet i 1 uke.

Eksempel 48.

Kvikksølv-acetat (alternativt preparat).

Fordi formuleringer ifølge oppfinnelsen er fremstilt uten dimetylsulfoksyd som benyttes i US-PS 3 411 887, ble et eksperiment utført som i eksempel 47 ovenfor, unntatt at 91,5 ml vann ble benyttet istedet for samme mengde dimetylsulfoksyd. Det ble iakttatt mens innretningene ble tørket, at HgO begynte å utfelle fra kvikksølv-acetat fellesystem-oppløsningen (ca. 15 minutter).

Disse innretninger ble deretter undersøkt som i eksempel

47, og reagerte på tilsvarende måte både før og etter lagring.

Eksempel 49 og 50.

Kvikksølv-klorid og kvikksølv-nitrat.

Eksperimentet ble utført som i eksempel 47 og 48 ovenfor, unntatt at separate sett av strimler ble fremstilt av kvikksølv-klorid og kvikksølv-nitrat respektivt. Mengden av disse forbindelser som benyttes i formulering av felles-systemet (og som erstatter 8 g kvikksølv-acetat) var 6,8g

HgCl2 og 13,4 Hg(N03)2.

Innretningene som var nyfremstilte fra HgCl2 var istand

til å differensiere glukosekonsentrasjoner fra 50 til 500 mg %. Ved aldring i 1 uke ved værelsestemperatur og lav fuktighet var de ureaktive selv ved 1000 mg % glukose. Innretningene fremstilt fra Hg(N03)2 forble ureaktive enten de var nyfremstilt eller etter lagring.

E. Fremstilling og ytelse av en blanding istand til å påvise hydrogenperoksyd.

Eksempel 51- 66.

En serie eksperimenter ble utført for å bestemme effektivi-teten av oppfinnelsen i omsetning av et peroksydfølsomt reagenssystem, fritt for askorbatforstyrrelser.' En rea-gensoppløsning istand til å danne en blåfarge i nærvær av hydrogenperoksyd omfatter bufferoppløsning av peroksydase og orto-tolidin i etanol ble fremstilt. Dets evne til å påvise H202 i nærvær av askorbinsyre og forskjellige kvikksølv-komplekser ble undersøkt.

Følgende stoffer ble benyttet til å fremstille forskjellige kvikksølv-komplekser i vann, idet det ble benyttet HgO eller kvikksølv-acetat som angitt.

Det ble iakttatt at blandingene, f.eks. 51 - 54 og

56 var klare oppløsninger. 55 var klar med suspenderte krystaller, 57 hadde grå, fast utfelling, 58-62 hadde enten hvit eller orange utfelling tilstede. 63 resulterte i en uklar suspensjon, og 64 dannet en gel.

En lagringsoppløsning av reagenser, følsomme for peroksyder ble fremstilt ved i rekkefølge å blande følgende reagenser:

Prøver, hver på 1,5 ml av denne oppløsning ble satt til

16 hulrom av en punktplate, hvert hulrom har 2,0 ml kapasi-tet. Til 15 av de i oppløsningsholdige hulrom ble det tilsatt 3 ul (mikroliter) av 10 g/dl oppløsning askorbinsyre i vann. Hulrommene ble merket 51 til 66, idet de som ble merket 65 og 66 tjente som kontroll uten kvikksølv-kompleks, og med og uten askorbinsyre resp. Til slutt ble et 1 ul porsjon av hver av kvikksølv-kompleksene satt til de merkede hulrom (51-64). når de 16 hulrom ble preparert således at hver var inoku-lert med 5 ul av en 10% oppløsning av H202 i vann ved omrør-ing idet det ble benyttet en glass-stav. Etter 5 sekunders omrøring ble hvert hulrom undersøkt for dannelse av blåfarge. Resultatene er oppstilt i det følgende:

Eksemplene 51 - 64 viser at komplekser ifølge oppfinnelsen, er forenlig med et reagens-system for å påvise peroksyd, og at de inhiberer forstyrrelser i prøven fra askorbinsyre.

Claims (6)

1. Blanding for bestemmelse av nærvær av en forbindelse i en prøve, hvori blandingen omfatter et enzymatisk oksydasjonssystem som frigjør peroksyd og hvilket vil tilveiebringe en farge i nærvær av forbindelsen ved omsetning med en kromogen indikator, omfattende benzidin eller en av dets kromogene derivater eller blandinger herav, og fordi blandingen er utsatt for ugunstig innvirkning ved nærvær av askorbinsyre i prøven, omfatter den en tungmetallforbindelse som i ionisert tilstand har et oksydasjonspotensial lavere enn indikatoren, men høyere enn for askorbinsyre, karakterisert ved at tungmetallforbindelsen er et kompleks av kvikksølv-ion og en eller flere ligander, idet liganden er kovalent bundet til ionet for å danne et vannoppløselig kompleks, idet liganden har et høyere oksydasjonspotensial enn ionet i dets komplekse tilstand og komplekset har en Kg større enn 10 7, og komplekset virker i det vesentlige ikke forstyrrende på reaksjonssystemet .

2. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at liganden er sarkosin, treonin, serin, prolin, bicin, uridin, trietanolamin, dietanolamin, natriumlauroylsarkosinat eller trifenylfosfin.

3. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at komplekset er kvikksølv (II)sarkosinat.

4. Blanding ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at prøvekomponenten er glukose og at reaksjonssystemet omfatter glukoseoksydase og peroksydase.

5. Blanding ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at den kromogene indikator er benzidin, o-tolidin, 3,3', 5,5'-tetra(lavere alkyl)-benzidin, N- eller N,N'-poly(lavere alkyl)-substituert benzidin, 2,7-diaminofluoren eller blandinger herav, idet uttrykket lavere alkyl betyr substituerte og usubstituerte hydrokarbonradikaler med fra 1-6 karbonatomer.

6. Teststrimmel for å bestemme nærvær av en kompo-nent i en prøve, karakterisert ved at strimmelen omfatter en bærematrix impregnert med en blanding ifølge et av kravene 1-5.